MycAssay™ Aspergillus
Contents
1. Hilden Alemanha Este produto comercializado sob a licen a do Public Health Research Institute Newark New Jersey EUA e pode ser utilizado sob os direitos de patente do PHRI apenas para o diagn stico humano in vitro SmartCycler uma marca comercial registada da Cepheid 904 Caribbean Drive Sunnyvale CA 94089 EUA Parte deste produto est coberta por uma licen a exclusiva a um pedido de patente detido pelo Fred Hutchinson Cancer Centre Seattle EUA Lab21 184 Cambridge Science Park Cambridge CB4 0GA United Kingdom Telephone 44 0 1638 552 882 Facsimile 44 0 1638 552 375 Email productsupportOlab21 com 030 116 Version 2 6 01MAR12 Portugu s 122. wentii A tubingensis e A foetidus O DNA gen mico extra do a partir de Penicillium spp tamb m gerou resultados positivos Tal deve se ao facto das sequ ncias dos alvos moleculares serem grandemente conservadas entre Aspergillus e Penicillium Por conseguinte deve notar se que um resultado positivo neste ensaio pode ser o resultado de infec o por Penicillium e n o por Aspergillus A selectividade anal tica foi testada com DNA extra do de uma variedade de esp cies f ngicas e n o f ngicas diferentes As esp cies seguintes n o apresentaram um resultado positivo Alternaria alternata Blastomyces capitatus Candida albicans C glabrata C parapsilosis C tropicalis Cladosporium spp Cryptococcus neoformans Doratomyces microsporus Fusarium solani Histoplasma capsulatum Pneumocystis jirovecii Rhizomucor pusillus Rhodotonila rubra Saccharomyces cerevisiae Scedosporium apiospermum S prolificans Sporothrix schenkii Trichosporon capitatum As esp cies bacterianas seguintes n o apresentaram um resultado positivo Bordetella pertussis Corynebacterium diphtheriae Escherichia coli Haemophilus influenzae Lactobacillus plantarum Legionella pneumophila Moraxella catarrhalis Mycoplasma pneumoniae Neisseria meningitidis Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Streptococcus pneumoniae S pyogenes S salivarius O DNA gen mico humano n o apresenta um resultado positivo com este ensaio Reprodutibilidade e repetib
3. Para determinar quanto tempo a execu o demorar a terminar clique no separador Check Status Verificar estado O nome da execu o e o subsequente tempo de execu o ser o apresentados 2 2 Software SmartCycler Dx Diagnostic vers o 3 0 2 2 1 Abra o software SmartCycler Dx Diagnostic vers o 3 0 e introduza o seu nome de utilizador e a palavra passe 2 2 2 Insira o CD ROM do protocolo MycAssay Aspergillus Myconostica e clique no separador Define Assays Definir ensaios e importe o ficheiro MycAssay Aspergillus vt 3 sca do CD ROM 2 2 3 Clique no separador Create Run Criar execu o Introduza um Run Name Nome de execu o recomenda se que este inclua a data e as iniciais do operador como m nimo ou deixe um espa o se desejar que o software crie o nome automaticamente 2 24 Seleccione MycAssay Aspergillus v1 3 como ensaio 2 2 5 Introduza o Lot Number N mero do lote e o Expiration Date Prazo de validade do kit conforme est impresso na caixa do kit e em cada bolsa O n mero do lote ter a forma de M XXXXXXXX 2 2 6 Introduza a ID amostra do doente na caixa Patient Sample ID e o n mero de amostras r plicas nas caixas Number of specimens apropriadas e clique em Apply Fa a isto para todas as amostras a analisar O software incluir automaticamente um controlo positivo e um negativo na execu o da PCR em tempo real 2 2 7 Coloque os tubos de reac o cuidadosamente nos s tios espec ficos no bloco do SmartCyc
4. protocolo correcto Se tiver mais d vidas ou problemas ou se tiver problemas contacte o Apoio T cnico productsupport lab21 com Portugu s 9 030 116 Vers o 2 6 01MAR12 MycAssay Pneumocystis Para utiliza o diagn stica in vitro Cepheid SmartCycler Amostras Respirat rias Caracter sticas e limita es do desempenho Sensibilidade anal tica Com o protocolo descrito acima e os padr es de PCR gerados na Myconostica o limite do branco LoB para MycAssay Aspergillus foi determinado como sendo um Ct de 38 0 enquanto o limite de detec o LoD foi determinado como sendo lt 50 c pias de DNA alvo Isto foi determinado utilizando a estirpe AF293 de Aspergillus fumigatus a partir da qual o genoma foi totalmente sequenciado Sabe se que existem 37 c pias do alvo dentro do genoma determinadas por mapeamento ptico e por conseguinte 50 c pias do alvo representam aproximadamente 1 3 genomas Especificidade e selectividade anal tica A especificidade anal tica foi testada com DNA extra do a partir de 15 esp cies diferentes de Aspergilli incluindo v rias estirpes de cada A fumigatus A niger A terreus e A nidulans Os sinais detectados acima do LoB foram registados como resultado positivo Todos os 15 Aspergillus spp analisados deram positivo no ensaio Al m dos anteriormente mencionados est o inclu dos A flavus A versicolor A glaucus A sclerotiorum A niveus A lentulus A unguis A candidus A
