ixSave®TBE real time RT
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1. Optical PCR reaction tubes with lid Optional Liquid handling systems for automation Important Notes The ixSaveGTBE real time RT PCR TM must be performed in adequate laboratories by qualified personnel Good Laboratory Practice GLP must be applied Clinical samples must always be regarded as potentially infectious material and all equipment used has to be treated as potentially contaminated General Precautions Stick to the protocol described in the Instruction M anual e Set up different laboratory areas for the preparation of samples and for the set up of the PCR in order to avoid contaminations Pipettes tubes and other material must not circulate between those different laboratory areas Always use filter tips page 4 Regulary decontaminate equipment and benches with alcohol free decontaminant e Do not combine ixSave TBE real time RT PCR Kit TM components of different lot numbers Preparation of Samples The ixSaveGTBE real time PCR TM is suitable for the detection of TBE Virus RNA released or isolated from ticks We recommend the release of RNA from ticks with the gerbion NukEx Nucleic Acid Release Reagent gerbion Cat No G01013 Thisisthe easiest and fastest method for the preparation of samples However if the extraction of RNA is prefered we recommend the use of commercially available kits e g NukExPure RNA DNA gerbion Cat No G05004 Further information about RNA release or isolat2. s Principle Of the Test sers i n cerner eie hei re Equipment and Reagents to be Supplied by User oo eects Important NOTES une o htt er e aaa Preparation of Samples sese Realtime RI PER Data RI EIER Mlassccare uae a e E Troubleshooting iis anrea re te er ttes Components The reagents supplied are sufficient for 96 or 32 reactions Labelling Lid Colour Content 96 32 K1 Reaction Mix yellow 2x 760ul 1x506 ul K2 Enzyme blue 1x192 ul 1x 64 K3 Positive Control red 1x100ul 1x 50ul K4 Negative Control green 1x100ul 1x 50ul Abbreviations cDNA copy Desoxyribonucleic Acid PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic Acid RT Reverse Transcription Transport and Storage The ixSave TBE real time RT PCR Kit TM is shipped on dry ice All components must be stored at 18 C in the dark immediately after receipt Do not use reagents after the date of expiry printed on the package After initial opening reagents are stable for up to six months Avoid repeated thawing freezing of the reagents if necessary aliquot kit components Intended Use The ixSaveGTBE real time RT PCR Kit TM is a screening assay for the detection of TBE Virus RNA in ticks using real time PCR microplate systems e g by Illumina Applied Biosystem Stratagene etc Sample Material Starting material for the detection assay is RNA released or isolated from ticks page 2 Quality Control In accordance with the gerbion s ISO certified
3. G01013 zu verwenden Dies ist die schnellste und einfachste M ethode der Probenvorbereitung Wird eine Extraktion der RNA bevorzugt so empfehlen wir kommerziell erh ltliche Extraktionskits zu verwenden ZB e NukExPure RNA DNA gerbion Art Nr G05004 Weitere Informationen zur Freisetzung oder Isolierung von RNA erhalten Sie in der NukEx Gebrauchsinformation oder der Gebrauchsinformation des Extraktionskits bzw vom technischen Service des Extraktionskit Her stellers Wichtig Unabhangig vom verwendeten Probenmaterial sollte zusatzlich zu den Proben eine Wasserkontrolle Reinstwasser extrahiert werden anhand derer sich eventuell auftretende Kontaminationen ablesen lassen Diese Wasserkontrolle muss analog einer Probe behandelt werden Falls die real time RT PCR nicht sofort durchgef hrt wird m ssen die RNA Extrakte entsprechend der Angaben des Extraktionskit Herstellers aufbewahrt werden Seite 6 Real time RT PCR Wichtige Punkte bevor Sie starten Bitte beachten sie die Wichtigen Hinweise auf Seite 6 e Bevor Sie die PCR ansetzen machen Sie sich mit dem real time PCR Ger t vertraut Die Programmierung des Temperaturprofils sollte ab geschlossen sein bevor die PCR angesetzt wird Beachten Sie dassin jedem PCR Lauf mindestens eine Positivkontrolle K3 und eine Negativkontrolle K4 enthalten sein sollte Alle Reagenzien bis auf das Enzym K2 m ssen komplett aufgetaut gemischt Reaktions M ix K1 nich
