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PDF - Accueil thèses - Université Toulouse III

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1. x e GL Ke BB K gor UM Pace sb Directs Epidermal Cell Differentiation Miniature F Actin TET Figure 6 vb Target Genes Are Involved in Separate Features of Denricle Edification A Subcellular localization of Singed Forked and Miniature In the epidermis of stage 15 wild type embryos Distribution of a catenin a component of adherens junctions that underlines the cell contour was observed in embryos expressing v catenin GFP driven by E22C Gal4 Red indicates F actin and green indicates catenin Singed Forked and Miniature B Transmission electron microscopy analysis of denticle cells from wild type wt m and sm 2 double mutant embryos As in smooth cells the flat region of the apical cell face organizes microvilli that cantact cuticle layers only at the apex In contrast the plasma membrane is in close contact with cuticle along the entire wild type denticle contour Although the m mutation alters this membrane cuticle contact na defects are visible in sn CT embryos Close up pictures show a region of the growing extension Scale bar represents 0 25 um GO 10 1371 journalpbio 0040290 9006 To better understand the role of sib targets we analyzed the subcellular distribution of Singed Forked and Miniature proteins at the onset of denticle formation Forked Singed and Miniature are sequentially accumulated in denticle cells Figure 51 and consistent with their bundling act
2. MCGK DEMDVELTESRP FEGIVSSKGOH SDPRCVYVPP STGKTEFSFRISYSRCGTKPDLN YDKDLLEVWDEAKRLRCEN QCEK THMRVHNIEFDRP FSRKGFY SDPHCVHLKP GTGHLSATFEIFLHSCGMTSSANHNG6AAGYGAPTPS IIIQYDPYVQEVWDQARKLRCTW KCLS GSHLITIKDAPPNHETGLFSCMIYPKGLS KNSTCLSEYR DH VGSLRYKLPLRSCHIMPKETDD GGIEPFN TIVLOPHLKLITDLGRGY SR ELLEMHLELSRP FRGLLYAKD LECRARGK DSTRLHLRIPTSGCGVRAEPLED RVMLOKEQKLROSTDILSSVRCOLP FGIY C WO ve RGPGEAVVSSGYIGAGSGSPIPIE YLPAENTLSSKVRLSILYQG RP TTTIAVGDPLTFRLEAQDG NATTSLGVSVRDSSVDSSEPVPSAIALESSLEYTEHMFPHEGVVHYNSSTGPHPHPSISLQILDLS HOHETNDVQIGONLELOIVAEYSPQOLAEHME YDLTNKSVSNGVDLDVRGDIMPAL SEEVIVESPNVIMRITSRDG SDMMRSAEVGDPLALKFEIVD YDLTNKTVLNDVDLGVTGE IESSL SEEITIDSPNVIMKITSRDG 5 IVE L SEEIIVDSPNVIMKITARDG SDMKRIAEVGDPLALRFEIVD ASPAYNVMMNATTGSSSTSTSSGGI HGLVKRDVLPAG FTRDLTVKSGTPLTMEINLDED ERVAVKTHALKMGVANDVQARSGG LLRKGSTG YTRHLENNGA YDMSSKNITFGMMPIRDPEMIHIN SSPEAPPPRIRILDTRORE VETVRIGDRLNFRIEIP YQTGEENVTLGFNVSHMLTTAGT IA NTGPPPI
3. ventral lat ral Dorsal EnCyrA Figure 20 Sch ma de l organisation g nomique du g ne cyr et expression des CRM LA r gion EnCyrB ne pr sente aucune activit r gulatrice Le CRM EnCyrA reproduit l expression du g ne sous la d pendance de Svb EnCyrB Scale 10 kb chr3R 27365000 27370000 27375000 27380000 27385000 27390000 svb positives CG1498 2 EM Nyo1E B svb negalives c51499 1 evo motifs TINI o dH d Ohba merit OMM Motifs Protein Coding Genes ventral lateral Dorsal SBK Figure 21 Sch ma de l organisation g nomique du g ne nyo et expression des CRM Le CRM EnNyolExt reproduit l expression du gene nyo sous la d pendance de Svb La r gion EnNyo2Ext pr sente une faible activit transcriptionelle dans certaines cellules pidermiques qui semble tre sous la d pendance de Svb La r gion EnNyo3 ne montre aucune activit transcriptionnelle EnNyoExt1 _ EnNyoExt2 EnNyo3 vecteur rapporteur lac Z contenant les s quences AttB Markstein et al 2008 Ce systeme pr sente l avantage de s int grer dans une plateforme g nomique AttP d termin e et donc a une position chromosomique connue et invariante entre diff rentes lign es Chaque l ment potentiellement r gulateur est donc plac dans le m me environnement chromatinien vitant l influence de la variation des s
4. une mauvaise distribution subcellulaire de cette prot ine b M ancr e versus M diffusible Afin de tester l existence d un clivage de M in vivo nous avons introduit une double tiquette une GFP en N ter et une mCherry en C ter figure 36 Ce double marquage fluorescent permet de suivre de mani re ind pendante les deux r gions de la prot ine 129 Expression Pas d expression de la Flp H __delaFlp com Clone mutant Clone Jumeau homozygote sauvage P d Figure 34 Recombinaison site sp cifique par le syst me FLP FRT A Cr ation d une d l tion sur le chromosome entre les deux sites FRT Deux lign es portant des sites FRT localis s des positions diff rentes sur le m me chromosome sont crois es puis la flipase FLP est induite par choc thermique pour cr er la d l tion d sir e B G n ration des clones mitotiques Le chromosome Bleu porte une mutation ast risque Rouge Dans ce cas les sites FRT sont des positions identiques sur les chromosomes homologues parentaux La recombinaison induite en phase G2 par la Flp va cr er des chromosomes mixtes qui au cours de la mitose vont s gr ger ind pendamment Cela cr e des cellules avec les deux bras de chromosome mut s le clone mutant et des cellules avec les deux bras de chromosome sauvage le clone jumeau Le reste de l individu est compos de cellules h trozygotes pour la mutation D apr s M t s et al Genome Biology 2
5. Fernandes et al Figure 3 100 91n614 je 5 uonnjosei peojumop 0 ajay 42119 palmbiy 101 oJnDi4 je je aew vonnjossu uBiu peojuwop 0 aray 345112 gainBi4 102 Figure6 Click here to download high resolution image wt tyn zye Denticle cel area a Crb ii Li d G Lil IE II Alli il ht ula du ALME Mb i a Dig Fernandes et al Figure 6 abewi uonnjosei uBiu 2194 49119 181614 104 Inventory of Supplemental Information Supplementary material and methods Molecular clones cDNAs for m RE53556 RE15579 dy LPO5062 neo GH22837 nyo RE37929 and RE22259 were obtained from the Drosophila Genomics Resource Center https darc cab indiana edu and inserted into pUAST vector using Noti and Acc65i restriction sites The integrity of each cDNA was verified by complete sequencing and in case of dyl the wild type sequence according to the last genome release was restored by site directed mutagenesis to correct a frame shift mutation present in the full length cDNA clone For mey we did not succeed in obtaining a full length and wild type ORF since all molecular clones we analyzed were corrupted at several locations We did not obtain either a correct cDNA for but in this case we could generate a mini gene rescuing construct zye ORF was PCR amplified from
6. tyn mutant phenotypes as assayed in embryos denticles and adults wing size 89 or viability respectively when expressed using the da GAL4 driver corresponds to a full rescue of denticle defects indicates very partial phenotypical amelioration and a slight modification of the denticle phenotype that cannot unambiguously be interpreted as rescuing towards wild type Levels of wing size were calculated from 100 rescue wild type size to 0 size of m mutant wings Figure 3 Functional specificity of ZPD proteins A Rescuing activities of chimeric forms of Trynity and Miniature shaded proteins The 3 Pan AP domains have been deleted from the Tyn protein Tyn APAN or inserted at a similar position within the Miniature protein M PAN Tyn M ZPTyn and Tyn ZPM correspond to a reciprocal exchange of the two ZP domains B Structure based alignment of the ZP N region of Drosophila M Tyn Nyo Mey Neo Cyr Dyl and Zye proteins as well as mouse Zona Pellucida 3 mZP3 Black boxes indicate conserved Cys residues and lines presumptive disulfide bonds The tyrosine residue corresponding to that substituted in human a tectorin Y1850C is boxed in pink In the Miniature protein the introduced mutation is Y117C M 8 C Activity of MT protein assayed in embryos denticles and adults wings Mr expression was driven by da GAL4 in m mutants or in wild type animals In the latter lecta dominant defects a
7. 3 Shavenbaby le d terminant ultime de la morphogen se cellulaire pidermique Dans les deux sections pr c dentes nous venons de r sumer les grands principes d une part des m canismes de sp cification des diff rentes populations de cellules pidermiques et d autre part de la diff renciation g n rale de l piderme de drosophile Au cours de l embryogen se ces deux processus sont en r alit largement concomitants et nous allons maintenant voquer comment leur interaction fonctionnelle aboutit au remodelage de la forme apicale des cellules pidermiques au cours de leur diff renciation terminale 3 1 M canismes cellulaires de la formation des trichomes Nous avons vu que la d termination du patron des trichomes r sulte de nombreuses cascades d interactions g niques Les trichomes cuticulaires repr sentent de robustes extensions cytoplasmiques mergeant de la face apicale de certaines cellules pidermiques Les trichomes diff rent dans leur taille et leur forme selon leur position sur le corps de larve par exemple entre les r gions dorsales les extensions apparaissent fines et souples et ventrales op les denticules qui serviront la locomotion de la larve sont larges rigides et avec une morphologie en crochet bien particuli re figure 13 26 Figure 14 Remodelage du cytosquelette d actine au cours de la formation des denticules Image issues d un film sur un embryon vivant exprim
8. Localisation de M grace a la GFP La prot ine M se localise dans le cytoplasme et s accumule la face apicale des cellules productrices pointe de fl che Dans le compartiment ant rieur la prot ine n est visible que sur la face apicale des cellules A Superposition des images A et A Coloration de la F actine par la phalloidine rhodamine B Localisation de M gr ce la GFP La prot ine GFP MAC ter mime une forme diffusible et s accumule la face apicale des cellules pointe de fl che Dans ce cas il est difficile d identifier les cellules productrices B Superposition des images et B La mCherry est localis e dans le cytoplasme des cellules productrices avec une accumulation punctiforme a la surface des cellules Dans le compartiment ant rieur la partie C ter se localise pr f rentiellement l apex des cellules pointe de fl che C La partie N ter visible grace la GFP se localise dans le cytoplasme des cellules productrices et la face apicale des cellules de l ant rieur B Superposition des images B et B plus coloration de la F actine en bleu La double fonction ancr e et diffusible est elle sp cifique de M Il serait utile pour la compr hension des m canismes d adressage et de r gulation des prot ines ZPD de tester si comme M Tyn est capable d agir distance Pour cela nous pourrons observer la localisation de la prot in
9. Cuticle differentiation during Drosophila embryogenesis Arthropod Struct Dev 35 137 152 Moussian B Veerkamp J Muller U and Schwarz H 2007 Assembly of the Drosophila larval exoskeleton requires controlled secretion and shaping of the apical plasma membrane Matrix Biol 26 337 347 Muller H A and Bossinger 2003 Molecular networks controlling epithelial cell polarity in development Mech Dev 120 1231 1256 Muriel J M Brannan M Taylor K Johnstone L Lithgow G J and Tuckwell D 2003 M142 2 cut 6 a novel Caenorhabditis elegans matrix gene important for dauer body shape Dev Biol 260 339 351 Parks A L Cook K R Belvin M Dompe N A Fawcett R Huppert K Tan L R Winter C G Bogart K P Deal J E ef al 2004 Systematic generation of high resolution deletion coverage of the Drosophila melanogaster genome Nat Genet 36 288 292 Payre F 2004 Genetic control of epidermis differentiation in Drosophila Int J Dev Biol 48 207 215 Payre F Vincent A and Carreno S 1999 ovo svb integrates Wingless and DER pathways to control epidermis differentiation Nature 400 271 275 3l 95 Roch F Alonso C R and Akam M 2003 Drosophila miniature and dusky encode ZP proteins required for cytoskeletal reorganisation during wing morphogenesis J Cell Sci 116 1199 1207 Sapio M R Hilliard MA Cermola M Favre R and Bazzicalupo P 2005 The Zona Pelluc
10. NN Md Mi Lb T1 T2 T3 1 A2 A3 T A6 A7 A8 A9 PIAIPIA IPTAIPIAIPTAIPTAIPTAIPI ALPI ALP AI PIA PIA PIA 7 1819 10 11 12 13 14 Figure 6 Segmentation de l embryon Image en microscopie lectronique balayage d un embryon au stade 14 Le d grad de couleurs repr sente l expression des diff rents g nes hox essentiels pour la segmentation de l embryon On distingue 3 segments c phaliques Md Mx et Lb 3 segments thoraciques 1 T3 et 9 segments abdominaux Al A9 Les r gions terminales de l animal acron en avant du premier m tam re et le telson en arri re du dernier ne sont pas des m tam res L embryon est aussi divis en 14 parasegments PS qui ne correspondent pas aux segments S de la larve ou de l adulte Un PS comprend le compartiment post rieur P d un S et le compartiment ant rieur A du S suivant genes de segmentation commandent la formation des S lorsque les axes principaux de l embryon sont d finis et sont r partis en 3 classes qui s expriment s quentiellement Les genes gap ou de d l tion subdivisent l embryon selon l axe A P en larges r gions comportant plusieurs bauches de PS Les g nes de parit segmentaire divisent ces grandes r gions en PS et les genes de polarit segmentaire tablissent la limite entre les compartiments ant rieurs et post rieurs au sein de chacun des segments Enfin la combinatoire d expression des g nes de segment
11. The ZP domain is a conserved module for polymerization of extracellular proteins Nat Cell Biol 4 457 461 Kurotaki Y Hatta K Nakao K Nabeshima Y and Fujimori T 2007 Blastocyst axis is specified independently of early cell lineage but aligns with the ZP shape Science 376 719 723 Lecuit T and Lenne P F 2007 Cell surface mechanics and the control of cell shape tissue patterns and morphogenesis Nat Rev Mol Cell Biol 8 633 644 Litscher E S Williams Z and Wassarman P M 2009 Zona Pellucida Glycoprotein ZP3 and Fertilization in Mammals Mol Reprod Dev 6 933 41 Locke M 2001 The Wigglesworth Lecture Insects for studying fundamental problems in biology J Insect Physiol 47 495 507 McGregor A P Orgogozo V Delon Zanet J Srinivasan D G Payre F and Stern D L 2007 Morphological evolution through multiple cis regulatory mutations at a single gene Nature 448 587 590 Mellman and Nelson W J 2008 Coordinated protein sorting targeting and distribution in polarized cells Nat Rev Mol Cell Biol 9 833 845 30 94 Monne M Han L Schwend T Burendahl S and Jovine L 2008 Crystal structure of the ZP N domain of ZP3 reveals the core fold of animal egg coats Nature 456 653 657 Morgan T H and Bridges C B 1916 Sex linked inheritance in Drosophila Publs Carnegie Instn 1 88 Moussian B Seifarth C Muller U Berger J and Schwarz H 2006
12. d fendre ce projet bien s r un projet de th se ca ne d cide pas tout seul j ai toujours t entour par une quipe pour avancer au quotidien Merci Jennifer qui nous d j quitt de m avoir accompagn dans la d couverte du monde merveilleux de la drosophile mais aussi pour nos nombreuses discussions rugbystiques et sa foi aveugle dans les victoires du Stade Toulousain Bon courage Emilie Delphine et Ahmad les nouveaux entrants de l quipe une petite pens e toute particuli re pour Emilie qui va devoir me remplacer aupr s de Serge occupe toi bien de lui je te le confie Je voudrais aussi faire un remerciement tout particulier H l ne F qui depuis quelques mois maintenant supporte ma mauvaise humeur permanente la r daction me r ussit assez mal cot panouissement personnel Merci d avoir toujours t l pour entendre mes plaintes et mes coups de gueule merci d avoir su garder ton sourire et souvent m me d avoir ri pour faire d compresser dans les moments les plus difficiles J ai trouv en toi des blagues aussi douteuses que les miennes et je garderai pour toujours l image de cet ours polaire apparaissant dans mon tube eppendorf Je ne serais pas l pour te rendre la pareille mais depuis mon Canada lointain c est promis je penserais toi Merci Yvan mon robot in situ HIS pour toute l aide qu il a pu m apporter et surtout l acharnement qu il a montr pour r aliser ces fameuses HIS fluo
13. linker scanning pour identifier en plus des sites Ovo l ensemble des autres motifs cis r gulateurs n cessaires la fonction de ces l ments Les tentatives de mod lisation des CRM m diant la r ponse transcriptionnelle Svb montre en effet l existence de plusieurs motifs statistiquement surrepr sent s dans les g nes cibles de Svb en plus des sites Ovo Des analyses syst matiques in vivo permettront de tester la fonction ventuelle des motifs identifi s in silico Serge Plaza vient en effet de r aliser une tude de ce type sur un CRM de m Lorsque le site Ovo est mut l activit r gulatrice du CRM de m est nulle montrant que Svb doit se fixer sur ce site Les exp riences de linker scanning de cet l ment r velent en outre l importance de diff rentes r gions d ADN elles aussi n cessaires la pleine activit r gulatrice du CRM de m Le challenge est maintenant de d couvrir quels sont les facteurs en trans reconnaissent ces motifs et comment ils pourraient interagir fonctionellement avec le facteur Svb 60 ventral lateral Dorsal EnDyl1 HSP27 EnDyI3HSP27 EnDyl31 HSP27 Figure 25 Expression des CRMs EnDyl1 EnDyl3 et EnDyl31 La r gion EnDyll dirige une faible expression du transg ne en lat ral qui semble tre sous la d pendance de Svb alors que cette m me r gion sous le contr le du hsp70 ne montrait aucune expression La r gion EnDyl3 ne montre elle aucune activit transcriptionn
14. tablie grace d une part la signalisation Hh et d autre part la d gradation acc l r e de Wg dans les 16 cellules exprimant En Dubois et al 2001 Contrairement a Wg les signaux Spi et Ser agissent a faible distance et sont distribu s sym triquement vis a vis des cellules sources Sanson 2001 Spi est exprim uniform ment dans l piderme mais sous une forme inactive C est de la prot ase Rho qui permet sa maturation et donc son activit pour d clencher la voie du r cepteur a Alexandre et al 1999 Ser est un ligand transmembranaire de la voie Notch qui n agit que sur les cellules adjacentes son domaine d expression Hatini and DiNardo 2001 Enfin la s cr tion de Hh tablit un gradient capable de signaler sur trois rang es cellulaires vers le post rieur depuis les cellules sources Au stade 12 les m mes voies de signalisation vont d terminer le destin morphologique de chaque cellule pidermique Par la suite nous ne pr sentons ici que les m canismes agissant dans la d termination du destin des cellules pidermiques ventrales c est dire le choix entre une surface lisse et la formation des denticules En absence de Wg l ensemble de l piderme est recouvert de denticules alors que l expression ectopique de ce facteur conduit une cuticule enti rement nue Wg est donc capable de sp cifier le destin des cellules lisses Au contraire l activation de la voie EGF r p
15. tude biophysique des prot ines ZPD est de plus g n e par leur structuration tridensionnelle tablissement de ponts disulfures et par les modifications post traductionnelle extensives glycosylation syalilation maturation ainsi que par leur ancrage membranaire Des approches in vivo dans des syst mes mod les peuvent donc contribuer mieux comprendre comment ces prot ines ZPD fonctionnent et sont r gul es L objectif de ce travail tait de mener une analyse fonctionnelle extensive de l ensemble des prot ines ZPD jouant un r le au cours de la morphogen se pidermique embryonnaire L analyse d une famille de g nes paralogues constitue une voie d tourn e mais n anmoins repr sentative des m canismes de diversification fonctionnelle des g nes au cours de l volution Pr cis ment chez la Drosophile il semble que cette activit volutive duplication divergence des g nes ZPD soit tr s dynamique De plus il existe des prot ines associant au domaine ZP un second domaine fonctionnel le domaine PAN ou Pan apple 142 Ces deux domaines sont assez r pandus mais leur pr sence simultan e apparait restreinte aux ecdysozoaires incluant arthropodes et n matodes Ces prot ines pourraient alors jouer un role particulier au cours de la mue ecdysis caract ristique des animaux de cet embranchement Parmi les drosophilidae une expansion r cente concernant les g nes neyo nyobe morpheyus a t identifi e En
16. 82 Dyl protein in m mutants IF unpublished results Although our genetic data are compatible with the existence of homo and or heterotypic interactions between epidermal ZPD proteins extensive test of their polymerisation properties now awaits biochemical characterization a challenging task due to the high level of post translational modifications of this family of extracellular matrix proteins The distribution of a given ZPD protein must also rely on extrinsic factors such as regulators of trafficking machineries and future cellular analyses will be required to address this important issue Routing ZPD proteins to apical sub regions likely requires as well a proper apico basal polarization Unexpectedly the most basal ZPD proteins Tyn and Zye are required for correct maintenance of junctional complexes and apical determinants in denticle cells This in turn suggests a bidirectional interaction between ZPD proteins and junction polarity complexes to ensure on the one hand proper localisation of ZPD and on the other hand a reinforcement of junctions and apical determinants in denticle cells Reorganization of cell junctions is critical for various changes in cell shape such as those involved during germ band extension or mesoderm invagination Lecuit and Lenne 2007 and it may be involved in the stretching that occurs along the DV axis of denticle cells In addition deformation of the apical compartment that is mediated by actin and E
17. MED 020 Bal Tek Balzers September 2006 Volume 4 Issue 9 e290 45 Liechtenstein witha 20 nmm gold palladium coat and examined with a Philips SLA held emission microscope For transmission electron microscopy stage 16 embryos fixed and devitellinized as above were post fixed for 1 h in paraformaldehyde 3 glutaraldehyde 0 5 in PBS und then in 155 osmaum tetroxide for Ih Alter dehydration samples were embedded in Epon Sections were stained with uranyl acetate and photographed with a Leo 510 Zeiss microscope Electrophoretic mobility shift assay and in vitro DNA binding DNA binding assays were perlormed as previously described 29 Wild tvpe or site directed mutagenized m DNA probes position 11487606 11487768 were synthesized by PCR end labeled and incubated with recombinant proteins produced in bacteria and purified according to the manufacturers specications Pharmacia Uppsala Sweden We used GST SVB a fusion protein with the 450 C terminal aa of Svb encompassing the DNA binding domain and GST alone as control Klectrophoresis gels were analyzed using a Bio imaging analyzer Fun Tokyo Japan Supporting Information Figure 1 Time Course Analvsis of the Distribution of Forked Singed and Miniature Proteins during Remodeling of Ventral Epidermal Cells Embryos were collected for 1 hat 18 C then allowed to develop at 25 C for a period corresponding to 11 12 and 14 h before being processed for actin
18. Q au centre de leur motif SNARE En noir les t SNARE de la famille de SNAP 25 dont le motif SNARE ressemble au motif SNARE N terminal de SNAP 25 encore appel s Qb SNARE cause du r sidu glutamine Q au centre de leur motif SNARE En vert les t SNARE de la famille de SNAP 25 dont le motif SNARE ressemble au motif SNARE C terminal de SNAP 25 encore appel s Qc SNARE cause du r sidu glutamine Q au centre de leur motif SNARE et les t SNARE qui ont la fois un domaine Qb et Qc cas de SNAP 23 25 29 B Mod le du r le de prot ines de SNARE dans la fusion des v sicules Un complexe h t rologue est form par l association des prot ines SNARE de la v sicule et la membrane plasmique arrimage Ce complexe rapproche les deux membranes par un m canisme semblable celui d une fermeture clair amor age Enfin les deux membranes fusionnent et le contenu de la v sicule est d vers fusion d Apr s de Bock JB 2001 finalement tre subdivis e dans deux couches l exo cuticule dans la partie sup rieure et l endocuticule en dessous Comme chez la Drosophile les microfibrilles de chitine et laminae deviennent visible longtemps apres la synthese chitine ait d but sugg rant que la synthese et l assemblage de chitine puissent tre des processus s par s Havemann et al 2008 c Les voies de s cr tion apicale La formation de la cuticule requiert une tr s forte activit s cr trice sugg rant une sp ci
19. ce qu elles ont t longues Merci de n avoir jamais dout de moi Cette th se est pour vous AUTEUR Isabelle Fernandes TITRE Etude fonctionnelle des prot ines domaine Zona Pellucida au cours de la morphogen se pidermique embryonnaire chez la Drosophile DIECTEUR DE THESE Dr Serge Plaza LIEU ET DATE DE SOUTENANCE 28 Septembre 2009 13h30 RESUME La morphogen se consiste en l acquisition de la forme tridimensionnelle des cellules et des tissus au cours de l embryog n se Nous abordons cette question par l tude de la morphogenese des cellules pidermiques embryonnaires de drosophile La diff renciation de l piderme est gouvern e par des cascades de r gulation transcriptionnelle conduisant une morphologie st r otyp e du tissu alternant des cellules lisses et des cellules formant des extensions apicales trichomes Les travaux de l quipe ont tabli que le facteur de transcription Shavenbaby Svb joue un r le cl dans la d termination des cellules formant des trichomes au cours du d veloppement Afin de comprendre comment les cellules embryonnaires acqui rent cette forme sp cifique mon objectif a t de d crypter les m canismes mol culaires responsables de la diff renciation morphologique de l piderme de drosophile Dans une premi re partie nous nous sommes attach s identifier les g nes dont l expression est sp cifiquement dirig e par le facteur Svb dans les cellules trichomes
20. chez la Drosophile peuvent contribuer lutter contre des maladies humaines Nous avons vu que la m me mutation d un acide amin de la r gion N terminale du domaine ZP entraine des cons quences similaires dans des processus biologiques apparemment tr s loign s Cela nous rappelle l importance des d terminants structuraux sur la fonction des prot ines En effet si les tudes chez la drosophile ne soigneront pas les surdit s humaines elles peuvent permettre de comprendre en quoi une mutation donn e va produire des effets d l t res sur le processus d veloppemental impliqu D autre part j aimerais conclure en rappelant l extraordinaire unicit des m canismes du vivant par del la grande diversit de ses formes Ainsi la conservation de l expression de diff rentes prot ines ZPD entre les ovocytes des insectes et ceux des mammif res reste fascinante C est pourquoi l utilisation de nos outils pour l analyse fonctionnelle des prot ines ZPD dans la diff renciation et la f condation des oeufs de drosophile ouvre des perspectives passionnantes pour peut tre contribuer mieux comprendre les m canismes de la f condation et ses alt rations pathologiques 144 REFERENCES A Adams J C 2004 Roles of fascin in cell adhesion and motility Curr Opin Cell Biol 16 590 6 Aerts S van Helden J Sand O and Hassan B A 2007 Fine tuning enhancer models to predict transcriptional targets across multiple geno
21. d avoir pass une nuit blanche avec moi au CBD assez lugubre comme endroit en pleine nuit Je souhaitais aussi remercier mes amis non scientifiques pour leur soutien m me si parfois vous ne me compreniez pas j ai toujours pu compter sur chacun de vous pour m couter me changer les id es tre l tout simplement et en particulier petit Pierre Et pour finir ce long monologue qui je suis s re commence vous ennuyer je voudrais remercier ma famille et ma belle famille pour tout les moments de d tente que j ai pu partager avec chacun de vous pour votre patience et votre int r t port mon travail difficilement compr hensible Genevi ve et Yannick merci de m avoir accueillie si chaleureusement dans votre famille je promets de prendre bien soin du petit Grand Fr re merci de toujours toujours avoir t l pour moi de ne jamais m avoir jug e de m avoir soutenu sans me m me pouvoir me comprendre pourtant Merci toi Florent sans qui cette derni re ann e aurait t tout simplement impossible Merci de m avoir soutenu au quotidien d avoir support mes crises d angoisses existentielles mes d lires les plus fous dans les moments o mon cerveau avait totalement d connect Merci aussi de m avoir donn le courage de partir tenter notre chance Montr al et merci d tre toi l homme le plus calme et le plus patient du monde Papa Maman merci de m avoir soutenu tout au long de mes tudes et pourtant qu est
22. des microvillosit s r gulieres de la membrane apicale alors que la section transversale montre une surface lisse B Section longitudinale d un embryon au stade 17 B Grossissement de la surface apicale de B On distingue les undulae la surface desquelles la chitine a t d pos e C D Section longitudinale oblique d un embryon au stade 17 C On peut voir les microfibrilles de chitine qui sont orient es perpendiculairement aux undulae pr sentes la surface apicale des cellules D Sous la membrane apicale on d couvre les microtubules mt qui soutiennent les undulae aj jonction adh rente Echelle B C et D 1 um B 500 nm D apr s Moussian et al 2006 l ultrastructure des SJ bien qu ils montrent quand m me une alt ration dans leur fonction de barri re plus d tanch it d montrant que Yrt et Nrx ont des fonctions distinctes Laprise et al 2009 L ensemble de ces m canismes assure la d finition des diff rents domaines membranaires et la formation de diff rents types de jonctions cellulaires pour la coh sion et les fonctions sp cifiques du tissu pidermique 2 2 L piderme et la s cr tion de la cuticule une barri re protectrice de l insecte A la fin de l embryogen se les cellules pidermiques s cr tent et assemblent les composants de l exosquelette recouvrant enti rement la larve la cuticule Les cellules pidermiques pr sentent une tr s forte activit de biosynth se A partir
23. ine par son DTM est n cessaire son activit D autres prot ines ZPD pourraient contribuer au maintien du contact membrane cuticule dans l aile incluant Pio Dy Dp et Cyr dont la fonction et ou l expression a t tablie dans les cellules de l aile au cours de la m tamorphose Par une association semblable celle de ZP1 2 et 3 dans la Zona Pellucida Greve and Wassarman 1985 Jovine et al 2002 les prot ines ZPD de drosophile pourraient former des fibres int gr es la cuticule de l aile Il est possible que ces interactions potentielles puissent contribuer la distribution sp cifique de la moiti extracellulaire des ZPD m me en absence d ancrage membranaire Les r sultats obtenus avec la prot ine extracellulaire GFP MAC ter suggerent que cette prot ine diffuse avec son DTM car il semble indispensable sa fonction Donc si M est cliv e pour tre int gr e dans la procuticule une autre fraction des prot ines M doit tre au moins transitoirement ancr e la membrane Pour analyser le devenir des deux parties de la 132 u Li I U AS MinDeltaCter Figure 37 Sauvetage ph notypique des mutants m dans l aile adulte A C E G et I Photos d aile adulte B D F H et J Grossissement de la r gion internervure L3 L4 Cadre figure A A B Aile sauvage La limite A P est illustr e par le trait rose B Les contours cellulaires ne sont pas visibles seul les poils sont discer
24. l interaction locale entre le compartiment membranaire apical et la matrice extracellulaire et ainsi sculpter la forme des extensions cellulaires Ces r sultats r v lent pour la premi re fois l existence d une sous compartimentalisation fonctionnelle du domaine apical Ils tablissent aussi l importance de la variation locale de la composition de la matrice extracellulaire apicale pour contr ler le changement de la forme des cellules au cours du d veloppement MOTS CLES morphogen se cellulaire piderme matrice extracellulaire polarit DISCIPLINE ADMINISTRATIVE G nes Cellules et D veloppement SOMMAIRE INIT ONCE Eege 9 1 R gulation de la mise en place du patron des trichomes 11 1 1 Etablissement des grands axes de Tembrvon 11 a D finition de l axe Ant ro post rieur AP 12 D D dorso 12 1 2 Formation et morphogen se g n rale du tissu pidermique 13 1 3 D finition des compartiments cellulaires au sein du tissu la segmentation 14 a Les acteurs de la polarite ua ee 15 b Mise en place d un centre organisateur ss 16 c Sp cification des diff rents destins cellulaires ooooooonnnncnnnnncnonononocnnnnnnnnnnnnnnos 16 2 Les cellules pidermiques et la mise en place de leur polarite 18 2 1 D finition de la polarit apico ba
25. la face dorsale de l embryon figure 5 Les cellules de l amnios reuse se contractent pour progressivement disparaitre de la surface apicale et ensuite tre limin es par apoptose Kiehart et al 2000 Les deux moiti s lat rales de l piderme se retrouvent ainsi sur la ligne m diane de la r gion dorsale La suture dorsale de l piderme est initi e par la formation de filopodes Millard and Martin 2008 aboutissant finalement relier ensemble les parties gauche et droite de l piderme figure 5 1 3 D finition des compartiments cellulaires au sein du tissu la segmentation De mani re concomitante la formation du tissu pidermique les cellules s engagent progressivement dans la sp cification de destins diff rents en fonction de leurs coordonn es la fois D V et A P L action concert e de Bicoid et des genes r gulateurs va d clencher la transcription d une nouvelle s rie de facteurs de r gulation transcriptionnelle les d terminants parasegmentaires L expression localis e de ces d terminants divise l embryon blastoderme cellulaire en une s rie de 14 groupes cellulaires r p t s le long de l axe A P appel s les parasegments PS Ces PS ne correspondent pas exactement aux limites morphologiques des segments de la larve ou de l adulte Chaque PS est compos en r alit de la partie post rieure d un segment S et la partie ant rieure du segment suivant figure 6 Deutsch 2004 Les 14 M AR OM
26. nous montrons que dyl et fyn sont r gul s directement par Svb gr ce sa fixation sur des sites Ovo Svb Dans le cas du g ne dyl parmi les trois CRM pr dits seul le fragment Endyl2 pr sente une l activit transcriptionnelle Cependant 11 reste possible que les approches rapporteur ne permettent pas de d tecter toutes les r gions fonctionnelles in vivo La nature et la topologie des communications enhancer promoteur peuvent avoir une influence importante sur l expression du transg ne Nous montrons par exemple l obtention de r sultats diff rents suivant le promoteur r put naif utilis dans diff rentes constructions rapportrices La r gion EnNyo2Ext montre une activit transcriptionnelle significative et d pendante de Svb dans les cellules trichomes avec un vecteur la pla ant en amont du promoteur minimal hsp27 figure 24 alors que cette m me r gion ne permet pas l expression du rapporteur avec le promoteur minimal Asp70 Par contre le passage dans un vecteur utilisant le promoteur hsp27 ne modifie pas la nature des r sultats obtenus pour les r gions EnDyll et EnDyl3 qui restent inactives figure 25 Il est aussi possible que diff rents l ments contribuent la r gulation de la transcription d un g ne mais ne montrent pas d activit individuelle quand ils sont artificiellement 1sol s les uns des autres dans une construction transg nique Pour tester cette hypoth se nous avons regroup deux
27. res cellules s individualiser au pole post rieur Apr s quatre divisions suppl mentaires la membrane plasmique s invagine entre les noyaux pour former un pith lium cellulaire L embryon au stade blastoderme cellulaire est compos d environ 6000 cellules somatiques formant une monocouche de cellules pith liales polaris es entourant la masse vitelline Sugiyama and Jackle 1993 Les axes principaux de l organisme se mettent en place au cours des phases pr coces de l embryogen se sous l action concert e de trois r seaux de r gulation g niques pour l axe ant ro post rieur ant rieur post rieur et r gions terminales et d un r seau d terminant la formation de l axe dorso ventral 11 Ant rieur Post rieur membrane syst me _extraembryonnaire nerveux et tete futurs segments Dorsa piderme dorsal syst me nerveux et piderme ventral mesoderme Ventral appareil digestif vue lat rale vue transversale Figure 3 Territoires embryonnaires pr somptifs Vue lat rale gauche et transversale droite d un embryon au stade 5 Des le stade 5 les diff rents tissus qui vont composer l embryon sont d j d finis En jaune les futurs tissus de l appareil digestif En rose le mesoderme en bleu le neuroectoderme en vert l piderme dorsal et en blanc le tissu extra embryonnaire a D finition de l axe Ant ro post rieur A P Le r seau de r gulation du sy
28. 2006 Il existe d ailleurs des prot ines ne poss dant que cette moiti N terminale du domaine ZPD sugg rant une fonction intrins que de la sous r gion ZP N Bokel et al 2005 Nous avons voulu tester l effet d une mutation ponctuelle de cette sous r gion ZP N sur l activit in vivo de la prot ine M Chez l homme l a Tectorine est l un des composants de la membrane tectoriale une matrice extracellulaire recouvrant les cellules de l oreille interne Une mutation remplacant une tyrosine Y par une cyst ine C dans le domaine ZP N Y1870C est associ e un syndrome de surdit cong nitale Legan et al 1997 Chez la souris la mutation Y1870C altere l assemblage des filaments de o D tectorine et provoque une r duction de l paisseur de la membrane tectoriale Legan et al 1997 R cemment cette mutation t introduite dans le ZP N de ZP3 Y111C Elle entraine une r duction de la solubilit de cette prot ine in vitro ainsi qu une diminution de sa s cr tion dans des cellules ex vivo Monne et al 2008 Nous avons introduit la mutation correspondante Y 117C dans le ZP N de la prot ine M et test la fonctionnalit de cette prot ine modifi e M Tecta M tecta est incapable de compenser l absence de M endog ne montrant l importance fonctionnelle du sous domaine ZP N in vivo figure 39D L expression de M tecta dans les cellules de l aile sauvage provoque un effet dominant n gatif g n rant des d fa
29. 67 32 96 Verhoeven K Van Laer L Kirschhofer K Legan P K Hughes D C Schatteman l Verstreken M Van Hauwe P Coucke P Chen A et al 1998 Mutations in the human alpha tectorin gene cause autosomal dominant non syndromic hearing impairment Nat Genet 79 60 62 Wassarman P M 2008 Zona pellucida glycoproteins J Biol Chem 283 24285 24289 Wodarz A and Nathke 2007 Cell polarity in development and cancer Nat Cell Biol 9 1016 1024 33 977 Figure Click here to download high resolution image ZP domain only E oa MEA H Dye CG e BS _ CG15013 e BS Omar une CG9355 WS Le 1547 vu e 615115 e BEE Dusky like Cypher Fernandes et al Figure 1 ZP and other extracellular domains PAN ue GITIS weer EE E E E cone wma 0611063 ERANT com Treue ene fete cov Conn gw Cairt 1 hs 6 Mor pheyut 2611432 98 Figure2 Click here to download high resolution image m mutants Denticles INN we Fernandes et al Figure 2 UAS m 3 5 4 4 P 180 nyo tyn mutants Denticles Viability 13 14 99 Figures Click here to download high resolution image A M PAN Tyn o4 G E EG o FE ek e mm mr oo p greer 0
30. As indicated in Supp 2 Zye lacks the entire Zye coding region whereas Tyn and Tyn delete part of the first tyn intron We generated small deficiencies removing dyl neo mey nyo and Adyf Aneo Anyo Amey Anyo using the following lines stock list description 105707 103405 e02047 105431 e00001 f06996 f02800 f06024 obtained from EXELIXIS Deficiencies were generated through FRT recombination Parks et al 2004 between PBac elements Thibault et al 2004 and characterized molecularly using the following primers transposon specific primers were according to Parks et al 2004 specific genomic primers were CG12063 5 CAACAGCGACATCCAAAGAAC and 5 CG15013 5 TGAACAGCAGCCAAGTTCAG and CGGAGTGCCAGAGGATCTAC 105 CG1499 5 GTGACGAATGACCCTTGACC S GGTGGTATCCGTGATGCTGC CG7802 5 CATCTATGGGCAGCTTGGACAGG and 5 GCCTTCATAGCAGCTCTTGG In situ hybridization as well as immunostaining experiments confirmed the absence of gene expression in the respective mutants Rescue experiments We constructed the following stocks by classical crosses using Kr GAL4 gt gt UAS GFP Casso et al 2000 versions of FM7c and TM3 Sb balancers Bloomington Drosophila Stock Center http flystocks bio indiana edu m FM7 da GAL4 TM3 and m FM7 UAS m TM3 and tyn FM7 da GAL4 TM3 tyn FM7 UAS tyn TM3 Females m FM7 GFP da GAL
31. H Morgan et provoque une r duction de la taille de l aile Morgan T H et al 1916 Plus r cemment F Roch 2003 a montr que cette r duction de l aile est due l absence d longation des cellules pith liales la fin du stade pupal De plus les trichomes de l aile sont d form es et ramifi es montrant que M est n cessaire la r organisation de la forme des cellules de l aile Notre tude permis de d montrer que Svb dirige l expression de m dans les cellules denticules et ceci de mani re directe Miniature est une prot ine transmembranaire avec une queue intra cytoplasmique courte et une grande r gion extracellulaire contenant le domaine Zona Pellucida ZP Les prot ines domaine ZP ont initialement t identifi es chez les mammif res ou trois de ces prot ines constituent les composant majeurs de l enveloppe extracellulaire des oocytes pour revue Jovine et al 2005 Nous montrons ici que M est indispensable la formation correcte des denticules r v lant ainsi une fonction inattendue des prot ines ZPD dans la formation d extensions cellulaires polaris es L absence de M g n re des d tachements localis s au niveau des denticules entre la cuticule et la membrane cellulaire r v lant une d sorganisation de la matrice extracellulaire L accumulation de M sp cifiquement dans les denticules r v le l existence d un sous domaine membranaire particulier sugg rant que la composition m me de la cuticul
32. M Macdonald P M and Kerr K 1998 Mutational analysis of an RNA recognition element that mediates localization of bicoid mRNA Mol Cell Biol 18 3788 95 Mace K A Pearson J C and McGinnis W 2005 An epidermal barrier wound repair pathway in Drosophila is mediated by grainy head Science 308 381 5 Mann S and Morata 2000 The developmental and molecular biology of genes that subdivide the body of Drosophila Annu Rev Cell Dev Biol 16 243 71 Manogaran A and Waring G L 2004 The N terminal prodomain of sV23 is essential for the assembly of a functional vitelline membrane network in Drosophila Dev Biol 270 261 71 Margaritis L 1985 The egg shell of drosophila melanogaster III Covalent crosslinking of the chorion proteins involves endogenous hydrogen peroxide Tissue Cell 17 553 9 Markstein M Pitsouli C Villalta C Celniker S E and Perrimon N 2008 Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes Nat Genet 40 476 83 McCartney B M Dierick H A Kirkpatrick C Moline M M Baas A Peifer M and Bejsovec A 1999 Drosophila APC2 is a cytoskeletally associated protein that regulates wingless signaling in the embryonic epidermis J Cell Biol 146 1303 18 Medina E Williams J Klipfell E Zarnescu D Thomas G and Le Bivic A 2002 Crumbs interacts with moesin and beta Heavy spectrin in the apical memb
33. Mech Dev 770 71 83 Chanut Delalande H Fernandes l Roch F Payre F and Plaza 5 2006 Shavenbaby couples patterning to epidermal cell shape control PLoS Biol 4 e290 Delon l Chanut Delalande H and Payre F 2003 The Ovo Shavenbaby transcription factor specifies actin remodelling during epidermal differentiation in Drosophila Mech Dev 120 747 758 Delon l and Payre F 2004 Evolution of larval morphology in flies get in shape with shavenbaby rends Genet 20 305 313 Dubois L Lecourtois M Alexandre C Hirst E and Vincent J P 2001 Regulated endocytic routing modulates wingless signaling in Drosophila embryos Cell 705 613 624 Jazwinska A and Affolter M 2004 A family of genes encoding zona pellucida ZP domain proteins is expressed in various epithelial tissues during Drosophila embryogenesis Gene Expr Patterns 4 413 421 93 Jazwinska A Ribeiro C and Affolter M 2003 Epithelial tube morphogenesis during Drosophila tracheal development requires Piopio a luminal ZP protein Nat Cell Biol 5 895 901 Jovine L Darie C C Litscher E S and Wassarman P M 2005 Zona pellucida domain proteins Annu Rev Biochem 74 83 114 Jovine L Janssen W G Litscher E S and Wassarman P M 2006 The PLAC1 homology region of the ZP domain is sufficient for protein polymerisation BMC Biochem 7 11 Jovine L Qi H Williams Z Litscher E and Wassarman P M 2002
34. Nous mettons en vidence que la formation des trichomes n cessite en r alit la r gulation transcriptionnelle d un grand nombre de g nes dont les fonctions individuelles contribuent la r organisation du cytosquelette mais aussi celle des compartiments membranaires et extracellulaires Nous avons ensuite explor les m canismes mol culaires responsables de l expression sp cifiques de ces effecteurs cellulaires Nous montrons que Svb contr le directement l expression de plusieurs effecteurs en se fixant sur les r gions cis r gulatrices CRM de ces genes Par la combinaison d approches fonctionnelles et bio informatiques nous avons identifi certains de ces CRM et recherch les l ments individuels impliqu s dans leur fonction in vivo Nos r sultats constituent un des rares cas de d cryptage des m canismes r gulant la transcription d effecteurs du changement de forme cellulaire Enfin la partie majeure de mes travaux de th se a t d volue l analyse fonctionnelle du r le d une famille de prot ines de la matrice extracellulaire apicale dans la morphogen se des cellules pidermiques Ces prot ines sont caract ris es par un domaine extracellulaire le Zona Pellucida Domain ZPD Nous montrons qu un ensemble de huit prot ines ZPD est n cessaire la r organisation localis e de l architecture cellulaire Malgr la similitude de leur domaine ZP chaque prot ine pr sente une fonction sp cifique pour organiser
35. Tyn Dyl and Zye see Materials and Methods M protein was first detected at the apical surface where after it rapidly accumulated in a restricted apical region at the base of extensions Chanut Delalande et al 2006 M finally became predominantly localized in the medial region of the denticle Fig 4A although it did not extend to the basal most zone or to the tip of extensions We generated a transgenic construct encoding a fully active Miniature HRP fusion protein Fig 53 whose HRP activity allows direct detection by electron microscopy Dubois et al 2001 Confirming results from confocal analysis M HRP was seen to localize in denticles and accumulate in the medial region of extensions Fig 4B In addition M HRP was found associated with the aECM in the protein rich layers of cuticle Fig 4B These data thus suggest that Miniature specifically modifies the local composition of the aECM surrounding the extension of the apical membrane While the Dyl protein appeared concomitantly with M the apical accumulation of Tyn and Zye was slightly delayed Similarly to M Dyl Tyn and Zye were concentrated in restricted apical regions in the vicinity of growing denticles However Dyl was restricted to the tip of actin filaments whereas Tyn and Zye accumulated only at the base of extensions Fig 4A Double staining confirmed that ZPD proteins were present in 75 overlapping but distinct apical regions Fig 4C From the tip of the e