5. significance Clin Microbiol Infect 4 710 716 Perfect JR Cox GM Lee JY Kauffman CA de Repentigny L Chapman SW Morrison VA Pappas P Hiemenz JW Stevens DA and the Mycoses Study Group 2001 The impact of culture isolation of Aspergillus species A hospital based survey of Aspergillosis Clinical Infectious Diseases 33 1824 33 Maertens J Van Eldere J Verhaegen J Verbeken E Verschakelen J Boogaerts M 2002 Use of Circulating Galactomannan Screening for Early Diagnosis of Invasive Aspergillosis in Allogeneic Stem Cell Transplant Recipients The Journal of Infectious Diseases 186 1297 306 8 Tillie Leblond I Tonnel AB 2005 Allergic bronchopulmonary aspergillosis Allergy 60 1004 13 Greene R 2005 The radiological spectrum of pulmonary aspergillosis Med Mycol 43 Suppl 1 8147 54 Portugu s 1 030 116 Vers o 2 6 01MAR12 MycAssay Pneumocystis Para utiliza o diagn stica in vitro Cepheid SmartCycler Amostras Respirat rias apenas 40 65 dos casos provados por radiologia e serologia Uma vez que o diagn stico diferencial amplo incluindo tuberculose micobacteriose at pica sarcoidose histoplasmose coccidioidomicose pneumoconiose pulm o reumat ide espondilite anquilosante e outras a documenta o da presen a de Aspergillus spp nas amostras respirat rias importante para evitar o atraso no diagn stico da aspergilose pulmonar e o tratamento incorrecto MycAssay Aspergillus
6. um kit de diagn stico molecular para a detec o do DNA gen mico de Aspergillus spp com base na tecnologia de PCR com sinais moleculares Molecular Beacon Todo o procedimento de an lise incluindo a extrac o de DNA da amostra cl nica pode ser terminado em 4 horas comparativamente cultura f ngica que pode demorar v rios dias a produzir resultados positivos Este ensaio oferece vantagens sobre os m todos de diagn stico actualmente dispon veis para a aspergilose invasiva aguda e a aspergilose pulmonar cr nica Estas vantagens incluem uma detec o mais r pida de Aspergillus spp e o potencial de um aumento da sensibilidade a Aspergillus spp em doentes altamente imunocomprometidos com suspeita de aspergilose pulmonar invasiva Princ pios do procedimento A seguir mistura dos reagentes no kit MycAssay Aspergillus com uma amostra contendo a sequ ncia de DNA alvo de Aspergillus uma por o do gene 18S riboss mico de Aspergillus a termociclagem resulta na ocorr ncia da amplifica o do DNA O ensaio tamb m cont m um Controlo de Amplifica o Interno IAC um fragmento de DNA n o presente em genomas de Aspergillus outros genomas f ngicos bacterianos ou humanos para detectar subst ncias inibit rias da PCR e confirmar a funcionalidade dos reagentes do ensaio Os alvos de DNA amplificados s o detectados com a tecnologia de sinais moleculares Os sinais moleculares s o amostras de hibridiza o de oligonucle tid
7. 0 1 Camuset J Lavol A Wislez M Khalil A Bellocq A Bazelly B Mayaud C Cadranel J 2007 Bronchopulmonary aspergillosis infections in the non immunocompromised patient Rev Pneumol Clin 63 155 166 o Tyagi S Kramer FR 1996 Molecular beacons Probes that fluoresce upon hybridization Nature Biotechnology 14 303 308 030 116 Version 2 6 01MAR12 Portugu s 2 Para utiliza o diagn stica in vitro MycAssay Pneumocystis Amostras Respirat rias Cepheid SmartCycler Elimine os reagentes n o utilizados e os res duos de acordo com os regulamentos nacionais federais estatais e locais Para evitar a contamina o com produtos de amplifica o de Aspergillus ou IAC n o abra os tubos de reac o ap s a amplifica o Podem ser analisados controlos adicionais de acordo com as directrizes ou os regulamentos de organiza o locais estatais provinciais federais ou acreditadas N o coma beba nem fume nas reas em que as amostras e os reagentes dos kits s o manuseados Concentra es baixas de DNA podem ser inst veis se n o forem conservadas correctamente Recomenda se que as extrac es de DNA de amostras cl nicas sejam conservadas a 80 C para preservar a sua integridade M ltiplos ciclos de descongela o e recongela o devem ser igualmente evitados sempre que poss vel Conte do do kit Descri o O kit consiste em cinco bolsas de folha seladas com 3 compartimentos podendo ser cada uma
8. Para utiliza o diagn stica in vitro MycAssay Aspergillus Cepheid SmartCycler myconosjica Amostras Respirat rias MycAssay M Aspergillus Cepheid SmartCycler Amostras Respirat rias REF 080 045 Utiliza o prevista O MycAssayTM Aspergillus est indicado para a utiliza o por profissionais de laborat rio qualificados para a detec o qualitativa do DNA gen mico de Aspergillus spp extra do de amostras respirat rias do tracto respirat rio inferior p ex amostras br nquicas como ajuda no diagn stico em doentes adultos com suspeita de infec o ou alergia por Aspergillus O MycAssay Aspergillus foi validado para a utiliza o com o Cepheid SmartCycler utilizando as vers es de software Dx 1 7b e 3 0 Resumo e explica o Aspergillus spp s o fungos ub quos e oportunistas que provocam tanto s ndromas al rgicas como invasivas O g nero abrangido por aproximadamente 300 esp cies das quais 41 foram associadas doen a humana A maioria das infec es causada por A fumigatus A flavus A terreus e A niger com menor frequ ncia foram implicados A nidulans e outras esp cies raras tais como A sydowii A versicolor A lentulus e A pseudofischeri A maioria das infec es e alergias causadas por Aspergillus spp afecta o tracto respirat rio As s ndromas al rgicas incluem aspergilose boncopulmonar ABPA e sinusite Aspergillus al rgica e s o habitualmente causadas por A fumigatus A a