4. Gebrauchsinformation Instruction M anual IxSave GTBE real time RT PCR Kit TM F r den in vitro Nachweis von FSM E Virus RNA in Zecken For the in vitro detection of Tick borne Encephalitis Virus TBEV RNA in ticks EZ RE G01011 32 G01011 96 g 32 96 e gerdiar GmbH amp Co KG Remsstr 1 D 70806 Kornwestheim Germany phone 449 0 7154 806 20 0 fax 49 0 7154 806 20 29 e mail info g gerbion com www gerbion com Version 3 2 15 08 2013 Inhaltsverzeichnis Komponenten uunsesnenesnenennennnnenennenennenennen nn Abk rzungen seeeeennnn Transport und Lagerung sss Anwendungszweck eeeeeennne Art und Beschaffenheit des Probenmaterials Qualit tskontrolle sss Produktgew hrleistung Einleitung Testprinzip seen Zusatzlich ben tigte M aterialien und Gerate Wichtige Hinweise nennen Probenvorbereitung eee Real time RT PCR see Interpretation der Ergebnisse Troubleshooting ee Komponenten Die Komponenten sind ausreichend f r den Ansatz von 96 bzw 32 Nach weisreaktionen Bezeichnung Deckelfarbe 96 onar 32 K1 Reaction Mix gelb 2x 760ul 1x506 ul K2 Enzyme blau 1x192ul 1x 64ul K3 Positive Control rot 1x 100ul 1x 50yl K4 Negative Control gr n 1x 100ul 1x 50yl Abk rzungen cDNA copy Desoxyribonuk
5. ME Viren kann das Infektionsrisiko bereits kurze Zeit nach Entdecken des Parasits abge sch tzt werden Seite 4 Testprinzip Der ixSave TBE real time RT PCR Kit enth lt spezifische Primer und Fluoreszenzfarbstoff markierte Sonden f r den Nachweis von FSM E Vi rus RNA nach vorausgegangener RNA Extraktion Die Reverse Transkription RT der m glicherweise enthaltenen viralen RNA zu cDNA und die anschlie ende Amplifikation von FSM E spezifischen Fragmenten mittels PCR erfolgen in einem Schritt Die Detektion der Am plifikation erfolgt in Echtzeit durch die Hybridisierung und anschlie en de Hydrolyse der FSM E Virus spezifischen Fluoreszenzsonden Die Detektion erfolgt im FAM Kanal Zus tzlich verf gt der ixSave TBE real time RT PCR Kit ber eine Interne Kontrolle Hierf r wird ein zeckenspezifisches Gen in einem zweiten heterologen Amplifikationssystem nachgewiesen Dies erm glicht zum einen das Aufdecken von Fehlern bei der Extraktion aus Zecken zum anderen kann eine m gliche Inhibition der PCR identifiziert werden Dadurch wird das Risiko von falsch negativen Ergebnissen reduziert Die Detektion der Interne Kontrolle erfolgt im HEX VIC J OE TET Kanal Zusatzlich ben tigte Materialien und Gerate NukEx Nukleinsaurefreisetzungsreagenz gerbion Art G01013 oder RNA Extraktionskit z B NukEx Pure RNA DNA gerbion Art Nr G05004 sterile Reaktionsgef e Pipetten variable Volumina sterile Pipettenspitzen mit Filter
6. Quality Management Sys tem each lot of the ixSaveGTBE real time RT PCR Kit TM is tested against predetermined specifications to ensure consistent product quality Product Warranty gerbion guaranteesthe performance of all products when used according to the instructions given in the Instruction M anual The purchaser must determine the suitability of the product for its particular use Should any product fail to perform satisfactorily due to any reason other than misuse gerbion will replace it free of charge or refund the price We reserve the right to change alter or modify any product to enhance its performance and design Introduction Tick borne encephalitis TBE is a viral infectious disease involving the central nervous system Alongside with flu like symptoms and fever the disease can manifest as meningitis encephalitis or meningoencephalitis In many cases infection remains symptom free TBE viruses are transmitted by the bite of several species of infected ticks including the common castor bean tick Ixodes ridinus The disease is incurable once manifested therapy is limited to symptomatic measures Anti inflammatory drugs such as corticosteroids may be considered under specific circumstances for symptomatic relief General preventive measures such as tick bite prevention and checking the body for ticks are recommended however reliable prophylaxis is only assured by vaccination Analyses of the tick for TBE virus allows