36. ZPD chez la drosophile pour mieux comprendre le r le de la matrice extracellulaire apicale dans le changement localis de la forme des cellules embryonnaires 62 III Les Prot ines a domaine Zona Pellucida dans l architecture de la denticule RESUME Le domaine Zona Pellucida ZP d finit une famille de prot ines membranaires conserv es au cours de l volution Cependant le r le de ces prot ines au cours du d veloppement reste encore mal caract ris Par une approche g n tique chez la drosophile nous montrons qu un ensemble de huit prot ines ZPD est n cessaire la r organisation localis e du compartiment apical au cours de la morphogen se pidermique embryonnaire Malgr la conservation structurale des domaines ZP ces prot ines poss dent des fonctions sp cifiques dans le remodelage de la forme apicale des cellules pidermiques En effet la perte de fonction de l une des prot ines ZPD ne peut tre compens e par la surexpression d une autre Chacune de ces prot ines se localise dans des r gions distinctes du domaine apical ne se recouvrant que tr s partiellement De plus l absence d une prot ine ZPD entraine un d tachement localis entre la membrane et la matrice extracellulaire apicale aECM Ainsi chacune de ces prot ines s accumule dans une sous r gion distincte du compartiment apical ou elle va organiser des interactions entre la membrane apicale et l aECM Nous montrons que cet chafaudage de p
37. and Cooley L 1994 Drosophila singed a fascin homolog is required for actin bundle formation during oogenesis and bristle extension J Cell Biol 125 369 80 Carlson E A 1959 Allelism Complementation and Pseudoallelism at the Dumpy Locus in Drosophila Melanogaster Genetics 44 347 73 Chanut Delalande H Fernandes I Roch F Payre F and Plaza S 2006 Shavenbaby couples patterning to epidermal cell shape control PLoS Biol 4 e290 D Delon I Chanut Delalande H and Payre F 2003 The Ovo Shavenbaby transcription factor specifies actin remodelling during epidermal differentiation in Drosophila Mech Dev 120 747 58 Delon I and Payre F 2004 Evolution of larval morphology in flies get in shape with shavenbaby Trends Genet 20 305 13 Deutsch J S 2004 Segments and parasegments in arthropods a functional perspective Bioessays 26 1117 25 DiBartolomeis S M Akten B Genova G Roberts M A and Jackson F R 2002 Molecular analysis of the Drosophila miniature dusky m dy gene complex m dy mRNAs encode transmembrane proteins with similarity to C elegans cuticulin Mol Genet Genomics 267 564 76 Dickinson W J and Thatcher J W 1997 Morphogenesis of denticles and hairs in Drosophila embryos involvement of actin associated proteins that also affect adult structures Cell Motil Cytoskeleton 38 9 21 Dobzhansky T 1929 A Homozygous Translocation in Drosophila Melanogaster P
38. anterior is to the left In addition to engrailed en posterior cells express Hedgehog Hh and patched ptc is expressed in a two cell wide stripe on each side of the Hh expressing cells Hh together with serrate Ser activates rhomboid Rho expression in a three cell wide stripe The Rhomboid protease activates the ligand of the d EGF receptor DER whose activation triggers the expression of swb resulting in the formation of six to seven rows of denticles Wingless which is expressed in the posterior most row of anterior cells diffuses asymmetrically and represses shavenbaby transcription to form naked cuticle B Whole mount in situ hybridization of svb top and m bottom mRNA cuticles are shown in the middle panels Inactivation of svb prevents the formation of most trichomes and abolishes m epidermal expression m expression foreshadows the pattern of trichomes in D melanogaster and D sechellia larvae Yellow brackets outline two dorsal segments C Close up of the cuticle region corresponding to the third A3 and fourth A4 abdominal segments top and m mRNA distribution bottom in wild type D melanogaster embryos left ptc Gal4 driven expression of UAS OvoA middle and expression of UAS svb under the control of wg Gal4 right Whereas in wild type m is expressed in each segment in a five to seven cell wide stripe the expression of OvoA prevents the formation of denticle rows 2 3 and represses m expression in the correspond
39. anti Dyl at 1 300 anti Tyn at 1 300 anti 1 20 a crb 1 500 Shg DCAD2 1 50 a Dig 4F3 1 100 the latter three from DSHB lowa Alexafluor 488 or Alexafluor 546 secondary antibodies at 1 1000 Molecular Probes and TRITC phalloidin Sigma Embryos were imaged with a Leica TSP2 confocal microscope In situ hybridization Dig or biotin labeled antisense RNA probes were synthesized from cDNA or genomic fragments and used for in situ hybridization experiments as described previously Chanut Delalande et al 2006 Fluorescent in situ hybridizations were processed using TSA following the manufacturer s specification Molecular Probe Electron microscopy Live mutant embryos were hand selected under a stereomicroscope equipped for epifluorescence Stage 16 embryos were fixed for 15 min in heptane saturated with glutaraldehyde hand devitellinized washed in water and dehydrated through ethanol series Following critical point drying CPD750 Emscope they were sputtered with a 2 9 nm platinum coat JEOL JFC2300HR and examined with a JEOL JSM6700F scanning electron microscope For transmission electron microscopy embryos were fixed and devitellinized as above and for M HRP detection were stained in DAB solution Following post fixation for 1 h in 1 osmium tetroxide and dehydration samples were embedded in 86 Epon Sections were stained with uranyl acetate and photographed with a JEOL 2100CRP200 keV
40. can be considered as highly significant p lt 0 001 The only exception is between ml and Df mr which is not statistically different in a good agreement with the fact the mf mutation is reported to be a null m allele B Histograms plot the respective effects of targets on denticle ane as estimated by the area and minber along the row Inactivation of each individual target decreases denticle size to various exrents a paenorype aggravated when mutations are cumulated The absence of shovenoil causes a severe reduction of the size resulting from multiple split denticles as indicated by the increase of the apparent denticle number and confirmed by scanning electron microscopy analyses Combination of m and sn and or f also leads to denticle splitting albeit at a lesser extent The simultaneous inactivation of m sn f and sha results in a strong reduction al the number of denticles that are replaced by naked regions indicating a functional interaction between these genes for denticle formation Found at DOE 10 137 1 journal pbio 00402 90 50002 1 1 MB JPG laan Acknowledgments We thank South P Blacker A McGregor D Stern L Delon l Walzer amd other members of our laboratory bor discussions amd critical reading of the manuscript We are grateful to Y Latapie and P Valenti for their help during the latest stages of this work We are grateful to Gs Guild D Stern E Wieschaus the Bloomington and National Inst t
41. concerted action of multiple genes all playing a direct role in the formation both of denticles and dorsal hairs A wild type sn mi f Ta an mi 380 wept anl mi fay T gt si A 7 s Ke x Riu e ET x F ek r A e ys gt d a d DE 7 5 QUE PI Pet VA Pa yee LO READE an AP E Re ALES sieut DAN P e d M HC eA gt E M Cat UE q cr ei s r ai f Pe i sm pra shavts Ti gm p AR etl MI i 1 H 5 1 d A dt 43 A e Ku di A y D An Figure 5 svb Downstream Targets Act Collectively in the Formation of Both Denticle and Dorsal Hairs A Denticle defects resulting from the combinations of individual mutations of sm ml sha views of the ventral region of the A4 segment Embryos triple mutant for m sn and f display an aggravated phenotype with respect to each simple mutant or double mutant This leads to poorly differentiated denticles which display an extremely thin tip and a small triangular base In addition the lateral spacing of mutant denticles is reduced a consequence of denticle splitting with two tiny extensions side by side The combined inactivation of sn L m and wsp further increases the severity of mutant phenotypes producing very small and highly abnormal denticles Similarly in embryos simultaneously lacking sn
42. cours de la structuration tridimensionnelle de la prot ine Le cadre rose montre l emplacement de la mutation ponctuelle Y111C Dans la prot ine M cette mutation correspond la substitution Y 117C et la prot ine mutante est nomm e M Tecta A C Rang es de denticules sauvages A et surexpression C ou sauvetage par le transgene UAS M Tecta D C Surexpression du transgene UAS Tecta La prot ine M Tecta n a aucun effet dans un contexte sauvage D Sauvetage la mutation m par l UAS Tecta L expression de M Tecta n est pas capable de sauver le ph notype ml E H Photos d aile adulte et Grossissement de la r gion internervure L3 L4 E Aile sauvage G La surexpression du transgene dans un contexte sauvage a un effet dominant n gatif dans la morphog nese L aile est l g rement plus petite et montre un aspect froiss H Les contours cellulaires sont visibles par l accumulation de mat riel apical mais les cellules montrent une forme toil e diff rente de la forme hexagonale des cellules m Ce ph notype sugg re que les cellules pith liales ont tendu leur surface mais pas de facon optimale domaine ZP a d autres prot ines ZPD Les donn es sur ZP3 montrent que la sous r gion N terminale du domaine ZPD ZP N est capable de se structurer ind pendamment du reste du domaine ZP Cette structure tridimensionnelle du ZP N est suffisante pour former des filaments par homo polym risation Jovine et al
43. culaires antagonistes OvoB est un activateur de la transcription alors qu OvoA agit comme r presseur de la transcription des m mes g nes cibles OvoB est la forme la plus courte produite par le locus et poss de en plus de son domaine de fixation l ADN un domaine trans activateur figure 15 La partie N terminale additionnelle d OvoA rajoute un domaine r presseur dominant en rouge figure 15 qui vient contrecarrer l action du domaine trans activateur produisant ainsi un r presseur de la transcription Andrews et al 2000 Dans l piderme embryonnaire le promoteur svb pr sente un pic transitoire d activit entre les stades 12 et 15 Le transcrit svb code l int gralit de la s quence OvoA laquelle s ajoute un exon additionnel tendant encore l extr mit N terminale de la prot ine figure 15 L expression ectopique d OvoB comme celle de Svb est suffisante pour induire la formation de denticules Par contraste l expression dirig e d OvoA dans les cellules denticules les transforme en cellules lisses montrant ainsi une action dominante n gative du r presseur OvoA vis vis de la fonction endog ne de svb Ces donn es sugg rent que Svb poss de une fonction activatrice et que les trois isoformes ovo svb sont capables de se lier aux m mes cibles g nomiques quand ils sont exprim s dans les m mes cellules En absence de svb ou suite l expression artificielle d OvoA ni les extensions pidermiques ni les
44. de sites de liaison a l chelle du locus n est donc pas indispensable l activit des CRM r pondants Svb Une autre id e r pandue est que le profil de conservation volutif evolutionary footprinting aide discriminer les sites de liaison fonctionnels au sein des r gions potentiellement cis r gulatrices Pourtant les motifs identifi s dans une r gion g nomique pr sentant une forte conservation se sont g n ralement r v l s inactifs dans nos analyses Cependant il est important de rappeler les limites d ordre technique concernant la qualit du s quencage des r gions non codantes tr s variable selon les douze esp ces de Drosophile De plus les algorithmes de recherche de conservation volutive sont bas s sur des approches initialement d velopp es pour l analyse des r gions codantes qui font l hypoth se initiale de l importance de la colin arit des r gions homologues En effet l ordre respectif et la distance entre les sites de fixation peuvent varier de mani re importante Hare et al 2008 En r sum nous avons montr ici que 1 les g nes cibles de Svb sont caract ris s par une accumulation de motifs potentiels de liaison Ovo Svb 11 ces sites sont dispers s travers les r gions non codantes de chaque locus 111 leur profil de conservation volutive ne permet pas de discriminer les sites fonctionnels au cours de l embryogen se Existe t il d autres motifs nucl otidiques d terminant l
45. de v ritables barri res entre les unit s adjacentes Deutsch 2004 Au sein d un segment chaque cellule va suivre un destin propre d terminant sa diff renciation morphologique c est dire pour les cellules pidermiques l adoption d une surface apicale lisse ou la formation d un trichome 15 C D i 1 f 4 h 4 d Me a KN ke vY JODDOOODUDUOOODOODODODQD e Wg En Rho Wa En Rho Hh Hh Figure 7 La signalisation intrasegmentaire dans l piderme embryonnaire ventral A Au stade 9 10 les expressions de Wg et En Hh sont interd pendantes et le gradient de Wg est sym trique B Au stade 11 l expression Wg devient ind pendante de celle de En Hh et le gradient de Wg devient asym trique En m me temps le domaine Ser est d limit par les actions r pressives la fois de Wg et de Hh C Au stade 12 Hh active l expression Rho dans deux rang es cellulaires post rieures au domaine En Hh et Ser active Rho dans la rang e ant rieure son domaine A la fin du stade 12 les fronti res PS ne sont plus visibles et les sillons de segment sont form s 1mm diatement en post rieur des cellules En D En fin d embryog n se la rang e la plus post rieure des cellules En les cellules Rho et Ser vont former les denticules La signalisation Wg sp cifie la cuticule lisse sur trois quatre diametres cellulaires vers l ant rieur et seulement la premiere rang e de cellules En vers le post ri
46. deficiencies deleting each of the neo nyo tyn and dyl genes Fig S2 In all ZPD mutants examined each denticle row was present but the denticles themselves displayed an altered morphology Fig 2A Re expression of M Dyl Tyn Neo Nyo and Zye in respective mutants restored wild type denticle shape Fig 2 amp S3 This indicates that denticles defects result from the lack of 71 each ZPD protein a weak effect of neighboring genes that are also affected in some deficiencies Fig S2 can not be formally ruled out In the absence of M denticles were small and lacked the median constriction adopting an abnormal triangular shape Fig 2A dyl mutants were characterized by very small unhooked denticles often with a split extremity Inactivation of tyn led to denticles with a flattened base and thin extensions pointing perpendicularly to the apical surface The denticles of zye mutants were thin and often twisted or broken While inactivation of neo did not affect the overall morphology of denticles it did lead to a marked decrease in their size Similarly nyo and mey mutants displayed smaller denticles without other obvious morphological defects We then analyzed embryos carrying combinations of mutations Fig 2A The phenotype of m tyn double mutants was aggravated compared to each single mutant Denticles displayed both the thin extremity found in tyn and the lack of medial constriction characteristic of m mutan
47. denticules Toutefois l expression ectopique de zye dans les cellules dorsales n est pas suffisante pour transformer les extensions dorsales en structures de type denticules donn es non publi es L expression de cyr tait initialement d crite comme tant limit e aux cellules produisant les trichomes dorsaux Jazwinska et al 2003 Nous montrons ici que son expression est dynamique aux cours des derniers stades embryonnaires Entre les stades 14 et 15 son expression est limit e aux cellules dorsales trichomes puis elle s att nue pour disparaitre compl tement au stade 16 et d buter sa transcription dans les cellules denticules et ceci jusqu au stade 17 Ce g ne semble donc requis pour ces deux types d extensions mais diff rentes tapes de leur formation sugg rant qu un m me g ne peut jouer plusieurs fonctions au sein d un m canisme 116 g n ral De plus dans la derni re annotation du g nome de la drosophile nous avons identifi un g ne ZPD suppl mentaire CG12814 Ce g ne est lui aussi co exprim et co r gul par Svb dans les cellules produisant des extensions ventrales et dorsales faisant de lui le neuvi me g ne ZPD impliqu dans ce m canisme cellulaire sp cifique supp3 Nous n avons pas observ de variations videntes du niveau d expression de ces 9 genes entre les diff rentes rang es cellulaires de la ceinture de denticules ou dans les diff rents types de trichomes Ceci suggere donc que ce n e
48. des m canismes d adressage des prot ines ZPD L aile pourrait tre un syst me plus adapt pour r pondre ces questions M est donc probablement adress e aux cellules voisines via un transport v siculaire qu il reste encore d finir De plus dans les cellules non productrices M est capable de se localiser sp cifiquement dans l extension cytoplasmique sugg rant un transport orient ou une interaction prot ine sp cifique Quel est le r le de la r gion N terminale du domaine ZP au cours de la morphogen se Nous avons vu que M est capable apr s avoir diffus de se localiser sp cifiquement ou sa fonction est requise M pourrait une fois dans l espace matriciel ext rieur se fixer via son 133 KT pc D A E E mZP3 aevi BITTEN IM ABER WIR S bh ebaugr N A B lt A y BEN a S ag AB 1 4 F a A CA oe Y A A d A UAS M Tecta D _ mUAS M Tecta FOUT e BRASS Pe Le ET x 4 e gt 4 lt 4 A ES E a y A e A IL S Figure 39 Fonction de la r gion N terminale du domaine ZP de M ZP N Structure de l h mi domaine ZP N de ZP3 Les fl ches repr sentent les feuillets D avec une couleur allant du bleu N terminal vers le rouge C terminal Les quatre cyst ines sont dans un cadre noir et num rot es de 1 4 Les crochets mat rialisent les ponts disulfures tablis au
49. des nutriments du milieu interne capt s la face basale des cellules une machinerie d exocytose orient e vers le domaine membranaire apical est mise en place La cuticule est sp cifique aux arthropodes et a sans doute largement contribu leur succes volutif Elle commence tre d pos e par les cellules pidermiques embryonnaires d s le stade 15 et jusqu la fin de l embryog n se La cuticule est une structure particuli rement complexe et ordonn e compos e de chitine et de nombreuses prot ines et lipides Locke et al 1994 Moussian et al 2006 Trois couches distinctes composent la cuticule la procuticule en contact avec la membrane plasmique l picuticule et l enveloppe couche la plus externe Ces diff rentes couches sont progressivement assembl es la surface apicale des cellules pidermiques partir du mat riel d vers par les v sicules de s cr tion a L piderme un organe de s cr tion Des analyses en microscopie lectronique ont permis de r v ler une organisation particuli re de la r gion apicale des cellules pidermiques embryonnaires les undulae figure 10 On a longtemps pens que ces cellules formaient comme de nombreuses autres cellules pith liales des microvilli apicaux Locke et al 1994 En r alit des coupes obliques la surface de la cellule montrent que les ondulations de la membrane apicale sont continues et courent perpendiculairement l axe A P de l e
50. detectable difference in expression levels Two additional ZPD genes displayed overlapping but distinct transcription patterns zye expression started later and was detected only in trichome cells of the ventral region Fig 1C cypher cyr displayed a dynamic pattern of expression in trichome cells mRNA was first restricted to dorsal cells Fig 1C then it shut down dorsally and was eventually detected only in ventral cells not shown As the expression of these ZPD genes strikingly matches the trichome pattern that is specified by svb we examined their dependence on svb activity We found that epidermal expression of each of the 8 ZPD genes was abolished or severely reduced in svb mutant embryos Fig 1C Hence these results show that svb controls the expression of a large and diverse subfamily of ZPD genes in trichome cells Each ZPD protein exerts a specific function in denticle cells The co regulation of ZPD genes in trichome cells suggests that they act with m in the formation of apical extensions To investigate the putative role of ZPD genes in epidermal morphogenesis we analyzed the consequences of their inactivation Notwithstanding morphological features specific to each row all wild type denticles share a common organization a large base followed by a median constriction supporting the distal hook which points anteriorly or posteriorly Fig 2A We used strong hypomorph alleles of tyn or and generated small
51. effet ces trois g nes poss dent un seul anc tre commun et ne sont donc pas s par s chez les culicidae moustiques ou les col opteres tribolium Malgr le nombre de g nes ZPD impliqu s et la proximit structurale des prot ines associ es nous avons montr que la plupart des 8 g nes ZPD exercent des fonctions non redondantes dans la morphogenese des cellules pidermiques D s lors les variations de s quence entre ces 8 g nes deviennent une mine potentielle d information concernant leurs m canismes de sp cificit fonctionnelle Enfin dans cette derni re section nous nous focaliserons sur la distribution subcellulaire des prot ines ZPD analys es et les cons quences potentielles de ces r sultats Nous avons vu que chaque prot ine ZPD est requise pour l interaction entre un sous domaine sp cifique de la membrane apicale et l aECM Nous montrons que cette activit correspond la localisation sp cifique d une prot ine ZP donn e dans la r gion apicale correspondante L importance de ces r sultats peut se r sumer pour trois points 1 Cette famille de prot ines ZPD d finit des sous compartiments concentriques au sein du domaine apical Il est possible que comme les interactions fonctionnelles entre les complexes prot iques des d terminants apicaux qui contribuent tablir d identit baso lat rale de la membrane cellulaire les interactions entre prot ines ZPD participent la d limitation des sou
52. epidermal cells Table 51 and references therein Mutations corresponding to seven genes affect denticles without altering either the general cuticle organization or embryonic patterning Table 51 While the expression of frita hem tricornered and Stubble ubiquitous or undetect _Singed E E E E wyg Gald svb A sb Directs Epidermal Cell Differentiation able in the embryonic epidermis forked UL singed sn and shavenoibhojak display a segmental pattern of expression Table 51 Mutations in both sm and f lead to similar defects 22 with thin crooked abnormal denticles whereas sha mutants display a distinct phenotype 25 32 with small misshapen multiply split denticles Figure 4A and Table 52 Detailed analysis of mRNA distribution revealed that sn f and sha are specifically expressed in denticle cells Figure 4B The epidermal expression of their transcript is strongly reduced in sub mutants Figure 4B revealing that sub is necessary for en L and sha expression in denticle cells In addition sub is sufficient to promote and sha expression in the epidermis since their mRNA is robustly expressed in additional stripes following ectopic expression of sub Figure 4B The sob driven ectopic expression of fis barely detectable indicating that additional factors are required to promote f expression in naked cells Taken together these data show that th
53. expression in stage 15 embryos strikingly resembles the trichome pattern which is specified hy sib at previous stages Figure IB We found that m expression in epidermal cells is abolished in sub mutant embryos FigurelB showing that sub is required lor m transcription im the epidermis Detailed examination Figure IC revealed precise correlation between m expression and the denticle pattern in wild type embryos with a six to seven cell wide expression stripe in each segment that alternates with a band of m negative cells vod is a germinal isoform of the ovofsub gene that acts as a transcriptional repressor 13 able to counteract seh activity when its expression is artificially directed in the epidermis 13 14 When expressed in fitz expressing cells see Figure 9 PLoS Biology www plosbiology ora svh Directs Epidermal Cell Differentiation LA OvoA leads to the replacement of denticle rows and 3 by a stripe of naked cuticle interrupting each denticle belt Figure 1C This OvoA expression also represses m tran scription in the epidermal cells corresponding to denticle rows 2 and 3 providing evidence that sub activity is required cell autonomously for w expression in denticle cells To test whether sub is sufficient to induce m expression in the epidermis we examined the consequence of the ectopic expression of sub in smooth cells Ectopic expression of sob in we expressing cells Figure 1A causes the formation of a
54. expriment En figure 32 Cependant on observe un sauvetage ph notypique vident de la forme des denticules produites par les rang es de cellules imm diatement post rieures c est dire des rang es 2 3 et 4 Ces r sultats indiquent que M peut agir de mani re cellulaire non autonome au cours de la morphogen se pidermique embryonnaire Pour approfondir cette analyse nous avons tudi la localisation de la prot ine cod e par le transgene tirant parti de l absence de signal d tectable par notre anticorps dans les embryons m Dans les cellules de la rang e qui ne forment pas de denticule la prot ine transg nique pr sente une distribution cytoplasmique fortement enrichie la surface apicale figure 32D Dans les cellules de la rang e 1 nous observons en plus une forte accumulation de M dans les denticules similaire celle observ e pour la prot ine endog ne De plus un signal tr s sp cifique est visible dans les extensions des cellules non productrices et ceci jusqu la rang e 4 Des r sultats similaires ont t obtenus avec une fusion GFP Miniature g n tiquement fonctionnelle dont la sp cificit de d tection ne fait aucun doute figure 33 Ensemble ces r sultats confirment donc que M est capable de se localiser pr cis ment dans les extensions des cellules adjacentes sa source de production et d y restaurer la morphogen se correcte des denticules Si ces donn es d montrent une diffusi
55. f m and sha the few remaining extensions are atrophic and numerous denticles are replaced by naked cuticle B svb downstream targets are required for dorsal hair formation The dorsal region of a wild type abdominal segment displays a stereotyped arrangement of epidermal extensions presenting a specific morphology a row of large trichomes pointing anteriorly a stripe of naked cuticle three rows of extensions of intermediate size and several rows of thin hairs The cumulated Inactivation of svb targets profoundly impairs dorsal hair formation Hairs that display the superimposition of single mutant phenotypes are thickened fm crooked sn f and split wsp sha In sn 9 m triple mutants dorsal hairs are severely reduced in size and in several cases the formation of dorsal hair is abrogated leaving abnormal naked regions as best seen in the first row of trichomes These phenotypes are even more pronounced following the combination with wsp mutation and culminate in embryos lacking m sn and sha where most dorsal hairs are absent and replaced by naked cuticle In some cases atrophic dorsal hairs are seen as duplicated spots revealing hair splitting as observed in sha and f embryos All pictures correspond to the A4 segment DOI 10 1371 journal phina 0040290 93005 PLoS Biology www plosbiolegy org 0007 September 2006 Volume 4 Issue 9 e290 4 catenin F Actin Forked F Actin F Actin ESS Da
56. induced the following small deficiencies AdyF Aneo 9 Anyo Amey Anyo mey using the procedure described in Parks et al 2004 see Fig S2 A strain that combined Anyo mey and Aneo was obtained by meiotic recombination Each stock was confirmed by molecular characterization and mutant chromosomes were kept over balancers carrying Kr Gal4 UAS GFP transgenes Molecular procedures UAS constructs are pUAST derivatives generated from cDNAs for m tyn dyl neo nyo and DGRC consortium or using PCR amplified ORF from BAC RO2B14 for Plasmids encoding modified ZPD proteins and HRP fusions were generated using PCR and QuikChange XL site directed mutagenesis Stratagene All constructs were verified by sequencing see supplementary data for detailed procedures Antibody production and staining DNA fragments corresponding to protein regions S266 Ta5s for and P354 G497 for Dyl were cloned into pGEX6p1 and GST fusion proteins purified according to the manufacturers specification GE Care were used for immunizing rats and rabbits Agrobio For Zye rabbits were immunized with the synthetic peptide Al 85 EFDDSSPRLTRDTSLC Eurogentec and antibodies were affinity purified In each case antibody specificity was attested by the lack of signal observed in embryos lacking the corresponding protein Staining was performed according to Chanut Delalande et al 2006 with anti M Roch et al 2003 at 1 200
57. lat rale Discs large T Antagonistes Recrutement Maintenance Voie d assemblage Figure 9 Formation des complexes de jonctions apicales A Les cellules pith liales polaris es forment une monocouche dans laquelle l apical est s par la fronti re avec les membranes basales et lat rales par le complexe apical de Jonction Le sch ma montre l organisation mol culaire du complexe apical de jonction Chez la Drosophile ce complexe est compos de l apex vers le basal par une r gion sub apicale SAR dont Crumbs Crb est l acteur principal la jonction adh rente AJ ou ZA constitu e par les complexes Bazooka Baz et Cadh rine Cad et enfin les jonctions sept es compos es par le complexe Lethal giant larvae Lgl et Discs large Dlg B Sch ma simplifi des interactions entre les diff rents complexes de la jonction apicale permettant l adh rence cellulaire Le complexe Cadh rine recrute la membrane apicale les complexes Baz Crb et la membrane lat rale le complexe Lgl Dlg Le recrutement de Crb la r gion sub apicale subcellulaire de Lgl est plus large Bilder et al 2000 Toutefois Lgl semble n cessaire pour restreindre la localisation membranaire de Dlg et Scrib a 1 ALM car on observe une extension de leur distribution dans les mutants g Bilder et al 2000 Ces diff rents complexes prot iques interagissent fonctionnellement pour d finir et ou maintenir les limites entre les domaines memb
58. les discussions de couloir et les caf s amicaux Jon parce t es toi Myriam prends de la goutte il s appelle ploc Justine et Am lie parce que votre sagesse su me donner le recul n cessaire pour ne pas imploser ces derniers mois Aur lie ta BD sera bient t sous verre merci Kar ne pour nos petits moments shopping et vous tous membres du CBD Une petite pens e pour Bruno Glise qui a su rendre la Biologie du D veloppement attractive et int ressante mes yeux et sans qui je ne serais s rement pas l cette ann e Bien siir je ne peux achever ces remerciements sans parler de mes amis Merci a vous tous scientifiques ou non de m avoir soutenu tout au long de mes longues tudes parfois voire souvent tr s prenantes Merci tous les membres la com f te d Alpha T Magali Guillaume Tophe Simon Alex C dric Allan Coco Camille Marie et bien s r El onore et Flavie qui sont bien plus que des camarades de f tes des vraies amies Merci toi Flalife depuis Bristol pour ton assistance d pannage distance et pour toute l amiti que tu m as donn et que tu me donnes encore merci de m avoir cout parler de mes poils avant les grandes ch ances El il y tellement de choses dire merci d avoir partag mon quotidien pendant un an je ne suis jamais senti aussi dr le je me suis m me convaincue d avoir un vrai potentiel comique Merci pour ton soutien au cours des derniers jours de r daction merci
59. localisation des ZPD et de caract risation des ph notypes des mutants et qui ont du eux aussi support de m entendre me plaindre en permanence de mes embryons tout simplement parce que je ne voyais pas leurs poils du ventre de grands moments mais je crois avoir conquis tout le monde dans ma recherche du poil parfait Alors le poil en EM c est sympa mais ca manque un peu de couleur et je crois que la suite de th se vous le d montrera Merci Brice et en particulier Aur lie pour toute leur aide en microscopie confocale Apr s des mois production de peptides pas dr le d attente pour l immunisation ce propos je tiens rendre hommage l un des lapinous mort sans pouvoir servir la science apr s l injection de Trynity un week end de solitude et de tests j ai pu localiser 4 des prot ines pr f r es avec de belles couleurs tout comme j aime pour enfin tablir le mod le du poil arc en ciel Aur lie a m me mis mes poils pr f r s en 3DM merci Mais tout ca n aurait jamais t possible sans financement donc merci Lucas de m avoir accord ta confiance et ton financement pour mener bien ce projet qui n a strictement rien voir avec l h matopoi se mais qui je le sais t a convaincu Pour te citer apr s ma 1 r union d quipe sur mon projet de th se poil tordu est poil tordu quelque soit le sens dans lequel il est tordu Merci tu as su trouver les mots justes pour m obliger me battre et
60. matiquement deux tapes 1 la formation du tissu partir des territoires pr somptifs embryonnaires 11 la r organisation de la forme apicale de groupes de cellules pidermiques pour la formation des trichomes C est cette deuxi me tape de morphogenese cellulaire qui est au centre de nos int r ts Elle d termine la mise place des deux sous populations pidermiques les cellules lisses et celles formant des trichomes De plus la diff renciation g n rale des cellules pidermiques va permettre la synth se de l enveloppe protectrice du corps de l animal la cuticule Bien que ces deux aspects du contr le de la formation des trichomes se chevauchent temporellement au cours du d veloppement ils seront trait s dans deux sections distinctes Dans cette premi re partie nous allons donc rappeler les principes g n raux de la d termination progressive des populations de cellules qui vont finalement former dans chacun des segments les denticules ventrales ou trichomes dorsaux 1 1 Etablissement des grands axes de l embryon Apr s f condation les phases pr coces du d veloppement de l embryon de drosophile d butent par une s rie de divisions rapides et synchrones des noyaux sans division cellulaire g n rant ainsi un syncytium A partir de la dixieme division nucl aire la plupart des noyaux migrent la p riph rie de l embryon formant le blastoderme syncytial et les pr curseurs de la lign e germinale seront les premi
61. pour initier l analyse des fonctions de M au cours de la formation de l aile a Sauvetage et diffusion Compar e un individu sauvage la taille de l aile est fortement r duite dans le mutant m figure 37A C Ce ph notype est probablement li un d faut d aplatissement des cellules en fin de m tamorphose comme le sugg re un d faut de la cuticule qui souligne les contours cellulaires figure 37D L expression dans le compartiment post rieur d un transgene codant une forme sauvage de M restaure largement la taille de l aile figure 37E De plus cette expression de m am liore aussi notablement le compartiment ant rieur A fort grossissement la diff rence d organisation cellulaire est facilement d celable figure 37F Les cellules post rieures pr sentent la taille et toutes les caract ristiques des cellules sauvages alors que les cellules ant rieures montrent encore des d fauts r siduels de la cuticule Toutefois cette accumulation de bourrelets membranaires l apex des cellules ant rieures est moins 130 A A gt es t Ll gt gt b Y S x d Y v gt d 5 ar P A Y e E ud Ma 3 A C D gt UAS M 2 Ne e ar A 4 NS A x A A a AH E ES UAS GFP pi 4 gt Sa AT A m G H UAS GEP MACter de Y lt a gt A a A gt A gt A gt gt 4 Mec Figure 35 Fonction du Domaine TransMembranaire de
62. que des prot ines ZPD Tyn et Zye sont n cessaires au maintien des AJs dans les cellules pidermiques denticules En plus de la d localisation des marqueurs apicaux nous avons observ une alt ration g n rale de la forme du compartiment apical des cellules denticules Avant la formation des denticules ces cellules adoptent une forme rectangulaire et leur surface apicale est r duite de moiti alors que les cellules lisses ne subissent aucun changement morphologique Dans les mutants tyn ou zye nous avons observ que les cellules denticules conservent une forme et une surface quasi identique celles des cellules lisses r v lant ainsi un d faut du remodelage apical qui leur est caract ristique figure 7 de l article De plus l tude ultrastructurale des d fauts met en vidence un d tachement des AJs d montrant que ces deux prot ines ZPD contribuent leur maintien Nous avons aussi test si Tyn et plus g n ralement les prot ines ZPD taient toujours correctement localis es dans un contexte mutant pour l une des prot ines de jonctions Un seul all le mutant pour shg b n ficie d une contribution maternelle suffisante pour atteindre le stade 15 et la formation des denticules figure 31 Dans ce contexte et malgr des d fauts plus g n raux les prot ines ZPD sont correctement adress es sugg rant que l int grit des AJs n est pas essentielle leur localisation Il est possible que les d fauts observ s
63. quelles cellules pidermiques formeront des trichomes Comment ces deux m canismes sont ils fonctionnellement reli s au sein de chaque cellule Dans le cas de la formation des denticules nous avons vu que les r seaux de r gulation du d veloppement pr coce mettent en place un ensemble de signalisations cellulaires notamment Wnt et EGF r Notch contr lant respectivement les destins morphog n tiques lisse ou 28 svb ovo ovoB D activateur lt o gt Sb 15 2 J 3 14 domaine domaine de represseur liaison l ADN Figure 15 Locus Ovo Svb et facteurs de transcription associ s Organisation mol culaire du locus et des prot ines Ovo Svb Les trois transcrits sont initi s depuis des promoteurs ind pendants fl ches un promoteur somatique svb et deux promoteurs germinaux ovoA et ovoB Les transcrits sont repr sent s avec en gris les exons communs et en couleur les exons svb ou ovo sp cifiques Les prot ines sont repr sent es avec les diff rents domaines fonctionnels En vert le domaine d activation en rouge le domaine de r pression et en bleu le domaine de liaison l ADN Le transcrit de svb poss de un exon suppl mentaire en violet et rallonge la prot ine en N terminal d un domaine dont la fonction est inconnue en violet denticule Wg sp cifie le destin des cellules lisses En effet en absence de wg l piderme embryonnaire est recouv
64. r gions inactives dans une m me construction L association des deux r gions Endyll et Endyl3 n am liore pas significativement leur activit car m me si on note une l g re exaltation du marquage l expression ne d pend pas de Svb figure 25 Toutefois pour un autre gene cible de Svb forked f nous montrons que l association de deux r gions inactives quand elles sont test es individuellement Enf4 et Enf5 permet de r v ler un effet clair de 61 ventral lat ral Dorsal Figure 26 Expression des CRMs EnF4 EnF5 et EnF45 Le CRM EnF4 montre une activit transcriptionnelle faible et d pendante de Svb dans les trois compartiments alors que cette m me r gion ne montrait aucune activit avec le promoteur de Hsp70 La r gion EnF5 ne montre elle aucune activit r gulatrice Par contre la combinaison des deux s quences EnF45 permet de diriger une expression reproduisant celle du g ne f endogene montrant qu il existe une coop rativit entre ces deux r gions g nomiques EnF5HSP27 EnF4 HSP27 EnF45 HSP27 coop rativit L association Enf4 5 montre une expression dans les cellules a trichomes robuste et d pendante de l activit de Svb figure 26 Ces r sultats illustrent que la strat gie exp rimentale retenue pour tester l activit transcriptionnelle des r gions pr dites n est pas neutre et pr sente de fait une influence significative sur la nature des r sultats obtenu
65. rentes affections incluant des surdit s cong nitales ou des malformations r nales pour revue Jovine et al 2005 Par l analyse syst matique de l ensemble des genes ZPD de drosophile nous montrons que Svb dirige l expression de huit d entre eux dans les cellules pidermiques formant les trichomes L expression de ces huit genes est comprise entre le stade 14 et le stade 16 avec augmentation notable au stade 15 Cette fen tre d expression correspond aux deux v nements majeurs de la diff renciation d pidermique le remodelage de la face apicale ainsi que le d but de la d position de la cuticule Moussian et al 2006 Alors que les genes m dyl nyo neo mey et tyn sont transcrits dans toutes les cellules formant des trichomes cyr et zye montrent une expression diff rentielle entre des cellules produisant des trichomes dorsaux et des denticules zye est sp cifiquement exprim dans les cellules denticules sugg rant une fonction sp cifique dans leur morphogen se La formation des extensions est r gie par un m canisme g n ral identique pour le ventre et dos l assemblage de l actine en faisceaux et leur croissance perpendiculairement la face apicale des cellules Chanut Delalande et al 2006 Ces structures diff rent n anmoins dans leur forme g n rale les denticules tant plus larges et crochues que les trichomes dorsaux Zye pourrait alors jouer un r le sp cifique dans l largissement et ou la courbure des
66. rho code une prot ase transmembranaire requise pour l act vation du ligand Spitz qui active son tour de la voie du r cepteur EGF r figure 7C De chaque cot des cellules productrices Hh active l expression de Rho sur deux diam tres cellulaires alors que Wg la r prime vers l ant rieur Sanson 2001 Cette signalisation antagoniste permet ainsi de d limiter l expression de Rho dans trois rang es cellulaires en post rieur du domaine En cr ant l asym trie n cessaire la polarit de chaque segment figure 7D A la fin du stade 12 les cellules de chaque segment sont ainsi subdivis es en cinq domaines dont quatre produisent des ligands activateurs de diff rentes voies de signalisation Spi EGF r Ser Notch Wg Wnt ou Hh C est l interaction entre ces voies de signalisation qui va permettre de cr er et d affiner la sp cification de chaque sous population avec une r solution la cellule pr s C Sp cification des diff rents destins cellulaires Le gradient du morphog ne Wg volue au cours de l embryogen se r gulant ainsi l expression de diff rents g nes cibles dans les cellules receveuses Lorsque Wg est n cessaire au maintien de l expression de En son gradient est sym trique par rapport la fronti re parasegmentaire Puis au stade 11 la distribution de Wg devient asym trique de part et d autre de la fronti re du PS figure 7B C Sanson et al 1999 Cette asym trie est
67. s dirigent une expression pidermique dans les cellules trichomes reproduisant celle du g ne sha endog ne r sultats non pr sent s La prot ine Svb se fixe in vitro sur ces r gions cis r gulatrices sugg rant fortement que sha est une cible directe de Svb Cette analyse illustre aussi que la conservation volutive d un site consensus n est pas suffisante pour pr dire la localisation des CRM actifs in vivo En effet les fragments BSO et BS2 eux aussi identifi s sur cette base et capables de fixer Svb in vitro ne pr sentent aucune activit pour la transcription d un gene rapporteur in vivo 55 Scale 10 kb chraL 3280000 4205000 4290000 4295000 svb positives di MN svb negatives 15013 1 oy MN 15013 2 BJ dyl3 ovo motifs ovo Matifs 1111 II B O OMM motif OMM Motifs H FlyBase Protein Coding Genes cal Figure 18 Sch ma de l organisation g nomique du g ne dyl et expression des CRM La r gion EnDyll ne montre aucune expression Le CRM EnDyl2 reproduit l expression du gene dyl sous la d pendance de Svb L ensemble de ces donn es montre que la conservation volutive de motifs nucl otidiques correspondant au site de fixation Ovo Svb n a qu une faible valeur pr dictive pour identifier des CRMs fonctionnels in vivo Nous avons alors d velopp des approches alternatives conjuguant d autres m thodes de pr diction et d analyses in vivo afin d identifier de nouvelles cibles g no
68. soient une cons quence m canique du remodelage infra apical qui n cessite un maintien plus robuste des jonctions Pour tester cette hypoth se nous avons d fini la localisation des marqueurs apicaux dans un contexte mutant pour svb ou l ensemble des prot ines ZPD n est donc plus pr sent Nous n avons observ ni des d fauts de la forme apicale des cellules ni de l accumulation des marqueurs jonctionnels Ces donn es sugg rent donc que le remodelage de la forme apicale est ind pendant de Svb et que les d fauts observ s dans les mutants fyn et zye sont probablement une cons quence m canique de la pouss e des faisceaux d actine la face apicale Ce remodelage de la r gion infra apicale ajoute une contrainte physique suppl mentaire aux jonctions apicales qui pour maintenir le lien intercellulaire n cessitent l interaction des prot ines ZPD L ensemble de ces donn es montrent que les modifications locales de l aECM sont n cessaires l organisation polaris e des cellules pith liales ainsi qu leur morphogenese La distribution sp cifique des prot ines ZPD ouvre de nouvelles perspectives dans l analyse et la compr hension de la machinerie d adressage sp cifique des prot ines vers des sous domaines infra apicaux de la membrane et leur interaction avec les d terminants de polarit et 123 des jonctions cellulaires L ensemble de ces r sultats montre que les cibles de Svb identifi es jusqu ici agissent collectiv
69. terminal half of ZPD ZP N acts as a polymerization module Jovine et al 2006 Monne et al 2008 while the C terminal half which allows alternative disulfide bond connectivity may be a primary determinant of specificity Our in vivo analyses support that the importance of the ZP N is widely conserved throughout species as a Y gt C mutation 80 originally identified in human TECTA Verhoeven et al 1998 compromises function of the Drosophila Miniature protein Furthermore mutated MT exerts a dominant effect when expressed in wild type animals suggesting that like in vitro Monne et al 2008 this substitution within the ZPD N term affects the polymerization properties of ZPD proteins The ZP domain also influences the specificity of ZPD proteins since replacing the ZP domain of Trynity by that of Miniature is sufficient to confer partial rescue of m defects in vivo However the reverse substitution does not compensate for the loss of Trynity activity which critically relies on the presence of PAN domains In addition the region C terminal to the ZP domain also contributes to ZPD protein specificity and accordingly it is strongly conserved between insect orthologs Fig 58 In the same vein mZP3 exon7 a region located downstream the ZP domain is responsible for mZP3 protein specificity Litscher et al 2009 Our results thus show that the functional specificity of epidermal PD in flies is determined by multiple protein regi
70. the embryonic epidermis Miniature is required for the contin uous membranelcuticle interaction that is specific to den ticles whereas only the tips of microvilli contact cuticle in naked regions 5 The accumulation of Miniature at the base of denticles reveals the existence of a denticle specific membrane subdomain suggesting that additional membrane proteins might be involved in denticle formation We found that two other ZP genes are regulated by sib Table 81 and analysis of their individual role in denticle formation is under way Our findings shed light on the importance of membrane proteins and their interaction with exiracellular matrices an aspect of cell shape control hardly accessible to cell culture approaches Future analysis of Miniature targeting to the denticle should help to understand the mechanisms required for localized cell shape modification during morphogenesis sub also regulates the expression of y a gene encoding an apically secreted protein that associates with cuticle and is required for the production of black pigments 24 While pigmentation per se is not related to cell morphogenesis the tole of Yellow in the catecholamine pathway remains elusive it could be involved in denticle hardening since y mutant larvae display defects in the morphology of denticles that have been proposed to account tor their abnormal locomotor activity H In addition seb could directly regulate the local protein composition o
