Amplified MTD™
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1. 15 Repeti o do teste 2 cais ace la saias analisa 15 5 15 INTERPRETA O DO TESTE ssssscsssssssssssessssssessssssssvevessssssseeseauavecessssseeseavevevecesnaeas 17 APRESENTA O DOS RESULTADOS 17 A E 18 VALORES ESPERADOS wisissseccsssctsscsiscscscacsscssendetsvacstesssavscssccscetsasscuedsaacsvedsaceversizetesanss 19 COMPORTAMENTO FUNCIONAL 2 ccseseeceesseeeeeeeseeeenseneeeesseeeeeseneeeesseeeeeessneeenseaes 20 RESOLU O DE INCIDENTES c cscsssssssessssssssssssssssesssssssssessavevevecsesseesusvevenseneaeaeaeen 24 5 262. 27 TESTE AMPLIFIED A DETEC O DIRECTA DAS 1 AW 12601 601 Rev 001 PT MICOBACT RIAS DO COMPLEXO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS UTILIZA O Amplified MTD UTILIZA O O teste Hologic AMPLIFIED PARA A DETEC O DIRECTA DAS MICOBACT RIAS DO COMPLEXO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS MTD um teste que utiliza uma sonda de cido nucleico dirigida contra um alvo amplificado permitindo a detec o in vitro dos cidos nucleicos das micobact rias do complexo Mycobacterium tuberculosis Este teste efectua se a partir de amostras provenientes de expectora es induzidas ou expectoradas de colheitas coletas br nquicas lavagens bronco alveolares ou aspira es br nquicas ou de aspira es traqueais ADVERT NCIA A efic cia deste teste n o foi demonstrada para a detec o directa de ARNr de M tuberculosis a partir de outras amostras cl nicas sangue urina ou fezes por exemplo O comportamento funcional do teste MTD foi estudada apenas para as amostras tratadas com a t cnica descrita e conservadas respeitando o tempo e temperaturas especificadas nesta ficha t cnica As amostras que derem resultados positivos devem ser colocadas em cultura para determinar a presen a eventual de micobact rias at picas juntamente com as do complexo M tuberculosis permitindo efectuar testes de sensibilidade aos agentes anti micobacterianos Devem ser efectuadas culturas para a detec o de
3. EMBALAGEM DE REAGENTES PARA HIBRIDIZA O Composi o da embalagem 50 Test bioM rieux ref 39006 Hologic Cat No 301001F Reagente de Hibridiza o H 1x6ml ap s reconstitui o Tamp o de Hibridiza o HB 1x6ml Reagente de Selec o S 1x15ml Tubos de Lise LT 2 x 25 tubos Cartas de protec o folhas autocolantes 1 pacote B Material necess rio n o fornecido Micropipetas capazes de distribuir 25 ul 50 ul 100 ul 200 ul 300 ul e 450 ul Vortex gua est ril filtrada ou autoclavada Tubos de cultura Esferas de vidro est reis de 3 mm Tubos para microcentr fuga com tampas de enroscar Suporte para tubos reaccionais Pontas de pipeta com filtro 1 000 ul Testemunhos Positivos de Amplifica o por ex M tuberculosis ATCC 25177 ou ATCC 27294 Testemunhos Negativos de Amplifica o por ex M gordonae ATCC 14470 ou M terrae ATCC 15755 Lix via solu o de hipoclorito a 5 25 Folhas de protec o plastificadas para bancada Pipetas de repeti o TESTE AMPLIFIED PARA A DETEC O DIRECTA DAS 8 AW 12601 601 Rev 001 PT MICOBACT RIAS DO COMPLEXO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS Amplified MTD PROCEDIMENTO C Material suplementar disponivel no distribuidor Hologic Cat No Sonicador 901104 bioM rieux ref 39409 Blocos de aquecimento 105524 10554F 42 C 1 C 60 C 1 C 95 C 5C 105524J bioM rieux ref 39405 39406 39407 Lumin
4. o Se o teste for efectuado com al quotas de enzimas congeladas coloc las previamente TESTE AMPLIFIED PARA A DETEC O DIRECTA DAS 13 AW 12601 601 Rev 001 PT MICOBACT RIAS DO COMPLEXO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS PROCEDIMENTO Amplified MTD temperatura ambiente nao descongelar as aliquotas colocando as a uma alta temperatura Para homogeneizar as aliquotas descongeladas aspirar e rejeitar a solu o utilizando uma pipeta de repeti o antes de adicion la aos tubos de amplifica o 6 Transferir os tubos para um bloco de aquecimento ou banho maria a 42 1 C e deix los arrefecer durante 5 minutos N O DEIXAR OS TUBOS ATINGIREM A TEMPERATURA AMBIENTE NAO COBRIR O BANHO MARIA 7 uando os tubos estiverem a 42 C adicionar 25 ul de Reagente Enzim tico em cada tubo utilizando uma pipeta de repeti o Sacudir para misturar Incubar a 42 C durante 30 minutos mas n o mais de 60 minutos necess rio utilizar folhas autocolantes ou tampas durante esta etapa de incuba o NAO COBRIR O BANHO MARIA 8 Ap s o per odo de incuba o de 30 minutos os tubos cobertos podem ser conservados a 2 C 8 C durante 2 horas ou a 20 C at ao dia seguinte Se forem conservados a 20 C at ao dia seguinte os tubos devem ser totalmente descongelados temperatura ambiente ou no m ximo a 60 C antes da etapa de hibridiza o e devem ser de prefer ncia fechados com tampas e n o com folhas autocolantes H
5. Transferir 450 ul de solu o de tamp o fosfato NALC NaOH e 50 ul de dilui o de Controlo de Amplifica o para o tubo correspondente de lise de micobact rias LT identificado TESTE AMPLIFIED PARA A DETEC O DIRECTA DAS 12 AW 12601 601 Rev 001 PT MICOBACT RIAS DO COMPLEXO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS Amplified MTD PROCEDIMENTO 3 Se estiverem a ser usados Controlos de Amplifica o transferir 450 ul do recipiente do Controlo de Amplifica o para o correspondente tubo de lise de micobact rias LT identificado Amostras Transferir 450 ul de cada amostra descontaminada e homogeneizada do recipiente para o correspondente tubo de lise de micobact rias identificado LT Fechar os tubos de lise de Micobact rias LT ap s a adi o de cada amostra 4 Agitar durante 3 segundos em vortex Lise das amostras 1 2 Inserir os Tubos de Lise no suporte do sonicador de forma a que a mistura de reac o no fundo dos tubos fique imersa mantendo as tampas fora de gua Colocar o suporte no local OS TUBOS N O DEVEM EM CASO ALGUM TOCAR NO FUNDO OU NAS PAREDES DO SONICADOR Colocar o sonicador em funcionamento durante 15 minutos mas nunca mais de 20 minutos As amostras e testemunhos assim tratados com ultra sons designam se por lisados NAO UTILIZAR O Vortex PARA AGITAR OS LISADOS Amplifica o 1 Identificar os tubos de polipropileno para amplifica o 12 x 75 mm escrevendo no topo
6. VEIS RECOMENDA ES Controlo negativo de amplifica o elevado ou Controlo negativo de Processamento da amostra 2 20 000 RLU Controlo Positivo de Amplifica o Baixo ou Controlo Positivo de Processamento da Amostra lt 500 000 RLU Homogeneiza o insuficiente ap s adi o do Reagente de Selec o S ou volume insuficiente de Reagente de Selec o Amplifica o de contaminantes introduzidos por falta de precau o no decurso da prepara o das reac es Omiss o da etapa de arrefecimento de 5 minutos Contamina o do laborat rio ou dos reagentes Omiss o da limpeza dos tubos antes da leitura no lumin metro Desrespeito das temperaturas preconizadas na etapa de amplifica o Adi o do Reagente de Amplifica o deitando o l quido sobre as paredes do tubo e n o directamente no fundo Homogeneiza o insuficiente ap s adi o do Reagente de Hibridiza o reconstitu do Volume excessivo de Reagente de Selec o TESTE AMPLIFIED PARA A DETEC O DIRECTA DAS 24 MICOBACT RIAS DO COMPLEXO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS Voltar a homogeneizar correctamente Respeitar os volumes indicados Verificar o aparecimento de uma solu o de cor rosa uniforme ap s a agita o Deve ter se muito cuidado com a utiliza o das pipetas na distribui o dos reagentes Os tubos usados devem ser descontaminados com uma solu o de lix via a 1 10 como indica do no par gra
