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Elucigene® CF-EU2v1 Instruções de utilização

1. none No instrumento 3500 a conven o do nome do ficheiro deve ser definida de modo a que o nome da amostra seja inclu do no nome do ficheiro fsa p ex CFEU2 DDMMAAAA 1234 5 A AO1 E qe Cretino Pew fode Elaine Cairon Setup F s Namo Corvontos q Inseto rega sed Debi Provode q nana vehes AT P lerr obe Si e aht Hir terne Mtidr mr Preen A bhe times oem r Haer do ntutdo AMT deste Hiler AM des Arnt um fogos dedos Pretos sh Hasse argir liper Aria Hante peter greve O ETE Ted uten Taz unom Tati y Ber miexi a dress Unebeicere i j Ade betwser tritare hds is ghar ts evadanto stirisdo pt e i Tea j 1 Tez zani Test lect Edo Loreti Py Mefe b Ere Liu phos D Prene E TT T 1444 Cuta Interpreta o dos resultados Durante a recolha de dados os fragmentos de PCR s o observados sob a forma de picos azuis mutantes ou verdes estirpe selvagem no electroforograma de dados n o tratados Cada indiv duo possui duas c pias do gene CFTR Quando estas c pias possuem a mesma sequ ncia num dado local diz se que o indiv duo homozig tico relativamente a este local Quando estas c pias possuem sequ ncias diferentes num dado local diz se que o indiv duo heterozig tico relativamente a este local Depois de terminar a colheita de dados os fragmentos de PCR de CF EU2v1 devem ser medidos frente ao padr o de tamanho GS600v2 LIZ utilizando o software de an lise de f
2. 394delTT S o observados dois picos com 2 bp de intervalo nas posi es 35 G85E WT 42 P67L WT e 44 E60X WT nos resultados da mistura B de indiv duos heterozig ticos para a muta o 394delTT O pico 34 desaparece e os picos 35 42 e 44 ter o a altura esperada mas apresentam um desvio de 2 bp a menos no tamanho esperado nos resultados de indiv duos homozig ticos para a muta o 394delTT IS4deITT WT pes E O F508del CFTRdele2 3 S o observadas alturas reduzidas dos picos nas posi es 34 394delTT 35 G85E WT 41 CFTRdele2 3 WT 42 P67L WT e 44 E60X WT nos resultados da mistura B de indiv duos heterozig ticos para a muta o CFTRdele2 3 Os picos 34 35 41 42 e 44 desaparecem dos resultados de indiv duos homozig ticos para a muta o CFTRdele2 3 Ladai CF2EUBYPT 002 Sep 2014 P gina 20 de 26 Elucigene CF EU2v1 Instru es de utiliza o 444del A S o observados dois picos com 1 bp de intervalo nas posi es 30 R117H WT 31 R117C WT 33 Y122X WT e 47 62141 WT nos resultados da mistura B de indiv duos heterozig ticos para a muta o 444delA O pico 27 desaparece e os picos 30 31 33 e 47 ter o a altura esperada mas est o apresentam um desvio de 1 bp a menos no tamanho esperado nos resultados de indiv duos homozig ticos para a muta o 444delA li ARIANA STRADA CM Id a E 7 no A dh o ms atado it MS 0 ido a to e NO E IA ie O D o mo A ie
3. presen a do polimorfismo de F508C 1655T gt G resulta na redu o da altura do pico 1507del na mistura B de CF EU2v1 6 A presen a de R117H resulta na redu o da altura do pico R117C na mistura B de CF EU2v1 Numa amostra homozig tica para R117H o pico R117C est ausente 7 presen a de G85E resulta na redu o da altura do pico 394delTT na mistura B de CF EU2v1 Numa amostra homozig tica para G85E o pico 394delTT est ausente 8 Por vezes pode observar se um pico de artefacto muito pequeno na posi o 1507del nos resultados de amostras heterozig ticas para F508del e em particular em amostras homozig ticas para F508del 9 As muta es que se seguem que n o foram verificadas quanto a uma eventual reactividade cruzada por n o estarem dispon veis amostras relevantes podem interferir com o funcionamento do teste R117P R117L 17 17 2A gt G 621 2T gt C 621 2T gt G R553G R5530 R347L 1506T 15065 1506V e a combina o rara de 1507del com o polimorfismo 1651A G Caracter sticas do desempenho Realizou se o teste ocultado de cento e dez amostras de DNA extra das de sangue total l quido EDTA utilizando o Elucigene CF EU2v1 Cinco amostras falharam ap s a PCR o que esteve correlacionado com a baixa concentra o de DNA inferior a 1 5 ng ul Das que deram resultados interpret veis 96 foram normais 5 foram heterozig ticas para F508del 1 foi heterozig tica para 1717 1G gt A 1 foi heterozig tica par
