Home

Wohlwend Daniel Diplomarbeit - Institut für Mikrobiologie und

1. Abb 12 Restriktionsverdau von pQE 9 Imp7 und pET 21a 1 iges Agarosegel Die oberen f nf Spuren zeigen den Verdau von pQE 9 Imp7 die unteren f nf den Verdau von pET 21a Der Restriktionsverdau war bei beiden Vektoren erfolgreich Das Insert 3 2 kbp lief unterhalb des restlichen Vektors pQE 9 3 4 kbp Das Insert und der Zielvektor 5 4 kbp wurden aus dem Gel ausgeschnitten Ihre ehemaligen Positionen sind an den Schatten der Bam Hind Spuren zu erkennen und durch Sterne gekennzeichnet pQE pQE 9 Imp7 pET pET 21a ung ungeschnitten Negativkontrolle 1kb ladder pET 2la Leerkontrolle 1 vo_s auPRruwum Abb 13 Kolonie Screen 1 iges Agarosegel Das Gen f r Imp7 wurde in einer Kolonie PCR durch Vektorprimer f r pET 21a amplifiziert Das Insert ist bei den Kolonien 1 8 erfolgreich in pET 21a ligiert worden In den Spuren ist es jeweils deutlich bei etwa 3 2 kbp zu erkennen pET 2la Leervektor als Positivkontrolle f r die Vektorprimer die Nummern entsprechen den getesteten Kolonien auf der Selektionsplatte nach der Transformation Der neue Vektor pET 21la Imp7 wurde in einer Midi Prep vgl 2 2 2 3 1 vermehrt und isoliert Anschlie end wurde das inserierte Gen mithilfe der Vektorprimer ansequenziert vgl 2 2 4 2 Der korrekte Einbau die Position des Gens im offenen Leserahmen und die Richtigkeit der ersten und letzten 700 Aminos uren konnte so best tigt werden Da die Co Aufreinigung von Imp7
2. Exportsubstrat Substratfunktion _Exportsignal _Exportrezeptor Proteine mit NES breites Spektrum LALKLAGLDI CRM1 Exportin1 l leucinreich l U snRNA _Splei en CBC Proteine mit NES CRMI Exportin 5S rRNA Translation m gl mit TFIHA oder CRM1 Exportin1 L5 Snurportin1 Adapterprotein f r U 150 Aminos uren CRM1 Exportin1 _snRNP Import _groBe Region l tRNA Translation Akzeptorarm und Exportin1 l _TYC Arm l Imp a Adapter f r Importin B 140 Aminos uren CAS Rezeptor gro e Region l mRNA Genexpression hnRNP Proteine nicht bekannt TAP SR Proteine Splei en _SR Dom ne nicht bekannt 1 2 4 Kerntransportzyklen im Vergleich Die gro e Vielzahl und die chemische Unterschiedlichkeit der Transportsubstrate bedingt eine gro e Diversit t an Transportrezeptoren und mehrere Transportstrategien Die au erordentlich hohe Spezifit t der Transportrezeptoren f r ihre Substrate wird n mlich nicht ausschlie lich dadurch erreicht da jeder bekannte Rezeptor ein bestimmtes Substrat durch die Kernpore translozieren kann Es gibt dar berhinaus zwei andere bislang identifizierte Transportsysteme so da insgesamt bis heute drei Systeme bekannt sind 1 Der Ein Rezeptor Weg Ein Import oder Exportrezeptor bindet sein Substrat und transloziert es durch die Pore Nach der Translokation wird das Substrat durch die Bindung eines weiteren Rezeptors an den Importrezeptor freigesetzt Ein Beispiel hierfiir ist der Import von rpL23a durch Imp7 Rout et al
3. 1997 J kel und G rlich 1998 2 Der Ein Rezeptor Ein Adapter Weg Ein Transportrezeptor bindet das Substrat und fungiert anschlie end als Adapter f r einen zweiten Transportrezeptor der den eigentlichen Transport durch den NPC vermittelt Nun l st sich der Transportrezeptor durch Bindung eines zweiten Rezeptors und gibt den Adapter Substrat Komplex frei Dieser dissoziiert schlie lich Als Beispiel sei der Import eines klassische NLS tragenden Substrats durch das Impa Imp Heterodimer Adam et al 1994 G rlich et al 1994 Moroianu et al 1995 Imamoto et al 1995 genannt 3 Der Zwei Rezeptoren Ein Substrat Weg Vor der Translokation dimerisieren zwei Rezeptoren und bilden erst jetzt ein funktionelles Transportrezeptorheterodimer Nun erfolgt die Bindung an das Substrat und dann der Transport Schlie lich dissoziiert erst der eine dann der andere Transportrezeptor vom Substrat Ein Beispiel ist der Import des Linker Histons Hl durch das Imp Imp7 Heterodimer J kel et al 1999 Baake et al 2001 B uerle et al 2002 Allen drei Wegen ist ein einheitliches Muster gemein Die Bindung des funktionellen Rezeptors an das Substrat erfolgt auf der einen Seite der Kernmembran gefolgt von der Translokation durch den Zentralkanal des NPC unter Ausbildung verschiedener koordinativer Bindungen an die FG repeats der Nucleoporine Nach Erreichen der anderen Seite des NE dissoziieren Rezeptor und Substrat und schlie lich kehrt der Rezepto
4. BamH I Hind II Not I Xho I T4 DNA Ligase Taq Polymerase Protease Inhibitor Cocktail Tablets Complete EDTA free Aprotinin Leupeptin Pepstatin 2 1 4 Verwendete Organismen coli BL21 DE3 LysE coli DH 5a coli HB 101 coli HMS 174 LysS coli M15 coli SG13009 coli SG13009 pREP4 coli TG I coli XL1 Blue See gt eS gt Ss Be 2 1 5 Plasmide und Vektoren pQE 9 Imp7 pQE 60 Imp no tag pQE 80Ndecahis Imp7 pET 2la New England Biolabs Frankfurt New England Biolabs Frankfurt New England Biolabs Frankfurt New England Biolabs Frankfurt New England Biolabs Frankfurt New England Biolabs Frankfurt Roche Mannheim Roth Karlsruhe Roth Karlsruhe Roth Karlsruhe Stammsammlung der AG Ficner und der AG Feu ner Prof Dr D Doenecke G ttingen Prof Dr D G rlich EMBL Heidelberg Prof Dr D G rlich EMBL Heidelberg Novagen Merck Darmstadt 2 1 6 Primer pGEXforward 5 GCT GGC AAG CCA CGT TTG GT 3 pGEXreverse 5 CGT CTC CGG GAG CTG CAT GT 3 pETM 70for 5 GGG AAT TGT GAG CGG ATA ACA ATT 3 pETM 70rev 5 TCA GCG GTG GCA GCA GCC AAC TCA 3 2 1 7 Reaktionskits NucleoSpin Extract Qiagen Plasmid Midi Kit Qiagen Plasmid Maxi Kit Sequence Mix Big Dye Terminator v1 1 sequencing kit MWG Biotech Ebersberg MWG Biotech Ebersberg MWG Biotech Ebersberg MWG Biotech Ebersberg Macherey Nagel D ren Qiagen Hilden Qiagen Hilden Applied Bi
5. Geyer M Assheuer R Klebe C Kuhlmann J Becker J Wittinghofer A Kalbitzer H R 1999 Conformational states of the nuclear GTP binding protein Ran and its complexes with the exchange factor RCC1 and the effector protein RanBP1 Biochemistry 38 35 11250 11260 Goff S P 2001 Intracellular trafficking of retroviral genomes during the early phase of infection viral exploitation of cellular pathways J Gene Med 3 517 528 G rlich D Prehn S Laskey R A Hartmann E 1994 Isolation of a protein that is essential for the first step of nuclear protein import Cell 79 767 778 G rlich D Kostka S Kraft R Dinwall C Laskey R A Hartmann E Prehn S 1995a Two different subunits of importin cooperate to recognize nuclear localization signals and bind them to the nuclear envelope Curr Biol 5 383 392 G rlich D Vogel F Mills A D Hartmann E Laskey R A 1995b Distinct functions for the two importin subunits in nuclear protein import Nature 377 246 248 G rlich D Henklein P Laskey R A Hartmann E 1996a A 41 amino acid motif in importin a confers binding to importin B and hence transit into the nucleus EMBO J 15 1810 1817 G rlich D Pant N Kutay U Aebi U Bischoff F R 1996b Identification of different roles for RanGDP and RanGTP in nuclear protein import EMBO J 15 5584 5594 G rlich D Dabrowski M Bischoff F R Kutay U B
6. im berschu zu His s Imp7 mit anschlie ender Inkubation f hrte zur Bildung eines stabilen Heterodimers aus beiden Rezeptoren welches ber eine Gelfiltration mit anschlie ender SDS PAGE visualisiert werden konnte vgl Abb 26 und 27 Allerdings waren die Ausbeuteverluste bei dieser Methode f r eine Kristallisation zu hoch da lediglich die Spitze des Dimer Peaks h tte weiterverwendet werden k nnen Im absteigenden Schenkel dieses Peaks trat n mlich bereits das Imp Monomer auf Die Co Elution eines Imp Dimers konnte ebenfalls nicht ausgeschlossen werden Dieses Problem konnte durch die Co Affinit tsaufreinigung umgangen werden da bei vollst ndiger Abs ttigung des immobilisierten Imp7 ausschlie lich das Heterodimer im Imidazolgradienten eluierte vgl 3 2 3 2 und Abb 26 und 27 So konnte die richtige St chiometrie sichergestellt werden F r sp tere Co Affinit tsaufreinigungen des Heterodimers w re es auch m glich Imp mit His Sequenz zu immobilisieren und Imp7 ohne Affinit tssequenz daran zu binden Da das Protein ohne Affinit tssequenz aber im berschu zugesetzt werden mu und die Ausbeute an Imp diejenige an Imp7 deutlich berstieg vgl Tab 5 und 8 wurde auf den umgekehrten Aufreinigungsweg verzichtet 4 2 3 Aufreinigung des tern ren ImpB Imp7 H1 Komplexes Wie anhand der Bindungsstudie des tern ren Komplexes aus Imp Imp7 und H1 deutlich wurde vgl 3 2 4 und Abb 28 und 29 ist das Vorliegen de
7. uM Imp7 zeigt die FITC Farbung hell gef rbte Nucleoli und nur wenig Imp bis fast kein Imp7 cytoplasmatisches Substrat Da die Zusammensetzung der ribosomalen Untereinheiten im Nucleus stattfindet genauer gesagt in den Nucleoli belegen die stark gef rbten Nucleoli nach Zugabe von Imp beziehungsweise Imp7 die korrekte Lokalisation der ribosomalen Proteine Dies illustriert die Qualit t der Importrezeptoren was in Hinblick auf die Kristallisation von enormer Wichtigkeit ist Die Negativkontrolle zeigte ebenfalls eine geringe Importaktivit t die daraus resultierte da beim Waschen nach der Permeabilisierung nur 80 90 der l slichen Proteine des Cytosols entfernt werden konnten Daher ist auch in der Negativkontrolle ein Basisimport zu sehen der bei der Interpretation der Importaktivit t ber cksichtigt werden mu Der Import des Linker Histons Hl fand nur in Anwesenheit des vorgebildeten Imp Imp7 Heterodimers mit gen gender Effizienz statt Abb 31 Hier waren die Nuclei der einzelnen Zellen deutlich gef rbt Die FITC F rbung zeigte im Vergleich mit der DAPI F rbung da das Histon nahezu vollst ndig kernlokalisiert war Wurde einer der beiden Importrezeptoren mit Hl vorinkubiert war der Import jedoch stark vermindert im Falle der Vorinkubation mit Imp7 sogar vollst ndig unterbunden Hier pr zipitierte das Histon in gro en Mengen im Cytosol was bei der Vorinkubation mit Imp nicht in solchem Ma e beobachtet wurde Hier
8. Ellenberg J 2001 Nuclear pore complexes form immobile networks and have a very low turnover in live mammalian cells J Cell Biol 154 1 71 84 Davis L I 1992 Control of nucleocytoplasmic transport Curr Opin Cell Biol 4 3 424 429 Doye V Hurt E 1997 From nucleoporins to nuclear pore complexes Curr Opin Cell Biol 9 401 411 Farnet C M Haseltine W A 1991 Determination of viral proteins present in the human immunodeficiency virus type 1 preintegration complex J Virol 65 1910 1915 Fassati A Goff S P 2001 Characterization of intracellular reverse transcription complexes of human immunodeficiency virus type 1 J Virol 75 3626 3635 Fassati A G rlich D Harrison I Zaytseva L Mingot J M 2003 Nuclear import of HIV 1 intracellular reverse transcription complexes is mediated by importin 7 EMBO J 22 14 3675 3685 Fornerod M Ohno M Yoshida M Mattaj I W 1997 CRMI is an export receptor for leucine rich nuclear export signals Cell 90 6 1051 1060 Fukuda M Gotoh I Adachi M Gotoh Y Nishida E 1997 A novel regulatory mechanism in the mitogen activated protein MAP kinase cascade Role of nuclear export signal of MAP kinase kinase J Biol Chem 272 5 32642 32648 Fukuhara N Fernandez E Ebert J Conti E Svergun D 2004 Conformational variability of nucleo cytoplasmic transport factors J Biol Chem 279 3 2176 2181
9. Karlsruhe Fluka Buchs di Kaliumhydrogenphosphat Lithiumchlorid Magnesiumformiat Dihydrat Magnesiumsulphat Hexahydrat Manganchlorid B Mercaptoethanol MOPS 3 N morpholino propansulfonsaure Natriumacetat Trihydrat Natriumchlorid Natriumformiat Natriumhydroxid Nickelsulphat Hexahydrat Polyethylenglykol 200 300 400 600 1000 3000 6000 10000 Polyethylenglykol 1500 2000 4000 5000 8000 20000 Polyethylenglykol 3350 pH Pufferl sungen pH 4 01 7 0 9 21 Protein Assay Bradford Reagens Rubidiumchlorid Salzs ure 37 SDS Natriumdodecylsulphat Ultrapure Skim milk powder TEMED N N N N Tetramethylethylendiamin Tris hydroxymethyl aminomethan Triton X 100 Trypton Pepton Yeast Extract 2 1 2 Gr enstandards BR Broad range Protein Standard Eigener Proteinstandard DNA Standard 1kb ladder Merck Darmstadt AppliChem Darmstadt Fluka Buchs AppliChem Darmstadt Merck Darmstadt Merck Darmstadt Roth Karlsruhe AppliChem Darmstadt Roth Karlsruhe Merck Darmstadt Roth Karlsruhe Fluka Buchs Merck Darmstadt Fluka Buchs Sigma Aldrich Steinheim Mettler Toledo Steinbach BioRad M nchen Fluka Buchs Roth Karlsruhe Roth Karlsruhe Fluka Buchs Roth Karlsruhe Roth Karlsruhe Roth Karlsruhe Roth Karlsruhe Oxoid Basingstoke Hampshire England New England Biolabs Frankfurt Annette Berndt G ttingen New England Biolabs Frankfurt 2 1 3 Enzyme und Inhibitoren
10. Proteinkonzentration 20 uM Temperatur 20 C Auch hier wurde um die Bedingung gescreent Dabei wurde die Temperatur variiert 20 C und 4 C die NaCl Konzentration ver ndert MgCl gegen CaCl und MgSO und schlie lich CTAB gegen SDS substituiert oder ganz weggelassen Da die Zugabe von SDS wider Erwarten nicht eine vollst ndige Prazipitation von Imp7 zur Folge hatte sondern vielmehr erneut klare tunnelartige Aggregationen ausl ste wurde daraus geschlossen da m glicherweise nur ein bestimmter Zusatz fehlt Solch ein Zusatz k nnte eine katalytische Funktion w hrend der Kristallbildung wahrnehmen oder aber auch aktiv in die Kristallstruktur integriert werden Aus diesem Grund wurden ausgehend von der Bedingung CS2 2 nicht nur die Additive Screens 1 3 von Hampton Research getestet sondern auch der Detergent Screen 1 der gleichen Firma Dabei wird das Additiv oder Detergens 1 10 im Tropfen verd nnt In den meisten Bedingungen waren amorphe aber klare und damit nicht denaturierte Proteinaggregationen zu beobachten Bei 4 C schien die L slichkeit von Imp7 erh ht was an der geringeren Aggregatebildung zu erkennen war In manchen F llen blieb der Tropfen fast klar In einigen Bedingungen kam es aber zu einer neuen Kristallbildung Abb 34 Bedingung im Tropfen 50 mM CTAB 0 25 M NaCl CS2 2 50 mM MgCl Add1 11 3 v v Ethylenglykol Proteinkonzentration 20 uM Temperatur 20 C Kristalldurchmesser 15
11. YKKPEERSPLIAAMOHF LPMLKEDRYIQLLADPSEQSVLIQ i i y 170 180 190 200 cong 10921299229224432205 22222120331139222231 E eee Pred HHHHHHHHHAHHHHHHHHAHHHHHHHHHHHHHAHAHHHHCC CC AA KOIFKIFYALVOYTLPLE LINQONLAEWIEILKTVVDRDY 1 i 210 220 230 240 cong 0322322232222 Pred u CHE Pred CCCCCCCC HAHAAHBBAAAHHBAHBAHHHAHBRBACCHHA AA PAETLOVDEDDRPELPRRKCKKRALHILARLFERYGSFGI 1 i 1 250 260 270 280 cont 19322222223333323333739992322223333 322221 Pred C E Pred HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHAHAHHAAHHHHHACCCHH AA VSKEYIDFAEVFLKAFAVGVOQVLLEKVLYOYKEKOYIAPR 1 y 290 300 310 320 cont 1123333332333333333323337333332332323233223 24 Pred REESE Pred HHHHHHHHAHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHAC CC AA VLQOTLITYFIQGY SHAVTWHILKPAIQGITQDVIFPLMCY 330 340 350 360 cont J909900999009000999900999as200000 00000000 Pred u ED EEE Pred CHHHHRRAACCHHAHAARACCCCCCCCC CHHHHAAAAAAA AA TDSDEDLWQEDPYEYIRMKFDVFEDFISPTTAAQTLLF TS 1 i 1 370 380 390 400 con 119220222211213222193232523221321122322231 Pred up u En Pred HHACCCHHHAHHHHHHHHAHHACCCCCCHHHHAHHHHHAHHAHRAHRHAH AA CSKRKEVLOKTMGFCYQI LTEPAADPRKKDGALHMIGS LA 410 420 430 440 Cont JJa9aa0900090090000000009930939990 0000002 Pred un u Pred HHHHAACCCCHHHHHHHAHAHHHHHAHHCCCHHHHHHAHRAHAH AA EILLKKKI YKDQMEFMLOUAVEP LFSSE LGYMRARACWYVL 450 460 470 480 cong 130934253322322219921143332233 32222222231 Pred u En E Pred HAAHHAHACCCHAABAHAABAHAHABACCCCCCHHHA
12. non hydrolyzable analogues of GTP and identification of the small GTPase Ran TC4 as an essential transport factor J Cell Biol 123 1649 1659 Melese T Xue Z 1995 The nucleolus an organelle formed by the act of building a ribosome Curr Opin Cell Biol 7 319 324 Moore M S Blobel G 1993 The GTP binding protein Ran TC4 is required for protein import into the nucleus Nature 365 661 663 Moore M S Blobel G 1994 Purification of a Ran interacting protein that is required for protein import into the nucleus Proc Natl Acad Sci USA 91 10212 10216 Moroianu J Blobel G Radu A 1995 Previously identified protein of uncertain function is karyopherin a and together with karyopherin B docks import substrate at nuclear pore complexes Proc Natl Acad Sci USA92 2008 2011 M hlh usser P M ller E C Otto A Kutay U 2001 Multiple pathways contribute to nuclear import of core histones EMBO Rep 21 81 690 696 Nakielny S Dreyfuss G 1997 Nuclear export of proteins and RNAs Curr Opin Cell Biol 9 420 429 Nakielny S Dreyfuss G 1999a Transport of proteins and RNAs in and out of the nucleus Cell 99 677 690 Nakielny S Shaikh S Burke B Dreyfuss G 1999b Nup153 is an M9 containing mobile nucleoporin with a novel Ran binding domain EMBO J 18 7 1982 95 Nevo R Stroh C Kienberger F Kaftan D Brumfeld V Elbaum M Reich Z Hinterdorfer P 20
13. substrates In this thesis the analysis of the special features of imp7 was tackled in several approaches On the one hand imp7 was highly purified in order to allow crystallographic studies and first conditions could be spotted which might render such investigations possible in the future Additionally the co purification of imp7 with imp succeeded thus potentiating further crystallization tests Furthermore an assay could be developed in which the ternary complex of imp imp7 and the linker histone H1 can easily be purified for crystallization On the other hand the behaviour of imp and imp7 during import of the linker histone Hl could be elucidated more precisely In this import pathway imp7 shows a supplementary chaperoning activity A hypothesis was developed which might explain how imp7 could fulfil its dual function as an import receptor and as a chaperone during the final steps of histone transport from the nuclear pore to chromosomal DNA The initial binding of imp to imp7 before binding the substrate in the cytosol activates a conformational switch in imp7 thus preventing unspecific interactions of the C terminal H1 binding domain of imp7 with the histone Thereby the foundations are laid for specific binding of this domain of imp7 to the basic regions on the surface of the histone after dissociation of imp either at the nuclear basket or in the karyoplasm In this way the basic surface of the histone could be protected from unspec
14. 1_Frctims Auch hier treten kleinere Peaks davor auf Sie 600 a repr sentieren ebenfalls dimerisiertes Protein Blau UV Absorption bei 280 san nm Rot UV Absorption bei 260 nm as 5 lis 17 helo la atale la 1215 zla 2 lz lal 150 no 20 300 ml Imp bei 12 2 ml mAU syperdec200HR1030003 1_UV1_280m 9 Superdac200HR1030003 1_UV2_25 rm 300 xn T Imp Imp7 Heterodimer bei 10 5 ml Fraktion 11 Abb 21 Chromatogramm der Gelfiltration des vorinkubierten Imp Imp7 Heterodimers Das Heterodimer eluiert deutlich vor den Monomeren vgl Abb 20 Der zweite gro e Peak bei etwa 12 2 ml repr sentiert Imp das im berschu zugegeben worden war Da beide Peaks hnlich hoch sind spricht einerseits f r eine nahezu vollst ndige Abs ttigung von Imp7 durch Imp und andererseits f r das Erreichen des angestrebten 2 1 berschusses an Imp Blau UV Absorption bei 280 nm Rot UV Absorption bei 260 nm Die einzelnen Fraktionen wurden mittels SDS PAGE analysiert Abb 25 Der erste Peak mit der Spitze bei 10 5 ml entsprach dem Heterodimer der zweite Peak mit der Spitze bei 12 2 ml entsprach ungebundenem Imp Ungebundenes Imp7 lag praktisch nicht mehr vor Dies best tigte die richtige Konformation der Bindungsdom nen beider aufgereinigten Produkte Abb 25 SDS PAGE der re Gelfiltration des 158 gt Imp Imp 7 Heterodi 116 p lt mp7 mers De
15. 20 um Bedingung im Tropfen 50 mM CTAB 0 25 M NaCl CS2 2 50 mM Mech Add1 13 3 w v 1 6 Hexandiol Proteinkonzentration 20 uM Temperatur 20 C Kristalldurchmesser 10 20 um Bedingung im Tropfen 50 mM CTAB CS2 2 0 25 M NaCl 50 mM MgCl Det 1 6 0 09 mM Triton X 100 Proteinkonzentration 20 uM Temperatur 20 C Kristalldurchmesser 15 20 40 um Abb 34 Kristallbildung in Gegenwart verschiedener Additive und Triton X 100 Aufnahmen mit einer Digitalkamera und vorgespanntem Polarisationsfilter Bemerkenswerterweise treten die gleichen Kristallformen auf die vorher in anderen Bedingungen schon beobachtet wurden vgl Abb 30 und 31 Auch hier sind die Kristalle klein mit einem nahezu konstanten Durchmesser von 20 um Lediglich in Gegenwart des nicht ionischen Detergens Triton X 100 sind auch gr ere Gebilde zu sehen Auf dem untersten Bild ist ein Solches zentral dargestellt Bei diesen Formationen k nnte es sich aber auch um Phasentrennungen handeln Daher ist der Durchmesser mit 40 um in Klammern gesetzt Es wurde versucht mit Protein aus derselben Aufreinigung die Kristalle zu reproduzieren was aber nicht gelang Auch Reproduktionstests bei 4 C schlugen fehl die L slichkeit von Imp7 schien dadurch eher gesteigert zu werden Micro und Macro Seeding vgl 2 2 6 2 und 2 2 6 3 blieben ohne Erfolg In s mtlichen Reproduktionsbedingungen und auch in denen in welche Kristallisationskeime ges t worden waren waren erneut a
16. 3 ml Ammoniumperoxodisulphat 30 ul 30 ul TEMED Sul Sul Aq bidest 2 8 ml 1 8 ml Trenngelpuffer 1 2 ml 1 2 ml 2 2 1 3 2 Agarosegelelektrophorese von Nucleins uren Zur pr parativen Reinigung und zur Analyse von DNA wird die Agarosegelelektrophorese benutzt Je nach Gr e der aufzutrennenden Fragmente werden die Agarosegele mit 0 5 bis 2 0 Agarosegehalt in 1x TBE Puffer hergestellt Die abgewogene Agarose wird mit TBE Puffer versetzt und zum L sen in der Mikrowelle zum Kochen gebracht F r das Gel wird eine Flachbettkammer abgedichtet und die handwarme Agarosel sung hineingegossen Luftblasen werden entfernt und ein Probenkamm wird in das Gel gesteckt Nach etwa einer Stunde ist das Gel erstarrt und wird in eine mit 1x TBE gef llte Elektrophoresekammer gelegt Zum Laden der DNA Proben werden diese mit Probenpuffer versetzt und in die Geltaschen pipettiert Die elektrophoretische Auftrennung erfolgt bei 12 mA cm Gelfl che TBE Puffer 10x 1 Liter Agarosegel Probenpuffer 10x 108 g TrisBase 0 5 w v Bromphenolblau 55 Bors ure 0 5 w v Xylencyanol FF 40 ml 0 5 M EDTA pH 8 0 60 v v Glycerin ad 11 H O 2 2 1 4 Detektion von Proteinen und Nucleins uren 2 2 1 4 1 Anf rben von Proteinen mit Coomassie Brilliant Blue Elektrophoretisch aufgetrennte Proteine k nnen mit Coomassie Brilliant Blue G 250 sichtbar gemacht werden wobei die Nachweisgrenze 0 3 ug Protein Bande betr gt Das Gel wird nach der Elektr
17. 55 6 42 7 gt Durch Zugabe 2 w v Glucose konnte die Basisexpression durch Promotorrepression gesenkt und durch den Zusatz von K27HPO und besonders 2 Ethanol abs die L slichkeit von Imp7 weiter gesteigert werden Die Induktionszeit wurde anhand der Ausbeute nach der Affinit tschromatographie vgl 3 1 2 bestimmt Tab 3 Tab 3 Ausbeute an Imp7 nach der Affinit tschromatographie in Abh ngigkeit von der Induktionszeit Induktionszeit h 6 12 16 24 Ausbeute mg l 2 3 2 4 3 8 LB Kultur Um die Expressionskulturen bei einer h heren Zelldichte ernten zu k nnen wurde sp ter von LB Medium auf 2YT Medium umgestellt vgl 2 2 3 2 und 2 2 3 4 2 Zun chst wurde eine 10 ml Vorkultur angeimpft vgl 2 2 3 4 1 und ber Nacht bei 29 C unter Sch tteln inkubiert Mit dieser Vorkultur wurde eine 400 ml Vorkultur angeimpft die im Sch ttelinkubator bei 29 C bis zu einer ODgo0 von 2 4 wachsen gelassen wurde Diese Vorkultur wurde schlie lich mit 580 ml 4 C kalten LB Mediums 20 ml Ethanol abs also 2 v v und 0 5 mM IPTG auf 1 1 Gesamtvolumen induziert Die Expressionsbedingungen sind zusammenfassend in Tab 4 dargestellt Sp ter wurde der Stamm SG13009 pREP4 verwendet vgl 2 2 3 1 wodurch die Basisexpression nahezu auf Null gesenkt werden konnte Tab 4 Expressionsbedingungen f r Imp7 Induktionszeit Expressions erforderliche Expressions Stamm Indu
18. Antibiotika 1 30 bis 1 100 angeimpft Im Sch ttler werden die Zellen bei 37 C dem Temperaturoptimum f r E coli bis zu einer ODeoo von etwa 0 5 0 7 wachsen gelassen Zur Induktion der Proteinexpression wird die Zellsuspensionen mit IPTG in einer Endkonzentration von 0 5 bis ImM versetzt Nun werden die Zellen weiter sch ttelnd inkubiert bis eine OD6oo von 1 5 2 0 erreicht ist etwa 3 4 Stunden An diesem Punkt verl t die Kultur den logarithmischen Wachstumsbereich und geht in die station re Phase ber Bei Verwendung von 2YT Medium ist aufgrund des h heren N hrstoffangebots dieser Punkt erst sp ter bei einer ODsoo von 3 4 erreicht Die Zellen werden bei 8000 x g und 4 C 15 Minuten lang abzentrifugiert anschlie end einmal mit eiskaltem Lysispuffer z B PBS gewaschen und das Pellet bis zur Proteinaufreinigung bei 20 C gelagert Einige Proteine akkumulieren in E coli in sogenannten Zelleinschlussk rperchen engl inclusion bodies Es gibt mehrere M glichkeiten dies zu vermeiden Zun chst kann die Induktionstemperatur gesenkt werden um eine niedrigere Expressionsrate zu erreichen Zus tzlich kann 2 Glucose zugegeben werden um die Basisexpression des Zielproteins zu reprimieren Da n mlich das einklonierte Gen unter der Kontrolle eines Lac Promotors liegt wirkt ein Abbauprodukt der Lactose wie z B Glucose inhibierend auf die Repressorfreisetzung vom Promotor vor dem eigentlichen Gen Schlie lich k nnen andere Expr