71. the BAC RO2B14 and subcloned into pUAST using the same cloning sites To generale deleted and chimerical proteins the cDNA sequence encoding the ZP domain of m and tyn were deleted and replaced by a linker containing Aval or Ndel restriction sites These restriction sites were used to introduce another ZP domain PCR amplified with the linker sites Introduction of restriction sites and deletion of the 3 PanAP region in tyn were performed using QuikChange XL Site Directed Mutagenesis Kit from Stratagene PanAP domains or HRP sequence were amplified by PCR and inserted between the signal peptide and the ZP domain at Ncol in m CDNA For HRP tyn a Smal site was created in the tyn cDNA between the signal peptide and PanAP domains and used to insert the DNA fragment encoding full length HRP from Connolly et al 1994 m was created by PCR directed mutagenesis the Y117 codon UAU was converted into UGU leading to Y117 C substitution in the M protein All constructions were verified by sequencing using an Applied Biosystem ABI sequencer Details of primers used are available upon request Deficiencies and ZPD mutants The two P elements insertions P GawB SP71 and P EPgy2 7 were induced to jump out through crossing with a line carrying a source of A2 3 P transposase Precise P element excisions resulted in both cases in the restoration of a wild type phenotype Imprecise excisions were further characterized by southern blot and PCR
72. these data reveal that denticle formation are specific to the lack of m activity requires besides actin remodeling a specific modification of the membrane cuticle interaction that is directly dependent on the localized activity of Miniature All together these results show that sub directs the expression of cellular effectors involved in different steps and aspects of cell shape control which are collectively responsible for denticle formation XE PLoS Biology www plosbiology org svb Controls Denticle Pigmentation in the Embryonic Epidermis through the Regulation of yellow Transcription In addition to the reorganization of cell shape denticle formation implies pigmentation of cuticle extensions We noticed that the supernumerary cuticular extensions formed after ectopic expression of sub are as darkly pigmented as normal denticles Figure FA thus suggesting that sob also controls the expression of pigmentation genes in the ventral epidermis Coticle pigmentation results from the activity ol the catecholamine biosynthetic pathway which transforms tyro sine into derivatives that are responsible for both sclerotization and coloration of the cuticle reviewed in 24 We examined the embryonic expression of ten genes putatively involved in pigmentation 24 among them four are expressed in the epidermis pale ple dopadecarboxylase de alpha metholrexate deficient oma and yellow y Figure While th
73. which encodes an activator of the Arp2 3 actin nucleation complex 31 is specifically expressed in denticle cells in a siuh dependent manner Figure 4D The epidermal expression of wsap is strongly reduced in sib mutants and ectopic expression of sub leads to additional bands of ws mRNA in naked cells albeit at a much weaker level than in denticle cells Figure 1B Cuticle analysis revealed that zvgotic wh mutations 35 lead to the alieration of denticles which are abnormally thin and often display bent extremities Figure 4A These defects are likely due to the lack of activation of the Arp2 5 complex since the zygotic inactivation of two ubiquitous Arp2I3 subunits ArcP54 and ArcP41 causes denticle alterations similar to those observed in usb mutants unpublished data Consistent with the idea that actin reorganization 15 required or denticle formation our results show that Sach activates the expression of a subset of genes controlling actin dynamics whose individual inactivation produces defects in denticle morphology svb Regulated Genes Functionally Collaborate in Denticle Formation Inactivation of each sub target we identifed leads to specific defects in the morphology of denticles but is not sufficient to inhibit their formation This suggests either that these genes are involved in nonessential aspects of denticle formation leg hne shaping or alternatively that denticle formation sb Directs Epidermal Cell Different
74. with the ptegal4 driver both in denticle rows 2 and 3 and in a two cell wide stripe in naked cells see Figure 1 does not affect cuticle organization Figure Therefore m expression is required but not sufficient for the correct formation of denticles These results show that m is directly involved in a specific aspect of denticle formation All together these data further ff i m MR d A A es kA w 0 4KminK O gald min a A De A Y ds ii Y amp 41 ds vr Z gt E A rh A Consequences of alterations of m function and expression on denticle formation The m mutation leads to morphological alteration of denticles with a characteristic abnormal triangular shape A similar phenotype is observed with Df TJm MR a deficiency in which the entire m locus is deleted Overexpression of m by crossing the Ptc Gal4 driver line to EP345 m does not modify the cuticular phenotype in the corresponding regions arrowheads Re expression of wild type m products driven by the 0 4Kmin gal4 transgenic lines but not O 4KminKO Gal4 lines rescues the characteristic denticles defects of m embryos All pictures correspond ta the A4 segment B High magnification views of wild type wt and m denticles fourth rows of A4 as observed in either light left or scanning electron microscopy right Whereas the absence of m does not affect the denticle height the width w is reduced prod
75. 007 cytoplasmique par la mCherry et extracellulaire par la GFP Les r sultats pr liminaires obtenus dans l piderme embryonnaire mettent en vidence une diff rence claire des deux marquages fluorescents aussi bien l chelle cellulaire que subcellulaire figure 36 Le signal GFP se localise sp cifiquement sur les denticules des cellules productrices mais aussi sur les denticules des cellules post rieures adjacentes Par contre le signal m Cherry n est d tect que dans les cellules productrices et de mani re punctiforme figure 36 Ces r sultats suggerent donc que M est cliv e et que seule la partie extracellulaire se relocalise sur les denticules De plus la distribution punctiforme de la partie ancr e pourrait correspondre des v sicules adressant la prot ine vers le domaine apical ou des v sicules de recyclage charg es de d grader la partie intra cytoplasmique Il est cependant indispensable de r p ter ces exp riences et de changer la nature de la d tection en utilisant des anticorps plut t que les fluorescences endog nes pour exclure l existence de biais exp rimentaux cette distribution diff rentielle des deux r gions de la prot ine M 3 Fonction de M chez l adulte M est n cessaire la r organisation de la forme des cellules pith liales de l aile ainsi qu la formation correcte des extensions leur face apicale Nous avons profit des outils de g n tique mol culaire construits
76. 4 TM3 GFP or tyn FM7 GFP da GAL4 TM3 GFP were crossed by males of the following genotypes FM7 GFP UAS dyl TM3 GFP and FM7 GFP UAS neo TM3 GFP and FM7 GFP UAS nyo TM3 GFP and FM7 UAS Zye TM3 GFP and FM7 UAS Tyn TM3 GFP and FM7 GFP UAS tyn APAN TM3 GFP and FM7 GFP UAS m PAN Tyn TM3 GFP and FMT7 GFP UAS m ZP Tyn TM3 GFP and FM GFP UAS tyn ZP M TM3 GFP and FM7 GFP UAS M HRPITM3 GFP and FM7 GFP UAS M TM3 GFP The percentage of viability was calculated from comparing numbers of males tym da GAL4 UAS cDNAxxx to that of their sibling sisters tyn FM7 da GALA UAS cDNAxxx For mey the absence of available full length cDNA precluded to rescuing assays On the other hand we did not succeed in generating mutations that abolish cyr expression For the genes zye dyl neo nyo that are all located on the third chromosome each deficiency was recombined with the appropriate UAS cDNA or da GAL4 construct and after molecular validation of the meiotic recombinants kept over TM3 Kr GAL4 gt gt GFP balancer In theses cases rescue experiments were performed according to the following cross Df xxx UAS xxx TM3 GFP X Df xxx da GAL4 TM3 GFP Stocks were Adv UAS dyl TM3 GFP and da GALA TM3 GFP and Aneo UAS neo TM3 GFP and Aneo da GAL4 TM3 GFP and Anyo UAS Nyo TM3 GFP and Anyo da GAL4 TM3 GFP Mutant embryos carrying both UAS and GAL4 transgenic constructs were selected under a LEICA stereomicroscope equipped for epi
77. 50 391 401 I Inestrosa N C Sunkel C E Arriagada J Garrido J and Godoy Herrera R 1996 Abnormal development of the locomotor activity in yellow larvae of Drosophila a cuticular defect Genetica 97 205 10 Irvine K D and Wieschaus E 1994 Cell intercalation during Drosophila germband extension and its regulation by pair rule segmentation genes Development 120 827 41 J Jackle H and Sauer F 1993 Transcriptional cascades in Drosophila Curr Opin Cell Biol 5 505 12 Jahn R and Scheller R H 2006 SNAREs engines for membrane fusion Nat Rev Mol Cell Biol 7 631 43 Jahn R and Sudhof T C 1999 Membrane fusion and exocytosis Annu Rev Biochem 68 863 911 Jazwinska A and Affolter M 2004 A family of genes encoding zona pellucida ZP domain proteins is expressed in various epithelial tissues during Drosophila embryogenesis Gene Expr Patterns 4 413 21 Jazwinska A Ribeiro C and Affolter M 2003 Epithelial tube morphogenesis during Drosophila tracheal development requires Piopio a luminal ZP protein Nat Cell Biol 5 895 901 Jovine L Darie C C Litscher E S and Wassarman P M 2005 Zona pellucida domain proteins Annu Rev Biochem 74 83 114 147 Jovine L Janssen W G Litscher E S and Wassarman P M 2006 The PLACI homology region of the ZP domain is sufficient for protein polymerisation BMC Biochem 7 11 Jovine L Qi H Williams Z Litsch
78. 83 24285 9 Wassarman P M Jovine L and Litscher E S 2004 Mouse zona pellucida genes and glycoproteins Cytogenet Genome Res 105 228 34 Wieschaus E and Sweeton D 1988 Requirements for X linked zygotic gene activity during cellularization of early Drosophila embryos Development 104 483 93 Wodarz A Hinz U Engelbert M and Knust E 1995 Expression of crumbs confers apical character on plasma membrane domains of ectodermal epithelia of Drosophila Cell 82 67 76 Wulfkuhle J D Petersen N S and Otto J J 1998 Changes in the F actin cytoskeleton during neurosensory bristle development in Drosophila the role of singed and forked proteins Cell Motil Cytoskeleton 40 119 32 X Xu H Boulianne G L and Trimble W S 2002a Drosophila syntaxin 16 is a Q SNARE implicated in Golgi dynamics J Cell Sci 115 4447 55 Xu H Brill J A Hsien J McBride R Boulianne L and Trimble W S 2002b Syntaxin 5 is required for cytokinesis and spermatid differentiation in Drosophila Dev Biol 251 294 306 Z Zanet J Stramer B Millard T Martin P Payre F and Plaza S 2009 Fascin is required for blood cell migration during Drosophila embryogenesis Development 136 2557 65 Zhao M Gold L Ginsberg A M Liang L F and Dean J 2002 Conserved furin cleavage site not essential for secretion and integration of ZP3 into the extracellular egg coat of transgenic mice Mol C
79. 87 Acknowledgements We are grateful to the Bloomington Drosophila Stock Center Developmental Studies Hybridoma Bank and Drosophila Genomic Resource Center for providing us with flies antibodies and molecular clones We are indebted to A Leru B Ronsin S Balor and N Benmeradi Toulouse RIO Imaging M D ggelin and U Sauder Zentrum Mikroskopie der Universitat Basel Fourquaux and B Payre CMEAB S Leblond TEMSCAN for their help with microscopy and to P Valenti for excellent technical assistance We also thank J Smith and A Vincent for critical reading of the manuscript This work was supported by grants from the Association pour la Recherche contre le Cancer n 3832 n 1111 and a fellowship to I F and the Fondation pour la Recherche M dicale programme quipe 2005 The authors declare no conflict of interest IF HCD FP and SP conceived and designed the experiments IF HCD YL PF and SP performed the experiments and are listed according to their respective contributions IF HCD PF SP and FP wrote the paper LW and MA contributed reagents and analytical tools 24 88 FIGURE LEGENDS Figure 1 Structure and expression of Drosophila ZPD proteins A Phylogenetic tree grouping Drosophila ZPD proteins according to the conservation of their ZP domain pink rectangle 7 proteins comprise additional motifs in the extracellular region such as EGF green pentagon or PAN green amp grey boxes repeats Signal
80. Ba 4 i d Lei LA Universit de Toulouse TH ES En vue de l obtention du DOCTORAT DE L UNI VERSI T DE TOULOUSE D livr par l Universit Toulouse III Paul Sabatier Discipline ou sp cialit Genes Cellules et D veloppement Pr sent e et soutenue par Isabelle Fernandes Le 28 Septembre 2009 Titre Etude fonctionnelle des prot ines domaine Zona Pellucida au cours de la morphogenese pidermique embryonnaire chez la Drosophile JURY Pr Pierre Emmanuel Gleizes Pr sident Pr Michel Labouesse Rapporteur Pr Bertrand Mollereau Rapporteur Dr Bernard Moussian Rapporteur Pr Markus Affolter Examinateur Pr Paul M Wassarman Examinateur Dr Serge Plaza Dr Francois Payre Ecole doctorale Biologie Sant et Biotechnologie Unit de recherche Centre de Biologie du d veloppement Directeur s de These Dr Serge Plaza Rapporteurs Pr Michel Labouesse Pr Bertrand Mollereau Dr Bernard Moussian Je n ai pas dit que ce serait facile N o J ai juste dit que ce serait la v rit Matrix 1999 REMERCIEMENTS Eh bien voil nous y sommes Apr s 5 ans eh oui d j 5 ans Je dois partir et cette th se vient achever en beaut j esp re toutes ces derni res ann es de travail Je l ai r dig comme mon cahier de manip version confession intime Tout d abord je souhaiterais remercier l ensemble de membre du jury d avoir accepter de juger ce travail Et avant d entamer les chose
81. CM reorganization probably requires a robust architecture of lateral structures to be translated into a coherent change in cell shape Interestingly Piopio and Dumpy ZPD proteins are also required for junction remodelling during trachea formation Jazwinska et al 2003 Likewise the ZPD protein Hensin DMBT1 influences cell polarity and promotes the formation of junctional complexes Takito and Al Awaaiti 2004 a finding that may be relevant to its deletion in various cancers Al Awaati 2008 83 In conclusion these data show that local modifications of the apical ECM provide additional cues that influence the polarized organization of epithelial cells and are required for their morphogenesis The specific distribution and function of ZPD proteins open novel directions to explore how trafficking machineries are specified for protein delivery to apical sub domains in intimate interaction with localized actin remodelling and fine tuning of polarity determinants and cell cell junctions 84 Materials and Methods Fly strains UAS m UAS tyn UAS dyl UAS neo UAS tyn APAN UAS m PAN tyn UAS m ZPtyn UAS tyn ZPm UAS mHRP and UAS m transgenic lines were generated using P element transformation Unless specified other stocks were obtained from the Bloomington stock centre m wn H P GawB SP71 Bourbon et al 2002 zye 8 PIEPgy2 95995 svb svb btd da GAL4 We generated null alleles for tyn and zye and
82. CQMRIITNEGEE INSAEIGDNLKLQVDVE GYD FPFLDVEVATGNEVV 7 7 7 7 7 FTLSPPECYMEIQNGYGIGG PRVTGPVRVGDPLTLIIYMRS GDEREKTVYFKPFVVDMLEVISVD TPSGPVECWMEI PNV KPIQGTLTLGTDITFTINVKH FNDYEKTASKPPMVIADLDVIQLD ERGDNVDCWME I QHGKGPWA PPVSGIVPLGSTLTLVVAIND YDFYEKAVTFRPFOVDMLHAVTAN FLGDNLOCWMQIQVGKGPWA EVSGIVKI KD LRKHAQKPQAFRSDDRREYGRSLDKQQDDD IPMPGCHMKIYNDEHKIADDVKIGDPLTIVISID ANAMGMPLPVLRQEKGHDRNARMRALAAAAAVPALG ATSSINQQQRETPRVRIWLELGG PNGTGSVEVGVATTLTVRAIVP V VGD T YNHVTDIFATN VARDP YSGRSIQLIDRFGCPVDPFVFPELD RDG DTLEARFNAFKIP ESNFLVFEATVRSCREG CQP AYCPGP LOLAPLPDFRATS VAKT ADNENFVLLIDERGCPTDASVFPALE HTAS RARFHAFKFS GTANVSFDVKIRFCVE CSP SNCISS EQSPYEIFIREL VAMD GVDNSEITLIDSNGCPTDHFIMGPIY SVS GKMLLSNFDAFKFP SSEVVOFRALVTPCMPS CEP VOCEQE PNSPYEIFVRELVAMD GSDSAEITLIDANGCPTDOYIMSTIQKLAQN REVLLSOFDAFKFP SSEVVOFRALVTPCIPR CEP VICDSE ANSPYEIFVRE VAMD GTDSAEITLIDANGCPTDQYIMSAMQ LANN RKVLLSQFDAFKFP SSELVQFRALVIPCIPS CEP VICDND SAPVYGLGVNY DVTD THTSSETLIFKGCTVDPYLFENFNTIDGD I SAKFKAFKFP DSSYVQFR TVNVCLDK CLG TOCSNN WNYTKLSDVQLO
83. During epidermis differentiation the apical surface is remodeled via a thrust of actin bundles which triggers the formation of the apical extension denticle beginning at stage 14 At stage 15 the localized deposition and function of ZPD proteins cause the extension to shrink thus sculpturing and stabilizing the shape of the denticle during and after actin bundle retraction B In wild type epidermal cells belts corresponding to aECM modifications mediated by each ZPD protein shape the denticle The loss of a given ZPD protein results in the local alteration of the aECM and or its interaction with corresponding membrane sub domain resulting in a specific defect of the apical cell shape 02 REFERENCES Al Awqati 2008 2007 Homer W Smith award control of terminal differentiation in epithelia J Am Soc Nephrol 79 443 449 Andrew D J and Baker B S 2008 Expression of the Drosophila secreted cuticle protein 73 dsc73 requires Shavenbaby Dev Dyn 237 1198 1206 Andrews J Garcia Estefania D Delon l Lu J Mevel Ninio M Spierer A Payre F Pauli D and Oliver B 2000 OVO transcription factors function antagonistically in the Drosophila female germline Development 727 881 892 Bourbon H M Gonzy Treboul G Peronnet F Alin M F Ardourel C Benassayag C Cribbs D Deutsch J Ferrer P Haenlin M et al 2002 A P insertion screen identifying novel X linked essential genes in Drosophila
84. ECM does indeed display distinct ZPD mediated modifications We speculate that a heterogeneous scaffold of ZPD proteins is necessary to induce and or organize the local forces necessary for the correct shaping of denticles Fig 7 A parallel can be drawn with data suggesting a mechanical role for ZPD proteins in the local remodeling of cell shape in other systems such as elongation of pupal wing cells in Drosophila Roch et al 2003 constriction of lateral hypodermal cells in C elegans Sapio et al 2005 and induction of columnar shape in kidney and ES cells Takito and Al Awqati 2004 The Zona Pellucida coat also influences the embryonic extraembryonic axis of the mammalian blastocyst through physical constraints Kurotaki et al 2007 showing that ZPD proteins may be involved at multiple steps in the mechanical regulation of cell and tissue shape ZPD proteins and the polarized organization of epidermal cells The concentric distribution of ZPD proteins within the apical membrane of epidermal cells reveals a previously overlooked sub compartmentalization of the apical domain How are these apical sub compartments defined and how do they interact with other determinants of cell polarity It is possible that intrinsic properties of ZPD proteins contribute to the construction of a highly ordered scaffold that organizes the apical membrane around the cell extension Supporting this hypothesis we observed for example a mislocalization of
85. M A C Image en contraste de phase de la forme de l ensemble des 7 rang es de denticules sauvages A et sauvetage par le transgene UAS m C UAS GFPm D et GFP MAC ter H B Les denticules m ont une forme triangulaire sur une base largie C Sch ma de la prot ine M En rouge le Peptide Signal PS permettant l adressage en rose le domaine fonctionnel ZP et en bleu le domaine transmembraneaire permettant l ancrage de la prot ine la membrane plasmique D Expression de l UAS M dirig e par le pilote daG4 qui permet un expression ubiquitaire pr coce du transg ne L ensemble des rang es pr sente un ph notype sauvage E Sch ma de la prot ine de fusion GFP M La GFP en vert a t ins r e en N terminal de la prot ine en aval du PS F Expression de l UAS GFP M dirig e par le pilote daG4 L ensemble des rang es pr sente un ph notype sauvage d montrant que la GFP ne gene pas la fonction de M G Sch ma de la prot ine GFP MAC ter ou la prot ine a t tronqu en amont de son DTM Expression de l UAS GFP MAC ter dirig e par le pilote daG4 L ensemble des rang es pr sente un ph notype proche des mutants ml Toutefois on remarque une l g re modification de la forme des denticules importante que celle observ e sur les cellules m figure 37D F Ces r sultats d montrent d une part que le ph notype m observ dans l aile est bien li la perte de fonction de m et d autre part que la prot
86. Merci pour toute l aide pr cieuse que tu as su m amener dans la pr paration des TPs le mat riel les chantillons le rangement impeccable des salles Merci mon Phiphi pour son soutien psychologique tout au long de ces 5 ann es m me si parfois entre nous il y a eu des d saccords non non nous sommes absolument aussi t tus je pr f re dire obstin s l un que l autre Merci d avoir toujours assur une playliste d exception dans le labo Je souhaitais aussi un grand merci Pierre qui lui me supporte depuis bien plus longtemps encore la licence soit 7ans Merci pour ta grande disponibilit au quotidien pour l aide pr cieuse en bioinformatique gr ce toi je ce mot l ne m apparait plus comme tant un gros mot Merci de m avoir fait confiance en tant que monitrice et de m avoir ainsi donn l opportunit de passer de l autre c t du miroir pas facile de se retrouver face une vingtaine d tudiants qui ne sont pas toujours l pour apprendre Merci H l ne C c est gr ce toi que j ai partir B le pour faire ma formation en EM et que cette histoire commenc merci de poursuivre mon travail et de lui donner une suite pour qu il ne reste pas moisir au fin fonds d un tiroir Je souhaiterais aussi remercier Francois d avoir fait confiance Serge et de m avoir donn l opportunit de faire ma th se dans ton quipe Merci galement pour ta volont incessante de tirer le meilleur de chacun de nous certes parf
87. PD les plus basales Tyn et Zye diminue l accumulation des composants de la SAR et de la ZA dans des cellules denticules En effet Arm un des composant principal de la SAR est enrichi dans les jonctions des cellules denticules Price et al 2006 De m me Shg un composant essentiel de la ZA est aussi enrichi dans les cellules denticules Dans les mutants tyn ou zye nous montrons qu il n y a plus de diff rence d accumulation de ces deux marqueurs entre les cellules lisses et les cellules denticules indiquant que les prot ines ZPD sont n cessaires au maintien de ces complexes de jonction Cela sugg re une interaction entre les prot ines ZPD et Zye et les complexes de jonction polarit afin d assurer le renfort des jonctions et des d terminants apicaux dans les cellules denticule La r organisation de jonctions cellulaires est un v nement critique pour les changements de forme cellulaire comme l intercalation cellulaire lors de l extension de la bandelette germinale ou la constriction apicale pour l invagination du m soderme Lecuit and Lenne 2007 Lors de la fermeture dorsale les cellules pidermiques vont s tirer le long de l axe D V pour former des rang es cellulaires align es Price et al 2006 Pour cela les cellules vont passer de trois contacts quatre contacts cellulaires et donc devoir tablir un contact cellulaire suppl mentaire communication Robert Simone 50th Annual Drosophila Reseach Confe
88. R ATGG EILNTVOLVSSRGCLHPAMONICAHPPILEP PLGORLHFKAVMFPGMRSGEVLVISMRITGCLER EDCQVTAQDCLPS EDTPYGIFARSCVAMA KDARTSFKIIDDDGCPTDPTIFP GFTAD QSTYEAFRFT ESYGVIFQCNVKYCLGP CEP AVCEWN PATIYGGFARSCIAKT MEDHVQHEYLVTDENGCATDTSIFGHN WEYHNPD THNS LASFHAFKFE S8DHIRFQCHIRVCFGR CQP VHCGGY KYDGFDIVVNDCYAHN GANKRIQLIDQHGCPVDDKLISRERGSWSDSGV YETOQVYAYMKTERET GSPALY IECDVRMCHGR CPS OPCHWR SEQAWDINILOCYASDDMDFEARTTKRLOLSDKRGCSIKEKIFGEMRKFEAG 88 TSTYYNTLKAFRFP DRSQVYLKCDIELCNGA CKR DYTCGSL YRGEFDMRVKSCVASD GSGHVINLSDEFGCVLRPKMISRFLKARAPDER ATVITYAFFHAFKFP DALSVHIKCKVEICRHG CLD HCQNT DENKFDMLVRNCVAHD GKRAPIOLVDONGCVVRPKIMSKFOKIKNFGPS ASVVSFAYFQOAFKFP DSMNVHFQCVIQVCRYN CPEP KCGPG KQKVYGLHVTDCIVRDG LGWGEQRLVGEDGCPMDNE IMGQFNYTQDR LAANVTFPAHKFP YTTSVYY PQCSGK GNI CAALDG LGESTOQLLDARGC PIDEQVMPALHTQRRPAEEGHSKQNEEDLVERTFARTFPAFKF DRERLUV Sg LCKGK CPT LNCRLK F Figure S7 Alignment of Drosophila ZP domains Sequences were extracted from flybase http flybase org and aligned using CLUSTALw2 The highly conserved Cysteine residues are shown in red similar residues are in blue orange or green Tyrosine residues corresponding to the Y gt C mutation in M is highlighted in magenta 114 Figure 8 Phylogram grouping insect ZPD proteins according to con
89. Roch et al 2003 les g nes y sn f sha et les g nes ZPD pio dy dp pot et cyr sont requis pour la diff renciation de Tale Bokel et al 2005 Prout et al 1997 Des donn es quantitatives montrent aussi que l expression des g nes dy cyr et dyl est fortement activ e au cours de la morphogen se de l aile pupale Ren et al 2005 Notre tude pr liminaire de la fonction des prot ines ZPD dans l aile montre que la surexpression de Dyl Tyn Cyr ou Pio ne peut compenser l absence d activit de m montrant qu il existe une sp cificit fonctionnelle de ces prot ines aussi dans la morphogen se de l aile r sultats non pr sent s En parall le de l tude fonctionnelle des g nes ZPD il sera int ressant d tudier leur r gulation dans l pith lium alaire Nous pourront utiliser l ensemble des outils construits mutants UAS anticorps CRM pour analyser dans ce modele la conservation ventuelle d un module r gulateur de la morphogen se cellulaire commun ces deux tapes du d veloppement Le gene Ovo Svb est connu pour son double r le la diff renciation pidermique embryonnaire d une part et l tablissement de la lign e germinale d autre part Nous avons vu que ces deux fonctions correspondent des promoteurs ind pendants g n rant des isoformes prot iques et partageant le domaine de fixation l ADN Les prot ines OvoB et OvoA pr sentent une activit respectivement activatrice ou r pressive
90. STRATIVE DISCIPLINE G nes Cellules et D veloppement Centre de Biologie du D veloppement UMR 5547 Batiment 4R3 118 Route de Narbonne 31062 TOULOUSE CEDEX 09
91. ZPD forment par leur association un chafaudage h t rog ne n cessaire l attachement de la cuticule le long de l extension pour obtenir une forme correcte figure 8 de l article Afin de v rifier cette hypoth se nous avons observ les localisations de ces prot ines dans un contexte mutant pour l un ou plusieurs des autres g nes ZP Dans les mutants m la prot ine Dyl est d localis e sa distribution ne se limite plus l extr mit de la denticule mais s tend jusqu la r gion m diale op M est normalement accumul e figure 28 Ce r sultat suggere que M restreint la localisation de Dyl via une interaction directe et qu il pourrait en tre de m me pour les autres prot ines ZPD dans les zones de recouvrement Cependant nous n avons pas pu mettre en vidence une d localisation des autres prot ines ZPD peut tre cause d une r solution insuffisante due la petite taille de la denticule 1 5 1 8 um Chacune des quatre prot ines observ es poss de une localisation sp cifique ne se recouvrant que partiellement sugg rant une interaction limit e dans l espace entre deux prot ines Les donn es mammif res montrent que ZP1 et ZP2 s associent en h t rodim res pour former des fibres qui seront rattach s la membrane de l ovocyte par ZP3 Wassarman et al 2004 Dans le cas des prot ines Dyl M Tyn et Zye nous avons observ des d tachements membrane aECM sugg rant que comme ZP3 elles pourraient ancr
92. a A RD A X A T LT ef e f 4 wild type h 1 W Figure 3 m Impinges on Denticle Formation svh Directs Epidermal Cell Differentiation common organization resembling a rose thorn a large base allowed by a median constriction forming narrow neck which supports the distal hook which points either anteriorly or posteriorly Figure 3 In larvae carrving the m loss of function mutation or the Am MR delicieney that deletes the entire m gene 28 denticles are small and misshapen Figure 3 and Table 52 the median constriction ts absent leading to poorly differentiated denticles that display an aberrant triangular shape These mutant defects are rescued when m is re expressed using the wild type 0 4Kmin element as a GALA driver Figure 34 These results provide additional evidence that this m enhancer is fully functional in the epidermis and demonstrate that the observed denticle defects are due to the loss of m activity To further investigate the role of m in denticle formation we tested the influence of its ectopic expression in wild type embryos We used both an EP target P element insertion located 2 kb upstream of the m start site or the min cDNA placed under the control of UAS sequences Gal4 binding sites Which both allow a strong m ectopic expression upon crossing with Gal4 drivers unpublished data None of the drivers we tested led to cuticular defects For example overexpression of m
93. a nuit car c est assez long Le lendemain il faut retourner au CMEB pour poser les petits b b s sur plot m tallique et retraverser le campus pour aller en TEMSCAN ou St phane m attends pour m talliser mon chantillon et faire des belles images avec son gros microscope Bref une belle balade Merci donc St phane qui manipule le micro et prend les images C tait la premi re fois qu il travaillait sur du vivant bon ok mes embryons sont un peu morts quand ils sont dans le micro mais d habitude il regarde des poudres ou trucs du genre bizarre Il a donc t rapidement confront mon obsession des poils du ventre oui sp cifiquement du ventre et il a du supporter de m entendre pendant plusieurs heures lui dire non pas celui l on ne voit pas le ventre non pas celui ci il est tout sale Bref merci St phane de m avoir support dans ma recherche du poil parfait Le balayage malgr me origine rien voir avec le m nage je suis toujours dans la microscopie r gl je me suis pench e sur la transmission toujours en microscopie pas celle de la voiture Merci Pierre Emmanuel pour tous ces conseils pr cieux mais aussi parce qu il a achet le second microscope de mes r ves oui je r ve de microscopes mais aussi parfois d embryons en optique ca s appelle une persistance r tinienne et en psychiatrie ca s appelle une hallucination Merci Nacer et St phanie qui m ont accompagn tout au long de projet de
94. al proteins the combination of these two motifs in the same protein was not detected in vertebrates Fig S1 In contrast we identified PAN ZPD proteins in arthropods and nematodes suggesting that they may be specific to ecdysozoan species In mammals the number of disulfide bridges defines two sub types of ZPD domains possibly related to different functions with 10 cysteines in ZP1 2 and 8 cysteines in ZP3 Jovine et al 2005 Fig 1B Both ZP1 2 and ZP3 like ZP domains are found in Drosophila proteins associated with or independent of PAN domains Fig 1A B The fact that ZPD proteins generally act within heterotypic polymers suggests that additional ZPD proteins contribute together with Miniature to epidermis differentiation To explore this hypothesis we systematically analyzed the expression of ZPD genes in trichome cells Of the ZPD genes expressed in epidermal derivatives Jazwinska and Affolter 2004 we found that seven were co expressed with m in trichome cells We named these putative components of the matrix after characters of the eponymous movie see Fig 1A The patterns of expression of trynity tyn neyo neo morfeyus mey nyobe nyo and dusky like dyl strikingly resembled that of m Fig 1C Double staining 70 experiments confirmed that all six ZPD genes were co expressed in trichome cells in coinciding time windows see below Each of these genes appeared to be transcribed in all trichome cells with no
95. alation cellulaire Irvine and Wieschaus 1994 La bandelette germinale va ensuite se r tracter aboutissant au positionnement de la partie caudale dans la r gion post rieure de l embryon L amniosereuse va alors recouvrir dorsalement le sac vitellin en gris figure 4 Ce tissu transitoire pourrait contribuer au mouvement de la bandelette germinale en repoussant les cellules les plus post rieures de la bandelette et les derniers segments post rieurs de l embryon Schock and Perrimon 2003 A ce stade les cellules neurales ont d lamin vers l int rieur de l embryon dont la couche cellulaire externe constitue maintenant l piderme en vert figure 4 Le tissu pidermique commence alors un mouvement coordonn pour recouvrir enti rement l amnios reuse et fusionner dans la r gion la plus dorsale un processus appel la fermeture dorsale en bleu figure 4 La fermeture dorsale r sulte d une r organisation de la forme tridimensionnelle des cellules pidermiques dorsales encore positionn es de mani re bilat rale dans l embryon Ces cellules vont s aplatir et s allonger sans intervention de division ou d intercalation cellulaire et migrer dorsalement figure 5 La rang e cellulaire la plus dorsale joue un r le majeur dans la fermeture en organisant un large c ble compos d actine et de myosine II non musculaire Walters et al 2006 La contraction de ce c ble d acto myosine va permettre de rapprocher les cellules pidermiques
96. ale des denticules et les trichomes dorsaux un ph notype l origine du nom b b ras Ce gene code un facteur de transcription doigt de zinc sp cifiquement exprim dans chacune des cellules pidermiques qui vont former des denticules ou des trichomes dorsaux Delon et al 2003 Garfinkel et al 1994 Mevel Ninio et al 1995 R ciproquement l expression ectopique de svb dans des cellules pidermiques normalement lisses est suffisante pour les forcer former des extensions quelque soit le statut des voies de signalisation Wg ou EGF r Payre et al 1999 svb fait partie du locus ovo svb contr lant la fois la diff renciation de la lign e germinale Ovo et celle de l piderme Sbv Ce locus dirige l expression de plusieurs transcrits qui codent tous des facteurs de transcription partageant le m me motif de liaison l ADN compos de quatre doigts de zinc Les fonctions du g ne ovo svb correspondent des promoteurs ind pendants un promoteur somatique pour la fonction svb et deux promoteurs germinaux permettant la synth se des isoformes OvoA et OvoB figure 15 OvoA et OvoB 29 sont exprim es de maniere diff rentielle au cours du d veloppement ovarien Le promoteur ovoB est actif tout au long de l ovogen se alors que le promoteur sp cifique d OvoA se met en route a la fin du processus de l ovogen se Mevel Ninio et al 1995 Salles et al 2002 Les deux isoformes poss dent de plus des fonctions mol
97. alisation ou adaptation des machineries du trafic v siculaire L inactivation de Sec61B un composant central de l appareil de translocation du r ticulum endoplasmique RE alt re profond ment le d p t de la cuticule avec notamment l absence d picuticule Valcarcel et al 1999 La s cr tion implique un adressage v siculaire sp cifique depuis le RE vers la membrane apicale et on connait d j un grand nombre de mol cules impliqu es dans le trafic v siculaire figure 12 Chez les eucaryotes les prot ines SNAREs Soluble N ethylmaleimide sensitive factor NSF Attachment Protein SNAP REceptor permettent la fusion des membranes entre les v sicules des diff rents compartiments cellulaires au cours de l exocytose Ces prot ines ont t initialement identifi es pour leur r le dans l exocytose des neurotransmetteurs pr synaptiques Jahn and Sudhof 1999 Cette famille de prot ines est compos e de diff rents membres sp cifiques du compartiment cellulaire impliqu RE Golgi et membrane cellulaire pour revue Jahn and Scheller 2006 Il existe donc de nombreuses tapes de formation puis de fusion des v sicules qui permettent aux prot ines de cheminer entre ces diff rents compartiments cellulaires figure 12 Le complexe prot ique permettant cette fusion est toujours compos par quatre prot ines d une part les target SNAREs t SNAREs aussi appel s Q SNAREs et deux prot ines synaptosome associed SNAP pr sent
98. and immunological staining Confocal views of abdominal segments AS and Ad were recorded using a Leica TSP 2 Microscope Found at DOL 10 137 Eporurnmal pb 004029059001 26 MB JPG Figure 2 Evolution of ob Target Gene Expression in D sechellin Embryos Epidermal expression of mash forked singed and shervenos in stage 15 embryos from D melanogaster left and D sechellia right species All pictures are lateral views corresponding to the same abdominal segments Anterior is to the left and dorsal is up Found at DO 10 137 journal phi 0 402980 5002 513 KB JPG Table S1 Summary of Candidate Genes Vested or Their Putative Regulation hy the Shavenbaby Transcription Factor Candidates were selected by three independent criteria 1 Expres sion pattern we searched for genes transcribed in a subset of epidermal cells by conducting a survey of the project of systematic determination of patterns of gene expression in Drosaplala emhryn genesis that runs in the Berkeley Drosophila Genome Project BOGI httpclltov Ibl gov RBRRBIcgi binlexfinsitu pl and from published liter 2 Dentidle phenotype we selected genes reported to specifically affect denticle formation when mutated 3 Putative function we selected candidates known to be involved in a biological process that is implicated in denticle formation either actin remodeling cuticle pigmentation or cuticle formation We confirmed or established the expression pa
99. ane and cuticle layers generally restricted to the base of the extension Fig 5d d Finally the absence of Tyn caused very basal defects in membrane cuticle interactions Fig 5e e TEM analysis suggested that the lack of Tyn and Zve disturbed the apical organization of denticle cells Staining for apical determinants Crumbs or components of 76 Zonula Adherens junctions DE cadherin revealed that denticle cells have a smaller apical area than smooth cells in wild type Fig Ga Whereas smooth cells display a cuboidal contour denticle cells are also markedly elongated along the dorso ventral axis Fig 6a e Inactivation of tyn or zye altered these typical features leading to an enlargement of the apical surface of denticle cells without affecting smooth cells Fig 6 Moreover the intensity of Crumbs staining in wild type was significantly higher in denticle cells than in smooth cells We noticed a similar increase in levels of DE Cadherin Shg within the junctions of wild type denticle cells Fig 6a e The lack of tyn or prevented this build up of apical complexes which were reduced to and often below levels normally observed in smooth cells Fig 6b f and c g In contrast septate junctions appeared unaffected in ZPD mutants as deduced from normal ultrastructure and distribution of Dlg or Fas3 in such embryos Fig 6i l In sum these data show that the different ZPD proteins are required to establish and or main
100. ant la Moesin GFP dans l piderme A Avant la formation des denticules B D L accumulation d actine au niveau du contour cellulaire apical pr figure la future ceinture de cellules denticules crochets D E Les foyers de condensation d actine apparaissent le long de la marge post rieure des futures cellules denticules fl ches blanches F H Les foyers d actine se condensent Fl ches blanches pointes de fl che rouges fusion de foyers K Les denticules commencent l allongement Temps en heures minutes L chelle dans la figure A correspond 10 um D apr s de Price et al 2006 Les premiers signes de la modification du compartiment apical des cellules pidermiques sont d tectables en milieu d embryogenese Guild et al 2005 Price et al 2006 Avant le stade 14 les cellules pidermiques pr sentent toutes une surface apicale convexe et sont tr s allong es selon l axe apico basal figure 14 L actine corticale marque alors les jonctions intercellulaires D s le d but de la fermeture dorsale les cellules pidermiques vont r organiser leur forme tridimensionnelle elles s aplatissent s allongent selon l axe D V figure 5 et s alignent pour former des rang es r gulieres Koppen et al 2006 Les futures cellules trichomes continuent de s allonger selon l axe D V et accumulent uniform ment des filaments d actine la surface apicale figure 14 L actine apicale devient rapidement polaris e avec une restric
101. ants majeurs de la Zona Pellucida des ovocytes mammiferes Wassarman 1988 Les prot ines ZP 1 2 et 3 forment une matrice extracellulaire prot geant l ovocyte et jouent le r le de r cepteur esp ce sp cifique pour le spermatozoide Howes et al 2001 Chez la Drosophile il existe diff rentes enveloppes entourant l embryon incluant la membrane vitelline et le chorion Margaritis 1985 La composition de la membrane vitelline est assez mal connue et seules quatre petites prot ines riches en proline ont t identifi es Ces prot ines sV17 sV23 VM32e et VM34C sont caract ris es par la pr sence d un domaine fonctionnel de 38 acides amin s fortement conserv Manogaran and Waring 2004 le domaine VM pour en revue Waring 2000 On ne connait qu une quinzaine de g nes codant des composants structuraux du chorion notamment un cluster de g nes codant des prot ines apparent es entre elles Orr Weaver 1991 Si l hypoth se d un r le ventuel des prot ines ZPD dans la structure et ou la fonction des enveloppes de l ceuf d insectes est attractive elle reste enti rement tester De mani re int ressante au cours de son stage de Master 1 Emilie Benrabah a pu tablir que les femelles mutantes m pr sentent une forte r duction de leur fertilit 7 E Ss Si certaines cibles des facteurs Ovo ont d j t identifi es Lu et al 1998 comme le gene ofu ou ovo lui m me aucune tude syst matique n a encore t
102. argets Materials and Methods Fly strains and constructs we Hec VAS sub Ptc GaHi Wi Gal4 sub bid sub subit 9 un s 2 pe sha isha in fI m 7 wan mam EP usp wp m an f msn pt aha msn f p UD wm f ont lt w liEPIEP45 and a w D sechellia stock from the D Stem Laboratory Stocks with multiple mutations were obtained by recombination and mutant chromosomes were kept over balancers carrving Kr Cald gt gt UAS GFP transgenes 46 Transgenic lines were generated using standard P element transformation Based on the 2003 genome release the Gkmin construct corresponds to genomic position chrx 11585555 11501094 and 11596605 11597139 3kmin to chrX 11585555 11585410 positions both inserted into pCasPER f gal Wild type or site directed mutagenized 0 4Kmin enhancer ws amplified from genomic regions 11437455 1148775 and cloned into the pCp vector carrying a nuclear Lac reporter and in the Pall vector for rescue experiments A full length m cD SA inserted into the pUASt vector was used to generate transgenic lines Details of cloning strategy are available upon request Embryo staining Antisense probes derived from cDNAs or genomic fragments were synthesized in vitro and processed for in sim hvhridization following standard procedures To identity ib mutant embryos we used either a sob mutant chromosome carrying the itd mutation leading to head defects a mi
103. argit lat ralement pour fusionner les sillons adjacents En milieu de cellularisation les jonctions adh rentes SubApical Junction ou SAJ se forment tout au long de la membrane lat rale avec une accumulation pr f rentielle au p le apical En d but de gastrulation les SAJ fusionnent l apex pour former la ZA C Maturation de la ZA Au cours de la gastrulation une r gion subapicale SubApical Region ouSAR et une marge apicale du domaine lat ral Apical Lateral Margin ou ALM sont form es Le SAR et l ALM fournissent des informations spatiales n cessaires pour placer correctement la ZA et en contr ler la formation D Maturation des jonctions pith liales au stade tardif de l embryog n se apr s la r traction de bandelette germinale les jonctions sept es Septate Junction ou SJ sont form es et le complexe jonctionnel pith lial est enti rement diff renci n cessite la fonction des g nes bazooka baz atypical PKC DaPKC et armadillo arm Muller and Wieschaus 1996 Le produit du g ne stardust sdt semble aussi agir avec Baz pour localiser les jonctions adh rentes en cours de maturation au pole apical Tanentzapf and Tepass 2003 Cependant il n existe pas de marqueur pr coce de la membrane apicale rendant difficile la compr hension pr cise de ce m canisme En effet Crumbs Crb est la premi re prot ine dont la localisation est restreinte au domaine apical mais elle intervient dans des tapes ult ri
104. at ZPD proteins contribute to the differential shaping of trichomes observed between different cell populations However ZPD genes are unlikely to play a role in the row specific shaping of denticles because we did not detect obvious differences in their expression within each denticle belt As shown in the case of m Chanut Delalande et al 2006 it is possible that Svb directly controls the expression of other ZPD genes in trichome cells Consistent with this hypothesis genomic analysis of sequenced Drosophilidae species predicts the existence of conserved Ovo Svb binding sites in non coding regions of these novel svb downstream genes Stark et al 2007 Evolutionary diversification of ZPD gene functions That Svb co regulates a set of 8 closely related ZPD genes may indicate that the latter correspond to a recent evolutionary expansion and consequently still retain redundant functions For example several ZPD genes co expressed in hypodermal cells of C elegans embryos play at least partially redundant roles in cuticle differentiation Muriel et al 2003 Sapio et al 2005 Sebastiano et al 1991 However several lines of evidence show that this is not the case for Drosophila ZPD in trichome cells First the individual 79 inactivation of ZPD genes leads to characteristic denticle defects The absence of a given ZPD gene results in a specific alteration of the denticle shape that is recognizable in both individual and combined ZPD
105. atic structure of the protein Bottom n situ hybridization revealed a striped expression in subsets of epidermal cells which depends on svb activity Lateral left and ventral right views of stage 14 embryos Top pictures are wild type embryos bottom svb mutant embryos 112 Species NMN gene number La D melanogaster D simulans melanogaster subgroup D sechellia melanogaster group vakuba D erecta AAN DAS 2E pscudoobscura D persimilis 1 D Sophophora obscura group D D D wilistoni D D Williston group repleta grow mojavensis Diptera iris group virilis Drosophila CRF Hawaiian Drosophila 2V grimsnaw Culicinac Culex pipiens Acdes acgvpti Culicidar Anop hilinae Lepidoptera Anopheles gambiae Bombyx mori Tribolium castaneum Hs mcnoptera Apis mellifera Colropliera Nasonia vitripennis Acvrthosiphon pisum P humanus corporis Hemipicra Fhihirapiera bet Fe be Eet Ft Lei La Lag fei Lag Le Lei ou Lab fei Figure 86 Phylogenic analysis of Nyo Mey Neo genes among arthropods 22 arthropod genomes were screened through Tblastn for DNA sequences encoding either Nyo Mey and Neo or their orthologous proteins http flybase org blast Duplication of a single ancestral Nyo Mey Neo gene NMN has occurred in Drosophilidae In several Drosophilidae genomes the three separated Nyo Mey and Neo genes remain tightly lin
106. ation de nouvelles cibles L un des enjeux majeurs est donc de comprendre ce qui diff rencie les CRM actifs in vivo de l ensemble des autres r gions contenant des motifs volutivement conserv s L hypothese la plus simple est d inf rer l existence d autres l ments cis r gulateurs dont la pr sence est n cessaire la fonctionnalit des sites de fixation pour Svb in vivo Nous avons donc recherch des motifs nucl otidiques statistiquement enrichis dans les 7 CRM fonctionnels par rapport l ensemble des r gions g nomiques contenant un site consensus de Ovo mais ne dirigeant pas d expression dans l piderme Le programme CisTarget X recherche alors la pr sence de sites statistiquement enrichis autour des sites Ovo Svb Ces analyses d tectent en effet une signature significativement associ e aux 7 CRM actifs correspondant deux mod les diff rents bien que partiellement recouvrant e Le mod le OG est bas sur la pr sence simultan e de sites consensus pour deux facteurs de trancription Ovo d une part et Grainyhead Grh d autre part e Le mod le OMM est bas sur la pr sence simultan e de sites consensus pour Ovo et Myb plus celle d un motif orphelin ACCGATTA Ces modeles pr dictifs nous ont conduits tester de nouvelles r gions g nomiques des genes cibles de Svb Nous avons tabli une liste de 23 nouveaux CRMs candidats dont 4 correspondent a des r gions interg niques des g nes ZPD