4. gt ma a ua 1 ss 4 o Polimorfismo rs4148721 delAT no intr o 22 S o observados dois picos com 2 bp de intervalo nas posi es 45 3659delC WT 49 R1162X WT e 50 R1158X WT nos resultados da mistura B de indiv duos heterozig ticos para o polimorfismo rs4148721 dele o de AT no intr o 22 Os picos 45 49 e 50 ter o a altura esperada mas apresentam um desvio de 2 bp a menos no tamanho esperado nos resultados de indiv duos homozig ticos para o polimorfismo rs4148721 Outras observa es V520F Polimorfismo 1584G gt A no ex o 12 Verificou se que o polimorfismo 1584G gt A interfere com a amplifica o do mutante V520F e com a sequ ncia de estirpe selvagem E observada uma altura do pico reduzida na posi o 12 V520F nos resultados da mistura B de indiv duos heterozig ticos para o polimorfismo 1584G gt A Na mistura B o pico 12 desaparece dos resultados de indiv duos homozig ticos para polimorfismo 1584G gt A Um indiv duo que seja heterozig tico para a muta o F508del e tamb m heterozig tico para a muta o 1584G gt A exibe apenas um pico 12 na mistura B em vez dos dois picos esperados na posi o 12 que s o normalmente observados num indiv duo heterozig tico F508del veja o exemplo abaixo O pico 12 desaparece da mistura A em indiv duos heterozig ticos para a muta o V520F e para o polimorfismo 1584G gt A no mesmo alelo embora tal resultado n o tenha sido observado at data e se considere um
5. 1000C gt T D Ara334Tro gt Arg347Pro R347H 3 Ara347Hi A455E eaaeo ooo Ooga 507de e507del Pe F508del 1521 1523del c 1521 1523delCTT p Phe508del 1677delTA c 1545 1546del c 1545 1546delTA o Tyr515X V520F p Val 520Phe 1558 S549N p Ser549Asn 1D p GIv551Asp R553X 2 Ara553X B560T Ara 60 Thr 1811 1 6kbA gt G c t680 886A gt 6 ooo o 1766 1G gt A E 2143delT 2012del c 2012delT o Leu671X 2184delA 2052del c 2052delA o Lyvs684AsnfsX38 2347del 2215del c 2215del D Val 39Tvr sX16 W846X 2538G gt A o Tro846X 2789 5G gt A lousa 0 d O 120 1G gt A c 2988 1G gt A LI CF2EUBYPT 002 Sep 2014 P gina 2 de 26 Elucigene CF EU2v1 Instru es de utiliza o De acordo com as orienta es da HGVS Y1092X C gt A p Tur1092X M1101K p Met1101L D11524 p Aspt152H R1158X 3472C gt T D Arq1158X R1162X D Ara1162X 559de 3528del c 3528del o Lyvs1177SerfsX1 349 10kbC gt T 9718 24770 gt T sl 1251N p Ser1251Asn 905insT 37173dup c 3773dupT Oo Leu1258PhefsX7 W1282X 3846G gt A O Tro1282X N1303K Asni303L with reference to Mutation Nomenclature in Practice Findings and Recommendations from the Cystic Fibrosis External Quality Assessment Scheme Berwouts S Morris M Girodon G Schwarz M Stuhrmann M and Dequeker E Human Mutation Vol 00 No O 1 7 2011 O CF EU2vi1 capaz de distinguir entre indiv duos heterozig ticos e homozig ticos relativamente a todas as muta es e variantes acima ex
6. 38000 etapas 3 Current Stability Estabilidade da corrente 5 0 int 0 2000 uA 4 PreRun_Voltage Tens o_pr execu o 15 0 0 15 kV 5 Pre Run Time Tempo pr execu o 180 1 1000 s 6 Injection Voltage Tens o injec o 3 0 1 15 kV 7 Injection_Time Tempo_injec o 12 0 1 600 s 8 Voltage Number Of Steps 20 1 100 nk Tens o N mero de etapas 9 Voltage Step Interval 15 1 60 s Intervalo passos tens o 10 Data Delay Time Tempo atraso dados 60 1 3600 s 11 Run Voltage Tens o execu o 15 0 0 15 kVs 12 Run Time Tempo execu o 1200 300 14000 s Aumente o tempo de injec o para 36 segundos para a an lise de DNA extra do de gotas de sangue seco Nota O tempo de execu o necess rio varia consoante a temperatura ambiente do local onde o analisador gen tico est instalado Para mais informa es acerca da cria o de m dulos de execu o queira consultar o Manual de utiliza o do analisador gen tico 3130 da Applied Biosystems Crie o protocolo para CF EU2 no Protocol Manager gestor de protocolos e assegure se de que selecciona as seguintes caracter sticas e Tipo regular e Run Module M dulo de execu o CF EU2 ver modulo de execu o acima e Dye Set Conjunto de corantes G5 Para executar as amostras crie uma ficha de amostras utilizando o Plate Manager gestor de placas e assegure se de que foi seleccionado o protocolo correcto para CF EU2v1 para o protocolo do in
7. CR et al Analysis of any point mutation in DNA The Amplification Refractory Mutation System ARMS Nucleic Acid Res 17 2503 2516 1989 9 Satsangi J et al Effect of heparin on polymerase chain reaction Lancet 343 1509 1510 1994 10 PCR Primer A Laboratory Manual 2 edition ColdSpring Harbour Laboratory Press Section 1 ELUCIGENE is a trademark of Delta Diagnostics UK Ltd ARMS uma marca comercial registada da AstraZeneca UK Ltd QIAAMP uma marca comercial registada da Qiagen GmbH PICOGREEN uma marca comercial registada da Molecular Probes Inc GENEMARKER uma marca comercial registada da SoftGenetics Corporation GENEMAPPER NED VIC PET POP 7 LIZ e HI DI s o marcas registadas da Life Technologies Corporation AVISO AO COMPRADOR LICEN A LIMITADA Os polinucle ticos marcados com corantes VIC NED e PET e ou a sua utiliza o podem estar abrangidos por uma ou mais patentes detidas pela Life Technologies Corp O pre o de aquisi o deste produto inclui os direitos limitados e n o transmiss veis ao abrigo de determinadas reivindica es de certas patentes detidas pela Life Technologies Corp para a utiliza o pelo comprador apenas desta quantidade do produto e exclusivamente em actividades de detec o de alvo s no dom nio do diagn stico humano N o s o transmitidos outros direitos Podem obter se mais informa es acerca da aquisi o de licen as relacionadas com os corantes atr s mencionados
