Emmanuel Collec
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1. Saitoh H et al 2002 Perturbation of SUMOlation enzyme Ubc9 by distinct domain within nucleoporin RanBP2 Nup358 J Biol Chem 277 7 4755 63 Sanger F 1981 Determination of nucl otide sequences in DNA Science 214 1205 1210 Seeler J S et al 2001 Common properties of nuclear body protein SP100 and TIFlalpha chromatin factor role of SUMO modification Mol Cell Biol 21 10 3314 24 Seufert W et al 1995 Role of a ubiquitin conjugating enzyme in degradation of S and M phase cyclins Nature 373 6509 78 81 Southcott M J et al 1999 The expression of human blood group antigens during erythropoiesis in a cell culture system Blood 93 12 4425 35 sT Timpl R 2000 Structure and function of lamini LG modules Matrix Biol Aout 19 4 309 17 Tong H et al 1997 Crystal structure of murine human Ubc9 provides insight into the variability of the ubiquitin conjugating system J Biol Chem 272 34 21381 7 Tsytsykova A V et al 1998 The mouse genome contains two expressed intronless retroposed pseudogenes for the sentrin sumo 1 PIC1 conjugating enzyme Ubc9 Mol Immunol 35 16 1057 67 EPHE Banque de Monographies SVT 18 U Udani M et al 1998 Basal cell adhesion molecule lutheran protein The receptor critical for sickle cell adhesion to laminin J Clin Invest 101 11 2550 8 UK L 1970 cleavage of structural prot ins during the assembly of the head of2. EPHE Banque de Monographies SVT 6 premi re fois un anticorps anti Lu r agissant avec 8 d chantillons de sang de donneurs dans le s rum d un sujet polytransfus Callender et al 1945 L anticorps antith tique anti Lu gt pr sent chez 99 de la population fut d couvert en 1956 Cutbush and Chanarin 1956 Les antig nes Lu et Lu d finissent quatre ph notypes dans la population caucasienne Lu a b Lu a b Lu a b et Lu a b de fr quence respective 0 15 7 5 et 92 35 tr s rare Les globules rouges de ph notype Lu a b Lu null sont d pourvus de tous les antig nes du syst me Luth ran leur surface Selon le mode de transmission du ph notype Lu a b on distingue trois ph notypes le ph notype autosomal dominant d la pr sence du g ne suppresseur n Lu pour Inhibiteur de Luth ran inhibant aussi l expression d autres antig nes de groupes sanguins tels que P1 i AnWj In Mer2 Rao and Telen 1994 C est le ph notype le plus courant le ph notype autosomal r cessif li au chromosome X d a l h mizygotie d un all le suppresseur nomm XS2 X suppressor Mulley Norman et al 1988 qui att nue l expression de certains antig nes comme Lu les rendant ind tectables par les techniques classiques d agglutination et de cytom trie en flux mais sans affecter ceux qui sont r gul s par n Lu Ce ph notype est exceptionnel le ph notype autosomal
3. influence des prot ines d adh rence sur le milieu intracellulaire est assur e soit par leur liaison au cytosquelette soit par leur capacit a produire des messagers intracellulaires D autre part des signaux d activation intracellulaires modifient l affinit des mol cules d adh rence pour leur ligands extracellulaires Un signal activateur provenant de l int rieur de la cellule peut entra ner un r arrangement de sa structure et ainsi amplifier son affinit pour son ligand On parle de signalisation Inside Out Geissmann F 2003 Au cours de ces dix derni res ann es il a t montr que les mol cules d adh rence sont impliqu es dans de multiples processus de transduction de signal Juliano 2002 Les quatre principales familles des mol cules d adh rence sont les cadh rines la superfamille des immunoglobulines les int grines les s lectines C 4 1 Les mol cules d adh rence dans les rythrocytes Les mol cules d adh rence pr sentes la surface des rythrocytes regroupent les antig nes Scianna SC et Radin rd port s par la prot ine ERMAP LW port s par la prot ine ICAM 4 Indian IN port s par le CD44 r cepteur de l acide hyaluronique Lu port s par les gps Lu Ok port s par la prot ine CD147 La plupart de ces prot ines appartienne a la superfamille des immunoglobulines poss de un ou plusieurs domaines g like et est responsable des interactions cellu
4. 596 S598 et S621 Ces sites de phosphorylations pourraient moduler l affinit des gps pour leur ligand extracellulaire Vinteraction avec le cytosquelette et tre impliqu s dans des processus de signalisation intracellulaire C 3 Distribution tissulaire des gps Lu B CAM Dans les tissus les gps Lu B CAM sont exprim es a la surface des cellules rythroides matures et sont galement exprim es dans les cellules endoth liales des vaisseaux capillaires et les cellules pith liales de nombreux tissus Garin Chesa et al 1994 Parsons et al 1995 Moulson Li et al 2001 Les antig nes Lu B CAM apparaissent un stade tardif de l rythropoi se juste avant le processus d nucl ation du r ticulocyte Bony et al 1999 Southcott et al 1999 Daniels and Green 2000 Leur expression est r gul e dans le foie avec un fort niveau d expression dans les cellules pith liales h patiques durant le premier trimestre de d veloppement fcetal Dans le rein l expression de la gp Lu est localis e au p le basal des cellules pith liales adjacentes aux membranes basales contenant la laminine a5 glycoprot ine h t rotrim rique de la matrice extracellulaire constitu e d une cha ne a b et g Moulson et al 2001 En culture la gp Lu est exprim e au p le basolat ral de cellules pith liales polaris es gr ce son motif dileucine La gp Lu v13 d pourvue de ce motif montre au contraire une expression non polaris e