107. ation des CRMs vers l identification de nouvelles cibles 58 DISCUSSION cr 60 III Les Prot ines domaine Zona Pellucida dans l architecture de la denticule 63 RESUME E 64 DISCUSSION 116 IV Mparadoxe d une dIlfUSIOR dices 125 INTRODUCTION EN 126 RESULTATS mi ii 128 1 Min diffuse et se relocalise pr cis ment sur la denticule 128 2 D couplage des fonctions de M ancr e versus diffusible 129 a Fonction du domaine transmembranaire ss 129 by MLancree versus NEE allen 129 3 Fonction de M chez l adulte eese nennen 130 a saUVetage Crd FUSION 130 b Fonction du domaine transmembranaire 131 DISCUSS ON EE 132 CONCLUSION et PERSPECTIVES 000 a as 136 1 R gulation transcriptionnelle de la diff renciation terminale 137 2 Des modules de diff renciation sont ils r utilis s au cours du d veloppement 139 3 Analyse in vivo des fonctions et de la r gulation des prot ines ZPD 142 REFERENCES RA 7777 145 INTRODUCTION Le cycle de vie de Drosophila melanogaster A Femelle embryon pupe E Larve L1 Larve L7 Figure 1 Cycle de vie de la drosophile A Le cycle de vie de Drosophila melanogaster Apr s f condation le d veloppement embryonnaire va conduire apr s 22h l closion d une larve d
108. ation during the evolution of insect species YE PLoS Biology www plosbiology org sb Directs Epidermal Cell Differentiation svb Controls Several Aspects of Actin Organization One of the first recognizable signs of the morphological differentiation of epidermal cells is the formation of an apical bundle of microfilaments in denticle cells 22 23 These early steps of denticle formation depend on svh which is necessary and sufficient to promote the formation of epidermal actin bundles 14 Our results show that sub controls the transcription of several genes involved in different steps of actin assemblyforganization First we found that sub directs the expression of shmwnowlkajak a gene producing strong denticle defects when mutated and recently shown to encode a protein reported to associate with actin 32 but whose biochemical function is unknown Second Svb also directs the expression of singed and forked coding respectively for the Drosophila putative homologs of Fascin and Espin two proteins that crosslink parallel actin filaments and promote the formation of bundles of microfilaments 35 327 The Forked and Singed proteins sequentially accu mulate in growing denticles a situation reminiscent of that of wing hair formation 38 suggesting that these proteins play similar roles in the formation of adult and embryonic epidermal extensions Accordingly the inactivation of sn and alters denticles strongly suggesting that de
109. ation selon l axe A P permet de contr ler l expression des g nes s lecteurs hom otiques Hox d terminant l identit sp cifique de chaque segment figure 6 La d finition du sous ensemble des cellules pidermiques qui forment des trichomes est intimement li e aux m canismes de la segmentation notamment l tablissement progressif de sous populations diff rentes au sein de chaque segment a Les acteurs de la polarit segmentaire Les facteurs cl s de la polarisation segmentaire sont des facteurs diffusibles qui r gulent des voies de signalisation cellulaire Wingless Wg et Hedgehog Hh Wg est un des membres fondateurs de la famille Wnt Hh est un morphog ne secr t par les cellules exprimant le facteur de transcription Engrailed En et dont le nom rappelle qu en son absence l embryon est enti rement h riss de trichomes Les domaines d expression de Wg et de Hh sont contigus et forment un centre organisateur bipartite qui va d limiter la fronti re entre chaque PS Mann and Morata 2000 Chaque PS est visible au stade 10 11 par la formation d un sillon passager l interface entre les cellules exprimant Wg et En Hh Plus tard partir du stade 12 chaque segment est soulign par un sillon morphologique persistant qui se forme au bord post rieur de la fronti re d En Hh L interaction entre ces deux voies de signalisation d finit l organisation des diff rentes unit s cellulaires ainsi que l tablissement
110. be Puis il y a extension de la bandelette germinale en bleu Les cellules m sodermales vont ensuite s aplatir et s tendre pour former une couche cellulaire simple L endoderme interne en vert va son tour s invaginer pour recouvrir la surface interne de l embryon Le neuroectoderme est en grande partie diff renci en syst me nerveux vert et l piderme turquoise La bandelette germinale se r tracte pour positionner les derniers segments de l embryon en post rieur A ce stade les cellules neurales en bleu fonc d laminent vers l int rieur de l embryon d sormais recouvert par l piderme en turquoise Les cellules de l amnioserreusse en gris se contractent avant de disparaitre de la surface pour tre ensuite limin es par apotose Les deux moiti s de l piderme se rejoignent alors dans le processus de fermeture dorsale paracrine TGFbeta Les interactions mutuelles entre ces genes figure2 pr cisent leurs domaines d expression et guident la d finition des futurs tissus embryonnaires Leptin 1995 1 2 Formation et morphogen se g n rale du tissu pidermique La mise en place de ces deux axes principaux va permettre ensuite la d termination de territoires pr somptifs l origine des futurs tissus de l embryon figure 3 Dans la r gion m diane de l axe A P les cellules les plus ventrales formeront le m soderme en rose figure 3 Les cellules les plus dorsales formeront l amnios reuse qui va recouvr
111. bryogenesis The structure of the egg envelopes and the formation of the cellular blastoderm Dev Biol 50 95 108 V Valcarcel R Weber U Jackson D B Benes V Ansorge W Bohmann D and Mlodzik M 1999 Sec6lbeta a subunit of the protein translocation channel is required during Drosophila development J Cell Sci 112 Pt 23 4389 96 Vavouri T and Elgar G 2005 Prediction of cis regulatory elements using binding site matrices the successes the failures and the reasons for both Curr Opin Genet Dev 15 395 402 151 W Walsh E P and Brown N H 1998 A screen to identify Drosophila genes required for integrin mediated adhesion Genetics 150 791 805 Walters J W Dilks S A and DiNardo S 2006 Planar polarization of the denticle field in the Drosophila embryo roles for Myosin II zipper and fringe Dev Biol 297 323 39 Waring G L 2000 Morphogenesis of the eggshell in Drosophila nt Rev Cytol 198 67 108 Warn R M and Robert Nicoud M 1990 F actin organization during the cellularization of the Drosophila embryo as revealed with a confocal laser scanning microscope J Cell Sci 96 Pt 1 35 42 Warn R M Warn A Planques V and Robert Nicoud M 1990 Cytokinesis in the early Drosophila embryo Ann N Y Acad Sci 582 222 32 Wassarman P M 1988 Zona pellucida glycoproteins Annu Rev Biochem 57 415 42 Wassarman P M 2008 Zona pellucida glycoproteins J Biol Chem 2
112. c v siculaire Assemat et al 2008 Crb interagit aussi avec des prot ines associ es l actine la Dmoesin et la By Spectrin Medina et al 2002 Le domaine N terminal de la Dmoesin domaine FERM est en effet capable de lier la partie intra cytoplasmique de Crb cr ant un lien mol culaire entre ces complexes de polarit et le cytosquelette d actine Medina et al 2002 Au dessous de la ZA se trouve une r gion appel e la marge apicale de la membrane lat rale ou ALM Muller and Bossinger 2003 figure 8 dont la d finition d pend aussi de l accumulation localis e de complexes prot iques impliquant Disc Large DIg Lethal Giant Larval Lgl Bilder et al 2000 et Scribble Scrib Bilder and Perrimon 2000 Dans les cellules pidermiques Dlg et Scrib co localisent au niveau de l ALM alors que la distribution 20 Prot ines Membranaires Partenaires Mol culaires Cytosquelette Dmoesine Crumbs w Stardust Da DH spectrine Actine Bazooka je PAR yp aPKC Actine Cadherine 3 Armadillo jw o cat nine Actine Neurexine es Discs Large Coracle Actine Scribble Complexe Crumbs Complexe Bazooka g Complexe Cadh rine Jonction Sept e Crumbs Stardust Bo Es Baz Crb Identit apicale E Cadh rine Bazooka MEE Dock Armadillo 1 3 PAR6 L es a cat nine J aPKC Adherens Lethal giant larva Scribble Identit baso
113. communs surrepr sent s dans les r gions potentiellement r gulatrices de ces g nes e localisation de motifs pattern matching partir de la sp cificit de reconnaissance l ADN d un facteur de transcription connu ou par la recherche des motifs consensus correspondants b tis autour de matrices positionnelles pond r es Cette recherche s effectue dans un ensemble de s quences non codantes et favorise l identification des regroupements locaux clustering de ces motifs e l empreinte phylog n tique phylogenetic footprinting Par rapport aux autres s quences non codantes qui voluent relativement vite les r gions cis r gulatrices apparaissent comme des ilots de s quences volutivement conserv s entre esp ces reli es phylog n tiquement 52 Nous avons vu que Svb r gule directement l expression de via sa fixation sur un site consensus de liaison Ovo Svb volutivement conserv La recherche syst matique des cibles g nomiques de Svb bas e sur l analyse des s quences interg niques est un paradigme int ressant pouvant b n ficier des diff rentes approches de pr diction En effet le site consensus de fixation des prot ines Ovo Svb l ADN est bien caract ris et d autre part nous disposons du s quencage des g nomes de 12 esp ces de drosophiles dont le dernier anc tre commun remonterait plus de 120 My Nos travaux ont de plus permis d identifier un sous ensemble des g nes cibles dont la tran
114. d 1990 Warn et al 1990 Nullo slow as molasses slam bottleneck bnk et serendipity a sry a sont des g nes zygotiques identifi s pour leur r le dans l organisation du r seau d actine au cours de la cellularisation Lecuit et al 2002 Schweisguth et al 1990 Wieschaus and Sweeton 1988 Nullo dont la fonction est sp cifiquement requise en milieu de cellularisation est n cessaire pour limiter la formation des complexes cadh rine cat nine la partie apicale des membranes lat rales en formation Hunter and Wieschaus 2000 Slam a un r le dans la sp cification du canal d invagination en suivant la progression de la jonction basale tout au long de la formation de la membrane lat rale Beronja and Tepass 2002 Bnk et Sry a sont localis es l apical le long des membranes lat rales du sillon et s accumule au niveau des canaux d invagination De plus la colocalisation de ces deux prot ines avec la F actine suggerent fortement qu elles pourraient tre n cessaires pour le positionnement initial et ou la stabilit du r seau de F actine Schejter and Wieschaus 1993 Schweisguth et al 1990 Le r le de la F actine et des prot ines associ es est essentiel au cours de l extension de la membrane cellulaire ainsi qu la distribution des noyaux afin d tablir une monocouche cellulaire Ces deux prot ines contribuent donc la fois au placement des noyaux et l longation des membranes au cours de la cellularisation Le
115. de la formation des denticules quand elles sont exprim es artificiellement dans l piderme embryonnaire montrant qu elles peuvent r guler les genes cibles de Svb Andrews et al 2000 Chanut Delalande et al 2006 Payre et al 1999 Notre d finition fonctionnelle des sites de liaison de Svb sur ses CRM dans l piderme confirme que Svb reconnait bien le m me site consensus de fixation que les prot ines Ovo L encore nos outils devraient permettre de mieux comprendre les principaux param tres de la sp cificit de r ponse aux facteurs Ovo Svb en fonction des tissus En effet plusieurs cibles de Svb dans l piderme sont exprim es dans la lign e germinale Singed est bien connu pour ces fonctions ovariennes et l inactivation de ce g ne provoque une st rilit femelle due un d faut d organisation du cytosquelette d actine dans les cellules nourrici res Cant et al 1994 Certains des g nes ZPD cibles de Svb sont aussi exprim s dans les ovaires figure 41 m et cyr sont exprim s tout au long de l ovogenese dans les cellules folliculaires et la lign e germinale alors que tyn est sp cifique des cellules folliculaires Jazwinska and Affolter 2004 Deux genes ZPD suppl mentaires sont exprim s dans les ovaires CG13432 dont le profil est identique celui de tyn et CG16798 plus proche 140 de m et cyr Jazwinska and Affolter 2004 Historiquement les prot ines ZPD ont t identifi es comme tant les compos
116. de taille plus importante figure 27 Ces donn es sont compatibles avec l hypoth se que les prot ines M et Tyn sont achemin es au compartiment apical via un transport v siculaire diff rent C est pourquoi nous nous sommes int ress s la localisation des prot ines ZPD en l absence d une prot ine connue pour son r le dans l adressage apical de composants cuticulaires la syntaxin 1A Syx1A Moussian et al 2007 Syx1A est une prot ine T SNARE impliqu e dans la fusion des v sicules la membrane apicale des cellules polaris es La cuticule des mutants syx A a une paisseur r duite et certaines couches sont soit affect es soit manquantes sugg rant que des enzymes extracellulaires impliqu s dans l assemblage ou la pigmentation ne sont pas correctement adress es Moussian et al 2007 Toutefois l assemblage de la chitine ne semble pas affect dans ces mutants ainsi que la distribution des prot ines Pio ZPD Serpentine Srp une chitine d sac tylase ou Knickkopf Knk une prot ine organisatrice de la procuticule Nous montrons que la localisation des prot ines M Dyl Tyn et Zye n est pas affect e en l absence de syx A figure 30 Les prot ines membranaires peuvent gagner le domaine apical ou baso lat ral des cellules polaris es par diverses voies d exocytose Lorsque la v sicule est form e elle se s pare du Golgi apr s hydrolyse du GTP par la GTPase GAP GTPase activating protein Elle sera ensuite dirig e v
117. dentiques b Les r gulateurs de l actine singed et shavenoid Comme ces approches pr dictives s taient av r s peu efficaces nous avons entrepris des analyses in vivo syst matiques par le test des r gions g nomiques des g nes singed sn et shavenoid sha Jennifer Zanet post doctorante au laboratoire s est attach e a l tude des fonctions du gene singed Zanet et al 2009 et des m canismes r gulant son expression sp cifique dans des sous populations cellulaires Par la construction d une batterie syst matique de lign es transg niques rapporteurs d activit transcriptionnelle Jennifer a pu d finir que le premier intron de 7kb reproduit le profil d expression pidermique de sn Ce fragment a t sous divis en deux r gions de 3Kb et l une contient toutes les informations n cessaires l expression pidermique figure 17 Cette r gion a ensuite t r duite jusqu un fragment de 617pb contenant deux sites Ovo et produisant un profil pidermique identique celle de la transcription de sn dans les cellules trichomes Ces travaux ont ainsi d limit fonctionnellement une deuxi me r gion cis r gulatrice dont l activit d pend du facteur Svb Lors de son stage de DESU S verine Viala a utilis une approche similaire pour rechercher les CRM dirigant l expression pidermique du gene sha Deux fragments BS et BS3 d environ 600 bp chacun contenant des sites consensus Ovo volutivement conserv
118. dependence on sub activity unpublished data Deletion of most intronic sequences toa 3 kb fragment leads to strong diminution of the expression Figure 21 showing that cis regulatory elements required for m epidermal expression are located in intronic regions We focused on a 0 4 kb region from the second m intron which is highly conserved in Drosophilidae Figure ZA This fragment when placed upstream of a minimal promoter promotes a robust expression in the epidermis Figure 2E similar to that of the endogenous m gene Figure 2B 2H Expression of 0 4Kmin lines is lost in a sub mutant background Figure 2F whereas an additional stripe of expression appears when swb is ectopically expressed in smooth cells Figure 2G Therefore this 0 4 region of the m gene behaves as a xii responsive element able to drive epidermal expression under the control of sub We then assayed the ability of the Svb protein to bind in vitro to the corresponding DNA region Gel retardation assays showed that the recombinant Svb protein binds specifically to the 0 4 kb m element through a single region further refined to a 200 base par bp fragment Figure 2I Sequence analysis revealed the presence of a nucleotide motif matching 7 7 the consensus binding site previously defined for Ovo proteins 29 which share the same DNA binding domain with Svb 12 Additional DNA binding experiments showed that Svb binds to this predicted site with a high aff
119. dermal cell remodeling sb thus appears to govern morphological module responsible For the major switch from smooth surface to trichome the precise shape of which is finely sculptured by independent intrinsic factors and activities Evolutionary Perspectives The pattern of trichomes has been modilicd several times during the evolution af insects Across the genus Drosapula at least four independent evolutionary transitions have led to the loss to various extents of dorsal hairs Nevertheless evolution of the pattern of dorsal hairs and denticles results from the modification of s expression in all studied cases 17 19 Although the expression of patterning genes is unchanged in all species examined 42 the difference in the dorsal hair pattern between D melonegaster and D sechellia is due only to the modification of shavenbalby s response to signaling pathways 16 Our analysis further shows that the restriction of sub expression in D sechellia embryos causes in turn the restriction of the dorsal expression ol m sm sha and wsp genes Figure 52 Therefore all these sub targets display a concerted modification of their expression in A sechellia bringing additional evidence that together they constitute a developmental module Consistent with this Interpretation we show that individual inactivation experimental modifications of the expression of any of the sub target genes identified so far are not sufficient to m
120. derme est un tissu pith lial compos de cellules s cr trices hautement polaris es selon l axe apico basal et en interaction avec les autres tissus embryonnaires par leur face basale et avec le milieu ext rieur par leur r gion apicale Les cellules pidermiques sont troitement connect es entre elles par des contacts intercellulaires Ces contacts mettent en jeu des jonctions cellulaires sp cialis es qui assurent la coh sion du tissu et aussi la communication entre cellules Il existe plusieurs types de jonctions cellulaires r parties selon l axe apico basal et diff rant par leurs compositions mol culaires et leurs propri t s m caniques L tablissement des jonctions cellulaires est intimement li la polarit g n rale des cellules pith liales et en interaction troite avec la d finition des diff rents domaines membranaires Tepass et al 2001 L analyse g n tique des cellules pidermiques embryonnaires a contribu de mani re tr s importante la compr hension des m canismes d tablissement de la polarit et des jonctions cellulaires en g n ral 2 1 D finition de la polarit apico basale des cellules La mise en place progressive de la diff renciation apico basale de cellules de l piderme embryonnaire peut tre divis e en trois phases la formation des cellules par invagination asym trique de la membrane plasmique la formation des Zones d Adh rence ZA intercellulaires et enfin la maturation d
121. dles in vitro rom a dendritic network Cell Biol 160 951 063 40 Jovine I Ch H Williams 4 Latscher E Wassarman PM 2002 The ZP 41 42 demain a conserved module for polymerivation of extracellular proteins Cell Biol A 407 4601 Inestrosa NO Sunkel CE Arriagada Garrido L Cocor Herrera E 1906 Abnormal development ol the locomotor activity dno yellow larvae of Droit A cuticular defect Genetica 17 205 210 Dickinson Wh Tang Y Schwke Akam M On Conservation of molecular prepatterm during the evolution of cuticle morphology in larvae Evolution 4 1396 11015 13 Wang A Chamberlin HM 2002 Multiple regulatory changes contribute to 45 the evolution of the Crabe lin 18 ove gene Genes Dev 16 2842 2 4 Dai X 5chonlaum C Degenstein L Bai W Mahowald A et al 19598 The ove gene required bor cuticle formation aid oorgemesis in Mies is involeed in hair formation and spermatogenesis in mice Genes Dev 12 5452 5465 Li B Mackay DR Dai Q Li TW Nair M et al 2002 The LEFVWiecta catenmin comes a s Ales ien a morse homolog ol ove required For epidermal appendage diflerentiation Proc Natl Acad Sci U 8 A ttt o064 il Mo 46 Caso D RamirezWeber F Kornberg IB 2000 GFP tagged balancer chromosomes for Drosoffhla melanogaster Mech Dev 981 451 454 September 2006 Volume 4 Issue 9 e290 47 DISCUSSION Nous montrons ici qu un facteur de transcription un
122. dyl neo et dp et engag le test de leur activit in vivo par la g n ration de lign es transg niques rapportrices Cette analyse r vele la pr sence d un deuxi me CRM fonctionnel dans le gene L l ment EminB dirige un profil d expression pidermique incomplet vis vis de l expression endog ne Il r v le une forte expression dans les cellules trichome dorsales et lat rales et seulement une activit r siduelle dans les cellules denticules ventrales figure 23 L activit de ce CRM de type OMM est cependant sensible svb car son activit transcriptionnelle est abolie dans un embryon mutant pour svb Il est donc possible que ce deuxi me CRM contribue renforcer l expression du g ne miniature dans les cellules trichomes dorsales Nous avons aussi test un nouveau CRM pour le gene dusky like Endyl3 correspondant simultan ment aux deux mod les OG et OMM figure 18 Toutefois ce fragment s est r v l 58 ventral lateral Dorsal EnEminB S Figure 23 Expression des nouveaux CRMs isol s Immunocoloration anti lac z Le CRM EminB reproduit partiellement l expression de m dans les cellules trichomes lat rales et dorsales sous le contr le de Svb Les CRMs EnDyl3 et EnNeo ne montrent aucune expression inactif en transcription sugg rant que cette r gion ne contribue pas a la r gulation de la transcription de dy dans l piderme figure 23 De m me le CRM candidat E
123. e caract ris e par un patron st r otyp d extensions appel es trichomes ou denticules dans la r gion ventrale figure 1B Le patron des trichomes repr sente une carte du plan d organisation de la larve et de chacun de ses segments Des cribles g n tiques grande chelle recherchant des mutations perturbant le patron des trichomes ont ainsi identifi de nombreux genes r gulateurs de la mise en place du plan d organisation de la drosophile L analyse g n tique de leur fonction a tabli le concept de l organisation des g nes contr lant le d veloppement en v ritables r seaux de r gulation g nique L importance g n rale de ces notions a t tendue l ensemble des esp ces animales d montrant une remarquable conservation volutive des genes r gulant le d veloppement Si les travaux de ces g n ticiens ont collectivement permis une compr hension d taill e des m canismes impliqu s dans la mise en place du patron des trichomes leur formation la surface de la larve reste un processus encore mal compris Depuis une dizaine d ann e le laboratoire dans lequel j ai r alis ma th se s int resse aux m canismes g n tiques et cellulaires responsables de la formation des trichomes Ces extensions sont le r sultat d un changement de forme localis e des cellules pidermiques au cours du d veloppement embryonnaire La formation des trichomes constitue ainsi un mod le simple pour aborder les m canismes mol culai
124. e transcription of genes previously implicated in denticle formation is specifically activated by sib sn f and she encode actin assoctated factors 52 33 and recent study has shown that other components of the actin cytoskeleton Diaphanous Enabled and the members of Arp2 3 complex accumulate in forming denticles 23 This prompted us to analyze the embryonic expression of these genes as well us additional actors in actin remodeling ehickadee gelsolin and keinster exhibit ubiquitous ex pression in embryos which is not influenced by sof activity F D Fam Figure 4 svb Directs the Expression of Genes Encoding Actin Remodeling Proteins Required for Denticle Formation A Cuticle preparations showing denticle morphology in 44 art sha and wsp mutants All views correspond to the same region Le the ventral most region of the A4 segment Close ups are scanning electron microscopy magnification of a representative denticle from the fourth row of denticles B mRNA expression of forked singed shavenoid kojak and wasp in the ventral embryonic abdomen A2 A6 of wild type seb mutants and embryos expressing swb in wg cells as observed fram in situ hybridization Arrowheads point to wg cells Anterior is to the left in all pictures DON 10 1371 journal phin 0040290 9004 Le PLoS Biology www plosbiology ora September 2006 Volume 4 Issue 9 e290 40 lable 51 However we found that wash sb
125. e de fusion GFP Tyn lorsque le transg ne correspondant est exprim sous le contr le du pilote enG4 dans l piderme embryonnaire Des exp riences pr liminaires sugg rent que Tyn est en fait incapable de diffuser dans ce contexte Nous envisageons pour compl ter cette tude de construire une prot ine de fusion GFP Dyl afin de d terminer si cette fonction diffusible est sp cifique de M Une ventuelle fonction de et ou Dyl au cours de la morphogen se de l aile reste aussi tablir Les premieres immunocolorations r alis es par H l ne Chanut montrent une distribution pr f rentielle dans diff rentes r gions du compartiment membranaire apical des prot ines Tyn et Dyl dans les cellules pith liales des ailes pupales figure 40 Il est donc possible que ces prot ines ZPD collaborent fonctionnellement avec M pour le remodelage de la forme des cellules de l aile La surexpression de Dyl ou de Tyn ne compense pas l absence de m pour la morphogen se de l aile sugg rant qu il existe dans ce tissu aussi une sp cificit fonctionnelle de chaque prot ine vis vis de la r organisation morphologique du compartiment apical 135 Figure 40 Localisation des prot ines et Dyl dans les ailes pupales Image en microscopie confocale de la surface d une aile pupale entre 40 et 60 heures APF Coloration de la F actine en rouge et immunocoloration de Tyn ou Dyl en vert Tyn se localise la surface apicale des ce
126. e diff re entre les cellules denticules et les cellules lisses Ce crible nous a donc permis d identifier deux g nes m et y exprim s sp cifiquement sous le contr le de Svb et modifiant la composition de la matrice extracellulaire apicale qui recouvre les denticules Ces donn es ouvrent de nouvelles perspectives dans le contr le du changement de la forme cellulaire montrant que des prot ines extracellulaires apicales sont impliqu es Nous proposons que M tablisse un lien direct entre la membrane apicale de la cellule et la cuticule n cessaire au sculptage de la morphologie des denticules De plus nous mettons en vidence que deux autres genes ZPD sont r gul s par Svb CG15335 et CG16798 Tableau 51 de l article Pour mieux comprendre le r le de la matrice extracellulaire apicale dans la modification de la forme cellulaire nous d velopperons plus loin l analyse des fonctions mol culaires de m ainsi que celle des autres genes ZPD au cours de la morphogen se pidermique embryonnaire 50 II La r gulation des genes cibles de Svb INTRODUCTION La r gulation de l expression des g nes est un aspect fondamental du d veloppement et de la diff rentiation cellulaire Le principe g n ral des m canismes de r gulation de l expression des g nes chez les eucaryotes a t initialement propos d s 1969 par Britten et Davidson Les genes co exprim s en r ponse un signal particulier contiendraient des l
127. e expression of ple Dee and emd are unaffected im sub mutants we found that y is regulated by sub Although y expression is strongly up regulated in a subset of denticle cells in late wild type embryos this expression is undetect able in sub mutants Figure 7 Furthermore ectopic expression of sub turns on y transcription in additional cell stripes Figure 7C showing that sub regulates y expression in epidermal cells Therefore in addition to cytoskeletal organization sib also controls cuticle pigmentation through the up regulation of y expression in denticle cells Discussion Using denticle pattern as a readout of developmental cues generations of fly geneticists have collectively gained a rare insight into the mechanisms acting to specily different cell populations Quite paradoxically how this pattern informa tion is connected to cell shape remodeling for denticle formation lias SER ai remained an unsolved quest I Hn September 2006 Volume 4 Issue 9 e290 42 gt 1 am i De hi dg 4 Fug WS 1E g T E ACE In 5T E A Ce Rs P 8 FAR ga A e x h 58 kV ri e n F ee mm ag fw Ad Le yellow mRNA A A A A Figure 7 svb Controls Denticle Pigmentation through the Regulation of Transcription A Cuticle preparations A3 A4 segments showing the effect of Ptc Gald driven ectopic expression of svb Ectopic cuticular extensions arrowheads are as d
128. e sauvage dans les cellules mutantes adjacentes soutenant que la diffusion est bien une qualit intrins que la prot ine M La mise en vidence de cette fonction diffusible de M est inattendue surtout la lumi re des r sultats de MET ot nous montrons l importance de cette prot ine dans l attachement local de la cuticule la membrane apicale Nous avons donc voulu approfondir nos investigations sur cette question dans la suite nos travaux 2 D couplage des fonctions de M ancr e versus diffusible a Fonction du domaine transmembranaire La position du site potentiel de clivage aux Furines entre le domaine ZPD et le DTM de M suggere que si forme diffusible il y a elle devrait ne pas comporter la r gion transmembranaire et cytoplasmique de M Nous avons donc test la fonction in vivo d une prot ine M tronqu e des r gions correspondantes mimant ainsi une prot ine constitutivement cliv e ce site GFP MAC ter La surexpression de cette prot ine dans un contexte sauvage ne g n re aucune modification de la forme des denticules montrant que GFP MAC ter n a pas d effet dominant sur la fonction de M endog ne figure 35 GFP MAC ter n est pas capable de restaurer la forme sauvage des denticules d un embryon mutant m quelque soit le pilote utilis daGal4 ou enGal4 figure 35 Cependant l tiquette GFP nous permettra de suivre la localisation de cette prot ine afin d tablir si l absence de sauvetage est li
129. effectu es sur des embryons de 19h APF dans lesquels les trois couches de la cuticule sont synth tis es mais dont la maturation n est pas encore achev e La procuticule en contact direct avec la membrane apicale va s paissir la fin de l embryogen se et jusqu closion de l embryon principalement grace la s cr tion de chitine Moussian et al 2006 Nos analyses des embryons mutants pour les prot ines ZPD 22h APF juste avant l closion n ont r v l aucun d tachement pour l ensemble des mutants figure 29 En revanche pour les mutants neo nyo et mye nous avons remarqu que cette couche est moins organis e et moins dense sugg rant un d faut dans l association des fibres de chitine figure 29 Pourtant les mutants de la chitine synthase krotzkopf verkehrt kkv responsable de la production de chitine ne montrent aucun d faut de la morphologie g n rale des denticules alors que la chitine et la procuticule y sont presque totalement absentes Moussian et al 2005 Ces donn es sugg rent donc que ce n est pas l paisseur mais plut t la composition en prot ines ZPD de la procuticule qui est essentielle forme g n rale de la denticule Neo Nyo et Mye pourraient comme ZPI et ZP2 former des fibres qui seront incorpor es dans la procuticule pour y structurer l assemblage des feuillets de chitine Nous avons d montr que M et Tyn s accumulent dans la procuticule et ceci dans des r gions sp cifi
130. ell Biol 22 3111 20 Zigmond S H 2004 Formin induced nucleation of actin filaments Curr Opin Cell Biol 16 99 105 152 AUTEUR Isabelle Fernandes TITRE Involment of Zona Pellucida domain proteins during epidermal cell shape changes in Drosophila embryos PhD SUPERVISOR Dr Serge Plaza PLACE AND DATE OF DEFENSE 28 Septembre 2009 13h30 ABSTRACT The Zona Pellucida Domain ZPD defines a conserved family of membrane anchored matrix proteins that are as yet poorly characterized with respect to their functions during development Using genetic approaches in flies we show here that a set of 8 ZPD proteins is required for the localized reorganization of embryonic epidermal cells during morphogenesis Despite varying degrees of sequence conservation these ZPD proteins exert specific and non redundant functions in the remodeling of epidermal cell shape Each one accumulates in restricted sub regions of the apical compartment where it organizes local interactions between the membrane and the extracellular matrix In addition ZPD proteins are required to sculpture the actin rich cell extensions and maintain appropriate polarization of the apical compartment These results on ZPD proteins therefore reveal a functional sub compartmentalization of the apical membrane and its role in the polarized control of epithelial cell shape during development KEY WORDS cell morphogenesis epidermis extracellular matrix polarity ADMINI
131. elle comme pr c demment comparer avec la figure 18 Enfin la r gion EnDyl31 montre une activit supp rieure celle de la r gion EnDyll seule surtout en dorsal Toutefois la combinaison des deux s quences n est pas suffisante pour reproduire l expression complete du g ne dyl montrant qu il n existe pas de coop rativit entre ces deux r gions La combinaison de pr dictions in silico et d analyses in vivo sugg rent donc fortement que la r gulation de la transcription d un g ne par Svb requiert la liaison d autres facteurs trans r gulateurs dont nous ne connaissons pour le moment que les motifs de fixation En effet de nombreux sites Ovo Svb sont retrouv s dans les s quences interg niques de ses genes cibles sans pour autant tre tous utilis s in vivo Nos analyses montrent l existence de motifs additionnels significativement associ s l activit transcriptionnelle des r gions g nomiques test es Ces donn es sugg rent donc que ces motifs permettraient de d finir collectivement un CRM dirigeant l expression dans certaines cellules pidermiques Une premi re hypoth se serait que ces sites recrutent des co facteurs transcriptionnels n cessaires in vivo la fixation ou la stabilisation de la liaison de Svb sur ces sites Alternativement ces motifs pourraient participer directement la r gulation de la structure de la chromatine par exemple en positionnant les nucl osomes Comme dans le cas du g ne
132. emble de ses cibles Au contraire le contexte cellulaire e g le paysage trans r gulateur et pig n tique pourrait tre d terminant et permettre au m me facteur de transcription de d clencher l expression de diff rentes cibles en fonction du tissu observ L encore notre compr hension de ces ph nom nes reste pour le moins lacunaire Nous d velopperons ici en quoi nos travaux peuvent contribuer fournir des outils int ressants pour aborder ces questions g n rales La comparaison des m canismes de la morphogen se cellulaire entre l piderme embryonnaire et l pith lium alaire qui va se diff rencier au cours de la m tamorphose pour rapidement d g n rer chez l adulte nous offre un mod le d tude int ressant Le statut d expression de svb ainsi que le r le que ce facteur pourrait jouer dans le processus de 139 miniature mRNA CG16798 5110 C D st9 CG15335 CG15335 E Fo stia st10 CG13432 313432 G sti0B CG17131 CG17131 Figure 41 Expression des g nes ZPD au cours de l ovog n se CG15335 correspond cypher et CG17131 trynity Les chiffres correspondent au stade st des chambres oeuf observ es La fl che dans l image H montre une expression de tyn renforc e dans les cellules folliculaires ant ro dorsales proches du noyau de l ovocyte Jazwinska et al 2004 morphogen se reste cependant pr ciser Delon et al 2003 En plus de m
133. ement pour promouvoir la formation correcte des extensions cellulaires 124 IV M paradoxe d une diffusion 125 INTRODUCTION Notre tude de la famille ZPD chez la Drosophile a conduit l identification de 9 g nes ZPD co r gul s par Svb et directement impliqu s dans le remodelage apical des cellules pidermiques embryonnaires La denticule est cependant un systeme modele dont la petite taille limite la r solution de son tude Nous nous sommes donc int ress s a un autre pith lium celui de ale adulte dans lequel le r le de certaines prot ines ZPD a d j t tabli Les cellules pith liales de Tale engagent une r organisation de leur cytosquelette d actine au cours de la diff renciation afin de modifier leur forme Entre 32 et 60 heures apr s la formation du puparium l pith lium est compos de cellules colonnaires qui vont ensuite s aplatir pour quadrupler leur superficie Chaque cellule va aussi mettre sa face apicale une extension riche en actine pr figurant les trichomes de l aile adulte Fristrom et al 1993 En absence de la taille de l aile est fortement r duite cause d un d faut d tirement des cellules pith liales Roch et al 2003 De plus les trichomes sont d form s et ramifi s montrant que M comme dans l piderme embryonnaire est n cessaire la r organisation de la forme des cellules de l aile adulte Nous avons donc test l existence de fonctions cell
134. ence ol preventing Svb binding vivo we intrao the 0 4 kb construct and generated corresponding transgenic lines All the tested 4KminKO lines 12 lost m like epidermal expression with only some variable residual staining variable from line to line Figure 2 These results demonstrate that 5yb binds to an evolutio duced these two mutations mto enhancer narily conserved element of the gene which behaves as a wh responsive enhancer in the embryonic epidermis Muta tions preventing Shavenbaby binding to this element abolish its enhancer activity thus providing strong evidence that Sach exerts a direct control on n transcription Miniature Is Required for Denticle Formation encodes a membrane protein 30 which has recently been implicated in actin based remodeling of wing cell shape during metamorphosis 28 31 To examine whether m also plavs a role in embryonic epidermal cells we analyzed consequences of m inactivation on denticles Although the absence of m does not affect the denticle pattern detailed examination shows that dent iles are altered mom mutant embryos Figure 5 In wild type cach denticle row has a characteristic morphology hut all denticles share a A s wild type x m A A A e o Ki a a Coo S iet q 1 4 A 4 e ZE b 4 pte gald gt gt EP 345m m 0 4Kmin gald min 4 LK Co ge A 4 E hl gt FRA A Se ff es a 4 4 A A
135. enerates an extended ovo protein isoform required for Drosophila oogenesis Dev Biol 246 366 706 Sanson B 2001 Generating patterns from fields of cells Examples from Drosophila segmentation EMBO Rep 2 1083 8 Sanson B Alexandre C Fascetti N and Vincent J P 1999 Engrailed and hedgehog make the range of Wingless asymmetric in Drosophila embryos Cell 98 207 16 150 Santambrogio S Cattaneo A Bernascone I Schwend T Jovine L Bachi A and Rampoldi L 2008 Urinary uromodulin carries an intact ZP domain generated by a conserved C terminal proteolytic cleavage Biochem Biophys Res Commun 370 410 3 Sapio M R Hilliard M A Cermola M Favre R and Bazzicalupo P 2005 The Zona Pellucida domain containing proteins CUT 1 CUT 3 and CUT 5 play essential roles in the development of the larval alae in Caenorhabditis elegans Dev Biol 282 231 45 Schejter E D and Wieschaus E 1993 bottleneck acts as a regulator of the microfilament network governing cellularization of the Drosophila embryo Cell 75 373 85 Schock F and Perrimon N 2003 Retraction of the Drosophila germ band requires cell matrix interaction Genes Dev 17 597 602 Schweisguth F Lepesant J A and Vincent A 1990 The serendipity alpha gene encodes a membrane associated protein required for the cellularization of the Drosophila embryo Genes Dev 4 922 31 Sebastiano M Lassandro F and Bazzicalupo P 1991 c
136. ensely pigmented as normal denticles as demonstrated by bright field observation right B Summary of the cuticular pigmentation pathway showing genes that are putatively implicated in the transformation of tyrosine to pigmented compounds Of the ten genes thought to be involved in pigment production we tested only four red are expressed in the embryonic epidermis at the time of cuticle formation C In situ hybridization showing the expression of y mRNA in the epidermis in late embryos In wild type y mRNA accumulates in three stripes per segment Due to deep morphological folds at this stage it is hard to define accurately the number of cell rows that express y in each segment y transcription is controlled by svb since staining is strongly decreased mutant and an ectopic stripe of y mRNA arrowheads results from svb ectopic expression in wg cells DOE 10 1371 journal pbio 0040290 q007 We show here that a single regulator Shavenbaby previously shown to integrate multiple patterning cascades governs epidermal cell remodeling through the transcrip tional control of several classes of effectors acting directly in various cellular functions This svb regulated set of effectors constitutes a developmental module used in different tissues during development to produce cuticle extensions Modifi cation of sib expression has allowed the concerted evolution of this developmental module to produce morphological diversific
137. entreprise La combinaison d approches in silico et in vivo que nous avons d velopp pour l piderme pourrait permettre d identifier de nouveaux g nes cibles d Ovo Contrairement au mod le que nous proposons pour les CRM pidermiques Ovo r gule ses cibles par des l ments contenant plusieurs sites de liaison regroup s en cluster autour du site d initiation de la transcription Lu and Oliver 2001 Il a t propos que ce clustering soit important pour int grer la dose de facteur Ovo notamment au moment de la d termination du sexe de la lign e germinale Lu and Oliver 2001 Ainsi bien que les facteurs Ovo versus Svb puissent se substituer l un l autre quand ils sont artificiellement exprim s au moins dans l piderme embryonnaire leur mode de reconnaissance des CRM dans leur tissu endog ne respectif semble tre diff rent Au cours de son stage de Master 1 Emilie Benrabah a test une ventuelle expression ovarienne des CRM pidermiques que nous avons identifi s Aucun d entre eux n a donn d expression sp cifique dans les ovaires montrant qu ils ne sont pas reconnus par la prot ine Ovo dans ce contexte Par contre Emilie a montr que les genes sn et m sont r gul s par Ovo dans la lign e germinale De plus elle a pu identifier des r gions proximales du promoteur de ces g nes susceptibles d tre responsables de cette r gulation De 141 mani re int ressante les promoteurs de sn et m contiennent des clus
138. er E and Wassarman P M 2002 The ZP domain is a conserved module for polymerization of extracellular proteins Nat Cell Biol 4 457 61 Jovine L Qi H Williams Z Litscher E S and Wassarman P M 2004 A duplicated motif controls assembly of zona pellucida domain proteins Proc Natl Acad Sci U S A 101 5922 7 Jovine L Qi H Williams Z Litscher E S and Wassarman P M 2007 Features that affect secretion and assembly of zona pellucida glycoproteins during mammalian oogenesis Soc Reprod Fertil Suppl 63 187 201 K Kiehart D P Galbraith C G Edwards K A Rickoll W L and Montague R A 2000 Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila J Cell Biol 149 471 90 Koppen M Fernandez B G Carvalho L Jacinto A and Heisenberg C P 2006 Coordinated cell shape changes control epithelial movement in zebrafish and Drosophila Development 133 2671 81 L Laprise P Beronja S Silva Gagliardi N F Pellikka M Jensen A M McGlade C J and Tepass U 2006 The FERM protein Yurt 1s a negative regulatory component of the Crumbs complex that controls epithelial polarity and apical membrane size Dev Cell 11 363 74 Laprise P Lau K M Harris P Silva Gagliardi N F Paul S M Beronja S Beitel G J McGlade C J and Tepass U 2009 Yurt Coracle Neurexin IV and the Na K ATPase form a novel group of epithel
139. er la cuticule la membrane apicale alors que pour les prot ines Neo Nyo et Mye nous n avons pas constat de d tachements figure 29 Nous avons d j vu que les mutations de ces trois g nes constituent une m me classe ph notypique sugg rant leur implication dans un m me m canisme fonctionnel Elles pourraient donc constituer des 119 tyn 16h H tyn 21h E ET A Figure 29 Analyse ultrastructurale de d fauts de denticules dans les mutants m dyl tyn et nmn Images en MET d une cellule a denticules dans des embryons sauvages ml dyl gt 238 et dans des embryons au d but du stade 17 A C D G I et K ou juste avant closion B D F J et L L inactivation des g nes ZP perturbe les interactions entre la membrane et la cuticule dans diff rentes r gions de la surface apicale Les gros plans A C D G et montrent un d tachement r gion sp cifique dans les diff rents mutants En fin d embryog nese la cuticule s est paissie B D F H J et L surtout la procuticle en contact direct avec la membrane apicale Sur les grossissements B D F H J et L les d fauts observables cinq heures plus t t ne sont plus visibles Les prot ines ZP sont donc requises au cours des tapes pr coces de la synthese de la cuticule PG38 h t romeres fibrillaires comme ZP1 ZP2 Jovine et al 2002 Les analyses r alis es en MET sont
140. ers le compartiment accepteur gr ce aux prot ines Rab prot ines d adressage rest es sa surface L accostage au compartiment receveur est facilit par l interaction des prot ines SNAREs qui sont associ es la v sicule v SNARE et la membrane du compartiment accepteur t 5NARE pour revue Jahn and Scheller 2006 La localisation hypersp cialis e des prot ines ZPD offre l opportunit de mieux comprendre les m canismes de l adressage des prot ines cuticulaires Dans le laboratoire H l ne Chanut m ne un crible g n tique la recherche des mutations modifiant la localisation subcellulaire de Dyl Pour cela nous utiliserons un ensemble de petites d ficiences couvrant le bras gauche 121 du chromosome II ainsi que les mutants disponibles pour les prot ines d adressage a apical tel que les prot ines Rab t SNARE ou v SNARE La distribution sp cifique des prot ines ZPD dans la membrane des cellules a denticules r vele une sous compartimentalisation suppl mentaire du domaine apical caract ristique de ces extensions En effet l extension cr e un domaine infra apical o les diff rentes prot ines ZPD s accumulent de mani re ordonn e et distincte des marqueurs sp cifiques les plus apicaux Le domaine membranaire sp cifique de l extension cytoplasmique interagit il fonctionnellement avec les d terminants g n raux de la polarit cellulaire Nous montrons que l absence des prot ines Z
