Aspergillus
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1. Aspergillus Amostras Respirat rias Applied Biosystems 7500 incluindo tuberculose micobacteriose at pica sarcoidose histoplasmose coccidioidomicose pneumoconiose pulm o reumat ide espondilite anquilosante e outras a documenta o da presen a de Aspergillus spp nas amostras respirat rias importante para evitar o atraso no diagn stico da aspergilose pulmonar e o tratamento incorrecto MycAssay Aspergillus um kit de diagn stico molecular para a detec o do DNA gen mico de Aspergillus spp com base na tecnologia de PCR com sinais moleculares molecular beacon Todo o procedimento de an lise incluindo a extrac o de DNA da amostra cl nica pode ser terminado em 4 horas comparativamente cultura f ngica que pode demorar v rios dias a produzir resultados positivos Este ensaio oferece vantagens sobre os m todos de diagn stico actualmente dispon veis para a aspergilose invasiva aguda e a aspergilose pulmonar cr nica Estas vantagens incluem uma detec o mais r pida de Aspergillus spp e o potencial de um aumento da sensibilidade a Aspergillus spp em doentes altamente imunocomprometidos com suspeita de aspergilose pulmonar invasiva Princ pios do procedimento A seguir mistura dos reagentes no kit MycAssay Aspergillus com uma amostra contendo a sequ ncia de DNA alvo de Aspergillus uma por o do gene 18S riboss mico de Aspergillus a termociclagem resulta na ocorr ncia da amplifica o do DNA2. 9 Falha do IAC na Repetir a detectado amostra amostra Resultado 3 CCO cut off cl nico Todos os resultados ao n vel ou abaixo do n vel s o considerados clinicamente positivos Outras amostras podem registar valores de Ct gt 33 5 mas estas s o reflectores de n veis normais ou de fundo da carga de Aspergillus na amostra respirat ria Ver Relat rio Cl nico Resultado 1 2 ou 3 Portugu s 9 030 150 Vers o 1 2 01MAR12 Para utiliza o diagn stica in vitro MycAssay Aspergillus Amostras Respirat rias Applied Biosystems 7500 Resolu o de problemas 4 1 O controlo negativo gerou um sinal positivo no canal FAM gt Ocorreu contamina o durante a prepara o Os resultados de toda a execu o n o s o fi veis como sendo precisos Repita toda a execu o tendo muito cuidado ao adicionar os padr es em particular o controlo positivo tubo 4 para assegurar que n o ocorre contamina o cruzada Certifique se de que a rea de trabalho e os instrumentos est o adequadamente descontaminados antes e depois de utilizar O controlo negativo foi posicionado incorrectamente no equipamento Tome cuidado para que os po os sejam anotados correctamente no software Foram utilizados tubos ou placas n o recomendadas Os limiares s s o v lidos se forem utilizadas placas para PCR de 96 po os com semi rebordo de 0 2 ml com pel cula adesiva de qualidade ptica Star Lab Cat amp E1
3. O ensaio tamb m cont m um Controlo de Amplifica o Interno IAC um fragmento de DNA n o presente em genomas de Aspergillus outros genomas f ngicos bacterianos ou humanos para detectar subst ncias inibit rias da PCR e confirmar a funcionalidade dos reagentes do ensaio Os alvos de DNA amplificados s o detectados com a tecnologia de sinais moleculares Os sinais moleculares s o amostras de hibridiza o de oligonucle tidos de cadeia nica que formam uma estrutura de haste e ansa stem and loop A ansa cont m uma sequ ncia de amostras que complementar sequ ncia alvo e a haste formada pela liga o de sequ ncias de bra o complementares que se encontram localizadas de ambos os lados da sequ ncia de amostras Um fluor foro que fluoresce quando excitado por luz com o comprimento de onda apropriado ligado covalentemente extremidade de um bra o e um supressor que suprime a fluoresc ncia do fluor foro quando se encontra em grande proximidade f sica ligado covalentemente extremidade do outro bra o Os sinais moleculares n o entram em fluoresc ncia quando se encontram livres na solu o No entanto quando se hibridizam a uma cadeia de cido nucleico que cont m uma sequ ncia alvo s o submetidos a uma altera o conformacional que separa o fluor foro e o supressor fisicamente possibilitando lhes entrarem em fluoresc ncia em consequ ncia da excita o A quantidade de fluoresc ncia em qualquer ciclo
4. o SmartCycler Cepheid Subst ncias interferentes contra indica es para a utiliza o Os compostos seguintes foram analisados com concentra es clinicamente relevantes e considerados como n o inibindo o ensaio acetilciste na anfotericina dipropionato de beclometasona budesonida colistimetato de s dio propionato de fluticasona fumarato de formoterol di hidratado brometo de ipratr pio lidoca na manitol sulfato de salbutamol salmeterol cloreto de s dio cromoglicato de s dio terbutalina e tobramicina Avalia o do desempenho Amostras respirat rios BAL colhidas em 2 hospitais extra das com o kit MycXtra e conservadas foram utilizadas para avaliar o desempenho do kit MycAssay Aspergillus em amostras cl nicas Foram feitas compara es tanto com o diagn stico cl nico como com a cultura O valor de cut off com um Ct de 36 0 foi estabelecido a seguir an lise de um conjunto de dados de amostras provenientes de centros diferentes e de popula es de doentes diferentes Os cut offs diferentes foram avaliados relativamente probabilidade de diferenciamento entre estado patol gico e estado n o patol gico PCR vs Diagn stico cl nico Positivo Negativo cl nico cl nico PCR 31 1 0 97 PPV positiva PCR 2 10 0 83 NPV negativa 0 94 0 91 Sensibilidade Especificidade PCR vs Cultura de Aspergillus Cultura Cultura positiva negativa PCR 29 3 0 91 PPV pos