8. analisar deve ser determinada para garantir a obten o dos melhores resultados S o aceit veis t cnicas como a fluoresc ncia PicoGreen ou a absorv ncia de UV Devido s varia es entre as t cnicas de quantifica o de DNA o utilizador deve ter em considera o as seguintes orienta es Quantidades de DNA de entrada muito elevadas aumentam a probabilidade de marca o de picos de fundo pelo software de an lise Podem ser tomadas as seguintes medidas para reduzir a probabilidade de marca o de picos de fundo e Dilua a amostra de DNA e volte a amplificar e Reduza o tempo de injec o consulte a sec o de eleciroforese de capilares CF2EUBYPT 002 Sep 2014 P gina 8 de 26 Elucigene CF EU2v1 Instru es de utiliza o e Aumente o limiar m nimo de amplitude do pico consulte o Guia do software de an lise do Elucigene CF EU2v1 Quantidades baixas de DNA de entrada aumentam a probabilidade de os picos de diagn stico serem fracos e n o serem marcados pelo software de an lise Podem ser tomadas as seguintes medidas para aumentar o sinal e Aumente o tempo de injec o para 36 segundos vivamente recomendado para extrac es a partir de gotas de sangue seco consulte a sec o de electroforese de capilares e Volte a extrair a amostra de gotas de sangue seco e elua num volume reduzido 50 ul de gua e Aumente o n mero de gotas de sangue seco para extrac o quando utiliza discos de 4 x 3 mm Consid
9. ci ia A DD ao A Dita lis SDL A AA ma it Sto DS LO ai A 2347delG S o observados dois picos com 1 bp de intervalo nas posi es 39 2184delA WT e 43 2143delT WT nos resultados da mistura B de indiv duos heterozig ticos para as muta es 2347delG O pico 16 desaparece e os picos 39 e 43 ter o a altura esperada mas apresentam um desvio de 1 bp a menos no tamanho esperado nos resultados de indiv duos homozig ticos para a muta o 2347delG 234 Salg AT peab A E l RRAN j HE ip UNE 2 Ha o Nos mms io ai dim as 4 3905insT S o observados dois picos com 1 bp de intervalo na posi o 26 S1251N WT nos resultados da mistura B de indiv duos heterozig ticos para a muta o 3905insT O pico 24 desaparece e o pico 26 ter a altura esperada mas apresentam um desvio de 1 bp a mais do que o tamanho esperado nos resultados de indiv duos homozig ticos para a muta o 3905insT 220SinsT WT peab CF2EUBYPT 002 Sep 2014 P gina 21 de 26 Elucigene CF EU2v1 Instru es de utiliza o R1158X observada uma altura do pico reduzida na posi o 49 R1162X WT nos resultados da mistura B de indiv duos heterozig ticos para a muta o R1158X O pico 49 desaparece dos resultados de indiv duos homozig ticos para a muta o R1158X a WT Oi N ml E E E E O PN VI VD PD VE PP PT O E NT OP E E E OO ON E O E N R 4 UR E p x bs 1 E p De o al s si
10. de muta o refract ria a amplifica o Amplification Refractory Mutation System ARMS de fluoresc ncia para amplifica o espec fica de alelos que detecta muta es inser es ou dele es pontuais no DNA 8 O princ pio do ARMS que os oligonucle tidos com um res duo n o correspondente na extremidade 3 n o funcionam como iniciadores da reac o em cadeia da polim rase PCR em condi es espec ficas A selec o de oligonucle tidos adequados permite a amplifica o e detec o de sequ ncias de DNA mutantes ou normais espec ficas As sequ ncias amplificadas produtos de amplifica o s o separadas por electroforese de capilares utilizando um analisador gen tico da Applied Biosystems O software de an lise permite a identifica o e a marca o dos produtos de amplifica o segundo o seu tamanho e a cor do corante O Elucigene CF EU2v1 um ensaio multifacetado que abrange duas reac es de PCR A e B Cinquenta sequ ncias mutantes no gene CFTR s o detectadas pela mistura A e visualizadas sob a forma de picos de produtos de amplifica o azuis As sequ ncias normais estirpe selvagem correspondentes s o detectadas pela mistura B e visualizadas sob a forma de picos de produtos de amplifica o verdes A mistura A detecta tamb m uma sequ ncia normal na muta o mais frequentemente observada enquanto causadora de fibrose c stica em popula es caucasianas denominada F508del que visualizada sob a form
11. os laborat rios devem processar em cada ensaio as suas pr prias amostras de QC interno de gen tipo conhecido Se a caixa do kit estiver danificada o conte do poder estar danificado n o utilize o kit e contacte o Apoio ao Cliente CF2EUBYPT 002 Sep 2014 P gina 5 de 26 Elucigene CF EU2v1 Instru es de utiliza o Simbolos utilizados nos r tulos Os s mbolos utilizados em todos os r tulos e embalagens est o em conformidade com a norma IS015223 harmonizada Fabricante N mero de an lises Consulte as instru es de utiliza o Armazene abaixo da temperatura indicada Utilize at data indicada 2 m q MA C digo de cat logo LOT N mero de lote Dispositivo m dico para diagn stico in vitro CF2EUBYPT 002 Sep 2014 P gina 6 de 26 Elucigene CF EU2v1 Instru es de utiliza o Materiais fornecidos Os reagentes devem ser armazenados em reas isentas de DNA ou produtos de PCR contaminantes Todos os reagentes s o fornecidos prontos a utilizar Armazene os reagentes abertos e por abrir a 20 C Os reagentes abertos podem ser armazenados durante at 3 meses S o fornecidos materiais suficientes para 50 10 an lises 2 x ampolas de 120ul 50ul de mistura de iniciadores A para CF EU2v1 contendo iniciadores para amplificar os seguintes alelos mutantes R347H R347P 2 89 5G gt A 3120 1G gt A 711 1G gt T R334W 1507del F508del 3849 10kbC gt T 1677delTA 1078delT V520F L20