19. Branson USA Branson USA Microfluidics USA Bandelin Berlin Beckman Coulter Krefeld Beckman Coulter Krefeld Beckman Coulter Krefeld Beckman Coulter Krefeld Beckman Coulter Krefeld Beckman Coulter Krefeld Beckman Coulter Krefeld Beckman Coulter Krefeld IKA Staufen Techne Minneapolis USA Eppendorf Hamburg Eppendorf Hamburg Sylvania Ohio USA BioRad Miinchen IKA Staufen Pipettierhilfe Accu Jet PCR Ger te AbiPrism 3100 DNA Sequencer Photometer Binokulare Mikroskop Axioskop 40 Fluoreszenzmikroskop Axioskop 20 Vortex GelDoc Geldokumentationsger t pH Meter Superloops Gelsch ttler Promax 1020 R ntgendiffraktometer RU H3R und Micromax 007 2 2 Methoden 2 2 1 Allgemeine Methoden 2 2 1 1 Mengenbestimmung von Proteinen Brand Wertheim Biometra G ttingen Applied Biosystems Darmstadt Biometra G ttingen Carl Zeiss Jena Carl Zeiss Jena Carl Zeiss Jena Sch tt G ttingen BioRad M nchen Beckman Coulter Krefeld Amersham Pharmacia Biotech Freiburg Heidolph Schwabach Rigaku Japan Die quantitative Bestimmung von Proteinl sungen erfolgt nach der Methode von Bearden 1978 In phosphosaurer L sung lassen sich Proteine mit dem Farbstoff Coomassie Brilliant Blue anf rben Die Proteinkonzentration kann mittels Absorption bei 595 nm photometrisch bestimmt werden da sich das Absorptionsspektrum des Farbstoffes in einem Bereich von ODs95 0 1 0 9 proportional zur
20. Das aufgereinigte Heterodimer aus Imp und Imp7 zeigte beim Import von H1 und H1 2 eine hohe Aktivit t bereits bei einer Konzentration von 0 5 uM die maximale Aktivit t wurde bei einer Konzentration von 1 uM erreicht vgl 3 3 und Abb 31 Auch dies deckt sich in etwa mit den Angaben in der Literatur J kel et al 1999 B uerle et al 2002 Da sich beim Import beide Histone bez glich des Importverhaltens mit dem Imp Imp7 Heterodimer in jeder Hinsicht gleich verhielten werden sie im Folgenden zusammenfassend als H1 bezeichnet Besonders bemerkenswert ist die Tatsache da sich das Imp Imp7 Heterodimer offensichtlich vor der Bindung an H1 gebildet haben mu um einen vollst ndigen Import vermitteln zu k nnen Wird n mlich zun chst nur einer der beiden Importrezeptoren mit dem Histon inkubiert so ergibt sich ein anderes Bild vgl 3 3 und Abb 31 Wird Imp mit dem Histon vorinkubiert so kann der Import des Substrats langsam rekonstituiert werden Der Import erreicht jedoch nie die Effizienz die das vorgebildete Heterodimer zeigt Wird hingegen Imp7 mit H1 vorinkubiert wird der Import des Substrats vollst ndig verhindert Stattdessen sind ausgedehnte Aggregate im gesamten Cytoplasma auff llig um die Kernmembran legt sich ein dichter Schleier aggregierten Substrats Die genaue Lokalisation des Schleiers also cytoplasmatisch oder nucle r ist nicht auszumachen Es k nnte sich hierbei auch um ein Artefakt infolge einer zu hoh
21. Histone B uerle et al 2002 neben DNA auch Protein RNA Komplexe und tRNA oder mRNA im Cytosol binden k nnen k nnte auch Hl im Cytosol tats chlich tRNAs mRNAs oder Protein RNA Komplexe binden Dies w rde eine weitere Bindung an Imp unm glich machen Die Bindung des Heterodimers an das Histon ist aber der erste Schritt im Import des Histons Erst nach der Bindung des Heterodimers kann es zur Translokation von Hl durch den NPC kommen Nach der Translokation des tern ren Komplexes mu dieser dissoziieren damit Hl seine Funktion als Linker Histon im Chromatin wahrnehmen kann vgl 1 3 5 Dies wirft die Frage auf wie und vor allem wo der tern re Importkomplex aus Imp Imp7 und dem Histon nach der Translokation durch den NPC im Karyoplasma dissoziieren kann Da n mlich die alleinige Bindung von Imp7 an Hl Aggregationen nicht verhindern kann k nnte man daraus folgern da der tern re Komplex bis zur Bindung des Histons an das Chromatin Bestand haben mu Dies stellt einen aber vor ein weiteres Problem Da die Translokation durch den Zentralkanal des NPC einem Affinit tsgradienten in Richtung Nucleus folgt Ben Efraim und Gerace 2001 wird am kernw rtigen Ende des Zentralkanals also am nuclear basket eine Bindung h chster Affinit t zwischen den Importrezeptoren und dem Nucleoporin Nup153 ausgebildet Ben Efraim und Gerace 2001 Bednenko 2003a Nup153 ist eindeutig am nuclear basket lokalisiert und geht nur Bindungen mit der K
22. Im Kern wird stetig RanGTP aus RanGDP erzeugt indem durch RCC1 engl regulator of chromosome condensation 1 der n tige Nucleotidaustausch katalysiert wird Bischoff und Postingl 1991 1995 Klebe et al 1995 Geyer et al 1999 RCC1 geh rt zu den RanGEFs engl Ran guanine nucleotide exchange factor M glicherweise sind am Nucleotidaustausch weitere Faktoren beteiligt n mlich nucle res RanBP1 und Mog engl multicopy suppressor of GSP1 Oki und Nishimoto 1998 Stewart und Baker 2000 Mogl wurde urspr nglich in Hefe entdeckt ein Ortholog gleicher Funktion ist zwischenzeitlich aber auch in Xenopus gefunden worden Nicolas et al 2001 Im Cytoplasma wird RanGTP abgebaut und damit RanGDP erzeugt Dies geschieht durch die gemeinsame Aktivit t von RanBP1 und RanGAPI1 Bischoff et al 1994 1995 Bischoff und G rlich 1997 welches teilweise an RanBP2 einem Protein der cytoplasmatischen Filamente des NPC situiert ist zu gro en Teilen aber auch frei im Cytoplasma vorkommt Mahajan et al 1997 1998 und die geringe intrinsische Hydrolyseaktivit t der GTPase erheblich steigert Bischoff et al 1994 RanBPl engl Ran binding protein 1 und RanGAPI Ran GTPase activating protein 1 binden vermutlich kooperativ an RanGTP und erh hen gemeinsam die Hydrolyserate von RanGTP um den Faktor 10 Bischoff et al 1995 Dadurch wird im Cytosol st ndig RanGTP angebaut w hrend es im Nucleus synthetisiert wird Der Transport von RanGDP i
23. Imp7 welches daher fr her eluiert Blau UV Absorption bei 280 nm Rot Leitf higkeit Das Eluat wurde durch SDS PAGE Abb 17 untersucht Die Fraktionen welche Imp7 enthielten wurden vereinigt und auf eine Proteinkonzentration von 10 mg ml 83 uM ankonzentriert Proteinbestimmung nach Bearden 1978 vgl 2 2 1 1 und 2 2 1 2 Geringe Verunreinigungen bestanden aus Proteinen mit einem Molekulargewicht von etwa 80 110 kDa sowie einem Protein von 60 kDa das wahrscheinlich HSP60 ist Heat shock protein 60 M 24 39 2 4 47 51 73 Imp7 ankonz Abb 17 SDS PAGE der ae Gelchromatographie von Imp7 ber 16 lt mp7 eine S200 Gelfiltrationss ule 72 Die Fraktionen 42 47 zeigen eine hohe w Reinheit von Imp7 Leichte Verun 66 4 gt eS is i ree reinigungen bestehen aus Proteinen mit Be f einem Molekulargewicht zwischen 80 427 gt f und 110 kDa sowie einer geringen Menge eines Proteins von etwa 60 kDa P m glicherweise HSP60 Fraktion 39 f enth lt ebenfalls Imp7 das vermutlich f dimerisiert ist vgl Abb 16 Die BEE f rechte Spur zeigt das ankonzentrierte f Endprodukt es wurden 8 ug aufgetragen Der Standard ist der 20 0 gt gleiche wie im linken Gel i M BR Marker die Zahlen repr sentieren die entsprechenden Fraktionen des Eluats vgl Abb 16 Die Ausbeute an Imp7 nach der Aufreinigung schwankte zwischen 3 und 9 mg aus einem Liter 2YT Kultur und betrug im Durchs
24. Promotor f r eine gerichtete Expression Gene f r die Inaktivierung von Antibiotika und schlie lich das Zielprotein Wichtig bei Klonierungen ist dass das Zielgen im Leseraster liegt F r die Proteinexpression beliebte Vektoren sind solche die aufw rts vom einklonierten Gen eine codierende Sequenz f r ein Peptid oder Protein besitzen das die sp tere Proteinaufreinigung erleichtert Solche Konstrukte sind z B N terminale GST Fusionsproteine in pGEX Vektoren N terminale MBP Fusionsproteine in pMAL Vektoren oder N oder C terminale His Sequenz Proteine in einigen pQE oder pET Vektoren 2 2 2 1 1 DNA Amplifizierung durch die Polymerasekettenreaktion PCR Die Polymerasekettenreaktion engl polymerase chain reaction PCR ist eine 1984 von Kary Mullis entwickelte Methode um DNA Sequenzen spezifisch zu amplifizieren F r die PCR werden kurze die gew nschte Sequenz flankierende 3 und 5 DNA Oligonukleotide kurz Oligos von etwa 20 bis 30 Basenpaaren L nge ben tigt sog primer die den Anfangs beziehungsweise Endpunkt der Sequenz definieren und als Startpunkt f r das Enzym DNA Polymerase dienen Zur Durchf hrung der PCR werden zu einer DNA L sung die die Zielsequenz besitzt ein Paar von Primern alle vier Desoxyribonucleosidtriphosphate dNTPs und eine hitzestabile DNA Polymerase z b aus Thermus aquaticus gegeben Ein PCR Zyklus besteht aus drei Schritten e Spaltung der DNA Doppelhelix f r die Hitzede
25. Proteinkonzentration ndert 20 ul Proteinprobe werden mit 1 ml 1 5 in Wasser verd nnter Bradfordreagens 1 mg ml Coomassie Brilliant Blue G 250 in 85 iger H3PO4 versetzt und nach 10 Minuten die Absorption bei 595 nm gegen einen Leerwert gemessen Aus dem Vergleich zu einer durch verschiedene Konzentrationen an BSA erstellten Standardkurve l sst sich die Proteinmenge der unbekannten Probe ermitteln 2 2 1 2 Ankonzentrieren von Proteinl sungen durch Zentrifugation Eine einfache Methode zum Ankonzentrieren von Proteinl sungen ist die Verwendung von sogenannten Centricons und Microcons Auf einen Zentrifugenbecher ist eine H lse gesteckt in deren unterem Drittel eine Membran mit bestimmter Porengr sse sitzt Diese Membran ist durchl ssig f r Wasser Ionen und kleine Molek le aber nicht f r Proteine die gr er als der Ausschluss der Membran sind Durch Zentrifugation 3 000 4 500 x g 4 C Zeit unterschiedlich k nnen Proteine auf diese Weise ankonzentriert werden In dieser Arbeit wurden Vivaspin Konzentratoren der Firma Vivascience verwendet 2 2 1 3 Gelelektrophoresen 2 2 1 3 1 Diskontinuierliche Polyacrylamid Gelelektrophorese von Proteinen SDS PAGE Die SDS Page nach L mmli et al 1970 wird zur analytischen und pr parativen Auftrennung von Proteinen benutzt Natriumdodecylsulfat ist ein Detergens das aus einer aliphatischen Kette von 12 Kohlenstoffatomen besteht und eine hydrophile Sulfatgruppe besitzt SDS lagert
26. hrt Beim Aufschlu im Sonifier wird die Zellsuspension auf Eis dreimal f r eine Minute sonifiziert Dabei werden folgende Einstellungen verwendet duty cycle 50 output control 7 Wenn sowohl Sonifier als auch Fluidizer benutzt werden wird erst mit Ultraschall dann im Fluidizer aufgeschlossen Nach dem Aufschluss der Zellen wird die Suspension in JA30 Zentrifugenr hrchen berf hrt und ultrazentrifugiert 100 000 x g 60 min 4 C Nach der Trennung des Lysats in Zelltr mmer und berstand wird mit dem berstand je nach Art des rekombinanten Proteins unterschiedlich verfahren vgl hierzu Aufreinigung von His markierten Proteinen und Proteinen ohne Affinit tssequenz 2 2 4 Biochemische Methoden 2 2 4 1 Chromatographische Trennmethoden 2 2 4 1 1 Affinit tschromatographie Die Affinit tschromatographie beruht auf spezifischen und reversiblen Interaktionen von S ulenmatrix und Molek l Abh ngig von der Beschaffenheit des S ulenmaterials und der Probe adsorbieren Molek le an die Matrix Das Adsorbens kann von der S ule durch kompetitive Verdr ngung Konformationswechsel durch pH Wert nderung oder durch nderung der lonenst rke eluiert werden Die Affinit tschromatographie stellt eine sehr spezifische und selektive Trennmethode f r Biomolek le dar 2 2 4 1 1 1 Affinit tschromatographische Trennung von Proteinen mit 6xHis Sequenz ber Ni NTA Sepharose Proteine die mit N oder C terminaler His Sequenz exprimier
27. import receptor with a novel domain structure EMBO J 17 14 4114 4126 Imamoto N Shimamoto T Kose S Takao T Tachibana T Matsubae M Sekimoto T Shimonishi Y Yoneda Y 1995 The nuclear pore targeting complex binds to nuclear pores after association with a karyophile FEBS Lett 368 415 419 Izaurralde E Kutay U von Kobbe C Mattaj I W G rlich D 1997 The asymmetric distribution of the constituents of the Ran system is essential for transport into and out of the nucleus EMBO J 16 6535 6547 Jakel S G rlich D 1998 Importin beta transportin RanBP5 and RanBP7 mediate nuclear import of ribosomal proteins in mammalian cells EMBO J 17 4491 4502 J kel S Albig W Kutay U Bischoff F R Schwamborn K Doenecke D G rlich D 1999 The importin B importin 7 heterodimer is a functional nuclear import receptor for histone Hl EMBO J 18 9 2411 2423 J kel S Mingot J M Schwarzmaier P Hartmann E G rlich D 2002 Importins fulfil a dual function as nuclear import receptors and cytoplasmic chaperones for exposed basic domains EMBO J 21 3 377 386 Jones D T 1999 Protein secondary structure prediction based on position specific scoring matrices J Mol Biol 292 195 202 Kalderon D Richardson W D Markham A F Smith A E 1984 Sequence requirements for nuclear location of simian virus 40 large T antigen Nature 311 33 38 Kl
28. mRNA bindend sind Die Tabellen 1 und 2 zeigen eine Auswahl einiger Import und Exportsubstrate und ihrer zugeh rigen Rezeptoren Tab 1 Importsignale und rezeptoren Importsubstrat Substratfunktion Importsignal Importrezeptor Proteine mit klassischer Breites Spektrum von T NLS PKKKRKV Impo Imp Komplex NLS Funktionen im Kern bpNLS KRPAAIKKAGQAKK l _K i A Lysin reich l U snRNP Splei en m3G cap Snurportin1 Imp Sm Dom ne Komplex l l n b Replikationsprotein A Replikation nicht bekannt RIPo Imp Komplex 70 kDa Untereinheit _ l l Linker Histon H1 Chromatinstruktur und zwei breite Dom nen Imp Imp7 Komplex funktion _basischer Aminos uren _ Core Histone Chromatinstruktur und ausgedehnte Dom ne Imp Imp5 Imp7 _ funktion _basischer Aminos uren Transportinl HIV 1 Rev virale RNA RQARRNRRRRWR Imp HTLV 1 Rex Exportfaktoren HIV 1 Tat viraler argininreiche _Transkriptionsfaktor Sequenzen l Integrase des RTC von Integration viraler DNA ausgedehnte Dom ne Imp7 HIV 1 in Wirtsgenom _basischer Aminos uren _ ribosomale Proteine Translation argininreiche Dom nen Imp Imp5 l l _Imp7 Transportin1 Cyclin B1 Zellzyklus Aminos uren 121 373 Imp Aminos uren 1 61 kein Faktor n tig in l l vitro 5S rRNA Translation ribosomales Protein L5 m gl Imp SR Protein SpleiBen _SR Dom ne _Transportin SR B Katenin Transkription nicht genau identifiziert kein Faktor n tig in arm repeats vitro
29. mittels SDS PAGE analysiert Die Proben die das Zielprotein enthalten werden gepoolt Der Pool wird f r weitere Aufreinigungsschritte bei 4 C gelagert Wasch Bindungspuffer Elutionspuffer 20 mM Tris HCl pH 7 5 20 mM Tris HCl pH 7 5 300 mM NaCl 300 mM NaCl 20 mM Imidazol 400 mM Imidazol 2 mM B Mercaptoethanol 2 mM B Mercaptoethanol 2 2 4 1 1 2 Affinit tschromatographische Trennung von Proteinen mit 10xHis Sequenz ber Ni NTA Sepharose F r die Aufreinigung von Proteinen mit 10xHis Sequenz werden dem berstand nach der Zentrifugation des Zellysats 20 mM Imidazol zugesetzt Da Imidazol stark basisch ist mu anschlie end der pH Wert auf 7 5 eingestellt werden Das weitere Verfahren ist der Aufreinigung von Proteinen mit 6xHis Sequenz analog au er dem Elutionspuffer Anstatt 400 mM Imidazol enth lt er 500 mM Imidazol 2 2 4 1 2 Ionenaustauschchromatographie Bei der Ionenaustauschchromatographie werden geladene Molek le nach ihrer Ionenst rke bei einem bestimmten pH Wert aufgetrennt Die Tr germatrix der Chromatographies ule bietet dabei Gegenionen als Bindungspartner f r die aufzutrennenden Molek le an Die Auftrennung erfolgt ber kompetitive Verdr ngung der Probemolek le durch st rkere Ionen im Elutionspuffer Bei Kationentauschern werden Kationen wie Na oder NH4 verwendet bei Anionentauschern Cl oder SO Schwach geladene Molek le eluieren fr her als stark geladene Auf diese Weise k nnen z B
30. ren warum die Bildung des Heterodimers aus Imp und Imp7 vor der Bindung von H1 essentiell ist und warum das Binden von Imp am Histon vor der Bindung von Imp7 dennoch einen Import erm glicht Weiterhin wird diese Hypothese durch die unterschiedlichen Bindungsaffinit ten von Imp Imp7 und dem Imp Imp7 Heterodimer zu H1 Histonen unterst tzt Die einzelnen Rezeptoren weisen eine deutlich geringere Affinit t zum Histon auf als das Heterodimer aus beiden Rezeptoren J kel et al 1999 Um mit diesem Modell der Konformations nderung von Imp7 nach Imp Bindung zu erkl ren warum Imp7 nach der Dissoziation von Imp eine Aggregation des Histons im Karyoplasma verhindern kann mu angenommen werden da durch die Konformations nderung der C terminalen Bindungsdom ne von Imp7 nach der Bindung von Imp diese sp ter also nach der Dissoziation von Imp auf eine andere n mlich sehr viel spezifischere Weise die globul re Dom ne von Hl binden kann Damit k nnte Imp7 H1 nun vor unerw nschten Interaktionen im Karyoplasma abschirmen Dies w re vor der Imp Bindung im Cytosol nicht m glich gewesen Daf r spricht da eine gro e Flexibilit t von Importrezeptoren vor und nach Substratbindung bereits durch Small Angle X Ray Scattering SAXS Experimente beobachtet werden Konnte Fukuhara et al 2004 Abb 36 zeigt die enorme Flexibilit t von Imp und Transportin einem weiteren Rezeptor der Imp Familie Pollard et al 1996 Es si
31. sehr beschr nkt aktiv W Albig 2004 pers nliche Mitteilung Dieser zweite Peak trat nicht in allen Aufreinigungen auf und wird daher als Artefakt betrachtet In anderen Aufreinigungen eluierte dimerisiertes Imp7 gemeinsam mit dem Monomer Die Pr senz von Imp7 in den Fraktionen des Eluats wurde mittels SDS PAGE verifiziert Abb 15 er Hip Sn Damien 131003 1_UV1_280m Hip Sn Dariellnp 131003 1_UW2 260m Hilrep Sm Dardelimp 131003 1 Care Hifrapsm Daniellup7131003 1_Bactims Abb 14 Chromatogramm der Affinit tschromatographie von Imp7 ber eine Ni NTA Sepharose S ule Bei der Elution von Imp7 treten zwei Peaks auf Die erste Fraktion von Imp7 eluiert zwischen 72 und 100 mM Imidazol die zweite zwischen 200 und 250mM Blau UV Absorption bei 280 nm Rot UV Absorption bei 260 nm Griin Elutionsgradient 100 400 mM Imidazol M vl ni P US 5 16 39 47 62 Abb 15 SDS PAGE der Affinit tschromatographie 158 116 mp von Imp7 ber eine Ni 972 er m ned NTA Sepharose S ule M BR Marker v I vor 66 4 gt amp Induktion nI nach 55 6 p Induktion P Pellet des Zellaufschlusses nach p Im Ultrazentrifugation S Uberstand des Zell gt aufschlusses nach Ultra En zentrifugation die Zahlen 26 6 stellen die Fraktionen des Eluats dar vgl Abb 14 u Die Fraktionen welche monomeres Imp7 enthielten wurden vereini
32. sei das Impa Imp Heterodimer genannt da es den funktionellen Rezeptor f r Substrate mit T NLS darstellt G rlich et al 1995a Imp stellt hier den funktionellen Importrezeptor dar Moroianu et al 1995 G rlich et al 1995b 1996a Imp a Moore und Blobel 1994 den Adapter f r das Substrat Weitere NLSs Sie bestehen h ufig ebenfalls aus basischen Sequenzabschnitten auf der Oberfl che der Transportsubstrate diese sind aber komplexer aufgebaut diffuser verteilt und daher h ufig nicht aus Sekund rstrukturvorhersagen abzuleiten Importsubstrate mit solchen NLSs sind z B ribosomale Proteine und Histone Der Import einiger dieser Proteine wird durch Importin 7 auch RanBP7 G rlich et al 1997a vermittelt Es bernimmt hier Rezeptorfunktionen beim Ein Rezeptor Weg vgl 1 2 4 kann aber auch als Corezeptor fungieren besonders im Verbund mit Imp vgl 1 2 4 Schlie lich gibt es weitere Substrate die sowohl ein NES als auch ein NLS besitzen Guiochon Mantel et al 1994 Die beiden Sequenzen lassen sich nicht immer voneinander trennen Die M9 Sequenz ist ein Beispiel f r ein solches bidirektionelles Lokalisationssignal Pollard et al 1996 Sie ist eine Dom ne aus etwa 40 in der Prim rstruktur nicht notwendigerweise benachbarter Aminos uren die reich an Glycin und aromatischen Seitenketten ist Pollard et al 1996 Bogerd et al 1999 Bidirektionelle Lokalisationssignale finden sich h ufig in Proteinen die
33. und Imp schlie lich etabliert werden konnte vgl 3 2 3 wurde der Vektor pET 21a Imp7 jedoch nicht f r eine weitere Subklonierung in einen Vektor mit anderer Affinit tssequenz verwendet 3 1 3 Aufreinigung von N His s Importin 7 3 1 3 1 Zellernte und Aufschlu Bei Ernte und Aufschlu wurde wie unter 2 2 3 5 angegeben verfahren Die nderungen die sich im Laufe der Arbeit ergaben sind im Folgenden angef hrt Lysispuffer 50 mM Tris HC1 pH 8 0 300 mM NaCl 4 v v Glycerin 2 mM B Mercaptoethanol Der Uberstand des Zellaufschlusses nach der Ultrazentrifugation wurde unmittelbar vor dem Beladen der Ni NTA Sepharose S ule durch einen Aufsatzfilter f r Spritzen mit einer Porengr e von 200 nm Durchmesser filtriert 3 1 3 2 Affinit tschromatographische Aufreinigung von Importin 7 F r die Affinit tschromatographie wurde eine HiTrapChelating Ni NTA Sepharose 5ml S ule von Amersham benutzt die Bedingungen entsprachen den unter 2 2 3 1 1 1 aufgef hrten Abb 14 zeigt ein typisches Elutionsprofil von Imp7 in der Affinit tschromatographie Auff llig ist das Auftreten zweier Peaks die beide Imp7 enthalten Nur der erste aber stellt aktives Protein dar da der zweite Peak berwiegend dimerisiertes Protein enth lt wie durch Gelfiltration nachgewiesen werden konnte nicht dargestellt Das dimerisierte Protein das zudem m glicherweise falsch gefaltet ist erwies sich im Import Assay vgl 2 2 5 und 3 3 als nur
34. war ein schwacher Import des Substrats zu erkennen Wurde hingegen das aufgereinigte Heterodimer vgl 3 2 3 2 in einer Konzentration von 1uM verwendet so war der Import von H1 sogar deutlich effektiver als in der Positivkontrolle mit Reticulocytenlysat wo cytoplasmatisches H1 noch deutlich detektiert werden konnte Das Heterodimer importierte das Histon so vollst ndig in den Nucleus da keinerlei cytoplasmatisches Substrat mehr vorhanden war Der Import berstieg bereits mit einer Imp Imp7 Konzentration von 0 5 uM das Niveau der Positivkontrolle Daten nicht gezeigt Retic rpL23a Negativ kontrolle rpL23a Imp rpL23a Imp7 rpL23a Abb 30 Import von rpL23a durch Imp und Imp7 Beide getesteten Importrezeptoren vermitteln einen deutlichen Import des Substrats Imp7 zeigt dabei eine h here Aktivit t als Imp Dies ist an der Fluoreszenz von cytoplasmatischem L23a beim Import durch Imp zu erkennen Beim Import von L23a durch Imp7 ist das Substrat fast vollst ndig im Nucleus Retic Reticulocytenlysat Konzentrationen Imp 0 8 uM Imp7 1uM L23a 0 5 uM DAPI FITC Retic Hl Negativ kontrolle Hl Impp Hl Imp7 Imp7 H1 Imp Impp Imp7 Hl Abb 31 Import des Linker Histons H1 durch das Imp Imp7 Heterodimer Wird Imp zuerst mit Hl inkubiert findet nur verminderter Transport statt Bei einer Vorinkubation von Imp7 und H1 ist kein H1 Import zu sehen Nur das vor
35. z B NaFormiat oder KFormiat anstelle von MgFormiat Schlie lich wurden auch die pH Werte und die Puffer ver ndert Das Rastern um die Bedingungen herum f hrten aber nicht zu einer neuen Kristallbildung Daher wurde Macro Seeding vgl 2 2 6 2 durchgef hrt um auf diese Weise neue Kristalle zu erzeugen Auch dies blieb jedoch ohne Ergebnis In etwa 70 80 der pipettierten Eingangsbedingungen war ein ausgepr gtes dunkelbraunes bis schwarzes Pr zipitat zu sehen Dies stellt in der Regel pr zipitiertes und vor allem denaturiertes Protein dar Daher wurden die Eingangstests mit frisch aufgereinigtem Imp7 wiederholt allerdings mit einer Konzentration von nur noch 2 5 mg ml 20 uM Imp7 im Tropfen Dadurch konnte die Pr zipitatbildung tats chlich signifikant gesenkt werden Denaturiertes Protein fand sich nur noch in etwa 35 aller Bedingungen Nach etwa einer Woche waren in Bedingung CS2 2 gr ere Aggregate zu sehen die klar und durchsichtig waren Auf ihnen wuchsen im Lauf der n chsten 3 Tage kleine Nadeln Abb 33 Abb 33 Kristallbildung in CS2 2 Aufnahme mit einer Digitalkamera und vorgespanntem Polarisationsfilter Es sind deutlich seeigelf rmige Gebilde zu erkennen Der Kern ist amorphes Protein auf diesem Kern wuchsen schmale Kristallnadeln Die langen dunklen Kristalle bestehen aus Izlt Proteinf rber der nach einem Tag lange kr ftige Nadeln bildete Bedingung im Tropfen 50 mM CTAB 0 25M NaCl 50mM MgCl
36. 03 A molecular switch between alternative conformational states in the complex of Ran and importin betal Nat Struct Biol 10 7 553 557 Nicolas F J Moore W Zhang C Clarke P R 2001 XMogl a nuclear Ran binding protein in Xenopus is a functional homologue of Schizosaccharomyces pombe Moglp that co operates with RanBP1 to control generation of Ran GTP J Cell Sci 114 3013 3023 Nigg E A Bauerle P A L hrmann R 1991 Nuclear import export in search of signals and mechanisms Cell 66 1 15 22 Oki M Nishimoto T 1998 A protein required for nuclear protein import Moglp directly interacts with GTP Gsplp the Saccharomyces cerevisiae Ran homologue Proc Natl Acad Sci USA 95 15388 15393 Ossareh Nazari B Bachelerie F Dargemont C 1997 Evidence for a role of CRM1 in signal mediated nuclear protein export Science 278 5335 141 144 Paine P L Moore L C Horowitz S B 1975 Nuclear envelope permeability Nature 254 109 114 Pante N Aebi U 1996 Molecular dissection of the nuclear pore complex Crit Rev Biochem Mol Biol 31 2 153 199 Paschal B M Gerace L 1995 Identification of NTF2 a cytosolic factor for nuclear import that interacts with nuclear pore complex protein p62 J Cell Biol 129 1649 1659 Pollard V W Michael W M Nakielny S Siomi M C Wang F Dreyfuss G 1996 A novel receptor mediated nuclear protein import pathway C
37. 4 C aufbewahrt Puffer f r die Aufreinigung von Importin Startpuffer Elutionspuffer 20 mM BisTris HCl pH 6 2 20 mM BisTris HCl pH 6 2 100 mM NaCl 1M NaCl 2 mM B Mercaptoethanol 2 mM B Mercaptoethanol 2 2 4 1 3 Ausschlusschromatographie Gelchromatographie Gelfiltration size exclusion Die Ausschlusschromatographie Gelfiltration trennt gel ste Molek le nach ihrer Gr sse auf Die hierbei verwendeten Chromatographies ulen bestehen aus einem por sen Gelmaterial mit definierter Porengr e Das Trennverhalten basiert auf dem unterschiedlichen hydrodynamischen Volumina der Probenmolek le Je nach Molek lgr e Molek lgestalt und gew hlten S uleneigenschaften dringen die Molek le unterschiedlich tief in die Gelmatrix ein Kleineren und globul ren Molek len steht mehr Raum zur Diffusion zur Verf gung als gr eren und ungeordneteren Daher erfahren kleinere Molek le durch das tiefere Eindringen in die Gelmatrix eine Verz gerung und eluieren sp ter von der S ule als gr ere Der Elutionspuffer selbst hat selbst ebenfalls einen Einfluss auf die Trennung der Molek le Entscheidend ist hierbei das L slichkeitsverhalten unterschiedlicher Molek le bei der Salzkonzentration des Puffers Die Ausschlu chromatographie ist daher eine beliebte Methode um Proteine nach den ersten Aufreinigungsschritten von Verunreinigungen zu befreien Die Aufl sung ist abh ngig von der Flu geschwindigkeit und dem aufgetragenen Probe