5. passo de centrifuga o diminui a propor o de inibidores que entram no sistema Resultados positivos falsos s o poss veis se o agente infectante for Penicillium spp que n o pode ser diferenciado de Aspergillus spp mediante a utiliza o deste kit Embora o procedimento de extrac o de DNA f ngico MycXtraTM tenha sido concebido para remover os inibidores da PCR nem todos os f rmacos ou popula es de doentes foram avaliados O procedimento n o foi totalmente avaliado em esputo nem em amostras induzidas com solu o salina ou amostras provenientes de crian as Podem ser obtidos resultados positivos falsos provenientes da contamina o externa da amostra ou da an lise original Essa contamina o pode surgir do ar contaminado com Aspergillus uma t cnica experimental fraca no que se refere ao controlo positivo ou contamina o externa especialmente pipetador com DNA de Aspergillus Uma vez que um resultado positivo verdadeiro pode ser obtido de doentes que estejam transitoriamente ou persistentemente colonizados com Aspergillus spp necess ria a avalia o cl nica na interpreta o dos resultados da an lise no contexto da doen a AUTORIZA O TopTaq Hot Start fornecido por QIAGEN QIAGEN uma marca comercial registada da Qiagen GmbH Hilden Alemanha Este produto comercializado sob a licen a do Public Health Research Institute Newark New Jersey EUA e pode ser utilizado sob os di
6. 1 com Portugu s 11 030 150 Vers o 1 2 01MAR12 Para utiliza o diagn stica in vitro MycAssay Aspergillus Amostras Respirat rias Applied Biosystems 7500 Caracter sticas e limita es do desempenho Dados de desempenho anal tico do AB7500 O kit foi inicialmente validado utilizando o Cepheid SmartCycler Determinadas reivindica es do desempenho do ensaio foram revalidadas na plataforma AB7500 utilizando placas para PCR de 96 po os com semi rebordo de 0 2 ml com pel cula adesiva ptica Star Lab Cat 4 E1403 8200 e Applied Biosystems Cat 4311971 e s o comunicadas abaixo Onde n o se esperava que as diferen as entre plataformas afectassem o desempenho do ensaio e por isso a reivindica o o estudo n o foi repetido Estes resultados obtidos utilizando o SmartCycler s o considerados transfer veis para a plataforma AB7500 Sensibilidade anal tica Com o protocolo do AB7500 descrito acima e os padr es de PCR gerados na Myconostica o LoB limite do branco do MycAssay Aspergillus foi determinado como sendo um Ct de 37 0 enquanto o LoD limite de detec o foi determinado como sendo lt 25 c pias de DNA alvo utilizando a estirpe AF293 de A fumigatus Selectividade anal tica O DNA gen mico extra do a partir de Penicillium spp gera resultados positivos Tal deve se ao facto das sequ ncias dos alvos moleculares serem grandemente conservadas entre Aspergillus e Penicillium Por conseguinte deve no
7. 403 8200 e Applied Biosystems Cat 4311971 recomendadas 4 2 O valor Ct de IAC do controlo negativo n o se situa dentro do intervalo aceit vel gt A PCR foi inibida Certifique se de que a rea de trabalho e os instrumentos est o perfeitamente secos ap s a utiliza o de agentes de descontamina o antes da prepara o da PCR As condi es de conserva o do kit n o cumpriram as instru es na sec o Conserva o destas instru es de utiliza o ou o kit expirou Verifique se foram seguidas as condi es de conserva o correctas do kit Verifique o prazo de validade dos reagentes ver caixa do kit r tulo da bolsa e repita com um kit dentro do prazo de validade se necess rio O reagente do tubo 1 ou 2 n o foi adicionado reac o da PCR ou foi adicionada a quantidade a dobrar do tubo 2 Repita a execu o tendo cuidado na fase de prepara o Este tipo de erros pode ser detectado ao observarem se n veis mais altos ou mais baixos de l quido num po o comparativamente aos outros Foram utilizados tubos ou placas n o recomendadas Os limiares s s o v lidos se forem utilizadas placas para PCR de 96 po os com semi rebordo de 0 2 ml com pel cula adesiva de qualidade ptica Star Lab Cat E1403 8200 e Applied Biosystems Cat 4311971 recomendadas 4 3 O controlo positivo est negativo gt As condi es de conserva o do kit n o cumpriram as instru es na sec o Conserva o desta