12. 34 5 240 5 242 246 250 252 299 9 209 265 267 26 9 269 9 2 9 280 282 288 289 295 5 297 303 5 308 314 315 321 323 326 332 338 341 5 347 5 349 355 357 360 360 366 5 367 373 377 383 384 390 391 397 398 5 404 5 406 411 413 418 423 429 433 439 439 5 445 5 446 450 5 453 5 460 5 461 465 5 470 476 485 5 491 5 P gina 17 de 26 Elucigene CF EU2v1 Instru es de utiliza o N Marcador Marcador Produto bp Tamanho Intervalo dados 3130 POP 7 496 503 506 512 516 5 524 5 110 130 140 160 175 195 S549R T gt G O pico 20 s est presente na mistura A Tamanhos de alelos 5T Produto bp Tamanho Marcador Intervalo dados 3130 POP7 5T 9 117 25 118 75 NOTA Os tamanhos dos marcadores podem variar consoante o aparelho e o pol mero utilizados Exemplos de interpreta o 1507del Devido localiza o da dele o 1507del no gene CFTR poss vel detectar a presen a deste marcador atrav s de um desvio de 3 bp no tamanho do pico de F508del assim como um pico espec fico da muta o 1507del Caso esteja presente um s alelo mutante 1507del o pico mutante que lhe corresponde ser observado sob a forma de um pico azul a aproximadamente 159 bp Ser observado como presente um pico de estirpe selvagem para F508 mas a altura do pico ser cerca de metade da normalmente associada a um gen tipo de estirpe selvagem homozig tico este observado sob a forma de um pico verde a cerc
13. 6W W1282X R560T 2347delG Q890X R553X G551D S549N M1101K G542X 3905insT Y1092X C gt A S1251N 444delA 1811 1 6kbA gt G 1717 1G gt A R117H R117C N1303K Y122X 394delTT G85E R1066C 1898 1G gt A W846X 2184delA D1152H CFTRdele2 3 P67L 2143delT E60X 3659delC 3272 26A gt G 621 1G gt T A455E R1162X e R1158X Esta mistura cont m tamb m iniciadores de estirpe selvagem para a detec o do alelo F508del normal iniciadores para a detec o das variantes de politimidina IVS8 5T IVS 7T e IVS8 9T e iniciadores para a identifica o de dois marcadores de microssat lites short tandem repeat STR hipervari veis 404473 4500483 2 x ampolas de 120ul 50ul de mistura de iniciadores B para CF EUv1 contendo iniciadores de estirpe selvagem para amplificar os alelos normais dos mutantes amplificados pela mistura de iniciadores A excep o do F508del o alelo normal que amplificado pelos iniciadores inclu dos na mistura A Esta mistura cont m ainda iniciadores para a identifica o de dois marcadores STR hipervari veis 404474 450044 2 x ampolas de 400ul 75ul de mistura principal para PCR contendo DNA polimerase HoitStart Tag e trifosfatos de desoxinucle tidos em tamp o 404480 450045 1 x ampola de 50 ul de controlo de DNA a 6 ng ul normal para as muta es detectadas pelo Elucigene CF EU2v1 404489 Materiais necess rios mas n o fornecidos Consum veis de laborat rio luvas tu
14. Elucigene CF EU2v1 Instru es de utiliza o Elucigene Diagnostics Elucigene CF EU2v1 Instru es de utiliza o C d cat CF2EUB2 50 testes CF2EUBX 10 testes Utiliza o em diagn stico in vitro E pela Elucigene Diagnostics Greenheys House Pencroft Way Manchester Science Park Manchester M15 6JJ Para Vendas Assist ncia ao Cliente e Assist ncia T cnica T 44 0 161 669 8122 F 44 0 161 669 8129 E enquiriesQelucigene com E techsupport Delucigene com Elucigene Diagnostics is the trading name of Delta Diagnostics UK Limited a company registered in England and Wales registration number 8696299 CF2EUBYPT 002 Sep 2014 P gina 1 de 26 Elucigene CF EU2v1 Instru es de utiliza o Elucigene CF EU2v1 Utiliza o prevista Para a detec o qualitativa simult nea in vitro das seguintes muta es do gene regulador da conduct ncia transmembranar na fibrose c stica Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator CFTR respons veis pela fibrose c stica em humanos em DNA extra do de sangue total conservado em EDTA e amostras de gotas de sangue secas De acordo com as orienta es da HGVS CFTRdele2 3 c 54 5940 273 1025del c 54 5940 273 10250del21080 Pe7L gt Pro67Le 35E l J4delTT gt Leu88llefsX22 444delA 313del c 313delA D lle105SerfsX2 R117 349C gt T o Arqaq117 R117H p Ara 17H 3 Tvr122X 489 1G gt T Da nor lesma o d O L206W R334W