7. Thermoblock Tischzentrifuge Vortexer Real time PCR Ger t z B Eco Illumina Optische PCR Gef e mit Verschlu Optional Pipettierger te zur Automation Wichtige Hinweise DieixSaveGTBE real time RT PCR TM muss in f r diesen Zweck geeigne ten Laboratorien und von speziell geschultem Personal durchgef hrt werden Die Richtlinien der Good Laboratory Practice GLP sind einzuhalten Alle Proben m ssen als potentiell infekti s betrachtet werden und alle mit den Proben in Ber hrung kommenden Gegenstande m ssen als potentiell kontaminiert erachtet werden Seite 5 Allgemeine Hinweise Die Anweisungen der Gebrauchsinformation sind einzuhalten Areale f r die Probenvorbereitung und den Ansatz des PCR Master Mix sollten strikt getrennt sein Pipetten R hrchen und andere Arbeitsmaterialien d rfen nicht von einem Bereich in den anderen zirkulieren Immer Pipettenspitzen mit Filter verwenden Pipetten und Arbeitsflachen regelm ig mit geeigneter Dekontami nationsl sung reinigen keine ethanolhaltigen M ittel Komponenten verschiedener Chargen des ixSave TBE real time RT PCR Kit TM d rfen nicht zusammen verwendet werden Probenvorbereitung Die ixSave TBE real time RT PCR TM ist geeignet f r den Nachweis von FSM E Virus RNA in Zecken nach vorausgegangener Freisetzung oder Ex traktion der RNA Es wird empfohlen zur Freisetzung der RNA das gerbion NukEx Nukleins urefreisetzungsreagenz Art Nr
8. detektiert wird negative Probe Norm Flaoro positive Probe Abb 2 Im VIC HEX OE TET Kanal zeigt die negative Probe ein Signal auf In diesem Fall liegt keine Inhibition der real time RT PCR vor auch verlief die Extraktion erfolgreich Die negative Probe ist somit als tat s chlich negativ zu werten Weder die Positiv noch die Negativkontrolle enthalten Zecken RNA daher ist kein Signal der Internen Kontrolle detektierbar Seite 10 Troubleshooting Der folgende Troubleshooting Guide soll bei eventuell auftretenden Pro blemen mit der real time PCR behilflich sein Sollten Sie weitere Fragen haben wenden Sie sich bitte an unsere Wissenschaftler unter info gerbion com Kein Fluoreszenzsignal im FAM Kanal der Positivkontrolle K3 Der gewahlte Kanal entspricht nicht dem im Protokoll angegebenen Wahlen Sie den FAM Kanal f r die Analyse der FSM E Virus spezifi schen Amplifikation und den VIC HEX J OE TET Kanal f r die Amp lifikation der Internen Kontrolle Fehlerhaftes Ansetzen der real time RT PCR Uberpr fen Sie Ihre Arbeitsschritte und vergleichen Sie diese mit den in Durchf hrung auf der Seite 8 beschriebenen Arbeitsschritten Fehlerhaftes real time RT PCR Temperaturprofil Vergleichen Sie das Temperaturprofil mit dem Protokoll Tabelle 2 Seite 8 Falsche Lagerbedingungen des Kits oder abgelaufenes Haltbarkeits datum berpr fen Sie die Lagerbedingungen und das Haltbarkeitsdatum auf dem Kit
9. e contaminated M ake sure that work space and instruments are decontaminated regularly Use a new kit and repeat the real time RT PCR page 10
10. es 15 sec 72 C Interpretation der Ergebnisse Die FSM E Virus spezifische Amplifikation wird im FAM Kanal detektiert Die Amplifikation der Internen Kontrolle wird im VIC HEX J OE TET Kanal gemessen Folgende Ergebnisse konnen auftreten Im FAM Kanal wird ein Signal detektiert Das Ergebnis ist positiv die Probe enthalt FSM E Virus RNA In diesem Fall ist die Detektion eines Signals im VICG HEX JOE TET Kanal nicht notwendig da eine hohe FSM E Virus CDNA Konzentration zu einem verminderten bzw fehlenden Fluoreszenzsignal der Internen Kontrolle f hren kann Kompetition mFAM Kanal wird kein Signal detektiert jedoch im VIC HEX JOE TET Kanal Das Ergebnis ist negativ die Probe enthalt keine FSM E Virus RNA Das detektierte Signal der Internen Kontrolle schlie t die M glichkeit einer fehlerhaften RNA Extraktion aus Au erdem sind weder die Re verse Transkription noch die PCR komplett inhibiert Weder im FAM noch im VIC HEX JOE TET Kanal wird ein Signal detektiert Eskann keine diagnostische Aussage getroffen werden Die real time RT PCR wurde inhibiert oder es trat ein Fehler bei der RNA Extraktion auf Seite 9 Abbildung 1 und Abbildung 2 zeigen Beispiele f r positive und negative PCR Ergebnisse positive Probe negative Probe 0 00 Abb 1 Die positive Probe zeigt eine starke Amplifikation im spezifischen FAM Kanal w hrend bei der negativen Probe kein Fluoreszenzsignal