38. A280 Quotienten 2 2 1 7 Trocknen von Polyacrylamidgelen zwischen zwei Cellophanfolien Polyacrylamidgele k nnen zu Dokumentationszwecken auch zwischen zwei Cellophanfolien getrocknet werden Dazu wird auf einen Spannrahmen zun chst eine in Wasser eingeweichte Cellophanfolie gelegt dann das Polyacrylamidgel und anschlie end eine zweite in Wasser eingeweichte Cellophanfolie Das Gel mu gut entsalzt sein da sonst Verf rbungen auftreten Zwischen Gel und den Folien sowie zwischen beiden Folien soll sich keine Luftblase befinden um ein Einrei en des Gels zu vermeiden Nun wird ein zweiter Rahmen auf die Folien gelegt und mit Klammern fixiert Im Geltrockner bei etwa 70 C in hei er Umluft ist das Gel nach zwei Stunden getrocknet Bei Raumtemperatur ist das Gel nach 20 Stunden trocken und kann aus den Rahmen genommen und archiviert werden 2 2 2 Molekularbiologische Methoden 2 2 2 1 Klonierung von Proteinen in Expressionsvektoren Plasmide sind bei Bakterien nat rlich vorkommende ringf rmige DNA Molek le die zus tzliche Gene tragen und zwischen Bakterien ausgetauscht werden k nnen Es ist auch m glich solche Plasmide zu modifizieren und in Bakterien zu einzuschleusen Bei Klonierungen wird das Zielgen zun chst amplifiziert und anschlie end in einen geeigneten Vektor gebracht Das daraus resultierende Plasmid besitzt f r die nachfolgende Expression der eingebrachten Gene wichtige Eigenschaften wie zum Beispiel einen induzierbaren
39. BAAHAR AA HYFCEVEFKVDOITLOTALELTRRCLIDDREMPVKVEAAIA i 1 i 490 500 510 520 cont 11103932223 1113331 11 32332222522212231 Fredi EEE Jr Pred HHHHHHHCCCCHHHHHHHHHAHHHHHHHHHAHHHHC CHHHHHH AA LOVLISNOEKAKE YIVPFIRPVMQALLAIIRETENDDLTIT i i i 530 540 550 560 Abb 35a Sekund rstrukturvorhersage f r die Aminos uren 1 560 von Imp7 aus Xenopus laevis Die Vorhersage durch PSIpredict zeigt deutlich das massierte Auftreten von a Helices gr ne Balken in der Sekund rstruktur Sie bilden die f r ein Impf Familien Protein charakteristische periodische Abfolge von HEAT repeats Die H he der t rkis gef rbten Sockel ber den einzelnen Aminos uren gibt die Konfidenz der Vorhersage wider C Loop H Helix conz DOSE Pred Pred HHHHHAHHHAHAHAHHHHHAHHARHAHHHHHAHHHAHAHHHACCCCCCC AA VIQKMICE YSEEVTPIAVEMTOHLAMTFNOVIOTGPDEEG 570 580 530 600 cong Ja999099990999999999099a3929220999900090 Pred EEE Pred CCHHHHHHAHAHE AHAB AAR ACA AAA ARR A AA SDDKAVTAMGILNTIDTLLSVVEDBKEITOQLE GICLQOVI 610 620 630 640 cong J99999399900909099909993909993009990009at Pred E Pred HHHHACCHHHHHHHAHHAHRHAHHHAHCCCCCHHHHHHHHAHHRH AA GTVLOOHVLEFYEEIFSLABSLTCOQVSPOMROLLPLVEFD 650 660 670 680 cont 9915222222113131933233232333323132 23003 Pred u D o as Pred HHHACCCCHHHHHHHHRHAHHHCCCHHHRACCCCCHHHHAH AA IFOODGED YF TDMMPLLANYVTVDTDTLLSDTKYLEMI YS 630 700 710 720 cont J990903999092990999909999099939999359090 Pred
40. Co Kristallisation herangezogen werden Dadurch k nnte das Protein in seiner Konformation stabilisiert werden Denkbare Kristallisationspartner w ren neben dem Linker Histon H1 auch bekannte Bindungspartner wie das ribosomale Protein rpL23a J kel und G rlich 1998 und die Integrase aus dem Pr integrasekomplex von HIV 1 Fassati und Goff 2001 Fassati et al 2003 Daneben sollten auch Deletionsmutanten von Imp7 f r Kristallisationstests verwendet werden Dies k nnte das Problem der Flexibilit t einzelner Dom nen zueinander beseitigen Dabei sollten solche Deletionsmutanten benutzt werden deren Deletionen sich an den Schnittstellen orientieren die aus den Sekund rstrukturvorhersagen als unproblematisch f r den Erhalt der funktionellen Dom nen eingestuft werden k nnen Hierf r sollten vor allem Schnittstellen in Schleifen engl loops in Betracht kommen welche f r den Erhalt der Affinit t zum jeweiligen Substrat nicht essentiell sind Die Sekund rstrukturvorhersage von PSIpredict gibt einige Anhaltspunkte f r solche Deletionsschnittstellen Abb 35a und b Die Vorhersagen anderer Programme wie zum Beispiel nnpredict oder PROF sind sehr hnlich nicht dargestellt Die Deletionsmutanten sollten zun chst durch eine biochemische Charakterisierung der Funktionalit t in Bezug auf ihre jeweiligen Interaktionspartner verifiziert werden Hierbei sollte besonders der Erhalt der Affinit t zum Substrat und die Bindungskonstante des Rez
41. Die Gemeinsamkeit dieser Prozesse ist die basische Natur der Substrate Auf welche Weise Imp7 aber seine Substrate binden kann und in welcher Weise es mit Imp bei der kooperativen Bindung des Histons Hl interagiert ist noch unklar R ntgenkristallographische Untersuchungen sollen Licht ins Dunkel bringen und das Studium der Interaktionen und der beteiligten Dom nen der Bindungspartner erm glichen F r die Kristallisation von Imp7 ist eine zuverl ssige Expressions und Aufreinigungsmethode unerl lich Die Methodik mu so weit optimiert werden da die f r die Kristallisation n tigen Ausbeutemengen erreicht werden also mehrere Milligramm pro Aufreinigung Das f r Imp7 codierende Gen war bereits in den Vektor pQE 9 kloniert worden und wurde von Prof Dr D Doenecke zur Verf gung gestellt Der Vektor wurde in XL1 Blue vermehrt und durch eine Maxi Pr paration isoliert vgl 2 2 3 3 2 Er bietet den Vorteil einer N terminalen Sequenz aus sechs Histidinen welche eine affinit tschromatographische Aufreinigung von Imp7 erm glicht Ein weiterer Vorteil der His Sequenz besteht darin da es offensichtlich nicht notwendig ist die Sequenz durch einen Proteaseverdau abzuschneiden da auch andere Kernimportrezeptoren der Imp Familie insbesondere Fragmente von Imp selbst mit His Sequenz kristallisiert wurden Cingolani et al 1999 Vetter et al 1999 und Bayliss et al 2000 vgl 1 3 1 3 1 1 berexpression von Importin 7 in E
42. Es folgt Sterilfiltration 2 2 3 3 2 Transformation von chemisch kompetenten E coli Zellen Unter Transformation versteht man das Einschleusen von Plasmid DNA in Bakterienzellen Zu 50 ul kompetenter Zellen werden 20 ul Ligationsansatz oder 1 ug Plasmid DNA pipettiert und gemischt Die Zellen werden dann 20 Minuten auf Eis inkubiert F r die DNA Aufnahme werden die Zellen bei 42 C f r 60 Sekunden inkubiert und anschlie end 2 Minuten auf Eis belassen Nach Zugabe von 950 ul antibiotikafreiem LB Medium werden die Zellen 60 Minuten bei 37 C unter Sch tteln inkubiert 50 ul 100 ul und 200ul des Transformationsansatzes werden je auf einer Selektionsplatte ausgestrichen an der Luft getrocknet und die Platten umgedreht ber Nacht bei 37 C inkubiert 2 2 3 4 berexpression von rekombinanten Proteinen in E coli 2 2 3 4 1 Anzucht einer Vorkultur F r eine Bakterienkultur die zur berexpression von rekombinanten Proteinen herangezogen werden soll wird zun chst eine Vorkultur angezogen In einem Reagenzglas werden 10 ml LB Medium mit den Selektionsantibiotika versetzt und mit einem Abstrich einer bewachsenen Agarplatte angeimpft Bei 37 C wird die Kultur sch ttelnd f r 14 bis 16 Stunden inkubiert 2 2 3 4 2 Anzucht einer Expressionskultur Im Allgemeinen wird LB Medium im gew nschten Endvolumen z B 1 Liter mit den entsprechenden Antibiotika versetzt und mit einer vorbereiteten E coli Starterkultur ebenfalls in LB Medium mit
43. Expression Aufreinigung und Kristallisation des Kernimportrezeptors Importin 7 Diplomarbeit vorgelegt von Daniel Wohlwend aus M nchen angefertigt im Institut f r Mikrobiologie und Genetik an der biologischen Fakult t der Georg August Universit t zu G ttingen 2004 Referent Prof Dr Ralf Ficner Korreferent Prof Dr Ivo Feu ner Tag der Abgabe der Diplomarbeit 30 M rz 2004 Letzter Tag der m ndlichen Diplompr fung 10 Juli 2003 Danksagungen Achim Dickmanns f r zahlreiche Hilfestellungen Denkanst sse und Diskussionen Ralf Ficner f r eine gute Betreuung und f r sein gro es Verst ndnis wenn Probleme auftraten Anja Strasser f r ihre Unterst tzung bei der Laborarbeit und der Arbeit am Rechner Winfried Lendeckel f r seine Hilfe bei vielen anderen technischen Fragen Marie Henseleit f r alles 1 Einleitung 1 1 Der Zellkern Nucleus Eine eukaryotische Zelle zeigt im Vergleich mit Prokaryoten als evolutive Weiterentwicklung eine weitreichende Kompartimentierung Diese erzeugt weitgehend voneinander separierte Reaktionsr ume welche das effiziente Nutzen der zellul ren Ressourcen erm glichen indem sie Stoffwechselvorg nge r umlich voneinander trennen Daher k nnen Eukaryoten einen wesentlich differenzierteren Stoffwechsel aufbauen und zugleich ungewollte Substratzyklen auch futile cycles verhindern Der Zellkern Nucleus der Eukaryoten ist eines der wichtigsten Unterscheidungsmerkma
44. M D CHE Pred HHHRHAHCCCCCCHHHHRAHAHAHHHHAAHHACCCCCCCHHHAH AA MCKKILTGVAGED AECHAAKLLEVVILQCKGRGIDQVIPL 730 740 750 760 cont JQ99909900922999399909999099990939900000t Pred u eee Pred HHHRHAHHHHHHACCCCHRHHHAHHHHHHHAHHAHHRHHHHHCHHHARHRH AA FVEAALER LTREVKTSELRTMCLOVAIAALYYSPPLLFIT i i r i 770 780 790 800 cont 19999090009 a90000 99000099 0992250 000000001 Pred Dup E Pred HHACCCCCCCHHHHHHRHARHHC CCCCCCHHHHAHHARHRH AA LEITLRFPITTEEPVTIBFIKORLIDVDCF LGLHDRKICY LG r D 1 810 820 830 840 cont 1002923233333333532333233733333333173333334 Pred En Pred HHHHHHHHACCCHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHRHAH AA LCALIELEORPOVLIOMSSQILPAFLLLFITGLKRAYACHA 1 i 50 860 870 880 Cont Ja3a3329223373333333223333333332723277333 1 Pred B0 Pred accecccececee eece ecececcc ccc CCCCHAHAHAHAR AA EQENDSDDDGDGE DDEDAAELGS DEDDIDEEGQEYLEI LA 1 1 1 i 890 300 310 320 Cont J9000029000900909s099290909099 000000092001 Pred u SD Pred HHHHAACCCCCCCHAARACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCHAR AA KQAGEDGDDEDWE DDDAEETALE GYTTLLDDED TPIDE YQ 330 340 350 360 con MINI Pes aaao Pred HHHHRRRACCCCCHHHHAHHHCCCCHHHARRRAAHAHHHH AA IFKAIFOKLOGRDPVRYQALTOGLINEDOGKQLODIATLAD 970 980 990 1000 cont 191290222092233 gt 952322233223222222222338 Pred ee gt gt Pred HHHHHHAHARAHAACCEECCCCCCCCEECCCCCCCcCcce AA QRRAAHESKMIEKHGGYKFIAPV VP STF IF GIP AP GMT 1010 1020 1030 Lagend z helix Conk Jan it donfidence of peadi
45. Obwohl es im Rahmen dieser Diplomarbeit nicht gelungen ist Imp7 f r die R ntgenkristallographie in einer Form zu kristallisieren welche R ntgenbeugungsexperimente erm glicht konnten erste Bedingungen f r Imp7 gefunden werden in denen sich Nucleationskeime und kleine Kristalle bildeten vgl 3 4 Da das Imp Imp7 Heterodimer den funktionellen Importrezeptor f r das Linker Histon H1 darstellt sollte schlie lich die Bildung des tern ren Komplexes aus Imp Imp7 und H1 best tigt werden um die gewonnenen Erkenntnisse f r eine Aufreinigung des tern ren Komplexes zu nutzen damit dieser ebenfalls kristallisiert werden kann Aus dem Vergleich Der Strukturen von Imp7 dem Imp Imp7 Heterodimer und dem Imp Imp7 Hl Komplex lie en sich dann die strukturellen Ver nderungen von Imp7 in der Interaktion mit weiteren Bindungspartnern verfolgen Hierzu komplement r sollten auch einige Aspekte beim HI Import durch das Imp Imp7 Heterodimer durch den in vitro Import Assay charakterisiert werden Im Zentrum des Interesses stand hierbei die Untersuchung der Chaperonaktivit t von Imp7 beim Import des Histons Dies sollte die sp tere Analyse der Kristallstruktur des Imp Imp7 Heterodimers und des tern ren Komplexes aus Imp Imp7 und Hl erleichtern Es gelang die Rollen von Imp7 und Imp im Import des Histons H1 n her zu beleuchten Die gewonnenen Erkenntnisse konnten dazu herangezogen werden eine Hypothese zu entwickeln die das Modell des H1 Im
46. Proteine nativ nach ihrem isoelektrischen Punkt pI getrennt werden 2 2 4 1 2 1 Anionenaustauschchromatographie ber DEAE Sepharose zur Trennung geladener Proteine Der Substituent der DEAE Sepharose eine Diethylaminoethylgruppe besitzt relativ schwache kationische Eigenschaften da der positiv geladene Stickstoff von positiv induktiven Effekten seiner der Ethylgruppen profitiert Die Bindung von Anionen ist deshalb eher schwach und besonders selektiv Daher eignet sich die DEAE Sepharose gut f r den ersten Aufreinigungsschritt eines Proteins ohne Affinit tssequenz wenn noch sehr viele Verunreinigungen in der Probe sind Schwach geladene Molek le d h solche deren pl knapp ber dem Puffer pH zwischen 0 und 1 pH Einheiten dar ber liegt eluieren fr her st rker geladene d h jene deren pI den Puffer pH deutlich bersteigt eluieren sp ter Entscheidend f r eine erfolgreiche Aufreinigung ist daher die Wahl des pH Wertes im Elutionspuffer der etwa eine pH Einheit ber dem pl des aufzureinigenden Proteins sein sollte Die hier verwendete DEAE Sepharose FF von Amersham Pharmacia Biotech wurde in eine XK16 20 S ule gepackt Vor der Benutzung wird mit 5 S ulenvolumina Startpuffer quilibriert und anschlie end mit einem steigenden Salzgradienten eluiert Es werden 5 ml Fraktionen gesammelt die sp ter via SDS PAGE analysiert werden Die Fraktionen mit dem gesuchten Protein werden gepoolt und f r weitere Aufreinigungsschritte bei
47. Transport durch die Kernpore gesichert Die R ckgewinnung von nucle rem RanGTP erfolgt auf die gleiche Weise wie bei Importprozessen 1 3 Der Kernimportrezeptor Importin 7 1 3 1 Strukturelle Daten zu Importin 7 Importin 7 aus Xenopus laevis accession number RanBP7 U71082 ist ein Transport rezeptor von 1038 Aminos uren L nge und einem Molekulargewicht von 119 4 kDa Der berechnete isoelektrische Punkt liegt bei pH 4 6 Er geh rt zur Familie der Importin B hnlichen Transportrezeptoren G rlich et al 1997a und b Die systematische Einordnung nach PSIpredict ist wie folgt Stamm Scop Klasse All alpha Proteine Faltung alpha alpha Superhelix Superfamilie ARM repeat Proteine Familie HEAT repeat Proteine Wie alle Mitglieder der Imp Familie besitzt Imp7 neben dem niedrigen pI eine N terminale Ran Bindungsstelle die aus mehreren HEAT Huntingtin elongation A subunit TOR repeats besteht eine oder mehrere Nup Bindungsstellen deren Positionen unbekannt sind und offenkundig mehr als eine Substratbindungsstelle J kel und G rlich 1998 G rlich und Kutay 1999 Baake et al 2001 B uerle et al 2002 In Abb 7 ist die Struktur von Imp dargestellt um die einzelnen Merkmale von Proteinen der Imp Familie und Substratbindungsstellen zu illustrieren Die kristallographischen Daten stammen von Cingolani et al 1999 Vetter et al 1999 und Bayliss et al 2000 Die Imp Fragmente wurden jeweils mit His Tag kristall
48. V 7 2004Mrzl 20006 1_Bactiorns Eee DER DER 21 lalala bsbs lal lol k kalz kalas lasla kalzo kola lalol lashes lils lols Is lsa Isslselsslsslsn Ise Iso bole lale ls les leslerles lelro h lalala lsh bzlel lo m 10 20 20 30 30 ml Abb 28 Chromatogramm der Gelfiltration des tern ren Imp Imp7 H1 Komplexes Der Komplex eluiert bei einem Elutionsvolumen von etwa 170 ml Dies entspricht 220 ml auf der Skalierung da die Injektion der Probe bei 50 ml vorgenommen wurde Blau UV Absorption bei 280 nm M tern Kompl Abb 29 SDS PAGE der Gelfiltration des tern ren LAH E lt m7 Imp Imp7 H1 Komplexes Die Impr einzelnen Komponenten des tern ren Komplexes treten in einer 66 4 m gemeinsamen Fraktion der Gelfiltration auf Die in etwa gleichstarken Signale von Imp 42 7 gt und H1 deuten auf eine 1 1 St chiometrie hin Der deutliche Imp7 berschu resultiert aus der H1 Dimerisierung von Imp7 vor dem Pulldown Assay Die unterste gt Bande ist die Lauffront des loading dye M Marker tern Kompl Fraktion des tern ren Komplexes in der Gelfiltration 3 3 Der in vitro Import Assay als Aktivit tsnachweis f r Imp Imp7 und das Imp Imp7 Heterodimer Zum Nachweis der Aktivit t der aufgereinigten Kernimportrezeptoren Imp Imp7 und des aus der Co Affinit tsaufreinigung gewonnenen Imp Imp7 Heterodimers wurde der in vitro Import Assay herangezogen da er den effizie
49. ammer gespannt und oberes und unteres Reservoir mit SDS Laufpuffer gef llt Der Kamm wird vorsichtig gezogen und die Probentaschen mit Puffer gesp lt um Gelreste zu entfernen Die Proteinproben werden 1 1 v v mit Laemmli Puffer versetzt bei 95 C f r drei bis f nf Minuten aufgekocht und in die Taschen des Gels geladen F r die Analyse von Zellsuspensionsproben mittels SDS PAGE wird 1 ml Kultur abzentrifugiert mit OD x 0 2 ml 2xLaemmli Puffer versetzt und anschlie end 10 min bei 95 C aufgekocht F r den Gr envergleich wird ein Proteingr enstandard mit aufgetragen Nach dem Auftragen auf das Gel werden die Proteine bei einer geringen Stromst rke ca 25 30 mA im Sammelgel zu einer schmalen Bande fokussiert und dann separiert Trenngelpuffer 5x Sammelgelpuffer 5x 1 88 M Tris HCl pH 8 8 0 625 M Tris HCl pH 6 8 0 5 w v SDS 0 5 w v SDS Proteinlaufpuffer 192 mM Glycin 25 mM Tris HCl pH 8 3 0 1 w v SDS 2x SDS Probenpuffer Laemmli Puffer 62 5 mM Tris HCl pH 6 8 70 mM SDS 50 v v Glycerin 0 1 v v Bromphenolblau Stamml sung 1 v v in EtOH abs 5 v v B Mercaptoethanol Ansatz fiir ein Sammelgel Volumen 2 ml Acrylamid Bisacrylamid 30 0 33 ml Ammoniumperoxodisulphat 10 ul TEMED 2 ul Aq bidest 1 26 ml Trenngelpuffer 0 4 ml Ansatz fiir ein Trenngel Volumen 6 ml Geldichte des Trenngels 10 15 Acrylamid Bisacrylamid 30 2 ml
50. an Nup153 am Ende der Kernpore Durch die Bindung von RanGTP an Imp dissoziiert das Imp7 H1 Heterodimer vermutlich von Imp Ob die RanGTP Bindung allerdings tats chlich direkt f r das Abl sen von Nup153 verantwortlich ist oder ob diese Dissoziation zu einem sp teren Zeitpunkt geschieht mu erst noch untersucht werden In seiner vierten Konformation ist Imp7 durch die vorangegangene Positionierung seiner sauren Loops durch Imp nun in der Lage die basische Oberfl che des Histons vollst ndig abzuschirmen und als Chaperon zu fungieren Schlie lich l st sich das Histon und bindet aufgrund seiner h heren Affinit t zu DNA als zu Imp7 an ein Nucleosom im Chromatin Die Bindung von RanGTP an Imp7 erniedrigt dabei die Affinit t von Imp7 zum Histon und beschleunigt damit die Dissoziation Zus tzlich gew hrleistet die Bindung von RanGTP den Reexport des Rezeptors Da mehrere Konformationen von Imp7 und Imp w hrend des H1 Imports auftreten kann aufgrund der zuvor angef hrten Argumente als sicher angesehen werden Um die formulierte Hypothese f r den Mechanismus der Substratbindung und frei setzung berpr fen zu k nnen m ssen die m glichen Zwischenprodukte des Imports zun chst biochemisch charakterisiert werden Die Bindung von H1 Histonen an cytosolische Bestandteile wie z B tRNAs mRNAs und RNA Proteinkomplexen nach der Bindung an entweder Imp oder Imp7 k nnte in vitro berpr ft werden z B ber einen Pulldown A
51. ann mittels Macro Seeding das Kristallwachstum fortgesetzt werden Hierzu werden Kristallisationskeime aus dem ersten Tropfen mithilfe eines Katzenschnurrhaares in neue Tropfen berf hrt ges t Deren Inhalte sind analog zum ersten mit einer Ausnahme Entweder die Pr zipitans oder die Proteinkonzentration m ssen in diesen Tropfen gegen ber dem ersten verringert sein da es sonst zu einer sofortigen Pr zipitation des Proteins in den neuen Tropfen kommen kann 2 2 6 3 Micro Seeding zur Verbesserung der Kristallordnung Wenn sich Kristalle formiert haben die ung nstige innere Ordnung haben d h da sie z B von unregelm iger Gestalt und geringer Aufl sung im R ntgendiffraktometer sind so k nnen Bruchst cke dieser Kristalle in verd nnten L sungen z B 1 200 in einer frischen Proteinl sung Kristallisationskeime f r Kristalle h herer Ordnung sein Beim Micro Seeding werden die Kristallisationskeime wie beim Macro Seeding mit Katzenschnurrhaaren in neue Tropfen berf hrt Auch hier gilt da entweder Pr zipitans oder Proteinkonzentration verringert sein sollten 2 2 6 4 Rontgenbeugungsexperimente F r die Durchf hrung eines R ntgenbeugungsexperimentes mit einem Proteinkristall wird dieser in einem R ntgendiffraktometer mit R ntgenstrahlen beschossen die durch die Elektronen im Kristallgitter abgelenkt werden Da im Kristallgitter sich jede Struktur die gr er als die Einheitszelle ist
52. as Verhalten von Imp7 und Imp beim Import des Linker Histons H1 durch den in vitro Import Assay n her beleuchtet werden Bei diesem Importweg nimmt Imp7 zus tzlich die Aufgabe eines Chaperons war Es wurde eine Hypothese entwickelt wie Imp7 diese Rolle beim abschlie enden Transport des Histons von der Kernpore zur chromosomalen DNA erf llen k nnte Durch die initiale Bindung von Imp vor der Substratbindung im Cytosol wird in Imp7 ein conformational switch umgelegt wodurch unspezifische Interaktionen der C terminalen Bindungsdom ne von Imp7 f r Hl mit dem Histon verhindert werden Dabei wird die Voraussetzung geschaffen da nach der Dissoziation von Imp am nuclear basket oder im Karyoplasma diese Dom ne von Imp7 nun in spezifischer Weise die basischen Regionen auf der Oberfl che von H1 vor Interaktionen mit Bestandteilen des Karyoplasmas sch tzen kann Nach dieser Hypothese w re die Chaperonaktivit t von Imp7 beim Import von Hl also Imp abh ngig 5 Summary The nuclear import receptor importin 7 is a major component of the nuclear import machinery of many of the higher eukaryotes Besides its role as a receptor for the nuclear import of ribosomal proteins imp7 fulfils an additional function as a co receptor with imp during import of substrates with extended basic surfaces Thus imp7 differs from classical adapters such as Impa A special function of imp7 is its chaperoning activity during the import of basic karyophilic
53. ces und hydrolysieren die Phosphodiesterbindungen an spezifischen Stellen Man findet diese Enzyme in Prokaryoten dort dienen sie dem Abbau von Fremd DNA die eigene DNA bleibt aufgrund eines bestimmten Methylierungsmusters ungespalten Restriktionsendonucleasen haben f r das Klonieren von DNA gro e Bedeutung gewonnen Ihre bemerkenswerteste Eigenschaft besteht darin Sequenzen mit zweifacher Rotationssymmetrie sogenannte Palindrome zu erkennen und so zu spalten dass berh ngende DNA Enden sticky ends entstehen Diese berh ngenden DNA Enden hybridisieren leicht mit komplement ren Enden und erm glichen so das gerichtete Einklonieren in mit den gleichen Enzymen ebenfalls zu sticky ends geschnittene Vektoren Die Restriktionsanalyse von Plasmiden aus Midi und Maxi Preps vgl 2 2 4 3 dient der Gr ssenanalyse der vorhandenen Fremdgene Ein typischer Ansatz von 20 ul enth lt l ug DNA 2 ul Restriktionsenzympuffer 10x 0 5 ul entspricht 1 U Restriktionsendonuclease f r 3 Schnittstelle 0 5 ul entspricht 1 U Restriktionsendonuclease f r 5 Schnittstelle 0 2 ul BSA 100x wird nur bei einigen Enzymen ben tigt H20 ad 20 ul Der Ansatz wird fiir eine Stunde bei 37 C inkubiert AnschlieBend werden die geschnittenen Fragmente im Agarosegel vgl 2 2 1 4 2 analysiert und gegebenenfalls fiir folgende Klonierungen aus dem Gel ausgeschnitten und eluiert vgl 2 2 1 5 2 2 2 1 3 Ligation eine
54. ch USA Jena Bioscience Jena Dr Susana Andrade G ttingen Dr Markus Rudolph G ttingen Dr Markus Rudolph G ttingen Prof Dr Ralf Ficner Millipore USA Merck Darmstadt Henkel Aachen Eppendorf Hamburg Falcon Deutschland Kobe Marburg Greiner sterreich Hampton Research USA Marienfeld Lauda K nigshofen American National Can USA Eppendorf Hamburg Sarstedt N mbrecht Vivascience Hannover JA30 Zentrifugenr hrchen Zentrifugenbecher 11 500 ml 2 1 12 Ger te kta Prime kta Purifier Autoklav HST 4 5 8 Frac 900 Fraktionierer Unitron Sch ttelinkubatoren Innova 4230 Sch ttelinkubator Brutschrank Mytron Rotationssch ttler Gelelektrophoresekammern Sonifier 250 Microtip 102 C Microfluidizer 110 S Ultraschallbad Sonorex Super RK 510 Zentrifuge Avanti J 20 XPI Zentrifuge Avanti JA 20 Zentrifuge Avanti J 30 I Zentrifuge Allegra 21R Rotor JLA 8 1000 Rotor JA 20 Rotor JA 30 50 Ti Rotor 4180 Heizbad Heizblock Dri Block CB 2A Thermomixer comfort Tischzentrifuge 5415 R Tischzentrifuge Micro centrifuge II Geltrockner Gel Air Dryer Magnetr hrer IKAMAG REO Beckman Coulter Krefeld Beckman Coulter Krefeld Amersham Pharmacia Biotech Freiburg Amersham Pharmacia Biotech Freiburg Zirbus Bad Grund Amersham Pharmacia Biotech Freiburg Infors Einsbach New Brunswick Scientific N rtingen Sch tt G ttingen Karl Hecht Staufen Biometra G ttingen BioRad Deutschland
55. chnitt etwa 4 5 mg l Kultur Die durchschnittlichen Proteinausbeuten nach den einzelnen Aufreinigungsschritten zeigt Tab 5 Tab 5 Zusammenfassung der Proteinausbeuten nach den jeweiligen Aufreinigungsschritten Aufreinigungs Affinit ts Ankon Ankon Gelfiltration schritt chromatographie zentrieren zentrieren durchschnittliche Proteinmenge 7 5 6 8 5 4 5 mg l 2YT Kultur Parallel wurde die Expression und Aufreinigung nach gleichem Schema allerdings mit geringerer IPTG Konzentration 100 uM f r Imp7 im Vektor pQE 80Ndecahis durchgef hrt Der Vektor mit dem Gen f r Imp7 wurde von Prof Dr Dirk G rlich zur Verf gung gestellt Imp7 wird in diesem Vektor mit zehn N teminalen Histidinen exprimiert Daher eluiert es sp ter von der Ni NTA Sepharose bei etwa 200 mM Imidazol Daten werden nicht gezeigt Die Aufreinigungsergebnisse waren sowohl in Bezug auf die Ausbeute als auch auf die Reinheit mit pQE 9 vergleichbar so da f r die Kristallisation weiterhin der Vektor pQE 9 verwendet wurde 3 2 Expression und Aufreinigung von rekombinantem Importin B aus Homo sapiens ohne Affinitats Sequenz Der Kernimportrezeptor Imp ist der Namenspate der Imp Proteinfamilie vgl 1 2 3 und 1 3 1 Humanes Imp besitzt ein Molekulargewicht von etwa 97 kDa und ist 876 Aminos uren lang Da humanes Imp nicht nur als Bindungspartner von humanem sondern auch von Xenopus Imp7 bekannt ist sollte neben der Expression