5. Il s agit d un des premiers exemples de transduction de signal dans les globules rouges m di par des mol cules d adh rence Toutefois une voie sp cifique entre l activation de la PKA et la stimulation de l adh sion par les gps Lu reste d montrer Au laboratoire nous avons r cemment montr dans des cellules rythro des et pith liales que l isoforme Lu est phosphoryl e par la PKA r sultats non publi s C 7 Interaction des gps Lu B CAM avec le squelette rythrocytaire L interaction des gps Lu avec le cytosquelette a t d montr par plusieurs techniques La technique de FIMD Fluorescence Imaged Micro Deformation qui permet de r aliser des tudes biophysiques de microd formabilit de globules rouges marqu s par des anticorps ant Lu fluorescents Parsons et al 2001 La technique de cytom trie en flux qui consiste 4 mettre en vidence la liaison des gps Lu B CAM au squelette rythrocytaire l aide d anticorps fluorescents sp cifiques des antig nes membranaires avant et apr s solubilisation de la membrane par le d tergent Triton X100 Gane P et al 2001 La technique de capture de GST GST pull down qui consiste greffer sur de la r sine EPHE Banque de Monographies SVT 12 gluthation l extr mit C terminale de la gp Lu fusionn e la prot ine GST et la mettre en pr sence d un lysat de membrane de globules rouges Kroviarski et al 2004 Le syst me Biacore ou tec
6. bacteriophage T4 Nature 227 680 685 V Vojtek A B et al 1993 Mammalian Ras interacts directly with the serine threonine kinase Raf Cell 74 1 205 14 W Wilson V G and D Rangasamy 2001 Intracellular targeting of proteins by sumoylation Exp Cell Res 271 1 57 65 ake Xu W et al 2000 Regulation of microphthalmia associated transcription factor MITF protein levels by association with the ubiquitin conjugating enzyme hUBC9 Exp Cell Res 255 2 135 43 a Yeh E T et al 2000 Ubiquitin like proteins new wines in new bottles Gene 248 1 2 1 14 Yonemura S et al 1998 Ezrin radixin moesin ERM proteins bind to a positively charged amino acid cluster in the juxta membrane cytoplasmic domain of CD44 CD43 and ICAM 2 J Cell Biol 140 4 885 95 EPHE Banque de Monographies SVT 19
7. carrying blood group antigens Vox Sang 74 Suppl 2 29 64 Cartron J P and Y Colin 2001 Structural and functional diversity of blood group antigens Transfus Clin Biol 8 3 163 99 Cutbush M and I Chanarin 1956 The expected blood group antibody ant Lub Nature 178 855 856 D Daniels G 1988 Lutheran related antibodies Rev Fr Transfus Immunohematol 31 2 447 52 Daniels G 1997 Blood group polymorphisms molecular approach and biological significance Transfus Clin Biol 4 4 383 90 EPHE Banque de Monographies SVT 14 Daniels G and C Green 2000 Expression of red cell surface antigens during erythropoiesis Vox Sang 78 Suppl 2 149 53 Daniels G L et al 2003 International Society of Blood Transfusion Committee on terminology for red cell surface antigens Vancouver Report Vox Sang 84 3 244 7 Desterro J M et al 1999 Identification of the enzyme required for activation of the small ubiquitin like protein SUMO 1 J Biol Chem 274 15 10618 24 Desterro J M et al 1997 Ubch9 conjugates SUMO but not ubiquitin FEBS Lett 417 3 297 300 E Ebina Y et al 1983 LexA protein is a repressor of the colicin El gene J Biol Chem 258 21 13258 61 El Nemer W et al 1999 Isoforms of the Lutheran basal cell adhesion molecule glycoprotein are differentially delivered in polarized epithelial cells Mapping of the basolateral sorting signal to a cytoplasm
8. la laminine C 6 Gps Lu et voies de signalisation C 7 Interaction des gps Lu B CAM avec le squelette rythrocytaire D Objectifs du travail 18 II MAT RIEL ET M THODES 24 A METHODES GENERALES A 1 Biologie mol culaire A 1 2 Amplification par PCR A 1 3 Digestion par des enzymes de restriction A 1 4 D phosphorylation A 1 5 Purification des ADNs A 1 6 Ligation plasmide insert A 1 7 Transformation des bact ries comp tentes DHS a et XL10 A 1 8 Purification des plasmides recombinants A 1 9 Mutag n se dirig e A 1 10 S quen age automatique d ADN A 2 Biochimie A 2 1 Electrophor se des prot ines en gel SDS polyacrylamide A 2 2 Transfert sur membrane de nitrocellulose A 3 Culture cellulaire A 3 1 Les cellules A 3 2 Transfection de cellules adh rentes par la lipofectine A 3 3 Transfection de cellules adh rentes par lectroporation B LE SYSTEME DOUBLE HYBRIDE B 1 Criblage de la Banque B 1 2 Les Mutants B 1 3 La banque compl mentaire de rein humain B 2 Confirmation de la sp cificit des interactions B 2 1 La souche de levure B 2 2 Les milieux de culture B 2 3 Le milieu complet ou YPDA B 2 4 Les milieux s lectifs B 2 5 Cotransformation dans la levure L40 B 3 Test d auxotrophie l histidine EPHE Banque de Monographies SVT Signet non d fini Signet non d fini Signet non d fini Signet non d fini Signet non d fini 11 11 12 12 13 13 14 14 1
9. 5 16 17 17 17 Signet non d fini C VALIDATION DE LA SPECIFICITE DES INTERACTIONS C 1 Le syst me de fusion GST Signet non d fini C 1 2 Expression et purification des prot ines de fusion GST C 1 2 1 Production C 1 2 2 Purification C 2 Le syst me 6x Histidine Signet non d fini C 2 1 Expression et purification d Ubc9 6x His C 2 2 1 Pr paration d Ubc9 C 2 2 2 Sous clonage d Ubc9 dans PQE80 C 2 2 3 Production C 2 2 4 Purification en conditions non d naturantes C 3 Technique de capture GST Signet non d fini C 3 1 Interaction directe entre 6x His Ubc9 et GST Lu D MICROSCOPIE CONFOCALE D 1 Immunofluorescence et microscopie confocale Signet non d fini III RESULTATS 48 A RECHERCHE DES PARTENAIRES DES GPS LU A 1 Classement et identification des clones His LacZ Signet non d fini A 2 Localisation du site d interaction de la prot ine Ubc9 sur la gp Lu Signet non d fini A 2 1 Interaction avec l Ankyrine G A 2 2 Interaction avec Ubc9 A 2 2 Tests b galactosidase en phase liquide A 3 Conclusion Signet non d fini B CONFIRMATION DE LA SPECIFICITE DES INTERACTIONS PAR DES APPROCHES BIOCHIMIQUES IN VITRO ET CELLULAIRE B 1 Capture de GST GST pull down Signet non d fini B 1 1 Productions prot ique des fusions GST B 1 2 Interaction Ubc9 Lu B 2 Co immunopr cipitation gp Lu Ubc9 65 C ANALYSE DE L EXPRESSION DES GPS LU SAUVAGES ET MUTEES EN MICROSCOP