11. etikett Falls n tig benutzen Sie einen neuen Kit und lagern Sie alle Komponenten wie auf Seite 3 unter Transport und Lagerung beschrieben Schwaches oder kein Signal der Internen Kontrolle und gleichzeitiges Aus bleiben eines Signals im FAM Kanal Die real time RT PCR Bedingungen stimmen nicht mit den im Proto koll beschriebenen berein Uberpr fen Sie die real time RT PCR Bedingungen Seite 7 8 real time RT PCR Inhibition Stellen Sie sicher dass Sie eine der empfohlenen RNA Freisetzungs bzw Extraktionsmethoden benutzen siehe Probenvorbereitung Sei te 6 und beachten Sie die Herstellerangaben Seite 11 Haben Sie das NukEx Nukleinsaurefreisetzungsreagenz benutzt ver d nnen Sie die Probe 1 5 in NukEx Universal Verd nnungspuffer gerbion Art G01014 oder in Reinstwasser und wiederholen Sie die real time RT PCR Haben Sie einen RNA Extraktionskit benutzt stellen Sie sicher dass ethanolhaltige Waschpuffer vollst ndig entfernt wur den ein zus tzlicher Zentrifugationsschritt bei hoher Geschwindig keit vor der RNA Elution wird empfohlen Verlust der DNA w hrend des Aufarbeitungsprozesses Das Ausbleiben des Signals kann auf eine fehlerhafte RNA Freisetzung bzw Extraktion hinweisen Stellen Sie sicher dass Sie eine geeignete RNA Freisetzungs bzw Extraktionsmethode verwenden NukEx Nukleinsaurefreisetzungsreagenz gerbion Art G01013 oder kom merziell erh ltliche Extraktionskits werden empfohlen siehe Se
12. for better assessment of the risk of infection shortly after removal of the parasite from the body Principle of the Test The ixSave TBE real time RT PCR Kit contains specific primers and probes labelled with a fluorescent dye for the analysis of TBE virus RNA isolated or released from ticks The reverse transcription RT of present viral RNA to cDNA and the subsequent amplification of TBE Virus specific fragments are performed in a one step RT PCR The detection of the amplification is carried out in page 3 real time via hybridization and following hydrolysis of the TBE virus specific fluorescent probes The fluorescence is measured in the FAM channel Furthermore the ixSave TBE real time RT PCR Kit contains an Internal Control in a second heterologous amplification system a tick specific gene is detected This allows not only for the detection of RT PCR inhibition but also of possible failures during RNA extraction release from ticks The risk of false negative results is greatly reduced this way The fluorescence of the Internal Control is measured in the VIC HEX J OE TET channel Equipment and Reagents to be Supplied by User e NukEx Nucleic Acid Release Reagent gerbion Cat No G01013 or RNA extraction kit e g NukEx Pure RNA DNA gerbion Cat No G05004 Sterile microtubes Pipets adjustable volume Sterile pipet tips with filter Thermoblock Table centrifuge Vortexer Real time PCR instrument e g Eco Illumina
13. in NukEx Universal Dilution Buffer gerbion Cat No G0104 or in PCR grade water and repeat real time PCR If a RNA extraction kit was used make sure that the ethanol containing washing buffer of the isolation kit has been completely removed An additional centrifugation step at high speed is recommended before elution of the RNA page 9 RNAlossduringisolation process The lack of an amplification signal can indicate that the RNA release extraction was not successful M ake sure that you use an appropriate isolation method NukEx Nucleic Acid Release Reagent gerbion Cat No G01013 or commercial extraction