7. cnicos do laborat rio aos erros de identifica o das amostras e aos erros de transcri o dos resultados Um teste negativo n o exclui a presen a de uma micobact ria do complexo M tuberculosis na amostra TESTE AMPLIFIED PARA A DETEC O DIRECTA DAS 18 AW 12601 601 Rev 001 PT MICOBACT RIAS DO COMPLEXO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS Amplified MTD VALORES ESPERADOS VALORES ESPERADOS A Intervalo dos valores de controlo obtidos no decurso de ensaios cl nicos O intervalo dos valores obtidos para os controlos RLU no decurso dos ensaios cl nicos efectuados em 7 locais foi RLU N 704 Intervalo M dia e 556 245 to Testemunho Positivo de Amplifica o 2 000 000 gt 2 000 000 Testemunho Negativo de Amplifica o 904 to 18 754 3 041 B Intervalo dos valores obtidos para amostras cl nicas Para 127 amostras MTD positivas os valores estavam compreendidos entre 35 777 e gt 2 000 000 RLU Para 577 amostras MTD negativas os valores estavam compreendidos entre 573 e 19 176 RLU A distribui o dos resultados em RLU para todas estas amostras ap s resolu o das discord ncias encontra se aqui abaixo a resolu o das discord ncias baseia se na an lise de outras amostras positivas em cultura provenientes do mesmo paciente e ou com diagn stico final do m dico TESTE AMPLIFIED PARA A DETEC O DIRECTA DAS 19 AW 12601 601 Rev 001 PT MICOBACT RIAS DO COMPLEXO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS COMPORT
8. e uma especificidade m dia de 99 6 em rela o cultura O quadro abaixo d a sensibilidade especificidade valor predictivo positivo VPP e o valor predictivo negativo VPN com intervalos de confian a de 95 para as estimativas do comportamento funcional Todos os dados s o apresentados ap s resolu o das discord ncias baseada na exist ncia de outras amostras com cultura positiva provenientes do mesmo paciente e ou com diagn stico final do m dico Por paciente Percentagem N mero Intervalo de m dia Total confian a de 95 Sensibilidade 93 3 56 60 83 8 98 2 Especificidade 99 1 221 223 96 8 99 9 VPP 96 6 56 58 88 1 99 6 VPN 98 2 221 225 95 5 99 5 Por amostra Percentagem N mero Intervalo de m dia Total confian a de 95 Sensibilidade 90 6 125 138 84 4 94 9 Especificidade 99 6 564 566 98 7 100 VPP 98 4 125 127 94 4 99 8 VPN 97 7 564 577 96 2 98 8 TESTE AMPLIFIED PARA A DETEC O DIRECTA DAS 21 AW 12601 601 Rev 001 PT MICOBACT RIAS DO COMPLEXO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS COMPORTAMENTO FUNCIONAL Amplified MTD Das 564 amostras com cultura e MTD negativas para o complexo M tuberculosis 114 amostras continham micobact rias at picas detectadas em cultura 64 provinham de pacientes em que outras amostras permitiram isolar micobact rias at picas em cultura e 169 provinham de pacientes em que n o foi isolada nenhuma m
9. variabilidade das colheitas coleta aos erros t cnicos do TESTE AMPLIFIED PARA A DETEC O DIRECTA DAS 2 AW 12601 601 Rev 001 PT MICOBACT RIAS DO COMPLEXO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS Amplified MTD PRECAU ES DE UTILIZA O laborat rio aos erros de identifica o das amostras e aos erros de transcri o dos resultados D O teste destina se apenas detec o das micobact rias do complexo M tuberculosis a partir de amostras preparadas segundo os m todos NALC NaOH ou NaOH que s o recomendados pelos Centers for Disease Control CDC Este teste deve ser utilizado unicamente para amostras concentradas preparadas a partir de expectora es induzidas ou expectoradas de aspira es traqueais ou de colheitas coleta br nquicas lavagens bronco alveolares ou aspira es br nquicas Quando proceder suspens o da amostra na solu o de tamp o fosfato verificar se a concentra o de fosfato de 67 mM E Evitar qualquer contacto dos Reagentes de Detec o e II bioM rieux ref 39300 Cat No 201791 com a pele olhos ou mucosas Caso haja contacto lavar com gua Se estes reagentes forem entornados dilu los com gua antes de limpar F Ter as precau es habituais na realiza o deste teste A prepara o das amostras fluidificadas e descontaminadas bem como as etapas do teste MTD devem ser efectuadas respeitando as regras de seguran a microbiol gica do n vel 2 G Utilizar unicame
10. C Reprodutibilidade O estudo da reprodutibilidade foi efectuado com 25 amostras intercaladas com testemunhos de amplifica o negativos para um total de 50 amostras O painel de reprodutibilidade foi testado em quatro locais No total 100 120 120 das amostras negativas e 98 8 79 80 das amostras positivas deram os resultados esperados TESTE AMPLIFIED PARA A DETEC O DIRECTA DAS 22 AW 12601 601 Rev 001 PT MICOBACT RIAS DO COMPLEXO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS Amplified MTD COMPORTAMENTO FUNCIONAL D Especificidade analitica A especificidade do teste MTD foi avaliada com bact rias fungos e virus No caso das bact rias e dos fungos os testes de especificidade incluirem 160 estirpes cepas 151 esp cies provenientes de 62 g neros de micobact rias muito pr ximas de M tuberculosis outros microrganismos respons veis por doen as respirat rias e um painel filogen tico de microrganismos da flora comensal do aparelho respirat rio As estirpes cepas tipo eram culturas ATCC American Type Culture Collection e 5 estirpes cepas foram fornecidas por laborat rios de an lises Os lisados preparados a partir de culturas em crescimento activo ou de ARNr em tr s casos foram analisados seguindo o procedimento do teste MTD com cerca de 5 x 10 UFC por teste S as estirpes cepas do complexo M tuberculosis deram resultados positivos exceptuando as estirpes cepas M celatum e M tipo terrae Com concentra es
11. Chem 35 1588 1594 3 Bradley S T S L Reed and A Catanzaro 1996 Clinical Efficacy of the Amplified Mycobacterium Tuberculosis Direct Test for the Diagnosis of Pulmonary Tuberculosis Am J Respir Crit Care Med 153 1606 1610 4 Centers for Disease Control 1988 United States Morbid and Mortal Weekly Rep 37 377 382 387 388 5 Centers for Disease Control and Prevention and National Institute of Health May 1993 3rd Edition Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories pp 93 96 6 Collins F M 1989 Mycobacterial disease immunosuppression and acquired immunodeficiency syndrome Clin Microbiol Rev 2 360 377 7 Kent P T and G P Kubica 1985 Public Health Mycobacteriology A Guide for the Level Ill Laboratory U S Department of Public Health and Human Services Public Health Service Centers for Disease Control Atlanta GA 8 National Committee for Clinical Laboratory Standards Internal quality control Principles and definitions Approved Guideline NCCLS document C24 A Villanova PA NCCLS 1991 9 Pitchenik A E D Fertel and A B Block 1988 Mycobacterial Disease Epidemiology Diagnosis Treatment and Prevention Clin Chest Med 9 425 441 10 Roberts G D E W Koneman and Y K Kim 1991 Mycobacterium pp 304 339 In A Balows et al eds Manual of Clinical Microbiology American Society for Microbiology Washington D C 11 Simone P M and Iseman M D 1992 Drug resistant Tuber