141. ert de denticules et r ciproquement l expression ubiquiste de Wg conduit a ce que toutes les cellules pidermiques ventrales adoptent un destin lisse La signalisation Wnt met cependant en oeuvre deux voies distinctes la voie dite canonique qui n cessite l activit de la B Catenine ou Armadillo chez la drosophile et la voie non canonique ind pendante de la B Catenine La sp cification des cellules lisses par Wg d pend de la B Catenine et n cessite de plus la fonction de pangolin d TCF Cette prot ine est un partenaire physique de la B Catenine qui agit comme un co facteur transcriptionnel De la m me fa on la fonction de pygopus un autre membre du complexe d activation transcriptionnelle de la voie Wg est aussi indispensable la sp cification des cellules lisses Hoffmans and Basler 2007 Ces donn es montrent donc la n cessit d une nouvelle tape de r gulation de la transcription en aval des voies de signalisation Un r sultat fondateur de l quipe a t la d monstration que les voies Wg et EGF r ont une action antagoniste sur la transcription d un gene cible commun shavenbaby svb Payre et al 1999 Les premieres mutations du g ne svb ont t initialement identifi es au cours du crible historique visant identifier de g nes influant sur le patron des trichomes Nusslein Volhard and Wieschaus 1980 Les embryons mutants pour svb pr sentent une cuticule lisse avec l absence g n r
142. es It was shown that the transcription factor Shavenbaby plays a pivotal role in the formation of trichomes and underlies all examined cases of the evolutionary diversification of their pattern To gain insight into the mechanisms of morphological differentiation we sought to identify shavenbaby s downstream targets We show here that Shavenbaby controls epidermal cell shape through the transcriptional activation of different classes of cellular effectors directly contributing to the organization of actin filaments regulation of the extracellular matrix and modification of the cuticle Individual inactivation of shavenbaby s targets produces distinct trichome defects and only their simultaneous inactivation prevent trichome formation Our data show that shavenbaby governs an evolutionarily conserved developmental module consisting of a set of genes collectively responsible for trichome formation shedding new light on molecular mechanisms acting during morphogenesis and the way they can influence evolution of animal forms Citation Chanut Delalande Fernandes Roch F Payre F Plaza 5 2006 Shavenbaby couples patterning to epidermal cell shape control PLoS Biol 4 9 e290 DOI 10 1371 journal phia 0040290 Introduction A general feature of development is the control of tissue and cell morphogenesis a process whereby each cell acquires specific shape depending upon its individual identity Although the mechanisms that permit the pat
143. es une r duction de la taille des denticules Ces trois g nes proviennent probablement d une duplication plus r cente car nyo et mey sont encore associ s en tandem la m me position g nomique supp 2 Finalement les sauvetages in vivo d montrent que la perte de fonction d une prot ine ZPD ne peut tre compens e par la surexpression d une autre montrant ainsi que chaque prot ine ZPD poss de une fonction sp cifique dans la formation des denticules Ce r sultat surprenant confirme que malgr le fort degr de similitude existant entre les prot ines ZPD elles pr sentent des fonctions non redondantes 117 Taille des v sicules en nm HRP M HRP Tyn Figure 27 Analyse ultrastructurale de la localisation de M HRP et Tyn HRP dans les cellules a denticules L expression des transg nes m HRP et tyn HRP dans des embryons sauvages est dirig e par le pilote m Gal4 dans l ensemble des rang es cellulaires produisant des denticules Image en MET un grandissement X10 000 des embryons au stade 16 Les v sicules contenant M HRP mesurent 10nm et marqu es la fois sur leur membrane et l int rieur fl che rose Les v sicules contenant Tyn HRP sont plus grandes 20nm et ne sont marqu es que sur leur pourtour membranaires fl che verte En moyenne les v sicules de s cr tion contenant Tyn HRP sont deux fois plus grandes que celles contenant M HRP cf histogramme Comment des prot ines partageant u
144. es au cours du d veloppement et plus encore dans les tapes de diff renciation terminale incluant la morphogen se restent essentiellement d couvrir aujourd hui Comment parmi l ensemble des motifs de liaison potentiels pr sents au sein du g nome un facteur de transcription identifie t il les sites fonctionnels dans un tissu donn Pour le facteur de transcription Svb la s quence reconnue est aCnGTTaca dont les lettres capitales repr sentent les nucl otides invariants Garfinkel et al 1994 Un calcul simple pr dit l existence de plus de 10 000 sites potentiellement reconnaissables par ce facteur soit un motif au voisinage de chaque g ne Nos r sultats montrent que Svb ne r gule l expression que d une centaine de g nes impliqu s dans la diff renciation des cellules pidermiques embryonnaires Nous montrons un enrichissement significatif des sites de liaison Ovo Svb dans les g nes cibles de Svb quel que soit le standard choisi autres g nes pidermiques ind pendant de Svb ou l ensemble des g nes de la Drosophile Paradoxalement nous ne d tectons pas de vrai clustering de sites dans les r gions g nomiques des g nes cibles de Svb Nous montrons que de courtes s quences de 200bp Ikb d plac es de leur contexte chromatinien endog ne suffisent diriger fid lement l expression svb d pendante d un g ne 137 rapporteur dans les cellules pidermiques a trichomes Cet enrichissement
145. es jonctions cellulaires L tablissement correct des jonctions entre les cellules pidermiques est critique pour la fonction du tissu assurant la coh sion de l pith lium et emp chant la diffusion des mol cules internes ou externes le long des membranes lat rales des cellules adjacentes a Du blastoderme syncytial au blastoderme cellulaire Nous avons introduit plus haut que les premi res tapes du d veloppement de la drosophile se d roulent dans un large syncytium favorisant par exemple la formation de gradients morphog n tiques Le processus dit de cellularisation va ensuite permettre d int grer chacun des noyaux dans une cellule individuelle pour former une monocouche cellulaire la p riph rie de l embryon blastoderme cellulaire L invagination de la membrane plasmique entre chaque noyau pr sente d abord une phase lente suivie d une phase plus rapide de 18 formation de membrane Lecuit and Wieschaus 2000 Turner and Mahowald 1976 Au cours de cette invagination le complexe prot ique Cadh rine Cat nine et la By spectrine vont tre accumul s Ce complexe est impliqu dans la formation des jonctions adh rentes AJ connues pour tablir un contact particuli rement troit entre les cellules Ces invaginations membranaires pr sentent aussi une accumulation d actine et de myosine corticale produisant la force n cessaire pour ins rer la nouvelle membrane lat rale entre les noyaux Warn and Robert Nicou
146. es sur la membrane cellulaire et d autre part les prot ines SNAREs associ es aux v sicules V SNARES aussi appel R SNAREs figure 12 La Syntaxin 1 Syx1A est une t SNARE impliqu e dans la fusion des v sicules la face apicale des cellules Les embryons de drosophile mutants pour syx A pr sentent une cuticule g n ralement plus fine et parfois m me l absence d picuticule S1 ces mutants ne pr sentent pas de d fauts de production ou de s cr tion de la chitine Moussian et al 2007 une alt ration de la structure lamellaire de la procuticule est cependant notable sugg rant que Syx1A joue un r le dans l acheminement de prot ines n cessaires l assemblage des fibres de chitine au sein de la matrice extracellulaire Moussian et al 2007 Pour identifier de 25 na A Ml E AA D yoy ys vid ey eee w ATA NAN 1234 567 Figure 13 Patron segmentaire des trichomes A Image d une larve Ll caract ris e par les ceintures de denticules ventrales B C Grossissement des trichomes de la larve B Vue dorsale Quatre types de cellules sont sp cifi s en fonction de leur position A P sur le segment Les trichomes de type 1 sont larges pigment s et orient s ant rieurement Les cellules de type 2 s cr tent une cuticule nue Les trichomes de types 3 dont durs et pigment s mais plus fins que les types 1 et orient s post rieurement Les trichomes de types 4 sont longs et fins et o
147. eur PS d signe les fronti res parasegmentaires et S les fronti res segmentaires L ant rieur de l embryon est gauche la face apicale des cellules est en haut Des petits points bleus repr sentent le gradient extracellulaire de la prot ine Wg D apres de Sanson et al 2001 b Mise en place d un centre organisateur Au cours des tapes pr coces de l embryogen se stades 9 10 les expressions de Wg et Hh sont interd pendantes figure 7A L activation paracrine de la voie Wg maintient l expression du facteur de transcription En dans les cellules adjacentes celles exprimant Weg R ciproquement le facteur En active l expression du morphog ne Hh qui renforce l expression de Wg dans les cellules voisines L expression de En Hh devient ensuite ind pendante de Wg marquant ainsi le d but de la signalisation intra segmentale figure 7B Des le stade 11 la combinatoire des genes de polarit et des g nes hom otiques Hox d limite l expression du facteur Serrate Ser un ligand de la voie Notch une bande unique de cellule dans chaque PS abdominal Hh s cr t par les cellules exprimant En r prime dans les rang es 1mm diatement post rieures l expression de Ser figure 7C De son cot Wg r prime aussi l expression de Ser en diffusant vers les rang es cellulaires ant rieures Ser via l activation de la voie de signalisation Notch stimule l expression de rhomboid rho dans les cellules directement adjacentes
148. eur en activant la transcription de hunchback B Le d terminant post rieur est cod par l ARNm de nanos qui se localise l extr mit post rieure La prot ine Nanos diffuse vers l ant rieur et r prime la traduction des ARNm du jeune embryon Cette expression est indispensable l expression des g nes knirps et giant C Le syst me terminal est compos de mol cules extracellulaire d origine maternelle mises en r serve dans la membrane vitelline Ces mol cules se fixent leur r cepteur cod par le g ne maternel torso L activation de la prot ine Torso stimule l expression du g ne zygotique failless D Le syst me dorso ventral utilise lui aussi un syst me ligand r cepteur Le r cepteur Toll r parti uniform ment sur la surface de l embryon est activ uniquement dans la r gion ventrale gr ce la fixation de son ligand lui m me distribu en gradient depuis la r gion ventrale L activation de Toll permet la prot ine Dorsal de migrer dans le noyau des cellules ventrales pour activer twist et r primer zen 1 R gulation de la mise en place du patron des trichomes La formation des trichomes de la larve de drosophile est le produit de la diff renciation morphologique des cellules de l piderme embryonnaire L piderme est un pith lium compos d une monocouche cellulaire constituant un mod le simple pour la compr hension g n rale des processus de morphogen se La morphogen se de l piderme requiert sch
149. eures du d veloppement Il existe de nombreux g nes dont la mutation affecte la maturation de la ZA comme scribble scrib sdt ou crb En absence de ces produits la cellularisation et la formation de la ZA ne sont pas affect es mais les AJs se fragmentent et ne parviennent pas former une ceinture apico lat rale continue Tepass et al 1996 Le composant principal des jonctions adh rentes est la E Cadherine une large prot ine transmembranaire qui tablit des interactions homotypiques fortes capables de relier entre elles deux cellules voisines La r gion intra cytoplasmique de la E Cadherine interagit avec la Catenine produisant un lien troit entre les jonctions cellulaires et le cytosquelette d actine Le domaine membranaire apical est d fini par l accumulation de deux complexes prot iques le complexe Crb et le complexe Baz figure 9 Le complexe Crb est compos de la prot ine cytoplasmique Drosiphila Pals associated tight junction proteint DPatJ qui se lie la prot ine MAGUK Stardust Sdt elle m me li e via le motif ERLI au domaine carboxy terminal de Crb Bachmann et al 2001 Pielage et al 2003 Le complexe Baz est compos des prot ines DmPAR 6 et DaPKC toutes deux li es la prot ine Baz figure 9 Ces complexes tablissent de larges chafaudages mol culaires en association avec la membrane apicale n cessaires pour activer de mani re localis e certains signaux cellulaires et pour polariser le traffi
150. everal factors involved in microfila ment formation or bundling We provide evidence that xis directly controls the transcription of miniature ml which encodes a membrane protein containing a Zona Pellucida ZP domain and we show that m is required for the membranelcuticle interaction in the denticle We also identified a sob target responsible for denticle pigmentation therefore demonstrating that sub coordinates several aspects of denticle differentiation Finally we show that sub regulates the same set of genes for the formation of dorsal hairs and suggest that the evolution of the dorsal hairs pattern in D serhellse results from the concerted modification of the expression of cellular effectors regulated by sib Results svb Directs m Expression in the Embryonic Epidermis As a first step towards identifying players involved in denticle formation we searched lor genes expressed in epidermal cells by conducting a systematic survey of expression patterns available from the Berkeley Drosophila Genome Project 27 and the literature Fable 81 Among the approximately 400 genes reported to be transcribed in the epidermis we found that only a small number 210 are expressed in a segmentally repeated pattern at a time of epidermal cells morphological differentiation We further analyzed the epidermal expression of these genes by in situ hybridization and tested for its dependence on sub Table 51 We first focused on m 28 because its
151. f cuticle as suggested by the identi fication of an additional target encoding a putative chitin binding protein Table 51 Svb Governs a Morphological Module Experimental evidence suggests that sub is situated at the bottom of regulatory cascades determining trichome pattern ing and is in turn directly responsible for triggering the cellular program of denticle formation Figure 8 First sub remains the most downstream regulator determining the pattern of denticles and dorsal hairs despite the unprece dented extent of genetic screens based upon cuticle observation which identibied most members of the Wg and DER pathways Second chome defects sub mutants display the strongest phenotype in which most denticles and dorsal hairs are replaced by naked cuticle Third we show that sub directs the expression ol genes involved in various aspects ol denticle formation including control of the cytoskeleton membrane matrix organization cuticle differentiation Finally we provide evidence for a direct control of one of the targets m We have defined a 400 bp m enhancer reproducing the endog enous expression pattern of m in the epidermis and show that the Svb transcription factor binds specifically to this evolutionarily conserved region Substituting 2 bp in this among mutat ens producing iri cis regulatory element preventing Svb binding is sufficient to YE PLoS Biology www plosbiology org svh Directs Epidermal Cell Di
152. f tyn leads to lethality at later stages Re expression of Tyn fully rescued tyn mutant defects in embryos and also restored adult viability Fig 2B In contrast M over expression was not able to suppress fyn phenotypes with respect neither to denticles nor to viability Reciprocally Tyn failed to rescue m phenotypes We then assayed the rescuing ability of Dyl and Zye that like M lacks PAN domains as well as Neo and Nyo two close epidermal relatives of Tyn see Fig 1A Expression of Dyl slightly modified the denticle phenotype of m embryos but did not rescue adult wings and did not improve tyn mutant phenotypes Zye was also unable to compensate for the absence of m or tyn Neo and Nyo which comprise three PAN domains partially restored the viability of tyn mutants without however significantly rescuing denticles Fig 2B Therefore the absence of a given ZPD protein cannot be efficiently compensated for by over expressing a different ZPD protein further demonstrating that they play non redundant roles The fact that M and have distinct functions in the same cells offers an attractive opportunity to delineate in vivo the protein regions involved in their specificity Using this genetic assay we first tested the influence of the most prominent divergence between M and Tyn proteins Le the presence of PAN domains Fig Deletion of PAN domains Tyn APAN severely impaired Tyn activity leading only to a slight modi
153. faisceaux de filaments d actine ne sont form s En r alit aucun signe des tapes m mes pr coces de la r organisation du cytosquelette n est d tectable en absence de Svb R ciproquement l expression ectopique de svb est capable d induire la formation d extensions apicales dans les cellules lisses Svb apparait donc comme n cessaire et au moins en partie suffisant pour induire la formation des extensions des cellules pidermiques via la r organisation du cytosquelette d actine Delon et al 2003 L ensemble de ces donn es d montraient Payre et al 1999 donc que l hypoth se d un lien direct entre les voies de signalisation cellulaire et la r organisation du cytosquelette des cellules a trichomes est une fausse piste voie Wg non canonique En r sum le contexte scientifique l origine de mon arriv e au laboratoire Tous les g nes connus pour modifier le patron des cellules trichomes agissaient pour contr ler collectivement l expression de svb dans les cellules pidermiques Payre 2004 De plus des tudes volutives montraient que des variations du profil des trichomes entre diff rentes esp ces taient due encore une fois la modification de l expression du gene svb Delon and Payre 2004 Sucena et al 2003 30 Sucena and Stern 2000 Tous ces r sultats sugg raient donc que le facteur de transcription Svb constituerait le r gulateur le plus en aval des r seaux de r gulation g nique d te
154. fferentiation Patterning Regulatory i Cascades y Signals Wi Tasa eh EGF r Notch Shavenbaby Singed Miniature Yellow Target Forked CG15335 CG17905 y Wasp CG16798 Shavenoid CG13913 General Factors Epidermal Cell Shape Remodelling Figure 8 Model of vb Regulation and Activity during Denticle Formation During epidermal differentiation regulatory regions governing swb transcription integrate outputs from many signaling pathways Wg Hh and DER and positional cues to define the precise subset of epidermal cells that express svb The Shavenbaby transcription factor triggers in turn the expression of different classes of genes encoding cellular effectors They are directly involved in distinct aspects of trichome formation including the reorganization of actin singed forked wasp shavenofd extracellular matrix m and cuticle y likely through modifying the activity of ubiquitous cellular machineries Additional cytoskeletal factors or regulators independent of svb might be required for the fine sculpturing of each kind of trichome characteristic of a given body region Modifications of svb cis regulatory regions thus provide a rich source of plasticity to evolve the trichome pattern and generate morphological diversification throughout species DOE 10 1371 journal pbio 00402950 9008 abrogate its in vivo enhancer ability thus suggesting that direct binding of Svb mediates the control of m e
155. fication of the denticle phenotype and no restoration of the viability of tyn mutants In addition Tyn APAN was incapable of compensating for the absence of M Reciprocally the 73 insertion of Tyn PAN domains within M M PAN Tyn resulted in a protein unable to rescue fyn mutants whereas this chimerical protein retained full m function Fig 3A Thus PAN domains are necessary for the function of Tyn but they are not sufficient to confer tyn activity when added to the M protein To test a putative contribution of the ZPD to the specificity of M and Tyn we swapped their ZP domains Fig 3A Replacement of the ZPD of M by that of M ZPTyn resulted in a protein with a reduced capacity to rescue m defects However a weak effect on the denticle phenotype of tyn mutants suggested that this chimera had gained some Tyn activity In the same vein replacing the ZPD of by that of M Tyn ZPM provided a significant rescue of m loss of function in adults albeit without rescue of denticle defects in embryos We further explored function of the ZP domain within the Miniature protein The determination of a ZP domain structure has recently shown the critical role of a conserved tyrosine residue for proper folding Monne et al 2008 A mutation substituting this tyrosine by a cysteine in human a Tectorin TECTA provokes dominant genetic deafness Verhoeven et al 1998 and its introduction into mZP3 alters its polymerization proper
156. fluorescence and further processed for cuticle analysis Measurement of cell and wing size Adult flies were stored in Glycerol EtOH 1 1 for at least 24h and then entire wings were dissected in the same medium Dissected wings were rinsed 3 times in 10096 EtOH 2 times in EtOH Lactic acid 5 8 and mounted between glass slide and coverslip in the same medium Wing preparations were stored under gentle pressure for at least 48h before examination Electronic pictures were processed using PhotoshopCs Adobe to delineate the contour of adult wings or embryonic cells Size measurement was performed using the ImageJ software http rsb info nih gov ij and data processed using Excel data sheets A minimum of 30 cells from at least 5 different embryos of the same genotype was used to estimate the mean size of embryonic epidermal cells For adult wings their size was estimated from measures done with 15 25 wings for each genotype 106 Antibodies The Cq4 DCAD2 and 4F3 antibodies developed respectively by E Knust Tepass et al 1990 T Uemura Oda et al 1994 and C Goodman Parnas et al 2001 were obtained from the Developmental Studies Hybridoma Bank developed under the auspices of the NICHD and maintained by The University of lowa Department of Biology lowa City IA 52242 Embryo staining was performed following standard procedures except fixative that was NalO4 12mM NaOPO4 25mM pH 7 2 Lysine 15mM 8 para formaldehyde EM grade B
157. gulatory cascades define the subpopulations of cells that undergo apical shape remodeling through the control of svb expression McGregor et al 2007 Payre et al 1999 Svb in turn triggers the expression of numerous factors that modify actin membrane and ECM organization Svb directly controls the expression of the ZPD gene m Chanut Delalande et al 2006 and we show here that m encodes a protein addressed to the extracellular space of the cell where it will become integrated within cuticle layers By means of a systematic analysis of the genomic set of ZPD genes in flies we find that Svb actually promotes the expression of eight ZPD genes in the precise sub 78 population of epidermal cells that form trichomes Epidermal expression of these ZPD genes generally starts at stage 14 peaks at stage 15 and becomes progressively down regulated from stage 16 This time window correlates with two major events of epidermal differentiation i e the first sign of apical shape remodeling and the onset of cuticle deposition Moussian et al 2006 While dyl nyo neo mey and tyn are transcribed in all trichome cells cyr and zye are differentially expressed between ventral and dorsal trichome cells We recently identified an additional ZPD gene CG12814 in the Drosophila genome and observed that svb triggers its expression like that of cyr and zye in restricted dorso ventral subsets of trichome cells Fig S5 This raises the possibility th
158. haping of the apical plasma membrane Matrix Biol 26 337 47 Muller H A and Bossinger O 2003 Molecular networks controlling epithelial cell polarity in development Mech Dev 120 1231 56 Muller H A and Wieschaus E 1996 armadillo bazooka and stardust are critical for early stages in formation of the zonula adherens and maintenance of the polarized blastoderm epithelium in Drosophila J Cell Biol 134 149 63 Muriel J M Brannan M Taylor K Johnstone I L Lithgow G J and Tuckwell D 2003 M142 2 cut 6 a novel Caenorhabditis elegans matrix gene important for dauer body shape Dev Biol 260 339 51 149 N Narasimha M Uv A Krejci A Brown N H and Bray S J 2008 Grainy head promotes expression of septate junction proteins and influences epithelial morphogenesis Cell Sci 121 747 52 Nusslein Volhard and Wieschaus E 1980 Mutations affecting segment number and polarity in Drosophila Nature 287 795 801 O Orr Weaver T L 1991 Drosophila chorion genes cracking the eggshells secrets Bioessays 13 97 105 Ostrowski S Dierick H A and Bejsovec A 2002 Genetic control of cuticle formation during embryonic development of Drosophila melanogaster Genetics 161 171 82 P Payre 2004 Genetic control of epidermis differentiation in Drosophila Int J Dev Biol 48 207 15 Payre F Vincent A and Carreno S 1999 ovo svb integrates Wingless and DER pathways
159. her to trigger the formation of apical cell extensions Whereas few molecules are sullicient to promote actin organization in vitro our studies indicate that in vivo many players are required to make a simple cellular extension Pursuing the identification of novel genes regu lated by swb should provide a means of identifying additional factors required for actin remodeling in vivo Denticle Formation Requires a Specific Membrane Cuticle Interaction A surprising outcome of our studies is that denticle formation requires a specific regulation of the membrane cuticle interaction We show that sub directs the expression of in trichome cells Miniature is a single pass membrane September 2006 Volume 4 Issue 9 e290 43 protein with a short cytoplasmic tail and a large extracellular region that contains a conserved Zona Pellucida ZP domain 28 ZP domains were initially identified in the three major proteins of the zona pellucida the extracellular envelope of mammalian oocytes see 50 for a recent review and they are thought to be components of apical matrices 40 We show that Miniature 15 required for the correct formation of denticles revealing novel aspect of ZP protein function in the formation of polarized cellular extensions The absence of m severely impairs the interaction between the plasma membrane and cuticle layers in denticle cells a detect likely due to a disorganization of the extracellular matrix In
160. hereas activation of the d EGF receptor DER pathway promotes denticle for mation 7 In addition Serrate Notch signaling also contrib YEA PLoS Biology www plosbiology org utes to define the denticle held 8 9 through a fine tuning of the extent of DER activation 10 The activities of We and DER pathways on epidermal differentiation converge in the transcriptional regulation of shavenbaby sub 11 DER activates sob transcription in denticle forming cells whereas We acts as a repressor in the naked territories Figure 1 leading to the precise expression of sob in denticle cells In turn sib is required for denticle formation since sub mutants display essentially naked cuticle In addition the ectopic expression of sub in smooth cells is sufficient to produce cuticular extensions 11 which nevertheless do not display the typical morphology of denticles likely because those cells lack auxiliary factors involved in the fine shaping of these structures sub which encodes a zine finger transcription factor 12 14 is the most downstream regulator so far known to specify the denticle pattern 11 Additional evidence supports the hypothesis that whereas all other upstream regulators act to define epidermal cell fates sof controls epidermal cell shape changes Although different mechanisms specify morphological ates in the Academic Editor Alonso Martinez Arias Cambridge University United Kingdom Received Feb
161. iRNAs encode iranmsamembrane proteins with similarity to C rigan cuticulin Mol Genet 207 DA I Ren X He B Stone D Kirakorda S Adler PN 2006 The shavenogl gene ol ihosi emnes a wovel actin cytoskeleton interacting protein ru promotes wing hair morphogenesis Genetics 172 1643 1654 Tilney Lt Gonnelly PS Vranich KA Shaw MK Guild GM 2000 Regulacion of actin filament cross linking and bundle shape in Drosophila bristles Cell Biol 148 87 100 Machesky IM Insall RH 1998 Scarl and the related Wiskott Aldriah syndrome protein WASP regulate the arrin cytoskeleton through the Arp complex Curr Biol amp 1347 1356 Ben Yaacor 5 Le Borge Abramson L Scehwelsgurh F Schejier ED 2081 Wasp the Wiskor Aldrich syndrome gene homologue is required for cell fate decisions mediated by Nowh signaling Cell Biol 152 1 13 Bariles JR Zheng L Li A Wierda A Chen B 1048 Small espin A third actin hundling protein and potential inrkeil protein orthobog in brush border microvilli Cell Biol 14 107 114 Adams JC 2004 Roles of fascin in cell adhesion and motility Curr Opin Cell Biol 16 500 506 38 Guild GM Connelly PS Ruggiero L Vranich KA Tilney LG 2005 Actin EI filament bundles in Prosa wing hairs Hairs and bristles use different strategies for assembly Mol Biol Cell 16 2620 563 Vignjevic D Yarar D Welch MD Peloquin Svitkina T et al 200 Formation of hlopodia like bun
162. ial polarity proteins Nature 459 1141 5 Lecuit T and Lenne P F 2007 Cell surface mechanics and the control of cell shape tissue patterns and morphogenesis Nat Rev Mol Cell Biol 8 633 44 Lecuit T Samanta R and Wieschaus E 2002 slam encodes a developmental regulator of polarized membrane growth during cleavage of the Drosophila embryo Dev Cell 2 425 36 Lecuit T and Wieschaus E 2000 Polarized insertion of new membrane from a cytoplasmic reservoir during cleavage of the Drosophila embryo J Cell Biol 150 849 60 Legan P K Rau A Keen J N and Richardson G P 1997 The mouse tectorins Modular matrix proteins of the inner ear homologous to components of the sperm egg adhesion system J Biol Chem 272 8791 801 Leptin M 1995 Drosophila gastrulation from pattern formation to morphogenesis Annu Rev Cell Dev Biol 11 189 212 Lewis E B 1978 A gene complex controlling segmentation in Drosophila Nature 276 565 70 Locke M Kiss A and Sass M 1994 The cuticular localization of integument peptides from particular routing categories Tissue Cell 26 707 34 Lu J Andrews J Pauli D and Oliver B 1998 Drosophila OVO zinc finger protein regulates ovo and ovarian tumor target promoters Dev Genes Evol 208 213 22 Lu J and Oliver B 2001 Drosophila OVO regulates ovarian tumor transcription by binding unusually near the transcription start site Development 128 1671 86 148
163. iation relies on the collective activity of numerous effectors nane ol them being absolutely indispensable To discriminate be tween these possibilities we analyzed embryos carrying combinations of mutations in different sub targets The phenotype of sa double mutants is slightly aggravated when compared to hat of ap or f mutants lable 52 When m mutation is combined with either or f denticles display both the crooked extremities found in sn and f and the defects characteristic of m In addition the inactivation of m and or sm causes denticle splitting as revealed by a significant increase in the number of abnormal denticles per row Table 52 Simultaneous inactivation of all three genes leads to small and highly misshapen denticles that are more affected than in double mutants Figure and Table 82 Adding a fourth mutation ws or sha further impairs the formation of denticles leading in many cases to their replacement hy naked regions Figure The cumulated Inactivation of sib targets thus progressively leads to tiny and highly malformed denticles ending in the inhibition of denticle formation Figure 5A A similar effect is observed in the dorsal region where combining mutations in sub targets ultimately prevents dorsal hair formation in addition ta producing cumulative morphological defects Figure 5B These results demonstrate that the morphological differ entiation of the embryonic epidermis requires the
164. icles and dorsal hairs These results show that the sub targets identified so far act collectively to promote the formation of various epidermal extensions despite the fact that they display different shapes In addition sb mutations also alfect the formation of adult wing hairs and antennae laterals 14 which are known to require the activity of several suh targets identifed in the embryonic epidermis m sn L sha for adult wing hairs and sm f sha for antennae laterals How can the same set of suh regulated effectors participate in the lormation of epidermal extensions of diversified morphology Additional cytoskeletal factors can be differentially expressed in distinct epidermal regions independently of sub It is also possible that other regulators modulate the response to sub cf the weak expression of fand ws in naked cells expressing ectopically sob when compared to that of an m sha and y Finally upstream signaling pathways certainly contribute to the sculpting of each kind of trichome through the regulation of the expression and or activities of cellular effectors Recent studies have shown that members of the planar polarity pathway PCP are indeed involved in defining denticle polarity in response to signaling pathways 23 Interestingly one of the identified sub targets sheavenoid has recently been reported to interact with PCP in the adult wing raising the possibility that such a dialog also occurs during embryonic epi
165. ida domain containing proteins CUT 1 CUT 3 and CUT 5 play essential roles in the development of the larval alae in Caenorhabditis elegans Dev Biol 282 231 245 Schock F and Perrimon N 2002 Molecular mechanisms of epithelial morphogenesis Annu Rev Cell Dev Biol 18 463 493 oebastiano M Lassandro F and Bazzicalupo P 1991 cut 1 a Caenorhabditis elegans gene coding for a dauer specific noncollagenous component of the cuticle Dev Biol 146 519 530 Stark A Lin M F Kheradpour P Pedersen J S Parts L Carlson J W Crosby M A Rasmussen M D Roy S Deoras A N et al 2007 Discovery of functional elements in 12 Drosophila genomes using evolutionary signatures Nature 450 219 232 Sucena E Delon l Jones l Payre F and Stern D L 2003 Regulatory evolution of shavenbaby ovo underlies multiple cases of morphological parallelism Nature 424 935 938 Takito J and Al Awgati Q 2004 Conversion of ES cells to columnar epithelia by hensin and to squamous epithelia by laminin J Cell Biol 766 1093 1102 Tian E and Ten Hagen K G 2007 O linked glycan expression during Drosophila development Glycobiology 17 820 827 Tordai H Banyai L and Patthy L 1999 The PAN module the N terminal domains of plasminogen and hepatocyte growth factor are homologous with the apple domains of the prekallikrein family and with a novel domain found in numerous nematode proteins FEBS Lett 461 63
166. idermiques elle va ensuite se redistribuer la base et l int rieur des denticules naissantes mais avec un marquage plus punctiforme que celui de l actine F Price et al 2006 Le complexe prot ique Arp2 3 permet la nucl ation des filaments d actine cr ant ainsi des branchements sur lesquelles de nouveaux filaments seront initi s pour revue Pollard and Borisy 2003 Au cours de l extension de la bandelette germinale Arp3 est localis aux bordures cellulaires ainsi que dans le cytoplasme puis il se concentre lui aussi la base des extensions naissantes avant de se localiser le long des trichomes Price et al 2006 APC2 est un r gulateur de l organisation des cytosquelettes d actine et ou de microtubules McCartney et al 1999 Des l initiation de la r organisation apicale des cellules a trichomes APC2 colocalise avec les filaments d actine en cours d longation Delon et al 2003 Price et al 2006 La formation des trichomes repose donc sur le contr le polaris de l organisation du cytosquelette d actine corticale impliquant diff rents facteurs de r gulation de la polym risation des filaments et de leur assemblage en faisceaux 3 3 Shavenbaby un niveau suppl mentaire de r gulation transcriptionnelle Nous venons de voir ici que la formation des trichomes repose sur la r organisation du cytosquelette et pr c demment nous avons pr sent les cascades de r gulations transcriptionnelles d terminant
167. indiquant que M est n cessaire la dans la restriction du domaine d accumulation de Dyl mutant leur donnant un aspect fourchu M est enrichi dans la r gion m diale de l extension cellulaire les mutants m montrent une absence de constriction donnant la denticule son aspect triangulaire Les denticules des mutants tyn et zye sont affect es leur base ou chacune des deux prot ines est accumul e L analyse ultrastructurale r vele que les d fauts de forme observ s sont la cons quence d un d tachement local de la membrane apicale par rapport l aECM sugg rant que les prot ines ZPD assurent la coh sion entre la cuticule et la membrane Des r sultats r cents montrent que Piopio Pio jouerait un r le quivalent dans les cellules lisses o elle semble aussi associ e la cuticule Bokel et al 2005 Ces m mes auteurs montrent que l absence de pio entraine des d tachements de la cuticule De plus l analyse ultrastructurale de la localisation des prot ines de fusion M HRP et Tyn HRP a r v l que ces deux prot ines s accumulent sp cifiquement dans la procuticule Ces prot ines sont donc des constituants de la cuticule s incorporant dans la couche souple et maintenant un lien avec la membrane apicale Ainsi les prot ines ZPD modifieraient la composition locale de l aECM et maintiendraient la cuticule attach e la membrane apicale La denticule tant une architecture complexe nous proposons que les prot ines
168. ine M agit de facon cellulaire non autonome au moins en partie galement dans ce tissu Nous avons alors reproduit au cours de la morphogenese alaire le m me type d exp riences que celles utilis es pour l piderme embryonnaire b Fonction du domaine transmembranaire L expression de GFP MAC ter dans le compartiment post rieur est incapable de restaurer une taille d aile correcte d montrant que la fonction ancr e de M est requise au cours de la morphogenese de l aile Toutefois une l g re augmentation de la taille du compartiment post rieur est constat e montrant que cette prot ine diffusible n est pas d nu e de toute fonction figure 371 En effet les d fauts observ s au niveau cellulaire sont visiblement att nu s montrant que cette prot ine extracellulaire compense partiellement l absence du produit M endog ne figure 37J L tiquette GFP nous permettra de suivre la localisation de cette prot ine pour la comparer celle de la prot ine sauvage endog ne ou GFP H l ne Chanut a d but cette analyse et ses premiers r sultats sugg rent que M pourrait diffuser depuis sa source d expression et se localiser sp cifiquement la face apicale des cellules r ceptrices figure 38A Des images similaires sont obtenues pour la prot ine GFP MAC ter figure 38B Enfin l tude de la prot ine doublement tiquet e GFP M mCherry montre que les deux signaux pr sentent une distribution diff rentielle compatible a
169. ing cells red lines Reciprocally ectopic expression of swb in wg cells triggers the formation of supermumerary denticles and ectopic expression of m arrowheads DOl 10 1371 journal pbio 0040290 3001 dorsal epidermis 15 sub is required for the formation of dorsal hairs as it is for denticles It has been shown that the modihcation of soh leading to the restriction of its expression in subset of dorsal epidermal cells is the unique cause of the sub is critical for epidermal differentiation and that the presencelabsence of sub expression ultimately determines the pattern of denticles and dorsal hairs 19 How does sob control the formation of denticles and dorsal modification of the trichome pattern in a sibling Drosophila melanogaster species D sechellia in which several rows of dorsal hairs are replaced by naked cuticle 16 5omewhat surpris ingly given the large number of genes that are theoretically capable of modifving dorsal hair patterning 1 all cases of dorsal hair pattern evolution examined in dipterans are the consequence of the modification of swb expression only 16 18 Thus developmental and evolutionary studies show that x d PLoS Biology www plosbiology org 0002 hairs during epidermal differentiation Little is known about the cellular mechanisms underlying trichome formation Epidermal cells are highly polarized along the apico basal axis with actin mierohlaments accumulating at the cell c
170. inity estimated Kd 2 5 0 8 nM unpublished data September 2006 Volume 4 Issue 9 e290 37 swb Directs Epidermal Cell Differentiation miniature o D DECOT 6Kmin 3Kmin E 3 jo4Kmin miniature mRNA wt 1 0 4Kmin svb P ZZ E d KG rss 0 4Kmin wi 0 4KminKO wt min minKO CgTCTAACTGTIc cgTCTAgaTGTic Figure 2 An Evolutionarily Conserved Enhancer Directs the svb Dependent Expression of m A Evolutionary conservation of the m lacus and summary of transgenic reporter canstructs Transcribed regions of m span more than 15kb and harbor an unrelated gene CG9360 transcribed from the complementary stand Histograms plot the level of sequence conservation between D melanogaster and D pseudoobscura top or D virilis bottom as represented from the Vista Genome Browser package Red light blue and dark blue peaks correspond to conserved sequences in non coding regions 3 and 5 UTR and translated sequences respectively Genomic regions disp aying high evolutionary conservation were fused with reporter LacZ genes encoding either a cytoplasmic 6Kmin and 3Kmin or nuclear 0 4Kmin f gal enzyme and used to generate transgenic lines B and C Compared to m mRNA B 6Kmin constructs reproduce endogenous m expression 07 Deletion of intronic sequences leads to a strong reduction of staining in 3Kmin construct
171. ion following procedures described in Parks et al 2004 109 Figure 53 Rescue of ZPD mutant phenotypes UAS construct Rescue m UAS Miniature mE M UAS Miniature HRP Anyo UAS Nyobe Rescuing abilities of the various UAS cDNA constructs were assayed in all cases with respects of denticles formation and in the case of m and tyn also tested for adult phenotypes ie wing size and viability respectively Most Aneo da GAL4 Aneo UAS neyo displayed wild type denticles but we noticed a small proportion of embryos with denticles defects we interpret as being neomorphic since unlike those of Aneo embryos they are of normal size but often mis orientated presumably resulting from ectopic levels of neyo expression 110 Figure 54 F Actin organization in apical extensions of epidermal cells Stage 15 embryos were stained with fluorescent phalloidin that reveals the distribution of actin filaments at the apical surface of wild type cells or lacking miniature dusky like trynity or Whereas modifications of the shape of actin rich cells extensions are visible in the different mutant contexts the lack of any ZPD protein does not prevent the formation of apical actin bundles 111 CG12814 Figure S5 Structure of the ZPD protein encoded by CG12814 and its expression during embryogenesis An additional ZPD gene has been uncovered in the genome release 2006 Top schem
172. ions sept es SJs Bilder et al 2003 Wodarz et al 1995 La formation de SJs d pend de l activit de Dlg Scrib et de la prot ine transmembranaire Neurexin Nrx Baumgartner et al 1996 Bilder et al 2003 Etonnamment dans les mutants g les SJs sont correctement form es alors que la localisation des prot ines Dlg et Scrib d passe largement la r gion ALM et s tend tout au long de la membrane lat rale Bilder et al 2000 Tanentzapf and Tepass 2003 Ces r sultats sugg rent que le complexe Dlg Scrib poss de deux fonctions distinctes 1 Dig et Scrib contr lerait d abord le positionnement lat ral de l ALM Dlg et Scrib joueraient ensuite un r le dans la formation des jonctions sept es au cours de la maturation pith liale De plus il a t r cemment d montr que Yrt est un interacteur g n tique de Nrx bien qu elle n interagisse pas g n tiquement avec le complexe Dlg Lgl Laprise et al 2009 Toutefois les mutants yrt contrairement aux mutants nrx ne montre aucun d faut de 21 limite la formation du complexe Lgl Dlg au domaine lat ral encadrant ainsi le domaine apical ou le complexe Baz Cad va pouvoir tablir les AJ Inspir de Nelson et al 2003 Figure 10 Les undulae sont form s la surface apicale des cellules pidermiques A Sch ma d une section d embryon au stade 17 montrant les undulae und la surface apicale La section longitudinale montre que les undulae ressemblent
173. ioscience References Casso D Ramirez Weber F and Kornberg T B 2000 GFP tagged balancer chromosomes for Drosophila melanogaster Mech Dev 97 451 454 Connolly C N Futter C E Gibson A Hopkins C R and Cutler D F 1994 Transport into and out of the Golgi complex studied by transfecting cells with cDNAs encoding horseradish peroxidase J Cell Biol 727 641 652 Oda H Uemura T Harada Y Iwai Y and Takeichi M 1994 A Drosophila homolog of cadherin associated with armadillo and essential for embryonic cell cell adhesion Dev Biol 765 716 726 Parks A L Cook K R Belvin M Dompe NA Fawcett R Huppert K Tan L R Winter C G Bogart K P Deal J E ef al 2004 Systematic generation of high resolution deletion coverage of the Drosophila melanogaster genome Nat Genet 36 288 292 Parnas D Haghighi A P Fetter R D Kim S W and Goodman 5 2001 Regulation of postsynaptic structure and protein localization by the Rho type guanine nucleotide exchange factor dPix Neuron 32 415 424 Tepass U Theres C and Knust E 1990 crumbs encodes an EGF like protein expressed on apical membranes of Drosophila epithelial cells and required for organization of epithelia Cell 67 787 799 Thibault S T Singer M A Miyazaki W Y Milash B Dompe N A Singh C M Buchholz R Demsky M Fawcett R Francis Lang H L ef al 2004 A complementary transposon tool kit fo
174. ique Shavenbaby integre des cascades de signalisation multiples pour diriger le remodelage des cellules pidermiques embryonnaires En retour Svb d clenche l expression sp cifique de plusieurs classes d effecteurs cellulaires qui agissent directement dans le remodelage des cellules de l piderme La formation de la denticule n cessite en effet la r gulation du cytosquelette d actine pour former l extension le d p t de la cuticule la scl rotisation et pigmentation de cette derni re Nous avons ici pu identifier des g nes cibles de svb dont les produits sont impliqu s dans chacun de ces trois processus Trois g nes cibles codent des prot ines qui interviennent directement dans la r organisation du cytosquelette d actine Wasp Wiskott Aldrich syndrome protein est un r gulateur positif du complexe de nucl ation Arp2 3 participant l allongement des microfilaments Pollard and Borisy 2003 Les prot ines Forked F et Singed Sn sont quant elles impliqu es dans l assemblage des filaments d actine tablissant des liens cross link entre les microfilaments parall les Adams 2004 Chacune de ces prot ines est requise pour la morphogen se des denticules Les mutants wasp montrent des denticules de taille r duite et plus fines alors que les mutants sn ou f montrent des extensions mal form es courb es ou tordues Chez l adulte soies sensorielles f est requis pour l initiation de la formation des faisceaux d acti