10. 6 EPHE Banque de Monographies SVT 15 Gauer S et al 1997 Adhesion molecules in the glomerular mesangium Kidney Int 51 5 1447 53 Geissmann F 2003 ADHERENCE ET MOBILITE CELLULAIRE COURS 2 Giorgino F et al 2000 The sentrin conjugating enzyme mUbc9 interacts with GLUT4 and GLUT1 glucose transporters and regulates transporter levels in skeletal muscle cells Proc Natl Acad Sci U S A 97 3 1125 30 H Hateboer G et al 1996 mUBC9 a novel adenovirus E1A interacting protein that complements a yeast cell cycle defect J Biol Chem 271 42 25906 11 Hebbel R P 1991 Beyond hemoglobin polymerization the red blood cell membrane and sickle disease pathophysiology Blood 77 214 37 Hillery C A 1998 Potential therapeutic approaches for the treatment of vaso occlusion in sickle cell disease Curr Opin Hematol 5 151 5 Hines P C et al 2003 Novel epinephrine and cyclic AMP mediated activation of B CAM Lu dependent sickle SS RBC adhesion Blood 101 8 3281 7 Huang X 1992 A contig assembly program based on sensitive detection of fragment overlaps Genomics 14 1 18 25 zf Ivanova A V S V Ivanov et al 2001 Regulation of STRA13 by the von Hippel Lindau tumor suppressor protein hypoxia and the UBC9 ubiquitin proteasome degradation pathway J Biol Chem 276 18 15306 15 D L Judson P A et al 1988 Report on group 8 Lutheran antibodies Rev F
11. IE CONFOCALE 70 IV DISCUSSION 75 A La prot ine Ubc9 A 1 La prot ine E2 Ubiquitin Conjugating Enzyme Ubc9 Signet non d fini A 2 Quel r le pour Ubc9 dans l expression membranaire de la gp Lu Signet non d fini V BIBLIOGRAPHIE 80 EPHE Banque de Monographies SVT 4 ABREVIATIONS a a Acide amin ADNc Acide d soxyribonucl ique compl mentaire ARNm Acide ribonucl ique messager Au Auberger B CAM Basal Cell Adhesion Molecule C TER Position C terminale EGF Epithelial Growth Factor gp Glycoprot ine GR Globule rouge GST Glutathion S Transferase Ig like Immunoglobulin like kb Kilobase kDa KiloDalton pb Paires de base PBS Phosphate Buffer Saline LB Milieu de Luria Bertani LL Di leucine Lu Luth ran MDCK Madin Darby Canine Kidney MEC Matrice extracellulaire N TER Position N terminale PCR Polymerase Chain Reaction PKA Prot ine Kinase A RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism SDS Sodium Dodecyl Sulfate SDS PAGE Sodium Dodecyl Sulfate polyacrylamide gel electrophoresis SFIg Superfamille des Immunoglobulines SH3 Src Homology 3 TBS Tris borate EDTA TRIS Tris hydroxym thyl amino m thane Ubc9 Ubiquitin Conjugated Enzyme 9 YPDA Yeast Peptone Dextrose ad nine sulfate I INTRODUCTION A G n ralit s sur les groupes sanguins EPHE Banque de Monographies SVT 5 Les antig nes de groupes sanguins sont des structures polymorphes port es par des prot ines lipides glycolipi
12. MINISTERE DE LA JEUNESSE L EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE Pr sent par EMMANUEL COLLEC Pour l obtention du dipl me de l Ecole Pratique des Hautes Etudes RECHERCHE DES PARTENAIRES CYTOPLASMIQUES DE LA GLYCOPROTEINE LUTHERAN ANALYSE DE L INTERACTION AVEC LA PROTEINE UBC9 Soutenu le 1 F vrier 2005 Devant le jury suivant Dr Andras Paldi Pr sident Dr RENAUD PAITRA Rapporteur Pr Philippe ROUGER Examinateur Pr Caroline LE VAN KIM Examinateur Pr Bernard GRANDCHAMP Examinateur Laboratoire EPHE de G n tique Mol culaire et Physiologique Universit de Versailles Saint Quentin CNRS UPRES A8087 B timent Fermat 45 avenue des Etats Unis 78035 VERSAILLES Cedex Directeur Pr Bernard MIGNOTTE E mail mignotte genetique uvsq fr Institut National de la Transfusion Sanguine Laboratoire de Biochimie et G n tique INSERM U76 6 rue Alexandre Cabanel 75015 PARIS Directeur Dr Jean Pierre CARTRON E mail cartron idf inserm fr ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre RECHERCHE DES PARTENAIRES CYTOPLASMIQUES EPHE Banque de Monographies SVT DE LA GLYCOPROTEINE LUTHERAN ANALYSE DE L INTERACTION AVEC LA PROTEINE UBC9 EMMANUEL COLLEC Le 1 F vrier 2005 RESUME Les antig nes de groupe sanguin Luth ran Lu et l antig ne B CAM Basal cell adhesion molecule sont port s par deux glycoprot
13. a b de type XS2 expression normale de CD44 indique que le CD44 qui est associ l expression des gps Lu B CAM ne participe pas la liaison la laminine Udani et al 1998 Les deux isoformes Lu ont la m me capacit de fixation la laminine El Nemer et al 1998 Zen et al 1999 Les cellules rythroleuc miques murines K562 exprimant les gps Lu recombinantes adh rent la laminine soluble dans des conditions d adh rence dynamiques et statiques El Nemer et al 1998 Udani et al 1998 Parsons et al 2001 Les globules rouges Lu positifs mais pas les Lu yy fixent sp cifiquement la laminine 10 11 aSb1 b2g1 isoforme contenant la cha ne a5 Parsons et al 2001 Il y a un effet totalement inhibiteur de la mol cule soluble Fc Lu sur la fixation de globules rouges sur la laminine conditions d adh rence dynamiques Ces r sultats indiquent que les gps Lu B CAM seraient les r cepteurs uniques de la laminine sur le globule rouge EI Nemer et al 1998 De r centes investigations par des techniques d interactions prot ines prot ines Biacore indiquent que les domaines extracellulaires recombinants de la gp Lu fixent la laminine avec une haute affinit Kp de 10 8nM Southcott et al 1997 La fixation la laminine des pr curseurs rythroides est corr l e l apparition tardive des gps Lu dans l rythropo se EI Nemer et al 1998 L hypoth se a t mise que les gps Lu B CAM pourraient jouer un role