9. Run s Arquivar execu o es do menu suspenso Surgir um ecr de mensagem clique em Proceed Avan ar Seleccione a execu o a ser arquivada assinalando a caixa esquerda e clique em OK Surgir uma mensagem de aviso informando quantas execu es ser o arquivadas se este n mero estiver correcto clique em Proceed Avan ar Seleccione um destino para gravar o ficheiro da execu o p ex uma pen USB de dados Clique em Save Guardar e anote o nome do ficheiro Surgir uma mensagem de aviso informando quantas execu es ser o arquivadas se este n mero estiver correcto clique em Proceed Avan ar Para importar dados da execu o prossiga para a directoria Tools Ferramentas no topo do ecr e seleccione Data Management Gest o de dados seguido por Retrieve run s Extrair execu o es do menu suspenso Surgir um ecr de mensagem clique em Proceed Avan ar V para Look In Ver em e seleccione o dispositivo de armazenamento utilizado para o arquivo dos dados da execu o ver sec o 3 4 acima Seleccione o ficheiro da execu o a ser extra do e clique em Open Abrir Outro ecr surgir indicando que seleccione a execu o que deseja extrair Seleccione a execu o a ser extra da e clique em OK Surgir um ecr de mensagem informando quantas execu es ser o extra das se este n mero estiver correcto clique em Proceed Avan ar Se tamb m for necess ria uma c pia em papel clique em Repor
10. ce of the pathogenic and allergenic filamentous fungus Aspergillus fumigates Nature 438 1151 6 030 116 Version 2 6 01MAR12 Portugu s 10 MycAssay Pneumocystis Para utiliza o diagn stica in vitro Cepheid SmartCycler Amostras Respirat rias Avalia o do desempenho Para avaliar o desempenho do kit MycAssay Aspergillus em amostras cl nicas foram utilizadas amostras respirat rios BAL colhidas em 2 hospitais extra das com o kit MycXtra e conservadas Foram feitas compara es tanto com o diagn stico cl nico como com a cultura O valor de cut off com um Ct de 36 0 foi estabelecido a seguir an lise de um conjunto de dados de amostras provenientes de centros diferentes e de popula es de doentes diferentes Os cut offs diferentes foram avaliados relativamente probabilidade de diferenciamento entre estado patol gico e estado n o patol gico PCR vs Diagn stico cl nico Positivo cl nico Negativo cl nico PCR positiva 31 1 0 97 PPV PCR negativa 2 10 0 83 NPV 0 94 0 91 Sensibilidade Especificidade PCR vs Cultura de Aspergillus Cultura positiva Cultura negativa PCR positiva 29 3 0 91 PPV PCR negativa 2 10 0 83 NPV 0 94 0 77 Sensibilidade Especificidade Das amostras testadas 0 8 continham inibidores da PCR conforme indicado pelo IAC a seguir extrac o com o conjunto MycXtra Relat rio cl nico NOTA Na an lise do relat rio de r
11. cional ao pipetar o Tubo 4 controlo positivo de DNA para assegurar que n o contamina outro tubo de reac o Fechar as tampas dos outros tubos de reac o antes de abrir o Tubo 4 pode reduzir o risco de contamina o cruzada 1 14 Certifique se de que todas as tampas dos tubos de reac o est o firmemente fechadas e em seguida rotule cada tampa utilizando uma caneta marcadora permanente p ex POS para controlo positivo NEG para controlo negativo e o ID do doente para as amostras do doente Centrifugue os tubos de reac o durante 10 segundos com a mini centr fuga especificamente adaptada Inspeccione visualmente se existem bolhas nas misturas da reac o 1 15 Avance imediatamente para a Sec o 2 As reac es do MycAssay Aspergillus permanecem est veis na bancada durante at 60 minutos 1 16 A seguir prepara o do PCR certifique se de que a rea de trabalho volta a ser perfeitamente limpa utilizando reagentes de descontamina o de DNA 2 Realizar a execu o Antes de prosseguir com a sec o seguinte verifique qual a vers o de software Dx que est instalada no seu computador Abra o software seleccione Help Ajuda da barra de ferramentas e clique em About Acerca Na vers o 1 7b siga as instru es seguintes na Sec o 2 1 Na vers o 3 0 siga as instru es seguintes na Sec o 2 2 Tome igualmente conhecimento que s o necess rios determinados privil gios de utilizador no software para Retrieve Run
12. delas removida da caixa e utilizada separadamente Cada bolsa cont m reagentes suficientes para 8 reac es Volume Tubo 1 dNTPs 66 uL Tampa cor de laranja MgCl Solu o tamponada com complexo de DNA polimerase Tubo 2 lt 0 01 prim rios 66 uL Tampa verde lt 0 01 sinais moleculares lt 0 0001 Controlo de Amplifica o Interno CAI O Controlo de Amplifica o Interno um plasm deo de DNA recombinante que abriga uma sequ ncia n o infecciosa n o relacionada com a sequ ncia alvo Aspergillus Tamp o Tris HCI Tubo 3 Controlo negativo 25 uL Tampa transparente gua Tubo 4 Controlo positivo 25 uL Tampa preta lt 0 0001 DNA de controlo positivo A mol cula do controlo positivo um plasm deo recombinante que abriga a sequ ncia alvo Aspergillus Tamp o Tris HCI O kit cont m igualmente CD ROM do Protocolo do MycAssay Aspergillus Myconostica Instru es de utiliza o Certificado de an lise Conserva o O kit deve ser conservado congelado 15 a 25 C at ao prazo de validade indicado no r tulo da caixa do kit momento em que deve ser eliminado em conformidade com as regulamenta es locais Uma vez aberta uma bolsa o conte do deve ser utilizado imediatamente sem voltar a congelar nem reutilizar posteriormente Portugu s 3 030 116 Vers o 2 6 01MAR12 MycAssay Pneumocystis Para utiliza o diagn stica in vitro Cepheid SmartCycler Amostras Respirat rias Materiais equi