175. ir transitoirement l embryon en blanc figure 3 Les cellules lat rales formeront selon l axe D V d abord les futures cellules gliales et neurales et plus dorsalement l piderme ventral et dorsal en vert et bleu figure 3 A la suite de l invagination du m soderme le neuroectoderme r gion pr curseur de l piderme et du syst me nerveux va entreprendre une suite de mouvements morphog n tiques li s la r organisation des contacts intercellulaires de convergence et d extension figure 4 pour revue Lecuit and Lenne 2007 Les mouvements de la gastrulation ne concernent que le blastoderme ventral dont les cellules sont plus hautes et plus volumineuses que celles de la partie dorsale Sur une carte des territoires embryonnaires ce stade on peut d limiter ventralement une bande m diane constituant le m soderme pr somptif Les cellules m sodermiques en rose figure 4 s invaginent le long d un sillon ventral qui se referme pour devenir un tube ventral Par la suite le tube m sodermique va s aplatir et chaque cellule va alors se diviser et migrer le long de l ectoderme ventral pour former une couche unicellulaire Jackle and Sauer 1993 Leptin 1995 Les cellules ectodermiques engagent un mouvement de convergence pour migrer vers la ligne m diale en ventral et participer la formation de la bandelette germinale en bleu figure 4 La bandelette germinale est une structure transitoire compos e des cellules ectode
176. ires figure 11A Par contraste la formation de la cuticule au niveau de la denticule apparait continue et synchrone sur tout le pourtour de l extension cytoplasmique Au stade 16 l enveloppe est maintenant presque continue sur toute la surface 23 de l embryon figure 1 1B La chitine commence tre d pos e sous l enveloppe pour former la procuticule L picuticule situ e entre l enveloppe et la procuticule devient distinguable figurel1 Au stade 17 l picuticule est maintenant bien visible en dessous de l enveloppe tout au long de l embryon et la procuticule commence s paissir figure 11C A la surface apicale des cellules les undulae vont finalement se r sorber laissant place une membrane apicale lisse en contact intime et continu avec la cuticule figure 1 1D Entre le d but du stade 17 et l closion de la larve il s coule environ 6h durant lesquelles la cuticule va finir d tre matur e gr ce un paississement important des trois couches qui la composent Les composants de la cuticule et les ventuels r gulateurs de leur organisation sont finalement encore tr s mal connus La mutation du g ne krotzkopf verkhert kkv codant une chitine synthase cause des d fauts s v res de la cuticule conduisant son d tachement de la membrane apicale Ostrowski et al 2002 Lorsqu on traite les embryons avec du luferon un inhibiteur de la synth se de chitine les m mes ph notypes sont retrouv s Mous
177. ite de stade 1 L1 Elle va ensuite croitre au travers de deux mues successives toutes les 72h pour donner les larves L2 puis L3 La larve va s immobiliser et former la pupe dans laquelle se d roule la m tamorphose Apr s 6 jours l adulte ou imago sort de la pupe Les indications de temps correspondent au cycle de vie de Drosophila melanogaster 25 C B Cuticule de larve Ll La larve pr sente un ph notype cuticulaire st r otyp et r p t dans la r gion ventrale Les segments abdominaux pr sentent une alternance de r gions lisses et d autres poss dants des denticules Depuis les travaux pionniers initi s au d but du si cle la drosophile reste un modele productif pour comprendre les m canismes g n tiques et du d veloppement Apres Morgan en 1933 et Muller en 1946 Ed Lewis C N sslein Volhard et E Wieschaus furent r compens s du Prix Nobel de M decine en 1995 pour leurs travaux sur le contr le g n tique du d veloppement de la drosophile Lewis 1978 Nusslein Volhard and Wieschaus 1980 La drosophile est un insecte m tamorphose compl te ou holom tabole figure 1A Le d veloppement embryonnaire conduit la formation d une larve capable de se d placer et se nourrir de facon autonome La larve va grandir travers deux mues successives et finalement former une pupe dans laquelle se d roule la m tamorphose pour la formation des organes adultes La larve pr sente une morphologie externe segment
178. ites d insertion sur l expression des diff rentes lign es transg niques Par cette approche nous avons test 9 CRMs candidats 2 CRMs pour dyl 2 CRMs pour 2 CRMs pour tyn et 3 CRMs pour le gene nyo Les CRM pr somptifs du g ne dyl correspondent deux r gions de 1kb localis es dans le premier intron Endyll et autour du deuxi me exon Endyl2 Seul Endyl2 montre une activit dirigeant l expression du g ne lac Z similaire a celle du g ne dyl endogene dans les cellules denticules figure 18 La fonction du CRM Endyl2 d pend de l activit de svb car l expression du rapporteur est abolie dans des embryons mutants pour svb figure 18 Les r gions test es pour le g ne tyn sont localis es dans le deuxi me Entynl et le premier intron Entyn2 Alors que le CRM Entynl apparait non fonctionnel Entyn2 dirige l expression du gene rapporteur dans les cellules a trichomes sous la d pendance de Svb figure 19 De m me nous avons identifi un CRM fonctionnel et d pendant de Svb pour les g nes EncyrB figure 20 et Nyo EnnyolExt figure 21 Enfin nous avons test l influence fonctionnelle des motifs correspondants aux sites consensus de liaison pour Ovo svb Le CRM Endyl2 comporte trois motifs potentiels et le CRM Entyn2 deux motifs potentiels Ovo svb en vert figure 18 et 19 L inactivation simultan e par introduction de 2 substitutions par motif des sites de liaison potentiels conduit la perte de
179. ivity both Singed and Forked co localize with F actin in growing denticles Figure GAL Forked accumulates in nascent den ticles from the earliest steps of F actin reorganization whereas Singed appears slightly later when the apical bundle is already formed and is continuing to grow Miniature appears concomitantly with Singed and is initially detected in the cytoplasm of denticle cells Figure 51 In later embryos stage 15 and 16 Miniature accumulates in a restricted apical domain that underlines the base of each denticle Figure 6A Since Miniature is a membrane protem this observation suggests the existence of a dentiche specific membrane subdomain We therefore analyzed mutant defects at the ultrastructural level In stage 16 wild type embryos the apical surface of epidermal cells organizes a dense array of micro villi that contact the cuticle only at their distal tips Figure In contrast there is a continuous and tight interaction between plasma membrane and cuticle layers in the denticle region Figure OB Although naked cells are unaffected denticle cells do not contact cuticle correctly in m mutant embryos Figure 6B The apical membrane is disorganized with an abnormal gap between the denticle membrane and cuticle layers indicating that m is required for the membrane cuticle interaction that is specific to denticle cells These defects are not observed in ar f mutants Figure GB confirming that they Therefore
180. ked 113 N CG17111 a CG13432 d DE 8020 Zye 1 Pio 0019111 o 0613432 CG13196 Tyn C515020 1 Pio Cyr 19111 Nea Nyo S IER 13196 C515020 ye M plo Cyr TCNE EGMEFTIRTPEG FLGRIYTYG FYDRCFFRGN GGTVNVLRLSGPOGYPDCGTQR YGDTLTN IVVVQFSDNVOTSRDKRYNLTCIF FCTR INPKDW FVGKIYASMHS KDCLARGSGNGSVLLTLOIGSEVKENRCGILRAYEMT QEYORTFISA LVVIONNPNVOTOGDRLIKVGCIQS ECGG GDMLARIRTSKL FNGKVYAKG SPKSCSVDVK SALDFELRMNYHD TAG DIIIQHHDMIVTSSDLGLALACQ ECRS GEMITKIRTSKL FDGKVYAKG APKSCAVNVN NSLEFDFRMGYNDLECNVRQSAYG DIVIQHHDMIVTSSDLGLAVSCQ DCRS GEMITKIRTSKL FDGKVYAKG APKSCAVNVN NSLEFDLKMRYNDLECNVROSAYG DIVIOHHDMIVTSSDLGLAVSCQ HCSE DOMRVDIGLPDAESKDQ SAPQIYLEGLKGY PDERCQPQID GSLAVFRLSLSD GVTRMVNOLTG KIIIESTS GKEIVSVKCITT RCLSAGY SFLG DQ QDKRCELRLS RS GOD AIRGLRT S GDSILTLHCKAQ HCKD TRIAVOVRTNKP FNGRIYALG RSETCNIDVI NSDAFRLDLTMAGQDCNT QSVTG VESN TVVLOHHSVVMTKADKIYKVKCT BSCLA DGVQVEIHITEP FHGVLYVEKGHS EKDEECRRVVN LAGETVPRTEIFRVHFGSCGMOQAVEKD VASF VLVIQEHPKLVTTEAQAYHIKCV ECOQD DYMKIRIGFNGS FSGLLYSAGYA YDPDCMYIN GSGRDYYEFYIQLNRCGTLGKNSLOEE SRKNPTNFMWN TVTVOYNPLIEEEYDEHFKVTCEY KCDQGSGMMVEVEFSED FEGVIYSQGYF SDPECHNYVEG DRSGRSFTETVPYDGCGSKPSCS
181. l activation transcriptionnelle de diff rentes classes d effecteurs cellulaires contribuant directement l organisation de filaments d actine de la matrice extracellulaire et la modification de la cuticule L inactivation individuelle de chacun de ces genes cibles produit des d fauts distincts de la forme des trichomes En conclusion nos donn es montrent que Svb gouverne un module volutivement conserv et responsable de l activation de g nes impliqu s collectivement dans la formation des trichomes tablissant pour la premi re fois le lien mol culaire entre les r seaux de r gulation g nique et un programme de contr le localis de la forme cellulaire 34 OPEN a ACCESS Freely available online PLOS siotocy Shavenbaby Couples Patterning to Epidermal Cell Shape Control L Helene Chanut Delalande Isabelle Fernandes Fernando Roch Fran ois Payre Serge Plaza Centre de Biologie du D veloppement CNRS UMAS547 Liniversit Paul Sabatier Toulouse France It is well established that developmental programs act during embryogenesis to determine animal morphogenesis How these developmental cues produce specific cell shape during morphogenesis however has remained elusive We addressed this question by studying the morphological differentiation of the Drosophila epidermis governed by a well known circuit of regulators leading to a stereotyped pattern of smooth cells and cells forming actin rich extensions trichom
182. l activit transcriptionnelle de ces deux l ments Endyl2 OvoABC et Entyn2 OvoAB figure 22 Ces r sultats sugg rent donc que le facteur Svb se fixe directement sur ces motifs dont l influence individuelle et l ventuelle coop rativit au sein de chaque l ment restent valuer En r sum sur les 9 r gions test es in vivo 4 pr sentent une activit transcriptionnelle d pendante de la fonction Svb dans les cellules pidermiques Pour dyl et tyn cette activit n cessite l int grit de motifs consensus pour la fixation des prot ines Ovo svb sugg rant que ces deux CRM sont des cibles g nomiques directes du facteur de transcription Svb dans l piderme Ces travaux permettent d allonger 7 la liste des CRMs d pendants de Svb que nous avons identifi 57 EnDyl2 EnDyl20voABC EnTyn2OvoAB Figure 22 Importance des sites de liaison Ovo Svb pour la fonction des CRM des g nes dyl et tyn Vues lat rales d embryons au stade 16 Le CRM EnDyl2 reproduit l expression endog ne du gene dyl et cette expression est d pendante de Svb Ce CRM contient 3 sites Ovo Svb La mutation simultan e de ces trois sites dans le CRM EnDyl2 OvoABC abolit l expression du transgene Le CRM EnTyn2 reproduit l expression endog ne du gene tyn et cette expression est d pendante de Svb Ce CRM contient 2 sites Ovo dont la mutation OvoAB abolit l expression du transg ne 3 Mod lisation des CRMs vers l identific
183. la synth se des diff rentes couches qui compose la cuticule Toutefois la diff rence de la Drosophile ou la cuticule est uniforme l picuticule et la procuticule ventrale sont diff rentes de celles en dorsal L picuticule dorsale continue et la procuticule dorsale va 24 SHAP 23 sal 2 a 4 aynd VAMP2 WAMPS VESICULE c ur dense SHAP 23 25 W xicule VAMPI amp VAMPI gt Sa VAMpl 2 V sicules Endosame synaptiques P pr coce R SEAU TRAM5 GOLGI vynl3 syn 10 11 16 R seou tront golgien VAMPT B vtile b Appareil de Golgi iynd ndg ram Tr membrine tordil iyn ee bet und rat ompasziment Wei Adi E COMPARTIMENT Lysosame 11 INTERM DIAIRE E ee R ticulum ayas LEE tee Ge endoplasmique E POE GE 4 rugueus betl e Noyau H syn17 TIFE ory RETICULUM d E po R ticulum ENDOPLASMIQUE ayn endoploimique lige B TL o BS SNAP25 v SNARE rimage Amor age Fusion des membranes Figure 12 Localisation des prot ines SNARE dans les diff rents compartiments membranaires d une cellule type de mammifere A Les membres des quatre familles de SNARE figurent en 4 couleurs En bleu les v SNARE de la famille de la synaptobr vine ou VAMP2 encore appel s R SNARE cause du r sidu arginine R au centre de leur motif SNARE En rouge les t 5NARE de la famille de la Syntaxine 1 encore appel s Qa SNARE cause du r sidu glutamine
184. leur compartiment apical Ce transport ou transcytose serait rendu possible gr ce des v sicules comme les argosomes la membrane desquelles M serait ancr e Ce type d adressage a initialement t sugg r pour le transport et la formation du gradient de Wg dans les disques d aile Greco et al 2001 Les argosomes sont form s partir de la membrane basolat rale et voyagent travers le tissu pith lial Le marquage que nous observons pour la partie intracellulaire de M est assez similaire celui form par les v sicules We Il est donc possible que M soit transport e d une cellule l autre sous sa forme pleine taille pour tre ensuite redirig e la surface apicale et ventuellement cliv e Ces hypotheses devront tre test es par des approches exp rimentales adapt es Pour confirmer que la partie intracellulaire est associ e des v sicules 11 faudra effectuer des co d tections avec les marqueurs des diff rentes v sicules de s cr tion et de recyclage vers et depuis l apical H l ne Chanut analyse actuellement la localisation de M dans des contextes mutants pour diff rentes prot ines impliqu es dans le trafic v siculaire Nos premiers r sultats montrent que syntaxin Syx1A une prot ine T SNARE n est pas impliqu e dans l adressage de M ni dans celui de Tyn ou Dyl dans l piderme embryonnaire figure 30 Toutefois nous avons vu que la petite taille de ces cellules rend difficile l tude
185. llules pith liales avec une accumulation pr f rentielle la base des poils naissants Dyl s accumule la base du poil naissant mais aussi tout autour des poils CONCLUSION et PERSPECTIVES 136 Cette discussion va s articuler selon trois axes Le premier concerne une r flexion autour de ce que nous avons appris des m canismes de contr le de l expression g nique dans le cas de la diff renciation terminale Le deuxi me concerne la r gulation par un m me facteur de transcription de diff rents processus tout au long du d veloppement Enfin nous terminerons par les ventuelles perspectives qu ouvre notre travail pour la compr hension des fonctions in vivo des prot ines ZPD dont les alt rations sont responsables de maladies g n tiques graves chez l Homme 1 R gulation transcriptionnelle de la diff renciation terminale Malgr l importance vidente de la r gulation de l expression des genes au cours du d veloppement la nature intime des m canismes impliqu s reste tonnamment mal connue Par exemple des genes cibles ont t identifi s pour moins d une cinquantaine de facteurs de transcription chez la Drosophile dont le g nome contient plus de 700 genes codant des facteurs de transcription Les arguments exp rimentaux d un contr le direct notamment l identification des CRM impliqu s sont encore plus pauvres Ainsi il faut rappeler que les m canismes mol culaires du contr le de l expression des g n
186. ls the transcription of miniature a gene encoding a membrane anchored extracellular protein required for correct morphogenesis of trichome cells Chanut Delalande et al 2006 These data thus suggest that the morphological differentiation of epidermal cells requires an intimate interaction between polarized actin cytoskeleton and aECM components 68 Miniature belongs to a conserved family of aECM proteins initially identified in the Zona Pellucida coat surrounding mammalian oocytes reviewed by Jovine et al 2005 These proteins are characterized by an extracellular motif of 260 aa the ZP domain ZPD whose structure includes a conserved array of disulfide bridges The ZPD is thought to act as a polymerization module promoting the formation of homo or hetero typic filaments Jovine et al 2002 Indeed the function of ZPD containing proteins often relies on polymers composed of distinct members of this family In vertebrates the hetero association of ZP1 2 and in the Zona Pellucida coat and that of and tectorin in the tectorial membrane is required for their function Le fertilization and hearing respectively Jovine et al 2005 Verhoeven et al 1998 In flies genetic data also support a concerted action of piopio and dumpy during tracheal development Jazwinska et al 2003 and miniature and dusky during wing development Roch et al 2003 To explore a possible contribution of multiple ZPD proteins to epidermal
187. mbryon Ces undulae semblent maintenues par des microtubules parall les mais n cessitent certainement aussi une organisation particuli re des filaments d actine Moussian et al 2006 Au stade 14 les cellules pr sentent une forme colonnaire allong e selon l axe apico basal et repoussent leur noyau dans la r gion 22 ey Pe iere Se 4 23 x PE Figure 11 Formation de la cuticule A Sch ma des cellules pidermiques et A ultrastructure de la cuticule au stade 15 Les cellules pidermiques commencent s aplatir et des petits fragments de l enveloppe sont assembl s la surface de la membrane env La surface apicale d bute son remodelage rif et les denticules sont d j form es A L enveloppe recouvre la surface des denticules B Sch ma des cellules pidermique et B ultrastructure de la cuticule au stade 16 La membrane cellulaire apicale montre des replis soutenus par le r seau de microtubules mt appel s les undulae und L enveloppe est continue sur l ensemble de la surface de l embryon B L picuticule epi la couche dense aux lectrons commence se former sous l enveloppe C Sch ma des cellules pidermiques et ultrastructure de la cuticule au d but du stade 17 Les cellules pidermiques sont d sormais cuboidales L picuticle est maintenant divis e en deux couches une couche dense aux lectrons et une couche translucide aux lectrons en contact di
188. ments de r gulation communs ou Cis Regulatory Module CRM responsables de leur activation transcriptionnelle Britten and Davidson 1969 Les signaux l origine de l activation des genes agissent en stimulant un g ne sp cifique int grateur dont le produit active les genes contenant des CRM correspondants Ces modules de r gulation repr sentent l association de plusieurs s quences cis r gulatrices dont le nombre et la distance peuvent varier Ces s quences r gulatrices correspondent des sites de fixation de 6 30 nucl otides de long sp cifiques de facteurs de transcription La localisation g nomique de CRM peut tre variable au sein des r gions non codantes d un g ne en amont et ou en aval du g ne et m me dans les introns et leur fonction est souvent ind pendante de leur orientation Bien que les premiers mod les de r gulation aient t propos s il y a 40 ans la compr hension de la r gulation des genes chez les eucaryotes reste encore tr s limit e Un des enjeux importants est de pouvoir identifier travers l ensemble des r gions non codantes du g nome ces l ments CRMs Un certain nombre d approches ont t d velopp es visant a identifier ces CRMs au sein des s quences g nomiques entourant les genes Elles incluent sch matiquement les d marches suivantes e d couverte de motifs pattern discovery partir des s quences de g nes co r gul s on peut rechercher des motifs nucl otidiques
189. mes PLoS ONE 2 e1115 Alexandre C Lecourtois M and Vincent J 1999 Wingless and Hedgehog pattern Drosophila denticle belts by regulating the production of short range signals Development 126 5689 98 Andrews J Garcia Estefania D Delon I Lu J Mevel Ninio M Spierer A Payre F Pauli D and Oliver B 2000 OVO transcription factors function antagonistically in the Drosophila female germline Development 127 881 92 Assemat E Bazellieres E Pallesi Pocachard E Le Bivic A and Massey Harroche D 2008 Polarity complex proteins Biochim Biophys Acta 1778 614 30 B Bachmann A Schneider M Theilenberg E Grawe F and Knust E 2001 Drosophila Stardust is a partner of Crumbs in the control of epithelial cell polarity Nature 414 638 43 Baek K H and Lee K Y 1999 Signal transduction pathway for anterior posterior development in Drosophila J Biomed Sci 6 314 9 Baumgartner S Littleton J T Broadie K Bhat M A Harbecke R Lengyel J A Chiquet Ehrismann R Prokop A and Bellen H J 1996 A Drosophila neurexin is required for septate junction and blood nerve barrier formation and function Cell 87 1059 68 Bergman C M Pfeiffer B D Rincon Limas D E Hoskins R A Gnirke A Mungall C J Wang A M Kronmiller B Pacleb J Park S et al 2002 Assessing the impact of comparative genomic sequence data on the functional annotation of the Dro
190. miques de Svb 2 Pr diction et test in vivo des CRM li es par Svb En collaboration avec S Aerts nous avons utilis une m thode bioinformatique d velopp e pour d tecter des motifs statistiquement surrepr sent s dans un jeu de g nes co exprim s par rapport l ensemble des genes de la drosophile Aerts et al 2007 Le programme CisTargetX int grant l analyse volutive et des m thodes statistiques non bas es sur des alignements locaux a t utilis pour l analyse des 18 g nes cibles de Svb identifi s cette p riode Cette analyse porte sur les r gions g nomiques situ es jusqu 5Kb en amont ou en aval de chaque g ne ainsi que celles correspondant tous les introns CisTargetX analyse ensuite ces s quences dans les 12 g nomes de Drosophile en parall le pour tablir une liste pond r e de chacun de motifs statistiquement enrichis dans les 18 g nes cibles de Svb Les motifs analys s correspondent une biblioth que de 2000 sites de fixation connus pour des facteurs de transcription ainsi que des motifs conserv s au cours de l volution Elemento and Tavazoie 2005 Cette analyse montre que le motif Ovo est significativement surrepr sent dans l ensemble des g nes cibles r gul es par Svb par rapport aux autres genes de la drosophile et m me par rapport d autres g nes pidermiques mais dont l expression ne d pend pas de Svb Si les motifs correspondants au site de fixation des
191. morphogenesis we analyzed the entire ZPD gene family in Drosophila We show that eight ZPD genes are co expressed in denticle cells under the transcriptional control of shavenbaby Individual ZPD proteins accumulate in separate regions along the cell extension revealing a sub compartmentalization of the apical region Ultrastructural analyses show that the lack of each ZPD protein induces specific defects in membrane aECM interactions in corresponding apical sub regions These results reveal the existence of an ordered assemblage of distinct ZPD proteins linking the aECM to actin organization and polarity complexes in order to remodel the apical region of epidermal cells 69 Results Diverse sub types of Zona Pellucida proteins are co expressed in the epidermis The Drosophila genome encodes 16 proteins with a full length ZP domain and other characteristics of ZPD proteins Jazwinska and Affolter 2004 Le a peptide signal a single pass transmembrane domain and a short C terminal cytoplasmic tail Fig 1A Phylogenetic analyses suggest early separation of most extant Drosophila ZPD proteins and underline the existence of additional extracellular domains Fig 1A For instance Dumpy a giant protein that contains 256 EGF motifs six ZPD proteins contain 2 4 repeats of the PlAsminogen N terminus PAN domain a cysteine rich motif involved in protein interactions Tordai et al 1999 Although PAN or ZPD are found separately in various anim
192. mutants For example the cumulated inactivation of m tyn and zye results in highly misshapen denticles which we interpret as the additive consequences of the lack of each ZPD gene Second most ZPD genes diverged more than 150 my ago since their putative ortholog can be traced back in beetles mosquitoes and bees Fig S6 and data not shown The only exceptions are neo nyo and mey which probably arose from recent gene duplication in Drosophilidae Fig 56 Although their absence leads to a similar small denticle phenotype these three genes are unlikely to retain fully redundant functions in denticle formation since their simultaneous inactivation does not increase the observed defects Finally our rescue experiments provide unambiguous evidence that the lack of a given ZPD gene cannot be efficiently compensated for by the over expression of a different ZPD gene thus demonstrating that each ZPD protein possesses a separate function for localized shaping of trichome cells Insights into the functional specificity of 2PD proteins One important question is therefore what determines the specific function of a given ZPD protein Current models suggest a major role of the ZPD itself in the functional diversification of ZPD proteins Wassarman 2008 Besides the conservation of a restricted structural backbone that involves invariant cysteines the ZPD has been the object of rapid sequence evolution Fig 3B and S7 It has been proposed that the N
193. n domaine fonctionnel similaire peuvent avoir une fonction sp cifique Des donn es biochimiques suggerent que la sp cificit fonctionnelle de ces prot ines passe par le domaine ZP lui m me Wassarman 2008 Il est propos que le domaine ZP comporte deux sous r gions la moiti N terminale servant la polym risation et la moiti C terminale d terminant la sp cificit de cette interaction Jovine et al 2006 Monne et al 2008 R cemment trois prot ines ne poss dant que la partie N ter du domaine ZPD ont t identifi es chez la drosophile Jovine et al 2006 De plus des tudes biochimiques sur l h mi domaine ZP N de ZP 3 montrent qu il est capable de s assembler en filaments Jovine et al 2006 De plus l tude phylog n tique du domaine ZPD r vele une volution rapide de sa s quence prot ique en dehors de la conservation des positions st r otyp es des r sidus cyst ine supp 5A Ces donn es illustrent l importance de ce domaine pour la fonction des prot ines ZPD Notre syst me de sauvetage offre la possibilit d explorer l importance fonctionnelle du domaine ZPD in vivo L change du domaine ZPD de Tyn par celui de M TynZPM est suffisant pour sauver partiellement la perte de fonction de m alors que l change inverse MZPTyn ne compense pas la perte de fonction de tyn Ces r sultats d montrent clairement que le domaine ZPD ne supporte pas lui seul la sp cificit fonctionelle de la prot i
194. nNeo pr dit sur la base du mod le OG correspond une r gion inactive en transcription nous laissant donc sans information sur la r gulation trancriptionnelle du g ne neo figure 23 De facon surprenante les analyses bio informatiques pr disent un CRM sur le mod le OMM dans dumpy dp un gene codant une prot ine ZPD exprim dans l piderme embryonnaire mais dont la transcription n est pas sensible l activit de Svb Nous montrons que cette r gion g nomique dirige une expression pidermique avec l alternance de fines bandes de cellules restreintes la partie ventrale de l embryon et avec une intensit d croissante vers le post rieur Toutefois l activit transcriptionnelle de cet l ment ne d pend pas de Svb puisque ce profil d expression est inchang dans les mutants svb r sultats non pr sent s En r sum cette tude a permis l identification d un CRM suppl mentaire pour les g nes ZPD ainsi que celle de nouveaux g nes cibles du facteur Svb donn es non pr sent es Parmi les 11 genes cibles publi s en 2006 nous avons pu tendre 7 sn f m sha cyr tyn dyl le nombre de g nes r gul es directement par Svb Chanut Delalande et al 2006 La compl mentarit des approches informatiques et exp rimentales apparait donc indispensable Ainsi nous avons pu d finir qu une s quence r gulatrice r pondant a Svb poss dent une longueur comprise entre 200pb et IKb avec 1 3 sites Ovo Sbv r pa
195. nables C D Aile ml Reduction de la taille de Tale comparer A et D Les contours cellulaires sont rendus visibles par l accumulation de la cuticule E F L UAS M pilot par enG4 est exprim uniquement dans le compartiment post rieur La taille de l aile est restaur e comparer A et E F Les cellules post rieures pr sentent une taille et toutes les caract ristiques des cellules sauvages alors que les cellules ant rieures ont un ph notype interm diaire G H L UAS GFP M restaure un ph notype de taille de l aile correcte compar A et G H Le sauvetage est identique a celui observ pour le transgene UAS M I J Expression de l UAS GFP MAC ter par le pilote enG4 I La taille de l aile est interm diaire entre celles des mutants m et sauvage comparer A C et I J Les d fauts cellulaires partiels restent identifiables quel que soit le compartiment observ prot ine M nous avons construit une prot ine doublement tiquet e GFP M mCherry Dans l aile la partie diffusible GFP est d celable dans le cytoplasme des cellules productrices et va s accumuler sp cifiquement leur face apicale La partie ancr e mCherry est elle aussi visible dans le cytoplasme mais son accumulation la face apicale est punctiforme et sur une distance plus courte sugg rant un marquage v siculaire figure 38 La prot ine pourrait tre adress e via un transport v siculaire dans les cellules voisines qui la dirigerait ensuite vers
196. ncomplet papillote pot a aussi t identifi pour son r le dans le maintien des deux feuillets de Tale Bokel et al 2005 L analyse du transcriptome alaire a aussi permis de caract riser les variations d expression g nique au cours de la morphogenese de l aile Ren et al 2005 Comme miniature plusieurs genes ZPD sont fortement activ s au cours de la morphogen se notamment dusky cypher et dusky like La morphogen se de l aile nous offre ainsi un nouveau modele d tude de la fonction des prot ines ZPD Existe t il une sp cificit de fonction de pour chacune des ZPD au cours de la morphogen se de l aile Les tudes d j r alis es suggerent donc que les prot ines ZPDs sont impliqu es de maniere g n rale dans le maintien du lien entre la membrane plasmique et l aECM dans les cellules pidermiques embryonnaires et adultes Cette fonction d ancrage de l aECM la membrane apparait paradoxale car les prot ines ZPD sont g n ralement r put es pour tre cliv es en dissociant la r gion extracellulaire du domaine trans membranaire La pr sence d un site potentiel de clivage par la Furine est d ailleurs une signature caract ristique de la famille ZPD Les Furines sont des proprot ines convertases dont le site consensus de clivage est R R L R L R Hosaka et al 1991 L excr tion de ZP3 n est cependant pas alt r e par la mutation du site t trabasique de cette prot ine montrant qu il n est pas indi
197. nd Hedgely parrern Presea denrilele behs hy regulating the production of shiri range signals Development 126 3680 5605 Walters JW Munoz E Paaby AB Dinardo amp 28805 Serrate Notch signaling defines the scope of the initial denticle Geld by modulating EGFR Dev Bin 2X 415 4256 10 September 2006 Volume 4 Issue 9 e290 46 1 MA 21 de Vincent A Carreno 5 ovb integrates Wingless amd DER pathways to control epidermis differentiation Nature 400 271 275 Mevel Ninio M Terracol E Salles C Vincent A Favre F 1005 ove a Drosophila gene requ ited for ovarian development is specifically expressed in the germline and shares most of its coding sequences with shavenbaby gene involved in embryo patterning Mech Dev 49 83 5 Andrews L Garcia Estefania D Delon 1 Lu j Mevel Ninio M et al 2000 OVO canscripion factors function antagonistically in ihe Drosophila female germline Development 127 881 802 Delon 1 Chanut Delalande H Pavre F 2004 The Ovo Shivenbabr ranseripilon actor specifies actin remodelling during epidermal differ entiation in Mrowa Mech Dey 120 717 758 DiNande 5 Heemskerk Dougan 5 O Farrell PH 1994 The making ol a Parterning the Drosob ula embryonic epidermis Curr Opin Genet Der 4 520 334 Sucena E Stern DL 2000 Divergence of larval morphology between sechellra Ad its sibling species cau
198. ne Les domaines PAN de Try sont essentiels son activit Toutefois ces domaines PAN ne sont pas capables de reprogrammer la fonction de M puisque M PAN est incapable de restaurer la perte de fonction de tyn sans toutefois alt rer la fonction de M La fonction de Tyn est donc due au dialogue concert entre les domaines PAN et ZPD qui la composent De plus la r gion C terminale entre le domaine ZPD et le domaine transmembranaire est fortement conserv e entre orthologues respectifs chez les insectes sugg rant une pression de s lection importante et donc une fonction de cette partie de la prot ine Supp 5B Nous montrons ainsi que la sp cificit fonctionnelle des prot ines ZPD ne peut pas tre seulement limit e au domaine ZPD mais qu elle est port e par de multiples r gions prot iques Existe t il une corr lation entre la localisation de ces prot ines et leur sp cificit fonctionnelle Les diff rentes prot ines ZPD tudi es se localisent dans des sous domaines distincts de la denticule qui corr lent avec la localisation des d fauts observ s dans les mutants correspondants Dyl s accumule l extr mit de la denticule qui se retrouve divis e dans le 118 Figure 28 Localisation de la prot ine Dyl Dans les embryons sauvages la distribution de Dyl est restreinte la pointe de la denticule Dans les mutants m nous observons que la distribution de Dyl s tend l ensemble de la denticule
199. ne alors que sn est n cessaire pour le maintien de la morphologie des faisceaux en cours de d veloppement Wulfkuhle et al 1998 Un des signes pr curseurs de la diff renciation des futures cellules denticules est l accumulation de filaments d actine leur face apicale Guild et al 2005 Price et al 2006 Les prot ines Sn et F s accumulent s quentiellement dans les denticules croissantes tout comme dans les trichomes de l aile sugg rant que ces prot ines jouent un r le similaire dans la formation des extensions adultes et embryonnaires Guild et al 2005 L inactivation des g nes sn et f conduit des d fauts de la forme des denticules d montrant que l assemblage des filaments d actine est une tape primordiale de la morphogen se pidermique De plus plusieurs autres r gulateurs du cytosquelette comme dAPC Enabled Diaphanous Formin et le complexe Arp2 3 s accumulent dans les denticules sugg rant qu ils sont eux aussi impliqu s dans cette formation Price et al 2006 Pourtant Svb ne contr le pas leur expression dans l piderme mais il est possible que Svb r gule indirectement leur activit ou leur localisation subcellulaire Nous avons montr pr c demment que dAPC 2 est sp cifiquement relocalis 48 dans des extensions pidermiques induites par l expression ectopique de Svb Delon et al 2003 Enfin nous montrons que Svb dirige l expression de shavenoid kojak un g ne r cemment identifi don
200. ne transitoire En r sum le patron des trichomes correspond un programme de remodelage localis de la forme apicale de certaines cellules pidermiques impliquant la r organisation du cytosquelette d actine 3 2 R gulateurs du cytosquelette dans la forme apicale des cellules trichomes Certaines mutations produisant des ph notypes anormaux des soies sensorielles adultes affectent galement les trichomes larvaires Plusieurs g nes incluant forked f multiple wing hairs mwh hairless H singed sn et javeline jv participent la formation des extensions 27 pidermiques riches en filaments d actine Dickinson and Thatcher 1997 Cependant la mutation de chacun de ces genes peut pr senter des effets diff rents suivant les populations de cellules pidermiques Par exemple l absence de H affecte les trichomes dorsaux mais apparemment pas les denticules Les mutants jv ont des denticules plus fines et allong es particuli rement pour les rang es 1 et 2 Dickinson and Thatcher 1997 D autres prot ines capables de se lier l actine et impliqu es dans la r gulation du cytosquelette ont pu tre identifi es pour leur fonction dans la formation des extensions pidermiques Diaphanous Dia appartient la famille des Formines qui r gulent la polym risation de l actine et participent l longation des microtubules pour revue Zigmond 2004 La prot ine Dia se localise tr s t t au cortex des cellules p
201. nkopp Carroll 55 Kopp A 2008 Evolution in black and white Genetic control of pigment patterns in roseta Trends Genet 1 405 54 Nusslein Volhard E Wieschaus E Kluding H 194 Mutaisions affecting the pattern of the larval cuticle in Drosophila melanogaster Roux Arch Dev Biol 193 207 282 Wieschaus E Nussleme Volliard E Jurgens C 1984 Mutations allecting the pattern of the larval cuticle in mebinogaster Roux Arch Dew Biol 193 296 417 Tomancak P Beaton A Weissmann R Kwan E Shu 5 e al 2002 Systematic determination of parteras of gene expression during Draosoplila embryogenesis Genome Biel 3 RESEARCHO088 RESEARCH 0033 14 doi 10 1 186gb 2002 3 12 researchiM88 Rech E Alonso CR Akam M QUOI Deeophda miniature amd dusky encode AP proteins required lor cytoskeletal reorganisation during wing genesis Cell Sci 116 1199 1307 8 PLoS Biology www plosbiology org 0013 svb Directs Epidermal Cell Differentiation Lu Oliver B 2001 Drossel OVO regulates ovarian bummer transcription by binding unusually near the trausciptionm start site Development 128 1071 1656 20 Jovine L Dame CO Luscher ES Wassarman PM 2005 Lona pellucida 31 A2 AA i AD AT domain proteins Annu Rew Biochem 74 83 114 DiBartolomeis SM Akten B Genova Roberts MA Jackson FR 20407 Molecular analysis of the retina rmaniaturesdusky may gene complex may m
202. nticle formation indeed involves parallel actin bundles as shown lor wing hairs Several cytoskeletal regulators such as Enabled Diaphanous Formin and the Arp2 3 complex accumulate in denticles 14 23 suggesting that they are involved in denticle formation although their respective functions remains to be evaluated Whereas sob does not control the expressim of those ubiquitous actin associated factors it is possible that sub regulates their activity or subcellular localization indirectly Consistent with this hypothesis we have previously shown that dAPC 2 is speciheally relocalized in sub induced ectopic epidermal extensions 14 In addition we show here that seb directs the epidermal expression of Wasp a key activator of the Arp2 3 actin nucleator complex which is well known to trigger the formation elongation of actin filaments Moreover it has been shown in vitro that Fascin switches the activity of the Arp2 3 complex from the formation of a mesh like branched network to parallel microfilaments 39 there fore suggesting that sub targets can regulate both the formation of actin filaments and their reorganization at least in part through a tight control of the activity of the 2 complex during denticle formation Taken together these results show that sib controls the expression of several cytoskeletal factors which probably by modifying the activity of housekeeping actin remodeling machinery act toget
203. nticule que sur les cellules lisses Moussian et al 2006 En effet la membrane plasmique de la denticule est d j recouverte par l enveloppe alors que seul le sommet des undulae pr sente des fragments en cours d assemblage Ainsi tout porte croire que l assemblage des couches de la cuticule s effectue en priorit au niveau des cellules mettant des denticules b Formation de la cuticule La s cr tion de la cuticule commence par celle de la couche la plus ext rieure l enveloppe qui constituera une barri re tanche avec le milieu externe Ensuite l picuticule est essentiellement compos e d un r seau de prot ines reli es entre elles de mani re covalente grace l action de quinones qui vont r guler la rigidit et la pigmentation de la cuticule La couche la plus interne en contact direct avec l piderme est la procuticule compos e de couches successives de chitine organis es en feuillets les laminae La chitine est d pos e avec un angle r gulier des fibres entre deux couches successives g n rant une organisation en spirale des fibres de chitine de la cuticule figure 10 On estime g n ralement que la chitine est le deuxi me polym re de sucre le plus abondant en masse sur notre plan te apr s la cellulose C est au cours du stade 15 que l enveloppe commence tre s cr t e Tout d abord la production de l enveloppe est discontinue et semble tre restreinte au sommet des microvillosit s membrana
204. odify the trichome pattern These data indicate that denticle YE PLoS Biology www plosbiology org svh Directs Epidermal Cell Differentiation formation requires multiple factors that act collectively La remodel epidermal cell shape This requirement for many genes to build a cuticular extension doubtless constitutes a developmental constraint explaining why modifications of the expression of sub the factor that governs this entire set of genes are required for the trichome pattern to evolve Evolutionary modifications of es regulatory elements of lin T8 the putative sob homolog in worms were responsible for the difference in the position of the excretory duct between Caenorhabditis elegans and briggsae 43 Although accumulated clata thus demonstrate the particular role of sub genes in morphological diversihcation between relatively close species how they are related to the evolution of animal forms across more distant phyla remains an open question Several features of sub function have been conserved mammals including the role of one of its homologs m ovef in the differentiation of epidermal derivatives 44 and its regulation by the Wot pathway 45 Our identification of genes regulated by sob in flies now opens the way to evaluate the contribution of the different parameters contributing to the role of sub in morphological evolution from the modification of its response to signaling pathways to that ol its cellular t
205. of epithelial cells is their polarization along the apical basal axis According to current models Wodarz and Nathke 2007 three main processes interact to modify the basic cellular mechanisms and lead to the polarized distribution of various molecules Mellman and Nelson 2008 First post translational control of protein sorting and intracellular trafficking provides intrinsic cues for the localized delivery of membrane components Second together with the cytoskeleton protein complexes act as polarity determinants to provide orientation cues that specify overall cell polarity and shape Wodarz and Nathke 2007 Finally extracellular cues are required to orientate intracellular mechanisms into a topologically ordered 3 dimensional space Schock and Perrimon 2002 It is well documented that adhesion both between cells and between cells and the basal extracellular matrix ECM provides extrinsic information for changes in cell shape In striking contrast little is known about a putative influence of the apical ECM on the control of epithelial cell organization Drosophila embryonic epidermal cells are highly polarized and secrete proteins and polysaccharides that form a prominent apical ECM aECM cuticle which protects the 67 animal against the external milieu Locke 2001 Payre 2004 The epidermis is composed of a monolayer of cells that adopt two distinct morphologies i smooth cells and ii cells producing actin rich apical ex
206. ois avec de mani re d sagr able mais malgr tout efficace Merci encore pour ma palette graphique ca m a facilit grandement le travail ces derniers temps Par contre depuis que je te r clamais une loupe fluo il aura fallu attendre que je parte pour qu elle soit enfin livr e je suis totalement d pit e Enfin bien s r je tenais remercier plus particuli rement Serge En effet c est lui qui a du m encadrer au quotidien et croyez moi ca n a pas toujours t facile Alors merci Serge d avoir cru en moi de m avoir soutenu conseill e de m avoir aid d velopper mon sens critique un peu trop parfois et de m avoir form e aux techniques de biologie mol culaire Je pars en ayant recu la meilleur formation qu un tudiant puisse r ver d avoir si on me demandait aujourd hui de revenir en arri re je ne changerais pas d avis J ai toujours dit que c tait moi qui t avais choisi et non l inverse et je ne regrette toujours pas ce choix Pardon pour les angoisses et les crises de e pepitos aigues mais je suis comme ca franche et enti re espere que tu t en souviendras comme de qualit s J aurais encore beaucoup dire mais tu le sais d j Pour finir avec la science proprement parler merci l ensemble des CBDistes pass s et pr sents pour avoir toujours su cr er une ambiance particuli re dans cet institut Je voudrais en citer quelques uns qui sont devenus sp ciaux et spatiaux Nicolas et Rami pour
207. on de la prot ine Miniature transg nique nous avons voulu tester cette propri t dans le cas de la prot ine endog ne En effet avec le systeme UASGal4 la prot ine M est produite en quantit tr s importante et surtout plus pr cocement qu partir du g ne endog ne Il est donc th oriquement possible que la diffusion 128 DN b Zr a d Ce P Figure 33 Localisation M GFP dans les cellules denticules dans un contexte sauvage Image en microscopie confocale des cellules a denticule du segment A3 B Coloration de la F actine par la phalloidine rhodamine en rouge C Localisation de M par la GFP en vert L expression de M est limit e au rang e 0 1 par le pilote enG4 Les rang es 1 3 sont fortement marqu es au niveau des denticules alors qu en rang e 0 M est strictement cytoplasmique Les rang es 4 et 5 sont marqu es au niveau des denticules mais de mani re moins intense observ e soit provoqu e par ces conditions artificielles d expression Nous avons alors choisi d tudier l ventuelle diffusion de M dans les cellules de adulte Ce tissu est bien adapt la r alisation d analyse g n tiques mosa ques i e de g n rer des clones de cellules mutantes au sein d un tissu sauvage gr ce la recombinaison mitotique par le syst me FLP FRT figure 34 Les r sultats obtenus par Serge Plaza confirment que la prot ine endogene peut restaurer un ph notype cellulair
208. ons and not solely by the ZP domain Extrinsic factors may also modulate the functions of ZPD proteins since they are known to be extensively modified with N and O linked oligosaccharides Jovine et al 2005 Interestingly several O glycosylation enzymes are expressed in subsets of epidermal cells in Drosophila embryos Tian and Ten Hagen 2007 where they possibly regulate the activity of ZPD proteins Epidermal ZPD proteins control polarized changes in cell shape ZPD proteins localize to distinct apical sub regions of epidermal cells in correlation with the local defects observed when a given protein is missing Fig 7 Dyl accumulates at the tip of denticles which are split in dy mutants M is enriched in the medial region of extensions and m mutants lose the medial constriction characteristic of normal denticles tyn and zye mutations affect the base of denticles where the respective proteins normally 81 accumulate Ultrastructural analyses further show that defects in denticle shaping imply local alteration of aECM and plasma membrane suggesting that ZPD proteins are required to organize extracellular components and possibly their interaction with membrane specifically in denticles This is consistent with recent results suggesting that cuticle formation relies on highly organized protein secretion at specific locations within the apical plasma membrane Moussian et al 2007 Our data show that the local composition of the a
209. ortex where they interact with apical junction complexes 20 21 The formation of denticles and dorsal hairs is initiated by F actin accumulation and reorganization leading to the produci ion of an apical bundle in the posterior region of September 2006 Volume 4 Issue 9 e290 36 the cell 14 22 23 Each bundle then grows perpendicularly to the apical cell surface 22 23 and probably provides the mechanical force for the modification of the apical mem brane At later stages ecdysteroid hormones induce epider mal cells to synthesize components of the cuticular envelopes which are modified by the catecholamine biosynthetic path way to ensure trichome pigmentation and hardening 21 Despite the large number of genetic screens based upon cuticle observation 25 26 the molecular mechanisms re sponsible for the different steps of epidermal differentiation still remain to be uncovered Since sub activity acts cell autonomously to promote denticle formation 11 14 we searched for genes whose expression is controlled by sub as an alternative approach to identify players responsible for the morphological differ entiation of epidermal cells We identified several cellular factors involved directly in subsequent steps of denticle formation Although actin remodeling is generally regarded as the outcome of post translational modifications we show that denticle formation relies on the sub dependent tran scriptional activation of s