8. C at ao prazo de validade indicado no r tulo da caixa do kit momento em que deve ser eliminado em conformidade com as regulamenta es locais Uma vez aberta uma bolsa o conte do deve ser utilizado imediatamente sem voltar a congelar nem reutilizar posteriormente Portugu s 3 030 150 Vers o 1 2 01MAR12 Para utiliza o diagn stica in vitro MycAssay Aspergillus Amostras Respirat rias Applied Biosystems 7500 Materiais equipamentos necess rios mas n o fornecidos A Equipamento necess rio Sistema de PCR em Tempo Real da Applied Biosystems incluindo o manual do utilizador o computador em anexo e o software SDS vers o 1 4 Placas de 96 po os com borda inteira borda elevada e pel cula de selagem de qualidade ptica Star Lab Cat E1403 8200 e Applied Biosystems Cat 4311971 Prateleira de suporte para placa de 96 po os Centr fuga com copos que suportem placas de 96 po os Equipamento habitual necess rio Microcentr fuga Agitador v rtex Micropipetas volumes necess rios 7 5 uL 20 uL Pontas de filtro de baixa reten o est reis Luvas descart veis sem p Solu o de descontamina o de DNA patenteada Caneta marcadora permanente Kit de isolamento de DNA ver em baixo Amostra A amostra para o ensaio MycAssay Aspergillus DNA gen mico total extra do de amostras cl nicas de LBA e de outras amostras das vias respirat rias inferiores Para este efeito r
9. Para utiliza o diagn stica in vitro MycAssay Aspergillus Applied Biosystems 7500 myconosjica Amostras Respirat rias MycAssay Aspergillus Applied Biosystems 7500 Amostras Respirat rias REF 080 045 Utiliza o prevista MycAssayT Aspergillus est indicado para a utiliza o por profissionais de laborat rio qualificados para a detec o qualitativa do DNA gen mico de Aspergillus spp extra do de amostras respirat rias do tracto respirat rio inferior p ex amostras br nquicas como ajuda no diagn stico em doentes adultos com suspeita de infec o ou alergia por Aspergillus MycAssay Aspergillus foi validado para a utiliza o com o Applied Biosystems 7500 utilizando a vers o de software SDS 1 4 Resumo e explica o Aspergillus spp s o fungos ub quos e oportunistas que provocam tanto s ndromas al rgicas como invasivas O g nero abrangido por aproximadamente 300 esp cies das quais 41 foram associadas doen a humana A maioria das infec es causada por A fumigatus A flavus A terreus e A niger com menor frequ ncia foram implicados A nidulans e outras esp cies raras tais como A sydowii A versicolor A lentulus e A pseudofischeri A maioria das infec es e alergias causadas por Aspergillus spp afecta o tracto respirat rio As s ndromas al rgicas incluem aspergilose broncopulmonar al rgica ABPA e sinusite Aspergillus al rgica e s o habitualmente causadas por A fum
10. RandRPro 031209 ADS sds Standard Curve DLEE view Tools Instrument Analysis Window Help ij New CtrhN E E Ciro Save As A Import Sample Setup Ctrl I Export D Sample Setup View Exported Results Calibration Data Lo Print Setup B PrintPreview patras Print Ctrp pt 1 RandRPro 031209 ADS sds CG o 2 RandR Prorun 041209 GJAE sds Dissociation 3 RandR Prorun 041209 GIAE sds fm 4 RandRPro 031209 ADS sds 5 30Nov09 RandR Kate day3 sds 6 27Nov09 RandR Kate day2 sds 7 26Nov09 RandR Kate dayl sds 8 MycAssay Aspergilus v1_1 Z25NOVOS SAF sds 9 RandRi plate SAF 19NOVO9 sds D Ext E E E 3 6 Para evitar confus o grave o ficheiro com o mesmo nome do pr prio ficheiro da execu o Lembre se de gravar o ficheiro num local apropriado 3 7 Quando solicitado active Export only selected wells Exportar apenas po os seleccionados e clique em OK 3 8 Abra o ficheiro csv gravado com Excel ou outro software de folha de c lculo similar 3 9 Analise cada amostra come ando com os controlos conforme indicado no fluxograma abaixo tamb m podem ser encontrados detalhes na tabela apresentada abaixo do fluxograma Portugu s 8 030 150 Vers o 1 2 01MAR12 Para utiliza o diagn stica in vitro Amostras Respirat rias MycAssay Aspergillus Applied Biosystems 7500 Verificar o controlo negativo O Ct do MycAssay de ASP de N O 37 0 ou n o detectado Execu o est contaminad MEDIDA Repetir a execu o Fal
11. and Bille J 1998 Aspergillus species isolated from clinical specimens suggested clinical and microbiological criteria to deteremine significance Clin Microbiol Infect 4 710 716 Perfect JR Cox GM Lee JY Kauffman CA de Repentigny L Chapman SW Morrison VA Pappas P Hiemenz JW Stevens DA and the Mycoses Study Group 2001 The impact of culture isolation of Aspergillus species A hospital based survey of Aspergillosis Clinical Infectious Diseases 33 1824 33 7 Maertens J Van Eldere J Verhaegen J Verbeken E Verschakelen J Boogaerts M 2002 Use of Circulating Galactomannan Screening for Early Diagnosis of Invasive Aspergillosis in Allogeneic Stem Cell Transplant Recipients The Journal of Infectious Diseases 186 1297 306 8 Tillie Leblond l Tonnel AB 2005 Allergic bronchopulmonary aspergillosis Allergy 60 1004 13 Greene R 2005 The radiological spectrum of pulmonary aspergillosis Med Mycol 43 Suppl 1 S147 54 Denning DW Riniotis K Dobrashian R Sambatakou H 2003 Chronic cavitary and fibrosing pulmonary and pleural aspergillosis Case series proposed nomenclature and review Clin Infect Dis 37 Suppl 3 S265 80 1 Camuset J Lavol A Wislez M Khalil A Bellocq A Bazelly B Mayaud C Cadranel J 2007 Bronchopulmonary aspergillosis infections in the non immunocompromised patient Rev Pneumol Clin 63 155 166 Portugu s 1 030 150 Vers o 1 2 01MAR12 Para utiliza o diagn stica in vitro MycAssay