kits are recommended Stick to the manufacturer s protocol ncorrectstorage conditionsfor one or more components or kit expired Check the storage conditions and the date of expiry printed on the kit label If necessary use a new kit and make sure kit components are stored as described in Transport and Storage page 2 Detection of a fluorescence signal in the FAM channel ofthe Negative Control K4 Contamination during preparation of the real time RT PCR Repeat the real time RT PCR in replicates If the result is negative in the repetition the contamination occured when the samples were pipetted into the optical PCR reaction tubes Make sure to pipet the Positive Control K3 last and close the optical PCR reaction tube immediately after adding the sample If the same result occurs one or more of the kit components might b
14. ing inaccuracy Table 1 Preparation of the Master M ix Reaction Volume Master MixVolume 15 8 ul Reaction M ix K1 15 8 ul x N41 0 2 ul Enzyme K2 0 2 ul x N 1 Putthe number of optical PCR reaction tubes into the cooling block Pipet 16 ul of the Master Mix into each optical PCR reaction tube e Add 4ulof the DNA eluates including the eluate of the water control or 4 ul of the NukEx supernatants the Positive Control K3 and the Negative Control K4 to the corresponding optical PCR reaction tube Close the optical PCR reaction tubes immediately after filling in order to reduce the risk of contamination Real time RT PCR Thermal Profile For the real time PCR use the thermal profile shown in Table 2 Table 2 Real time RT PCR thermal profile 1 Reverse Transcription 20 min 45 C 2 Initial Denaturation 10 min 95 C 3 Amplification of cDNA Number of cycles 45 Denaturation 15 sec 95 C Annealing 30 sec 57 C measurement at the end of this step Extension 15 sec 72 C page 6 Data Analysis The TBE Virus specific amplification is measured in the FAM channel The amplification of the Internal Control is measured in the VIC HEX JOE TET channel Following results can occur A signal in the FAM channel is detected The result is positive the sample contains TBE Virus RNA In this case detection of a signal of the Internal Control in the VIC HEX JOE TET channel is inessential as high concentrati
15. ion is to be found in the NukEx Instruction M anual or the extraction kit manual from the extraction kit manufacturer s technical service Important In addition to the samples always run a water control in your extraction possible contaminations during RNA extraction will be detectable Treat this water control analogous to a sample If the real time RT PCR is not performed immediatly store extracted RNA according to the instructions given by the RNA isolation kit manufacturer Real time RT PCR Important Points Before Starting e Please pay attention to the Important Notes on page 4 Before setting up the real time PCR familiarise yourself with the real time PCR instrument and read the user manual supplied with the instrument The programming of the thermal profile should take place before the PCR set up n every PCR run at least one Positive Control K3 and one Negative Control K4 should be included Prior to each use all reagents except the Enzyme K2 should be thawed completely at room temperature thouroughly mixed do NOT vortex the Reaction Mix K1 but mix by pipetting up and down repeatedly and centrifuged very briefly Then place all reagents on ice or on a cooling block 2 to 48 C page 5 Procedure The M aster M ix contains all of the components needed for RT PCR except the sample Prepare a volume of M aster M ixfor at least one sample more than required in order to compensate for pipett