210. os analyses illustrent l int r t d une interaction troite entre les analyses comparatives pr dictives et les tests fonctionnels De mani re g n rale nos r sultats tablissent d j que les m canismes de r gulation de l expression des genes de diff renciation terminale au moins dans notre cas utilisent des strat gies diff rentes de celles d j bien d crites pour la r gulation de l expression des facteurs de transcription responsables de la segmentation Le mod le g n ral que nous proposons est celui de CRM compacts parfois dispers s l int rieur du m me g ne et construits autour d un regroupement h t rotypique de sites non ordonn s les uns vis vis des autres Nos travaux contribuent donc une vision plus large des paradigmes de la r gulation transcriptionnelle et d finissent les nouvelles directions explorer 2 Des modules de diff renciation sont ils r utilis s au cours du d veloppement Il est bien tabli que les m mes r gulateurs facteur de transcription voies de signalisation pr sentent une expression sp cifique dans diff rents tissus et ou diff rentes tapes du d veloppement Un facteur de transcription donn et ses g nes cibles pourraient donc d finir un module fonctionnel impliqu dans la sp cification des diff rents tissus au cours du d veloppement Ainsi l expression d un facteur de transcription d clencherait une routine transcriptionnelle capable d activer l ens
211. peptides are drawn in orange and trans membrane domains in blue B Patterns of conserved Cys in the ZP domain define two subgroups of Drosophila proteins which like mammalian ZP1 2 and ZP3 contain 10 and 8 residues respectively C mRNA expression of miniature m dusky like morpheyus nyobe nyo trynity tyn neyo neo cypher cyr at stage 15 and zye at stage 16 Whole mounts show n situ hybridization in wild type embryos Note the expression of zye only in the ventral region arrowhead Cyr mRNA is restricted to dorsal cells at stage 15 open arrowhead then switches to ventral stripes at stage 16 17 Close up of ZPD expression in A3 4 abdominal segments in wild type wf and shavenbaby svb mutant embryos All views are of ventral cells except for cyr pictures showing latero dorsal cells Figure 2 ZPD mutant display specific defects in epidermal cell shape A Electron micrographs of denticles 4 row of the A4 segment When compared to wild dei G38 type embryos mutant for any ZPD gene ie m dyl zye neo nyo or mey display specific alterations of denticle shape Embryos carrying simultaneous mutations for m tyn 9 9 and m tyn x72 exhibit additive denticle phenotypes while the combination of neo and nyo mey mutations leads to a phenotype similar to that of single mutant Scale bar 500 nm B Ability of UAS cDNA constructs to rescue m 638
212. phila despite lack of sequence conservation PLoS Genet 4 e1000106 Hashimoto C Hudson K L and Anderson K V 1988 The Toll gene of Drosophila required for dorsal ventral embryonic polarity appears to encode a transmembrane protein Cell 52 269 79 Hatini V and DiNardo S 2001 Divide and conquer pattern formation in Drosophila embryonic epidermis Trends Genet 17 574 9 Havemann J Muller U Berger J Schwarz H Gerberding and Moussian 2008 Cuticle differentiation in the embryo of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis Cell Tissue Res 332 359 70 Hoffmans and Basler 2007 BCL9 2 binds Arm beta catenin in a 142 independent manner and requires Pygopus for its function in Wg Wnt signaling Mech Dev 124 59 67 Hosaka M Nagahama M Kim W S Watanabe T Hatsuzawa K Ikemizu J Murakami K and Nakayama K 1991 Arg X Lys Arg Arg motif as a signal for precursor cleavage catalyzed by furin within the constitutive secretory pathway J Biol Chem 266 12127 30 Howes E Pascall J C Engel W and Jones R 2001 Interactions between mouse ZP2 glycoprotein and proacrosin a mechanism for secondary binding of sperm to the zona pellucida during fertilization J Cell Sci 114 4127 36 Hunter C and Wieschaus E 2000 Regulated expression of nullo is required for the formation of distinct apical and basal adherens junctions in the Drosophila blastoderm J Cell Biol 1
213. pidermal expression Several putative w binding sites have been detected in evolutionarily conserved regions of other sub targets Whether they are all required for sub transcriptional regulation remains to be tested Further dissection of the m enhancer as well as those of other swb targets should lead to the definition of a functional cis regulatary element respon sible for sob control This outcome should facilitate the identification by bioinformatic approaches of additional sob responsive enhancers and target genes We propose that sb directly controls the expression of a set of effector genes all required for a concerted modification of cell shape and cuticle organization to achieve the formation of denticles Figure 8 How many genes are September 2006 Volume 4 Issue 9 e290 44 regulated by sub to promote remodeling of epidermal cells Oh analysis which covers approximately 25 of the total number of Drosophila genes has led to the identification of 11 downstream targets suggesting that sub activates the expres sion of numerous additional genes to trigger the formation of embryonic epidermal cell extensions Several results suggest that this sob controlled module is used in different developmental programs that produce cuticle extensions Although signaling pathways act differently in ventral and dorsal embryonic regions we show that sub is also required to express the same target genes for the formation of dent
214. ppeared when using two copies of UAS m construct and three copies gave clear defects in all examined specimen Pictures show denticle organization in wild type m mutant embryos and embryos expressing MISS in an otherwise wild type context 90 Figure 4 ZPD proteins localize in specific sub apical domains A Subcellular localization of M Dyl Tyn and Zye proteins in epidermal cells of stage 15 wild type embryos A3 or A4 segment Actin filaments were stained by phalloidin red and ZPD proteins with mono specific antibodies green Close ups highlight the distinct localization of ZPD proteins along the extension B TEM analysis of M HRP localization in stage 16 embryos HRP activity leads to a dark stain revealing M HRP accumulation within endocuticle layers of the denticle Bar 500 nm C Co detection of Miniature green with either Dyl or Tyn magenta colocalization appears in white Figure 5 Ultra structural analysis of denticle defects in m dyl tyn and zye mutants POSE defi Ey05938 a e TEM micrographs of denticle cells from wild type m tyn and zye embryos Inactivation of m alters membrane aECM contact all around the extension b FY05838 te alter the base of extensions down to cell junctions whereas tyn d and zye dyl mutants lack cytoplasm in the extension c Scale bar 500 nm a e close ups of a e pictures a e schematic representations of close ups with double black lines rep
215. prot ines Ovo et Svb sont statistiquement enrichis dans ces g nes cibles il faut noter qu on ne d tecte pas de regroupement local de ces sites mais de 1 3 sites dans des r gions de taille comprise entre 600pb et Ikb Nous avons ainsi d fini une liste de 17 CRMs candidats partir de 6 g nes cibles diff rents dont 4 g nes ZPD dyl tyn nyo et cyr sur lesquels mes travaux ont plus particuli rement t centr s Pour tester la fonctionnalit in vivo de ces CRMs pr dits par Cis TargetX nous avons d velopp l utilisation d une nouvelle m thode de transg n se utilisant la recombinaison site sp cifique PhiC31 Bischof et al 2007 Les r gions test es correspondent des fragments d environ 1kb centr s sur la position du es site s de liaison potentiel s ins r s dans un 56 Scale 10 kb chrX 60000 65000 70000 75000 s0000 85000 svb posilives tyne EN svb negatives Li _ avo matiis ovo Matifs Hail 81 E II FlyBase Protein Coding Genes E ventral lat ral Dorsal Figure 19 Sch ma de l organisation g nomique du g ne tyn et expression des CRM La r gion EnTynl ne montre aucune expression Le CRM EnTyn2 reproduit l expression du g ne sous la d pendance de Svb EnTyn2 Scale chrX 7965000 7970000 7975000 7980000 svb positives GTA syb negatives ove motifs ovo Motifs d ser m Genes CE LL
216. ques de la denticule op elles jouent un r le essentiel dans le maintien du contact membrane apicale aECM Nos donn es sugg rent que Dyl M Tyn et Zye se localisent dans la procuticule o elles attachent la cuticule alors que Neo Nyo et Mye en sont des composants fibrillaires figure 29 Comment ces prot ines sont elles capables de se localiser sp cifiquement dans une r gion d termin e Il est possible que les propri t s intrins ques des prot ines ZPD contribuent un chafaudage ordonn qui organise la membrane apicale autour de l extension cellulaire Comme le sugg rent les donn es structurales 1l existe peut tre une sp cificit d assemblage cod e par la partie C terminale du domaine ZPD Jovine et al 2004 Les zones de co localisation entre deux prot ines ZPD pourraient correspondre la formation d h t rodim res M co localise avec deux autres prot ines ZPD Dyl dans la r gion la plus apicale et Tyn dans la r gion basale La sp cificit d assemblage ne semble donc pas uniquement li e aux propri t s intrins ques du domaine ZP Nous avons vu que la temporalit d expression n est pas indispensable la fonction des prot ines ZPD La distribution des prot ines ZPD pourrait 120 F actin Syx1A0 7 F actin F actin Syx1A 22 Figure 30 Localisation des prot ines M Tyn et Dyl dans un contexte mutant pour la syntaxine 1A M se localise tout autour de la partie m diale de la den
217. r Drosophila melanogaster using P and piggyBac Nat Genet 36 283 287 107 Supplemental Figures and Text Organisms ZP domains PAN ZP PAN Comp ete domains domains Ze 3 eo A thaliana Figure 51 Evolutionary repartition of proteins containing PAN and or ZP domains Several annotated genomes were searched for genes encoding proteins containing a complete 8 or 10 conserved cysleines Zona Pellucida domain or Apple PAN PAN domains or both ZP PAN Numbers correspond to the total number of genes in a given genome that encode a protein comprising a single motif or combination of those Ensembl database yeast Ciona Tetraodon chick human wormbase Caenorhabditis beetlebase Tribolium vectorbase Anopheles flybase Drosophila and Tair Arabidopsis have been screened through Ensembl Smart or Interpro tools for PFAM domains PF00100 and PF0024 108 Far Ir LT Ler Them pue LA Figure S2 Maps of deletions generated at the various ZP loci PG38 Bourbon et al 2002 was used to generate P element excisions Imprecise excisions of the P EPgy2 EY05938 flybase were generated to obtain a complete deletion of the CG5847 zye gene PBac elements were obtained from Exelixis https drosophila med harvard edu and used to generate small deficiencies deleting dyl neo nyo and mey nyo through FRT mediated site specific recombinat
218. ranaires selon l axe apico basal des cellules Par exemple la diminution de l activit de scrib dig ou lgl compense au moins partiellement l absence de crb pour la polarisation des cellules pidermiques Dans des cellules normales Scrib contrecarre l identit apicale de la membrane en bloquant l activit du complexe Baz le long de la membrane lat rale Le complexe Crb est recrut par le complexe Baz dans la r gion apicale de la cellule et va pouvoir alors inhiber sa lat ralisation Bilder 2003 Ainsi la membrane de la cellule pith liale est divis e en trois sous domaines interd pendants le domaine apical d fini par la distribution des complexes Baz Crb lat ral avec le complexe E Cad Cat et baso lat ral avec DIg Scrib figure 9 Enfin plus r cemment la prot ine FERM 4 proteins ezrin radixin moesin Yurt Yrt a t identifi e comme tant un r gulateur n gatif du complexe Crb Laprise et al 2006 Cette prot ine ce localise le long de la membrane baso lat rale et n est recrut au complexe Crb qu en fin de diff renciation pith liale la placant ainsi comme prot ine organisatrice du domaine baso lat ral Laprise et al 2006 c Maturation des complexes jonctionnels tablissement d une barri re tanche La formation des jonctions cellulaires fonctionnelles n cessite une tape suppl mentaire de maturation figure 9 Elle implique la formation de jonctions dans le domaine lat ral les Jonct
219. rane skeleton of Drosophila J Cell Biol 158 941 51 Mevel Ninio M Terracol R Salles C Vincent A and Payre F 1995 ovo a Drosophila gene required for ovarian development is specifically expressed in the germline and shares most of its coding sequences with shavenbaby a gene involved in embryo patterning Mech Dev 49 83 95 Millard T H and Martin P 2008 Dynamic analysis of filopodial interactions during the zippering phase of Drosophila dorsal closure Development 135 621 6 Monne M Han L Schwend T Burendahl S and Jovine L 2008 Crystal structure of the ZP N domain of ZP3 reveals the core fold of animal egg coats Nature 456 653 7 Morisato D and Anderson K V 1995 Signaling pathways that establish the dorsal ventral pattern of the Drosophila embryo Annu Rev Genet 29 371 99 Moussian B 2008 The role of GICNAc in formation and function of extracellular matrices Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol 149 215 26 Moussian B Schwarz H Bartoszewski S and Nusslein Volhard C 2005 Involvement of chitin in exoskeleton morphogenesis in Drosophila melanogaster J Morphol 264 117 30 Moussian B Seifarth C Muller U Berger J and Schwarz H 2006 Cuticle differentiation during Drosophila embryogenesis Arthropod Struct Dev 35 137 52 Moussian B Veerkamp J Muller U and Schwarz H 2007 Assembly of the Drosophila larval exoskeleton requires controlled secretion and s
220. rect avec l enveloppe La procuticule est s cr t e et en contact avec le sommet des undulae D Sch ma des cellules pidermiques et ultrastructure de la cuticule en fin de stade 17 Les cellules pidermiques sont aplaties et la cuticule cesse de s paissir La procuticule atteint son paisseur maximale et l orientation des fibres de chitine est maintenant visible La surface cellulaire est redevenue lisse Echelle 500 nm dans les coupes transversales et 250 nm pour les denticules D apr s Moussian et al 2006 basale la r gion apicale accumulant les organites de synth se et d adressage des biomol cules leur face apicale Par exemple de nombreuses mitochondries ainsi qu un r seau golgien tr s important sont mis en place la face apicale Au stade 15 les undulae apicales pourraient permettre d augmenter et ou d orienter spatialement la s cr tion L ensemble des transformations de l organisation cellulaire t moigne de la sp cialisation des cellules pidermiques pour la production de la cuticule L piderme embryonnaire est donc orient vers la fonction de s cr tion et ceci de mani re tr s active De mani re int ressante il existe des diff rences notables entre les cellules lisses et les cellules qui produisent des denticules Premierement la membrane apicale au niveau de la denticule ne pr sente pas d undulae Deuxi mement les diff rentes couches de la cuticule sont d pos es plus rapidement sur la de
221. rence Chicago 2009 Les cellules denticules vont donc subir en plus de leur allongement dans l axe D V des modifications des jonctions intercellulaires ainsi que de tout le compartiment apical En effet la pouss e perpendiculaire des faisceaux d actine d forme ce compartiment et exige probablement une architecture plus robuste de jonctions apicales expliquant l accumulation des marqueurs Arm et Shg De facon int ressante il a t montr que Pio et Dumpy Dp deux prot ines ZPD sont n cessaires dans la r organisation des AJs au cours de la formation tube trach al la dans l embryon 127 bp i Figure 31 Localisation des prot ines Dyl et Tyn dans un contexte mutant pour la DE Cadh rine Shg Dans les mutants Shg la localisation de M ne semble pas tre affect e malgr les d fauts de d veloppement bloquant les embryons au stade 15 A ce stade les denticules n ont pas atteint leur taille d finitive Tyn se localise la base de la denticule autour des faisceaux de F actine Dans les mutants Shg la prot ine est toujours correctement adress e et localis e Toutefois une localisation de Tyn au niveau des contours cellulaires des cellules lisses semble tre renforc e dans ce contexte mutant Jazwinska and Affolter 2004 De m me la prot ine ZPD Hensin DMBTI influence la polarit cellulaire pith liale et promeut la formation de complexes de jonctions Takito and Al Awgati 2004 Nous montrons
222. res de la morphogen se au sein d un processus de d veloppement dont les m canismes de r gulation sont bien connus L introduction de ce manuscrit abordera successivement les grandes tapes de l tablissement du patron des trichomes puis celles de la diff renciation g n rale de l piderme et enfin comment ces deux processus contribuent ensemble au contr le de la forme des cellules pidermiques Nous d velopperons ensuite les r sultats de nos tudes et montrerons comment ils contribuent une meilleure compr hension des m canismes de la morphogen se cellulaire et de la nature de leur lien avec les r seaux de r gulation g nique 10 A Ant rieur B Post rieur D ARNm bicoid ARNm nanos ARNm hunchback Prot ine Hunchback Prot ine Bicoid Prot ine Nanos ARNm knirps IY m ZT ARNm hunchback ARNm giant C D Ant rieur Post rieur Proteine Torsolike Prot ine Toll Proteine Torso activ e Prot ine Toll activ e ARNm zen BA en ARNm twist Figure 2 Etablissement des axes de polarit de l embryon de Drosophile La t te est gauche le ventre en bas Trois stades embryonnaires sont indiqu s l oeuf f cond le blastoderme syncytial et le blastoderme cellulaire A Le d terminant ant rieur cod par bicoid est localis en ant rieur La prot ine Bicoid est synth tis e apr s f condation et diffuse vers le post ri
223. resenting the epicuticle light grey lines endocuticle and dark grey the cytoplasm Pink green and yellow correspond to the Marginal Zone MZ also referred to as Sup Apical Region Adherens Junctions AJ and Septate Junctions SJ respectively Blue areas highlight regions where plasma membrane does not appear to contact cuticle layers showing abnormal enlargement in 7PD mutants at specific locations along the extension Figure 6 Disorganization of the apical compartment in tyn and zye mutants 91 Localization green of Crumbs Shotgun e h and Disc large i l proteins in wt PG38 exfa yn and zye embryos Apical extensions are visualized using anti Dyl antibody red and magenta lines delimit denticle cells d h and I histograms represent the apparent area of denticle cells as from Crb Shg and Dlg staining Note the increased area of denticle cells in tyn and zye mutants when compared to wild type ratio 1 6 for tyn wt and 1 9 for zye wt using the Crb staining Yellow lines outline the contour of one cell Below confocal pictures histograms plot the signal intensity Crumbs levels are enhanced in wt denticle cells compared to naked cells a while signal intensity is similar in all epidermal cells in tyn and mutants b c Shotgun is also enhanced in wt denticle cells e whilst diminished in tyn and mutants f g Figure 7 Model of ZPD protein function during apical cell shape remodeling A
224. richome reproduisant ainsi l expression endog ne de m L activit de ce CRM est d pendante de Svb puisqu elle est abolie dans un contexte svb mutant SBK mutant du gene svb et buttonhead btd cette derni re mutation produisant un d faut de la formation de la t te permettant l identification ph notypique des embryons mutants RESULTATS 1 Cibles directes du facteur Svb dans l piderme a M est une cible directe de Svb conservation volutive du motif Ovo Les r gions r gulatrices ou CRM apparaissent souvent comme des blocs de conservation volutive au sein des s quences non codantes interg niques et introniques Bergman et al 2002 Vavouri and Elgar 2005 Suite l analyse des m canismes de r gulation transcriptionnelle au cours du d veloppement pr coce notamment au stade blastoderme le regroupement local clustering de sites de fixation pour un m me facteur de transcription est souvent consid r comme une signature caract ristique des CRM Bergman et al 2002 Le site consensus de fixation du facteur de transcription Ovo est bien d fini in vitro TTACMGTTACA Lu et al 1998 ACNGTTACA Garfinkel et al 1994 L analyse in vivo de la r gulation de l expression d otu une cible d Ovo dans les cellules germinales femelles montre le clustering de trois sites de fixation pour Ovo dans une r gion r gulatrice compacte autour du point d initiation Cette r gion fixe sp cifiquement la prot ine Ovo in vit
225. rient s post rieurement pour les premieres rang es et ant rieurement pour les rang es suivantes C Vue ventrale d un segment abdominal A4 Les rang es 1 et 4 pointent ant rieurement alors que toutes les autres sont orient es post rieurement nouvelles prot ines SNAREs chez la Drosophile un crible double hybride a t entrepris pour rechercher des prot ines capables de lier directement la prot ine alpha SNAP Ces travaux ont permis d identifier les homologues des Syntaxin 5 Syx5 et 16 dSyx16 Xu et al 2002a Xu et al 2002b Des mutations du gene Syx5 provoquent une accumulation anormale de prot ines membranaires dans les compartiments intracellulaires et conduit a la l talit des animaux au stade larvaire Xu et al 2002b Ces donn es sugg rent que Syx5 joue un r le important dans la r gulation du trafic v siculaire en route vers le domaine apical Cependant aucun des mutants identifi s dans ces travaux ne semble affecter la cuticule Les m canismes de s cr tion de la cuticule restent globalement mal compris existe peut tre des acteurs sp cialis s par exemple sp cifiques aux arthropodes rendant plus difficile leur identification R ciproquement pour les acteurs g n riques du trafic v siculaire l identification de leur r le pour la synth se de cuticule peut tre g n par la l talit pr coce des embryons emp chant une analyse sp cifique dans les tapes les plus tardives de l embryogenese
226. rminant la formation des trichomes Pour contribuer comprendre les m canismes du contr le g n tique de la morphogen se cellulaire j ai particip l identification des g nes cibles de svb le d cryptage des m canismes de leur r gulation transcriptionnelle et surtout j ai orient plus particuli rement mes travaux sur l analyse fonctionnelle d un sous groupe d entre eux codant des prot ines Zona Pellucida dans les tapes intimes du remodelage de la forme cellulaire 31 RESULTATS I Les cibles de Svb RESUME La morphogen se contr le l acquisition de la forme tridimensionnelle des cellules et des tissus gr ce l tablissement de programmes sp cifiques au cours de l embryog n se Toutefois les m canismes et les acteurs mol culaires impliqu s dans ce processus de morphogen se restent encore tr s mal connus Nous avons abord cette question en tudiant la diff renciation morphologique de l piderme chez la Drosophile dirig e par un circuit bien connu de r gulateurs menant un patron st r otyp de cellules lisses et des cellules formant des extensions riches en actine les trichomes Notre quipe avait montr que le facteur de transcription Shavenbaby Svb joue un r le central dans la formation des trichomes Pour comprendre ce m canisme de diff renciation morphologique nous avons recherch les cibles de Svb Nous montrons ici que Svb contr le la forme des cellules pidermiques gr ce
227. rmiques en interaction intime avec le m soderme sous jacent Au cours de son extension elle va s tirer selon l axe A P pour doubler sa longueur tout en diminuant sa largeur Les futures cellules pidermiques participent cette extension notamment par des divisions cellulaires qui s arr tent cependant la fin d une phase rapide d longation Les cellules neurales ne se divisent pas mais participent aussi ce mouvement par l accroissement de leur taille Apr s cette phase rapide l extension de la bandelette germinale continue gr ce 13 Crumb ArmiDE Cad 4 fasill Dlg LS Figure 5 Morphogen se des cellules pidermiques au cours de la fermeture dorsale A B Repr sentation sch matique de la fermeture dorsale A Les cellules pidermiques sont rondes et non align es Les cellules de la marge sont en contact avec l amnios reuse A ce stade l actine en blanc s accumule la fronti re des deux tissus et marque les contours cellulaires B En fin de fermeture dorsale les cellules pidermiques s allongent selon l axe dorso ventral et s alignent A B Sch ma du changement de la forme des cellules pidermiques au cours de la fermeture dorsale correspondant aux images A et B respectivement Sch ma de localisation des diff rents complexes jonctionnels d terminant l identit apico lat ro basale au cours de la fermeture dorsale D apr s K ppen M et al 2006 cette fois des processus d interc
228. ro et est suffisante pour diriger in vivo l expression d un rapporteur Lu and Oliver 2001 Ces r sultats identifient donc otu comme un g ne de cible direct d Ovo pour la diff renciation de la lign e germinale Pour comprendre comment Svb r gule la transcription de ses cibles pour morphogenese pidermique nous avons recherch la pr sence des sites Ovo regroup s et conserv s volutivement dans les s quences interg niques des g nes cibles pr c demment identifi s L analyse compar e des g nomes de D melanogaster D pseudobscura et D virilis bas e sur l alignement local des s quences met en vidence la pr sence de sites Ovo volutivement conserv s dans six des g nes cibles forked f singed sn miniature m dusky like dyl nyobe nyo et morpheyus mye Nous avons test in vivo la fonctionnalit des r gions g nomiques centr es autour de ces motifs Par des approches d sormais classiques de lign es transg niques pla ant l expression d un g ne rapporteur lacZ sous le contr le des r gions tester nous avons analys l activit transcriptionnelle de ces s quences Les premiers r sultats de ces approches se sont av r s d cevants une seule r gion celle identifi e pour m montre une activit de r gulation transcriptionnelle dans les cellules trichomes Cette r gion qui se eme situe dans le intron de m a pu tre ensuite r duite un court fragment de 180bp qui ne poss de qu un se
229. roc Natl Acad Sci U S A 15 633 8 Dubois L Lecourtois M Alexandre C Hirst E and Vincent J P 2001 Regulated endocytic routing modulates wingless signaling in Drosophila embryos Cell 105 613 24 E Elemento O and Tavazoie S 2005 Fast and systematic genome wide discovery of conserved regulatory elements using a non alignment based approach Genome Biol 6 R18 F Fristrom D Wilcox M and Fristrom J 1993 The distribution of PS integrins laminin A and F actin during key stages in Drosophila wing development Development 117 509 23 G Garfinkel M D Wang J Liang Y and Mahowald A P 1994 Multiple products from the shavenbaby ovo gene region of Drosophila melanogaster relationship to genetic complexity Mol Cell Biol 14 6809 18 Greco V Hannus M and Eaton S 2001 Argosomes a potential vehicle for the spread of morphogens through epithelia Cell 106 633 45 Greve J M and Wassarman P M 1985 Mouse egg extracellular coat is a matrix of interconnected filaments possessing a structural repeat J Mol Biol 181 253 64 Guild G M Connelly P S Ruggiero L Vranich K A and Tilney L G 2005 Actin filament bundles in Drosophila wing hairs hairs and bristles use different strategies for assembly Mol Biol Cell 16 3620 31 146 H Hare E E Peterson B K Iyer V N Meier R and Eisen M B 2008 Sepsid even skipped enhancers are functionally conserved in Droso
230. romeut la formation des denticules Hatini and DiNardo 2001 Payre 2004 Sanson 2001 Toutefois les domaines d finis par ces deux voies seront par la suite affin s afin de cr er une identit propre pour chacune des cellules qui constitue le S L expression constitutive d une forme dominante n gative du r cepteur l EGF tend le domaine des cellules pidermiques lisses en r duisant la formation des denticules 2 3 rang es cellulaires sur les 7 normalement observ es dans la r gion abdominale d un embryon sauvage De m me dans les mutants ser on constate la r duction du nombre de denticules montrant la n cessit de l activation de la voie Notch pour r guler le destin des cellules denticules La voie Notch est de plus modul e n gativement par la glycosyl transferase Fringe Fng En effet les mutants fng pr sentent des denticules surnum raires qui vont se former dans les rang es 2 4 sans pourtant tre affect es dans leur forme Walters et al 2006 Il semble donc qu un exc s de la voie Notch conduit en retour la sur activation de la voie EGF r et par cons quent la formation de rang es suppl mentaires de denticules Le r le antagoniste des voies Wnt et EGF r pour le destin morphologique des cellules pidermiques montre ici l importance d une r gulation pr cise permettant d tablir le profil des cellules trichomes 17 2 Les cellules pidermiques et la mise en place de leur polarit L pi
231. rot ines ZPD est n cessaire pour sculpter la forme des extensions cellulaires et maintenir l int grit apicale des cellules qui vont les former Les prot ines ZPD r v lent une sous compartimentalisation fonctionnelle de la membrane apicale n cessaire au contr le du changement de la forme des cellules pith liales au cours du d veloppement 64 Manuscript Click here to view linked References Zona Pellucida Domain proteins remodel the apical compartment for localized cell shape changes Isabelle FERNANDES H l ne CHANUT DELALANDE Pierre FERRER Yvan LATAPIE Lucas WALTZER Markus AFFOLTER Fran ois PAYRE and Serge PLAZA Universit de Toulouse UPS Centre de Biologie du D veloppement F 31062 Toulouse France Biozentrum der Universit t Basel 4056 Basel Switzerland gt CNRS UMR5547 Centre de Biologie du D veloppement F 31062 Toulouse France These authors contributed equally to the work Corresponding authors plaza cict fr payre cict fr Running title ZPD proteins in morphological differentiation 65 Abstract The Zona Pellucida Domain ZPD defines a conserved family of membrane anchored matrix proteins that are as yet poorly characterized with respect to their functions during development Using genetic approaches in flies we show here that a set of 8 ZPD proteins is required for the localized reorganization of embryonic epidermal cells during morphogenesis Despite
232. rti sur le long de cette s quence Chacune de ces s quences est capable de fonctionner de mani re autonome bien que certaines diff rences entre les CRM peuvent tre not es les CRM dirigeant une expression forte et compl te Emin Epidsnl ShaBS3 EnDyl2 Entyn2 et EnNyolExt ou les CRM dirigeant une expression faible et ou partielle EminB ShaBS1 EnCyrA EnNyo2Ext De plus nos donn es sugg rent que la pr sence de certains motifs proximit du site Ovo mod le OMM pourrait tre une signature de l utilisation fonctionnelle de ce site in vivo dans l piderme Par exemple il est possible qu il existe une coop rativit entre Svb et d autres facteurs de transcription pour l expression des effecteurs cellulaires dans le sous ensemble des cellules pidermiques trichomes 59 ventral lateral Dorsal mnm Figure 24 Expression du CRM EnNyo2Ext HSP27 Le promoteur Hsp70 du vecteur pATTB a t remplac par le promoteur Hsp27 du vecteur pCp Ce remplacement a aussi ramen la s quence NLS permettant la localisation nucl aire de la Bgal transg nique Ce changement de promoteur permet d am liorer l expression du CRM tablissant que la nature du promoteur minimal utilis n est pas neutre sur l activit transcriptionnelle des CRM comparer avec la figure 21 EnNyo2Ext HSP27 DISCUSSION La morphogen se pidermique embryonnaire offre un mod le int ressant dans la compr hension de la r g
233. ruary 23 2005 Accepted June 28 7006 Published August 22 2006 DOE 10 137 1 journal pbie o040290 Copyright 2006 Chanut Delalande et al This is an open access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License which permits unrestricted use detribution and reproduction in any medium provided the original author and source are credited Abbraviations bp base pair kb kilobase O 4KminKO O 4Kmin knockout To whom correspondence should be addressed E mail plaza amp cict fr SP payre FP amp These authors contributed equally to this work Current address Biorentrum der Universitat Bass Basel Switzerland September 2006 Volume 4 Issue 9 e290 35 swb Directs Epidermal Cell Differentiation ema Wem FT CEET ZEN e 7 shavenbaby shavenbaby B Drosophila melanogaster D melanogaster svb Drosophila sechellia svb cuticle e iri F Iw 8 P KI Ss ak Ir d Ca 7 To d Ct Lag gi 3292 0m hate re T D j borr amp m x E mi cu Wu u AOL uf Ken dE d Fork z e We Fo z aF a Figure 1 Control of m Expression by svb in the Embryonic Epidermis A Schematic representation of the signaling pathways that control morphological differentiation of the ventral embryonic epidermis at stage 12 top and at the end of embryogenesis bottom
234. s E The 0 4Kmin construct drives m like epidermal expression at a high level The white box indicates the ventral region selected for the close up presented in panel H and Like the endogenous gene this enhancer Is responsive to svb since staining ls absent in svb mutants Fl and additional stripes are produced after svb ectopic expression arrowheads 6 Close up of the ventral region segments A3 A5 of a 0 4Kmin embryo showing that the Egal reporter red is co expressed with endogenous Miniature protein green in epidermal cells and J Electrophoresis mobility shift assays show the specific binding of the Svb protein to wild type m enhancer Introduction of 2 point mutations prevents in vitro binding 1 and leads to an inactive enhancer when assayed in vivo 0 Sequence of the Svb binding site capital letters and introduced mutations red are indicated DOE 10 1371 journal pbio 0040290 9002 55 PLoS Biology www plosbiology org 0004 September 2006 Volume 4 Issue 9 e290 38 The sequence of this Svb binding site on the m enhancer at position chrX 1 1487686 on the genomic scaffold is con served in all sequenced Drosophila species Introduction of point mutations that substitute two invariant nucleotides found in all Ove binding sites 29 eliminates Svb binding in vitro Figure 21 showing that Svb interacts specifically with the m enhancer through this single binding site To test the consequ
235. s En conclusion nos travaux am nent une connaissance nouvelle des m canismes de contr le de la transcription des g nes cibles de Svb au cours de la morphogen se cellulaire dans l piderme embryonnaire Si on note un enrichissement significatif dans l occurrence du nombre de sites potentiels de liaison pour Svb dans ces g nes nos analyses fonctionnelles montrent que l activit in vivo de chacun de ces motifs ne peut tre pr dite simplement par son niveau de conservation volutive De plus nous n avons pas d tect de CRM bas sur le regroupement local de nombreux sites clustering En effet les r gions pr sentant une activit transcriptionnelle en r ponse Svb ne contiennent au mieux que 3 sites loign s dont l influence individuelle reste cependant d terminer Dans le cas de miniature 1l existe m me un seul site de fixation Svb dans chacun des deux CRM fonctionnels Nos analyses pr disent qu un l ment potentiellement important est plut t l association h t rotypique avec le site Ovo d autres motifs nucl otidiques qui semble significative des CRM fonctionnels Concernant la nature des m canismes du changement de l organisation apicale des cellules pidermiques pour la formation des trichomes nos r sultats mettent en vidence que le facteur de transcription Svb active probablement directement l expression de plusieurs genes ZPD Nous avons engag ensuite l analyse fonctionnelle syst matique de famille
236. s compartiments subapicaux 2 La distribution subcellulaire des prot ines ZPD dans les sous domaines de la membrane apicale sugg rent l existence de machineries d adressage cellulaire n cessaire cet assemblage ordonn Nos outils anticorps fusion XFP prot ines chim res ainsi que des essais fonctionnels sauvetage g n tique pourraient permettre de mieux comprendre les m canismes d adressage impliqu s dans la subdivision des domaines membranaires apicaux En effet un crible g n tique pilote est actuellement en cours au laboratoire pour identifier les r gulateurs de la distribution subcellulaire des prot ines ZPD Les premiers r sultats montrent la faisabilit et l efficience de cette d marche L encore il semble que seules des 143 approches in vivo soient m me de pouvoir d couvrir et d crypter ces m canismes 3 L existence d une distribution subcellulaire diff rentielle entre les prot ines ZPD modifie notre vision de la nature des polymeres fibrillaires qu elles forment L analyse d taill e de la fonction des prot ines ZP 1 2 et 3 dans la Zona Pellucida a d j d montr que chaque prot ine joue un r le particulier Howes et al 2001 Dans les cellules trichomes nos r sultats sugg rent l existence d une h t rog n it de la matrice apicale li e la variation de sa composition en prot ines ZPD Si la connaissance du vivant est un objectif en soi comment les tudes fondamentales
237. s differentiation in Prosofhila Int Dev Biol 4 207 215 9 PLoS Biology www plosbiology org 0012 Directs Epidermal Cell Differentiation CNS central nervous system Ep epidermal NT not tested Found at DOE 10 137 journal pla 355 KB PIF Table 82 Quantification of Denticle Defects Kesulting from Inactivation of seh Downstream Targets The denticle belt of the fourth abdominal segment of wild type and simple or multiple mutant embryos was photographed at high resolution using a 63 phase contrast objective NA numerical apermre 1 4 and a digital Nikon COD camera Pictures were processed and analyzed using the Image software Se in ru gelt We focused on the fourth row of denticles which are relatively large and display a characteristic stereotyped morphology Analyses were perlormed on five to ten individuals ol the same genotype to obtain a number of denticles superior to 70 A Summary of the consequences of wb target inactivation on denticle formation We measured several geometrical parameters mcluding denticle area perimeter width and heihi We determined the number of denticles that are present along the fourth row we focused on a 75 um wide region corresponding to the most ventral mat Statistical analyses 3 way ANOVA with denticle being nested in individuals which is nested im genotype on given variable confirm that despite intragroup variations differences between genotypes
238. s membranes s allongent donc basalement et d autres points de ZA sont form s tout au long de cette future membrane lat rale Muller and Wieschaus 1996 Une fois que les sillons membranaires ont pass la base des noyaux les canaux d invagination s tendent lat ralement pour produire la membrane basale et fusionnent entre eux pour former une unit cellulaire figure 8 Pendant cette phase les ZA sont aussi r organis es pour se concentrer uniquement au pole apical des cellules Lecuit and Wieschaus 2000 b Formation de la zonula adherens mise en place de la polarit A P A la fin de la cellularisation d bute la maturation de la ZA accompagn e de la restriction de la formation des jonctions adh rentes AJ dans la r gion apicale des cellules Ce processus 19 SAR ZA 4 5 Figure 8 Formation des jonctions au cours de la cellularisation Chez les invert br s les jonctions des cellules pith liales sont compos es en apical par la Zonula Adherens ZA et en lat ral les Jonctions Sept es SJ Les diff rentes tapes de la formation des cellules pith liales au cours de l embryog n se de la Drosophile A Au cours de la premi re tape de la formation des cellules cellularisation un sillon de clivage Furrow Canal ou FC et les jonctions adh rentes basales Basal Junction ou BJ sont form s B Formation de la ZA Le sillon de clivage se d place basalement et une fois en dessous du noyau il s l
239. s s rieuses je tenais remercier un certaines nombres de personnes sans lesquelles tous ce travail n aurait jamais pu tre fait ou alors avec beaucoup plus de difficult s Je vais commencer par toutes les personnes qui travaillent dans l ombre ou plut t ici dans les sous sols Il y aurait pas mal de choses dire sur ces sous sols mais ce n est pas le propos de ce paragraphe Alors je commencerais tout d abord par remercier Julien et Fred sans qui au quotidien il nous serait impossible d entretenir nos stocks lancer les croisements r colter des embryons mais aussi utiliser des tubes eppendorf et des c nes st riles en bref tout simplement travailler Merci les garcons de toujours veiller depuis les tr fonds de notre sous sol nous fournit ce dont nous avons besoin Merci aussi Daniel de g rer dans l ombre les achats de tout ce mat riel mais aussi de g rer nos absences et notre manques de ponctualit dans les commandes merci d avoir toujours su trouver une solution mes petits SOUCIS Lors de mon entretien d entr e dans le M2R on m a demand quel stage m int ressait et pourquoi Ma r ponse en a fait sourire plus d un et sur le moment je n ai pas vraiment compris pourquoi mais je voulais travailler avec Serge et faire de l imagerie Et je n ai pas t d cue Alors bon la base ca n a pas t vident Au cours du M2R j ai fais trois images au confocal avec l assistance de Serge et puis c est tout beauco
240. sale des cellules 18 a Du blastoderme syncytial au blastoderme cellulaire 18 b Formation de la zonula adherens mise en place de la polarit A P 19 Maturation des complexes jonctionnels tablissement d une barri re tanche 21 2 2 L piderme et la s cr tion de la cuticule une barri re protectrice de l insecte 22 a I epiderme Un EE ne Ee 22 DFormation de la Cu CU le E ee 23 Les voles de secretion E EE 25 3 Shavenbaby le d terminant ultime de la morphogen se cellulaire pidermique 26 3 1 M canismes cellulaires de la formation des trichomes 26 3 2 R gulateurs du cytosquelette dans la forme apicale des cellules trichomes 21 3 3 Shavenbaby un niveau suppl mentaire de r gulation transcriptionnelle 28 ua Nee 32 RN A E 33 RESUME 34 DISCUSSION E 48 II La r gulation des g nes cibles de Svb 22200000000000000000000000000000000000000000000000000000000 51 INTRODUCTION iu E M S 52 R SULTATS su Ei 54 1 Cibles directes du facteur Svb dans l piderme nennen 54 a Mest une cible directe de Svb conservation volutive du motif Ovo 54 b Les r gulateurs de l actine singed et shaveno id sse 55 2 Prediction et test in vivo des CRM li es par Svb 56 3 Mod lis
241. scription est d pendante de Svb au cours la diff rentiation pidermique Chanut Delalande et al 2006 Arm s de l ensemble de ces connaissances nous avons donc engag un programme de recherche visant identifier les cibles g nomiques de Svb au cours de la morphogen se pidermique Pour ce faire nous avons d velopp une combinaison d approches compl mentaires faisant appel de nouvelles m thodes pr dictives en collaboration avec S Aerts Louvain ainsi qu une analyse fonctionnelle des r gions g nomiques candidates 53 Scale 10 kb chr 11585000 1580000 1 1595000 11600000 svb positives Emin Emne MN svb negatives mint MS ovo motifs avo Muotits OMM matif OMM Motifs FlyBase Protein Coding Genes cG9360 MR e E E due Emin SBK Figure 16 Sch ma de l organisation g nomique du g ne m et expression du CRM Emin Le g ne est repr sent en bleu gris les rectangles correspondent aux exons et les traits aux introns Les boites bleues Emin et EminB correspondent aux CRM r pondants l activit de Svb et capables de diriger une expression dans les cellules trichomes Les carr s rouges repr sentent les r gions g nomiques pr dites mais ne pr sentant pas d activit transcriptionnelle dans l embryon Vues lat rales d embryons au stade 16 apr s une immunocoloration anti lac z Le CRM Emin dirige l expression du rapporteur lacZ dans l ensemble de cellules t
242. sed by cis regulatory evolution of ovolshaven baby Proc Nail Acad Sci U 5 A 97 4550 4554 Suce a E Delon L Jones I Payre E Stern DIE 2003 Regulatory evolution of shavenbabyiow underlies multiple cases of morphological parallelism Nature 424 995 938 khila A El Haidani A Vincent A Payre F I5n Souda 5 200 The dual function of ovolshavenhaby in germline and epidermis differentiation is conserved between melanagastor and the olive fruit Hactracera aleae Insect Biochem Mol Biol 3 691 09 Delon L Favre 20041 Evolution of larval morphology in flies Get in shape with shavenbalwy Trends Genet 207 305 413 MoCartney BM Derick HA Kirkpatrick Moline MM Baas A et al Drouin APCS is a cytoxkeletally associated protein that regulates wingless signaling in the embryonic epidermis Gell Biol 146 1303 1318 Domnstey EM Biene M 2000 Actin dependent membrane association of a Drinephile epithelial protein and its effect on junctional Armadillo Curr Biol 10 1540 1548 Dickinson Thatcher JW 1997 Morphogenesis of denticles and hairs in embryos Involvement of actinsassociated proteins that also affect adult structures Cell Moul Cytoskeleton 38 4 21 Price MH Roberts DM Metartney BM E feier M 2006 Cytoskeletal dynamics and cell signaling during planar polarity establish ment inthe Drosophila embryonic denticle Cell Sel 11 403 415 Wi
243. servation of their ZP domain A or that of the linker region located between the ZP domain and single pass transmembrane region B see arrows Sequences were extracted from Drosophila melanogaster Mel Dyl Tyn M indicated as Min Neo Nyo Mey and ortholog ZP protein sequences Ano Anopheles gambiae Tri Tribolium castaneum using the SMART package http smart embl de Amino acid sequences were then aligned with CLUSTALW2 and evolutionary relationships were best viewed through a phylogram tree http www ebi ac uk Tools clustalw2 index html Accession numbers for orthologs of ZP proteins Dyl FBpp0073197 Tyn FBpp0099481 Min FBpp0073400 Neo FBpp0084851 Nyo FBpp0085152 Mey FBpp0039851 are respectively AGAP003211 PA AGAP003012 PA AGAP000786 PA AGAP002316 PA in Anopheles and gt GLEAN 01440 gt GLEAN 00163 gt GLEAN 03770 gt GLEAN_03763 in Tribolium Tee Inte 115 DISCUSSION Les prot ines Zona Pellucida ZP ont initialement t identifi es en tant que composants majeurs de la Zona Pellucida 1 matrice entourant et prot geant les ovocytes Bleil and Wassarman 1980 Ces prot ines sont caract ris es par la pr sence d un domaine fonctionnel extracellulaire le domaine ZP qui d finit une famille de prot ines ZPD volutivement conserv es Les prot ines ZPD sont impliqu es dans l organisation de diverses matrices extracellulaires ECM et leur alt ration chez l Homme cause diff
244. sgene dans les rang es 0 1 permet un sauvetage ph notypique des denticules qui s tend jusqu en rang e 4 D D Image en microscopie confocale des cellules a denticule du segment A3 D Coloration de la F actine par la phalloidine rhodamine Immunocoloration de M D Superposition de D et D L expression de M est limit e aux rang es 0 1 par le pilote enG4 La rang e 1 fortement marqu e au niveau des denticules montre une localisation correcte de la prot ine alors qu en rang e 0 M est strictement cytoplasmique Les rang es 2 4 sont marqu es au niveau des denticules RESULTATS Nos premi res exp riences de sauvetage ph notypique de la mutation m mettent en vidence que M serait capable d agir distance des cellules sources de sa production Nous avons donc recherch la nature des m canismes pouvant expliquer cet effet distance dit cellulaire non autonome 1 Min diffuse et se relocalise pr cis ment sur la denticule Pour le sauvetage du ph notype m nous avons utilis deux pilotes da Gal4 dirigeant une expression ubiquitaire et en Gal4 se limitant aux rang es cellulaires 0 1 de chaque segment de l piderme embryonnaire figure 32 L expression ubiquitaire pr coce du transgene UAS m permet de restaurer le ph notype sauvage pour l ensemble des sept rang es de denticules L expression limit e aux cellules En restaure la forme sauvage des denticules des cellules de la rang e 1 qui