12. Colocar 3 a 5 esferas de vidro de 3 mm num tubo de cultura limpo b Adicionar 1 a 2 ml de gua est ril Adicionar o conte do de v rias ansas 1 ul de cultura apropriada Fechar o tubo e agitar v rias vezes a uma grande velocidade utilizando um Vortex c Deixar repousar durante 15 minutos d Transferir o sobrenadante para um tubo de cultura limpo Ajustar a turbidez a 1 McFarland utilizando um nefel metro e Diluir a 1 100 a suspens o colocando 100 ul da suspens o a 1 McFarland em 10 ml de gua est ril Fechar e agitar em vortex Esta a primeira dilui o f Diluir uma segunda vez a 1 100 colocando 100 ul da dilui o 1 10 ml gua est ril Fechar e agitar em vortex Esta a segunda dilui o Esta dilui o deve conter aproximadamente 25 150 CFU por 50 ul Aliquotar e Conservar os Controlos a As dilui es devem ser distribu das em al quotas 500 ul em micro tubos de centr fuga de 1 5 ml limpos com tampas de rosca As al quotas destinam se a uma nica utiliza o e podem ser conservadas a 20 C durante 6 meses ou a 70 C durante 1 ano N o utilizar congelador com descongela o autom tica A utiliza o do controlo positivo para M tuberculosis servir para monitorizar apenas a falha substancial do reagente O controlo positivo foi concebido para verificar se houve excesso de NaOH e de tamp o fosfato nos reagentes utilizados durante o procedimento As varia es dos proce
13. MTD NOTAS A Os blocos de aquecimento devem conter po os previstos para tubos de 12 x 75 mm Aconselha se a utiliza o dos blocos de aquecimento B Para a conserva o das al quotas congeladas recomenda se a utiliza o de tubos de microcentr fuga com tampa As al quotas congeladas individualmente podem ser descongeladas apenas uma vez N o devem ser usados congeladores com descongela o autom tica C Recomenda se a utiliza o de frascos de congela o de 5 ml para a conserva o das al quotas congeladas As al quotas congeladas individualmente podem ser descongeladas apenas uma vez N o devem ser usa dos congeladores com descongela o autom tica D As performances dos Vortex podem variar consoante o material utilizado podendo por isso ser necess rio adaptar o tempo de agita o Regular a velocidade do aparelho e seguir as instru es do PROCEDIMENTO par grafo E para deixar a mistura de reac o atingir a metade superior da parede do tubo indispens vel uma boa homogeneiza o para obter resultados precisos O tempo de agita o pode ir at 15 segundos sem afectar os resultados TESTE AMPLIFIED PARA A DETEC O DIRECTA DAS 26 AW 12601 601 Rev 001 PT MICOBACT RIAS DO COMPLEXO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS Amplified MTD BIBLIOGRAFIA BIBLIOGRAFIA 2 Arnold L J P W Hammond W A Wiese and N C Nelson 1989 Assay formats involving acridinuim ester labeled DNA probes Clin
14. a mistura entrar em contacto com as folhas autocolantes ou com as tampas Quando a homogeneiza o estiver correctamente efectuada a mistura deve ter uma cor amarela uniforme 3 Incubar a 60 C durante 15 minutos mas n o mais de 20 minutos num bloco de aquecimento ou em banho maria TESTE AMPLIFIED PARA A DETEC O DIRECTA DAS 14 AW 12601 601 Rev 001 PT MICOBACT RIAS DO COMPLEXO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS Amplified MTD PROCEDIMENTO Selec o 1 Deteccao 1 O Reagente de Selec o S deve estar temperatura ambiente antes de come ar o teste Retirar os tubos do banho maria ou do bloco de aquecimento a 60 C e adicionar 300 ul de Reagente de Selec o S com uma pipeta de repeti o Cobrir os tubos com folhas autocolantes ou com tampas Agitar num Vortex a uma velocidade m dia 3 vezes durante pelo menos 1 segundo Para uma boa homogeneiza o dos tubos de reac o mant los na posi o vertical e deixar a mistura atingir a metade superior da parede do tubo durante a agita o para evitar qualquer contamina o n o deixar a mistura entrar em contacto com as folhas autocolantes ou com as tampas Quando a homogeneiza o estiver correcta mente efectuada a mistura deve ter uma cor rosa uniforme Incubar a 60 C durante 15 minutos mas n o mais de 16 minutos num bloco de aquecimento ou num banho maria Retirar os tubos do banho maria ou do bloco de aquecimento Deixar os tubos atingirem a
15. os n meros correspondentes aos n meros de identifica o dos Tubos de Lise Identificar igualmente os tubos de amplifica o para os testemunhos de amplifica o positivo e negativo Introduzir 50 ul de Reagente de Amplifica o reconstitu do no fundo de cada tubo utilizando uma pipeta repetitiva Adicionar 200 ul de leo para reac o de amplifica o O em cada tubo utilizando uma pipeta de repeti o N O UTILIZAR O VORTEX PARA OS LISADOS Transferir 25 ul de cada lisado para o fundo do tubo de amplifica o correspondente utilizando uma nova ponta com filtro para cada transfer ncia Os lisados que sobrarem podem ser conservados a 2 C 8 C durante 7 dias ou congelados a uma temperatura igual ou inferior a 20 C durante 1 m s N o utilizar congelador com descongela o autom tica Se for necess rio efectuar outros testes com os lisados deix los atingir previamente a temperatura ambiente N O UTILIZAR O VORTEX PARA OS LISADOS Incubar os tubos num bloco de aquecimento a 95 C durante 15 minutos mas n o mais de 20 minutos Preparar a Solu o Enzim tica adicionando 1 5 ml de Tamp o de Dilui o Enzim tica EDB ao Reagente Enzim tico liofilizado E Rodar para misturar N o agitar num Vortex O Reagente Enzim tico reconstitu do utiliz vel durante um m s a 2 C 8 C ou durante dois meses a uma temperatura igual ou inferior a 20 C se for distribu do em al quotas e congelado no dia da reconstitui
16. A do complexo de Mycobacterium tuberculosis Cultura de AFB em crescimento As amostras podem n o conter M tuberculosis o resultado pode ser falso negativo devido a baixos n meros de M tuberculosis na presen a ou aus ncia de MOTT ou o resultado pode ser falso negativo devido a interfer ncia de inibidores da amostra recomendado testar uma nova amostra do paciente se clinicamente houver forte suspeita de tuberculose ou se houver suspeita de inibi o LIMITES Este teste destina se apenas detec o das micobact rias do complexo M tuberculosis a partir de amostras preparadas segundo os procedimentos NALC NaOH ou NaOH recomendados pelo CDC Este teste s pode ser efectuado com amostras preparadas a partir de expectora es induzidas ou expectoradas de colheitas coletas br nquicas lavagens bronco alveolares ou aspira es br nquicas ou de aspira es traqueais O teste MTD espec fico das micobact rias do complexo M tuberculosis ou seja M tuberculosis M bovis M bovis BCG M africanum M microti e M canetti mas n o as diferencia entre si celatum e tipoterrae podem provocar reac es cruzadas se estiverem presentes em concentra es superiores a 30 UFC por teste No entanto M celatum e M tipo terrae s o raramente isoladas em cl nica A qualidade dos resultados do teste est ligada qualidade da colheita coleta e ao seu transporte variabilidade das colheitas coletas aos erros t