14. ansgenic mice suggests an interaction with laminin alpha5 in vivo Dev Dyn 222 1 101 14 Mudad R and M J Telen 1996 Biologic functions of blood group antigens Curr Opin Hematol 3 6 473 9 Muller S et al 2001 SUMO ubiquitin s mysterious cousin Nat Rev Mol Cell Biol 2 3 202 10 Mulley J C et al 1988 A regional localisation for X linked suppressor gene XS for the Lutheran blood group Hum Genet 78 127 9 Myhre B et al 1975 A further example of the recessive Lu a b phenotype Vox Sang 29 1 66 8 P Palek J and S Lambert 1990 Genetics of the red cell membrane skeleton Semin Hematol 27 4 290 332 Parsons S F et al 2001 Lutheran blood group glycoprotein and its newly characterized mouse homologue specifically bind alphaS chain containing human laminin with high affinity Blood 97 1 312 20 Parsons S F et al 1997 Use of domain deletion mutants to locate Lutheran blood group antigens to each of the five immunoglobulin superfamily domains of the Lutheran glycoprotein elucidation of the molecular basis of the Lu a Lu b and the Au a Au b polymorphisms Blood 89 11 4219 25 Parsons S F et al 1995 The Lutheran blood group glycoprotein another member of the immunoglobulin superfamily is widely expressed in human tissues and is developmentally regulated in human liver Proc Natl Acad Sci U_S A 92 12 5496 500 Parsons S F et al 1987 Evid
15. dans ces cellules EI Nemer et al 1999 C 4 Les gps Lu B CAM mol cules d adh rence Les mol cules d adh rence sont exprim es la surface de nombreuses membranes cellulaires et assurent l adh rence entre deux cellules ou entre une cellule et la matrice extracellulaire membrane basale ou tissu de soutien La s lectivit d une mol cule d adh rence donn e repose sur sa capacit interagir avec un nombre limit de mol cules appel es ligands Les mol cules d adh rence ont trois r les possibles dans la cellule assurer la coh sion d un tissu cette forme d adh rence peut tre appel e structurelle donner une cellule la possibilit d effectuer une fonction biologique d termin e que l on peut appeler fonctionnelle et qui est transitoire et limit e au seul temps d induction du processus biologique La propri t fondamentale des prot ines d adh rence est de mettre en contact le milieu extracellulaire et intracellulaire La reconnaissance d un ligand extracellulaire entraine la production d informations destin es au reste EPHE Banque de Monographies SVT 9 de la cellule et susceptible de modifier la structure ou les fonctions de celle ci Cette propri t des prot ines d adh rence les rapproche plus des syst mes de transduction de signaux qui transforment un 99 signal extracellulaire en un signal intracellulaire dit Outside In compr hensible par la cellule L
16. dans la migration des rythrocytes matures de la moelle osseuse vers le sang p riph rique Parsons et al 1995 Les gps Lu B CAM pourraient aussi avoir un r le dans la migration des prog niteurs du foie foetal vers la moelle osseuse Parsons et al 1995 La dr panocytose est une maladie g n tique dont la base mol culaire est une substitution Glu6Val dans l h moglobine b Cette mutation provoque la polym risation de la d oxyh moglobine S et la formation de longs cristaux qui d forment la membrane rythrocytaire L an mie h molytique chronique et la vaso occlusion sont les deux signes cliniques majeurs de cette maladie pour revues voir Hebbel 1991 et Hillery 1998 Les globules rouges dr panocytaires SS pr sentent une surexpression des antig nes Lu corr l e une liaison augment e la laminine 10 11 ce qui contribuerait leur adh rence renforc e la matrice subendoth liale et aux ph nom nes de vaso EPHE Banque de Monographies SVT 11 occlusion observ s chez les patients dr panocytaires El Nemer et al 1999 C 5 1 Site de fixation aux gps Lu B CAM La cartographie du domaine d interaction des gp Lu et Lu v13 avec la laminine a t effectu e en utilisant des prot ines solubles Fc Lu pr sentant diff rentes combinaisons des cinq domaines Ig like extracellulaires des gp Lu Ce sont des prot ines chim res comprenant le peptide Fc de Vimmunoglobuline 25 kDa qui permet leur lution du
17. des de la membrane des globules rouges dont les d terminants sont de nature glucidique ou prot ique Mudad and Telen 1996 Daniels 1997 Cartron and Colin 2001 La plupart de ces antig nes est aussi exprim e dans de nombreux tissus de l organisme Par exemple des tudes r centes sugg rent que la prot ine Kell qui a longtemps t consid r e comme restreinte aux globules rouges a une large distribution tissulaire notamment dans les organes lymphoides les testicules et le cerveau Russo et al 2000 Camara Clayette Rahuel et al 2001 Cependant certains syst mes sont sp cifiquement rythroides tels que RH MNS LW et ERMAP Les antig nes ABO Hh Lewis Sese sont d finis par des structures glucidiques et sont les produits indirects des g nes de groupes sanguins En effet ils r sultent de l addition de motifs glucidiques sur des prot ines ou des lipides catalys e par des glycosyltransf rases pr sentes dans l appareil de Golgi produits directs de ces g nes Cartron et al 1998 Au contraire les antig nes de nature polypeptidique sont les produits directs des genes La base mol culaire des 29 syst mes de groupes sanguins connus est bien d finie par la Soci t Internationale de la Transfusion Sanguine La bonne connaissance de leurs polymorphismes au niveau de l ADN a permis l laboration de nouvelles m thodes de g notypage par PCR Cartron and Colin 2001 En comparant les informations apport es par les ba