15. YPT 002 Sep 2014 P gina 25 de 26 Elucigene CF EU2v1 Instru es de utiliza o Bibliografia 1 Rosenstein BJ Cutting GR The diagnosis of cystic fibrosis a consensus statement Cystic Fibrosis Foundation Consensus Panel J Pediatr 1998 132 589 95 2 De Braekeleer M Allard C Leblanc JP Simard F Aubin G Genotype phenotype correlation in cystic fibrosis patients compound heterozygous for the A455E mutation Hum Genet 1997 101 208 11 3 Drumm ML Konstan MW Schluchter MD Handler A Pace R Zou F Zariwala M Fargo D Xu A Dunn JM Darrah RJ Dorfman R Sandford AJ Corey M Zielenski J Durie P Goddard K Yankaskas JR Wright FA Knowles MR Genetic modifiers of lung disease in cystic fibrosis N Engl J Med 2005 353 1443 53 4 Goss CH Newsom SA Schildcrout JS Sheppard L Kaufman JD Effect of ambient air pollution on pulmonary exacerbations and lung function in cystic fibrosis Am J Respir Crit Care Med 2004 169 816 21 5 Kerem B Rommens JM Buchanan JA Markiewicz D Cox TK Chakravarti A Buchwald M and Tsui LC Identification of the Cystic Fibrosis Gene Genetic Analysis Science 1989 245 4922 1073 8 6 Cystic Fibrosis Mutation Database www genet sickkids on ca cftr app 7 Joshua D Groman et al Variation in a Repeat Sequence Determines Whether a Common Variant of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Gene Is Pathogenic or Benign Am J Hum Genet 2004 74 1 176 179 8 Newton
16. a G551D 1 foi heterozig tica para 621 1G gt T 1 foi heterozig tica para G542X e 1 foi heterozig tica composta para G542X F508del Realizou se o teste ocultado de noventa e um amostras de DNA extra do de gotas de sangue seco utilizando o Elucigene CF EU2v1 A amplifica o de cinco amostras falhou Das amostras com amplifica o bem sucedida 20 n o cumpriram os crit rios de an lise para a interpreta o seguindo se uma injec o de 12 segundos num analisador gen tico 3500 todas as amostras cuja amplifica o falhou apresentaram correla o com concentra es baixas de DNA menos de 1 5 ng ul As 20 amostras que falharam foram reinjectadas durante 36 segundos no analisador gen tico 3500 e analisadas 7 amostras n o chegaram a cumprir os crit rios de an lise para a interpreta o Das 79 amostras que deram resultados interpret veis 38 foram normais 5 foram heterozig ticas para F508del 3 foram heterozig ticas para G551D 3 foram heterozig ticas para W1282X CF2EUBYPT 002 Sep 2014 P gina 23 de 26 Elucigene CF EU2v1 Instru es de utiliza o 2 foram heterozig ticas para D1152H e 2 foram heterozig ticas para G542X Foram ainda determinados quatro heterozig ticos compostos 3120 1G gt A F508del R117H F508del R1162X F50 del e R553X Fb08del Al m disso foram ainda observados numa nica ocasi o as seguintes amostras heterozig ticas E60X G8S5E 394delTT Y122X 621 1G gt T 1078delT R334W R347P A455E I507
17. a combina o rara CF2EUBYPT 002 Sep 2014 P gina 22 de 26 Elucigene CF EU2v1 Instru es de utiliza o Reactividade cruzada Durante o desenvolvimento do teste foram envidados todos os esfor os para evitar a interfer ncia no funcionamento do teste da presen a de outros polimorfismos e muta es do gene CFTR descritos A muta o rara R1283M foi avaliada quanto possibilidade de reac o cruzada e n o foi detectada pelo kit Elucigene CF EU2v1 Al m disso n o foram detectados pelo teste os seguintes polimorfismos 1655T G F508C 1651A G A avalia o de muta es e polimorfismos conhecidos do gene CFTR revelou os seguintes efeitos nos resultados do kit Elucigene CF EU2v1 1 O iniciador mutante G551D da mistura A tamb m detecta a muta o S549RT gt G O software de an lise rotula a como pico 20 N o existe um pico de estirpe selvagem correspondente na mistura B 2 O iniciador mutante 2184delA na mistura A faz reac o cruzada com a sequ ncia de DNA do mutante 2183AA gt G o que resulta num pico mutante na posi o 2184delA 3 O iniciador mutante 1078delT na mistura A faz reac o cruzada com a sequ ncia de DNA do mutante F316L o que resulta num pico mutante na posi o 10 8delT 4 O iniciador mutante R347P da mistura A faz reac o cruzada com a sequ ncia de DNA do mutante R347H o que resulta num pico mutante na posi o R347P cuja altura menor do que a de um pico de R347P verdadeiro 5
18. a de 167 bp Observar se ainda um outro pico verde a cerca de 164 pb Amostra heterozig tica 1507del Uma amostra 1507del F508del produz um pico WT F508del verde desviado a aproximadamente 164 bp menos 3 bp que o normal um pico M F508del azul a 166 bp e um pico M 1507del azul a cerca de 159 bp CF2EUBYPT 002 Sep 2014 P gina 18 de 26 Elucigene CF EU2v1 Instru es de utiliza o Uma amostra 1507del 507del resulta num pico azul a aproximadamente 159 bp e num pico verde nico a cerca de 164 bp 3 bp inferior ao pico F508 normal observado quando 1507del n o est presente F508del A presen a de uma muta o F508del impede o iniciador WT 1507del de funcionar Consequentemente um indiv duo homozig tico para F508del n o apresenta um pico WT 1507del na mistura WT ver abaixo Um pico WT 1507del de altura reduzida e dois picos com 3 bp de intervalo nas posi es 10 e 12 da mistura WT ver abaixo s o observados nos resultados da mistura B para indiv duos heterozig ticos para F508del II E li dedos a de eop VA qndo tt n begt q a e genge Pe o qu s ums toe ue Inser es e dele es Devido natureza do desenho do kit CF EU2v1 a presen a de inser es ou dele es entre dois iniciadores opostos resulta em varia es do tamanho da totalidade do produto de amplifica o produzido entre estes dois iniciadores Por conseguinte al m das 50 muta es detectad