245. sian 2005 Trois autres mutations sont connues pour donner des d fauts similaires retroactive rtv knickkof knk et zeppelin zep Ostrowski et al 2002 L analyse ultrastructurale des mutants knk et rtv montre que les fibres de chitine ne sont plus assembl es dans la procuticule Rtv est une prot ine transmembranaire poss dant un domaine potentiel de fixation la chitine et qui pourrait donc contribuer son organisation lamellaire Moussian et al 2005 Knk est prot ine extracellulaire ancr e la membrane apicale via une ancre GPI et elle aussi semble indispensable pour la formation de cette structure lamellaire Moussian et al 2005 L identification des composants de la cuticule reste donc un des challenges majeurs dans la compr hension de cette structure sp cifique aux arthropodes Les arthropodes comprennent notamment les insectes et crustac s et constituent un clade avec les N matode les Ecdisozoaires dont le d veloppement s effectue par une ou plusieurs mues cuticulaires Le nom du taxon vient du mot ecdysis qui d signe la mue La cuticule larvaire de la Drosophile a t particuli rement bien tudi e contrairement aux autres ecdisozoaires Toutefois tr s r cemment la cuticule d un embryon de crustac Parhyale hawaiensis a t d crite grdce une analyse en microscopie lectronique Havemann et al 2008 Cette tude a permis d montrer qu il existe une grande similitude avec la Drosophile dans
246. sine La Tyrosine hydroxylase TH et la Dopa d carboxylase DCC convertissent la tyrosine en dihydroxyph nylalanine DOPA puis en dopamine DA dont l oxydation en quinones produit des d riv s impliqu s dans la rigidification et la pigmentation Wittkopp et al 2002 Chez l adulte la combinaison entre les pigments noirs et bruns contr l s respectivement par y et ebony e permet de d finir les diff rentes pigmentations de la cuticule La pigmentation semble a priori un processus diff rent de la morphogen se cellulaire Pourtant en fin d embryogenese les filaments d actine sont d sassembl s et l architecture cuticulaire doit se maintenir et il faut pour cela rigidifier la cuticule Les larves mutantes pour y montrent des d fauts de la morphologie des denticules g n rant une activit locomotrice anormale Inestrosa et al 1996 Svb pourrait directement r guler la composition locale en prot ines de la cuticule d pos e sur les denticules La cuticule est d pos e d abord sur la denticule sugg rant une r gulation du d p t et de l assemblage diff rente de celle des 49 cellules lisses Moussian et al 2006 La pr sence de la prot ine Y uniquement dans les cellules denticules renforce l hypoth se d une maturation sp cifique ces structures Enfin Svb r gule l expression du g ne miniature m dans les cellules denticules La premi re mutation de ce g ne m a t caract ris e en 1910 par T
247. sophila genome Genome Biol 3 RESEARCHOOS6 Beronja S and Tepass U 2002 Cellular morphogenesis slow as molasses accelerates polarized membrane growth Dev Cell 2 382 4 Bilder D 2003 PDZ domain polarity complexes Curr Biol 13 R661 2 Bilder D Li M and Perrimon N 2000 Cooperative regulation of cell polarity and growth by Drosophila tumor suppressors Science 289 113 6 Bilder D and Perrimon N 2000 Localization of apical epithelial determinants by the basolateral PDZ protein Scribble Nature 403 676 80 Bilder D Schober M and Perrimon N 2003 Integrated activity of PDZ protein complexes regulates epithelial polarity Nat Cell Biol 5 53 8 Bischof J Maeda R K Hediger M Karch F and Basler K 2007 An optimized transgenesis system for Drosophila using germ line specific phiC31 integrases Proc Natl Acad Sci U S A 104 3312 7 Bleil J D and Wassarman P M 1980 Mammalian sperm egg interaction identification of a glycoprotein in mouse egg zonae pellucidae possessing receptor activity for sperm Cell 20 873 82 Bokel C Prokop A and Brown N H 2005 Papillote and Piopio Drosophila ZP domain proteins required for cell adhesion to the apical extracellular matrix and microtubule organization J Cell Sci 118 633 42 Britten R J and Davidson E H 1969 Gene regulation for higher cells a theory Science 165 349 57 145 Cant K Knowles A Mooseker S
248. spensable au relargage de la prot ine dans le milieu extracellulaire Zhao et al 2002 a t sugg r que la s cr tion du complexe ZP2 3 se fait en r alit de mani re concomitante leur assemblage Jovine et al 2007 gr ce un changement conformationnel exposant des domaines hydrophobes facilitant le passage travers la membrane Jovine et al 2007 N anmoins pour la prot ine ZPD uromoduline il a t montr que sa partie C terminale est cliv e au niveau d un site prot olytique conserv Santambrogio et al 2008 Le r le du motif tetrabasique volutivement conserv dans les prot ines ZPD reste finalement mal connu et 11 en va de m me pour l importance fonctionnelle d une ventuelle maturation par clivage des prot ines ZPD M est elle cliv e Et si oui comment joue t elle son r le dans le maintien du contact membrane apicale aECM 127 A Ba Em x A lt x 2 awx x mEUAS M A E a Je A 4 LT gt A 4 aA N gt EA Figure 32 Fonction de m au cours de la morphog nese pidermique A C Image en contraste de phase de l ensemble des 7 rang es de denticules sauvages avec un erandissement de la rang e 4 caract ristique du ph notype en bas droite A B et sauvetage par le transgene UAS m C B Les denticules m ont une forme triangulaire sur une base largie C L expression de l UAS m par le pilote enG4 dirigeant l expression du tran
249. st me ant rieur contr le la mise en place et le d veloppement de la t te et du thorax Leptin 1995 Bicoid est l l ment cl de cette r gulation Son ARNm est synth tis au cours de l ovogen se et reste ancr sp cifiquement la pointe ant rieure du jeune embryon Sa traduction permet la prot ine Bicoid de diffuser vers la r gion post rieure tablissant ainsi un gradient de concentration A P Macdonald and Kerr 1998 Ce gradient est int gr par les promoteurs de diff rents g nes cibles dont l expression sera restreinte des grandes r gions selon l axe A P figure 2A La prot ine Nanos d origine maternelle est confin e la partie post rieure de l embryon et inhibe la traduction de l ARNm maternel de hunchback uniform ment r parti Ainsi la partie post rieure de l embryon sera d pourvue de la prot ine Hunchback Le gradient de Hunchback r sultant d termine alors les domaines d expression de plusieurs autres genes impliqu s dans la d finition de l axe A P tels que kr ppel knirps et giant figure 2B Jackle and Sauer 1993 Leptin 1995 Le syst me terminal gouverne quant lui le d veloppement des extr mit s non segment es de l embryon Le r cepteur Torso est uniform ment distribu mais activ exclusivement aux deux p les de l embryon ou il induit l expression de g nes zygotiques tel que tailless figure 2C Baek and Lee 1999 b D finition de l axe dorso ventral L axe dorso
250. st pas une variation du niveau d expression de l un des g nes parmi les autres qui permet aux extensions d acqu rir une morphologie caract ristique chacune d elles De plus lors des exp riences de sauvetage nous avons utilis un pilote ubiquitaire pr coce daG4 qui permet au transgene de compenser la perte de fonction du g ne correspondant Cela d montre que le contr le strict de la temporalit d expression n est pas indispensable non plus pour la fonction de ces prot ines Existe t il une sp cificit de fonction parmi l ensemble des neuf g nes exprim s dans les cellules denticules Svb co r gule un ensemble de neuf g nes ZPD structuralement apparent s laissant penser que ces g nes correspondent une duplication r cente et gardent donc une fonction redondante Chez C elegans plusieurs g nes ZPD sont aussi co exprim s dans les cellules hypodermiques embryonnaires et jouent un r le partiellement redondant dans la diff renciation de la cuticule Muriel et al 2003 Sapio et al 2005 Sebastiano et al 1991 Nous montrons ici que chacun des huit g nes tudi s poss de une fonction sp cifique dans la morphogenese pidermique L inactivation individuelle de chacun de ces 8 g nes provoque un d faut sp cifique de la forme des denticules l inactivation simultan e de m tyn et zye montre un ph notype additif Seuls les mutants neo nyo et individuels ou simultan s montrent des ph notypes similair
251. supernumerary row of cuticular extensions and leads an ectopic stripe ol m expression Figure Ij showing that sub is sufficient to trigger m transcenption in epidermal cells As the evolutionary loss of dorsal trichomes in D sechellia embryos is the result of the restriction of sub expression to narrow stripes in dorsal epidermal cells 16 we asked whether m expression was modified accordingly in D sechellia When compared to D melanagaster m expression in D sechellia embryos is indeed seen to he restricted to narrow bands in the dorsal region These data thus bring independent support to the conclusion that m expression is controlled by sob in the embryonic epidermis and show that this regulation has been evolutionarily conserved All together our results demonstrate that sub activity is necessary and sufficient to control m expression specifically in epidermal cells producing denticle and dorsal hairs Shavenbaby Directly Controls Miniature Transcription To investigate whether sz directly regulates m expression we first attempted to identify cis regulatory elements direct ing m transcription in the embryonic epidermis We generated transgenic lines in which a reporter gene is placed under the control of a 6 kilobase kb genomic region encompassing the m transcriptional start site 6kmin see Figure 2A These Gkmin reporter transgenes faithfully reproduce m expression in late embryos Figure 2B and 2 and display a similar
252. t de me rencontrer alors que vous tiez en vacances de d jeuner en m coutant parler de mon projet avec enthousiasme d apr s Markus ou plut t avec beaucoup de stress et le d bit impressionnant qui va avec C tait juste magique Me voil form e en microscopie lectronique et toute heureuse de ma rencontre avec Le Mr des prot ines ZPD mais surtout me voil de retour Toulouse ou maintenant il va falloir tout mettre en uvre pour faire de Si je dois tre de fi re d un d tail en particulier par rapport mon travail c est d avoir r ussit obtenir des images d EM d aussi bonne qualit qu B le Cela a t plus qu pique comme entreprise mais j ai trouv toute l aide dont j avais besoin et surtout des personnes comp tentes et disponibles Je voudrais tout d abord remercier Isabelle et Bruno au CMEB qui m ont beaucoup aid pour la microscopie balayage Gr ce eux j ai pu pr parer mes chantillons et trouver le microscope de mes r ves en TEMSCAN et c est la que a se complique puisqu il est situ dans un autre service un autre endroit dans le campus Mode d emploi pour obtenir une belle image en 3DM d un poil de ventre de b b mouche Toulouse tout d abord pr parer ces b b s mouches important ensuite direction la facult de M decine CMEB pour les amener Isabelle qui va se charger de leur faire un point critique houlala encore un truc compliqu ca se passe pendant l
253. t from E Wieschaus or embryos sorted using the GFP balancer For high resolution imaging ventral epidermis was hand dissected Immunostaining was performed according to 14 with anti Miniature 28 at 1400 anti Forked 37 at 1300 anti Singed Development Studies Hybridoma Bank lowa City lowa United States at 1 2 ami V galactaosulase Cappel Solon Ohio United States Alexafluor488 labeled anti bodies Molecular Probes Eugene Oregon United States and LIKITC phallonlin Sigma St Louis Missouri United States brvos were mounted in Wectashield Vector Laboratories Burlin game California United States and photographed with a Leica TSP confocal microscope Wetzlar Germany Cuticle preparation and electronic microscopy Live mutant embryos lacking GFP fluorescence from balancers were hand selected and cuticles prepared in hoversflactic acid 11 Abdominal 2 amd 4 were using a Zeiss Axioplan microscope equipped with phase contrast Zeiss herkochen Germany All high magnification pictures correspond to the midline region of the fourth abdominal segment For scanning electron microscopy stage I6 embryos were fixed 12 min in heptane saturated in glutaraldehyde devitellinized by hand and after several water washes dehydrated through an ethanol series They were then dried using CO in a ROMAR lt 2001 A critic al point dryer omar Tacoma Wash ington United States sputtered
254. t le produit serait capable de s associer avec l actine mais dont la fonction biochimique reste identifier Ren et al 2006 Toutefois la localisation uniforme de cette prot ine autour des denticules ne ressemble pas celle des autres prot ines liant l actine comme Sn ou F donn es non publi es Ces donn es sugg rent donc un r le diff rent de Sha dans ce processus Svb contr le donc l expression de plusieurs facteurs essentiels au remodelage du r seau d actine n cessaire pour d clencher la formation des extensions cellulaires apicales La poursuite de l identification des g nes r gul s par svb devrait permettre de d couvrir des facteurs suppl mentaires n cessaires pour remodeler l actine in vivo La modification de l expression de svb a permis l volution concert e de ce module contr lant la morphogen se des cellules pidermiques au cours du d veloppement et la diversification morphologique pendant l volution d esp ces d insectes Svb r gule aussi l expression du gene yellow y impliqu dans la pigmentation de la cuticule La premi re mutation de y a t d crite en 1911 par E Wallace Puis T H Morgan en 1916 a montr que ce g ne est requis pour la production de pigments cuticulaires figure 7 de l article N anmoins le r le biochimique exact de Y dans la pigmentation reste encore d terminer Les pigments cuticulaires d rivent des cat cholamines qui sont synth tis s partir de la tyro
255. tain localized membrane aECM contacts within restricted areas of the apical compartment This includes the stabilization of high levels of apical protein complexes likely to be involved in the remodeling of epidermal cells to promote the formation of apical extensions 71 Discussion Zona Pellucida Domain ZPD proteins organize various ECM known to play important roles in adults since mutations in ZPD genes cause infertility deafness or renal and vascular disorders Jovine et al 2005 However our understanding of how ZPD proteins contribute to the development of embryonic tissues remains limited Through the systematic analysis of Drosophila ZPD genes we show here that a diverse subfamily of ZPD proteins contributes to remodeling the shape of embryonic epidermal cells during their differentiation We find that each ZPD protein accumulates in and thereby defines a restricted apical sub region to locally modify the composition of aECM and its interaction with membrane domains Transcriptional control of epidermal morphogenesis The Drosophila embryonic epidermis provides a well understood framework within which to address the mechanisms of changes in cell shape during development Schock and Perrimon 2002 The polarity of epidermal cells is progressively established throughout the period of tissue differentiation Muller and Bossinger 2003 and hormones subsequently control cuticle deposition Locke 2001 Payre 2004 Before this re
256. tensions called denticles in the ventral region and hairs in the dorsal region collectively referred to as trichomes The pattern of trichomes is stereotyped in Drosophila melanogaster and displays a wide range of evolutionary diversification between insect species Delon and Payre 2004 Results both from developmental and evolutionary studies have shown the importance of the gene shavenbaby svb in determining the trichome pattern Delon and Payre 2004 McGregor et al 2007 Payre et al 1999 Sucena et al 2003 The control regions of svb integrate multiple inputs emanating from signaling and positional information to define the subset of cells forming trichomes in a given species Delon and Payre 2004 McGregor et al 2007 Payre et al 1999 Svb encodes a transcription factor that acts in a cell autonomous manner to trigger trichome formation Andrews et al 2000 Delon et al 2003 and identification of svb downstream targets has provided an unbiased means of discovering direct effectors of epidermal cell remodeling Svb triggers the expression of regulators of general machineries such as the ARP2 3 nucleation complex for the localized polymerization and organization of actin filaments Chanut Delalande et al 2006 More unexpectedly Svb controls the expression of cuticle proteins Andrew and Baker 2008 and enzymes that increase trichome pigmentation and hardness Chanut Delalande et al 2006 Furthermore Svb directly contro
257. terning of a cellular field are now relatively well understood in different systems how cell fate becomes translated into cell shape control remains largely unknown Genetic analysis of epidermal differentiation in Drosophila has made this process a paradigm for our attempts to understand the subsequent steps of morphogenesis in animals During early embrvogenesis cascades of transcrip tion factors progressively refine the different cellular territories and define their respective identity 1 Signaling pathways then act to establish boundaries between adjacent cell fields reviewed in 2 3 and participate in the regulation of the size of these territories through the control of cell survival 4 Finally when the epidermis is composed of a monolayer of post mitotic cells signaling pathways specify cell fates ultimately determining morphological differentia tion 1 2 5 Epidermal cells in a given embryonic segment display a stereotyped pattern of two distinct morphological fates cells with a smooth apical surface which generate naked cuticle and cells producing actin rich cytoplasmic exten sions which eventually become the mature larval micro trichiae or trichomes generally called denticles ventral and hairs dorsal In the ventral region of the abdomen each segment possesses Six to seven rows ul pigmented denticles which are involved in locomotion Activation ol the Wingless Wg pathway determines the naked fate w
258. ters de motif Ovo Svb Dans la lign e germinale la prot ine Ovo semble donc privil gier l utilisation des CRMs compos s par un clustering homotypique de sites de liaison comme cela avait t tabli pour otu et ovo Lu and Oliver 2001 De nombreux points voqu s dans cette section restent confirmer ou m me enti rement tester de mani re exp rimentale n anmoins nos r sultats montrent que le choix des CRM reconnus par un facteur de transcription dans un tissu d pend d au moins trois param tres Un param tre intrins que au facteur de transcription sa stabilit d interaction avec son motif reconnu sur l ADN Un param tre d pendant du contexte chromatinien au sens large structure de la chromatine pr sence de co facteurs etc Et enfin un param tre particulier aux CRMs bas sur le regroupement homotypique de sites dans un cas Ovo et h t rotypique dans l autre Svb 3 Analyse in vivo des fonctions et de la r gulation des prot ines ZPD Les prot ines ZPD malgr leur importance en sant humaine maladies g n tiques surdit cancer et pour la zootechnie production d hybrides vaccins contraceptifs restent globalement mal comprises dans leurs fonctions et leurs m canismes de r gulation pour revue Jovine et al 2005 Les prot ines ZPD sont g n ralement sp cifiques des stades de diff renciation terminale pour lesquels nous ne disposons pas de mod les de cellules en culture adapt s L
259. ticule Dans les deux mutants syx A observ s la localisation de M est identique a celle observ e dans des embryons sauvages d montrant que la Syx1A n est pas impliqu e dans sa localisation correcte Dyl se localise la pointe de la denticule des cellules sauvages Dans les mutants syx A la prot ine Dyl est toujours correctement adress e et localis e Tyn est localis e la base de la denticule tout autour des faisceaux de F actine et nous n observons pas de d fauts de cette localisation en absence de Syx1A indiquant que Syx1A ne semble pas jouer un r le crucial dans l adressage de ces prot ines ZPD tre due au moins en partie leur adressage sp cifique via la machinerie de trafic intracellulaire Au cours de leur maturation les prot ines ZP2 et ZP3 sont incorpor es dans des v sicules de s cr tion o elles vont tre assembl es Ces v sicules vont ensuite fusionner avec la membrane de l oocyte pour y d poser les h t rom res de ZP en surface Wassarman et al 2004 Nos analyses pr liminaires en MET suggerent en effet que les prot ines M HRP et Tyn HRP ne suivent pas les m mes voies de s cr tion M HRP est retrouv e dans de petites v sicules qui cheminent dans le cytoplasme l int rieur de la denticule sugg rant que M est directement dirig e dans sa r gion d accumulation Dans le cas de Tyn on retrouve des v sicules fusionn es la base des denticules dans une quantit moindre que pour M mais surtout
260. ties Monne et al 2008 We generated transgenic lines encoding an Y117C mutated MSC Miniature protein Fig 3B and found that M was unable to rescue even partially the phenotypes resulting from absence of M Fig 3C Furthermore increasing levels of in a wild type background progressively leads to dominant epidermal cell shape defects in both embryos and adults Fig 3C Taken together these data establish that despite a varying degree of conservation the different ZPD proteins co expressed in denticle cells fulfill separate genetic functions Functional specification of Miniature versus Trynity during evolution has relied on the divergence of multiple protein regions including the addition of PAN domains modification of the ZP domain itself and other sequences Finally a mutation shown in vitro to affect 74 polymerization properties of the ZP domain leads to a dominant behavior in vivo further suggesting that function of epidermal ZPD proteins in Drosophila involves homo and or heterotypic interactions ZPD proteins locally organize the contacts between the apical membrane and ECM Having shown that several ZPD proteins play non redundant roles in denticle formation we then explored their cellular functions during the remodeling of epidermal cell shape As a first step we analyzed the sub cellular distribution of ZPD proteins during denticle formation using non cross reacting antibodies raised against M
261. tine en bleu DISCUSSION Nos r sultats montrent que la prot ine M est capable d agir a distance des cellules qui l expriment effet cellulaire non autonome dans l piderme embryonnaire et aussi dans l pith lium de ale adulte De plus nos exp riences montrent clairement que la prot ine M peut diffuser vers les cellules adjacentes celles qui la produisent et se localiser sp cifiquement dans les extensions apicales Ces r sultats inattendus semblent difficiles r concilier avec ceux montrant que l ancrage la membrane de M est requis pour sa fonction L analyse ultrastructurale montre en effet que M est n cessaire au maintien du contact entre la membrane et la cuticule dans l piderme embryonnaire Chanut Delalande et al 2006 et possiblement aussi dans les ailes adultes Roch et al 2003 Comment une prot ine n cessaire au lien entre la membrane et la cuticule peut elle agir distance L une des caract ristiques de la famille des prot ines ZPD est la pr sence d un site potentiel de clivage aux Furines volutivement conserv mais dont le r le reste lucider Zhao et al 2002 Pour tudier l importance de l ancrage de M nous avons g n r une prot ine uniquement diffusible GFP MAC ter tronqu e du domaine transmembranaire DTM et la partie intra cytoplasmique Nous montrons que cette prot ine extracellulaire ne remplit que partiellement les fonctions de M sugg rant que l ancrage de la prot
262. tion des filaments la marge A P des cellules Price et al 2006 Le r seau d actine continue de se rassembler en quelques foci apicaux par cellule figure 14 qui vont croitre perpendiculairement la surface apicale Dickinson and Thatcher 1997 Price et al 2006 Ces extensions cellulaires atteignent leur taille maximale en fin de fermeture dorsale et dans l piderme ventral la formation des denticules s tale sur environ deux heures figure 14 Au stade 16 l piderme pr sente ainsi un patron de cellules formant des extensions cytoplasmiques apicales qui pr figure parfaitement celui des trichomes Dans chaque rang e cellulaire en fonction de sa position A P et D V les extensions pr sentent une polarit un nombre par cellule et une forme g n rale tr s sp cifique Toutes les extensions des cellules denticules sont ancr es dans la r gion la plus post rieure de la face apicale de la cellule et pointent post rieurement durant les tapes pr coces de leur formation Elles adopteront plus tard leur orientation d finitive avec les rang es 2 3 et 5 qui pointent vers le post rieur alors que les rang es 1 et 4 pointent vers l ant rieur En fin d embryogen se une fois la cuticule s cr t e et assembl e les micro filaments se d sassemblent et ou d polym risent La forme particuli re de chaque denticule apparait donc r sulter du moulage de la cuticule sur la membrane apicale maintenue par une structure d acti
263. to control epidermis differentiation Nature 400 271 5 Pielage J Stork T Bunse I and Klambt C 2003 The Drosophila cell survival gene discs lost encodes a cytoplasmic Codanin 1 like protein not a homolog of tight junction PDZ protein Patj Dev Cell 5 841 51 Pollard T D and Borisy G G 2003 Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments Cell 112 453 65 Price M H Roberts D M McCartney B M Jezuit E and Peifer M 2006 Cytoskeletal dynamics and cell signaling during planar polarity establishment in the Drosophila embryonic denticle J Cell Sci 119 403 15 Prout M Damania Z Soong J Fristrom D and Fristrom J W 1997 Autosomal mutations affecting adhesion between wing surfaces in Drosophila melanogaster Genetics 146 275 85 R Ren N He B Stone D Kirakodu S and Adler P N 2006 The shavenoid gene of Drosophila encodes a novel actin cytoskeleton interacting protein that promotes wing hair morphogenesis Genetics 172 1643 53 Ren N Zhu C Lee H and Adler P N 2005 Gene expression during Drosophila wing morphogenesis and differentiation Genetics 171 625 38 Roch F Alonso C R and Akam M 2003 Drosophila miniature and dusky encode ZP proteins required for cytoskeletal reorganisation during wing morphogenesis J Cell Sci 116 1199 207 S Salles C Mevel Ninio M Vincent A and Payre F 2002 A germline specific splicing g
264. ts The additional inactivation of zye had a further effect leading to denticles with a twisted appearance Fig 2A The phenotype resulting from the cumulated inactivation of m tyn and zye therefore suggests additive defects The simultaneous inactivation of neo mey and nyo caused defects similar to individual mutations suggesting that these proteins probably act together during denticle formation These data establish that denticle formation relies on the coordinated action of seven genes encoding 4PD proteins Furthermore the phenotypical diversity observed between mutants suggests that these proteins are involved in separate functions The functional specificity of ZPD proteins relies on multiple protein regions To further test the functional separation of epidermal ZPD proteins we devised an in vivo rescue assay based on Gal4 UAS system that provides comparable temporal and quantitative expression of tested products We focused on M and Tyn representative 72 members of the two main sub classes of ZPD in Drosophila ie proteins with only a ZPD and those containing both ZPD and PAN extracellular motifs Fig 1A Re expression of M under these conditions was sufficient to rescue the denticle defects observed in m mutant embryos Fig 2B It also rescued the strong reduction in size of adult wings the phenotype at the origin of the name miniature Morgan and Bridges 1916 In addition to denticle defects in embryos the absence o
265. ttern of candidares by situ hybridization and determined whether their expression depended upon sub activity by comparing their expression between wild type and seb mutant embryos Each candidate showing a strong reduction of its epidermal expression in sh mutants was further validated through the analysis of consequences both of seh cctopic expression fag tach and of the inhibition of seb activity in a subset of denticle cells The dillerent columns refer to the name of candidates their synonym their respective FIvhase identifier hop fy base bic indiana edul their putative function a summary of their embryonic expression at the time of epidermal differentiation and their dependence on sib activity Kelerences 1 Martinez Arias A 1993 Development and patterning of the larval epidermis of fosa In Date M Martiner Arias A editors The development of Drosophila melancgaster Cold Spring Harbor New York Cold Spring Harbor Laboratory Press pp 317 608 Haini V DiNardo 2001 Divide and conquer Pattern formation in Dratophila embryonic epidermis Trends Genet 17 574 474 3 Sanson B 2001 Generating patterns from bel of cells Examples from Drosophila segmentation EMBO Rep 2 1083 1088 l Urban 5 Brown C Freeman M 2004 EGF receptor signalling protects amoatb cuticle cells from apoptosis during ventral epidermis development Development 151 18355 1845 Payre E 2004 Genetic control of epidermi
266. ucing denticles of smaller area that display an abnormal shape lacking the median constriction characteristic of wild type denticles See Table 52 for quantification of these defects DOK 10 137 1 journal_pbie 0040290 g003 Le PLoS Biology www plosbiology ora 0005 September 2006 Volume 4 Issue 9 e290 39 demonstrate that sub directly impinges or epidermal cell morphogenesis through the direct control of m Mutations Altering Denticles Allow the Identification of Additional svb Targets The inactivation of m is nor sufficient to mimic the sub phenotype indicating that svt must regulate additional targets to achieve denticle formation Mutations known so far to prevent denticle formation affect either sub or upstream regulators therefore suggesting that inactivation of a given sub downstream target produces denticle malfor mation rather than prevents denticle formation To test this hypothesis we searched extensively for genes affecting denticle morphology Table 51 and examined whether they are regulated by sol A dozen genes reported to affect denticle formation lead when inactivated to general cuticle defects which are not however specific to trichomes Table ST and references therein These genes e g the Halloween family that encodes members of the ecdysteroid pathway are either not x pressed in the epidermis e g are restricted to the ring gland or display ubiquitous expression in
267. ul motif de fixation Ovo svb figure 16 Nous avons montr que cette r gion 54 Scale E chrX 7815000 7820000 7825000 7830000 svb positives posi CRM Epidsn es svb neqgatives negati ch I i EE ove motis ave Motifs OMitst motit OMM Matifs 5 ventral lat ral dorsal Epidsn1 Figure 17 Sch ma de l organisation g nomique du g ne sn et expression du CRM Epidsni Le rectangle vert correspond la s quence r gulatrice minimale Epidsnl 600pb capable de conduire l expression du transgene lac z l identique du g ne sn endog ne Vues ventrales lat rales et dorsales d embryons au stade 16 apr s immuocoloration anti lacZ Le CRM Epidsn reproduit l expression du g ne sn dans les cellules trichomes et son activit est sous la d pendance de Svb dirige une expression pidermique sp cifique des cellules a trichomes et dont l activit est sous la d pendance de Svb Chanut Delalande et al 2006 En effet l introduction de deux substitutions nucl otidiques dans ce motif emp che la fixation de Svb in vitro et inactive les propri t s transcriptionnelles de cet l ment in vivo Ces r sultats d montrent donc que les isoformes prot iques qui contiennent le m me domaine de reconnaissance l ADN Ovo dans la lign e germinale et Svb dans l piderme r gulent l expression de leurs g nes cibles respectifs en se fixant des motifs partageant des s quences i
268. ulaires de M communes ces deux processus de morphogen se M n est pas la seule prot ine ZPD impliqu e dans la diff rentiation des cellules de l aile Comme pour m des mutations de dusky dy ont t identifi es il y a fort longtemps cause des d fauts qu elles produisent sur la morphologie des ailes adultes m a t 1sol en 1910 par T H Morgan et dy en 1916 par C Ponts Le gene dy est le voisin direct du g ne m et une petite d ficience Df MR qui enl ve les deux g nes provoque une r duction importante de la taille de l aile DiBartolomeis et al 2002 Les mutants ponctuels ou m ont des ph notypes semblables avec une r duction moins prononc e de la taille de l aile que celle observ e dans la d ficience Df MR Dobzhansky 1929 piopio pio et dumpy dp ont t identifi s au cours d un crible la recherche de mutations affectant l adh rence entre les deux feuillets pith liaux de l aile Prout et al 1997 Walsh and Brown 1998 un ph notype bien connu pour l inactivation des int grines Il existe diff rents all les mutants de dp class s selon qu ils causent l obliquit des ailes 0 la l talit 1 ou des irr gularit s hypodermiques du thorax appel es vortices v Carlson 1959 Les mutants dr pr sentent des ailes dont l extr mit distale n est plus arrondie mais oblique montrant que ce g ne est n cessaire la 126 formation correcte de Tale Un troisi me g ne ZPD i
269. ulation par un m me facteur d un ensemble de g nes au cours d un processus de diff renciation terminale Svb r gule via sa fixation directe sur un site consensus Ovo Svb l expression de trois g nes ZPD m tyn et dyl De plus nous avons identifi des CRM actifs pour deux autres g nes ZPD nyo et cyr L absence d expression dirig e par ces deux CRMs dans un contexte mutant pour svb montre la d pendance fonctionnelle de ces s quences Svb Il sera int ressant de muter les sites Ovo pour ces deux derniers CRMs afin de tester si ces deux genes sont eux aussi des cibles directes de Svb Il reste encore identifier les CRMs dirigeant l expression pidermique des g nes mye et neo Le seul CRM pr dit pour neo ne montre aucune activit et nous n avons pas obtenu pour l heure de pr dictions de CRM pour le g ne mye Malgr des limites videntes ces analyses bioinformatiques ont donc significativement am lior la pr diction des s quences r gulatrices fonctionnelles in vivo Les CRMs identifi s pour les g nes dyl et sont contenus chacun dans une r gion de Ikb et comprennent deux sous r gions dans lesquelles sont concentr s tous les motifs d tect s figures 18 et 19 Il reste tester les effets de l inactivation individuelle de chaque site Ovo Svb sur l activit r gulatrice des deux CRMs ainsi qu identifier le fragment minimum portant l activit Il deviendra alors possible de mener une approche syst matique par
270. up d images en contraste de phase j en ai vu des pr parations de cuticule oh oui Bref aujourd hui ca me semble peu stimulant mais d j ces premi res acquisitions m ont donn le go t de faire de belles images A la fin de ma premi re de th se j ai eu l opportunit de partir B le dans le laboratoire de Markus Affolter pour b n ficier d une formation en microscopie lectronique EM Alors merci Markus de m avoir accueilli pendant deux mois dans ton labo de m avoir permis d acc der un service de tr s haute qualit et de m avoir permis de rencontrer Ursula et Marcel qui tout deux m ont t d une grande aide dans l avanc e de mon projet de caract risation ph notypique et hop une premier gros mot Une autre chose pour laquelle je tenais absolument remercier Markus c est de m avoir pr sent Paul Wassarman Oui lorsque j ai racont ma rencontre la plupart de mes amis ils m ont prise pour une hyst rique mais quand m me c est quelque chose de rencontrer au hasard d un couloir l homme qui d couvert les prot ines domaine Zona Pellucida et qui depuis 30 ans d j d coupe ces prot ines pour comprendre comment elles fonctionnent C est d abord surprenant puis intimidant surtout quand Markus m annonce que je peux d jeuner avec lui et lui parler de mon projet Moi petite tudiante en 1 ann e de th se Non j y crois pas Et puis si c est vrai Alors merci Mr Wassarman enfin Paul d avoir accep
271. ut 1 a Caenorhabditis elegans gene coding for a dauer specific noncollagenous component of the cuticle Dev Biol 146 519 30 Sucena E Delon I Jones I Payre F and Stern D L 2003 Regulatory evolution of shavenbaby ovo underlies multiple cases of morphological parallelism Nature 424 935 8 Sucena E and Stern D L 2000 Divergence of larval morphology between Drosophila sechellia and its sibling species caused by cis regulatory evolution of ovo shaven baby Proc Natl Acad Sci U S A 97 4530 4 Sugiyama S and Jackle H 1993 Genes involved in segmentation Tanpakushitsu Kakusan Koso 38 2492 504 T Takito J and Al Awgati Q 2004 Conversion of ES cells to columnar epithelia by hensin and to squamous epithelia by laminin J Cell Biol 166 1093 102 Tanentzapf G and Tepass U 2003 Interactions between the crumbs lethal giant larvae and bazooka pathways in epithelial polarization Nat Cell Biol 5 46 52 Tepass U Gruszynski DeFeo E Haag T A Omatyar L Torok T and Hartenstein V 1996 shotgun encodes Drosophila E cadherin and is preferentially required during cell rearrangement in the neurectoderm and other morphogenetically active epithelia Genes Dev 10 672 85 Tepass U Tanentzapf G Ward R and Fehon R 2001 Epithelial cell polarity and cell junctions in Drosophila Annu Rev Genet 35 747 84 Turner F R and Mahowald A P 1976 Scanning electron microscopy of Drosophila em
272. ute of Genetics NIG Fly Hy stock centers and Developmental Studies Hybridoma Bank DSHB for providing us with fly stocks and antibodies We very much thank M Affolter in w Insee Lala part al thus work wis done anal Mathys aul Ursula Sauder Zentrum Mikroskopie der Universit t Basel for the skilful electron microscopy pictures Author contributions HCD FP and SP conceived and designed the experiments HCD IF FP and SP performed the experiments HOD IF FP and SP analyzed the cata FR and FP contributed reagenisimzarerialstnalvsis tools HCD and SP wrote the paper Funding l his work was supported by grants from the Association pour la Recherche contre le Cancer 5832 and Fondation pour la Recherche M dicale programme quipe 2005 HCD was supported by a fellowship from the Ligue Nationale Contre le Cancer Competing interests The authors have declared that no competing interesis exist Noondermeer Johnston F Kijsewijk E Musse K Lawrence PA TAR The consequences o ubiquitous expression ol the wingless gene im the Drosophila embryo Development 116 711 719 Sous D Freeman M Biene M 1997 Antagenis n between EGER amd Wingless signalling in the larval cuticle of Drosophila Development 124 3300 37 19 Wielleue EL McCinnis W TER Hox genes differentially regulate Serrate to generate segment specific structures Development 126 1985 1005 aj Alexandre Lecourois M Vincem 1000 Wingless a
273. utilisation in vivo d un site de liaison donn Nous nous sommes alors int ress s aux autres motifs significativement enrichis dans les genes cibles de Svb En plus du site Ovo Svb nous retrouvons des motifs correspondants au site de fixation du facteur de transcription Grainy Head Grh qui joue un r le important dans la diff renciation pidermique Mace et al 2005 Narasimha et al 2008 Cependant ce mod le OG s avere peu discriminant pour la pr diction des CRM D autre part l inactivation de grh ne modifie pas l expression des genes cibles de Svb ou de leurs CRM dans les cellules trichomes Nous avons alors recherch par des m thodes statistiques l existence de motifs nucl otidiques sp cifiques de ces r gions fonctionnelles en comparant les r gions transcriptionnellement actives a celles restant inactives Cette analyse propose une signature des CRM actifs compos e par la pr sence simultan e d un site Ovo Svb d un motif correspondant au site de fixation du facteur de transcription c Myb et d un motif nucl otidique orphelin mod le OMM De plus l analyse des d l tions syst matiques d un 138 CRM de m montre une bonne correspondance entre ces motifs pr dits et l influence fonctionnelle de leur d l tion communication personnelle Serge Plaza La recherche d un facteur ventuellement associ au motif orphelin repr sente un challenge exp rimental qui pourra tre entrepris ult rieurement N
274. uts de la cuticule des cellules pith liales figure 39G Des bourrelets cuticulaires ectopiques soulignent le pourtour des cellules comme observ dans les mutants figure 9 Toutefois le p rimetre tr s irr gulier des cellules sugg re que M Tecta n emp che pas l augmentation de leur surface apicale au cours de leur morphogen se ou en tout cas un stade plus tardif qu en absence de fonction De mani re int ressante le ph notype r sultant de l expression de M tecta d pend du rapport de son niveau d expression vis vis de celui de la prot ine endog ne sugg rant que cette prot ine mutante Y 133C entre en comp tition avec le produit endog ne L analyse structurale du domaine ZP N Y111C montre qu un pont disulfure suppl mentaire est form entre la C111 et la C139 Monne et al 2008 Il est donc possible que la prot ine M Tecta pr sente aussi des d fauts de conformation g nant l interaction de ce domaine avec d autres prot ines de la matrice incluant peut tre la forme normale de la prot ine M 134 A C Gel A E AU iw Figure 38 Localisation cellulaire de la prot ine M dans les ailes pupales Image en microscopie confocale d une section d aile pupale entre 40 et 60 heures APF Les transgenes sont dirig s par enG4 limitant leur expression au domaine post rieur droite du trait en pointill blanc A Coloration de la F actine par la phalloidine rhodamine A7
275. varying degrees of sequence conservation these ZPD proteins exert specific and non redundant functions in the remodeling of epidermal cell shape Each one accumulates in a restricted sub region of the apical compartment where it organizes local interactions between the membrane and the extracellular matrix In addition ZPD proteins are required to sculpture the actin rich cell extensions and maintain appropriate organization of the apical compartment These results on ZPD proteins therefore reveal a functional sub compartmentalization of the apical membrane and its role in the polarized control of epithelial cell shape during development 66 Introduction Recent studies have demonstrated the importance of variations in the apical area of epithelial cells for the morphogenesis of different tissues Lecuit and Lenne 2007 However the mechanisms by which terminal differentiation produces highly ordered Threedimensional structures within the apical compartment remains poorly understood In many cases specific membrane extensions are required for the function of epithelial cells and human diseases such as deafness or retinal disorders are linked to improper morphological differentiation of corresponding cells Deciphering the dynamic networks that remodel the shape of epithelial cells is thus a prerequisite to understanding normal morphogenesis of animal cells as well as various pathological states A primary step for the localized remodeling
276. vec un clivage de la prot ine figure 38C Les r sultats de cette premi re tude semblent encourageants et sugg rent que l pith lium alaire est bien adapt l analyse fonctionnelle des prot ines ZPD Si nous montrons une diffusion de la prot ine M l existence d un clivage reste encore tre tablie Les outils que nous avons g n r s devraient permettre de r pondre sans ambiguit cette question Nous esp rons ainsi terme contribuer mieux comprendre les fonctions g n rales et ou sp cifiques des prot ines ZPDs pour la morphogen se 131 Figure 36 Localisation de la prot ine GFP M mCherry permettant de visualiser les parties N terminale et C terminale de la prot ine M A Sch ma de la prot ine o la GFP a t ins r e en N erminal entre le PS et le domaine ZP et la mCherry en C terminal apr s le DTM L expression du transg ne est dirig e par enG4 Image en microscopie confocale du segment A3 B Localisation de la partie C ter de M gr ce la mCherry La prot ine se localise dans le cytoplasme en rang e et de mani re punctiforme dans les premi re rang es de denticules 1 3 La mCherry est aussi visible dans les denticules des rang es suivantes 4a 5 C Localisation de la partie N ter grace la GFP La prot ine se localise dans le cytoplasme en rang e et sur les denticules des trois premi res rang es D Superposition des 1mages B et C plus coloration de la F ac
277. ventral est d fini par la formation du gradient d un facteur de transcription le produit du g ne dorsal Initialement la prot ine Dorsal est distribu e uniform ment dans le cytoplasme des cellules embryonnaires L tape critique de la distribution de ce facteur est sa translocation dans le noyau En r ponse un signal d pos au cours de l ovogen se et ce seulement dans la r gion ventrale la prot ine Dorsal est lib r e de l interaction physique qui la maintenait dans le cytoplasme Hashimoto et al 1988 Elle peut alors migrer dans les noyaux formant ainsi un gradient de concentration nucl aire selon l axe ventro dorsal figure 2D Leptin 1995 Ce gradient va activer diff rentiellement les g nes r gulateurs qui sp cifient les limites des trois feuillets embryonnaires A haute concentration Dorsal active l expression des genes twist twi et snail sna alors que les faibles concentrations suffisent r primer les genes zerkniillt zen et decapentaplegic dpp Morisato and Anderson 1995 zen sna et twi codent des facteurs de transcription tandis que dpp code un signal cellulaire 12 Figure 4 Repr sentation sch matique des mouvements morphog n tiques et de la formation de l piderne Vues lat rales et ouvertes montrant les destins des diff rents tissus pr somptifs au cours de la gastrulation Au d but de la gastrulation le m soderme ventral en rose s invagine dans l embryon pour former un tu
278. xtension to the base of the apical compartment first Dyl then M and more basally Zye and Tyn accumulated All together these data therefore show that each ZPD protein is targeted to a specific apical region revealing successive sub domains within the apical compartment of denticle cells ZPD proteins impinge on the apical organization of epithelial cells To pursue the question of how ZPD proteins participate in the remodeling of the apical region we undertook ultrastructural analyses of the organization of the membrane aECM compartment The apical surface of smooth cells organizes actin rich microvilli Locke 2001 or undulae Moussian et al 2007 which contact the cuticle only at their tips In contrast there is a continuous tight interaction between the plasma membrane and cuticle in denticles of wild type embryos Fig Lack of m disturbed this stereotyped organization with impaired contacts between the denticle membrane and cuticle layers Fig 5b b The absence of Dyl caused more severe defects although again restricted to the denticle The denticle cuticle appeared as a hollow structure with the cell membrane lying at the bottom of the extension Fig 5c c Since we did not detect abnormalities in the formation of actin bundles at earlier stages Fig 54 this suggests that Dyl is required to anchor the cell membrane to the tip of the denticles Lack of Zye also resulted in apparent abnormal gaps between the membr

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