18. ence that the Lub blood group antigen is located on red cell membrane glycoproteins of 85 and 78 kd Transfusion 27 1 61 3 EPHE Banque de Monographies SVT 17 Poukka H et al 1999 Ubc9 interacts with the androgen receptor and activates receptor dependent transcription J Biol Chem 274 27 19441 6 R Rahuel C et al 1996 A unique gene encodes spliceoforms of the B cell adhesion molecule cell surface glycoprotein of epithelial cancer and of the Lutheran blood group glycoprotein Blood 88 5 1865 72 Rao N and M Telen 1994 Lutheran antigens Lutheran regulatory genes and Lutheran regulatory gene targets Blood Cell Biochemistry J P Cartron and P Rouger New York Plenum Press 6 267 297 Rettig W J et al 1988 Cell surface glycoproteins of human sarcomas differential expression in normal and malignant tissues and cultured cells Proc Natl Acad Sci U S A 85 9 3110 4 Rodriguez M S et al 1999 SUMO 1 modification activates the transcriptional response of p53 Embo J 18 22 6455 61 Rodriguez M S et al 2001 SUMO 1 conjugation in vivo requires both a consensus modification motif and nuclear targeting J Biol Chem 276 16 12654 9 Russo D et al 2000 Expression of Kell blood group protein in nonerythroid tissues Blood 96 1 340 6 _S Saiki R K 1985 Primer directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polym rase Science 239 487 491
19. hnique d interaction prot ines prot ines en temps r el qui consiste a d tecter des interactions biosp cifiques entre deux composant L analyse consiste immobiliser l un des deux composants tester le ligand sur une matrice microfluidique et a faire passer l autre composant analyte au contact de cette surface l aide d un flux microfluidique D Objectifs du travail Les gps Lu B CAM ont t bien tudi es au niveau de leur capacit a lier la laminine 10 11 par leurs domaines extracellulaires Mais le r le du domaine cytoplasmique reste encore d finir Nous avons montr que les gps Lu sont li es au squelette rythrocytaire Gane et al 2001 et nous avons montr que cette interaction est m di e par la spectrine Kroviarski et al 2004 Le but de ce travail a t de rechercher d autres partenaires cytoplasmiques des gps Lu pouvant tre impliqu s non seulement dans l interaction avec le cytosquelette mais galement dans la transduction de signal Pour cela et en collaboration avec le Dr MC Lecomte U459 H pital Xavier Bichat nous avons utilis la technique du double hybride dans la levure partir d une banque d ADNc de rein humain Nicolas et al 2002 Lorsque j ai int gr cette th matique le crible tait r alis par un tudiant en fin de these Mon travail a commenc par l isolement et la caract risation des diff rentes prot ines potentiellement partenaires des prot ines Lu don
20. ic di leucine motif J Biol Chem 274 45 31903 8 El Nemer W et al 1998 The Lutheran blood group glycoproteins the erythroid receptors for laminin are adhesion molecules J Biol Chem 273 27 16686 93 El Nemer W et al 2001 Characterization of the laminin binding domains of the Lutheran blood group glycoprotein J Biol Chem 276 26 23757 62 El Nemer W et al 1997 Organization of the human LU gene and molecular basis ofthe Lu a Lu b blood group polymorphism Blood 89 12 4608 16 Engel J et al 1981 Shapes domain organizations and flexibility of laminin and fibronectin two multifunctional proteins of the extracellular matrix J Mol Biol 150 1 97 120 sF Fields S and O Song 1989 A novel genetic system to detect protein protein interactions Nature 340 6230 245 6 Firestein R and N Feuerstein 1998 Association of activating transcription factor 2 ATF2 with the ubiquitin conjugating enzyme hUBC9 Implication of the ubiquitin proteasome pathway in regulation of ATF2 in T cells J Biol Chem 273 10 5892 902 G Gane P C et al 2001 Flow cytometric analysis of the association between blood group related proteins and the detergent insoluble material of K562 cells and erythroid precursors Br J Haematol 113 3 680 8 Garin Chesa P et al 1994 Non polarized expression of basal cell adhesion molecule B CAM in epithelial ovarian cancers Int J Oncol 5 1261 126
21. ine ensuite la structure du g ne LU L exon 1 code le peptide signal les exons 2 12 codent les 5 domaines Immunoglobulin like deux exons par domaine except le domaine 2 qui est cod par les exons 4 6 l exon 13 code la r gion transmembranaire et la r gion cytoplasmique commune aux deux isoformes Lu et les exons 14 et 15 codent les 40 acides amin s sp cifiques de l isoforme la plus longue Parsons et al 1997 C 2 Structure des gps Lu B CAM C 2 1 Les antig nes Lu sont port s par deux gps isoformes Lu et Lu v13 Les antig nes de groupe sanguin Luth ran sont sensibles la digestion par la trypsine et la chymotrypsine Daniels 1988 Judson et al 1988 Les prot ines Lu sont glycosyl es car le traitement a l endoglycosidase F hydrolyse les cha nes N glucidiques au niveau des asparagines fait appara tre une r duction de poids mol culaire apparent 73 et 66 kDa En conditions r ductrices il y a perte de Vantig nicit ce qui sugg re que la pr sence des ponts disulfures est importante pour int grit des antig nes Lu Levene et al 1987 Parsons et al 1987 Daniels 1988 Les antig nes de groupe sanguin Luth ran Lu sont port s par deux glycoprot ines isoformes CD239 Lu et Lu v13 d un poids mol culaire de 85 et 78 kDa Parsons et al 1995 Ces deux gps portent galement l antig ne tumoral nomm B CAM Basal cell adhesion molecule Campbell et al 1994 antig ne surexprim da