12. e analisaram um painel de 7 padr es diferentes em triplicado num total de 168 ensaios As experi ncias foram realizadas utilizando 1 lote de fabrica o diferente do kit MycAssay Aspergillus em 2 equipamentos diferentes situados em 2 locais diferentes no Reino Unido Os resultados foram analisados contra o limite do branco LoB e o cut off cl nico CCO Com uma concentra o de 3 vezes o limite de detec o LoD os resultados de 100 de todas as amostras analisadas estavam em concord ncia positivo com o LoB e 83 das amostras estavam em concord ncia no CCO Com concentra es superiores a 3 x LoD os resultados de 100 de todas as amostras estavam em concord ncia tanto com CCO como LoB Relativamente aos padr es negativos todas as amostras analisadas foram negativas para CCO Transfer ncia do cut off cl nico O cut off cl nico de 36 0 foi estabelecido no SmartCycler Este cut off foi transferido analiticamente para a plataforma AB7500 utilizando um padr o com uma concentra o de Aspergillus que tinha demonstrado render 295 de resultados positivos no CCO no SmartCycler Foi determinado um valor de Ct de 33 5 que foi ent o confirmado utilizando padr es com 3 concentra es diferentes Portugu s 12 030 150 Vers o 1 2 01MAR12 Para utiliza o diagn stica in vitro MycAssay Aspergillus Amostras Respirat rias Applied Biosystems 7500 Foram estabelecidas as seguintes reivindica es de desempenho utilizando
13. ecomenda se o seguinte kit de isolamento e equipamento que foi utilizado durante a valida o Kit de Extrac o de DNA F ngico MycXtra REF 080 005 dispon vel na Myconostica Vortex Genie 2 Scientific Industries Inc New York USA Placa de adapta o para V rtex REF 080 015 dispon vel na Myconostica Observa es metodol gicas Leia todo o protocolo antes de come ar O processo completo do MycAssayT Aspergillus excluindo a extrac o de DNA demora aproximadamente 2 horas dependendo do n mero de amostras analisadas A prepara o da an lise deve ser efectuada numa esta o de trabalho de PCR ou num laborat rio pr PCR Se n o houver uma esta o de trabalho de PCR dispon vel a an lise deve ser preparada numa rea espec fica do laborat rio separada de reas utilizadas para extrac o de DNA que seja regularmente limpa com reagentes de descontamina o de DNA No entanto evite utilizar reagentes de descontamina o de DNA durante a prepara o da PCR em tempo real uma vez que podem interferir com o ensaio Utilize micropipetas para transfer ncia de fluidos Para a prepara o destas reac es devem ser utilizadas micropipetas espec ficas que devem ser regularmente descontaminadas Recomenda se a utiliza o de pontas de filtro de baixa reten o para assegurar que nenhum DNA perdido durante a prepara o do procedimento Exer a precau o ao manipular o tubo 4 Este cont m mate
14. gillus vt 2 sdt do CD ROM atrav s de Browse Pesquisar D um Nome de Placa adequado execu o Abaixo pode encontrar um exemplo New Document Wizard Define Document Select the assay container and template for the document and enter the operator name and comments Assay Standard Curve Absolute Quantitation 2 Container 96 well Clear z El Template MycAssay Aspergillus v1_2 sdt Browse Run Mode Operator your namel Comments Plate Name Aspergillus 04JANTO name Finish Cancel Clique em Finish Terminar Ser aberto um novo documento contendo os par metros e detectores de PCR definidos automaticamente para este ensaio Na visualiza o Plate Placa do separador Setup Configura o utilize Well Inspector Inspector de po os seleccione um po o e pressione Ctrl 1 ou clique com a tecla direita do rato para atribuir o nome aos po os de acordo com as posi es das amostras em 1 12 Portugu s 6 030 150 Vers o 1 2 01MAR12 Para utiliza o diagn stica in vitro MycAssay Aspergillus Amostras Respirat rias Applied Biosystems 7500 Por exemplo F sargu 5 gecs 2 7 Quando todos os po os possu rem nomes adequados grave a execu o mantendo o Plate Name Nome da placa como nome de ficheiro 2 8 Inicie a execu o no separador Instrument Equipamento clicando no bot o Sta
15. ha da execu o MEDIDA Repetir a execu o Positivo para DNA de Aspergillus Verificar o controlo negativo O Ct do MycAssay de IAC de 27 7 31 9 Verificar o controlo positivo O Ct do MycAssay de ASP de 15 0 20 0 SIM Verificar a amostra do doente MEDIDA Registar Resultado 2 Sw O Ct do MycAssay de ASP lt 33 5 N O Negativo parar DNA de Aspergillus Verificar a amostra do doente MEDIDA Registar Resultado 1 E O Ct do MycAssay de IAC de 27 7 31 9 Falha do IAC MEDIDA Repetir a amostra Se novamente o mesmo resultado Registar Resultado 3 Amostra ASP IAC Interpreta o Medida MycAssay Ct MycAssay Ct subsequente Controlo 37 0 n o Entre 27 7 e Controlo Os resultados negativo detectado 31 9 negativo do doente s o aceit vel v lidos Controlo 37 0 n o lt 27 7 ou gt 31 9 Falha no Repetir a negativo detectado controlo execu o negativo completa Controlo lt 37 0 Entre 27 7 e Contamina o Repetir a negativo 31 9 execu o completa Controlo Entre 15 0 e N D Controlo positivo Os resultados positivo 20 0 aceit vel do doente s o v lidos Controlo lt 15 0 ou N D Falha no Repetir a positivo gt 20 0 controlo positivo execu o completa Doente gt 33 5 Entre 27 7 e Negativo para Registar 31 9 Aspergillus no resultado Cco Resultado 1 Doente lt 33 5 N D Positivo para Registar Aspergillus no resultado Cco Resultado 2 Doente 37 0 n o lt 27 7 ou gt 31