56. coli F r die Expression von Imp7 in E coli wurde zun chst ein geeigneter Expressionsstamm gesucht Dazu wurden mehrere St mme HB101 TG 1 HMS 174 LysS BL21 DE3 LysE XL1 Blue M15 DH5a mit dem Vektor transformiert und auf Selektionsplatten ausgestrichen vgl 2 2 3 3 Die St mme XL1 Blue HB101 und DHSa sind eigentlich f r die Plasmidvermehrung und nicht f r die Proteinexpression bestimmt wurden aber zur Sicherheit dennoch getestet Von den Platten wurden kleine Kulturen in 10 ml LB Medium vgl 2 2 3 4 1 angeimpft und f r jeden Stamm im kleinen Ma stab mehrere Expressionsbedingungen Temperatur und Induktionszeit getestet Induziert wurde mit 0 5 mM IPTG sobald die Kulturen eine von 0 6 erreicht hatten Die Induktionsdauer betrug 3 7 Stunden die Kulturen hatten in dieser Zeit i d R eine ODgo0 von 1 5 nach 3 h bis 2 7 nach 7 h erreicht Es wurden jeweils Zellsuspensionsproben unmittelbar vor der Induktion und vor der Ernte genommen und per SDS PAGE auf eine Expression von Imp7 untersucht vgl 2 2 1 3 1 Die Suche nach dem richtigen Stamm gestaltete sich schwierig da die meisten St mme Voll ngen Imp7 entweder gar nicht oder nur in sehr geringen l slichen Mengen produzierten Die Bildung von inclusion bodies war ein gro es Problem Es stellte sich aber heraus da der Stamm E coli SG13009 in der Lage war Imp7 in gr eren Mengen l slich zu exprimieren Ein Vergleich der Expressionsniveaus einiger ausgew hlter St mme m
57. ction p ateand Peed predicted setondacy steuctuce evil Ah tecget sequence Abb 35b Sekundarstrukturvorhersage f r die Aminos uren 561 1038 von Imp7 aus Xenopus laevis Am C Terminus von Imp7 f llt besonders das Auftreten zweier langer Loops von aa 882 912 und von aa 927 957 auf Sie sind jeweils besonders reich an sauren Aminos ureresten Die Bindungsdom ne f r Imp also etwa die letzten 30 Aminos uren zeigt keine besonderen Sekund rstrukturelemente Die vorhergesagten Faltbl tter k nnen aufgrund ihrer K rze vernachl ssigt werden Gr ne Balken sind Helices gelbrote Pfeile sind Faltbl tter die H he der t rkisfarbenen Sockel stellt die Konfidenz der Vorhersage dar H a Helix E B Faltblatt C Loop Importin B RanGTP Importin B IBB Abb 36 Molekulare Umrisse von Importinen in ungebundenem Ran GTP gebundenem und substratgebundenem Zustand A Transportin SAXS ab initio Rekonstruktionen von ungebundenem Transportin links Ran GTP gebundenem Transportin Mitte und M9 gebundenem Transportin rechts sind in rot dargestellt und zeigen alle eine hnliche Gestalt In der Mitte ist in schwarz die Kristallstruktur von Ran GTP Transportin dar ber gelegt links und rechts jeweils die Kristallstruktur von ungebundenem Transportin B Importin SAXS ab initio Modelle von ungebundenem links und Ran GTP gebundenem Mitte Imp sind in gr n dargestellt und zeigen da Imp gro e Konformations nderun
58. det sich im unstrukturierten C terminalen Teil des Histons und ist reich an basischen Aminos ureresten Sie wird durch mehrere Importrezeptoren erkannt wie z B Transportin1 Imp5 RanBP5 und Imp7 B uerle et al 2002 Die zweite Dom ne hingegen liegt zentral enth lt nur wenige basische Aminos uren und wird ausschlie lich durch Imp erkannt Jedoch ist kein Rezeptor allein in der Lage Hl zu importieren Hierf r wird das ImpB Imp7 Heterodimer ben tigt Nach Bildung des ImpB Imp7 Heterodimers im Cytoplasma kann dieses das Linker Histon H1 binden und anschlie end als tern rer Komplex den NPC durchqueren Abb 9 Bei der Bindung des Komplexes an den NPC kommt Imp eine entscheidende Rolle zu w hrend Imp7 zun chst eine passivere Rolle einzunehmen scheint Nach der Translokation deren Vorgang gegenw rtig noch nicht genauer untersucht ist induziert die Bindung von RanGTP an Imp das Freisetzen des bin ren Komplexes Imp7 Hl in das Karyoplasma J kel et al 1999 Imp7 bernimmt hierbei offensichtlich eine Chaperonfunktion indem es nun die Oberfl che des Histons vor Interaktionen mit karyoplasmatischen Bestandteilen und dem Karyoplasma selbst durch Abschirmung sch tzt J kel et al 1999 J kel et al 2002 Dieser Komplex wandert nun zum Chromatin wo H1 seine Funktion aufnehmen kann Die Freisetzung des Histons von Imp7 wird vermutlich durch eine Bindung von Imp7 an RanGTP ausgel st so da nach dem Reexport beider bete
59. e Imp spezifisch bindet k nnte dabei sterisch durch Imp7 teilweise verdeckt sein so da diese verfr hte Bindung von Imp7 einen Teil der globul ren Bindungsdom ne f r Imp irreversibel unzug nglich macht Da aber zur vollst ndigen Abschirmung der basischen Oberfl che des Histons die Bindung von zwei Rezeptoren erforderlich ist J kel et al 1999 B uerle et al 2002 h tte dies unweigerlich ungewollte Interaktionen mit Bestandteilen des Cytosols zur Folge Zweitens w re es vorstellbar da die globul re Dom ne nicht von Imp7 sondern von unspezifischen Interaktionspartnern von Hl im Cytosol nach der Bindung an Imp7 verdeckt w rde Auch hier k nnte Imp nicht mehr binden Die dritte M glichkeit besteht darin da Imp doch binden k nnte weil die globul re Dom ne berhaupt nicht abgeschirmt w rde Da aber das Histon schon mit anderen Bindungspartnern aggregiert w re k nnte es durch die Bindung von Imp nicht mehr gel st werden Die erste M glichkeit ist wohl die wahrscheinlichste weil die globul re Dom ne tats chlich nicht nur die Bindungsdom ne f r Imp darstellt was die dritte M glichkeit mit hoher Wahrscheinlichkeit ausschlie t Sie ist auch eine Bindungsdom ne f r den typischen Interaktionspartner des Histons n mlich chromosomale DNA Hayes et al 1996 Pruss et al 1996 Da in fr heren Arbeiten festgestellt wurde da Core Histone Baake et al 2001 M hlh usser et al 2001 und auch Linker
60. ebe C Bischoff F R Posting H Wittinghofer A 1995 Interaction of the nuclear GTP binding protein Ran with its regulatory proteins RCC1 and RanGAP1 Biochem 34 2 639 647 Lanford R E Butel J S 1984 Construction and characterization of an SV40 mutant defective in nuclear transport of T antigen Cell 37 801 813 Lanford R E Kanda P Kennedy R C 1986 Induction of nuclear transport with a synthetic peptide homologous to the SV40 T antigen transport signal Cell 46 575 582 Lorenzen J A Baker S E Denhez F Melnick M B Brower D L Perkins L A 2001 Nuclear import of activated D ERK by DIM 7 an importin family member encoded by the gene moleskin Development 128 8 1403 1414 Mahajan R Delphin C Guan T Gerace L Melchior F 1997 A small ubiquitin related polypeptide involved in targeting RanGAP1 to nuclear pore complex protein RanBP2 Cell 88 1 97 107 Mahajan R Gerace L Melchior F 1998 Molecular characterization of the SUMO 1 modification of RanGAP1 and its role in nuclear envelope association J Cell Biol 140 259 270 Mattaj I W Englmeier L 1998 Nucleocytoplasmic transport the soluble phase Annu Rev Biochem 67 265 306 McGuffin L J Bryson K Jones D T 2000 The PSIPRED protein structure prediction server Bioinformatics 16 404 405 Melchior F Paschal B M Evans J Gerace L 1993 Inhibition of nuclear protein import by
61. edingungen Nucleationskeime entstanden Die gebildeten Kristalle waren stets von der gleichen Form wie jene welche sich auch in den anderen Bedingungen gebildet hatten Da die einzige Gemeinsamkeit aller Bedingungen der Zusatz von Imp7 ist sind die gebildeten Kristalle h chstwahrscheinlich Proteinkristalle Daf r spricht auch da in den Screens um CS2 2 ausschlie lich klares amorphes Protein zu beobachten war Dies ist ein Anzeichen daf r da die Bedingung zur Kristallformation geeignet sein kann M Rudolph und O Einsle 2004 pers nliche Mitteilung Die Co Kristallisation von Imp7 mit Imp gelang nicht es war auch bislang keinerlei Kristallbildung zu beobachten Allerdings wurden vor dem Pipettieren der Co Kristallisationsans tze beide Importrezeptoren nicht gemeinsam aufgereinigt sondern lediglich vor dem Pipettieren quimolar gemeinsam inkubiert vgl 3 4 2 So konnte nicht sichergestellt werden da das Imp Imp7 Heterodimer in ausreichender Konzentration vorlag um die Kristallisationstropfen in den Zustand der bers ttigung zu berf hren Nur dann aber kann es zur Bildung von Nucleationskeimen kommen Die Co Affinit tsaufreinigung sollte die richtige Methode sein um dieses Problem zu beseitigen Da Imp7 offensichtlich eine sehr hohe Flexibilit t aufweist Fukuhara et al 2004 eine zu hohe um leicht kristallisiert werden zu k nnen sollten neben Imp in Zukunft noch weitere Substrate von Imp7 f r eine
62. ei um dimerisiertes Imp7 handeln k nnte da ein hnliches Verhalten ebenso von Imp bekannt ist A Dickmanns 2003 pers nliche Mitteilung In der SDS PAGE konnte dieser Peak als Imp7 identifiziert werden vgl Abb 17 Das Dimer dissoziierte nur zu einem geringen Teil durch die Inkubation mit Imp was darauf hindeuten k nnte da auch monomeres aber falsch gefaltetes Imp7 in diesem Peak vertreten war Daten nicht gezeigt Aus diesem Grunde wurden nur die Fraktionen des zweiten Imp7 Peaks vereinigt und ankonzentriert Die Verunreinigungen im Produkt machten insgesamt deutlich weniger als 5 des Gesamtproteins aus vgl Abb 17 Die Reinheit und die Ausbeute waren also f r die Kristallisation ausreichend Bei der Verwendung des Vektors pQE 80Ndecahis Imp7 ergab sich ein vergleichbares Bild Von seiner weiteren Verwendung wurde abgesehen da die ersten Kristallisationsbedingungen in denen sich Nucleationskeime gebildet hatten mit His s Imp7 pipettiert worden waren der Vektor pQE 80Ndecahis Imp7 aber f r His o Imp7 codiert 4 2 Expression und Aufreinigung von rekombinantem Importin B Um das Imp Imp7 Heterodimer f r die Kristallisation in hochreiner Form zu gewinnen bestand eine M glichkeit darin rekombinantes Imp ohne Affinit tssequenz zu exprimieren und aufzureinigen So w rde eine Co Affinit tsaufreinigung zur Gewinnung beider Rezeptoren als hochreines Dimer m glich 4 2 1 Expression und Aufreinigung von rekomb
63. ell 86 985 994 Pruss D Bartholomew B Persinger J Hayes J Arents G Moudrianakis E N Wolffe A P 1996 An asymmetric model for the nucleosome a binding site for linker histones inside the DNA gyres Science 274 614 617 Reichelt R Holzenburg A Buhle E L Jr Jarnik M Engel A Aebi U 1990 Correlation between structure and mass distribution of the nuclear pore complex and of distinct pore complex components J Cell Biol 110 883 894 Ribbeck K Lipowsky G Kent H M Stewart M G rlich D 1998 NTF2 mediates nuclear import of Ran EMBO J 17 22 6587 98 Ribbeck K G rlich D 2001 Kinetic analysis of translocation through nuclear pore complexes EMBO J 20 6 1320 1330 Robbins J Dilworth S M Laskey R A Dingwall C 1991 Two independent basic domains in nucleoplasmin nuclear targeting sequence identification of a class of bipartite nuclear targeting sequence Cell 64 615 623 Rout M P Blobel G 1993 Isolation of the yeast nuclear pore complex J Cell Biol 123 771 783 Rout M P Blobel G Aitchinson J D 1997 A distinct nuclear import pathway used by ribosomal proteins Cell 89 715 725 Rout M P Aitchinson J D Suprapto A Hjertaas K Zhao Y Chait B T 2000 The yeast nuclear pore complex Composition architecture and transport mechanism J Cell Biol 148 635 651 Schwamborn K Albig W Doenecke D 1998 T
64. en Substratkonzentration handeln Ein berschu des Histons w rde ebenso zu ausgepr gten Aggregationen f hren Dasselbe Bild wurde aber schon in der Arbeit von B uerle 2002 beobachtet so da angenommen werden kann da es sich hierbei nicht um ein Artefakt sondern vielmehr um die tats chliche Verhinderung eines Imports handelt Besonders in Hinblick auf die postulierte Rolle von Imp7 als Chaperon f r Hl w hrend des Imports J kel et al 1999 B uerle et al 2002 ist dies bemerkenswert Es ist bekannt da H1 zwei NLS Dom nen besitzt eine zentrale globul re und eine C terminale die reich an basischen Aminos uren ist Schwamborn et al 1998 Imp ist der einzige bekannte Importrezeptor der an die globul re Dom ne des Histons binden kann Imp7 geh rt neben anderen wie z B auch Imp5 zu den Rezeptoren die das C terminale NLS binden k nnen B uerle et al 2002 Eine alleinige Bindung an das C terminale NLS reicht selbst nach sp terer Zugabe von Imp wie der Import Assay mit Vorinkubation von Imp7 und H1 zeigt vgl Abb 31 nicht aus um cytoplasmatische Aggregationen zu verhindern da das Histon Interaktionen mit cytoplasmatischen Proteinen oder Nucleins uren eingeht J kel et al 2002 Es gibt drei M glichkeiten wie dieses Ergebnis interpretiert werden kann Die erste besteht darin da nach vorzeitiger Bindung von Imp7 an das Histon dieses nicht mehr an Imp binden kann Die globul re NLS Dom ne an di
65. entrationsgradient an Salzen und Pr zipitantien zwischen Tropfen und Reservoir da der Tropfen neben dem Protein nur 50 der Salz und Pr zipitans Konzentration des Reservoirs enth lt Durch Diffusion des Wassers aus dem Tropfen in das Reservoir wird der Tropfen im Well nun langsam eingeengt und das enthaltene Protein ankonzentriert Wird dabei der Punkt der bers ttigung berschritten Es kann als Ausweg aus diesem metastabilen Zustand spontan eine Proteinkristallisationskeimung stattfinden Zun chst werden 500 ul der zu testenden Kristallisationsbedingung in das Reservoir pipettiert Aus diesem wird nun 1 ul entnommen und in den Well berf hrt Anschlie end wird 1 ul der Proteinl sung in den Well pipettiert und gut gemischt Schlie lich wird der Well mit Klarsichtklebeband verschlossen um einem Austrocknen vorzubeugen Der Tropfen wird in der ersten Woche t glich kontrolliert Danach wird einmal pro Woche bis einschlie lich vier Wochen nach dem Pipettieren der Bedingung kontrolliert Sp ter wird der Tropfen einmal im Monat berpr ft Bilder der verschiedenen Tropfen werden mit einer Digitalkamera die auf ein Binokular aufgesetzt wird aufgenommen und am PC bearbeitet Kontrast Helligkeit Gamma 2 2 6 2 Macro Seeding zur Verbesserung des Kristallwachstums Wenn sich erste kleine Kristalle entwickelt haben die aber wegen einer zwischenzeitlich zu geringen Proteinkonzentration im Tropfen nicht mehr weiterwachsen so k
66. eptor Substrat Komplexes sowie die Funktionalit t im Mittelpunkt stehen Die Kalorimetrie kann herangezogen werden um die Bindungskonstanten und damit die Affinit ten der Deletionsmutanten zum Substrat zu bestimmen der in vitro Import Assay k nnte die Funktionalit t der Mutanten im Substratimport verifizieren 5 Zusammenfassung Der Kernimportrezeptor Importin 7 ist eine wichtige Komponente der Kerntransportmaschinerie vieler h herer Eukaryoten Neben seiner Rolle als Rezeptor f r den Import ribosomaler Proteine erf llt Imp7 die Rolle eines Corezeptors neben Imp beim Import von Substraten mit ausgedehnten basischen Oberfl chenbereichen Er unterscheidet sich damit von klassischen Adaptern wie z B Importin a Eine besondere Funktion von Imp7 ist die eines Chaperons beim Import basischer karyophiler Substrate In dieser Arbeit wurde die Untersuchung der besonderen Eigenschaften von Imp7 von mehreren Seiten aus angegangen Einerseits wurde Imp7 f r r ntgenkristallographische Untersuchungen in hochreiner Form gewonnen und es konnten erste Kristallisationsbedingungen gefunden werden die solche Untersuchungen in der Zukunft erlauben k nnten Zus tzlich gelang die Co Aufreinigung von Imp7 mit Imp Dies erm glicht weitere Kristallisationstests Dar berhinaus konnte ein Ansatz erarbeitet werden wie sich der tern re Komplex aus Imp7 Imp und dem Linker Histon HI f r eine Kristallisation aufreinigen l t Andererseits konnte d
67. erden Die Geschwindigkeit der Proteine ist dabei gr er als die der Folgeionen aber langsamer als die der Leitionen Es resultiert die Fokussierung der Proteine als scharfe Bande an dem Feldst rkesprung Beim Auftreffen auf das Trenngel ndern die Folgeionen aufgrund des erh hten pH Wertes ihre Ladung und damit ihre Ionenbeweglichkeit Sie berholen die Proteine die dann wieder in einem Gebiet konstanter Feldst rke wandern Die Folge ist eine normale Gelelektrophorese Das Trenngel wirkt als Molekularsieb da die Proteine durch die weit engeren Poren des Trenngels in Abh ngigkeit ihrer Masse verlangsamt werden und so nach ihrer Gr e aufgetrennt werden F r die Vorbereitung einer SDS PAGE werden zwei Glasplatten mit Ethanol gereinigt und staubfrei trockengerieben Zwei 1 mm dicke Abstandshalter werden an den R ndern platziert und eine d nne Gummidichtung wird U f rmig zwischen die Glasplatten gebracht Die Glasplatten werden dort wo die Gummidichtung liegt geklammert Jetzt wird das Trenngel zwischen die Glasplatten zu H he gegossen und f r die Dauer der Polymerisation mit wasser ges ttigtem Isopropanol berschichtet Nach dem Polymerisieren wird das Isopropanol abgegossen und mit Wasser nachgesp lt Das Sammelgel wird in das obere Viertel gegossen und schlie lich der Kamm zwischen die Glasplatten gesteckt Die Gummidichtung wird nach Abschluss des Polymerisationsvorganges entfernt das Gel in eine vertikale Elektrophoresek
68. erinnerten Bei der Auflistung der Bedingungen wird auf die Angabe des Puffers der Imp7 Praparation 20 mM Tris HCl pH 7 5 100 mM NaCl verzichtet Abb 32 Kleine Proteinkristalle in CS1 41 Aufnahme mit einer Digitalkamera mit vorgespanntem Polarisationsfilter Nach sieben Tagen waren in dieser Bedingung kleine diamantf rmige Proteinkristalle gewachsen Die Kristalle haben einen Durchmesser von 20uM Bedingung im Tropfen 50 mM NaHEPES pH 7 5 10 v v PEG4000 5 v v Isopropanol Proteinkonzentration 40 uM Temperatur 20 C Kristalle der gleichen Form und Gr e wuchsen auch in CS1 44 und CS1 47 Die Bedingungen in den Tropfen sind CS 1 44 0 1M MgFormiat CS1 47 1M Ammoniumsulphat 50 mM NaAcetat pH 4 6 Es lie sich nicht nachweisen da das kristallisierte Protein tats chlich Vollangen Imp7 ist da die Kristalle zu klein f r das zur Verf gung stehende Diffraktometer sind Aufgrund ihrer geringen Gr e konnten sie auch nicht durch SDS PAGE analysiert werden Daher wurden die Bedingungen CS 1 41 CS1 44 und CS1 47 in einem systematischen Raster geringf gig ver ndert und mit Imp7 aus der gleichen Aufreinigung versucht ob sich die Kristalle reproduzieren oder sogar vergr ern lassen Dabei wurden die Salz und Pr zipitanskonzentrationen nach oben und nach unten ver ndert Zus tzlich wurden bei einigen Salzen die Kationen durch andere Metalle der gleichen oder einer benachbarten Hauptgruppe substituiert
69. ernlamina ein Gruenbaum et al 2000 Daigle et al 2001 Daher mu vor dem Erreichen des Chromatins der tern re Komplex von Nup153 dissoziieren Eine M glichkeit diese Bindung zu l sen best nde darin da der tern re Komplex ohne RanGTP Bindung also energieunabh ngig von Nup153 dissoziiert und auf diese Weise das Chromatin erreicht Ein vergleichbarer energieunabh ngiger Mechanismus ist f r den Imp SPNI Komplex bereits entdeckt worden Huber et al 1998 Die Energie zum L sen des Imp Imp7 H1 Komplexes von Nup153 wird aber vermutlich durch die Bindung von RanGTP an Imp aufgebracht J kel et al 1999 B uerle et al 2002 obwohl der Beweis f r die Energieabh ngigkeit des H1 Imports bislang nicht erbracht worden ist Solch ein Mechanismus ist aber auch von anderen Importkomplexen wie dem Impa Imp Komplex bekannt Adam et al 1994 G rlich et al 1994 Moroianu et al 1995 Imamoto et al 1995 Dabei k nnte eine Konformations nderung in Imp ausgel st werden Nevo et al 2003 welche zwangsl ufig zur Dissoziation des tern ren Komplexes f hren w rde da die Bindungsdom nen in Imp f r Imp7 und RanGTP berlappen J kel et al 1999 Daher m sste der tern re Komplex vor dem Erreichen des Chromatinger sts schon zerfallen sein Wenn aber Imp7 tats chlich eine Chaperonaktivit t besitzt wie es berichtet wurde J kel und G rlich 1998 J kel et al 1999 B uerle et al 2002 dann ist offen warum es
70. essionsst mme getestet werden Folgende Expressionsvektoren wurden in verschiedene Wirtsst mme transformiert exprimiertes Protein Expressionsvektor Antibiotikaresistenz N His s Imp7 pQE 9 Ampicillin N His 0 Imp7 pQE 80N Ampicillin N His e Imp pQE 60 Ampicillin Imp ohne Affinit tssequenz pQE 60 Ampicillin 2 2 3 5 Aufschliessen von coli Zellen Um rekombinante Proteine aus Bakterienzellen zu isolieren m ssen die Zellen geerntet und aufgebrochen werden Die Ernte erfolgt durch Zentrifugation 6 000 x g 20 min 4 C und einmaligem Waschen in eiskaltem Lysispuffer mit anschlie ender Zentrifugation 6 000 g 20 min 4 C Der Zellaufschluss kann mechanisch im Fluidizer oder durch Schockgefrieren chemisch durch Zusatz von Lysozym oder physikalisch durch Ultraschall erfolgen In dieser Arbeit wurden die Bakterienzellen generell im Fluidizer oder durch die Kombination von Fluidizer und Ultraschallbehandlung im Sonifier aufgeschlossen Ein Zellpellet aus 1 1 Sch ttelkultur vgl 2 2 2 4 2 wird in 30 ml Lysispuffer aufgetaut und resuspendiert Die Zusammensetzung des Lysispuffers richtet sich nach den Erfordernissen des ersten Aufreinigungsschrittes vgl 2 2 3 1 Um proteolytische Enzyme zu inaktivieren wird vor dem Auftauen eine halbe Tablette Protease Inhibitor Cocktail Complete EDTA free in den Lysispuffer gegeben Der Zellaufschlu im Fluidizer wird bei 80 90 psi in 4 5 Zyklen durchgef
71. fixiert Nach zweimaligem Waschen k nnen die Zellen eingebettet werden Hierzu wird Fluroprep auf einen Objekttr ger getropft und ein Deckgl schen mit der bedeckten Seite nach unten blasenfrei in den Tropfen gelegt und versiegelt Die Detektion des Transportsubstrates erfolgte in dieser Arbeit an einem Zeiss Fluoreszenzmikroskop das mit einem FITC und DAPI Filter ausgestattet ist FITC absorbiert bei 492 nm und emittiert Licht im gr nen Spektralbereich mit einer Wellenl nge von 515 nm Das Karyoplasma wird vom Cytoplasma durch F rbung mit dem DNA bindenden Farbstoff DAPI unterschieden Fluorochrom Abs nm Em nm DAPI 344 450 FITC 494 526 Puffer und L sungen Digitonin Stamml sung 20 mg ml in DMSO Permeabilisierungspuffer PB 40 ug ml Digitonin in Transportpuffer Bovines Serumalbumin BSA 20 mg ml ATP regenerierendes System Kreatinphosphat 10 mM Kreatinkinase 5 mg ml 10 mM Tris HCl pH 7 4 40 mM KCl 1 mM DTT 50 Glycerin gelagert bei 70 C GTP L sung 100 mM pH 7 0 gelagert bei 70 C ATP L sung 100 mM pH 7 0 gelagert bei 70 C HEPES KOH Puffer 1 M pH 7 3 Saccharose 15M 10 x Stamml sung 25 5 mg Kreatinphosphat 50 ul ATP L sung 50 ul GTP L sung 166 ul Saccharose 15 ul Kreatinkinase auf 1 ml mit Wasser Aliquots bei 70 C Reticulocytenlysat Transportsubstrat 500 nM HeLa Zellen e Gewebekulturschalen mit 6 Wells steril durch UV Bestrahlung e Deck
72. ge die Genexpression scharf zu kontrollieren und damit wesentlich gr ere Mengen an Erbinformationen zu verwalten Schlie lich wird durch den Zellkern eine h here Stabilit t der genetischen Information gew hrleistet 1 2 Kerntransport Das Vorhandensein einer Kernmembran birgt einige Probleme da karyophile Proteine wie z B Transkriptionsfaktoren ribosomale Proteine RNPs und Histone diese Membran auf ihrem Weg in den Nucleus durchdringen m ssen um ihre Effektorfunktion aus ben zu k nnen Zus tzlich m ssen die im Kern synthetisierten RNAs wie z B mRNAs und tRNAs diese Barriere auf dem Weg ins Cytoplasma ebenfalls berwinden Daneben existieren weitere Proteine RNA und Protein RNA Komplexe die zwischen beiden Kompartimenten hin und herwechseln Dar berhinaus wird die Situation durch die offene Mitose h herer Eukaryoten kompliziert da hier karyophile Molek le nach dem Wiederaufbau der Kernmembran nach abgeschlossener Teilung wieder in den Kern reimportiert werden und im Nucleus befindliche cytoplasmatische Molek le ins Cytosol exportiert werden m ssen Die Lipiddoppelmembran des Nucleus ist von zahlreichen Kernporen durchsetzt die jedoch f r gr ere hydrophile Molek le nahezu undurchl ssig sind Daher sind Mechanismen notwendig die den Stoffaustausch zwischen Nucleus und restlicher Zelle gew hrleisten Eine hochspezifische Transportmaschinerie aus l slichen Transportrezeptoren und den Proteinen des Kernporenkomple
73. gen w hrend der Bindung von Ran GTP erf hrt Die korrespondierenden Kristallstrukturen sind jeweils in schwarz dar ber gelegt Rechts ist die Kristallstruktur von Imp IBB IBB Importin B bindende Dom ne von Impa als Referenz abgebildet Abb entnommen aus Fukuhara et al J Biol Chem 2004 Es kann abschlie end folgende Hypothese formuliert werden Es m ssen vier verschiedene Konformationen von Imp7 w hrend des Imports des Linker Histons H1 existieren Die erste stellt den ungebundenen Rezeptor dar Die C terminalen sauren Loops sind frei beweglich Sie k nnen eine spezifische Bindung mit dem C terminalen NLS des Histons eingehen w rden dabei aber durch unspezifische Interaktionen mit der globul ren Dom ne des Histons die Bindung von Imp so weit behindern da eine Aggregation von Hl an Protein RNA Komplexen kinetisch bevorzugt w re Die zweite Konformation wird im Komplex mit Imp eingenommen Der C Terminus ist durch die direkte Bindung an Imp fixiert und die sauren Loops f r eine spezifische Bindung des C terminalen NLS von H1 positioniert Sie k nnen nicht mit der globul ren Dom ne interagieren und damit nicht um diese mit Imp konkurrieren Die dritte Konformation tritt im tern ren Imp Imp7 Hl Komplex auf Beide Importrezeptoren umhiillen das Substrat so da es nicht mit anderen m glichen Bindungspartnern interagieren kann In dieser Konformation durchtritt der Komplex den NPC und bindet schlie lich