22. ines gps isoformes appel es Lu et Lu v13 qui ne diff rent que par la taille de leur domaine cytolasmique Ces prot ines appartiennent la superfamille des immunoglobulines sont exprim es dans les globules rouges dans les cellules pith liales de nombreux tissus et notamment dans le rein dans les cellules endoth liales des vaisseaux capillaires et sont surexprim es dans certaines cellules canc reuses Ces glycoprot ines sont des mol cules d adh rence r cepteurs uniques de la laminine dans les globules rouges Le domaine cytoplasmique de l isoforme la plus longue Lu poss de des sites consensus de phosphorylation et d adressage membranaire Il a de plus t montr que ce domaine est li au squelette rythrocytaire Nous avons recherch des partenaires potentiels du domaine cytoplasmique de la gp Lu par la technique du double hybride dans la levure en criblant une banque d ADNc de rein humain Ce crible a permis d isoler l enzyme Ubc9 Ubiquitin conjugated enzyme 9 Mon travail a consist 1 analyser l interaction avec la gp Lu et cartographier son site de fixation sur la gp Lu ii confirmer cette interaction par des approches biochimiques Dans ce but nous avons utilis les techniques de capture GST GST pulldown in vitro et de coimmunopr cipitation ex vivo Ces exp riences ont t r alis es avec la gp Lu sauvage et ses diff rents mutants Les r sultats ont confirm l existence d une interaction io
23. les cellules et cellules matrice extracellulaire MEC Ces mol cules d adh rence sont pr sentes a la surface des r ticulocytes et des globules rouges matures humains Elles leur permettraient d adh rer a de nombreux ligands incluant la thrombospondine la fibronectine les acides hyaluroniques la laminine et a des cellules endoth liales et des leucocytes C 4 2 Les mol cules d adh rence dans les cellules m sangiales glom rulaires Le d veloppement d finitif du rein implique entre autre la conversion du m senchyme en pith lium Cet pith lium subit une suite de modifications morphologiques qui ont pour r sultat la formation du n phron unit de filtration form e du glom rule et des tubules Les cellules m sangiales sont des cellules pith liales pr sentes dans le glom rule Elle expriment plusieurs mol cules d adh rence de type int grine b1 alb1 a2b1 a3b1 a5b1 a6b1 et a8b1 ainsi que la gp Lu En association avec des cellules endoth liales elles participent au maintien de la configuration en boucle des capillaires du glom rule Gauer 1997 Des exp riences d immunohistochimie chez la souris ont montr que la gp Lu est exprim e en association avec l int grine bl et semblerait avoir un r le fondamental dans le d veloppement embryonnaire et dans la morphogen se du rein Kikkawa et al 2003 L inactivation sp cifique du g ne murin codant la chaine a5 de la laminine entra ne des dommages important
24. milieu de culture apr s transfection et production par les cellules COS 7 Ces tudes ont montr qu il existe peut tre deux sites de fixation la laminine sur les gps Lu Zen et al 1999 ont montr qu un site de fixation se situe sur le domaine Ig like 5 de la gp Lu Notre quipe a ensuite montr que la fixation est m di e par les domaines 1 2 3 de la gp Lu humaine Un r arrangement spatial sp cifique de ces trois domaines est probablement n cessaire pour l interaction avec la laminine El Nemer et al 2001 Parsons et al 2001 C 5 2 Site de fixation au niveau de la laminine La chaine a de la laminine poss de au niveau de son domaine C terminal un large domaine globulaire G constitu de cinq modules de type LG arrang s en tandem LG1 LGS qui contiennent des sites de fixation pour les int grines b1 et l h parine Timp 2000 Le site de fixation de la gp Lu sur la laminine a5 in vivo se situe dans le module a5 LG3 Kikkawa et al 2002 C 6 Gps Lu et voies de signalisation Un article r cent du groupe de M Telen fait tat du r le activateur de la voie AMP cyclique d pendante de la Prot ine Kinase A PKA dans l adh rence renforc e des globules rouges dr panocytaires la laminine via les gps Lu Hines et al 2003 La stimulation de l adh sion par lAMPc et la PKA tait inattendue car la PKA tait largement d crite comme r gulateur n gatif de l adh sion dans de nombreux types cellulaire
25. nique entre Ubc9 et la gp Lu Nous avons ensuite d termin l effet de cette interaction pour pr ciser la localisation subcellulaire de la gp Lu Par microscopie confocale on observe une localisation de la gp Lu majoritairement basolat rale dans les cellules MDCK polaris es Par contre le mutant Lu incapable de fixer Ubc9 pr sente une localisation diffuse au niveau apical et basal Il semble donc que la prot ine Ubc9 soit impliqu e dans le transport cellulaire et l encrage membranaire de la gp Lu MOTS CLES Glycoprot ine Lu B CAM mol cule d adh rence r cepteur de la laminine Ubc9 interaction ionique localisation cellulaire ABREVIATIONS I INTRODUCTION 1 A G n ralit s sur les groupes sanguins 9 B Le syst me de groupe sanguin Luth ran 10 B 1 Le polymorphisme Lu LuP 10 EPHE Banque de Monographies SVT 2 B 2 Structure du g ne LU humain C Les Glycoprot ines Luth ran gps lu 11 C 1 Clonage des gps Lu B CAM C 2 Structure des gps Lu B CAM C 2 1 Les antig nes Lu sont port s par deux gps isoformes Lu et Lu v13 C 3 Distribution tissulaire des gps Lu B CAM C 4 Les gps Lu B CAM mol cules d adh rence C 4 1 Les mol cules d adh rence dans les rythrocytes C 4 2 Mol cules d adh rence dans les cellules m sangiales glom rulaires C 5 Les gps Lu B CAM r cepteurs sp cifiques de la laminine 10 11 C 5 1 Site de fixation aux gps Lu B CAM C 5 2 Site de fixation au niveau de