16. igatus A aspergilose pulmonar cr nica inclui aspergiloma aspergilose pulmonar cavit ria cr nica e aspergilose fibr tica cr nica A aspergilose invasiva Al ocorre em grupos de doentes em risco incluindo doentes tratados com corticoster ides e doentes com neutropenia ou disfun o fagocit ria i e doen a granulomatosa cr nica e infec o por VIH Cerca de 80 dos casos de aspergilose invasiva envolve os pulm es O diagn stico de rotina da aspergilose pulmonar invasiva inclui tomografia computorizada TAC broncoscopia e lavagem broncoalveolar microscopia e cultura an lises sangu neas de antig nios de Aspergillus ou exame histol gico de amostras de biopsia cir rgica Neste cen rio as culturas s o com frequ ncia falsamente negativas De facto a lavagem broncoalveolar s positiva por cultura em aproximadamente 40 dos casos mesmo quando o diagn stico provado por outros meios 4567 demonstrando a falta de sensibilidade da cultura na detec o da aspergilose invasiva e da aspergilose pulmonar cr nica As culturas s o no entanto importantes se forem positivas uma vez que muitas an lises de diagn stico n o indicam o g nero ou a esp cie do fungo que causa a doen a ou o perfil de susceptibilidade do isolado que causa a infec o A aspergilose broncopulmonar complica a asma e a fibrose qu stica e pode raramente apresentar se sem doen as subjacentes A maioria dos casos est associada a A fumigatus com outro
17. ipiente de res duos cl nicos que possa ser selado Os reagentes n o utilizados n o podem ser guardados para utiliza o posterior Tenha um cuidado adicional ao pipetar o tubo 4 controlo positivo de DNA para assegurar que n o contamina outro tubo de reac o Fechar as tampas dos outros tubos de reac o antes de abrir o tubo 4 pode reduzir o risco de contamina o cruzada Anote as posi es de cada amostra na placa no plano da placa Vede cuidadosa e minuciosamente a placa com a pel cula de veda o de qualidade ptica tomando cuidado para assegurar que as bordas se encontram firmemente coladas Centrifugue a placa numa centr fuga a 900 g durante 1 minuto Certifique de de que n o existem bolhas no fundos dos po os Se existirem repita a centrifuga o Avance imediatamente para a sec o 2 As reac es do MycAssay Aspergillus permanecem est veis na bancada durante at 60 minutos A seguir prepara o do PCR certifique se de que a rea de trabalho volta a ser perfeitamente limpa utilizando reagentes de descontamina o de DNA Realizar a execu o Abra o software AB7500 SDS vers o 1 4 e introduza o seu nome de utilizador e a palavra passe Insira o CD ROM do Protocolo do MycAssay Aspergillus Myconostica No menu Quick Startup In cio r pido seleccione a primeira op o Create New Document Criar novo documento Seleccione as defini es conforme apresentado abaixo Seleccione o modelo MycAssay Asper
18. itiva PCR 2 10 0 83 NPV negativa 0 94 0 77 Sensibilidade Especificidade Das amostras testadas 0 8 continha inibidores da PCR conforme indicado pelo IAC a seguir extrac o com o kit MycXtra Relat rio cl nico O kit MycAssay Aspergillus foi concebido como uma ajuda no diagn stico Os resultados t m de ser contextualizados na doen a cl nica do doente e noutros resultados de an lises de diagn stico Os seguintes s o relat rios recomendados dependendo cada um da interpreta o do resultado do ensaio Resultado n 1 Aspergillus spp n o detectado Resultado n 2 Aspergillus spp detectado Resultado positivo Este ensaio tamb m detecta Penicillium spp Resultado n 3 An lise falhada presen a de inibidores ou de outra subst ncia desconhecida Portugu s 13 030 150 Vers o 1 2 01MAR12 Para utiliza o diagn stica in vitro MycAssay Aspergillus Amostras Respirat rias Applied Biosystems 7500 Limites do procedimento limite principal deste procedimento relaciona se com a qualidade da amostra principal Se a amostra for muito pequena ou se n o tiver sido colhida na rea afectada do pulm o a an lise ser menos sens vel e pode ser falsamente negativa s amostras da BAL devem ser centrifugadas antes da extrac o do DNA do sedimento Os dados demonstraram igualmente que a redu o no volume do sobrenadante utilizado no processo de extrac o alcan ada pelo