74. gl schen 10 mm Durchmesser steril durch UV Bestrahlung e Paraformaldehyd 3 w v in PBS e Nagellack Objekttrager e Transportpuffer 20 mM Hepes 110 mM KAc 2 mM Mg OAc 1 mM EGTA 2 mM DTT pH 7 4 1 ug ul Aprotinin Leupeptin und Pepstatin In den Rekonstitutionsexperimenten werden dem Versuchsansatz neben dem Transportsubstrat entweder exogenes Cytosol Reticulocytenlysat oder eine Kombination aus rekombinanten Transportfaktoren hinzugef gt Die einzelnen Transportfaktoren sind wie folgt konzentriert Transportfaktoren Importin B ohne Tag 0 5 1 5 uM Importin 7 0 5 1 5 uM Imp Imp7 Dimer 0 5 1 5 uM Transportsubstrat 0 5 uM Allen Transportans tzen wird ein Ran NTF2 und ein Energiemix zugegeben Energiemix Ran 3uM NTF2 0 4 uM Alle Ans tze werden mit Transportpuffer auf ein Endvolumen von 20 ul gebracht Die Bilder des Assays werden an einem Fluoreszenzmikroskop mit einer CCD Kamera aufgenommen und am PC bearbeitet Kontrast Helligkeit 2 2 6 Kristallisation von Proteinen 2 2 6 1 Kristallisationsans tze Bei der Kristallisation eines Proteins wird mithilfe von Salzen Puffern und Pr zipitantien eine Proteinl sung in den bers ttigten Zustand berf hrt In diesem metastabilen Zustand gibt es zwei M glichkeiten wie ein Protein sich verhalten kann 1 Es f llt aus die Konzentration an gel stem Protein sinkt dadurch drastisch ab Dieser Vorgang ist stark exergonisch da so der
75. gt und auf ein Volumen von 5 ml ankonzentriert vgl 2 2 1 7 F r die folgenden Kristallisationsversuche vgl 3 4 3 1 3 3 Gelfiltration des Pools aus der Affinit tschromatographie F r die pr parative ausschlu chromatographische Aufreinigung des Imp7 Pools aus der Affinit tschromatographie wurde wie unter 2 2 3 1 3 1 verfahren Das Chromatogramm der Gelfiltration ist in Abb 16 dargestellt Der niedrige Peak um Fraktion 38 vor dem Hauptpeak der Fraktionen 41 47 stellt wahrscheinlich dimerisiertes Imp7 dar da das Elutionsvolumen dieses Peaks in etwa einem Molekulargewicht von 200 250 kDa entspricht Dies wurde durch das vergleichbare Elutionsvolumen des Imp Imp7 Heterodimers mit einem Molekulargewicht von 217 kDa best tigt vgl Abb 24 Dieser Peak war bei der gelchromatographischen Untersuchung des zweiten Peaks aus der Affinit tschromatographie vgl Abb 14 der prominente visualisiert durch SDS PAGE ohne vorheriges Aufkochen der Proben nicht dargestellt 72008 Ob Bno002 1 UF 2003 Cktl310002 1_Cad 20030bt Gro002 1_Frcties HTT LITEIT labllslehllohd bal bal hd bol bo bd bd bi t bd Hd bl bd bd bol bal h bd bal bol bd bal bel be bol bal bl bd bl bo pA bd bel bel bd bd b hd Abb 16 Elutionsprofil der Gelchromatographie von Imp7 ber eine Superdex 200 S ule Der Peak der Fraktionen 41 47 stellt als Monomer vorliegendes Imp7 dar Der kleine Peak um Fraktion 38 ist vermutlich dimerisiertes
76. h chste Grad an Entropie erreicht werden kann 2 Das Protein bildet Kristallisationskeime aus aus denen richtige Proteinkristalle wachsen k nnen Dieser Proze geschieht in der Regel deutlich langsamer als die Pr zipitation und ist auch nicht so energetisch g nstig da nicht die maximale Entropie erreicht wird In der Kristallographie wird nach Bedingungen gesucht die den zweiten Fall erm glichen Dazu werden zu Beginn sog Initial Screens durchgef hrt um erste Kristallisationsbedingungen f r ein Protein zu finden Bei den Initial Screens handelt es sich um eine Sammlung von Eingangsbedingungen die relativ h ufig zur Kristallisation verschiedener Proteine gef hrt haben Das aufgereinigte Protein wird dabei zu Anfang meist in einer Konzentration von 10 mg ml getestet Sobald Bedingungen ausgemacht sind die f r eine Kristallisation g nstig sind wird in einem Raster um die Bedingungen herum optimiert Dabei k nnen die Konzentrationen der enthaltenen Salze Puffer und Pr zipitantien variiert werden es k nnen aber auch Substitutionen getestet werden F r die Kristallisation im sog sitzenden Tropfen werden 24er Ansatz Kristallisationsplatten verwendet deren einzelne Kammern eine zentrale S ule mit darin liegender Vertiefung dem sog well und ein darunter liegendes Reservoir besitzen In das Reservoir wird eine Bedingung vorgelegt die dann im Well mit dem Protein zu einem Tropfen vermischt wird Es besteht also ein Konz
77. haperonaktivit t von Imp7 verantwortlich ist 4 4 Kristallisation von Importin 7 Es konnten keine Kristalle von Imp7 produziert werden die gro genug f r ein R ntgenbeugungsexperiment gewesen w ren Erste Kristallisationsbedingungen konnten aber gefunden werden Die Kristalle lie en sich bislang nicht verl lich reproduzieren zeigen aber alle eine hnliche u ere Gestalt Sie sind dreidimensional nicht nadelf rmig und scheinen mindestens acht Fl chen zu haben Sie sind allerdings zu klein als da ihre Gestalt exakt bestimmt werden k nnte Da es sich hierbei um Artefakte aufgrund gleicher oder hnlicher Salze in den Kristallisationsbedingungen handeln k nnte kann ausgeschlossen werden da diese Kristalle in Gegenwart v llig unterschiedlicher Salze gewachsen sind Es scheint generell g nstig zu sein wenn der pH Wert im Tropfen zwischen 5 und 6 liegt da dies auf zwei der vier Bedingungen in denen die ersten Kristalle gewachsen waren zutrifft n mlich CS1 47 und CS2 2 Dies entspricht in etwa der Regel da viele Proteine bei einem pH Wert kristallisieren der etwa um eins ber oder unter dem isoelektrischen Punkt des Proteins liegt R Ficner pers nliche Mitteilung Der theoretische pI von Imp7 wurde auf 4 6 berechnet Die Bedingung CS2 2 mit CTAB MgCl und NaCl scheint ein guter Ansatzpunkt f r weitere Kristallisationstests zu sein da unter Zusatz von Additiven und dem Detergens Triton X 100 in insgesamt drei weiteren B
78. he histone H1 0 contains multiple sequence elements for nuclear targeting Exp Cell Res 244 1 206 217 Shah S Forbes D J 1998 a Separate nuclear import pathways converge on the nucleoporin Nup153 and can be dissected with dominant negative inhibitors Curr Biol 8 25 1376 86 Shah S Tugendreich S Forbes D 1998 b Major binding sites for the nuclear import receptor are the internal nucleoporin Nup153 and the adjacent nuclear filament protein Tpr J Cell Biol 141 1 31 49 S dergvist H Imreh G Kihlmark M Linnman C Ringertz N Hallberg E 1997 Intracellular distribution of an integral nuclear pore membrane protein fused to green fluorescent protein localization of a targeting domain Eur J Biochem 250 3 808 813 Stade K Ford C S Guthrie C Weis K 1997 Exportin 1 Crm1p is an essential nuclear export factor Cell 90 6 1041 1050 Stewart M Baker R P 2000 1 9 A resolution crystal structure of the Saccharomyces cerevisiae Ran binding protein Moglp J Mol Biol 299 213 223 Stoffler D Fahrenkrog B Aebi U 1999 The nuclear pore complex from molecular architecture to functional dynamics Curr Opin Cell Biol 11 391 401 Str m A C Weis K 2001 Importin like nuclear transport receptors Genome Biol 2 6 3008 1 3008 9 Trotman L C Mosberger N Fornerod M Stidwill R P Greber U F 2001 Import of adenovirus DNA involves the
79. her gebildete Dimer aus Imp und Imp7 kann Hl effektiv importieren Auff llig ist hier das ausgepr gte Pr zipitat des Histons Retic Reticulocytenlysat Konzentrationen Imp 1 uM Imp7 1 uM ImpB Imp7 1 uM H1 0 5 uM 3 4 Kristallisation von Importin 7 Die Kristallisation des Kernimportrezeptors Imp7 sollte die Strukturaufkl rung des ungebundenen Rezeptors erm glichen Beim Vergleich mit Strukturen von substratgebundenem Imp7 k nnte so der Mechanismus der Substratbindung aufgekl rt werden F r die Kristallisationsans tze wurde das in dieser Arbeit aufgereinigte Imp7 aus Xenopus laevis mit His Affinit tssequenz verwendet vgl 3 1 3 4 1 Kristallisation von Imp7 ohne Bindungspartner Nachdem Imp7 in ausreichender Reinheit gewonnen worden war wurden die ersten Kristallisationstests durchgef hrt Dazu wurden folgende Eingangsbedingungen engl initial screens im sitzenden Tropfen mit einer Proteinkonzentration von 5 mg ml 40 uM Imp7 im Kristallisationsansatz bei 20 C pipettiert vgl 2 2 6 1 die Abk rzungen f r die Initial Screens sind in Klammern angef hrt e Crystal Screen 1 CS1 e Crystal Screen 2 CS2 e Crystal Screen Lite CSL e Crystal Screen Cryo CSC e Crystal Screen PEG Ion CSPI e JB Screens 1 10 JB1 10 e Magic Screen MS e Footprint Screen FS e Structure Screen SS Nach sieben Tagen waren in der Bedingung CS1 41 Abb 32 kleine Kristalle gewachsen die in ihrer Form an Diamanten
80. hie f r Imp darstellt Das Chromatogramm der Gelfiltration wird in Abb 21 dargestellt ma 2004 Feb1 2 000 1 1_ UV 2004Feb1 2w001 1_ Cast 277 2004Febl 0001 1_Fractin Abb 21 Elutionsprofil der Gelfiltration von Impf ber eine Superdex 200 S ule Die Fraktionen 23 34 enthalten alle Imp jedoch liegt es nur in den Fraktionen 28 31 als reines Monomer vor Die fr heren Fraktionen 23 27 enthalten dimerisiertes Imp die sp teren 32 34 k rzere Fragmente m glicherweise Abbauprodukte Blau UV Absorption bei 280 nm Rot Leitf higkeit Die einzelnen Fraktionen des Eluats wurden durch SDS PAGE analysiert Abb 22 M 16 2126 27 28 30 31 33 36 Imp ankonz Abb 22 SDS PAGE der Fraktionen des Gelfiltrationseluates Die ken E37 ung Fraktionen des Hauptpeaks 28 31 enthalten haupts chlich Imp neben kleineren Verunreinigungen Die Spur ganz rechts zeigt das ankonzentrierte Endprodukt es wurde hier 1 ug Protein aufgetragen Die Verunreinigungen wurden anhand dieser Spur auf 20 gesch tzt M Marker Nummern repr sentieren die entsprechenden Fraktionen der Gilfiltration Imp ankonz Imp Pool ankonzentriert a ImpR Imp zeigt eine Tendenz zu dimerisieren A Dickmanns m ndl Mitteilung 2003 Die Fraktionen welche das Imp Monomer enthielten wurden vereinigt und auf 10 mg ml 100 uM ankonzentriert vgl 2 2 1 2 Wie Abb 19 zu entnehmen ist treten einige Verunreinigunge
81. hst wird nach quilibrieren der S ule das zu immobilisierende Protein auf die S ule geladen Anschlie end werden mit 5 S ulenvolumina Waschpuffer unspezifische Bindungen gel st Dann wird das zweite Protein im berschu 2 3x auf die S ule geladen um den immobilisierten Bindungspartner vollst ndig abzus ttigen Nach 15 min Inkubation bei Raumtemperatur wird mit 5 S ulenvolumina Waschpuffer gesp lt und schlie lich im steigenden Imidazol Gradienten eluiert Das Eluat wird fraktioniert und per SDS PAGE analysiert Wasch und Elutionspuffer vgl 2 2 3 1 1 1 2 2 4 3 Bindungsstudien mit dem Imp Imp7 Heterodimer und dem Linker Histon H1 Das aus der Co Affinit tsreinigung gewonnene Imp Imp7 Heterodimer vgl 2 2 3 2 wird durch zweimaliges Ankonzentrieren vgl 2 2 1 7 und jeweils darauf folgendes Verd nnen mit Gelfiltrationspuffer vgl 2 2 3 1 3 umgepuffert und anschlie end quimolar mit dem Histon H1 welches sich im gleichen Puffer befindet 30 min auf Eis inkubiert Anschlie end wird der tern re Komplex durch eine pr parative Gelfiltration vgl 2 2 3 1 3 1 aufgereinigt und durch SDS PAGE analysiert vgl 2 2 1 3 1 2 2 5 Der in vitro Import Assay Der von Adam und Gerace 1990 entwickelte in vitro Import Assay dient der Analyse von Kerntransportprozessen Als Rekonstitutionsexperimente werden Untersuchungen verstanden in denen aufgereinigte rekombinante Transportfaktoren einem bekannten Transportsubstrat hinzugef g
82. ia Biotech verwendet Zur Auftrennung des Imp Imp7 Heterodimers werden beide Proteine vor dem S ulenlauf in einem Verh ltnis von 2 1 ImpB Imp7 f r eine halbe Stunde in 500 ul Gesamtvolumen bei 10 C inkubiert Anschlie end wird die Probe auf die zuvor mit Puffer gewaschene S ule aufgetragen und eluiert 1 ml gro e Fraktionen werden gesammelt und im SDS Polyacrylamidgel analysiert Zus tzlich zu den Proteinkomplexen wird als Kalibrierung das Laufverhalten von Importin B und Importin 7 alleine untersucht Bindungspuffer Elutionspuffer 20 mM Tris HC1 pH 7 5 100 mM NaCl 2 mM B Mercaptoethanol 2 2 4 2 Co Affinit tsaufreinigung von Imp ohne Affinit tssequenz mit immobilisiertem His Imp7 Fir einen sog Pulldown Assay zur Analyse von Protein Protein Interaktionen werden Fusionsproteine oder Proteine mit Affinit tssequenz benutzt deren Fusionsanteil oder Tag die Immobilisierung an Affinit tss ulen erm glichen Dies erm glicht dann eine Co Aufreinigung mit einem anderen Protein das ein Bindungspartner f r das immobilisierte ist Auf diese Weise k nnen beide Proteine in absoluter St chiometrie gewonnen werden da sie als Komplex vorliegen In dieser Arbeit wurde eine solche Abwandlung des Pulldown Assays dazu benutzt das Heterodimer aus Imp und Imp7 aufzureinigen um einen berschu eines der beiden Proteine im Eluat zu vermeiden Dazu wurde eine HiTrapChelating Ni NTA Sepharose 5 ml benutzt Zun c
83. ific interactions with karyoplasmic components According to this hypothesis the chaperoning activity of imp7 is imp dependent 6 Literaturverzeichnis Adam E J H Adam S A 1994 Identification of cytosolic factors required for nuclear location sequence mediated binding to the nuclear envelope J Cell Biol 125 547 555 Adam S A Sterne Marr R Gerace L 1990 Nuclear protein import in permeabilized mammalian cells requires soluble cytoplasmic factors J Cell Biol 111 807 816 Adam S A Gerace L 1991 Cytosolic proteins that specifically bind nuclear localization signals are receptors for nuclear import Cell 66 837 847 Allen T D Cronshaw J M Bagley S Kiseleva E Goldberg M W 2000 The nuclear pore complex mediator of translocation between nucleus and cytoplasm J Cell Sci 113 1651 1659 Baake M Bauerle M Doenecke D Albig W 2001 Core histones and linker histones are imported into the nucleus by different pathways Eur J Cell Biol 80 11 669 677 Baker S E Lorenzen J A Miller S W Bunch T A Jannuzi A L Ginsberg M H Perkins L A Brower D L 2002 Genetic interaction between integrins and moleskin a gene encoding a Drosophila homolog of importin 7 Genetics 162 1 285 296 Bauerle M Doenecke D Albig W 2002 The requirement of H1 histones for a heterodimeric nuclear import receptor J Biol Chem 277 36 32480 32489 Bayli
84. iligter Transportrezeptoren zwei RanGTP Molek le regeneriert werden m ssen J kel et al 1999 B uerle et al 2002 Cytoplasm Nucleus low RanGTP high RanGTP Abb 9 Der H1 Importweg Nach Bildung des Imp Imp7 Heterodimers bindet es das Histon Hl Nach der Translokation durch die Kernpore vermittelt die RanGTP Bindung an Imp die Dissoziation des tern ren Komplexes Imp RanGTP kehrt ins Cytoplasma zur ck Imp7 transferiert H1 zur DNA Dort wird das Histon durch die Bindung eines RanGTP an Imp7 freigesetzt Schlie lich kehrt auch Imp7 RanGTP ins Cytoplasma zur ck Abb entnommen aus J kel et al EMBO J 1999 1 4 Aufgabenstellung und Zielsetzung Die Aufgabenstellung dieser Diplomarbeit bestand zum einen in der Entwicklung einer Expressions und Aufreinigungsstrategie f r den Kernimportrezeptor Importin 7 Dazu sollten Expression und Aufreinigung so weit optimiert werden da die f r die Kristallographie n tigen Ausbeuten erreicht werden Weiterhin sollte die Funktionalit t des aufgereinigten Produkts durch Aktivit tstests belegt und die Interaktion mit den Bindungspartnern Importin B und H1 genauer untersucht werden Der dritte Aufgabenteil bestand in der Kristallisation von Importin 7 um mittels R ntgenbeugungsexperimenten die Struktur aufkl ren zu k nnen Hierzu sollten auch Co Kristallisationsversuche mit Importin B unternommen werden da auf diese Weise der sehr bewegliche Rezeptor Imp7 stabilisiert werde
85. in das Cytoplasma exportiert HIV gilt seit seiner Entdeckung Gottlieb et al 1981 als gefahrlichstes aller Retroviren Daher gilt der Aufkl rung der Interaktionen von viralen Proteinen mit der Wirtszelle gro e Aufmerksamkeit Hier ist insbesondere der Import von HIV Proteinen in Hinblick auf die Eigenschaft von HIV interessant f r die Infektion der Wirtszelle nicht auf deren Teilung angewiesen zu sein Die meisten Retroviren ben tigen diese offene Mitose um Zugang zum Nucleus zu erhalten HIV hingegen nutzt die zelleigene Transportmaschinerie um das virale Genom in den Nucleus der Wirtszelle zu importieren Goff 2001 Einer der wichtigsten Transportrezeptoren in diesem Zusammenhang ist Imp7 Allen bislang bekannten Substraten ist gemein da es sich um basische Proteine handelt Viele von ihnen aggregieren und fallen aus wenn sie ungebunden im Cyto oder Karyoplasma vorliegen Daher wird beim Import solcher Substrate eine chaperonartige Rolle von Imp7 vermutet J kel et al 2002 welches die ausgedehnten basischen Bereiche auf der Oberfl che des Importsubstrats verdecken und so ungewollte Interaktionen verhindern k nnte 1 3 3 Importin 7 abh ngige Importwege Karyophile Substrate von Imp7 werden i d R ber den schon bekannten Ein Rezeptor Weg in den Kern transportiert Abb 6 Ihre Kernlokalisationssequenzen geh ren nicht zu den klassischen NLSs vielmehr scheinen gro e basische Bereiche auf der Oberfl che eine Art Ko
86. inantem Importin ohne Affinit tssequenz Beide getesteten E coli St mme M15 und SG13009 pREP4 exprimierten Imp in f r die Kristallisation absolut ausreichenden Mengen vgl Abb 18 Nach der Optimierung der Expressionsbedingungen betrug die Ausbeute an Imp aus SG13009 pREP4 etwa 80 mg pro Liter 2YT Kultur vgl 3 2 2 und Tab 8 Die Expression in E coli M15 w re vermutlich ebenso erfolgreich gewesen Aus praktischen Gr nden wurde aber auch hier wie bei der Expression von Imp7 der Stamm SG13009 pREP4 verwendet da so nur von diesem Stamm kompetente Zellen hergestellt werden mussten Die Zugabe von Glucose vor der Induktion vgl 2 2 3 4 2 war hier n tig da die Basisexpression selbst in Gegenwart des pREP4 Plasmids vgl 2 2 3 1 so hoch war da es aufgrund der Selektion von Deletionsmutanten zu empfindlichen Ausbeuteeinbu en an Voll ngenprotein kam Auch f r Imp galt da eine niedrige Expressionstemperatur die Zellvermehrung zwar verlangsamte die L slichkeit des Produkts aber extrem steigerte Da Imp ohne Affinit tssequenz in pQE 60 hineinkloniert worden war mu te eine Aufreinigungsstrategie entwickelt werden die die nat rlichen Eigenschaften des Proteins ausnutzt um dieses von anderen Verunreinigungen zu trennen Die Aufreinigung ber die Anionenaustauschchromatographie mit DEAE Sepharose war hierf r ein gutes Mittel Die verwendete Diethylaminoethyl Sepharose S ule besitzt eine hohe Bindungskapazi
87. inigt und auf ein Volumen von 10 ml ankonzentriert vgl 2 2 1 7 da die Proteinkonzentration f r ein kleineres Volumen zu gro war vgl Tab 8 Daher mussten f r einen DEAE Pool zwei Gelfiltrationen durchgef hrt werden da sonst das Probevolumen etwa 10 ml bei einer Proteinkonzentration von 13 mg ml f r eine Gelfiltration zu gro geworden w re I P US M 233132 33 34 35 3638 40 4142 43 44 45 47 n Abb 20 SDS PAGE der Fn Fraktionen des Eluats der Anionenaustauschchroma l tographie Der Peak der Fraktionen lt MPR 3147 wird haupts chlich von Imp 102 7 97 5 verursacht Die bei der Elution aufgetretene Zweiteilung des Peaks 66 gt ergibt sich aus der Anwesenheit eines etwa 45 kDa und eines etwa 70 kDa schweren Proteins im ersten Teilpeak g und mehrerer weiterer Proteine zwischen 60 und 90 kDa im zweiten Teilpeak M Marker n I nach Induktion P Pellet des Zellysats US berstand des Zellysats die Nummern repr sentieren die entsprechenden z Fraktionen des Eluates vgl Abb 19 3 2 2 3 Ausschlu chromatographische Aufreinigung des Pools Als n chster und letzter Aufreinigungsschritt wurde eine pr parative Gelfiltration mit einer Superdex 200 S ule durchgef hrt wie unter 2 2 4 1 3 1 beschrieben durchgef hrt da die Reinheit von Imp f r den Pulldown Assay mit Imp7 v llig ausreichend war und dieser schlie lich eine hochspezifische Affinit tschromatograp
88. isiert Abb 7 Struktur von Imp Imp ist aus 19 HEAT repeats aufgebaut Jedes besteht aus einer A und einer B Helix die durch einen kurzen Loop verbunden sind Der Loop in HEAT 8 ist saurer Natur und reguliert die Substratbindung und freisetzung Die gr nen Helices interagieren mit FxFG repeats von Nucleoporinen In blau ist die Bindungsstelle f r die IBB Dom ne von Imp a dargestellt in rot jene f r RanGTP Der rote Loop in der N he der IBB Bindungsdom ne kontaktiert sowohl die Ran als auch die IBB Bindungsdom ne und ist f r die reziproken Affinit ten von Imp zu RanGTP beziehungsweise Impa verantwortlich Abb entnommen aus Str m und Weis Genome Biol 2001 Dar ber hinaus ist Imp7 offensichtlich u erst vielseitig und wie andere Mitglieder der Imp Familie in sich sehr beweglich Fukuhara et al 2004 Die Helix Zusammensetzung ist bei Imp7 vermutlich nicht so regelm ig wie bei Imp Die Bindungsdom ne f r Imp liegt C terminal und besteht wahrscheinlich aus den letzten 31 Aminos uren aa 1008 1038 B uerle et al 2002 Abb 8 stellt die Kartierung der Bindungsdom nen von Imp und Imp7 zueinander dar Binding site for a 1 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1036 Imp7 Imp impp C Imp7 impp C H1 Abb 8 Kartierung der Bindungsstellen in Imp7 und Imp zueinander Aminos uresequenzen die f r eine Bindung essentiell sind sind dunkelgrau dargestellt nicht essentielle in m
89. ittelgrau Impf und hellgrau Imp7 Die Bindungsstelle in Imp7 f r Impf ist am C Terminus lokalisiert und umfa t die letzten 31 Aminos urereste Die Bindungsstelle in Imp f r Imp7 umfa t etwa 160 aa zwischen aa 200 und aa 360 Es ist bemerkenswert da die Bindungsstellen f r Imp7 und das Linker Histon H1 berlappen Anmerkung Vollangen Imp7 aus Xenopus ist nicht wie dargestellt 1036 sondern 1038 aa lang Abb entnommen aus B uerle et al J Biol Chem 2002 Imp7 ist nicht nur auf Vertebraten beschr nkt ein Ortholog wurde auch in Drosophila melanogaster entdeckt welches als DIM 7 bezeichnet wird Lorenzen et al 2001 Baker et al 2002 und ebenfalls als Kernimportrezeptor fungiert 1 3 2 Importsubstrate von Importin 7 Es wurden bislang mehrere Substrate identifiziert die durch Imp7 in den Nucleus transportiert werden Zu ihnen geh ren die ribosomalen Proteine S7 L5 und L23a J kel und G rlich 1998 die Integrase aus dem Reverse Transkriptions Komplex von HIV 1 Fassati und Goff 2001 Fassati et al 2003 core Histone Baake et al 2001 M hlh usser et al 2001 und weitere DNA RNA bindende Proteine Goff 2001 Der Import von ribosomalen Proteinen in den Nucleus ist erforderlich da die ribosomalen Untereinheiten in den Nucleoli synthetisiert werden Melese und Xue 1995 Dazu werden die ribosomalen Proteine mit rRNAs kombiniert und die fertigen ribosomalen Untereinheiten anschlie end aus dem Nucleus
90. ittels SDS PAGE ist in Abb 10 dargestellt BL21 DE3 HMS 174 M15 SG13009 Abb 10 Expressions LysE LysS niveaus von Imp7 in M vl nl vi nil vl nl vi ol verschiedenen E coli St mmen bei 29 C 10 Fe 3 i Lediglich E coli SG13009 Himd zeigt eine signifikante Expression von Imp7 oz allerdings ist in der sr zugeh rigen Spur vor 42 7 Induktion eine schwache 5 Basisexpression zu erkennen M BR Marker v I vor Induktion n I nach Induktion 26 6 gt Die Induktionstemperatur wurde auf 15 C gesenkt da ein Vergleich der Expressionslevels bei 29 C und 17 C zeigte da bei niedrigeren Temperaturen die Ausbeute an synthetisiertem Protein zus tzlich um den Faktor 4 5 gesteigert werden kann Abb 11 Viel wichtiger ist zudem die erh hte L slichkeit da bei gem igteren Induktionsbedingungen die Formierung von inclusion bodies deutlich zur ckging wie Untersuchungen der Expressionskultur unter dem Mikroskop ergaben Die Daten werden nicht dargestellt 17 C 29 C M vl nl vl nl Abb 11 Optimier ung der Induktions temperatur SDS PAGE Das Expressionsniveau in SG13009 konnte bei niedrigeren Induk tionstemperaturen deutlich gesteigert werden Die Spuren nach Induktion bei 17 und 29 C im Vergleich belegen dies M BR Marker v l vor Induktion n I nach Induktion 212 158 gt 116 97 2 gt 66 4 gt
91. itzen periodisch auftretende Wiederholungen der Motive FXFG oder GLFG engl FG repeats Doye und Hurt 1997 Rout et al 2000 Diese Nucleoporine fungieren als Interaktionspartner f r Transportkomplexe sowohl in Export als auch in Importprozessen Ein Gradient ansteigender Affinit t der Rezeptor Substrat Komplexe zu diesen FG repeats k nnte die Translokation durch die Pore vermitteln Ben Efraim und Gerace 2001 Dabei w rden die koordinativen Bindungen die die aromatischen Seitenketten der FG repeats untereinander bilden nacheinander gel st und durch koordinative Bindungen der Phenylalanine mit Aromaten oder elektronenreichen Strukturelementen des Rezeptors ersetzt Ribbeck und G rlich 2001 Eine Anh ufung der gleichzeitigen Bindungen oder sterisch g nstigere Koordinationen der delokalisierten n Elektronensysteme der Phenylalaninseitenketten der Nucleoporine und der elektronenreichen Seitenketten des Transportkomplexes k nnten so den Affinit tsanstieg erkl ren Bayliss et al 2002 Die r umliche Anordnung der Nucleoporine und ihrer FG repeats ist charakteristisch und spielt daher bei der Direktionalit t der Transportprozesse vermutlich eine wichtige Rolle Ben Efraim und Gerace 2001 Im Zentrum des Kanals befindet sich ein Komplex Abb 1 aus zwei Ringen der ebenfalls eine Interaktion mit Transport Substrat Komplexen eingeht und der als p62 Komplex bezeichnet wird 1 2 3 Transportsubstrate und ihre Rezeptoren Eine Vielzahl a