17. AMENTO FUNCIONAL Amplified MTD Quadros dos resultados obtidos a partir de amostras Provenientes de pacientes nao tratados 7 locals N 704 80 4 BH Cultura NEG E Cultura POS 60 7 Numero de amostras 40 7 20 7 lt 7 500 7 500 20K 30K 100K 500K 21M a a a a a 19 999 29 999 99 999 499 999 999 999 R sultados da cultura M tuberculosis NEG 554 19 0 M tuberculosis POS 13 0 0 1 0 0 1 4 7 6 108 COMPORTAMENTO FUNCIONAL A Avalia o cl nica O comportamento funcional do teste MTD na sua forma original foram avaliadas no decurso de ensaios cl nicos efectuados em seis laborat rios comparando os resultados obtidos por exame de esfrega os com os resultados da cultura em 6 079 amostras provenientes de 2 609 pacientes Entre estas 4 000 amostras provinham de 1 898 pacientes que n o receberam tratamento anti tuberculose Os seis locais representavam zonas geogr ficas diferentes cinco hospitais de grandes cidades americanas com um servi o especializado para a tuberculose e um laborat rio p blico O comportamento funcional do teste MTD na sua forma actual foram avaliadas em sete locais comparando os resultados do teste MTD com os resultados da cultura Os sete hospitais que participaram no teste representavam zonas geogr ficas diferentes seis hospitais de grandes cidades americanas com um servi o especializado para a tuberculose e um laborat rio p blico nacional de mi
18. HOLOGIC Amplified MTD TESTE AMPLIFIED PARA A DETECGAO DIRECTA DAS MICOBACTERIAS DO COMPLEXO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS Embalagem de 50 testes bioM rieux ref 39006 Hologic Cat No 301001F 2 OAE E E E SE a 2 ADVERT NCIA 2 PRECAU ES DE UTILIZA O ca sscsisssccssiasinenscniannassvsssecisiasnesnsecinesidasennnstdsasousdbisonen 2 INTRODU O eae 4 PRINCIPIO 5 REAGENTES Embalagem de 50 nan 5 CONSE AV ACA oases cessed atecutesscensteareerensants Si 6 COLHEITA COLETA CONSERVAGAO TRANSPORTE E TRATAMENTO DAS 7 Colheita coleta e conserva o da amostra 7 Transporte sssspenassorserisssanesissiaaaicsiseaicosa asseio siiasodantrssudaiseioidia devassa 7 Tratamento descontamina o e concentra o 7 Conserva o das amostras 7 MATERIAL ios cas cede ceo ccescecdedcny dususetccscede ex dxcesccceiede vx lisess co alone ssa cas dedesibeceeeeesend
19. OCEDIMENTO e NOTAS para evitar a contamina o do laborat rio com amplicons M NUNCA usar novamente as folhas autocolantes e as tampas utilizadas durante uma etapa anterior As tampas devem ser eliminadas num recipiente apropriado imediatamente ap s t las retirado para evitar qualquer contamina o cruzada As folhas autocolantes devem ser aplicadas firmemente no cimo dos tubos reaccionais TESTE AMPLIFIED PARA A DETEC O DIRECTA DAS 3 AW 12601 601 Rev 001 PT MICOBACT RIAS DO COMPLEXO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS INTRODU O Amplified MTD N N o cobrir o banho maria durante as incuba es especialmente se as tampas forem utilizadas a condensa o na tampa pode ser uma fonte de contamina o O necess rio efectuar uma boa homogeneiza o em Vortex depois da adi o do Reagentes de Selec o para obter resultados precisos P recomendado utilizar uma rea separada para a etapa de Ensaio de Protec o de Hibridiza o HPA Hybridization Protection Assay para minimizar a contamina o por amplicons no ensaio Esta rea deve estar separada da rea onde efectuada a prepara o da amostra a prepara o do reagente e a amplifica o Q Para evitar que as reas do laborat rio figuem contaminadas por amplicons o laborat rio deve estar organizado de uma forma uni direccional de trabalho Por exemplo efectuar em primeiro lugar a prepara o da amostra e do reagente numa rea em seguida
20. a amplifica o noutra e por ltimo o HPA noutra rea As amostras equipamento e reagentes n o devem voltar para a rea onde foi efectuada uma etapa anterior Al m disso o pessoal de laborat rio n o deve voltar para uma rea de trabalho anterior sem ter as devidas precau es de anti contamina o E vivamente recomendado que a rea de seguran a biol gica usada para o processamento da amostra n o seja usada para efectuar o teste MTD INTRODU O O teste MTD utiliza os m todos TMA Transcription Mediated Amplification e HPA Hybridization Protection Assay para detectar qualitativamente o ARN riboss mico ARNr das micobact rias do complexo M tuberculosis O teste MTD detecta o ARN dos organismos cultiv veis e n o cultiv veis O complexo M tuberculosis constitu do pelas sub esp cies M tuberculosis M bovis M bovis BCG M africanum M microti e M 13 O teste MTD detecta todos os microrganismos do complexo M tuberculosis No entanto M microti infecta apenas os animais M bovis raramente se transmite dos animais para o homem M africanum respons vel pela tuberculose pulmonar na Africa M tuberculosis longe o mais comum sendo respons vel por uma morbidez significativa no mundo inteiro O CDC relatou recentemente um aumento dos casos de tuberculose nos pacientes atingidos com SIDA e nos imigrantes e um aumento da transmiss o da doen a nas popula es de alto
21. bacilos cido lcool resistentes BAAR para precisar que tipo de sub esp cie do complexo M tuberculosis est presente M bovis por exemplo No decurso de ensaios cl nicos foram submetidas ao teste amostras provenientes de crian as de pacientes VIH positivos e de pacientes infectados com micobact rias at picas No entanto o n mero destes ensaios n o permitiu comparar estatisticamente o comportamento funcional do teste para estes diferentes grupos O comportamento funcional do teste em amostras provenientes de pacientes sob tratamento anti tuberculose no intuito de efectuar um seguimento terap utico ou de confirmar uma cura n o foi avaliada As amostras com muito sangue n o devem ser analisadas com o dispositivo MTD PRECAU ES DE UTILIZA O A Somente para uso em diagn stico in vitro O teste MTD espec fico para as micobact rias do complexo M tuberculosis ou seja M tuberculosis M bovis M bovis BCG M africanum M microti e M canetti 13 mas n o as diferencia M celatum e M tipo terrae podem provocar reac es cruzadas se estiverem presentes concentra es superiores a 30 UFC Unidades Formadoras de Col nias por teste No entanto M celatum e M tipo terrae s o raramente isoladas em cl nica C Um resultado negativo n o exclui a presen a de uma micobact ria do complexo M tuberculosis na amostra A qualidade dos resultados est ligada qualidade da colheita e do seu transporte
22. cobacteriologia As amostras analisadas eram provenientes de pacientes que n o receberam tratamento anti tuberculose 132 deram resultados positivos na cultura para as micobact rias do complexo M tuberculosis MTD detectou 119 destas amostras cultura positivas 7 amostras continham micobact rias n o tuberculosas para al m das M tuberculosis TESTE AMPLIFIED PARA A DETEC O DIRECTA DAS 20 AW 12601 601 Rev 001 PT MICOBACT RIAS DO COMPLEXO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS Amplified MTD COMPORTAMENTO FUNCIONAL AMOSTRAS PROVENIENTES DE PACIENTES NAO TRATADOS Compara o MTD cultura N 704 POR PACIENTE antes da resolu o das discord ncias Cultura MTD 54 4 MTD 4 221 POR AMOSTRA antes da resolu o das discord ncias Cultura MTD 119 8 MTD 13 564 POR PACIENTE ap s resolu o das discord ncias Cultura MTD 56 2 MTD 4 221 POR PACIENTE ap s resolu o das discord ncias Cultura MTD 125 2 MTD 13 564 Foram incluidos neste estudo pacientes suspeitos de terem uma tuberculose pulmonar activa e nao estando sob tratamento A preval ncia total dos pacientes que tiveram uma cultura positiva para M tuberculosis foi de 20 5 Foram determinadas por paciente uma sensibilidade m dia de 93 3 e uma especificidade m dia de 99 1 em rela o a cultura Foram determinadas por amostra uma sensibilidade m dia de 90 6