16. ite 6 Halten Sie sich an das Herstellerprotokoll Falsche Lagerbedingungen des Kit oder abgelaufenes Haltbarkeitsdatum berpr fen Sie die Lagerbedingungen und das Haltbarkeitsdatum auf dem Kitetikett Falls n tig benutzen Sie einen neuen Kit und lagern Sie alle Komponenten wie auf Seite 3 unter Transport und Lagerung be schrieben Detektion eines Signals im FAM Kanal der Negativkontrolle K4 Kontamination des real time RT PCR Ansatzes Wiederholen Sie die real time RT PCR in Replikaten Falls das Ergeb nis der Wiederholungen negativ sein sollte so ereignete sich die Kon tamination w hrend der Bef llung der PCR Gef e Stellen Sie sicher dass Sie die Positivkontrolle K3 zuletzt pipettieren und verschlie en Sie die Gef e sofort nachdem Sie die jeweilige Probe zugegeben ha ben Falls die Negativkontrolle K4 in der Wiederholung wieder ein Signal im FAM Kanal ergibt deutet dies darauf hin dass eine oder mehrere Kitkomponenten kontaminiert sind Stellen Sie sicher dass die Arbeitsbereiche und die Ger te regelm ig dekontaminert wer den Wiederholen Sie die real time RT PCR mit einem neuen Kit Seite 12 COMPONENTS 3 cerni rea eret RH Waratah S E D DR ERR ETATE RA DARE HA AbbrevidblOlis uci teer t a tamem ete e etus Transport and Storage vic rai anne Incendie nein neh Sample Material nn Quality Control een Product Warranty sse nnne nnns INtrodUction iic trc mese med rete aen eatur an erra
17. leins ure PCR Polymerase Ketten Reaktion RNA Ribonukleinsaure RT Reverse Transkription Transport und Lagerung Der Transport des ixSave TBE real time RT PCR Kit TM erfolgt gefroren auf Trockeneis Alle Komponenten des ixSaveGTBE real time RT PCR Kit TM sind direkt nach Erhalt bei 18 C lichtgesch tzt zu lagern Nach Ablauf des auf der Packung angegebenen Haltbarkeitsdatums nicht mehr ver wenden Nach Anbruch der Reagenzien sind diese f r maximal sechs Monate verwendbar M ehrmaliges Auftauen und Einfrieren zweimal der Reagenzien vermeiden da dadurch die Sensitivit t verringert werden kann Gegebenenfalls sollten der Reaktions M ix K1 und die Positiv kontrolle K3 aliquotiert werden Anwendungszweck Der ixSave TBE real time RT PCR Kit TM dient dem Nachweis FSM E Virus RNA in Zecken mittels real time RT PCR in offenen real time PCR Systemen z B von Illumina Applied Biosystems Stratagene Seite 3 Art und Beschaffenheit des Probenmaterials Das Ausgangsmaterial f r die Nachweisreaktion ist RNA die aus Zecken gewonnen wurde Qualitatskontrolle In bereinstimmung mit dem ISO zertifizierten Qualit tsmanagement system der gerbion GmbH amp Co KG wird jede Charge des ixSaveGTBE real time RT PCR Kits TM gegen vorgegebene Spezifikationen getestet um eine einheitliche Produktqualit t zu gew hrleisten Produktgew hrleistung Diese Gebrauchsinformation gilt als vollst ndig und richtig zum Zeit punkt ihrer Ve
18. ons of TBE Virus cDNA may reduce or completely inhibit amplification of the Internal Control No signal in the FAM channel but a signal in the VIC HEX JOE TET channel is detected The result is negative the sample does not contain TBE Virus RNA The signal of the Internal Control excludes the possibilities of RNA isolation release failure and or real time RT PCR inhibition Neither in the FAM nor in the VIC HEX JOE TET channel a signal is detected A diagnostic statement cannot be made The RNA isolation release was not successful or an inhibition of the RT PCR has occurred page 7 Figure 1 and Figure 2 show examples for positive and negative real time PCR results positive sample 004 negative sample Om Figure 1 The positive sample shows specific amplification in the FAM channel whereas no fluorescence signal is detected in the negative sample negative sample positive sample Figure 2 The negative sample shows a signal in the VIC HEX JOE TETchannel The amplification signal of the tick gene in the negative sample shows that the missing signal in the TBE Virus specific channel FAM is not due to PCR inhibition or failure of RNA release extraction but that the sample is a true negative Neither Positive nor Negative Control contain tick DNA therefore no signal in the VIC HEX JOE TET channel is detected page 8 Troubleshooting Thefollowing troubleshooting guide is included