92. konzentriert 3 2 4 Bindungsstudie des ternaren Imp Imp7 Hl Komplexes Um eine stabile Bindung des Imp Imp7 Heterodimers zu best tigen wurde zun chst ein Pulldown Assay zur Co Aufreinigung des Heterodimers durchgef hrt Leider war in diesem Versuchsansatz Imp7 zu einem gro en Teil zuvor dimerisiert Dies ergab sich aus dem Elutionsprofil der Gelfiltration von Imp7 nicht dargestellt Das Dimer lie sich durch einen Imp berschu zum Teil wieder aufl sen Es bildete sich das Heterodimer in geringeren Mengen Ein Imp7 berschu der aus der Dimerisierung resultiert war in der SDS PAGE des tern ren Komplexes immer noch zu erkennen vgl Abb 29 Da sich das Elutionsverhalten von Imp7 und dem Imp Imp7 Heterodimer in der Affinit tschromatographie aber nicht unterscheiden eluierten das noch vorhandene Imp7 Dimer und der Imp Imp7 Komplex gemeinsam Da die St chiometrie von Imp und Imp7 im Heterodimer bekannt ist war dies jedoch f r die Effektivit t des Bindungstests unerheblich zumal das Imp7 Dimer das Histon nicht binden kann W Albig pers nliche Mitteilung und damit die St chiometrie nicht st ren kann Daher wurde dem Eluat des Pulldown Assays das Histon H1 dennoch zugesetzt und 30 min auf Eis inkubiert vgl 2 2 3 3 Die Detektion des tern ren Komplexes erfolgte ber eine pr parative Gelfiltration Abb 28 und anschlie ende SDS PAGE Abb 29 Die Bindungspartner sind deutlich zu erkennen 2004 Mrz15no005 1_ U
93. ktion und vektor Antibiotika medium temperatur 2 YT 100 mg l 0 5 mM E coli 20 mM pQE 9 Ampicillin IPTG 2 16h SG13009 K HPO hexaHis Imp7 50 mg l v v EtOH bei 15 C pREP4 2 w v Kanamycin abs Glucose 3 1 2 Subklonierung von Imp7 aus Xenopus in den Expressionsvektor pET 2la Parallel zu den Expressionsstudien wurde eine Subklonierung des Gens fiir Imp7 vorgenommen Dies sollte eine Expression mit einer anderen Affinit tssequenz als His erm glichen damit Imp7 sp ter selektiv mit His s Imp gemeinsam aufgereinigt werden kann Das Gen f r Imp7 wurde mit BamH I und Hind III wie unter 2 2 2 1 2 angegeben aus dem Vektor pQE 9 ausgeschnitten Parallel wurde pET 2la mit den gleichen Restriktionsendonucleasen verdaut Der Restriktionsverdau wurde auf ein Agarosegel aufgetragen Abb 12 und die Banden mit verdautem Insert und verdautem Zielvektor ausgeschnitten vgl 2 2 1 3 2 2 2 1 4 2 und 22 19 Nun wurde das Insert in pET 21a durch eine Ligation einkloniert vgl 2 2 2 1 3 Der fertige Vektor pET 2la Imp7 wurde in XL1 Blue transformiert und die transformierten Zellen auf einer Selektionsplatte ausgestrichen Die erfolgreiche Subklonierung wurde durch eine Kolonie PCR verifiziert vgl 2 2 2 1 1 Abb 13 i s Hk Ikb ladder ea pQE ung pQE BamH I pQE Hind IN x pQE Bam Hind pQE Bam Hind e pET ung e pET BamH I pET Hind III xT pET Bam Hind G pET Bam Hind
94. kurze Leucin reiche Sequenz Fornerod et al 1997 Fukuda et al 1997 Ossareh Nazari et al 1997 Stade et al 1997 Ein bedeutender Transportrezeptor fiir Exportprozesse ist Crml Fornerod et al 1997 Ossareh Nazari et al 1997 Stade et al 1997 Nakielny und Dreyfuss 1997 Eine kurze Darstellung von Exportzyklen wird in Abb 5 gezeigt Als Kernimportsignale werden von den Importrezeptoren bestimmte Sequenzabschnitte auf der Oberflache der Transportsubstrate erkannt Adam und Gerace 1991 die als NLS engl nuclear localisation sequence bezeichnet werden Es existieren mehrere verschiedene Typen von NLSs die im Folgenden vorgestellt werden Klassische NLSs T NLS von SV40 large T antigen type Kalderon et al 1984 Lanford und Butel 1984 Lanford et al 1986 Dies ist eine kurze Sequenz aus 7 bis 8 Aminos uren mit normalerweise 4 Lysinen z B PKKKRKV Dieses Importsignal ist eine Spezialform des von Nucleoplasmin bekannten Signals bpNLS von engl bipartite NLS Robbins et al 1986 Dies sind zwei kurze basische Sequenzen die durch eine sog spacer region getrennt sind Das bpNLS ist von Nucleoplasmin bekannt Die klassischen NLSs werden durch Mitglieder der Importin B Superfamilie Chi et al 1995 Mattaj und Englmeier 1998 G rlich und Kutay 1999 Nakielny und Dreyfuss 1999 erkannt und entweder mit dem Rezeptor oder ber den Ein Rezeptor Ein Adapter Weg in den Kern transportiert Als Beispiel
95. l 2 2 1 4 2 wird zun chst aus dem Agarosegel ausgeschnitten dann aus der Agarose herausgel st anschlie end an eine S ule gebunden gewaschen und von der S ule eluiert Es wurde nach Angaben des Herstellers verfahren F r die Klonierung von DNA Fragmenten in Vektorsysteme ist diese Methode n tzlich da elektrophoretisch aufgetrennte DNA aus den Agarosegelen ausgeschnitten und so aufgereinigt werden kann Bei den ausgeschnittenen DNA Banden handelt es sich um bereits mit Restriktionsenzymen geschnittene DNA Inserts und Vektoren die von ungeschnittener und einfach geschnittener DNA getrennt wurden 2 2 1 6 Konzentrationsbestimmung von Nukleins uren Die Konzentration w ssriger Nukleins urel sungen wird quantitativ im Photometer bei 260 nm gegen einen Leerwert bestimmt nach Sambrook et al 1989 Folgende Umrechnungswerte werden hierbei herangezogen 1 A 260 50 ug ml doppelstr ngige DNA 1 A 260 40 ug ml einzelstr ngige DNA 1 A 260 33 ug ml Oligonukleotid Die Reinheit der Nukleins urel sung wird ber den Quotient der Extinktionen bei 260 nm und 280 nm ermittelt W hrend die aromatischen Basen der Nukleins uren ein Absorptionsmaximum von 260 nm und ein Halbmaximum bei 280 nm besitzen absorbiert Tryptophan eine aromatische Aminos ure der Proteine vor allem im Bereich von 280 nm Reine DNA liegt bei einem Quotienten von 1 8 bis 2 0 vor Mit Proteinen verunreinigte DNA L sungen besitzen einen kleineren A260
96. le zwischen Pro und Eukaryoten Er enth lt die genomische DNA die in ihrer gepackten Form als Chromatin bezeichnet wird die Nucleoli welche den Ort des Aufbaus der ribosomalen Untereinheiten darstellen und viele weitere Proteine die an der Umsetzung des Genoms in Proteine beteiligt sind wie z B Transkriptionsfaktoren W hrend in Prokaryoten die Schritte der Proteinbiosynthese also die Transkription der DNA Matrize in pr mRNA und die Translation der modifizierten mRNA in die codierte Aminos uresequenz parallel im Cytoplasma ablaufen sind Transkription und Translation bei Eukaryoten r umlich und zeitlich durch die Doppelmembran des Nucleus voneinander getrennt Die RNA Biogenese und auch die DNA Replikation bei in eukaryotischen Zellen finden im Karyoplasma statt die Translation geschieht im Cytosol Daher haben Eukaryoten die M glichkeit die pr mRNA vor dem Beginn der Translation zu modifizieren Eine der wichtigsten Modifikationen ist das Herausschneiden von Introns Genabschnitten die f r die Funktion des sp teren Proteins nicht erforderlich oder sogar hinderlich sind Eukaryoten ist es m glich nicht mehr sinnvolle Nucleotidsequenzen aus der pr mRNA ausschneiden Daher k nnen sie eine gr ere Vielfalt an Proteinen synthetisieren als Prokaryoten ohne f r jede evolution re Anpassung die komplette Sequenz eines Genes neu evolvieren zu m ssen Durch selektiven Zugang von Transkriptionsfaktoren sind Eukaryoten zus tzlich in der La
97. llung chemisch kompetenter E coli Zellen F r die Transformation von E coli mit einem gew nschten Vektor mu der entsprechende Bakterienstamm zuerst kompetent f r die Aufnahme von Plasmiden gemacht werden Dabei wird die Zellmembran des Bakteriums durch eine chemische Behandlung perforiert Durch diese por se Membran k nnen nun Plasmide in das Bakterium eingeschleust werden Zun chst wird ein Aliquot des Stammes der kompetent gemacht werden soll auf einer antibiotikafreien LB Agar Platte ausgestrichen und ber Nacht bei 37 C inkubiert Eine Kolonie wird in 5 ml LB Medium berimpft und ber Nacht bei 37 C inkubiert Die 5 ml Vorkultur wird 1 100 in 500 ml LB Medium verd nnt und bei 37 C bis zu einer OD 00 von 0 6 wachsen gelassen Die Ernte erfolgt durch Zentrifugieren 3 000 g 10 min 4 C Das Pellet wird in 150 ml eiskaltem TFB1 Puffer resuspendiert und 5 min auf Eis inkubiert Nach einer weiteren Zentrifugation 6 000 g 10 min 4 C wird das Pellet in 5 ml eiskaltem TFB2 Puffer vorsichtig resuspendiert Die kompetenten Zellen werden nun unter K hlung durch fl ssigen Stickstoff aliquotiert Die Lagerung erfolgt bei 80 C TFB1 Puffer TFB2 Puffer 30 mM KAc pH 7 0 10 mM NaMOPS pH 7 2 50 mM MnCl 75 mM CaCl 10 mM CaCl 10 mM RbCh 100 mM RbCl 15 v v Glycerin 15 v v Glycerin Der pH wird mit 1 M NaOH auf 6 5 eingestellt Der pH wird mit 0 2 M HAc auf 5 8 eingestellt Es folgt Sterilfiltration
98. lso in der Lage das Histon H1 mit hoher Effizienz zu binden Deshalb st rt der berschu des Imp7 Dimers nicht bei der Interpretation der SDS PAGE Abb 29 Die Bildung des tern ren Komplexes konnte daher best tigt werden Er lie sich stabil aufreinigen Um den tern ren Komplex mit H1 f r die Kristallisation aufzureinigen ist es notwendig da vor der Co Affinit tsaufreinigung beide Importrezeptoren frisch pr pariert sind und als aktive Monomere vorliegen Nur so kann es zu einer vollst ndigen S ttigung von immobilisiertem Imp7 mit Imp kommen Sind die Rezeptoren optimal pr pariert so kann der tern re Imp Imp7 Hl Komplex leicht aufgereinigt werden Der aufgereinigte Komplex kann so zur Strukturaufkl rung m glicherweise kristallisiert werden Dies sollte in Zukunft angegangen werden 4 3 Charakterisierung der Rolle von Imp7 im H1 Importweg Durch den in vitro Import Assay konnte die Aktivit t der aufgereinigten Importrezeptoren Imp und Imp7 belegt werden Die beobachteten Aktivit ten beim Import des ribosomalen Proteins rpL23a erreichten f r beide Rezeptoren ihr Maximum bei einer Konzentration von lt 1 uM signifikanter Import war aber bereits bei einer Konzentration von jeweils 0 5 uM zu beobachten vgl 3 3 und Abb 30 Dies entspricht insgesamt in etwa den Angaben in der Literatur J kel und G rlich 1998 J kel et al 1999 Hier wird das Erreichen der maximalen Aktivit t bei jeweils etwa 0 5 uM angegeben
99. men von 500 ul in einem Eppendorf cup 30 min lang bei 10 C durchgef hrt Nach der Inkubation wurde eine analytische 10 30 Superdex 200 Gelfiltrationss ule kalibriert Die Kalibrierung erfolgte durch Auftragen der beiden Kernimportrezeptoren jeweils allein Anschlie end wurde das Heterodimer aufgetragen Die Kalibrierungsl ufe von Imp beziehungsweise Imp7 Abb 23 zeigen da das Aufl sungsverm gen der analytischen S200 S ule ausreichend gut f r die Trennung der beiden Proteine voneinander ist Die Bildung des Heterodimers konnte durch die Auftrennung des inkubierten Bindungsansatzes Abb 24 belegt werden Die Aufl sung war hoch genug um das Heterodimer vom Imp berschu zu trennen Abb 23 Kalibrierung der A analytischen Gelfiltration Es wurde eine 10 30 S200 wu a ui Teaser Gelfiltrationss ule benutzt Superdex DOHR1BOMp7001 1_UVI_ 28m Superdex 200HR1030imp7001 1_UV2_25 em Saperdec200HR1030imp 001 1_Fractime A Der Kalibrierungslauf von Imp7 zeigt da das Protein bei 11 7 ml im Maximum des Peaks eluiert Die Peaks davor 19 resultieren aus zwischenzeitlich dimerisiertem Imp7 Blau UV Absorption bei 280 nm Rot UV Absorption bei 260 10 nm Imp7 bei 11 7 ml B Der Kalibrierungslauf von Imp zeigt da dieses B Protein bei 12 2 ml im Peakmaximum eluiert mAU Spender 00HR1030002 1_UVI 280m 9 Superdx200HR1030002 1_UV2_254m Superde200HR1020000
100. morphe klare Proteinaggregationen zu beobachten die offensichtlich zur Kristallisation tendieren ohne aber eine neuerliche Kristallbildung zu zeigen 3 4 2 Co Kristallisation von Imp7 mit Imp als Heterodimer Die Co Kristallisation von Imp7 mit Imp sollte einerseits die Kristallisation von Imp7 schlicht erleichtern andererseits aber auch das Studium der Interaktion beider Bindungspartner durch die R ntgenkristallographie erm glichen Besonders im Vergleich mit der Struktur von Imp7 allein w ren m gliche Konformations nderungen beziehungsweise Neuordnungen der Bindungsdom nen analysierbar F r die Co Kristallisation wurde Imp mit N terminalem His Tag verwendet welches von Anja Strasser G ttingen zur Verf gung gestellt worden war da zu diesem Zeitpunkt die Aufreinigung von ungetaggtem Imp noch nicht etabliert war Die beiden Proteine wurden vor dem Pipettieren der Initial Screens quimolar gemischt mit einer Endkonzentration von 10 mg ml 40 uM und f r 30 min bei 10 C inkubiert Die Kristallisationsans tze wurden bei einer Temperatur von 20 C pipettiert Folgende Initial Screens wurden verwendet e Crystal Screen 1 e Crystal Screen 2 e Crystal Screen Lite e Crystal Screen Cryo e Crystal Screen PEG Ion e JB Screens 1 10 e Footprint Screen Schon nach einem Tag war in tiber 50 aller Wells nahezu alles Protein ausgefallen Nach etwa 1 Woche fand sich bereits in ber 70 aller Ans tze dunkelbraunes al
101. n GTP zu GDP stattgefunden hat sinkt die Affinit t von Ran zu Imp so stark ab da der Komplex dissoziiert Cingolani et al 1999 Vetter et al 1999 RanGDP wird nun ber NTF2 in den Kern reimportiert Dort kommt es durch die Aktivit t von RCC1 zum Nukleotidaustausch so da schlie lich RanGTP rekonstituiert ist Die Energie der Hydrolysereaktion wird also nicht direkt im eigentlichen Transportproze verbraucht Bei Exportprozessen erh ht die Bindung von RanGTP an den Exportrezeptor im Nucleus dessen Affinit t zum Substrat also exakt umgekehrt wie bei Importrezeptoren so da die RanGTP Bindung in diesem Fall vor der Translokation durch den NPC stattfinden mu Abb 6 Eine hohe Konzentration von RanGTP im Nucleus hat also das Freisetzen eines karyophilen Substrates vom Importrezeptor beziehungsweise das Binden eines cytosolischen Substrates an einen Exportrezeptor zur Folge Dar berhinaus gew hrleistet sie den Export des substratungebundenen Importrezeptors Damit es nicht zu einem Transport eines Importrezeptors ohne Substrat in den Nucleus oder zum Erliegen von Exportprozessen kommen kann mu die RanGTP Konzentration im Cytosol niedrig und damit die RanGDP Konzentration hoch sein Auf diese Weise ist die Bidirektionalit t von Transportmechanismen gew hrleistet Cytoplasm Nucleus low RanGTP high RanGTP Eu g nBP os D Cs SG RanGTP Importin Cargo delivered Import Ts to SE GTP hydrolysis q JJ Cyto
102. n Substraten mu die Kernh lle durchdringen um an ihren Bestimmungsort im Cytosol beziehungsweise Karyoplasma zu erreichen Daf r steht eine gro e Zahl an Transportrezeptoren zur Verf gung In Abb 3 wird ein Stammbaum einiger bekannter Mitglieder einer Proteinfamilie der Importin P Superfamilie dargestellt da sie den Gro teil der bislang bekannten Transportrezeptoren darstellen Mattaj und Engelmeyer 1998 G rlich und Kutay 1999 Nakielny und Dreyfuss 1999a yHRC1004p yLph2p ySxmlp yNmd5p hImp7 hRanBP8 amp yCselp ACAS yim hTrn2 hTrn yImp hImp yYrb4p yPselp hRanBP6 hlmp5 yPdr6p yMsn5p yCrmip _ hCRMI yMtr10p hMitr10a AMtr10b yLosip hExpT Abb 3 Stammbaum der Importin Superfamilie Mitglieder der Importin B Superfamilie besitzen unterschiedlich gro e Sequenz hnlichkeiten zueinander Die Abbildung zeigt schematisch den Verwandtschaftsgrad humaner in blauen K stchen Rezeptoren und der homologen Faktoren in Hefe S cerevisiae Abb entnommen aus G rlich und Kutay Annu Rev Cell Dev Biol 1999 F r weitere Informationen zur Imp Superfamilie vgl Abschnitt 1 3 1 F r die Erkennung der Transportsubstrate durch ihre spezifischen Rezeptoren existieren Lokalisationssignale in der Aminos uresequenz der Substrate die ihnen eine Cytoplasma oder Kernlokalisation zuweisen Das h ufigste Kernexportsignal in Proteinen ist das sog NES engl nuclear export signal eine
103. n den Nucleus damit dort der Nucleotidaustausch stattfinden kann wird durch den Rezeptor NTF2 engl nuclear transport factor 2 vermittelt Moore und Blobel 1994 Paschal und Gerace 1995 Ribbeck et al 1998 Chaillan Huntington et al 2000 Diese Asymmetrie der RanGTP RanGDP Verteilung bewirkt die Bidirektionalit t der Transportprozesse durch den NPC Izaurralde et al 1997 Dies soll am Beispiel von Importin P vermittelten Transportprozessen erl utert werden s auch Abb 5 Das Freisetzen des Importsubstrats das auch an einen Adapter wie Impa gebunden vorliegen kann von Nup153 nach der Translokation durch den NPC wird durch die Bindung von Imp an RanGTP ausgel st Chi et al 1996 G rlich et al 1996b Izaurralde et al 1997 Die Bindungsdom ne von Imp f r RanGTP berlappt jene f r das Importsubstrat Cingolani et al 1999 Vetter et al 1999 Daher verursacht die Bindung an RanGTP eine Konformations nderung von Imp Nevo et al 2003 so da dessen Affinit t zu seinem Substrat drastisch sinkt Das Substrat wird freigesetzt der Imp RanGTP Komplex l st sich vermutlich von Nup153 Vetter et al 1999 Bayliss et al 2000a und b Anschlie end kehrt der Imp RanGTP Komplex durch die Kernpore in das Cytosol zur ck Izaurralde et al 1997 Damit Imp f r einen neuen Import zur Verf gung stehen kann mu der Imp RanGTP Komplex aufgel st werden Sobald die von RanBP1 und RanGAPI beschleunigte Hydrolyse vo
104. n durch Fremdprotein auf deren Menge auf etwa 20 der Gesamtproteinmenge gesch tzt wurde Dies ist in die Ausbeuteberechnung Tab 8 vorletzte und letzte Spalte eingeflossen Die Endausbeute an ungetaggtem Imp betrug im Durchschnitt 80 mg aus einem Liter 2YT Kultur Tab 8 Zusammenfassung der Proteinausbeuten nach den jeweiligen Aufreinigungsschritten Aufreinigungs Anionenaustausch Ankon Anko Gelfiltration schritt chromatographie zentrieren zentrieren durchschnittliche Proteinmenge 140 130 85 80 mg l 2YT Kultur 3 2 3 Co Aufreinigung des Importin B Importin 7 Heterodimers Die Co Aufreinigung des Imp Imp7 Heterodimers diente einerseits einer ersten Best tigung der richtigen r umlichen Konformation von Imp und Imp7 andererseits sollte auf diese Weise sichergestellt werden da das Heterodimer in der f r die Kristallisation erforderlichen Reinheit vorliegt 3 2 3 1 Bindungsstudien des ImpB Imp7 Heterodimers Die Bildung des stabilen Komplexes aus Imp und Imp7 wurde durch eine analytische Gelfiltration getestet Hierbei wurde wie in 2 2 4 1 3 2 angegeben verfahren Aufgereinigtes His s Imp7 vgl 3 1 3 und aufgereinigtes His s Imp welches von Anja Strasser G ttingen zur Verf gung gestellt worden war wurden gemeinsam inkubiert Die Inkubation wurde hierzu in einem molaren Verh ltnis von 2 1 Imp Imp7 d h 3 1 mg 32 uM Imp und 1 9 mg 16 uM Imp7 bei einem Gesamtvolu
105. n geringeres 158 gt Tg apparentes Molekulargewicht als 116 97 2 gt 97 kDa Sowohl M15 als auch en SG13009 pREP4 zeigen eine 66 4 gute Expression von Imp Es 55 6 gt wurden 2 Glucose in die 427 Vorkultur gegeben M BR Marker v vor Induktion n I nach Induktion 36 5 gt 26 6 gt Durch Zugabe von 2 Glucose konnte die Ausbeute gesteigert werden vgl 2 2 3 4 2 Auch hier erh hte die Zugabe von Ethanol die L slichkeit der Zusatz von K gt HPO hatte aber keinen weiteren Einflu Die Induktionszzet wurde anhand der Ausbeuten nach ersten Tests der Anionenaustauschchromatographie vgl 3 2 2 optimiert und liegt idealerweise bei 18 20 Stunden Tab 6 Tab 6 Ausbeute an Imp nach der Anionenaustauschchromatographie in Abh ngigkeit von der Induktionszeit Induktionszeit 3 7 18 22 h Ausbeute 8 12 17 18 mg l LB Kultur Um h here Zelldichten bei der Ernte zu erreichen wurde bei der Expression sp ter 2YT Medium verwendet vgl 2 2 3 F r die berexpression von Imp in SG13009 pREP4 wurde zuerst eine 10 ml Vorkultur in 2YT Medium angeimpft vgl 2 2 3 2 und 2 2 3 4 1 Die Vorkultur inkubierte unter Sch tteln bei 29 C ber Nacht und wurde dann 1 50 mit frischem 2YT Medium und 2 Glucose auf ein Volumen von 500 ml verd nnt Diese Vorkultur inkubierte bei 29 C bis zu einer ODeoo von 1 8 und wurde dann mit 480 ml eiskal
106. n k nnte Zu diesem Zweck sollte eine Aufreinigungsstrategie f r den Imp Imp7 Komplex entwickelt werden Die Co Kristallisation w rde das Studium der Interaktion von Imp7 mit seinem Bindungspartner erlauben und so m glicherweise die Notwendigkeit eines Heterodimers in Importprozessen erkl ren 2 Material und Methoden 2 1 Material 2 1 1 Feinchemikalien Alle Standardchemikalien organische Substanzen besitzen den Reinheitsgrad pro analysis Dabei wurde nach M glichkeiten der g nstigste Anbieter ausgew hlt Acrylamid Bisacrylamid Rotiphorese Gel 30 Agar Agar Agarose Ammoniumperoxodisulphat Ammoniumsulphat BisTrisPropan Borsaure Bromphenolblau Coomassie Brillant Blue G250 Calciumchlorid Dihydrat DMSO Dimethylsulfoxid Essigsaure EDTA Ethylendiamintetraessigs ure D Glucose Monohydrat Glycin Glycerin Guanidiniumhydrochlorid Hexadecyltrimethylammoniumbromid L Histidin Imidazol IPTG Isopropyl beta D thiogalactopyranosid dioxanfrei Kaliumacetat Kaliumchlorid Kaliumformiat Roth Karlsruhe Roth Karlsruhe Roth Karlsruhe Merck Darmstadt Roth Karlsruhe AppliChem Darmstadt AppliChem Darmstadt Roth Karlsruhe Roth Karlsruhe AppliChem Darmstadt Merck Darmstadt Roth Karlsruhe Sigma Aldrich Steinheim AppliChem Darmstadt Roth Karlsruhe Sigma Aldrich Steinheim AppliChem Darmstadt Fluka Buchs Fluka Buchs AppliChem Darmstadt Roth Karlsruhe Merck Darmstadt Roth
107. nach der Dissoziation von Imp diese Funktion aus ben kann w hrend es dazu offensichtlich nicht in der Lage ist wenn es alleine ohne Imp an das Histon bindet Hierf r scheint eine Erkl rung besonders plausibel Die initiale Bindung von Imp7 an Imp wirkt sich in einer Konformations nderung von Imp7 aus Die Bindungsdom ne von Imp7 f r Imp ist bekannt sie umfa t die letzten C terminalen 31 Aminos uren von Imp7 B uerle et al 2002 Von Imp seinerseits ist bekannt da es sehr flexibel Strukturen seiner Bindungspartner binden kann Cingolani et al 1999 Vetter et al 1999 Bayliss et al 2000 Fukuhara et al 2004 vgl Abb 7 Im Vergleich dieser Aussage mit der Sekund rstrukturvorhersage von PSIpredict McGuffin et al 2000 Jones 1999 Abb 35a und b f llt auf da die Bindungsdom ne von Imp7 f r Imp keinerlei Sekund rstrukturelemente enth lt Ihre Flexibilit t ist wahrscheinlich die Voraussetzung f r eine spezifische Interaktion mit Imp und vor allem eine darauf folgende spezifische Interaktion mit Hl Denn durch die Interaktion mit Imp k nnten die beiden C terminalen sauren Loops vgl Abb 35b in einer Art und Weise positioniert werden die es Imp7 erlaubt in spezifischer Weise an das C terminale sehr basische NLS des Histons Hl zu binden Auf die gleiche Weise k nnten die sauren Loops von Imp7 daran gehindert werden unspezifisch an einen Teil der globul ren Dom ne zu binden Dies k nnte erkl
108. naturierung der DNA wird das Reaktionsgemisch auf 95 C erhitzt Die beiden komplement ren DNA Str nge werden voneinander getrennt e Hybridisierung der Primer mit der DNA annealing der PCR Ansatz wird auf eine Temperatur gesenkt die etwa 3 C unter den Schmelzpunkten der Primer liegt um ein optimales weil hochspezifisches Hybridisieren der Primer mit der DNA zu gew hrleisten e DNA Synthese durch die DNA Polymerase die optimale Temperatur f r die verwendete Taq DNA Polymerase liegt bei 72 C Die Elongationszeit h ngt von der L nge des zu amplifizierenden Fragments ab und sollte bei etwa min pro 1000 Basenpaaren liegen Diese drei Schritte laufen mehrmals hintereinander ab um eine ausreichende Menge an PCR Produkt zu erhalten Die bereits entstandenen DNA Str nge dienen in den Folgezyklen wiederum als Matrizen so dass die Vermehrung der zu amplifizierenden DNA Sequenz exponentiell zunimmt F r die Klonierung in Vektoren enthalten die Primer normalerweise bereits die Sequenzen f r die 5 und 3 Restriktionsschnittstellen mit deren Hilfe das korrekte Einpassen der DNA Sequenz in den Zielvektor gelingt Bei der Subklonierung eines Gens von einem Vektor in den anderen k nnen diese Restriktionsschittstellen f r den Zielvektor entweder durch Primer in der PCR eingef hrt werden oder sie werden durch einen Zwischenklonierungsschritt aus einem weiteren Vektor in den Zielvektor eingeschleppt Um den korrekten Einbau ei
109. nd Isolierung von DNA in mittlerem Ma stab um klonierte Plasmide f r Expressionsetablierungen zu erhalten werden Midi Pr parationen kurz Midi Preps durchgef hrt Dabei werden 100 ml einer E coli bernachtkultur aufgeschlossen und die DNA pr pariert In dieser Arbeit wurde das Plasmid Midi Kit von Qiagen benutzt und die DNA nach den Angaben des Herstellers isoliert 2 2 2 3 2 Plasmidpr paration im gro en Ma stab Bei Maxi Pr parationen kurz Maxi Preps werden Plasmide aus einer 250 ml E coli bernachtkultur isoliert F r Maxi Preps wurde das Plasmid Maxi Kit von Qiagen verwendet Dabei wurde nach den Angaben zur Isolation im Benutzerhandbuch des Herstellers verfahren 2 2 3 Zellbiologische Methoden 2 2 3 1 Expression von rekombinanten Proteinen in E coli E coli Zellen enthalten nach der Transformation einen Vektor der ein einkloniertes Fremdgen sowie ein oder mehrere Gene f r Antibiotikaresistenzen enth lt Die Antibiotikaresistenzen auf dem eingebrachten Plasmid erm glichen das Wachstum der plasmidtragenden Bakterien auf einem antibiotikahaltigem Medium das gleichzeitig wachstumshemmend oder letal auf andere Bakterien die das Plasmid nicht enthalten wirkt So k nnen plasmidtragende Bakterien durch Antibiotika positiv selektiert und Kontaminationen mit fremden Bakterien vermieden werden Das einklonierte Fremdgen ist bei den hier verwendeten Plasmiden so lokalisiert dass die Expression unter der Kontrolle ei