13. egistar resultado 2 Positive Vermelho Positivo para Aspergillus Registar resultado 3 Invalid Cinzento claro Falha do IAC na amostra Repetir a amostra 4 Invalid Cinzento claro Falha no controlo positivo Repetir a execu o ou negativo completa Se o resultado for comunicado como ND em cinzento claro isto corresponde ao c digo de erro 3079 o resultado de fluoresc ncia elevada em um ou mais canais Se for registado um valor Ct de lt 36 0 no canal de Aspergillus registe o como positivo Para visualizar separadamente resultados de amostras individuais tanto de Aspergillus como de CAI seleccione Sample Results Resultados de amostras na lista Views Visualiza es e clique nos separadores individuais de cada alvo Os resultados ser o exibidos no mesmo formato que os Patient Results Resultados de doente mas para cada alvo individual Se uma amostra de doente apresentar um resultado inv lido tal deve se a um resultado de IAC falhado indicado por N o resolvido no separador Sample Results Resultados de amostras repita a reac o mais os controlos positivo e negativo Se a reac o continuar a falhar pode estar presente uma subst ncia inibit ria no padr o e os resultados negativos n o s o fi veis Para exportar os dados da execu o para permitir a transfer ncia para outro computador v para a directoria Tools Ferramentas no topo do ecr e seleccione Data Management Gest o de dados seguido por Archive
14. esultados assegure se que est utiliza o protocolo correcto Para amostras respirat rias deve utilizar se o MycAssay Aspergillus Dx1 7b v1 3 ou o MycAssay Aspergillus vt 3 O protocolo SERUM MycAssay Asp v1 deve ser utilizado apenas em conjunto com o MycAssay Aspergillus SmartCycler Serum IFU refer ncia 030 169 A utiliza o de um protocolo errado conduz a resultados inv lidos O kit MycAssay Aspergillus foi concebido como uma ajuda no diagn stico Os resultados t m de ser contextualizados na doen a cl nica do doente e noutros resultados de an lises de diagn stico Os seguintes s o relat rios recomendados dependendo cada um da interpreta o do resultado do ensaio Resultado n 1 Aspergillus spp n o detectado Resultado n 2 Aspergillus spp detectado Resultado positivo Este ensaio tamb m detecta Penicillium spp Resultado n 3 An lise falhada presen a de inibidores ou de outra subst ncia desconhecida Limites do procedimento Q limite principal deste procedimento relaciona se com a qualidade da amostra principal Se a amostra for muito pequena ou se n o tiver sido colhida na rea afectada do pulm o a an lise ser menos sens vel e pode ser falsamente negativa As amostras da BAL devem ser centrifugadas antes da extrac o do DNA do sedimento Os dados demonstraram igualmente que a redu o no volume do sobrenadante utilizado no processo de extrac o alcan ada pelo pas
15. evem ser seguidas no manuseamento de todas as amostras A Myconostica Ltd disponibiliza uma Ficha de dados de seguran a do material Este teste destina se apenas a utiliza o diagn stica in vitro Esta an lise destina se apenas a ser utilizada em combina o com o sistema Cepheid SmartCycler e o software Dx Diagnostic nas vers es 1 7b e 3 0 N o utilize reagentes ou controlos se as bolsas protectoras estiverem abertas ou quebradas chegada Os reagentes e os controlos n o s o intercambi veis entre kits com n meros de lote diferentes Nunca junte reagentes ou controlos de tubos diferentes mesmo que perten am ao mesmo lote Nunca utilize reagentes ou controlos ap s o seu prazo de validade Os reagentes e os controlos nunca devem voltar a ser congelados ou reutilizados ap s a abertura Use roupas protectoras e luvas descart veis enquanto manipular os kits de reagentes Evite a contamina o microbiana e com desoxirribonuclease DNAse dos reagentes ao remover as al quotas dos tubos Recomenda se a utiliza o de pontas de pipetas com filtro de baixa reten o descart veis isentas de DNAse ou pontas de pipetas de deslocamento positivo Utilize uma nova ponta para cada amostra ou reagente 10 Denning DW Riniotis K Dobrashian R Sambatakou H 2003 Chronic cavitary and fibrosing pulmonary and pleural aspergillosis Case series proposed nomenclature and review Clin Infect Dis 37 Suppl 3 S265 8
16. ilidade A repetibilidade e a reprodutibilidade foram determinadas por 5 operadores diferentes que analisaram um painel com oculta o de 7 padr es diferentes em triplicado As experi ncias foram realizadas utilizando 3 lotes de fabrica o diferentes do kit MycAssay Aspergillus em 3 equipamentos diferentes situados em 2 locais diferentes no Reino Unido Os resultados foram analisados contra o limite do branco LoB e o cut off cl nico CCO Com uma concentra o de 3 vezes o limite de detec o LoD os resultados de 100 de todas as amostras analisadas estavam em concord ncia positivo com o LoB e 91 das amostras estavam em concord ncia no CCO Com concentra es superiores a 3 x LoD os resultados de 100 de todas as amostras estavam em concord ncia tanto com CCO como LoB Relativamente aos padr es negativos todas as amostras analisadas foram negativas para CCO Subst ncias interferentes contra indica es para a utiliza o Os compostos seguintes foram analisados com concentra es clinicamente relevantes e considerados como n o inibindo o ensaio acetilciste na anfotericina dipropionato de beclometasona budesonida colistimetato de s dio propionato de fluticasona fumarato de formoterol di hidratado brometo de ipratr pio lidoca na manitol sulfato de salbutamol salmeterol cloreto de s dio cromoglicato de s dio terbutalina tobramicina 14 Nierman WC Pain A Anderson MJ et al 2005 Genomic sequen