23. culosis A Deadly and Growing Danger J Resp Dis 13 960 971 12 Wayne L G 1982 Microbiology of the tubercle bacilli Am Rev Respir Dis 125 3 pt 2 31 41 13 Van Soolingen D et al 1997 A novel pathogenic taxon of the Mycobacterium tuberculosis complex canetti characterization of an exceptional isolate from Africa Intl J Syst Bacteriol 47 1236 1245 14 Kerleguer A Koeck J L Fabre M G r me P Teyssou R Herv V 2002 Application of a Grey Zone for the Interpretation of The Amplified Mycobacterium Tuberculosis Direct Test for the Rapid Diagnosis of Respiratory Tuberculosis Esm May 2002 15 Coll P Garrig M Moreno C Marti N 2002 Routine Use of E MTD Hologic For Direct Detection of Mycobacterium Tuberculosis in Clinical Samples Esm 2002 TESTE AMPLIFIED PARA A DETEC O DIRECTA DAS 27 AW 12601 601 Rev 001 PT Thoracic Society Medical Section of the American Lung Association 1983 Levels of laboratory services for mycobacterial diseases Am Rev Respir Dis 128 213 MICOBACTERIAS DO COMPLEXO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS Amplified MTD 0 Hologic Inc 10210 Genetic Center Drive San Diego CA 92121 USA Apoio ao Cliente 1 844 Hologic 1 844 465 6442 customersupport hologic com Suporte t cnico 1 888 484 4747 molecularsupport hologic com Para obter mais informa es sobre contactos aceda a www hologic com Hologic e Amplified MTD s o marcas comerciais e ou
24. dimentos no tempo ou nas temperaturas que podem afectar a efici ncia da amplifica o ou a exactid o do tempo seleccionado podem n o ser detectadas utilizando os controlos recomendados Os controlos adicionais podem ser testados em conformidade com as directivas ou recomenda es especiais Controlo de inibi o das amostras Quando o teste MTD for negativo mas o diagn stico do m dico for favor vel a uma tuberculose poss vel verificar se a amostra cont m um inibidor procedendo da forma seguinte a Colocar 50 ul de Tamp o de Dilui o das amostras em 2 tubos de lise das micobact rias identificado com testemunho e sem testemunho b Introduzir 50 ul de Testemunho Positivo de Amplifica o e 450 ul de amostra num tubo com testemunho Adicionar 450 ul de amostra num segundo tubo sem testemunho Efectuar o teste seguindo o protocolo habitual TESTE AMPLIFIED PARA A DETEC O DIRECTA DAS 10 AW 12601 601 Rev 001 PT MICOBACT RIAS DO COMPLEXO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS Amplified MTD PROCEDIMENTO Interpreta o Se o numero RLU Relative Light Units obtido no lumin metro com tubo com testemunho for gt 30 000 RLU a amostra n o cont m inibidor de amplifica o e aparentemente n o cont m alvo a amplificar Se o n mero de RLU obtido com o tubo com testemunho for lt 30 000 RLU a amostra cont m um inibidor de amplifica o e uma outra amostra deve ser analisada Se o teste repetido do tubo sem t
25. do par grafo PROCEDIMENTO Prepara o do material Se se suspeitar de uma contamina o do banho maria proceder do mesmo modo que o acima descrito com 25 ul de gua do banho maria na condi o de esta n o conter nenhum produto anti s ptico Prepara o do material 1 A gua dever ser desgaseificada para optimizar a transfer ncia de energia dos ultra sons a Encher o reservat rio do sonicador com gua da torneira temperatura ambiente at cerca de 1 cm do bordo TESTE AMPLIFIED PARA A DETEC O DIRECTA DAS 11 AW 12601 601 Rev 001 PT MICOBACT RIAS DO COMPLEXO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS PROCEDIMENTO Amplified MTD b Para desgaseificar inteiramente a agua colocar o sonicador em funcionamento durante 15 minutos antes do in cio dos testes 2 Regular um bloco de aquecimento a 95 5C um outro bloco de aquecimento ou um banho maria a 60 1 C e ainda outro bloco de aquecimento ou um banho maria a 42 1 3 Limpar as superf cies de trabalho material e pipetas com uma dilui o 1 2 de lixivia antes de come ar a an lise Deixar a lix via actuar durante pelo menos 15 minutos Lavar com gua a superf cie de trabalho para eliminar os tra os de lix via Cobrir a superf cie na qual o teste ser efectuado com uma folha de protec o plastificada para bancada 4 Preparar o lumin metro Leader Certificar se de que h uma quantidade suficiente de Reagentes de Detec o e Il para efect
26. do reservado quando um teste inicial equ voco Um resultado repetido do lisado gt 30 000 considerado positivo A Controlo de qualidade e valida o de resultados Os controlos devem dar os seguintes valores e Controlo negativo de amplifica o lt 20 000 RLU e Controlo positivo de amplifica o gt 500 000 RLU e Testemunho negativo lt 20 000 RLU e Testemunho positivo 2 1 000 000 RLU Os resultados dos testes dos pacientes n o devem ser fornecidos se os valores do controlo de teste MTD n o estiverem dentro destes crit rios Consultar a tabela de RESOLU O DE INCIDENTES para informa es complementares Cada laborat rio deve determinar os valores alvo para cada controlo em fun o dos resultados obtidos para cada s rie de controlos B Resultados de Testes de Pacientes Se os valores dos controlos n o estiverem dentro dos valores esperados os resultados das amostras de testes de pacientes n o devem ser validados Resultados e gt 500 000 RLU positivo para o ARNr do complexo M tuberculosis e lt 30 000 RLU negativo para o ARNr do complexo M tuberculosis e 30 000 a 499 999 RLU prov vel rRNA positivo do complexo de M tuberculosis repetir para verificar os resultados Repetir gt 30 000 RLU positivo para o complexo rRNA para M tuberculosis Repetir lt 30 000 RLU negativo para o complexo rRNA para M tuberculosis APRESENTA O DOS RESULTADOS Os resultados do teste MTD devem ser interpretados em conjun
27. ensiecesess 7 PROCEDIMENT Ove ea a E A E E A 9 CON isesi ararnar eusa tht ecte stele nae eeiv eed asasnya veniou 9 Prepara o do 11 Prepara o do 2 12 Prepara o das 12 Lise das 13 Amplifica o 13 14 15
28. ente leo de amplifica o leo para reac o de amplifica o O 1 10 leo de silicone Reagente Enzim tico E 1x1 5ml Transcriptase inversa e ARN polimerase liofilizadas numa solu o ap s ap s reconstitui o reconstitui o tamp o HEPES contendo lt 10 de agente espessante e 2 15 mM de N Acetil L Cisteina Tamp o de Dilui o Enzim tica tamp o de dilui o das enzimas 1x1 5 ml EDB Solu o tamp o Tris contendo um surfactante e glicerol TESTE AMPLIFIED PARA A DETEC O DIRECTA DAS 5 AW 12601 601 Rev 001 PT MICOBACT RIAS DO COMPLEXO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS CONSERVA O Amplified MTD EMBALAGEM DE REAGENTES PARA A HIBRIDIZA O Nome do reagente Volume Reagente de Hibridiza o H 1x6ml lt 100 ng frasco de sonda ADN n o infecciosa conjugada com um ap s reconstitui o marcador quimioluminescente liofilizado numa solu o tamp o succinato contendo um agente espessante e um detergente Tamp o de Hibridiza o HB 1x6ml Solu o tamp o succinato contendo lt 4 de detergente Reagente de Selec o S 1x15ml Solu o tamp o borato contendo um surfactante Tubos de Lise LT 2 x 25 tubos Esferas de vidro agente espessante CONSERVA O A As solu es ou os componentes n o reconstitu dos seguintes devem ser conservados a 2 C 8 C e s o utiliz veis at data de validade indicada e Tamp o de Dilui o das Amostras SDB e Reagente de Amplif