110. nd eine korb hnliche Struktur auf nukle rer Seite engl nuclear basket aufsitzen 120 nm Abb 1 Schematischer Querschnitt durch den Kernporenkomplex Der Nup358 RanBP2 Kernporenkomplex bildet eine 8 fache Rotationssymmetrie und ist mittels gp210 POMI121 und POM152 in der Kernmembran CAN Nup214 verankert Das Kernst ck des zentralen Transporters bildet der p62 Komplex Filamente reichen in CYTOPLASM das Cytoplasma w hrend eine korb hnliche Struktur nulear basket in Richtung Karyoplasma En J zeigt gp210 i Abb entnommen aus Allen et al J POM121 Cell Sci 2000 Nup96 Nup98 Nup107 p205 Nup155 Die cytoplasmatischen Filamente werden durch die Nucleoporine CAN Nup214 Nup 84 Nup88 und Nup358 RanBP2 gebildet die mit den Proteinen RanGAP und RanBP1 assoziiert sind Abb 1 Mahajan et al 1997 F r Export und vor allem Importprozesse sind Interaktionen der Transportkomplexe mit dem am u ersten Teil des nuclear basket sitzenden Nucleoporin Nup153 essentiell Shah et al 1998a und b Nakielny et al 1999a und b Ben Efraim er al 2001 Bednenko et al 2003a und b F r Importprozesse vermittelt Nup153 die Termination der Translokation f r Exportprozesse die Initiation Eine bersicht der Organisation des NPC ist in Abb 2 dargestellt Filaments Central Cytoplasmic Channel Coaxial Ring Nucleoplasmic Coaxial Ring PER Basket Abb 2 A Schematische Darstellung des Ke
111. nd nicht nur die ungebundenen Rezeptoren dargestellt sondern auch ihre Konformationen nach der Substratbindung Hierbei ndert sich nicht nur die relative Position der a Helices zueinander Im Falle von Imp kann sich auch die relative Position von Aminos uren zueinander innerhalb eines Loops vgl Abb 7 ver ndern je nachdem welches Substrat gebunden ist Da die beiden C terminalen Loops von Imp7 wesentlich ausgedehnter zu sein scheinen als jene von Imp liegt die Schlu folgerung nahe da hier eine hnlich gro e wenn nicht sogar gr ere Flexibilit t gegeben ist Die Wahrscheinlichkeit f r einen sog conformational switch ist damit relativ hoch conz 0922292222202 Pred u En Pred CCHHHHHHHHAHHC CCHHHHHHHHHHHHHHHHCC CHHHHHH AA MDPNILIEALRGTMDPALREAAEROLNESHKSLHFVSTLL 1 i i 10 20 30 40 cont JJJ333723333773332333233323233332322333333 Pred DED D Pred HHHHACCCCCHHHHHHHHAHAHAHHARHHHCCCCCCCCCCCCCC AA QITMSEQLELPVROAGVIYLEITMITOYRPDREVTPGELPP 1 i 1 i 50 60 70 g0 cont 310221212 Pred i EEE Pred CCCCHHHHHAHHAHHHHHHAHHHACCCCHHHHHHHHHAHHHHHRHH AA HTIPEEDRACIRENIVEAIMHSPELIRVOLTTC IHHITKA i i i i 90 100 110 120 cont Jaa Mao Pred DC D Pred HCCCCCHHHHHAHAAAAC CCCHHHHHHHHHHAHHHHHRHCC AA DYPIRWTAVVEKI GF YLOSDISACWLGI LLCLYOLVEKI YE 1 1 i 130 140 150 160 cong 193242322211922231292222933243322222122 Peed C CHE Pred CCCHHHHHHHHHHHHHHHAHHHHHHHAHHHHHCCCHHHHHRHH AA
112. nes IPTG induzierbaren Lac Promotors z B T5 oder T7 liegt und gleichzeitig das Gen im offenen Leserahmen zu liegen kommt Das eingebrachte Plasmid erlaubt unter diesen Bedingungen die selektive Expression des klonierten Fremdgens Einige der in dieser Arbeit verwendeten Bakterienst mme ben tigen zus tzlich zu den Selektionsantibiotika die f r die Expression ben tigt werden Kanamycin f r den Erhalt des pREP4 Plasmides das f r einen Promotorrepressor codiert Diese senken die Basisexpression und verhindern so die Vermehrung von im Wachstum beg nstigten Deletionsmutanten 2 2 3 2 Medien zur Aufzucht von coli LB Medium 10g Bacto Tryptone 5g Bacto Yeast extract 10g NaCl in 900 ml H20 pH mit NaOH auf 7 0 einstellen ad 1 1 H20 2YT Medium 16g Bacto Tryptone 10g Bacto Yeast extract 5g NaCl in 900 ml H20 der pH wird mit 1 M NaOH auf 7 0 eingestellt ad 11 H20 Die Sterilisation erfolgt durch Autoclavieren die Lagerung bei Raumtemperatur LB Agar f r Selektionsplatten 250 ml LB Medium 3g Agar Agar Der Agar wird durch Erhitzen gel st sobald der LB Agar auf etwa 42 45 C abgek hlt ist werden 40 mg Ampicillin beziehungsweise 20 mg Kanamycin unter R hren zugegeben Nun wird der LB Agar in Platten gegossen Sollen die LB Agar Platten nicht selektiv sein so wird auf den Zusatz von Antibiotika verzichtet Die Lagerung erfolgt bei 4 C 2 2 3 3 Transformationen in Bakterienst mme 2 2 3 3 1 Herste
113. nes Inserts in einen Vektor nach einer erfolgreichen Transformation eines Bakterienstammes mit diesem Vektor zu untersuchen wird eine Kolonie PCR durchgef hrt Die einzelnen transformierten Kolonien auf einer Selektionsplatte k nnen so auf das richtige Insert gescreent werden F r einen typischen PCR Ansatz f r einen Kolonie Screen wird pipettiert 0 5 ul 5 Primer 10 mM 0 5 ul 3 Primer 10 mM 0 5 ul dNTPs 100 mM 2 5 ul Taq Polymerase Puffer 10x 0 25 ul Taq Polymerase 5 U l 20 75 ul H 0 Kolonie auf der Spitze eines Zahnstochers Die PCR zur Amplifizierung von Importin 7 wurde im Thermocycler mit folgendem Programm durchgef hrt 1 Denaturierung 94 C 5 min 2 Denaturierung 94 C 30s 3 Hybridisierung 52 C 30s 4 Elongation 72 C 3 min Schritte 2 4 10x wiederholen 5 Denaturierung 94 C 30s 6 Hybridisierung 52 C 30s 7 Elongation 72 C 3 min 5 s Zyklus Schritte 5 7 15x wiederholen 8 Elongation 72 C 10 min 9 Hold 4 C Da Imp7 in pQE 9 ber eine N terminale BamH I und eine C terminale Hind III Schnittstelle einkloniert ist und sonst keine weiteren Restriktionsschnittstellen vorhanden sind wurde in dieser Arbeit ausgehend vom Vektor pQE 9 Imp7 die Imp7 DNA Sequenz in den Vektor pET 2la kloniert um neue Schnittstellen f r weitere Subklonierungen zu erhalten 2 2 2 1 2 Spaltung von DNA durch Restriktionsendonucleasen Restriktionsendonucleasen erkennen spezifische Basensequenzen in DNA Doppelheli
114. nsensussequenz f r den Imp7 vermittelten Kernimport zu sein 1 3 4 Das Importin B Importin 7 Heterodimer Imp7 und Imp liegen in der Zelle nicht nur alleine sondern zum Teil auch als Heterodimer vor G rlich et al 1997a G rlich 1997b Das Imp Imp7 Heterodimer ist ein funktioneller Importrezeptor f r mehrere Substrate 1 Es importiert den RTC engl reverse transcription complex von HIV 1 in den Nucleus der Wirtszelle Fassati et al 2003 Die Integrase IN des RTC Farnet und Haseltine 1991 wird wie bereits erw hnt in vitro auch von Imp7 allein importiert 2 Das Linker Histon HI ist ebenfalls ein Importsubstrat des Dimers J kel et al 1999 B uerle et al 2002 Der Importweg von Hl ist in Abb 8 detaillierter dargestellt 3 Unter Beteiligung des Histons Hl wird auch DNA von Adenoviren durch das Imp Imp7 Heterodimer in den Nucleus importiert Das Heterodimer zeigt dabei eine bemerkenswerte Stabilit t da es sich gemeinsam aufreinigen l t ohne dabei zu dissoziieren G rlich et al 1997a Die Bindung ist dabei hochspezifisch da sie durch RanGTP gel st werden kann Die Bildung des Heterodimers kann zus tzlich durch die IBB Dom ne von Impa welche an Imp bindet inhibiert werden G rlich et al 1997a was die Spezifit t der Bindung zus tzlich unterstreicht 1 3 5 Der Hl Kernimportweg H1 Histone enthalten zwei strukturell unterschiedliche Dom nen die als NLS erkannt werden Die erste befin
115. ntesten Aktivit tsnachweis bei Kernimportprozessen darstellt der bislang bekannt ist Die Importsubstrate rpL23a H1 und H1 2 wurden rekombinant aus coli gewonnen und von Dr Werner Albig G ttingen zur Verf gung gestellt Bei der Durchf hrung wurde wie unter 2 2 5 angegeben verfahren Beim H1 Import wurden sowohl H1 und H1 2 getestet zwei Unterarten von Hl da zwischen beiden bez glich des Imports aber kein Unterschied bestand werden sie im Folgenden zusammenfassend mit dem berbegriff H1 bezeichnet Bei der Untersuchung des Imports durch das Heterodimer aus Imp und Imp7 sollte gekl rt werden ob die Bildung des Dimers vor der Bindung an das Histon f r den Import zwingend notwendig ist oder ob zun chst ein Importrezeptor an das Histon binden kann bevor der zweite hinzukommt Die Vorinkubation einzelner Transportfaktoren mit dem Histon H1 Imp Hl und Imp7 H1 erfolgte bei 4 C 5 min lang Erst danach wurde der zweite Rezeptor zugegeben Beim Test des vorher gebildeten Heterodimers wurde dieses direkt mit H1 inkubiert F r den Import Assay mit H1 galt da der oder die Rezeptoren immer in Transportpuffer vorgelegt und erst danach das Histon hinzugesetzt wurde Damit sollte ein Pr zipitieren des Histons verhindert werden Die Importaktivit ten von Imp und Imp7 beim Import des ribosomalen Proteins rpL23a waren deutlich erkennbar Abb 30 Bei einer Konzentration der Importrezeptoren von 0 8 uM Imp beziehungsweise
116. nuclear pore complex receptor CAN Nup214 and histone H1 Nature Cell Biol 3 1092 1100 Vetter I R Arndt A Kutay U G rlich D Wittinghofer A 1999 Structural view of the Ran importin beta interaction at 2 3 A resolution Cell 97 635 646 Abk rzungsverzeichnis bb c ATP bidest gt gt ere BSA C cm d h DMSO DNA DTT EDTA et al EtOH E coli FG GTP HEPES hn IPTG KD EBZ alpha Ampere ngstr m Abbildung Acetat Adenosintriphosphat bidestilliert beta Rinderserumalbumin centi als Pr fix Cytidin Grad Celsius Zentimeter desoxy Dalton das hei t Dimethylsulfoxid Desoxyribonucleins ure Dithiothreitol Ethylendiamintetracetat et altera lat und andere Ethanol Escherichia coli Phenylalanin Arginin reich gamma Guanosin Gramm Guanosin 5 triphosphat Stunde N 2 Hydroxyethylpiperazin N 2 ethansulfons ure heterogen nukle r Isopropyl beta D thiogalactopyranosid kilo als Pr fix Kilodalton Liter molar milli als Pr fix mikro als Pr fix min mRNA n NES NLS Nup OD Oligo P PAGE PBS PCR pr mRNA RNA RNP rpm rRNA s S cerevisiae SDS sn T Tab TBE TEMED Tris HCl tRNA U U snRNP UV V vgl v v w v z B Minute messenger RNA nano als Pr fix nuclear export signal nuclear localisation signal Nukleoporin Optische Dichte Oligonukleotid Orthophosphat Polyacryamidgel elektrophorese Phos
117. nvolumen wobei kleine Volumina vorzuziehen sind 2 2 4 1 3 1 Pr parative Ausschlu chromatographie zur weiteren Aufreinigung von Proteinen Die HiPrep 26 60 Superdex200 S ule von Amersham Pharmacia Biotech eignet sich zur Trennung von Proteinen mit einer Molek lmasse von weniger als 200 kDa Ihre Gelmatrix besteht aus Allyldextran das kovalent zu N N Methylenbisacrylamid verkn pft ist Nach quilibrierung der S ule mit 1 5fachem S ulenvolumen Elutionspuffer wird die Probe ber einen Sml Loop injiziert Die Proteinprobe wird von der S ule mit Puffer eluiert 5 ml gro e Fraktionen werden aufgefangen und die Fraktionen anschlie end im SDS Polyacrylamidgel analysiert Elutionspuffer 20mM Tris HCl pH 7 5 100mM NaCl 2mM B Mercaptoethanol 2 2 4 1 3 2 Analytische Ausschlu chromatographie zur Untersuchung von Proteinkomplexen Analytische Ausschlusschromatographies ulen sind kleiner als pr parative Ihre Verwendung spart gegen ber pr parativen S ulen viel Zeit die Probevolumina die aufgetragen werden k nnen sind aber wesentlich kleiner Daher eignen sie sich nicht f r die Aufreinigung rekombinanter Proteine Sie k nnen aber sehr gut zur Analyse stabiler Proteinkomplexe herangezogen werden da w hrend der Elution die Proteinkomplexe in der Regel intakt bleiben und ihr Elutionsverhalten ihre Komplexeigenschaften widerspiegeln F r die analytische Gelfiltration wurde eine 10 30 Superdex200 S ule von Amersham Pharmac
118. ods Enzymol 257 135 144 Bischoff F R Krebber H Smirnova E Dong W Ponstingl H 1995 Co activation of RanGTPase and inhibition of GTP dissociation by Ran GTP binding protein RanBP1 EMBO J 14 4 705 715 Bischoff F R G rlich D 1997 RanBP1 is crucial for the release of RanGTP from importin related nuclear transport factors FEBS Lett 419 249 254 Breeuwer M Goldfarb D S 1990 Facilitated nuclear transport of histone H1 and other small nucleophilic proteins Cell 60 6 999 1008 Chaillan Huntington C Braslavsky C V Kuhlmann J Stewart M 2000 Dissecting the interactions between NTF2 RanGDP and the nucleoporin XFXFG repeats J Biol Chem 275 8 5874 5879 Chi N C Adam E A Adam S a 1995 Sequence and characterization of cytoplasmic nuclear import factor P97 J Cell Biol 130 265 274 Cingolani G Petosa C Weis K M ller C W 1999 Structure of importin beta bound to the IBB domain of importin alpha Nature 399 221 229 Cordes V C Reidenbach S Franke W W 1995 High content of a nuclear pore complex protein in cytoplasmic annulate lamellae of Xenopus oocytes Eur J Cell Biol 68 3 240 255 Cronshaw J M Krutchinsky A N Zhang W Chait B T Matunis M J 2002 Proteomic analysis of the mammalian nuclear pore complex J Cell Biol 158 915 927 Daigle N Beaudouin J Hartnell L Imreh G Hallberg E Lippincott Schwartz J
119. ophorese im Coomassie F rbebad mindestens 30 min inkubiert intensivere Banden k nnen mit mehrmaliger F rbung und Entf rbung oder einer F rbung ber Nacht erzielt werden Anschlie end wird das Gel unter mehrfachem Erneuern des Entf rbebads mehrere Stunden entf rbt Gestoppt wird der Entf rbevorgang mit 5 Essigs ure oder Wasser F rbebad Entf rber 0 25 w v Coomassie Brilliant Blue R 250 40 v v Methanol 0 1 w v Coomassie Brilliant Blue G 250 10 v v Essigs ure 40 v v Methanol 10 v v Essigs ure 2 2 1 4 2 Anf rben von Nukleins uren mit Ethidiumbromid Elektrophoretisch aufgetrennte Nukleins uren k nnen mit Ethidiumbromid im UV Licht sichtbar gemacht werden Hierzu wird das Gel 15 20 min im Ethidiumbromidbad inkubiert und anschlie end unter UV Licht bei 254 beziehungsweise 365 nm detektiert Ethidiumbromid interkaliert in die DNA und fluoresziert dabei intensiv orange Bei 365 nm wird vor allem DNA detektiert die noch f r weitere Reaktionen zur Verf gung stehen soll also z B durch Restriktionsverdau gewonnene DNA Fragmente Durch l ngere Wellenl ngen wird die Mutatiosrate herabgesetzt 2 2 1 5 DNA Elution aus Agarosegelen Diese Methode eignet sich um 70 bp bis 10 kb lange DNA aus niedrig schmelzenden Standard Agarosegelen zu eluieren und zu reinigen In dieser Arbeit wurde dazu das NucleoSpin Extract Kit der Firma Macherey Nagel benutzt Die DNA durch Ethidiumbromid angef rbte DNA vg
120. ork P Hartmann E Prehn S Izaurralde E 1997a A novel class of RanGTP binding proteins J Cell Biol 138 65 80 G rlich D 1997b Nuclear protein import Curr Opin Cell Biol 9 412 419 G rlich D 1998 Transport into and out of the cell nucleus EMBO J 17 10 2721 2127 G rlich D Kutay U 1999 Transport between the cell nucleus and the cytoplasm Annu Rev Cell Dev Biol 15 607 660 Gottlieb M S Schroff R Schanker H M Weisman J D Fan P T Wolf R A Saxon A 1981 Pneumocystis carinii pneumonia and mucosal candidiasis in previously healthy homosexual men evidence of a new acquired cellular immunodeficiency N Engl J Med 305 1425 1431 Gruenbaum Y Wilson K L Harel A Goldberg M Cohen M 2000 Review nuclear lamins structural proteins with fundamental functions J Struct Biol 129 2 3 313 323 Guiochon Mantel A Delabre K Lescop P Milgrom E 1994 Nuclear localization signals also mediate the outward movement of proteins from the nucleus Proc Natl Acad Sci USA 91 7179 7183 Hayes J J Kaplan R Ura K Pruss D Wolffe A 1996 A putative DNA binding surface in the globular domain of a linker histone is not essential for specific binding to the nucleosome J Biol Chem 271 42 25817 25822 Huber J Cronshagen U Kadokura M Marshallsay C Wada T Sekine M L hrmann R 1998 Snurportinl an M3G cap specific nuclear
121. osystems Darmstadt 2 1 8 Chromatographies ulen und S ulenmaterial HiTrapChelating Ni NTA Sepharose 1 ml HiTrapChelating Ni NTA Sepharose 5 ml HiTrapChelating NTA Sepharose S ulenmaterial HisTrapChelating Ni NTA Sepharose 1 ml Superdex200 DEAE Sepharose FF Phenylsepharose FF Resource Q XK 16 20 XK 26 60 Amersham Pharmacia Biotech Freiburg Amersham Pharmacia Biotech Freiburg Amersham Pharmacia Biotech Freiburg Amersham Pharmacia Biotech Freiburg Amersham Pharmacia Biotech Freiburg Amersham Pharmacia Biotech Freiburg Amersham Pharmacia Biotech Freiburg Amersham Pharmacia Biotech Freiburg Amersham Pharmacia Biotech Freiburg Amersham Pharmacia Biotech Freiburg 2 1 9 Antibiotika Ampicillin Kanamycin Chloramphenicol 2 1 10 Kristallisationsscreens Crystal Screens 1 2 Crystal Screen Lite Crystal Screen Cryo Crystal Screen PEG Ion JB Screens 1 10 Magic Screen Footprint Screens 1 3 Structure Screens 1 3 Strategy Screens 1 3 2 1 11 sonstige Materialien Sterilfilter Glasger te Crystal Clear Tape Reaktionsgef sse 0 5 ml 1 5 ml 2 0 ml Reaktionsgef sse 15 ml 50 ml Deckgl schen 6er Reservoir Gewebekulturschalen 24Well Kristallisationsschalen sitting drop Objekttr ger Parafilm Pipetten verstellbar Pipettenspitzen Vivaspin Konzentratoren Roche Mannheim Roth Karlsruhe Roth Karlsruhe Hampton Research USA Hampton Research USA Hampton Research USA Hampton Resear
122. phate Buffered Saline Polymerase Chain Reaction Vorl ufer mRNA Ribonucleins ure Ribonukleoprotein rounds per minute ribosomale RNA Sekunde Saccharomyces cerevisiae Natrium Dodecylsulphat small nuclear Thymidin Tabelle Tris Borat EDTA L sung N N N N Tetra methylethylendiamin Tris hydroxymethyl aminomethan Hydrochlorid Transfer RNA Unit uridine rich small nuclear ribonucleoprotein particle Ultraviolett Volt vergleiche volume per volume weight per volume zum Beispiel
123. plasm Nucleus Nuclear pore o N complex RanGTP binding e7 gt os RanGTP as zi Cargo N Export delivered to cargo nucieus cargo A amp oe ro RanBP1 ox RanBP1 Abb 5 Impo Imp vermittelter Transport eines Substrates mit klassischem NLS Die Formierung des Impa ImpB Heterodimers 10 ist die Voraussetzung f r die Bindung des Transportsubstrats 1 Impa stellt dabei die Bindungs dom ne f r das Substrat bereit Nach der Translokation durch die Kernpore 2 3 setzt die Bindung von RanGTP an Imp den Impa Substrat Komplex ins Karyoplasma frei 4 Dort dis soziiert das Substrat von Impa 5 Die Importrezeptoren wer den in das Cytosol exportiert 6 7 und durch die Hydrolyse des GTP freigesetzt 8 und 9 Abb entnommen aus Gorlich EMBO J 1998 Abb 6 Schema von Import und Exportzyklen durch den NPC Der Vergleich von Im und Export zeigt da die Bindung von RanGTP an den Importrezeptor nach der Translokation durch den NPC geschieht w hrend bei Exportprozessen die Bindung vor der Translokation erfolgen mu Beides geschieht aber im Nucleus Es wird die entgegen gesetzte Affinit ts nderung von Im und Exportrezeptoren zum Substrat nach RanGTP Bindung deutlich Abb entnommen aus Str m und Weis Genome Biol 2001 Die Freisetzung des Substrats erfolgt hier durch die durch RanBP1 und RanGAPI vermittelte Hydrolyse des GTP Auf diese Weise wird der gerichtete
124. ports verfeinern k nnte Schlie lich gelang auch die Aufreinigung des tern ren Imp Imp7 Hl Komplexes die allerdings f r die Kristallisation noch optimiert werden mu vgl 3 2 4 4 1 Expression und Aufreinigung von rekombinantem Importin 7 F r die Kristallisation von Imp7 aus Xenopus laevis werden gro e Mengen rekombinanten Proteins ben tigt Hierzu sollte ein Protokoll entwickelt werden das es erm glicht Imp7 in E coli zu exprimieren und aufzureinigen Dies sollte m glichst zeitsparend und mit m glichst gro en Ausbeuten durchf hrbar sein Die Synthese von rekombinantem Imp7 gestaltete sich in den meisten der getesteten E coli St mme sehr schwierig M glicherweise hat Imp7 toxische Eigenschaften in E coli da es basische Proteine und auch zum Teil DNA binden kann Rout et al 1997 J kel und G rlich 1998 Goff 2001 Die Verwendung von E coli SG13009 l ste dieses Problem Dieser Stamm wird vom Hersteller Qiagen f r die Expression toxischer Proteine empfohlen Dar berhinaus ist dieser Stamm f r die Expression von Proteinen in pQE Vektoren besonders geeignet da seine Transkriptionsmaschinerie auf solche Vektoren zugeschnitten ist Durch die Zugabe von 2 Glucose konnte die Basisexpression deutlich gesenkt und damit die Selektion von Deletionsmutanten verhindert werden vgl 2 2 3 4 2 Dies steigerte die Expression von Vollangen Imp7 erheblich Bei der Verwendung von SG13009 pREP4 wurde auf die Zugabe von Glucose ver
125. r Fragmente aus den vier Reaktionsans tzen kann so die Sequenz abgeleitet werden Mit dem Seq Mix BigDye Terminator v1 1 von Applied Biosystems kann die komplette Reaktion in einem einzigen Ansatz durchgef hrt werden F r einen typischen Sequenzierungsansatz werden pipettiert 200 ng Template 8 pmol Primer 1 ul Seq Mix ad 10 ul H O Das PCR Programm f r Sequenzierungsreaktionen ist dem unter 2 2 4 1 1 genannten Programm analog Die Annealing Temperatur ist abh ngig von den verwendeten Sequenzierprimern die Elongationszeit von der L nge des zu sequenzierenden DNA Fragments Nach der PCR werden die Produkte f r den Sequenzierungsautomaten aufgereinigt um st rende Faktoren wie Primer und Polymerase zu entfernen Hierzu wird dem Ansatz hinzupipettiert lul 125 mM EDTA lul 3MNaAc 50 ul Ethanol abs Der Ansatz wird vorsichtig durch leichtes Antippen mit der Fingerspitze durchmischt f r 5 min inkubiert und anschlie end zentrifugiert 20 000 x g 15 min 4 C Der berstand wird abgenommen das Pellet in 70 ul Ethanol 70 gewaschen Es folgt eine weitere Zentrifugation 20 000 x g 5 min 4 C Das Pellet wird 2 min an der Luft getrocknet und schlie lich in 30 ul HPLC Wasser aufgenommen Die gereinigten DNA Fragmente wurden in dieser Arbeit in einem Kapillarsequenzierer von Applied Biosystems analysiert 2 2 2 3 Plasmidpr parationen 2 2 2 3 1 Plasmidpr paration im mittleren Ma stab F r die Vermehrung u
126. r erste Peak des 97 2 gt Chromatogramms Abb e Empe 24 korrespondiert mit 664 gt w den Fraktionen 10 und 11 i Fraktion 12 zeigt einen a TIS deutlichen berschu Die Imp da diese Fraktion neben dem absteigenden 2 Schenkel des ersten Peaks zum Teil bereits den zweiten Peak repr sen Se tiert Dieser wird im Gel n Fraktion 13 als unge bundenes Imp identifiziert M BR Marker die Nummern entsprechen den Fraktionen des Eluats 3 2 3 2 Die Co Aufreinigung von Imp ohne Affinit tssequenz mit immobilisiertem His s Imp7 Um ein reines aktives Heterodimer aus Imp und Imp7 zu gewinnen und die Anzahl der His Tags im Dimer von zwei auf einen zu reduzieren wurde eine Co Affinit tsreinigung gem 2 2 4 2 durchgef hrt Dabei wurde zun chst 1 mg aufgereinigtes Imp7 vgl 3 1 3 auf einer HiTrapChelating Ni NTA Sepharose S ule immobilisiert Nun wurden 3 mg vorgereinigtes Imp ohne Affinit tssequenz vgl 3 2 2 auf die S ule geladen und ungebundenes Imp nach einer 15 min tigen Inkubation durch Sp len mit Waschpuffer entfernt Schlie lich wurde das Heterodimer im Imidazolgradienten eluiert Abb 26 Die Fraktionen des Eluats wurden anschlie end durch SDS PAGE analysiert Abb 27 Pulldaunassayb amp 37220204 1 _UNVI_2 amp 0nm Pulldownassaybeta 220204 1_U V2_260nm Puldownassaybeta 220204 1_Cone Pulldownassaybeta 220204 1_ Fractions Abb 26 Ch
127. r in sein origin res Kompartiment zur ck Eine zentrale Rolle bei Kerntransportprozessen spielt der Phosphorylierungs Dephos phorylierungszyklus der kleinen ras verwandten GTPase Ran Nigg et al 1991 Davis 1992 Melchior et al 1993 Moore und Blobel 1993 Guiochon Mantel et al 1994 Er ist in Abb 4 dargestellt Die GTPase Dom ne von Ran kann GTP zu GDP und P hydrolysieren Sie kommt deshalb in zwei Formen vor Die eine ist GTP gebunden und liegt berwiegend im Karyoplasma vor die andere ist GDP gebunden und ist nahezu vollst ndig cytoplasmatisch Abb 4 Der RanGTPase Zyklus Die GTP Hydrolyse P H 0 a erfolgt im Cytoplasma Die N Ran Imp Aktivierung der GTPase GTP Exp geschieht durch die Bindung von RanGAPI und RanBP1 Eran Der Import von RanGDP in den Kern wird durch NTF2 vermittelt Dort erfolgt der Cytoplasm Nucleotidaustausch durch RCC1 Am Austausch sind 5 s m glicherweise auch RanBP1 Nucinopiasm und Mogl beteiligt Der i An ae ra Export von RanGTP durch die Bindung an ein RanGDP bindendes Karyopherin RanGEF RCC1 Imp Exp beschlie t den RanBP1 Mogt Ran Imp Zyklus g x GIP Exp GTP GDP Uber den NE besteht ein ausgepragter Gradient mit einer hohen Konzentration an RanGTP im Kern und einer niedrigen im Cytoplasma Der RanGDP Gradient ist entgegengerichtet G rlich et al 1996b Izaurralde et al 1997 und wird durch das Zusammenspiel mehrerer Enzyme erzeugt
128. rden Nach einem erfolgreichen Import befinden sich die fluoreszenzmarkierten Transportsubtrate im Zellkern und k nnen mittels Fluoreszenzmikroskopie detektiert werden Schritt 1 Permeabilisierung der Zellen Es werden 2 x 10 Zellen 2 Tage beziehungsweise 5 x 10 Zellen 1 Tag vor Versuchsdurchf hrung auf sterilen Deckgl schen 10 mm in 6er Reservoir Gewebekulturschalen ausges t Die Deckgl schen werden vor Versuchsbeginn in eisgek hlten Transportpuffer transferiert Der Transportpuffer wird abgesaugt kalter Permeabilisierungspuffer PB 4 ml Well erg nzt und nicht l nger als 10 min inkubiert Der PB wird abgesaugt und die Zellen dreimal mit kaltem Transportpuffer gewaschen Waschzeiten 1 min 5 min 10 min Die Deckgl schen werden vorsichtig abgetropft Anschlie end werden sie in einer feuchten Kammer inkubiert Nach dieser Behandlung sind die Zellen f r den eigentlichen Transportvorgang vorbereitet Schritt 2 Transport Reaktion Nach dem Entfernen bersch ssiger Fl ssigkeit von den Deckgl schen wird der komplette Import Mix Die Ans tze haben vorzugsweise ein Volumen von 20 ul auf die Zellen gegeben und in einer feuchten Kammer f r 15 min bei RT inkubiert Schritt 3 Fixieren der Zellen und Detektion Der Import Mix wird von den Zellen abgesaugt Nun werden die Zellen zweimal mit Transportpuffer gewaschen Nach den Waschschritten werden die Zellen durch Inkubation mit 3 Paraformaldehyd f r 15 min bei 37 C