19. r ffentlichung Die gerbion GmbH amp Co KG haftet keinesfalls f r Neben oder Folgesch den die sich im Zusammenhang mit oder in der Folge der Benutzung dieser Gebrauchsinformation ergeben gerbion garantiert die volle Funktionsf higkeit wenn das Produkt entsprechend der in der Gebrauchsinformation angegebenen Anleitung erfolgt Der K ufer muss selbst bestimmen ob das Produkt f r seine spezielle An wendung geeignet ist gerbion beh lt sich vor Produkte jederzeit zu mo difizieren um die Funktionalit t oder das Design zu verbessern Einleitung FSME Viren sind die Erreger der sogenannten Fr hsommer Meningoenzephalitis FSME Diese Erkrankung verl uft mit grippe hnlichen Symptomen und Fieber bei einem Teil der Patienten kommt es zu einer M eningoenzephalitis der Entz ndung von Gehirn und Hirnh u ten Oft verl uft eine Infektion auch symptomlos bertr ger der Erreger sind Zecken haupts chlich Ixodes ricinus der gemeine Holzbock Eine urs chliche Behandlung der FSME ist nicht m glich Bei einzelnen sehr schweren Verl ufen k nnen Interferone verabreicht werden Insgesamt beschr nkt sich die Therapie auf symptomatische Ma nahmen Neben allgemeinen Schutzma nahmen wie dem Absuchen des K rpers nach Zecken kommt die aktive Impfung als vorbeugende M a nahme in Frage Sie wird national etwas unterschiedlich f r alle Personen die sich in Risikogebieten aufhalten empfohlen Durch die Untersuchung der Zecke auf FS
20. t vortexen sondern durch wiederholtes Auf und Abpipettieren mischen und kurz abzentrifugiert werden Halten Sie die Reagenzien stetig gek hlt in einem K hlblock 42 bis 8 C oder auf Eis Durchf hrung Zun chst wird ein PCR Master M ix angesetzt Dieser M aster M ix enth lt alle ben tigten Komponenten au er der Probe Setzen Sie f r die Gesamt zahl der geplanten PCR Ansatze mindestens einen Ansatz mehr als ben tigt an Tabelle 1 Herstellung des M aster M ix Reaktionsvolumen Master Mix Volumen 15 8 ul Reaktions M ix K1 15 8 ul x N41 0 2 ul Enzym K2 0 2 ul x N 1 Ben tigte Anzahl optischer PCR Reaktionsgef e in einen geeigneten K hlblock stellen e 16 ul des Master Mix in jedes Gef pipettieren 4 ul der RNA Eluate inklusive der Eluate der Wasserkontrolle bzw der NukEx berst nde der Positivkontrolle K3 und der Negativ kontrolle KA in die entsprechenden Gef e hinzupipettieren Die Reaktionsgef e sofort nach dem die Probe zugef gt wurde ver schlie en um das Kontaminationsrisiko zu minimieren F r die real time RT PCR das in Tabelle 2 beschriebene Temperaturprofil benutzen Seite 7 Tabelle 2 real time RT PCR Temperaturprofil 1 Reverse Transkription 2 Initiale Denaturierung 3 Amplifikation der cDNA Anzahl der Zyklen Denaturierung Annealing Extension Seite 8 20 min 45 C 10 min 95 C 45 15 sec 95 C 30 sec 57 C M essung am Ende dieses Schritt
21. to help you with possible problems that may arise when performing a real time RT PCR If you have further questions please do not hesitate to contact our scientists on info gerbion com No fluorescence signal in the FAM channel of the Positive Control K3 The selected channel for analysis does not comply with the protocol Select the FAM channel for analysis of the TBE Virus specific amplification and the VIC HEX JOE TET channel for the amplification of the Internal Control Incorrect configuration of the real time RT PCR Check your work steps and compare with Procedure on page 6 The programming of the thermal profile is incorrect Compare the thermal profile with the protocol Table 2 page 6 Incorrect storage conditions for one or more kit components or kit expired Check the storage conditions and the date of expiry printed on the kit label If necessary use a new kit and make sure kit components are stored as described in Transport and Storage page 2 Weak or no signal of the Internal Control and simultaneous absence of a signal in the TBE Virus specific FAM channel real time PCR conditions do not comply with the protocol Check the real time PCR conditions page 6 real time RT PCR inhibited Make sure that you use an appropriate RNA release extraction method see Preparation of Samples page 5 and follow the manufacturer s instructions If NukEx Nucleic Acid Release Reagent was used dilute sample 1 5
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