17. implicados ocasionalmente A obstru o epis dica das vias a reas com tamp es de esputo espesso de Aspergillus hyphae IgE total s rica gt 1000 Ul mL e anticorpos IgE e IgG espec ficos de Aspergillus fumigatus detect veis ou um teste de pun o cut nea positivo para Aspergillus s o as caracter sticas da doen a As culturas de esputo podem ser positivas para A fumigatus e podem ser observadas bronquiectasia numa TAC do t rax Os meios actuais de diagn stico da aspergilose pulmonar cr nica s o uma mistura de radiologia que n o espec fica e serologia anticorpos IgG contra Aspergillus ou precipitinas que positiva na maioria das formas de aspergilose e por conseguinte n o espec fica para qualquer manifesta o particular de aspergilose As culturas s o positivas em 1 Species Database in www aspergillus org uk 2 Hope WW Walsh TJ Denning DW 2005 The invasive and saprophytic syndromes due to Aspergillus spp Medical Mycology 43 suppl 1 S207 38 3 Hope WW Walsh TJ Denning DW 2005 Laboratory diagnosis of invasive aspergillosis Lancet Infectious Diseases 9 609 22 Levy H Horak DA Tegtmeier BR Yokota SB Forman SJ 1992 The value of bronchoalveolar lavage and bronchial washings in the diagnosis of invasive pulmonary aspergillosis Respir Med 86 243 8 5 Greub G and Bille J 1998 Aspergillus species isolated from clinical specimens suggested clinical and microbiological criteria to deteremine
18. ler e clique em Start Run Iniciar execu o N B Tenha cuidado em colocar os tubos de reac o nos s tios espec ficos uma vez que podem n o estar na mesma ordem da sua prepara o Fa a uma nota do nome da execu o e clique em OK A execu o iniciar se agora e surgir o luzes vermelhas por cima de cada s tio em utiliza o no bloco 2 2 8 Para determinar quanto tempo a execu o demorar a terminar clique no separador Check Status Verificar estado O nome da execu o e o subsequente tempo de execu o ser o apresentados 3 An lise e interpreta o de dados 3 1 Os resultados podem ser visualizados no software Dx seleccionando o separador View Results Visualizar resultados 3 2 Clique no bot o View Another Run Visualizar outra execu o no fundo da p gina seleccione a execu o que deseja visualizar e em seguida clique em OK 3 3 Os Patient Results j devem estar seleccionados na lista Views Visualiza es A ID amostra de doente e o resultado do ensaio subsequente estar o claramente apresentados Os resultados podem ser interpretados mediante a tabela seguinte Portugu s 7 030 116 Vers o 2 6 01MAR12 MycAssay Pneumocystis Cepheid SmartCycler 3 4 3 5 3 6 3 7 3 8 4 Para utiliza o diagn stica in vitro Amostras Respirat rias Resultado Resultado de doente Cor Interpreta o Medida subsequente 1 Negative Verde Negativo para Aspergillus R
19. o lote Pode ser analisado um m ximo de 38 amostras de doente utilizando as 5 bolsas do kit Calcule o n mero de reac es necess rias consultando a tabela abaixo N mero m ximo de amostras de doente 6 N mero de bolsas Retire o n mero adequado de bolsas do congelador N o utilize bolsas que j n o estejam seladas Se as amostras de doentes tiverem sido congeladas ap s a extrac o remova as igualmente do congelador Abra o n mero necess rio de bolsas e retire os tubos Se for utilizada mais de uma bolsa mas se for executado apenas um conjunto de controlos positivos e negativos s necess rio retirar os Tubos 3 e 4 de uma das bolsas Proceda com precau o ao manipular o Tubo 4 Este cont m material de controlo positivo de DNA e uma contamina o pode dar origem a resultados de an lise positivos falsos Deixe o conte do dos tubos descongelar colocando os sobre a bancada do laborat rio durante 5 10 minutos assegurando se que o conte do de cada tubo descongela antes de prosseguir Agite o conte do dos tubos e as amostras de doentes no v rtice prossiga com uma breve centrifuga o numa microcentr fuga para garantir a acumula o de todo o conte do no fundo dos tubos antes de utilizar Coloque o n mero necess rio de tubos de reac o SmartCycler na s respectivas prateleira s de suporte Tenha cuidado em tocar com as m os apenas o pesco o dos tubos de reac o Prepare sempre primeiro o c
20. olsa e repita com um kit dentro do prazo de validade se necess rio O reagente do Tubo 1 ou 2 n o foi adicionado reac o da PCR ou foi adicionada a quantidade a dobrar do Tubo 2 Repita a execu o tendo cuidado na fase de prepara o Este tipo de erros pode ser detectado ao observarem se n veis mais altos ou mais baixos de l quido num tubo de reac o comparativamente aos outros 4 3 O controlo positivo est negativo 4 4 4 5 gt As condi es de conserva o do kit n o cumpriram as instru es na sec o Conserva o destas instru es de utiliza o ou o kit expirou Verifique se foram seguidas as condi es de conserva o correctas do kit Verifique o prazo de validade dos reagentes ver caixa do kit r tulo da bolsa e repita com um kit dentro do prazo de validade se necess rio Ocorreu um erro durante o passo 1 12 e o padr o do controlo positivo Tubo 4 foi colocado no tubo de reac o errado Repita a execu o tendo muito cuidado na fase de prepara o Este tipo de erros pode ser detectado ao observar um n vel mais alto de l quido num tubo de reac o e um n vel mais baixo noutro comparativamente ao normal O reagente do Tubo 1 ou 2 n o foi adicionado reac o Repita a execu o tendo cuidado na fase de prepara o Este tipo de erros pode ser detectado ao observarem se n veis mais baixos de l quido neste tubo de reac o comparativamente aos outros O controlo posi