129. rnporenkomplexes Die Darstellung des Querschnitts durch den NPC zeigt die einzelnen Komponenten im Verbund miteinander B Strukturelle Darstellung des NPC Links Dreidimensionale Struktur des NPC Rechts Direkte Visualisierung der einzelnen Komponenten des Kernporenkomplexes durch FEISEM Die Komponenten sind einzeln dargestellt Der mehrlagige Aufbau des NPC gibt vom Membraninnern nach au en hin in etwa den Neuaufbau des NPC nach einer Mitose wider modifiziert nach Goldberg et al 1999 Abb entnommen aus Allen et al J Cell Sci 2000 1 2 2 Kerntransport durch den NPC Der NPC erm glicht zwei Wege des Durchtritts von Molek len in den Nucleus oder in das Cytoplasma passive Diffusion und erleichterten Transport Passive Diffusion durch die Pore ist mit ausreichender Geschwindigkeit aufgrund des Durchmessers des Diffusionskanals lediglich Molek len mit einer Masse von 20 30 kDa vorbehalten Paine et al 1975 G rlich m ndl Mitteilung 2004 Jedoch gibt es viele Beispiele von kleineren Molek len die dennoch aktiv transportiert werden wie z B Ran und Histone Breeuwer und Goldfarb 1990 J kel et al 1999 auf beide wird noch eingegangen Der Mechanismus der Translokation durch den Zentralkanal des NPC wird mit dem sog selektiven Phasenmodell beschrieben Ribbeck und G rlich 2001 Ein gro er Teil der kanalbildenden Proteine besitzt seriell angeordnete Dom nen die aus einer Anzahl kurzer Peptide gebildet werden Diese bes
130. romatogramm der Co Affinit tsreinigung Das Elutionsprofil nach Inkubation von Imp und Imp7 zeigt da ungebundenes Imp ohne His Tag erwartungsgem bereits durch den Bindungs Waschpuffer eluiert wird Der Imp Imp7 Komplex eluiert zwischen 80 und 100 mM Imidazol Fraktionen 16 20 Die Starke der Bindung des Komplexes tiber den His Tag von Imp7 ist mit der von Imp7 allein absolut identisch Der His Tag interagiert offensichtlich nicht mit der Bindungsdom ne von Imp7 f r Imp Blau UV Absorption bei 280 nm Rot UV Absorption bei 260 nm Gr n Elutionsgradient M2 3 6 8 10 13 1719 21 Abb 27 SDS PAGE Analyse des Eluats des Pulldown Assays In den Fraktionen 2 und 3 ist mp7 deutlich zu sehen da die Verunreinigungen aus der Pr paration des ungetaggten Imp el hochselektiv entfernt wurden Da Imp im berschu zugesetzt j worden war ist es ber eine relativ A i gro e Breite in den ersten Fraktionen zu finden Das Heterodimer aus Imp und Imp7 ee findet sich in den Fraktionen des Peaks im Elutionsgradienten Abb 23 Dies ist am quimolaren Verh ltnis beider Proteine in den Peak Fraktionen zu erkennen M 102 oe a ImpR 45 Marker die Nummern 27 E repr sentieren die Fraktionen des Pulldown Assays Die Fraktionen welche das Heterodimer enthielten wurden vereinigt und f r die Aktivit tstests mittels in vitro Import Assay vgl 3 3 auf 1 1 mg ml 5 uM an
131. s Imp7 Monomers f r die Co Affinit tsaufreinigung mit Imp zwingend notwendig da sich das Imp7 Dimer in dieser Aufreinigung meist genauso verh lt wie das Imp Imp7 Heterodimer vgl 3 1 3 2 und 3 2 4 Sie k nnen nicht voneinander getrennt werden auch nicht durch eine anschlie ende Gelfiltration da sie in ihrer Gr e zu hnlich sind Das Imp7 Dimer hat ein Molekulargewicht von 239 kDa das Imp Imp7 Heterodimer eines von 217 kDa Bei der Gelfiltration des Bindungsansatzes mit dem Histon H1 konnte der tern re Komplex aus Imp Imp7 und H1 ebenfalls nicht vom Imp7 Dimer getrennt werden da sie mit 238 beziehungsweise 239 kDa ein nahezu identisches Molekulargewicht besitzen Allerdings konnte in der vorausgehenden Co Affinit tsaufreinigung vgl 3 2 3 2 und 4 2 2 belegt werden da Imp und monomeres Imp7 in einer 1 1 St chiometrie aneinander binden Da deshalb die Intensit t des Signals und damit die Menge an Imp indirekt auch derjenigen von im Heterodimer gebundenem Imp7 entspricht kann so von der Signalintensit t von Imp in den Fraktionen des tern ren ImpB Imp7 H1 Komplexes auf die Menge an in diesem Komplex gebundenem Imp7 geschlossen werden Da das Signal von Imp in der SDS PAGE Analyse des Gelfiltrationseluats exakt genauso deutlich ist wie jenes des Histons legt dies eine f r alle drei Bindungspartner quimolare St chiometrie nahe vgl Abb 29 Das in der Co Affinit tsaufreinigung gebildete Heterodimer ist a
132. s verdauten DNA Fragments in einen Zielvektor durch DNA Ligasen Ligasen katalysieren die Phosphodiesterbildung benachbarter Nucleotide eines DNA Stranges In der Natur spielen sie deshalb bei der DNA Replikation eine entscheidende Rolle Sie verkn pfen z B die Okazaki Fragmente eines zum Mutterstrang neu gebildeten komplement ren Tochterstranges In der Molekularbiologie werden sie dazu benutzt komplement re sticky ends von DNA Fragmenten nach der Hybridisierung der berh ngenden Enden zu verkn pfen Sie erm glichen auf diese Weise das Einklonieren von Genen in ein geschnittenes Plasmid Ein typischer Ligationsansatz setzt sich wie folgt zusammen 0 2 ul Ty DNA Ligase 10 U l 2 ul geschnittener Vektor 6 ul Insert 2 ul T4 DNA Ligase Puffer 10x ad 20 pl H20 2 2 2 2 Sequenzierung von DNA Fragmenten Die Sequenzierung von DNA wird mit der didesoxy Methode nach Sanger 1977 durchgef hrt Dabei werden bei der Amplifikation der zu sequenzierenden DNA in einer PCR Kettenabbr che der Polymerase Reaktion durch den zuf lligen Einbau eines ddNTPs didesoxy Ribonucleosidtriphosphat erzeugt Hierzu werden vier PCR Ans tze mit dNTPs versetzt Eines der vier liegt jedoch nicht als dNTP sondern als ddNTP vor Da hier die 3 OH Gruppe fehlt kommt es zum Kettenabbruch Der Statistik folgend ist damit jedes m gliche auf das entsprechende ddNTP endende Fragment im jeweiligen Reaktionsansatz vorhanden Durch einen L ngenabgleich de
133. sich durch Translation oder Additionen dieser Einheitszelle erzeugen l t und dadurch eine unendliche Periodizit t entsteht werden die R ntgenstrahlen an theoretischen Ebenen durch den Kristall gebeugt Das aus einem R ntgenbeugungsexperiment resultierende Beugungsmuster stellt daher viele einzelne Punkte dar die durch eine reverse Fourier Transformation die Raumkoordinaten der theoretischen Ebenen genauer die Schnittstellen dieser Ebenen mit den drei Raumachsen wiedergeben an denen der R ntgenstrahl gebeugt wurde So kann aus einem Datensatz mit vielen solcher R ntgenbeugungsmuster eine sog Elektronendichtekarte der Einheitszelle im Kristall erstellt werden In dieses wird durch PC Analysemethoden die Aminos uresequenz des Proteins eingebaut so da schlie lich eine dreidimensionale Struktur des untersuchten Proteins auf atomarer Ebene dargestellt werden kann F r die Durchf hrung eines R ntgenbeugungsexperiments wird der Proteinkristall mit einer kleinen Schlinge aus dem Kristallisationstropfen entnommen und vor den Strahlengangverschluss des Diffraktometers gespannt Dabei wird der Kristall in einem Stickstoffgasstrahl gek hlt und anschlie end der R ntgenstrahlung ausgesetzt Dabei rotiert der Kristall dreidimensional um vorher definierte Gradzahlen um so durch die Drehung der theoretischen Ebenen durch den Kristall ein Beugungsspektrum zu erhalten F r Testzwecke also um zu verifizieren ob der Kristall aus Protein oder Sal
134. sich gleichm ig an Aminos uren an und denaturiert und entfaltet dabei das Protein Zus tzlich werden Disulfidbr cken durch B Mercaptoethanol das im Probenpuffer enthalten ist reduziert und dadurch gespalten Es entsteht ein SDS Protein Komplex mit nach au en gerichteten negativen Ladungen Die Eigenladungen des Proteins sind jetzt vernachl ssigbar und der entstandene Komplex besitzt ein konstantes Masse Ladungs Verh ltnis Unter diesen Bedingungen sind Proteine unabh ngig von ihrer Faltung in einem Molekularsieb wie dem Polyacrylamidgel nach ihrem Molekulargewicht separierbar Das Prinzip der diskontinuierlichen Gelelektrophorese beruht auf der Fokussierung von Proteinen durch einen pH Sprung von zwei bereinander geschichteten Polyacrylamidgelen Das untere Trenngel enth lt einen Puffer mit einem pH Wert von 8 8 und einem Leition hoher Ionenbeweglichkeit Der pH Wert des dar bergeschichteten Sammelgels liegt deutlich tiefer bei 6 8 Das Leition des Sammelgels besitzt geringere Ionenbeweglichkeit Der Elektrodenpuffer enth lt ein Folgeion geringer Ionenbeweglichkeit dessen Ladung allerdings pH abh ngig ist Durch das Einschalten des Stromes wandern die Leitionen des Laufpuffers mit hoher Geschwindigkeit durch das elektrische Feld und berholen dabei die aufgetragenen Proteine Daraus resultiert hinter den Proteinen eine Zone geringerer Ionendichte und erh hter Feldst rke aufgrund dessen die Proteine und Folgeionen beschleunigt w
135. so denaturiertes Pr zipitat Eine Kristallbildung war in keiner Bedingung zu erkennen Insgesamt bot sich ein ahnliches Bild wie bei den ersten Kristallisationsversuchen von Imp7 allein vgl 3 4 1 Da die Pr zipitatbildung ein gro es Problem darstellte wurden die selben Eingangsbedingungen auch bei 4 C pipettiert Die Pr zipitatbildung ging erkennbar zur ck zur Bildung von Kristallen kam es aber nicht 4 Diskussion Das Ziel dieser Diplomarbeit bestand darin eine Expressions und Aufreinigungsstrategie f r den Kernimportrezeptor Importin 7 aus Xenopus laevis zu etablieren um das in hochreiner Form gewonnene Protein zu kristallisieren Dies sollte r ntgenkristallographische Analysen der Struktur des Proteins erm glichen Weiterhin sollte auch das Heterodimer aus Importin 7 und seinem bekannten Bindungspartner Importin B zur Kristallisation gebracht werden Dazu sollte auch f r Importin B eine Expression und Aufreinigung etabliert werden Da dadurch eine Co Aufreinigung beider Rezeptoren erm glicht werden sollte mu te Imp in einer Form ohne Affinit tssequenz vorliegen Dies w rde eine Co Affinit tsaufreinigung mit immobilisiertem Imp7 erlauben So lie e sich das Heterodimer in hochreiner Form gewinnen was f r die Kristallisation unerl lich ist Die Etablierung der Expression und Aufreinigung von rekombinantem Imp7 und Imp gelang vgl 3 1 und 3 2 ebenso wie die Co Affinit tsaufreinigung beider Rezeptoren vgl 3 2 3
136. ss R Corbett A H Stewart M 2000a The molecular mechanism of transport of macromolecules through nuclear pore complexes Traffic 1 448 456 Bayliss R Littlewood T Stewart M 2000b Structural basis for the interaction between FxFG nucleoporin repeats and importin beta in nuclear trafficking Cell 102 1 99 108 Bayliss R Littlewood T Strawn L A Wente S R Stewart M 2002 GLFG and FxFG nucleoporins bind to overlapping sites on importin beta J Biol Chem 277 52 50597 50606 Bednenko J Cingolani G Gerace L 2003a Nucleocytoplasmic transport navigating the channel Traffic 4 127 135 Bednenko J Cingolani G Gerace L 2003b Importin contains a COOH terminal nucleoporin binding region important for nuclear transport J Cell Biol 162 3 391 401 Ben Efraim I Gerace L 2001 Gradient of increasing affinity of importin B for nucleoporins along the pathway of nuclear import J Cell Biol 152 2 411 417 Bischoff F R Ponstingl H 1991 Catalysis of guanine nucleotide exchange on Ran by the mitotic regulator RCC1 Nature 354 80 82 Bischoff F R Klebe C Kretschmer J Wittinghofer A Ponstingl H 1994 RanGAP1 induces GTPase activity of nuclear ras related Ran Proc Natl Acad Sci USA 91 2587 2591 Bischoff F R Postingl H 1995 Catalysis of guanine nucleotide exchange of Ran by RCC1 and stimulation of hydrolysis of Ran bound GTP by Ran GAP1 Meth
137. ssay Auf die gleiche Weise lie e sich das Bindungsverhalten des ImpB H1 Komplexes oder des Imp7 H1 Komplexes in Gegenwart des jeweils anderen Importrezeptors untersuchen Beide Ans tze gemeinsam k nnten die Bildung von Aggregaten im Cytosol erkl ren Die postulierte Energieabh ngigkeit des NPC Durchtritts des tern ren Komplexes also die Dissoziation von Nup153 nach RanGTP Bindung lie e sich in Gegenwart eines nicht hydrolysierbaren GTP Analogons wie zum Beispiel PNP GMP nachweisen Dies k nnte im in vitro Import Assay gezeigt werden wenn durch einen Rezeptor berschuss ein m glicher single round Import sichtbar gemacht w rde Dies k nnte alternativ durch eine Antik rperf rbung gegen die Fluoreszenzsequenz des im Import Assay verwendeten Histons erreicht werden Dar berhinaus sind weitere biochemische Charakterisierungen n tig Hierbei sollte insbesondere mithilfe von Deletionsmutanten auf die sauren Loops im C Terminus von Imp7 und ihre Interaktionen mit Impp und H1 eingegangen werden Weiterhin mu gekl rt werden von welcher Gestalt die verschiedenen Konformationen von Imp7 und Imp w hrend des H1 Imports sind F r die Aufkl rung der Strukturen dieser Konformationen wird es notwendig sein die einzelnen Zwischenprodukte des Importprozesses zu kristallisieren um eine R ntgenstrukturanalyse zu erm glichen So k nnte gekl rt werden ob eine nderung der Konformation dieser Loops in Abh ngigkeit von Imp f r die C
138. t t und ist ein schwacher Anionentauscher dessen Trennverhalten ausreichend war um viele Verunreinigungen beseitigen zu k nnen Die Wahl des pH Wertes von 6 2 im Laufpuffer war dabei entscheidend da Imp hier im Gradienten eluiert wurde und so am wenigsten Fremdprotein miteluierte vgl 3 2 2 2 und Abb 19 und 20 Dennoch war aber zu viel Fremdprotein in den Imp haltigen Fraktionen enthalten Diese Verunreinigungen konnten durch eine Gelfiltration zu einem gro en Teil entfernt werden obwohl auch nach der Gelfiltration der Anteil der Verunreinigungen am Gesamtprotein immer noch etwa 20 betrug vgl 3 2 2 3 und Abb 21 und 22 Ein weiterer Reinigungsschritt wie z B die Verwendung einer hydrophoben Interaktionss ule mit Phenylsepharose w re m glich gewesen da Imp leicht hydrophobe Eigenschaften hat A Strasser pers nliche Mitteilung Darauf wurde aber verzichtet da die Reinheit nach der Gelfiltration f r die Co Affinit tsaufreinigung mit immobilisiertem Imp7 v llig ausreichend war Es war hier n mlich vornehmlich wichtig die Menge an Imp f r die Aufreinigung des Heterodimers mit Imp7 in etwa einsch tzen zu k nnen Die Ausbeute an rekombinantem Imp war schlie lich selbst unter Ber cksichtigung der Verunreinigungen hoch genug um eine Co Kristallisation mit Imp7 nach der gemeinsamen Affinit tsaufreinigung vornehmen zu k nnen vgl Tab 8 4 2 2 Co Aufreinigung von Importin B und Importin 7 Die Zugabe von His s Imp
139. t werden um deren Aktivit t zu testen In dieser Arbeit wurde der Assay durchgef hrt um die rekombinant hergestellten Kernimportrezeptoren Importin Importin7 sowie das Imp Imp7 Heterodimer auf ihre Funktionalit t zu testen F r den in vitro Import Assay werden adh sive Zellen der immortalen HeLa Tumorzellinie 24 Stunden vor der Durchf hrung des Import Assays auf Deckgl schen in 6er Reservoir Gewebekulturplatten ausges t Der Import Assay wird durchgef hrt wenn die Zellen eine Konfluidit t von etwa 70 aufweisen Beim Import Assay werden die Zellmembranen durch Digitoninbehandlung permeabilisiert Digitonin ist ein Steroid Glycosid das spezifisch 3 Hydroxysterole bindet und daher die cholesterinreiche Plasmamembran selektiv permeabilisiert w hrend die Kerndoppelmembran funktionell nicht beeintr chtigt wird da sie keine Cholesterin Bausteine enth lt Die Digitoninpermeabilisierung erfolgt in Anwesenheit eines ATP regenerierenden Systems Dies hat zur Folge dass so auch an den Kernmembranen der HeLa Zellen gebundene ansonsten aber l sliche endogene Transportrezeptoren entfernt werden Nun werden die Zellen mit einem physiologischen Transportpuffer gewaschen Es entsteht dadurch ein riesiges gemeinsames Cytosol aller HeLa Zellen eines einzelnen Reservoirs welches auch als well bezeichnet wird Daher k nnen rekombinante Faktoren und Substrate einfach mit den Zellen inkubiert und nach erfolgtem Import weggewaschen we
140. t wurden lassen sich selektiv ber eine Affinit tschromatographie mittels immobilisierter Metallchelatkomplexe aufreinigen IMAC engl immobilized metal chelating affinity chromatography Hierbei bilden zwei Histidine ber die freien Elektronenpaare ihrer Stickstoffe koordinative Bindungen zu einem immobilisierten Metallion aus Dabei bildet sich ein Chelatkomplex der kompetitiv durch Imidazol aufgel st werden kann Die Metallionen z B Ni oder Co m ssen zweiwertig sein und sind meistens an NTA Nitrilotriessigs ure Sepharose gebunden Bei der IMAC d rfen die verwendeten Puffer weder DTT noch EDTA enthalten da chelatkomplexbildende Substanzen die Kopplung der Proteine st ren Anstelle von DTT wird daher B Mercaptoethanol eingesetzt In dieser Arbeit wurden f r die Aufreinigung von Proteinen mit His Sequenz die HiTrapChelating Ni NTA Sepharose S ulen von Amersham Pharmacia Biotech benutzt Als Metallion wird Nickel benutzt das ber vier koordinative Bindungen an NTA gebunden ist NTA ist kovalent an die Sepharose Tr germatrix gebunden F r die Affinit tschromatographien mit Ni NTA Sepharose wurden Akta Purifier HPLCs benutzt Nach dem Laden der Proteinprobe auf die S ule ber einen 50 ml Superloop wird mit vier S ulenvolumina 20 mM Imidazol im Waschpuffer gewaschen um unspezifisch gebundene Proteine zu entfernen Anschlie end wird ber einen aufsteigenden Imidazolgradienten eluiert Das Eluat wird fraktioniert und die Fraktionen
141. ten 2YT Mediums 20 ml Ethanol abs und 0 3 mM IPTG induziert Die Induktionszeit betrug 18 Stunden bei 16 C Die Expressionsbedingungen sind zusammenfassend in Tab 7 dargestellt Tab 7 Expressionsbedingungen f r Imp Expressions erforderliche Expressions Induktionszeit Stamm Induktion vektor Antibiotika medium und temperatur 100 mg l 0 3 mM E coli 2 YT pQE 60 Ampicillin IPTG 2 18h SG13009 2 w v Imp no tag 50 mg l v v EtOH bei 16 C pREP4 Glucose Kanamycin abs 3 2 2 Aufreinigung von Importin B 3 2 2 1 Zellernte und aufschlu Bei Ernte und Aufschlu8 wurde wie unter 2 2 2 5 angegeben verfahren Der Uberstand des Zellysats nach der Ultrazentrifugation wurde unmittelbar vor dem Beladen der DEAE Sepharose S ule durch einen Aufsatzfilter f r Spritzen mit einer Porengr e von 200 nm Durchmesser filtriert Der pH Wert des Lysis Startpuffers wurde durch Bindungsstudien an DEAE Sepharose bei verschiedenen pH Werten bestimmt Erwartungsgem lag der ideale pH Wert f r die Anionenaustauschchromatographie etwa eine pH Einheit ber dem theoretischen berechneten pI von Imp pI 4 9 n mlich bei 6 2 vgl 3 2 2 2 Lysispuffer 20 mM BisTris HCl pH 6 2 100 mM NaCl 2 mM B Mercaptoethanol 3 2 2 2 Anionenaustauschchromatographische Aufreinigung von Imp F r die Anionenaustauschchromatographie wurde mit einer DEAE Sepharose FF S ule nach den Angaben in 2 2 4 1 2 1
142. und Aufreinigung von Imp7 auch eine Strategie zur Gewinnung von Imp ohne Affinit tssequenz etabliert werden um so eine Co Aufreinigung mit Imp7 in st chiometrischem Verh ltnis zu erm glichen Dies k nnte die Wahrscheinlichkeit der Kristallisation von Imp7 erh hen da dieses durch Substratbindung vermutlich stabilisiert wird 3 2 1 berexpression von Importin in E coli Imp war bereits in den Vektor pQE60 kloniert worden Der normalerweise in diesem Vektor enthaltene N terminale His Tag war zuvor entfernt worden Der Vektor wurde von Prof Dr D G rlich zur Verf gung gestellt Er wurde in XL1 Blue vermehrt und durch eine Maxi Pr paration isoliert vgl 2 2 3 3 2 Da bereits bekannt war da der Stamm E coli M15 Imp mit His Affinit tssequenz effektiv exprimieren kann wurden f r die Expressionstests die nah miteinander verwandten St mme M15 und SG13009 pREP4 verwendet In beiden St mmen wurde Imp bei 16 C ausreichend stark exprimiert vgl Abb 18 Dabei zeigt sich da das apparente Molekulargewicht des Proteins im SDS Gel geringer als 97 kDa zu sein scheint Dies deckt sich mit Beobachtungen anderer Arbeitsgruppen A Strasser 2003 pers nliche Mitteilung Es wurde der Stamm SG13009 pREP4 ausgew hlt da hier die Basisexpression schw cher als in M15 war M15 SG13009 pREP4 Abb 18 Expressionstests von M vi nl vi anl Impp bei 16 C SDS PAGE Impp hat gem seinem A Laufverhalten ei
143. vorgegangen Es wurden drei verschiedene pH Werte in den Puffern getestet 20mM L Histidin HCl pH 5 7 20mM BisTris HCl pH 6 2 20mM BisTrisPropan HCl pH 7 0 100 mM NaCl 100 mM NaCl 100 mM NaCl 2 mM Mercaptoethanol 2 mM f Mercaptoethanol 2 mM f Mercaptoethanol Lediglich bei Verwendung des BisTris haltigen Puffers mit pH 6 2 band Imp einerseits so fest da es nicht im Durchfluss von der S ule gewaschen wurde wie bei Verwendung von L Histidin pH 5 7 nicht dargestellt und andererseits so leicht da es im Gradienten von der S ule eluiert werden konnte Bei Verwendung von BisTrisPropan pH 7 0 war dies nicht mehr gegeben nicht dargestellt Das Elutionsprofil ist in Abb 19 dargestellt ni 2004 Feb 4 000 1 1_U 2004Feb 4r0001 1_Cand D04Feb100L 1 Come 777 2004Feb 420001 1_Fracions p2 Abb 19 Elutionsprofil von Imp in der Anionenaustauschchromatographie ber eine DEAE Sepharose S ule Die Fraktionen 31 47 enthalten Imp in gro en Mengen Bedingt durch die begrenzte Aufl sungskapazit t der DEAE Sepharose ist der Peak sehr langgezogen Auff llig ist das Auftreten zweier H cker im Imp Peak die aber nicht von Imp herr hren sondern von anderen Proteinen die Verunreinigungen darstellen vgl Abb 20 Blau UV Absorption bei 280 nm Rot relative Leitf higkeit Gr n Elutionsgradient Die Fraktionen des Eluats wurden durch SDS PAGE analysiert Abb 20 die Imp enthaltenden Fraktionen vere
144. xes NPC engl nuclear pore complex vermittelt den gerichteten Transport von Substraten durch die Kernh lle der Eukaryoten 1 2 1 Der Kernporenkomplex Im Zentrum des Kerntransports steht die Kernpore Sie ist einer der gr ten makromolekularen Komplexe der Zelle Sie hat ein gesch tztes Molekulargewicht von etwa 125 MDa Reichelt et al 1990 und besteht aus etwa 30 Proteinen die jeweils in mehreren Kopien vorliegen Cronshaw et al 2002 und als Nucleoporine bezeichnet werden Der Kernporenkomplex der Hefe ist etwas kleiner mit ebenfalls etwa 30 verschiedenen Nucleoporinen kurz Nups und einem Molekulargewicht von etwa 66 MDa Rout und Blobel 1993 Rout et al 2000 Allen NPCs aber ist eine achtfache Rotationssymmetrie gemein Die Zahl der Kernporen pro Zelle variiert mit der Zellgr e und Synthese und Proliferationsaktivit t des Zelltyps Eine proliferierende humane Zelle besitzt etwa 3000 5000 Poren eine einzige reife Xenopus Oozyte enth lt hingegen sogar etwa 5x10 Kernporen Cordes et al 1995 Der NPC durchspannt die Kernh lle NE engl nuclear envelope und bildet einen wassergef llten Kanal zwischen Karyo und Cytoplasma Der Komplex ist ber die drei Proteine gp210 POM121 und POM152 in der Kernmembran verankert Pante et al 1996 S derqvist et al 1997 Neben diesem 55 MDa gro en zylindrischen Kernger st besitzt die Kernpore karyo und cytoplasmatische Ringe denen Filamente auf cytoplasmatischer Seite u
145. z besteht wird oft um 5 Grad binnen einer Minute gedreht Das Beugungsmuster wird ber einen strahlungssensitiven Schirm detektiert und am PC ausgewertet 3 Ergebnisse Der Ergebnisteil gliedert sich in vier Abschnitte Im ersten Teil wird erl utert wie eine Expressions und Aufreinigungsstrategie f r den Kernimportrezeptor Importin 7 aus Xenopus laevis etabliert wurde um das Protein in ausreichender Reinheit f r die Kristallisation zu gewinnen Im zweiten Teil wird gezeigt wie die Expression und Aufreinigung f r den Kernimportrezeptor Importin B ohne Affinit tssequenz etabliert wurde und wie das Protein gemeinsam mit Imp7 mit N terminaler His Sequenz in der Co Affinit tsaufreinigung gewonnen wurde Der dritte Teil stellt die Aktivit tstests beider Proteine dar und beleuchtet ihre Interaktion beim Import des Linker Histons Hl Hier wird zus tzlich die Aufreinigung des tern ren Imp Imp7 HIl Komplexes erl utert Der vierte Teil behandelt schlie lich die Kristallisationsversuche mit rekombinantem Imp7 sowohl allein als auch mit seinen Bindungspartnern Imp und Hl 3 1 Expression und Aufreinigung von rekombinantem Importin 7 aus Xenopus laevis Der Kernimportrezeptor Imp7 steht in mehreren Gesichtspunkten im Mittelpunkt des Interesses Einerseits ist er als Bindungspartner von Imp beim H1 Import identifiziert worden andererseits ist er auch eigenst ndiger Transportrezeptor in mehreren bislang untersuchten Importwegen
146. zichtet da dieser Stamm auch ohne Glucose eine gute Expression des Voll ngenproteins erkennen lie vgl 2 2 3 1 Das Herabsenken der Expressionstemperatur auf 15 C verlangsamte das Wachstum der Kulturen zwar erheblich da es hemmend auf die Teilungsrate der Bakterien wirkt steigerte aber die L slichkeit des Produkts um den Faktor 4 5 Der Zusatz von Ethanol zur induzierten Kultur erh hte zus tzlich die L slichkeit des Proteins und zwar von etwa 30 auf 50 Durch die Zugabe von K HPO konnte die L slichkeit zus tzlich geringf gig gesteigert werden Da der Vektor pQE 9 f r eine N teminale His Sequenz codiert konnte Imp7 ber eine Affinit tschromatographie mit Nickel als Koordinationspartner selektiv aufgereinigt werden vgl 3 1 3 2 und Abb 14 und 15 Durch den Zusatz von 4 Glycerin und einer Salzkonzentration von 300 mM NaCl im Lysis Puffer konnten unspezifische Interaktionen von Proteinen im Zellysat mit der Ni NTA Sepharose weitgehend abgebaut werden So war die abschlie ende Gelfiltration des Eluats ausreichend um Imp7 in hochreiner Form zu gewinnen vgl 3 1 3 3 und Abb 16 und 17 Das Protein mit einem apparenten Molekulargewicht von 60 kDa wahrscheinlich HSP60 konnte weitestgehend entfernt werden Bei der Gelfiltration zeigte sich au erdem da ein Teil von Imp7 unerwartet fr h eluiert Das Elutionsvolumen dieses ersten Imp7 Peaks entspricht einem Molekulargewicht von 200 250 kDa Dies spricht daf r da es sich hierb

Wohlwend Daniel Diplomarbeit - Institut für Mikrobiologie und

Contents

Download Pdf Manuals

Related Search

Related Contents

Wohlwend Daniel Diplomarbeit - Institut f&uuml;r Mikrobiologie und

Contents

Download Pdf Manuals

Related Search

Related Contents

Wohlwend Daniel Diplomarbeit - Institut für Mikrobiologie und