19. m que os reagentes s o de um nico kit Por conseguinte uma bolsa pode analisar 6 amostras de doentes Se for necess rio analisar mais de 6 amostras pode utilizar se mais de uma bolsa se as bolsas utilizadas forem do mesmo lote Pode ser analisado um m ximo de 38 amostras de doente utilizando as 5 bolsas do kit Calcule o n mero de reac es necess rias consultando a tabela abaixo N mero de N mero m ximo de amostras bolsas de doente 6 Retire o n mero adequado de bolsas do congelador N o utilize bolsas que j n o estejam seladas Se as amostras de doentes tiverem sido congeladas ap s a extrac o remova as igualmente do congelador Abra o n mero necess rio de bolsas e retire os tubos Se for utilizada mais de uma bolsa mas se for executado apenas um conjunto de controlos positivos e negativos s necess rio retirar os tubos 3 e 4 de uma das bolsas Exer a precau o ao manipular o tubo 4 Este cont m material de controlo positivo de DNA e a contamina o pode dar origem a resultados de an lise positivos falsos Deixe o conte do dos tubos descongelar colocando os sobre a bancada do laborat rio durante 5 10 minutos assegurando se que o conte do de cada tubo descongela antes de prosseguir Agite o conte do dos tubos e as amostras de doentes no v rtex prossiga com uma breve centrifuga o numa microcentr fuga para garantir a acumula o de todo o conte do no fundo dos tubos antes de utilizar C
20. o de baixa reten o descart veis isentas de DNAse ou pontas de pipetas de deslocamento positivo Utilize uma nova ponta para cada amostra ou reagente Elimine os reagentes n o utilizados e os res duos de acordo com os regulamentos nacionais federais estatais e locais Para evitar a contamina o com produtos de amplifica o de Aspergillus ou IAC n o abra os tubos de reac o ap s a amplifica o t Tyagi S Kramer FR 1996 Molecular beacons Probes that fluoresce upon hybridization Nature Biotechnology 14 303 308 Portugu s 2 030 150 Vers o 1 2 01MAR12 Para utiliza o diagn stica in vitro MycAssay Aspergillus Amostras Respirat rias Applied Biosystems 7500 Podem ser analisados controlos adicionais de acordo com as directrizes ou os regulamentos de organiza o locais estatais provinciais federais ou acreditadas N o coma beba nem fume nas reas em que as amostras e os reagentes dos kits s o manuseados Concentra es baixas de DNA podem ser inst veis se n o forem conservadas correctamente Recomenda se que as extrac es de DNA de amostras cl nicas sejam conservadas a 80 C para preservar a sua integridade M ltiplos ciclos de descongela o e recongela o devem ser igualmente evitados sempre que poss vel O kit foi validado utilizando placas para PCR de 96 po os com semi rebordo de 0 2 ml com pel cula adesiva de qualidade ptica Star Lab Cat E1403 8200 e Applied Biosy
21. oloque a placa de 96 po os numa prateleira de suporte Tome cuidado para tocar com as m os apenas na borda da placa Prepare sempre o controlo negativo primeiro seguido pelas amostras do doente O controlo positivo deve ser sempre preparado em ltimo lugar Os volumes de reagente e de DNA s o apresentados na seguinte tabela Reac o Controlo Amostra Controlo negativo do positivo doente Tubo 1 tampa 7 5 uL 75 uL 7 5 uL cor de laranja Tubo 2 tampa 7 5 uL 7 5 uL verde Tubo 3 tampa 10 uL transparente Amostra do doente Tubo 4 tampa preta Reagente Volume total Portugu s 5 030 150 Vers o 1 2 01MAR12 Para utiliza o diagn stica in vitro MycAssay Aspergillus Amostras Respirat rias Applied Biosystems 7500 1 11 1 13 2 1 2 2 2 3 2 4 2 5 2 6 Adicione os reagentes na ordem apresentada na tabela anterior o tubo 1 em seguida o tubo 2 seguido pelo padr o controlo negativo amostra do doente ou controlo positivo Tome cuidado ao retirar al quotas do tubo 1 o l quido ligeiramente viscoso e pode aderir aresta interna do tubo Se isto acontecer volte a centrifugar para acumular o conte do final na base do tubo antes de tentar remover as al quotas finais Utilize uma nova ponta de pipeta para cada transfer ncia de l quido Volte a tapar cada tubo de reagente a seguir utiliza o e elimine o imediatamente assim como todo o conte do restante num rec
22. ou a seguir ao ciclo depende da quantidade de produtos da amplifica o presentes nessa altura O sistema de PCR em Tempo Real monitoriza simultaneamente a fluoresc ncia emitida por cada sinal Precau es O kit destina se a ser utilizado apenas por profissionais de laborat rio Os procedimentos s o necess rios para manipula es n o aerossol de amostras As precau es normais e as directrizes institucionais devem ser seguidas no manuseamento de todas as amostras A Myconostica Ltd disponibiliza uma Ficha de dados de seguran a do material Este teste destina se apenas a utiliza o diagn stica in vitro Este teste s deve ser utilizado com o Applied Biosystems 7500 com a vers o de software SDS 1 4 N o utilize reagentes ou controlos se as bolsas protectoras estiverem abertas ou quebradas chegada Os reagentes e os controlos n o s o intercambi veis entre kits com n meros de lote diferentes Nunca junte reagentes ou controlos de tubos diferentes mesmo que perten am ao mesmo lote Nunca utilize reagentes ou controlos ap s o seu prazo de validade Os reagentes e os controlos nunca devem voltar a ser congelados ou reutilizados ap s a abertura Use roupas protectoras e luvas descart veis enquanto manipular os kits de reagentes Evite a contamina o microbiana e com desoxirribonuclease DNAse dos reagentes ao remover as al quotas dos tubos Recomenda se a utiliza o de pontas de pipetas com filtr