19. a de um pico de produtos de amplifica o verde Al m disso as sequ ncias repetidas de poli T s o detectadas pela mistura A e visualizadas sob a forma de picos de produtos de amplifica o pretos Est o inclu dos marcadores de controlo interno da amplifica o n o associados a fibrose c stica nas misturas A e B para monitorizar a efici ncia da amplifica o das amostras sendo visualizadas sob a forma de picos de produtos de amplifica o vermelhos CF2EUBYPT 002 Sep 2014 P gina 4 de 26 Elucigene CF EU2v1 Instru es de utiliza o Advert ncias e precau es 1 O controlo de DNA fornecido com este kit de origem humana e foi analisado independentemente com um ensaio de PCR tendo se verificado que negativo para o v rus da hepatite B HBV o v rus da hepatite C HCV e o v rus da imunodefici ncia humana 1 HIV1 H que ter cautela quando se manuseia material de origem humana Todas as amostras devem ser consideradas potencialmente infecciosas Nenhum m todo de teste pode garantir totalmente a aus ncia de HBV HCV HIV 1 ou de outros agentes infecciosos O manuseamento das amostras e dos componentes dos testes a sua utiliza o O seu armazenamento e a sua elimina o devem estar de acordo com os procedimentos definidos pelas orienta es ou regulamentos nacionais de seguran a biol gica De acordo bom as boas pr ticas de laborat rio actuais e para que se possa avaliar a validade do procedimento
20. ada com a mistura de estirpe selvagem para reduzir a probabilidade de as amostras serem confundidas um perfil STR diferente em cada uma das duas misturas indica que houve confus o de amostras A aus ncia destes marcadores STR indica que a amostra falhou A presen a de marcadores STR com RFU muito baixas indica uma amostra fraca que deve ser analisada com cautela Nota Consulte o Guia de resolu o de problemas para mais informa es CF2EUBYPT 002 Sep 2014 P gina 16 de 26 Marcadores detectados Elucigene CF EU2v1 Instru es de utiliza o A tabela que se segue resume os marcadores detectados pela mistura CF EU2v1 Os marcadores s o indicados por intervalo de tamanhos do produto de PCR observado Marcador N Pico CF2EUBYPT 002 Marcadores detectados Marcador R347H R347P 2 789 5G gt A 3120 1G gt A 711 1G gt T R334W 1 507del F508del 3849 10KbC gt T 1677delTA 1078delT V520F L206W W1282X R560T 2347delG Q890X R553X G551D S549R T gt G S549N M1101K G542X 3905insT Y1092X C gt A S1251N 444delA 1811 1 6kbA gt G 1717 1G gt A R117H R117C N1303K Y122X 394delTT G85E R1066C 1898 1G gt A W846X 2184delA D1152H CFTRdel2 3 P67L 2143delT E60X 3659delC 3272 26A gt G 621 41G gt T Sep 2014 Produto bp Tamanho Intervalo dados 3130 POP 7 110 5 116 5 117 128 124 130 132 5 138 5 141 5 147 5 147 5 154 156 162 5 163 169 172 178 180 188 5 193 199 206 211 5 215 220 224 5 230 5 2
21. ar um pouco as ampolas Prepare mistura de reac o suficiente para o n mero de amostras e controlos a testar Tabela 1 Nota A mistura principal para PCR viscosa e necess rio ter cuidado para assegurar que se lida com os volumes correctos Recomenda se a adi o da mistura principal para PCR s misturas de iniciadores previamente distribu das para garantir que todo o l quido distribu do pela pipeta na mistura de iniciadores Nota N o utilize misturas ou componentes diferentes de lotes diferentes do kit CF EU2v1 CF2EUBYPT 002 Sep 2014 P gina 10 de 26 Elucigene CF EU2v1 Instru es de utiliza o Activa o Ciclos Extens o final enzim tica Temperatura ambiente Tabela 1 Formula o da mistura de reac o Rai al PS PRP ul 45 45 1125 225 Mistura principal para PIPPP PCR T 7 5 75 187 5 375 Total ul 12 120 300 600 Pipete 10 ul de cada mistura de reac o para o fundo de ampolas ou placas para PCR de 0 2 ml devidamente rotuladas Utilizando pontas de pipeta distintas adicione 2 5 ul de amostra de DNA de teste a cada uma das ampolas e coloque a tampa N o adicione DNA ampola para controlo negativo substitua por 2 5 ul de gua desionizada esterilizada Centrifugue um pouco as ampolas de PCR para recolher o conte do do fundo das ampolas Coloque firmemente as ampolas no bloco do termociclador Inicie o ciclo de etapa nica de 94 LC seguido do programa