21. ontrolo negativo seguido pelas amostras do doente O controlo positivo deve ser sempre preparado em ltimo lugar Os volumes de reagente e de DNA s o apresentados na seguinte tabela Reac o Reagente Controlo negativo Amostra do doente Controlo positivo Tubo 1 tampa cor de laranja Tubo 2 tampa verde Tubo 3 tampa transparente Amostra do doente Tubo 4 tampa preta 7 5 uL 7 5 uL 10 uL 7 5 uL 7 5 uL 10 uL 7 5 uL 7 5 uL Volume total 25uL Adicione os reagentes na ordem apresentada na tabela anterior o Tubo 1 em seguida o Tubo 2 seguido pelo padr o controlo negativo amostra do doente ou controlo positivo Tome cuidado ao retirar al quotas do Tubo 1 o l quido ligeiramente viscoso e pode aderir aresta interna do tubo Se isto acontecer volte a centrifugar para acumular o conte do final na base do tubo antes de tentar remover as al quotas finais 030 116 Vers o 2 6 01MAR12 MycAssay Pneumocystis Para utiliza o diagn stica in vitro Cepheid SmartCycler Amostras Respirat rias 1 12 Utilize uma nova ponta de pipeta para cada transfer ncia de l quido Volte a tapar cada tubo de reagente a seguir utiliza o e elimine o imediatamente assim como todo o conte do restante num recipiente de res duos cl nicos que possa ser selado Os reagentes n o utilizados n o podem ser guardados para utiliza o posterior 1 13 Tenha um cuidado adi
22. os de cadeia nica que formam uma estrutura de haste e ansa stem and loop A ansa cont m uma sequ ncia de amostras que complementar sequ ncia alvo e a haste formada pela liga o de sequ ncias de bra o complementares que se encontram localizadas de ambos os lados da sequ ncia de amostras Um fluor foro que fluoresce quando excitado por luz com o comprimento de onda apropriado ligado covalentemente extremidade de um bra o e um supressor que suprime a fluoresc ncia do fluor foro quando se encontra em grande proximidade f sica ligado covalentemente extremidade do outro bra o Os sinais moleculares n o entram em fluoresc ncia quando se encontram livres na solu o No entanto quando se hibridizam a uma cadeia de cido nucleico que cont m uma sequ ncia alvo s o submetidos a uma altera o conformacional que separa o fluor foro e o supressor fisicamente possibilitando lhes entrarem em fluoresc ncia em consequ ncia da excita o A quantidade de fluoresc ncia em qualquer ciclo ou a seguir ao ciclo depende da quantidade de produtos da amplifica o presentes nessa altura O sistema de PCR em Tempo Real SmartCycler monitoriza simultaneamente a fluoresc ncia emitida por cada sinal Precau es O kit destina se a ser utilizado apenas por profissionais de laborat rio Os procedimentos s o necess rios para manipula es n o aerossol de amostras As precau es normais e as directrizes institucionais d
23. pamentos necess rios mas n o fornecidos A Equipamento necess rio Sistema de PCR em Tempo Real SmartCycler incluindo o manual do utilizador o computador em anexo e o software Dx Diagnostic SmartCycler vers es 3 0 ou 1 7b Tubos de reac o SmartCycler Minicentr fuga adaptada aos tubos de reac o SmartCycler Prateleira de suporte em pl stico para tubos de reac o SmartCycler B Equipamento geralmente necess rio Microcentr fuga Agitador v rtice Micropipetas volumes necess rios 7 5 uL 20 uL Pontas de filtro de baixa reten o est reis Luvas descart veis sem p Solu o de descontamina o de DNA patenteada Caneta marcadora permanente Kit de isolamento de DNA ver em baixo Amostra A amostra para o ensaio MycAssay Aspergillus DNA gen mico total extra do de amostras cl nicas de LBA e de outras amostras das vias respirat rias inferiores Para este efeito recomenda se o seguinte kit de isolamento e equipamento que foi utilizado durante a valida o Kit de Extrac o de DNA F ngico MycXtraTM REF 080 005 disponibilizado pela Myconostica Vortex Genie 2 Scientific Industries Inc New York USA Placa de adapta o para v rtice REF 080 015 disponibilizado pela Myconostica Observa es metodol gicas Leia todo o protocolo antes de come ar O processo completo do MycAssay Aspergillus excluindo a extrac o de DNA demora aproximadamente 2 ho