23. reitos de patente do PHRI apenas para o diagn stico humano in vitro SmartCycler uma marca comercial registada da Cepheid 904 Caribbean Drive Sunnyvale CA 94089 EUA Parte deste produto est coberta por uma licen a exclusiva a um pedido de patente detido pelo Fred Hutchinson Cancer Centre Seattle EUA Applied BioSystems uma marca comercial registada da Applera Corporation ou das suas subsidi rias nos EU e ou determinados outros pa ses Lab21 184 Cambridge Science Park Cambridge CB4 OGA United Kingdom Telephone 44 0 1638 552 882 Facsimile 44 0 1638 552 375 Email productsupportOlab21 com Portugu s 14 030 150 Vers o 1 2 01MAR12
24. rial de controlo positivo de DNA e a contamina o pode dar origem a resultados de an lise positivos falsos Use sempre luvas Todos os tubos de reagente devem ser tapados a seguir utiliza o e antes da sua elimina o Anote com precis o as posi es das amostras dentro da placa de 96 po os no plano da placa Procedimento para a utiliza o 13 Para um exemplo ver Mifflin T E 2003 Setting up a PCR Laboratory em PCR Primer 2 Ed eds Dieffenbach and Dveksler Cold Spring Harbour Laboratory Press Cold Spring Harbour NY EUA Portugu s 4 030 150 Vers o 1 2 01MAR12 Para utiliza o diagn stica in vitro MycAssay Aspergillus Amostras Respirat rias Applied Biosystems 7500 1 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 Prepara o da PCR em tempo real Para come ar ligue o sistema de PCR em Tempo Real equipamento e computador associado Introduza os nomes de utilizador e as palavras passe conforme exigido Assegure se de que a rea de trabalho foi limpa com reagentes de descontamina o de DNA e deixe secar completamente evite utiliz los durante a prepara o do ensaio uma vez que o excesso de solu o de limpeza pode inibir as reac es de PCR Cada bolsa cont m um de cada um dos tubos 1 2 3 e 4 Em cada bolsa existem reagentes suficientes para executar 8 reac es Devem ser realizadas pelo menos uma reac o com controlo positivo e uma reac o com controlo negativo por execu o e
25. rt Iniciar 2 9 Para determinar quanto tempo a execu o demorar a terminar apresentada uma contagem decrescente junto ao bot o Start Iniciar Portugu s 7 030 150 Vers o 1 2 01MAR12 Para utiliza o diagn stica in vitro MycAssay Aspergillus Amostras Respirat rias Applied Biosystems 7500 3 An lise e interpreta o de dados 3 1 Logo que a execu o tenha terminado clique na seta verde na barra do menu superior para actualizar 3 2 Abra a visualiza o Amplification Plot Gr fico da amplifica o do separador Result Resultados No lado direito defina os limiares para cada canal da seguinte forma Asp MycAssay 12000 IAC MycAssay 4000 A Manual Baseline Par metros base manuais deve permanecer em 3 15 para ambos os detectores 3 3 Clique no bot o Analyze Analisar para activar estas altera es Por exemplo Detector Npchssay ASP Detector casar at Line Color Detector Color w Line Color Detector Color x Analysis Settings Analysis Settings C Auto lt C Atom Manual Ot Manual Ct Threshold 1 24004 Threshold 4 0es003 C Auto Baseline Auto Baseline Statfeycte E Simtloyeep 3 Endfeyoke 15 Erd eycke 15 Analyze Analyze 3 4 Grave as altera es 3 5 Seleccione os po os contendo amostras e exporte o ficheiro de relat rio File gt Export gt Resulis Ficheiro gt Exportar gt Resultados conforme apresentado abaixo 24 7500 System SDS Software
26. s fungos implicados ocasionalmente A obstru o epis dica das vias a reas com tamp es de esputo espesso de Aspergillus hyphae IgE total s rica gt 1000 Ul mL e anticorpos IgE e IgG espec ficos de Aspergillus fumigatus detect veis ou um teste de pun o cut nea positivo para Aspergillus s o as caracter sticas da doen a As culturas de esputo podem ser positivas para A fumigatus e podem ser observadas bronquiectasia numa TAC do t rax Os meios actuais de diagn stico da aspergilose pulmonar cr nica s o uma mistura de radiologia que n o espec fica e serologia anticorpos IgC contra Aspergillus ou precipitinas que positiva na maioria das formas de aspergilose e por conseguinte n o espec fica para qualquer manifesta o particular de aspergilose As culturas s o positivas em apenas 40 65 dos casos provados por radiologia e serologia Uma vez que o diagn stico diferencial amplo 1 Base de dados de esp cies em www aspergillus org uk Hope WW Walsh TJ Denning DW 2005 The invasive and saprophytic syndromes due to Aspergillus spp Medical Mycology 43 suppl 1 S207 38 8 Hope WW Walsh TJ Denning DW 2005 Laboratory diagnosis of invasive aspergillosis Lancet Infectious Diseases 9 609 22 hi Levy H Horak DA Tegtmeier BR Yokota SB Forman SJ 1992 The value of bronchoalveolar lavage and bronchial washings in the diagnosis of invasive pulmonary aspergillosis Respir Med 86 243 8 5 Greub G