22. as pelo kit CF EU2v1 quaisquer inser es e dele es no interior das sequ ncias alvo amplificadas podem ser detectadas atrav s da varia o do tamanho esperado do produto de amplifica o na mistura de estirpe selvagem B Estas foram tabeladas e est o dispon veis em documento parte no s tio Web da Elucigene Diagnostics www elucigene com producits S o apresentados abaixo exemplos de inser es e dele es detectadas pelo kit e do impacto que t m no perfil da mistura B F508del 1677delTA S o observados dois picos com 1 bp de intervalo na posi o 12 V520F WT nos resultados da mistura B de indiv duos heterozig ticos para as muta es F508del 1677delTaA CF2EUBYPT 002 Sep 2014 P gina 19 de 26 Elucigene CF EU2v1 Instru es de utiliza o IST delTA WT peab o E et preto came e qi O eq um r m epe ei A qe cy sm adiado i o y O i PSI R TE EET i J a V520F observado um pico de estirpe selvagem de altura reduzida na posi o 10 1677delTA WT nos resultados da mistura B de indiv duos heterozig ticos para a muta o V520F pois isto impede o iniciador 1677delTA WT de funcionar Os picos 10 e 12 desaparecem dos resultados de indiv duos homozig ticos para a muta o V520F Ee 4 1 Ta em t r eu epey lt r em ea mae m a ye reer MERE e e eee mm E a j
23. bos de microcentr fuga de tampa de rosca ampolas para PCR de 0 2 ml ou placas de microtitula o recomendadas pelo fabricante do termociclador utilizado pontas de pipeta Prepara o do DNA QlAamp DNA Mini Kit Qiagen GmbH N Cat 51304 51306 ou equivalente Electroforese de capilares padr o de tamanho GeneScan 600 LIZ N Cat ABI 4366589 padr o de tamanho GeneScan 600v2 LIZ N Cat ABI 4408399 padr o de matriz multicapilares DS 33 conjunto de corantes G5 N Cat ABI 4345833 pol mero POP 7 N Cat ABI 4352759 10x tamp o para analisador gen tico N Cat ABI 402824 e formamida Hi Di ABI Cat No 4311320 Nota Assegure se de que todos os materiais utilizados se encontram dentro do prazo de estabilidade definido pelo fabricante Equipamento necess rio Equipamento de laborat rio pipetas de precis o 2 conjuntos 1 para utilizar antes da amplifica o e 1 para depois da amplifica o vestu rio de protec o agitador v rtex microcentr fuga centr fuga de placas de microtitula o de 96 po os Amplifica o por PCR Termociclador onde caibam placas de microtitula o de 96 po os ou ampolas de 0 2 ml com exactid o m nima da temperatura de 1 C entre 33 Ce e 100 C e uniformidade da temperatura est tica de 1 C CF2EUBYPT 002 Sep 2014 P gina 7 de 26 Elucigene CF EU2v1 Instru es de utiliza o Nota O equipamento do termociclador deve ser mantido regularment
24. cep o de S549R T gt G consulte a sec o de reactividade cruzada deste documento Resumo e explica o A fibrose c stica FC a patologia autoss mica recessiva limitante mais comum entre a popula o caucasiana incid ncia da doen a de 1 3200 nados vivos nesta etnia 1 Na popula o caucasiana a frequ ncia de heterozig ticos de aproximadamente 1 25 A fibrose c stica afecta o epit lio de diversos rg os resultando numa doen a complexa e multissist mica que envolve o p ncreas ex crino os intestinos o aparelho respirat rio o aparelho genital masculino o sistema hepatobiliar e as gl ndulas sudor paras ex crinas A express o da doen a varia segundo a gravidade das muta es do CFTR 2 dos modificadores gen ticos 3 e dos factores ambientais 4 Esta gravidade varia desde morte no in cio da inf ncia em resultado de doen a pulmonar obstrutiva progressiva com broncoectasia at insufici ncia pancre tica com doen a pulmonar obstrutiva gradualmente progressiva durante a adolesc ncia e aumento da frequ ncia de hospitaliza es motivadas por doen as pulmonares no in cio da idade adulta e at sinusite e bronquite recorrentes ou infertilidade masculina no in cio da idade adulta Habitualmente o diagn stico de fibrose c stica estabelecido em indiv duos com uma ou mais caracter sticas fenot picas de CF e dados de uma anomalia na fun o do CFTR com base em um dos seguintes aspectos
25. congelar e descongelar repetidas vezes Prepara o de DNA a partir de amostras de sangue total EDTA S o obtidos resultados consistentes com o DNA extra do por meio do QlAamp 96 DNA Blood Kit ou o QlAamp DNA Mini Kit com Proteinase K seguindo o protocolo descrito no Manual QlAamp partindo de 200 ul de sangue total l quido e eluindo o em 200 ul de gua de pureza adequada a biologia molecular Prepara o de DNA a partir de gotas de sangue seco S o obtidos resultados consistentes com o DNA extra do por meio do QlAamp DNA Mini Kit seguindo o protocolo descrito no Manual QlAamp mas partindo de discos de 2 x 3 mm de uma gota de sangue seco e eluindo os em 100 ul de de gua de pureza adequada a biologia molecular Recomenda se que m todos de extrac o de DNA e tipos de amostra alternativos sejam cabalmente avaliados com o teste Elucigene CF EU2v1 antes de os resultados serem utilizados para fins de diagn stico Considera es importantes Quantidade de DNA Em condi es de PCR ideais e utilizando as defini es de injec o de amostras recomendadas consulte a nota na sec o de electroforese de capilares indicadas nos m dulos de execu o de colunas de capilares t m sido repetidamente obtidos resultados aceit veis a partir de DNA extra do utilizando os m todos atr s referidos em concentra es de 1 5 ng ul a 25 ng ul A quantifica o do DNA muito importante pelo que a concentra o de cada amostra de DNA a