26. nques de donn es sur les homologies de structures avec d autres prot ines sur la pr diction des structures secondaires et sur la d termination des fonctions de certaines mol cules les antig nes de groupes sanguins ont t class s sch matiquement en cing familles fonctionnelles Les transporteurs et canaux Les r cepteurs de ligands exog nes virus bact ries et parasites Les mol cules d adh rence Les enzymes Les prot ines structurales Il faut pr ciser que cette classification est arbitraire car certaines mol cules peuvent avoir des propri t s communes plusieurs cat gories Par exemple la Bande 3 porteuse des antig nes Diego est la fois responsable de la fonction de transporteur d anions et du maintien de la structure du globule rouge travers son interaction avec des prot ines du squelette rythrocytaire comme l ankyrine Palek et Lambert 1990 B Le syst me de groupe sanguin Luth ran Le syst me de groupe sanguin Luth ran comprend en 19 antig nes LUI LU21 s rologiquement d finis Crew et al 2004 LU10 et LUI5 sont d clar s obsol tes Quatre paires d antig nes sont antith tiques ex toutes h maties Lu n gative est necessairement Lu et inversement Lu LU1 et Lu LU2 Lu et Lu9 Lu8 et Lul4 et AU LU18 et AUP LU19 B 1 Le polymorphisme Lu Lu On doit la d couverte du syst me Lu Callender et son quipe en 1945 qui ont identifi pour la
27. ns certain tissus canc reux Rettig Garin Chesa et al 1988 Ces deux prot ines constitu es d une r gion extracellulaire contenant le polymorphisme Lif Lu gt 5 sites potentiels de N glycosylation un site dans le domaine 3 et 4 sites dans le domaine 4 un motif RGD de liaison aux int grines dans le domaine 3 et un domaine transmembranaire Dans les 40 a a sp cifiques de la gp Lu on trouve un site potentiel de liaison aux domaines SH3 sarc homology 3 P P P G E P Koch et al 1991 sugg rant que les gps Lu B CAM seraient impliqu es dans des m canismes de signalisation Parsons et al 1995 un motif dileucine LL en position 608 609 impliqu dans l expression basolat rale de la gp Lu dans les cellules pith liales polaris es Ce motif est absent du domaine cytoplasmique de la gp Lu v13 et entra ne l expression d polaris e de cette prot ine EI Nemer et al 1999 EPHE Banque de Monographies SVT 8 enfin parmi les 5 s rines pr sentes dans le domaine cytoplasmique de la gp Lu et grace a l utilisation de logiciels de pr dictions de sites potentiels de phosphorylation Netphos nous avons localis deux sites potentiels de phosphorylation le site consensus chevauchant LSHSGSE reconnu par la Cas ine Kinase II CKII et la Glycog ne Synthase Kinase b GSK3b et un autre site RGGSGGF reconnu par la Calmoduline dependant kinase II CaMKII et la Prot ine Kinase A PKA respectivement en position
28. r cessif qui est un vrai ph notype amorphe not Lu caract ris par Vabsence totale des antig nes Lu la surface des globules rouges Il est d l homozygotie d un all le silencieux au locus LU Myhre et al 1975 Les individus de ph notype Lu a b produisent un seul anticorps dirig contre un pitope diff rent de celui d finissant les antig nes Lu et Lu Cet anticorps appel antiLu gt Melonas et Noto 1965 est not anti Lu3 dans la nomenclature internationale B 2 Structure du g ne LU humain Le g ne LU a t clon partir d une banque g nomique restreinte d ADN provenant d un individu de g notype Lu Lu La structure du g ne LU a t d termin e apr s amplification et s quen age de fragments d ADN chevauchants utilisant des amorces nucl otidiques choisies dans la s quence de PADNc Le g ne LU a une taille de 12 5 kb et est constitu de 15 exons dont la taille varie entre 71 et 498 pb La caract risation structurale du g ne LU a permis de d terminer les bases mol culaires du polymorphisme Lu Lu L analyse des s quences nucl otidiques de l all le Lu et la comparaison avec la s quence de l all le Lu ont mis en vidence la transition A229G dans l Exon 3 entra nant une substitution His77Arg El Nemer et al 1997 Cette transition cr e un site de restriction Acil sp cifique de l all le Lu ce qui permet de g notyper les all les Lu et Lu C Les Gl
29. r Transfus Immunohematol 31 2 433 40 Juliano R L 2002 Signal transduction by cell adhesion receptors and the cytoskeleton functions of integrins cadherins selectins and immunoglobulin superfamily members Annu_Rev Pharmacol Toxicol 42 283 323 K Kikkawa Y et al 2002 Identification of the binding site for the Lutheran blood group glycoprotein on laminin alpha 5 through expression of chimeric laminin chains in vivo J Biol Chem Kikkawa Y et al 2003 Mesangial cells organize the glomerular capillaries by adhering to the G domain of laminin alphas in the glomerular basement membrane J Cell Biol 161 1 187 96 EPHE Banque de Monographies SVT 16 Koch C A et al 1991 SH2 and SH3 domains elements that control interactions of cytoplasmic signaling proteins Science 252 5006 668 74 Kroviarski Y et al 2004 Direct interaction between the Lu B CAM adhesion glycoproteins and erythroid spectrin Br J Haematol 126 2 255 64 L Levene C Y Karniel et al 1987 2 Aminoethylisothiouronium bromide treated red cells and the Lutheran antigens Lua and Lub letter Transfusion 27 6 505 6 M Melchior F 2000 SUMO nonclassical ubiquitin Annu Rev Cell Dev Biol 16 591 626 Melonas K et Noto T A 1965 Anti LuaLub imitating a panagglutinin Transfusion 5 370 Moulson C L et al 2001 Localization of Lutheran a novel laminin receptor in normal knockout and tr