29. estemunho for positivo o resultado do teste MTD pode considerar se positivo A explica o mais plaus vel para este tipo de resultado a variabilidade ligada amostragem a primeira amostra n o continha alvo a amplificar enquanto a segunda o continha O n mero de RLU do tubo em testemunho pode ser positivo ou negativo dependendo da amostra conter ou n o ARNr de micobact ria pertencente ao complexo M tuberculosis 3 Controlo da contamina o do laborat rio Para controlar se o laborat rio foi contaminado pelos amplicons de M tuberculosis proceder como segue a Colocar 1 ml de gua est ril num tubo limpo Humidificar uma zaragatoa swab est ril de poliester ou dacron com gua est ril b Esfregar a zaragatoa swab na bancada ou no material a controlar c Colocar a zaragatoa swab no tubo e misturar suavemente Retirar a zaragatoa swab espremendo a na parede do tubo Eliminar a zaragatoa swab num recipiente contendo uma solu o de lix via dilu da a 1 2 metade de lix via metade de gua d Distribuir 25 ul da solu o obtida num tubo de amplifica o contendo 50 ul de Reagente de Amplifica o e 200 ul de leo para reac o de amplifica o e Seguir as instru es do par grafo PROCEDIMENTO para a amplifica o e a detec o Interpreta o Se os resultados forem gt 30 000 RLU a superf cie analisada est contaminada e deve ser descontaminada com seguindo as instru es
30. fo PROCEDIMENTO As bancadas blocos de aquecimento banhos maria e pipetas devem ser descontaminados com uma solu o de lix via dilu da a 1 2 como indicado no par grafo PROCEDIMENTO Os tubos devem limpar se com papel absorvente h mido que n o se desfa a antes da leitura no lumin metro Verificar a temperatura do banho maria e ou do bloco de aquecimento e ajust la se necess rio para respeitar as temperaturas preconizadas Agitar cuidadosamente num Vortex como especificado consultar o par grafo Hibridiza o 2 Verificar a for ma o de uma solu o de cor amarela uniforme ap s a agita o Verificar a regula o do volume na pipeta AW 12601 601 Rev 001 PT Amplified MTD RESOLU O DE INCIDENTES OBSERVA O CAUSAS POSS VEIS RECOMENDA ES Desrespeito do tempo preconiza Respeitar os 15 minutos de incuba o a 60 do para a etapa de selec o C no decurso da etapa de Selec o A temperatura dos tubos desceu a Transferir directamente os tubos do bloco de menos de 42 C ap s a incuba o aquecimento a 95 C para banho maria bloco 95 de aquecimento 42 Os tubos de passagem do Lavar os tubos com gua quente como Reagente de Detec o est o indicado no manual de utiliza o do aparelho entupidos TESTE AMPLIFIED PARA A DETEC O DIRECTA DAS 25 AW 12601 601 Rev 001 PT MICOBACT RIAS DO COMPLEXO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS NOTAS Amplified
31. ibridiza o 1 Reconstituir o Reagente de Hibridiza o liofilizado H com 6 ml de Tamp o Hibridiza o HB O Reagente de Hibridiza o H e o Tamp o de Hibridiza o HB devem estar temperatura ambiente antes da reconstitui o Se o Tamp o de Hibridiza o HB foi guardado no frigor fico aquec lo a 60 C rodando o lentamente para assegurar que todos os componentes se dissolvem Agitar num Vortex at que a solu o fique clara o que pode demorar cerca de um minuto para assegurar que todos os componentes est o dissolvidos O Reagente de Hibridiza o reconstitu do utiliz vel durante um m s a 2 C 8 C ou durante dois meses a uma temperatura igual ou inferior a 20 C se tiver sido distribu do em al quotas e congelado no dia da reconstitui o Se o Reagente de Hibridiza o reconstitu do foi guardado no frigor fico ou congelado aquec lo a 60 C rodando o ligeiramente para assegurar que todos os componentes se dissolvem 2 Adicionar 100 ul de Reagente de Hibridiza o reconstitu do em cada tubo com uma pipeta de repeti o Cobrir os tubos com folhas autocolantes ou com tampas os tubos com um Vortex a uma velocidade m dia 3 vezes durante pelos menos 1 segundo Para uma boa homogeneiza o dos tubos de reac o mant los na posi o vertical e deixar a mistura atingir a metade superior da parede do tubo durante a agita o para evitar qualquer contamina o n o deixar
32. ica o A e Tamp o de Amplifica o AB e Reagente Enzim tico E e Tamp o de Dilui o Enzim tica EDB e Reagente de Hibridiza o H O Reagente de Amplifica o reconstitu do A utiliz vel durante 2 meses e conserva se a 2 8 C O Reagente de Hibridiza o e o Reagente Enzim tico E s o utiliz veis um m s a 2 C 8 C ap s reconstitui o ou dois meses a uma temperatura igual ou inferior a 20 C se forem distribu dos em al quotas e congelados no dia da reconstitui o As al quotas congeladas devem ser utilizadas no pr prio dia da descongela o N o utilizar congelador com descongela o autom tica Os componentes que se seguem devem ser conservados entre 2 25 e s o utiliz veis at data de validade indicada e Reagente leo de amplifica o O e Tamp o de Hibridiza o HB e Reagente de Selec o S e Tubos de Lise LT TESTE AMPLIFIED PARA A DETEC O DIRECTA DAS 6 AW 12601 601 Rev 001 PT MICOBACT RIAS DO COMPLEXO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS Amplified MTD COLHEITA COLETA CONSERVAGAO TRANSPORTE E TRATAMENTO DAS AMOSTRAS COLHEITA COLETA CONSERVA O TRANSPORTE E TRATAMENTO DAS AMOSTRAS Colheita coleta e conserva o da amostra As amostras devem ser colocadas em recipientes de pl stico est reis e conservadas a 2 C 8 C antes do seu transporte e tratamento No decurso dos ensaios cl nicos as amostras foram conservadas menos de 4 dia
33. icobact ria em cultura B Precis o Foram analisados em tr s locais dois pain is de amostras consistindo em 2 amostras negativas 2 amostras fracamente positivas 100 UFC teste e 2 amostras moderadamente positivas 1000 UFC teste As amostras positivas foram preparadas adicionando quantidades conhecidas de M tuberculosis a um pool de amostras moderadamente inibidor Tanto as amostras como os testemunhos de amplifica o positivo e negativo foram testados em triplicado duas vezes por dia durante 3 dias em tr s locais N o houve variabilidade significativa de resultados de um local para outro ou de um dia para outro e assim os resultados dos tr s locais puderam ser consolidados e apresentam se aqui abaixo Os valores de leitura medidos em RLU est o limitados pela resolu o do tubo fotomultiplicador do lumin metro Por esta raz o os valores superiores a 2 000 000 RLU foram truncados Nem os desvios padr o nem os coeficientes de varia o s o indicados Precis o N mero de de Intervalo M dia observa es resultados RLU RLU correctos Amostras 1 108 100 154 103 gt 2 000 000 gt 2 000 000 Positivas fortes Amostras 108 99 1 16 324 gt 2 000 000 gt 2 000 000 Positivas fracas Amostras 3 108 100 2 004 5 693 2 689 Negativas Testemunho 54 100 gt 2 000 000 gt 2 000 000 Testemunho 54 100 2 272 4 241 2 944 negativo Observou se um resultado negativo
34. ifica o TESTE AMPLIFIED PARA A DETEC O DIRECTA DAS 15 AW 12601 601 Rev 001 PT MICOBACT RIAS DO COMPLEXO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS NOTAS Amplified MTD NOTAS A Reagentes 1 O Reagente Enzim tico n o deve permanecer a temperatura ambiente mais de 15 minutos ap s a reconstitui o 2 O Tamp o de Hibridiza o HB pode precipitar Aquecer e agitar o Tamp o de Hibridiza o HB ou o Reagente de Hibridiza o reconstitu do a 60 C para dissolver o precipitado B Temperatura 1 A amplifica o a hibridiza o e a selec o s o reac es termo dependentes consequentemente imperativo manter o banho maria ou o bloco de aquecimento as temperaturas preconizadas 2 Antes de adicionar o Reagente Enzim tico deixar arrefecer os tubos a 42 C durante 5 minutos Esta temperatura permite obter um comportamento funcional ptimo de amplifica o 3 fundamental respeitar a temperatura para a fase amplifica o 42 1 C C Tempo imperativo respeitar os tempos indicados no par grafo PROCEDIMENTO D Banho maria 1 O n vel de gua no banho maria deve manter se de forma a que a mistura de reagentes no fundo dos tubos esteja imersa mas que a gua n o penetre nos tubos 2 Durante a fase de amplifica o o banho maria n o deve ser coberto para evitar que haja condensa o sobre ou dentro dos tubos E Agita o utilizando um Vortex importante dispor de uma mis