24. ras dependendo do n mero de amostras analisadas A prepara o da an lise deve ser efectuada numa esta o de trabalho de PCR ou num laborat rio pr PCR Se n o houver uma esta o de trabalho de PCR dispon vel a an lise deve ser preparada numa rea espec fica do laborat rio separada de reas utilizadas para extrac o de DNA que seja regularmente limpa com reagentes de descontamina o de DNA No entanto evite utilizar reagentes de descontamina o de DNA durante a prepara o da PCR em tempo real uma vez que podem interferir com o ensaio Utilize micropipetas para transfer ncia de fluidos Para a prepara o destas reac es devem ser utilizadas micropipetas espec ficas que devem ser regularmente descontaminadas Recomenda se a utiliza o de pontas de filtro de baixa reten o para assegurar que nenhum DNA perdido durante a prepara o do procedimento Proceda com precau o ao manipular o Tubo 4 Este cont m material de controlo positivo de DNA e uma contamina o pode dar origem a resultados de an lise positivos falsos Use sempre luvas Todos os tubos de reagente devem ser tapados a seguir utiliza o e antes da sua elimina o Tenha o cuidado de identificar devidamente os tubos de reac o SmartCycler quando processar amostras de v rios doentes Tenha cuidado ao seleccionar o ficheiro de protocolo da execu o seleccione APENAS MycAssay Aspergillus Dx1 7b v1 3 ou MycAssay A
25. s ou Import um ensaio Estes s podem ser atribu dos pelo Administrator do equipamento 2 1 Software SmartCycler Dx Diagnostic vers o 1 7d 2 1 1 Abra o software SmartCycler Dx Diagnostic vers o 1 7b e introduza o seu nome de utilizador e a palavra passe 2 1 2 Insira o CD do protocolo MycAssay Aspergillus Myconostica e clique no separador Define Assays Definir ensaios 2 1 3 V para Retrieve Run s Extrair execu o es atrav s da directoria Tools Ferramentas na barra do menu superior e clique em Proceed Avan ar User Logs Setup Tools Help Data Management Tea i A Retrieve Run s Installation Qualification e E Control Trending Complete Restore System Monitoring Report compact Database Retrieve Run s This will retrieve the selected run s into the main database i Would you like to continue ec 2 1 4 Seleccione o ficheiro MycAssay Aspergillus Dx1 7bv1 3 DXA no CD ROM conforme apresentado abaixo Este ficheiro deve ser um entre dois reconhecidos pelo software 2 1 5 No pr ximo ecr seleccione o nome do ficheiro MycAssay Aspergillus Dx1 7b v1 3 e clique em OK e a seguir em Proceed Avan ar e OK 2 1 6 Feche o software Ao ser novamente aberto o ensaio Aspergillus Dx1 7b v1 3 estar dispon vel para uma utiliza o durante a cria o de uma nova execu o 030 116 Version 2 6 01MAR12 Portugu s 6 Para utiliza o diagn stica in vitro MycAssay Pne
26. so de centrifuga o diminui a propor o de inibidores que entram no sistema Portugu s 11 030 116 Vers o 2 6 01MAR12 MycAssay Pneumocystis Para utiliza o diagn stica in vitro Cepheid SmartCycler Amostras Respirat rias Resultados positivos falsos s o poss veis se o agente infectante for Penicillium spp que n o pode ser diferenciado de Aspergillus spp mediante a utiliza o deste kit Embora o procedimento de extrac o de DNA f ngico MycXtraTM tenha sido concebido para remover os inibidores da PCR nem todos os f rmacos ou popula es de doentes foram avaliados O procedimento n o foi totalmente avaliado em esputo nem em amostras induzidas com solu o salina ou amostras provenientes de crian as Podem ser obtidos resultados positivos falsos provenientes da contamina o externa da amostra ou da an lise original Essa contamina o pode surgir do ar contaminado com Aspergillus uma t cnica experimental fraca no que se refere ao controlo positivo ou contamina o externa especialmente pipetador com DNA de Aspergillus Uma vez que um resultado positivo verdadeiro pode ser obtido de doentes que estejam transitoriamente ou persistentemente colonizados com Aspergillus spp necess ria a avalia o cl nica na interpreta o dos resultados da an lise no contexto da doen a AUTORIZA O TopTaq Hot Start fornecido por QIAGEN QIAGEN uma marca comercial registada da Qiagen GmbH
27. spergillus vi 3 N O seleccione SERUM MycAssay Asp v1 13 vide por exemplo Mifflin T E 2003 Setting up a PCR Laboratory em PCR Primer 2 Ed eds Dieffenbach and Dveksler Cold Spring Harbour Laboratory Press Cold Spring Harbour NY EUA 030 116 Version 2 6 01MAR12 Portugu s 4 Para utiliza o diagn stica in vitro Amostras Respirat rias MycAssay Pneumocystis Cepheid SmartCycler Procedimento para a utiliza o 1 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8 1 9 Portugu s 5 Prepara o da PCR em tempo real Para come ar ligue o sistema de PCR em Tempo Real equipamento e computador associado Introduza os nomes de utilizador e as palavras passe conforme exigido Assegure se de que a rea de trabalho foi limpa com reagentes de descontamina o de DNA e deixe secar completamente evite utiliz los durante a prepara o do ensaio uma vez que o excesso de solu o de limpeza pode inibir as reac es de PCR Cada bolsa cont m um tubo de cada Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 e Tubo 4 Em cada bolsa existem reagentes suficientes para executar 8 reac es Devem ser realizadas pelo menos uma reac o com controlo positivo e uma reac o com controlo negativo por execu o em que os reagentes s o de um nico kit Por conseguinte uma bolsa pode analisar 6 amostras de doentes Se for necess rio analisar mais de 6 amostras pode utilizar se mais de uma bolsa se as bolsas utilizadas forem do mesm