30. s des membranes basales et montre un r le fondamental de cette isoforme dans le d veloppement embryonnaire et EPHE Banque de Monographies SVT 10 notamment dans la morphogen se du rein Kikkawa et al 2003 Les gps Lu et l int grine a3b1 sont les deux r cepteurs de cette isoforme dans les cellules m sangliales et coop rent in vitro pour m dier l adh rence de ces cellules sur la chaine a5 de la laminine dans le rein En effet l inactivation du g ne murin codant pour l int grine a3b1 entra ne chez les souris un ph notype qui ressemble celui observ chez les souris laminine a5 mais avec des effets moins s v res ce qui sugg re une coop ration in vivo entre les r cepteurs et a3b1 C 5 Les gps Lu B CAM r cepteurs sp cifiques de la laminine 10 11 Les laminines sont des glycoprot ines extracellulaires pr sentes dans toutes les membranes basales Ce sont des h t rodim res compos s de trois cha nes g n tiquement distinctes a b g Engel et al 1981 Bruch et al 1989 Il existe 15 isoformes de laminines d rivant de la combinaison des 5 cha nes a 3 cha nes b et 3 cha nes g La gp lu fixe la laminine El Nemer et al 1998 Udani et al 1998 mais pas la fibronectine la vitronectine la transferrine le fibrinog ne ou la fibrine L absence de liaison la laminine des globules rouges de ph notype Lu a b de type n Lu r duction s v re de l expression de CD44 et des globules rouges de ph notype
31. t une fait l objet de ce m moire la prot ine Ubc9 Ubiquitin enzyme conjugated 9 Cette enzyme dont la fonction est peu connue chez les mammif res est impliqu e dans la conjugaison de SUMO 1 small ubiquitin related modifier sur des prot ines cibles La sumoylation la diff rence de l ubiquitinylation consid r e comme une des premi res tapes qui m nent la d gradation semble fonctionner comme antagoniste de l ubiquitine en prot geant les prot ines de la d gradation De plus la sumoylation jouerait galement un r le dans la localisation subcellulaire des prot ines Nous avons confirm la sp cificit de cette interaction 1 in vitro par la technique du double hybride et par une technique de capture de GST GST pull down 2 dans un syst me cellulaire par une technique de coimmunopr cipitation Gr ce l utilisation de mutants nous avons cartographi le site de fixation de ce partenaire au sein du domaine cytoplasmique de la gp Lu Nous avons ensuite tudi par microscopie confocale l effet de mutation du sited interaction sur la localisation et le routage des gps Lu V BIBLIOGRAPHIE ae EPHE Banque de Monographies SVT 13 al Khodairy et al 1995 The Schizosaccharomyces pombe husS gene encodes a ubiquitin conjugating enzyme required for normal mitosis J Cell Sci 108 Pt 2 475 86 B Bartel P et al 1993 Elimination of false positives that arise in using the two h
32. ybrid system Biotechniques 14 6 920 4 Bies J et al 2002 Covalent attachment of the SUMO I protein to the negative regulatory domain of the c Myb transcription factor modifies its stability and transactivation capacity J Biol Chem 277 11 8999 9009 Bolcato Bellemin et al 2003 Laminin alpha5 chain is required for intestinal smooth muscle development Dev Biol 260 2 376 90 Bony V et al 1999 Time course expression of polypeptides carrying blood group antigens during human erythroid differentiation Br J Haematol 107 2 263 74 Bruch M et al 1989 Dissection of laminin by cathepsin G into its long arm and shortarm structures and localization of regions involved in calcium dependent stabilization and self association Eur J Biochem 185 2 271 9 C Callender S T et al 1945 Hypersensitivity to transfused blood Br Med J ii 8 Camara Clayette V et al 2001 Transcriptional regulation of the KEL gene and Kell protein expression in erythroid and non erythroid cells Biochem J 356 Pt 1 171 80 Camonis J and F Moreau Gachelin 1997 Prot ines cherche prot ine mode d emploi H matologie 3 540 549 Campbell I G et al 1994 Molecular cloning of the B CAM cell surface glycoprotein of epithelial cancers a novel member of the immunoglobulin superfamily Cancer Res 54 22 5761 5 Cartron J P et al 1998 Insights into the structure and function of membrane polypeptides
33. ycoprot ines Luth ran gps lu C 1 Clonage des gps Lu B CAM L ADNc codant les gps Lu est clon en 1995 partir d une banque d ADNc de placenta humain Cet ADNc code une prot ine transmembranaire de type I de 628 a a La prot ine appartient la Super Famille des Immunoglobulines SFIg et comporte 5 domaines extracellulaires Ig like un domaine EPHE Banque de Monographies SVT 7 transmembranaire et un domaine intracytoplasmique de 59 a a Parsons et al 1995 Dans une tude ind pendante Campbell et son quipe ont clon un ADNc codant une gp de surface cellulaire appel e B CAM Basal Cell Adhesion Molecule un marqueur de surface surexprim dans certains cancers pith liaux de l ovaire et du colon Campbell et al 1994 La gp BCAM 588 a a appartient a la SFIg et comporte 5 domaines extracellulaires Ig like un domaine transmembranaire et un domaine intracytoplasmique de 19 a a Des travaux de notre laboratoire montrent que les gps Lu et B CAM repr sentent deux isoformes cod es par un g ne unique LU Rahuel et al 1996 Les deux isoformes sont issues de l pissage alternatif de l intron 13 faisant appara tre un codon stop la position 589 g n rant ainsi l isoforme courte B CAM tronqu e des 40 a a C terminaux par rapport l isoforme longue Lu L isoforme B CAM a t renomm Lu v13 car elle r sulte de la persistance de l intron 13 dans le messager Notre laboratoire d term
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