27. s instru es de utiliza o ou o kit expirou Verifique se foram seguidas as condi es de conserva o correctas do kit Verifique o prazo de validade dos reagentes ver caixa do kit r tulo da bolsa e repita com um kit dentro do prazo de validade se necess rio Ocorreu um erro durante o passo 1 12 e o padr o do controlo positivo tubo 4 foi colocado no tubo de reac o errado Repita a execu o tendo muito cuidado na fase de prepara o Este tipo de erros pode ser detectado ao observar um n vel mais alto de l quido num tubo de reac o e um n vel mais baixo noutro comparativamente ao normal O reagente do tubo 1 ou 2 n o foi adicionado reac o Repita a execu o tendo cuidado na fase de prepara o Este tipo de erros pode ser detectado ao observarem se n veis mais baixos de l quido neste po o comparativamente aos outros O controlo positivo foi posicionado incorrectamente no equipamento Tome cuidado para que os po os sejam anotados correctamente no software Foram utilizados tubos ou placas n o recomendadas Os limiares s s o v lidos se forem utilizadas placas para PCR de 96 po os com semi rebordo de 0 2 ml com pel cula adesiva de qualidade ptica Star Lab Cat E1403 8200 e Applied Biosystems Cat 4311971 recomendadas Portugu s 10 030 150 Vers o 1 2 01MAR12 Para utiliza o diagn stica in vitro MycAssay Aspergillus Amostras Respirat rias Applied Biosystems 7500 4 4 Amo
28. stems Cat 4311971 A utiliza o de outras fontesttipos de pl stico pode invalidar os limiares e assim as reivindica es feitas nas instru es de utiliza o Recomenda se que caso se utilize uma fonte alternativa essa valida o local seja conduzida com as reac es com controlo positivo e negativo Conte do do kit Descri o O kit consiste em cinco bolsas de folha seladas com 3 compartimentos podendo ser cada uma delas removida da caixa e utilizada separadamente Cada bolsa cont m reagentes suficientes para 8 reac es Volume Tubo 1 dNTPs 66 uL Tampa cor MgCl de laranja Solu o tamponada com complexo de DNA polimerase Tubo 2 lt 0 01 prim rios 66 uL Tampa verde lt 0 01 sinais moleculares lt 0 0001 Controlo de Amplifica o Interno IAC O Controlo de Amplifica o Interno um plasm deo de DNA recombinante que abriga uma sequ ncia n o infecciosa n o relacionada com a sequ ncia alvo Aspergillus Tamp o Tris HCI Tubo 3 Controlo negativo 25 uL Tampa gua transparente Tubo 4 Controlo positivo 25 uL Tampa preta lt 0 0001 DNA de controlo positivo A mol cula do controlo positivo um plasm deo recombinante que abriga a sequ ncia alvo Aspergillus Tamp o Tris HCI O kit cont m igualmente CD ROM do Protocolo do MycAssay Aspergillus Myconostica Instru es de utiliza o Certificado de an lise Conserva o O kit deve ser conservado congelado 15 a 25
29. stra s de doentes apresenta m resultado 3 Inv lido prov vel que a s amostra s cl nica s extra da s contenha m inibidores da PCR gt Recomenda se que o DNA de amostras cl nicas seja extra do utilizando o kit de Extrac o de DNA F ngico MycXtra 4 5 N o existem resultados para qualquer canal com amostras ou controlos As condi es de conserva o do kit n o cumpriram as instru es na sec o Conserva o destas instru es de utiliza o ou o kit expirou gt Verifique se foram seguidas as condi es de conserva o correctas do kit Verifique o prazo de validade dos reagentes ver caixa do kit r tulo da bolsa e repita com um kit dentro do prazo de validade se necess rio O equipamento utilizado n o funciona correctamente gt Verifique se o seu equipamento de PCR em tempo real tem o hist rico de manuten es actualizado e se foi totalmente calibrado conforme descrito no Guia de Instala o e Manuten o Foi utilizado um ficheiro de protocolo incorrecto durante a configura o do software gt Consulte a sec o 2 e seleccione o ficheiro de protocolo correcto conforme especificado para cada tipo vers o de software do CD ROM do Protocolo Myconostica S pode ser carregado o ficheiro apropriado para o software Repita a execu o utilizando o ficheiro de protocolo correcto Se tiver mais d vidas ou problemas ou se tiver problemas contacte o Apoio T cnico productsupportDlab2
30. tar se que um resultado positivo neste ensaio pode ser o resultado de infec o por Penicillium e n o por Aspergillus A selectividade anal tica foi testada com DNA extra do de uma variedade de esp cies f ngicas e n o f ngicas diferentes As esp cies seguintes n o apresentaram um resultado positivo Blastomyces capitatus Candida albicans C glabrata C parapsilosis C tropicalis Cladosporium spp Cryptococcus neoformans Doratomyces microsporus Fusarium solani Rhizomucor pusillus Rhodotonila rubra Saccharomyces cerevisiae Scedosporium apiosperinu S prolificans Sporothrix schenkii Trichosporon capitatu As esp cies bacterianas seguintes n o apresentaram um resultado positivo Bordetella pertussis Corynebacterium diphtheriae Escherichia coli Haemophilus influenza Lactobacillus plantarum Legionella pneumophila Moraxella catarrhalis Mycoplasma pneumoniae Neisseria meningitidis Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Streptococcus pneumoniae S pyogenes S salivarius O DNA gen mico humano n o apresenta um resultado positivo com este ensaio As 3 esp cies f ngicas seguintes n o foram analisadas no sistema AB7500 mas tinham sido analisadas no SmartCycler Pneumocystis jirovecii Histoplasma capsulatum e Alternaria alternata Todas as 3 forneceram resultados negativos com o ensaio Reprodutibilidade e repetibilidade A repetibilidade e a reprodutibilidade foram determinadas por 4 operadores diferentes qu
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