28. spergilose pulmonar cr nica inclui aspergiloma aspergilose pulmonar cavit ria cr nica e aspergilose fibr tica cr nica A aspergilose invasiva Al ocorre em grupos de doentes em risco incluindo doentes tratados com corticoster ides e doentes com neutropenia ou disfun o fagocit ria i e doen a granulomatosa cr nica e infec o por HIV Cerca de 80 dos casos de aspergilose invasiva envolve os pulm es O diagn stico de rotina da aspergilose pulmonar invasiva inclui tomografia computorizada TAC broncoscopia e lavagem broncoalveolar microscopia e cultura an lises sangu neas de antig nios de Aspergillus ou exame histol gico de amostras de biopsia cir rgica Neste cen rio as culturas s o com frequ ncia falsamente negativas De facto a lavagem broncoalveolar s positiva por cultura em aproximadamente 40 dos casos mesmo quando o diagn stico provado por outros meios 4587 demonstrando a falta de sensibilidade da cultura na detec o da aspergilose invasiva e da aspergilose pulmonar cr nica As culturas s o no entanto importantes se forem positivas uma vez que muitos testes de diagn stico n o indicam o g nero ou a esp cie do fungo que causa a doen a ou o perfil de susceptibilidade do isolado que causa a infec o A aspergilose broncopulmonar complica a asma e a fibrose qu stica e pode raramente apresentar se sem doen as subjacentes A maioria dos casos est associada a A fumigatus com outros fungos
29. t Relat rio e Print Imprimir Resolu o de problemas 4 1 O controlo negativo gerou um sinal positivo no canal FAM gt 030 116 Version 2 6 01MAR12 Ocorreu contamina o durante a prepara o Os resultados de toda a execu o n o s o fi veis como sendo precisos Repita toda a execu o tendo muito cuidado ao adicionar os padr es em particular o controlo positivo Tubo 4 para assegurar que n o ocorre contamina o cruzada Certifique se de que a rea de trabalho e os instrumentos est o adequadamente descontaminados antes e depois de utilizar O controlo negativo foi posicionado incorrectamente no equipamento Tome cuidado para que os tubos de reac o fiquem colocados nos s tios espec ficos Portugu s 8 Para utiliza o diagn stica in vitro MycAssay Pneumocystis Amostras Respirat rias Cepheid SmartCycler 4 2 O valor Ct de IAC do controlo negativo n o se situa dentro do intervalo aceit vel gt A PCR foi inibida Certifique se de que a rea de trabalho e os instrumentos est o perfeitamente secos ap s a utiliza o de agentes de descontamina o antes da prepara o da PCR As condi es de conserva o do kit n o cumpriram as instru es na sec o Conserva o destas instru es de utiliza o ou o kit expirou Verifique se foram seguidas as condi es de conserva o correctas do kit Verifique o prazo de validade dos reagentes ver caixa do kit r tulo da b
30. tivo foi posicionado incorrectamente no equipamento Tome cuidado para que os tubos de reac o fiquem colocados nos s tios espec ficos Amostra s de doentes apresenta m Resultado 3 Inv lido gt prov vel que a s amostra s cl nica s extra da s contenha m inibidores da PCR Recomenda se que o DNA de amostras cl nicas seja extra do utilizando o kit de Extrac o de DNA F ngico MycXtra N o existem resultados para qualquer canal com amostras ou controlos gt As condi es de conserva o do kit n o cumpriram as instru es na sec o Conserva o destas instru es de utiliza o ou o kit expirou Verifique se foram seguidas as condi es de conserva o correctas do kit Verifique o prazo de validade dos reagentes ver caixa do kit r tulo da bolsa e repita com um kit dentro do prazo de validade se necess rio O equipamento utilizado n o funciona correctamente Verifique se o seu equipamento de PCR em tempo real tem o hist rico de manuten es actualizado e se foi totalmente calibrado conforme descrito no Guia de Instala o e Manuten o Foi utilizado um ficheiro de protocolo incorrecto durante a configura o do software Consulte a Sec o 2 e seleccione o ficheiro de protocolo correcto conforme especificado para cada tipo vers o de software do CD ROM do Protocolo Myconostica S pode ser carregado o ficheiro apropriado para o software Repita a execu o utilizando o ficheiro de
31. umocystis Amostras Respirat rias Cepheid SmartCycler 2 1 7 Clique no separador Create Run Criar execu o Introduza um Run Name Nome de execu o recomenda se que este inclua a data e as iniciais do operador como m nimo ou deixe um espa o se desejar que o software crie o nome automaticamente 2 1 8 Seleccione MycAssay Aspergillus Dx1 7b v1 3 como ensaio 2 1 9 Introduza o Lot Number N mero do lote e o Expiration Date Prazo de validade do kit conforme est impresso na caixa do kit e em cada bolsa O n mero do lote ter a forma de M XXXXXXXX 2 1 10 Introduza o Number of specimens na caixa e clique em Apply Aplicar A Sample ID de cada amostra ser automaticamente denominada SPEC pelo software Por isso d novo nome a cada centro adequadamente para efeitos de identifica o i e fa a duplo clique em SPEC para seleccionar e em seguida digite a ID da amostra O software incluir automaticamente um controlo positivo e um negativo na execu o da PCR em tempo real 2 1 11 Coloque os tubos de reac o cuidadosamente nos s tios espec ficos no bloco do SmartCycler e clique em Start Run Iniciar execu o N B Tenha cuidado em colocar os tubos de reac o nos s tios espec ficos uma vez que podem n o estar na mesma ordem da sua prepara o Fa a uma nota do nome da execu o e clique em OK A execu o iniciar se agora e surgir o luzes vermelhas por cima de cada s tio em utiliza o no bloco 2 1 12
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