35. marcas registadas da Hologic Inc e ou respectivas subsidi rias nos EUA e ou em outros pa ses Quaisquer outras marcas comerciais que possam aparecer neste folheto informativo pertencem aos respectivos propriet rios REP Authorized Representative EMERGO EUROPE Molenstraat 15 2513 BH The Hague The Netherlands AW 12601 601 Rev 001 PT 1995 2015 Hologic Inc Todos os direitos reservados 2015 03 TESTE AMPLIFIED PARA A DETEC O DIRECTA DAS 28 AW 12601 601 Rev 001 PT MICOBACT RIAS DO COMPLEXO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
36. metro Leader 50i 103100i bioM rieux ref 39400 Embalagem de Reagente de Detec o 201791 bioM rieux ref 39300 Controlos de Amplifica o MTD 301043F bioM rieux ref 39223 Suporte de tubos para o sonicador 104027 bioM rieux ref 39313 Suporte de tubos reaccionais 104769 bioM rieux ref 39311 Pontas de pipeta longas com filtro 1250 ul 104316 bioM rieux ref 39315 Tubos em polipropileno 12 x 75 mm 102440 bioM rieux ref 39308 Tampas em polipropileno para tubos de 12 x 75 mm 400713 bioM rieux ref 39320 PROCEDIMENTO Controlos As c lulas usadas para o Controlo de Amplifica o Positivo devem fazer parte do complexo M tuberculosis tal como a H37Ra n o virulenta ATCC 25177 ou a H37Rv virulenta ATCC 27294 As c lulas usadas para o Controlo Negativo devem ser MOTT tal como M gordonae ATCC 14470 ou M terrae ATCC 15755 Os controlos devem ser preparados antes de efectuar o teste da amostra Os controlos devem conter 25 150 CFU por 50 ul para obter uma concentra o final de 1 10 CFU por amostra Esta concentra o deve ser verificada em cultura Estes controlos devem ser utilizados na prepara o dos Controlos de Processamento da Amostra consultar a Prepara o da Amostra TESTE AMPLIFIED PARA A DETEC O DIRECTA DAS 9 AW 12601 601 Rev 001 PT MICOBACT RIAS DO COMPLEXO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS PROCEDIMENTO Amplified MTD 1 Prepara o recomendada para os Controlos a
37. nte o material fornecido ou material de laborat rio de utiliza o nica H As bancadas pipetas e material devem ser descontaminados com uma solu o de lix via dilu da a 1 2 metade de lix via metade de gua como descrito no par grafo PROCEDIMENTO Deixar a lix via actuar durante 15 minutos depois lavar com gua e enxugar para eliminar tra os de lix via Devem ser utilizadas as pipetas da bancada de trabalho ou as pipetas da c mara de fluxo laminar equipadas de pontas com filtro para efectuar este teste Devem utilizar se pontas extra longas para transferir o lisado dos tubos de lise para os tubos de amplifica o Mudar de ponta em cada etapa Evitar passar por cima dos outros tubos do suporte As pontas usadas devem ser imediatamente deitadas num recipiente destinado aos detritos biol gicos J Quando utilizar uma pipeta de repeti o para a distribui o dos reagentes depois da introdu o do lisado nos tubos evitar tocar no tubo com a ponta da pipeta para reduzir Os riscos de contamina o entre tubos Os reagentes devem ser distribu dos contra a parede do tubo para evitar projec es O cuidado na distribui o dos reagentes permitir reduzir os riscos de contamina o cruzada K N o utilizar as mesmas pipetas para as etapas anteriores e posteriores amplifica o L Depois da leitura dos resultados no lumin metro descontaminar os tubos elimin los como descrito nos par grafos PR
38. risco Observa se igualmente aumento de n mero de estirpes cepas resistentes ou seja multi resistentes aos anti tuberculostaticos As consequ ncias s o consider veis no dom nio da sa de p blica Os m todos de cultura convencionais permitem observar o crescimento de M tuberculosis num prazo de 1 a 8 semanas O teste MTD permite a detec o do ARNr das micobact rias do complexo M tuberculosis em 2 5 a 3 5 horas Mesmo n o permitindo efectuar o antibiograma o teste MTD detecta o M tuberculosis fi vel e rapidamente Isto permite uma melhor utiliza o dos servi os de isolamento dos hospitais come ar rapidamente um tratamento apropriado e prevenir a propaga o da doen a gra as identifica o precoce ao isolamento das pessoas contaminadas TESTE AMPLIFIED PARA A DETEC O DIRECTA DAS 4 AW 12601 601 Rev 001 PT MICOBACT RIAS DO COMPLEXO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS Amplified MTD PRINC PIO PRINC PIO O teste MTD um teste em duas fases amplifica o e detec o que se efectuam no mesmo tubo Primeiro a sonica o provoca a liberta o dos cidos nucleicos das micobact rias O calor utilizado para desnaturar estes cidos nucleicos e romper a estrutura secund ria do ARNr O m todo de amplifica o Transcription Mediated Amplification TMA amplifica em seguida um alvo espec fico do ARNr micobacteriano atrav s de um intermedi rio de ADN a uma temperatura constante de 42 C Produzem
39. s geralmente menos de 24 horas antes do seu tratamento Transporte Transportar as amostras para o laborat rio o mais rapidamente poss vel em conformidade com as regulamenta es em vigor Tratamento descontamina o e concentra o As amostras com muito sangue n o devem ser testadas com MTD Este teste foi concebido para detectar o ARNr das micobact rias do complexo M tuberculosis utilizando amostras preparadas segundo os m todos de descontamina o NALC NaOH ou NaOH utilizando 1 a 1 5 de NaOH durante 15 a 20 minutos e uma centrifuga o com uma velocidade gt 3 000 g Conserva o das amostras tratadas As amostras podem ser conservadas no m ximo durante 3 dias a 2 C 8 C antes do teste Podem tamb m conservar se entre 20 C e 70 C durante 6 meses ou mais N o utilizar congeladores com descongela o autom tica MATERIAL A Material fornecido EMBALAGEM DE REAGENTES PARA AMPLIFICA O Composi o da embalagem 50 testes bioM rieux ref 39006 Hologic Cat No 301001F Tamp o de Dilui o das Amostras SDB 1 2 5 Reagente Amplifica o 1x3ml ap s reconstitui o Tamp o de Reconstitui o AB 1x3ml Reagente de leo leo para reac o de amplifica o O 1x10ml Reagente Enzim tico E 1 1 5 ml ap s reconstitui o Tamp o de Dilui o Enzim tica EDB 1 1 5 ml MICOBACTERIAS DO COMPLEXO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS MATERIAL Amplified MTD
40. se assim m ltiplas c pias de ARNr micobacteriano amplicons As sequ ncias de amplicons de ARNr espec ficas das micobact rias do complexo M tuberculosis s o detectadas em seguida pelo m todo de hibridiza o entre cidos nucleicos Hibridization Protection Assay HPA da O Reagente de Hibridiza o do teste MTD cont m uma sonda ADN monocaten ria conjugada com um marcador quimioluminescente Esta sonda complementar das sequ ncias de ARN espec ficas das micobact rias do complexo M tuberculosis A sonda forma com estas sequ ncias espec ficas h bridos est veis ARN ADN Ap s a etapa de selec o o sinal luminoso emitido pelas sondas hibridizadas medido no lumin metro Leader REAGENTES Embalagem de 50 testes Nota Para obter informa es sobre quaisquer declara es de perigo e de precau o que possam estar associadas a estes reagentes consulte a Biblioteca de fichas de dados de seguran a Safety Data Sheet Library em www hologic com sds Os reagentes para o teste MTD s o fornecidos como segue EMBALAGEM DE REAGENTES PARA AMPLIFICA O Nome do reagente Volume Tamp o de Dilui o das Amostras SDB 1x2 5ml Solu o Tamp o Tris contendo lt 3 de detergente Reagente de Amplifica o A 1x3ml Acidos nucleicos liofilizados numa solu o tamp o Tris contendo 5 de ap s reconstitui o agente espessante Tamp o de amplifica o AB 1x3ml Solu o aquosa contendo conservantes Reag
41. superiores a 30 UFC por teste as estirpes cepas de M celatum e algumas estirpes cepas de M tipo terrae deram resultados positivos 26 772 RLU para M celatum e de 19 470 a 49 976 RLU para M tipo terrae E Limite de detec o Foram detectadas com o teste MTD trinta estirpes cepas de M tuberculosis provenientes de regi es geogr ficas muito variadas incluindo representantes de estirpes cepas resistentes e de estirpes cepas sens veis aos antibi ticos O teste MTD detectou at 1 UFC por teste de cada uma destas estirpes cepas F Teste de sobrecarga Foram analisados os ARNr de Mycobacterium tuberculosis com uma concentra o de 25 fg equivalente a 5 UFC por teste na presen a de cerca de 540 000 UFC por teste 450 ul dos organismos n o alvo seguintes Haemophilus influenzae Streptococcus pneumoniae Legionella pneumophila Pseudomonas aeruginosa Mycobacterium gordonae M avium M kansasii M terrae Nocardia asteroides N otitidis caviarum Corynebacterium pseudotuberculosis C diphtheriae Gordona sputie Rhodococcus bronchialis Todos os resultados foram positivos para o ARNr de M tuberculosis na presen a destes organismos n oalvo os quais portanto n o criaram interfer ncia TESTE AMPLIFIED PARA A DETEC O DIRECTA DAS 23 AW 12601 601 Rev 001 PT MICOBACT RIAS DO COMPLEXO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS RESOLU O DE INCIDENTES Amplified MTD RESOLU O DE INCIDENTES OBSERVA O CAUSAS POSS
42. temperatura ambiente durante pelo menos 5 minutos mas n o mais de uma hora Retirar as folhas autocolantes ou as tampas imediatamente antes da fase de detec o Programar o procedimento apropriado no lumin metro Escolher uma leitura de 2 segundos Para eliminar qualquer res duo da superf cie dos tubos limp los com um papel absorvente h mido que n o se desfa a com a humidade e depois introduzi los no lumin metro seguindo as instru es do manual de utiliza o Os tubos devem ser lidos na hora a seguir etapa de selec o Quando a an lise tiver terminado retirar os tubos do lumin metro Ap s a leitura dos tubos ench los cuidadosamente com uma solu o de lix via dilu da a 1 10 um volume de 9 volumes de gua utilizando um esguicho Deixar a lix via actuar durante pelo menos uma hora antes de eliminar os tubos para evitar a contamina o do laborat rio com amplicons Os suportes de tubos devem ser descontaminados por imers o completa numa solu o de lix via dilu da a 1 2 durante pelo menos 15 minutos Em seguida devem se lavar com gua e enxugar ou secar ao ar Descontaminar o laborat rio e o material utilizando uma solu o de lix via dilu da a 1 2 Repeti o do teste 1 2 Se tiver de repetir o teste deixar os lisados atingir a temperatura ambiente NAO UTILIZAR O VORTEX PARA OS LISADOS Seguir o protocolo de PROCEDIMENTO come ando pela etapa de ampl
43. to com outros dados cl nicos e laboratoriais Deve ser considerada a possibilidade de ser testada uma outra amostra consoante a suspeita cl nica existente Se o resultado de teste MTD inicial for positivo 2 500 000 RLU ou se o resultado do teste MTD repetido for positivo 2 30 000 RLU apresentar os resultados da forma seguinte TESTE AMPLIFIED PARA A DETEC O DIRECTA DAS 17 AW 12601 601 Rev 001 PT MICOBACT RIAS DO COMPLEXO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS LIMITES Amplified MTD Apresentar Foi detectado o rRNA do complexo Mycobacterium tuberculosis Colora o AFB positiva ou negativa Informa o adicional Cultura de AFB em crescimento As amostras podem conter MOTT e M tuberculosis ou apenas M tuberculosis Este teste n o deve ser efectuado isoladamente para o diagn stico M tuberculosis O valor positivo preditivo para uma amostra com colora o AFB negativa mais baixo que para uma amostra com colora o AFB positiva Tal particularmente importante ao testar amostras de popula es em que a preval ncia de M tuberculosis baixa e os valores esperados com m todos de diagn stico correspondentes s o reduzidos Se o resultado de teste MTD ou a repeti o deste for negativa lt 30 000 RLU apresentar os resultados da forma seguinte Apresentar N o foi detectado o rRNA do complexo de Mycobacterium tuberculosis Colora o AFB positiva ou negativa Informa o adicional N o foi detectado o rRN
44. tura homog nea durante as etapas de hibridiza o e de selec o especialmente ap s a adi o do Reagente de Hibridiza o H reconstitu do a mistura fica com uma cor amarela uniforme e do Reagente de Selec o S a mistura fica com uma cor rosa uniforme A agita o com Vortex permite obter uma suspens o uniforme Quando os reagentes s o colocados no tubo de reac o e expostos a uma fonte de energia exterior produz se uma rota o r pida da solu o volta do eixo do tubo Da resulta uma suspens o uniforme Para que a homogeneiza o seja correctamente efectuada num Vortex os tubos devem segurar se na parte superior e manter se na vertical O l quido deve ent o atingir a metade superior do tubo durante a agita o Durante as etapas de hibridiza o e de selec o esta agita o deve efectuar se 3 vezes seguidas e durar pelo menos 1 segundo de cada vez TESTE AMPLIFIED PARA A DETEC O DIRECTA DAS 16 AW 12601 601 Rev 001 PT MICOBACT RIAS DO COMPLEXO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS Amplified MTD INTERPRETA O DO TESTE INTERPRETA O DO TESTE Os resultados do teste AMPLIFIED PARA A DETEC O DIRECTA DAS MICOBACT RIAS DO COMPLEXO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS MTD s o interpretados considerando que um resultado negativo inicial lt 30 000 RLU um resultado positivo inicial gt 500 000 RLU ou um resultado equ voco inicial 30 000 a 499 999 RLU O teste MTD deve ser repetido a partir do lisa
45. uar os testes que os tubos s o correctamente injectados com os reagentes de detec o Consultar o Manual de Utiliza o do lumin metro para as instru es de introdu o dos Reagentes de Detec o estes reagentes s o vendidos separadamente Prepara o do reagente Reconstituir o Reagente de Amplifica o liofilizado A no seu frasco 50 testes com 3 ml de Tamp o de Amplifica o AB Homogeneizar num Vortex Deixar o reagente reconstitu do repousar temperatura ambiente at ficar claro O Reagente de Amplifica o reconstitu do pode conservar se durante 2 meses a 2 C 8 C A solu o deve ser colocada a temperatura ambiente antes da utiliza o Prepara o das amostras 1 Identificar um n mero suficiente de Tubos de Lise de Micobact rias LT para analisar as amostras os controlos de amplifica o positiva e negativa e os testemunhos de amplifica o positivo e negativo Retirar e conservar as tampas 2 Distribuir 50 ul do Tamp o de Dilui o das Amostras de Micobact rias SDB em todos os tubos de lise de Micobact rias LT Proceder como infra descrito em A e B para os controlos e em C para as amostras A Procedimento para Testemunhos de amplifica o Para cada controlo adicionar 1 ml de solu o de NALC NaOH ml do tamp o fosfato utilizado para efectuar o processamento da expectora o com 1 ml de gua est ril no tubo de processamento da amostra Homogeneizar em vortex ll
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