26. contactando o Director de Licenciamento outlicensingOlifetech com Copyright O 2014 Delta Diagnostics UK Ltd CF2EUBYPT 002 Sep 2014 P gina 26 de 26
27. de ciclos de amplifica o Conclu do o programa de ciclos de amplifica o as amostras podem ser armazenadas durante a noite temperatura ambiente ou a 2 8 durante 7 dias no escuro at an lise por electroforese de capilares Electroforese de capilares Recomenda se que cada utilizador zele para que o equipamento de eleciroforese de capilares escolhido seja utilizado de acordo com as instru es do fabricante e seja compat vel com este teste Neste contexto os par metros principais s o o pol mero e a matriz de capilares Podem obter se os melhores resultados nas seguintes condi es de electroforese de capilares 1 Combine 6 8 ul de padr o de tamanho GS600v2 LIZ com 250 ul de formamida Hi Di e misture bem mistura suficiente para 16 po os Distribua 15 ul da mistura por cada po o de uma placa de PCR de 96 po os Adicione 3 u de produto de PCR de cada uma das amplifica es das misturas A e B para distinguir os po os que cont m o padr o de tamanho mistura de formamida da etapa 1 j distribu do na placa CF2EUBYPT 002 Sep 2014 P gina 11 de 26 Elucigene CF EU2v1 Instru es de utiliza o 3 Desnaiure o produto de PCR distribu do na placa de PCR num termociclador utilizando os seguintes par metros 94 C durante 3 minutos ligado a 4 TC durante 30 segundos 4 Centrifugue um pouco a placa para recolher o conte do no fundo das ampolas e para remover eventuais bolhas existentes nos po o
28. del 1717 1G gt A R553X 1811 1 6kbA gt G 1898 1G gt A 2184delA W846X 3272 26A gt G Y1092X 3659delC 3849 10kbC gt T S1251N e N1303K Quarenta e seis amostras de DNA representantes de todas as 50 muta es detectadas pelo kit CF EU2v1 foram amplificadas em cinco ocasi es distintas Todas as amostras deram os resultados esperados sem resultados negativos falsos ou positivos falsos demonstrando especificidade e sensibilidade cl nicas de 100 Resolu o de problemas Estas instru es de utiliza o s o disponibilizadas para garantir o melhor desempenho do ensaio Os utilizadores n o podem desviar se dos procedimentos indicados Qualquer desvio pode resultar num desempenho de n vel inferior e originar dados de baixa qualidade Mediante pedido a Elucigene Diagnostics disponibiliza um Guia de resolu o de problemas e fornece exemplos e solu es para algumas das observa es mais comuns com o Elucigene CF EU2vi1 incluindo Sem picos de diagn stico ou STR Picos de diagn stico ou STR fracos Picos demasiado altos breakthrough peaks picos de fundo excessivos Picos n o marcados Picos FAM mutantes fracos Perfil da mistura A desequilibrado Perfil da mistura B desequilibrado Picos divididos no perfil da mistura B Para obter uma c pia do Guia de resolu o de problemas do Elucigene CF EU2v1 queira contactar o nosso grupo de assist ncia t cnica T 44 0 161 669 8122 F 44 0 161 669 8129 E enquirieseluci
29. e assegure se de que foi atribu do o protocolo do instrumento correcto para CF EU2v1 ver acima Defini o da ficha de amostras para o GeneMarker O software GeneMarker permite a compara o directa entre dados A e B do mesmo indiv duo Para que tal possa ser feito facilmente importante que a atribui o de nomes aos ficheiros de dados de sa da n o tratados fsa seja coerente em todas as amostras e misturas A ficha de amostras deve conter o nome nico da amostra para cada amostra a testar adicionando se o sufixo A ou B consoante a mistura testada Caso se pretenda incluir a identifica o da placa no nome do fsa deve utilizar se sempre um formato fixo p ex CFEU2 DDMMAAAA No instrumento 3130 os par metros do Results Destination Destino dos resultados devem ser definidos de modo a que o nome da amostra seja inclu do no nome do ficheiro fsa p ex CFEU2 DDMMAAAA 1234 5 A A01 CF2EUBYPT 002 Sep 2014 P gina 14 de 26 Elucigene CF EU2v1 Instru es de utiliza o NM Results Group Editor Sample File Name Format Example 123456789 Sample3 412 sex Filename is greater than 13 characters Prefix Name Delimiter _ mem Plate ID E sample Name E well Position Suffix File Extension None gt Run Folder Name Format Example PiDiagnostics DevelopmentiDiag Dev 3100 ProjectsiCF HNCF UK3130 runsisinstr Prefix Name Delimiter _ em
30. e obedecendo s instru es do fabricante e calibrado de forma a garantir a exactid o dos ciclos de PCR e um desempenho ideal O ensaio Elucigene CF EU2v1 foi desenvolvido em termocicladores Applied Biosystems 9700 Outras marcas e modelos dever o ser cabalmente testados e avaliados pelo utilizador para verificar se o seu desempenho o ideal antes de os resultados relativos ao CF EU2v1 serem lan ados Eleciroforese de capilares analisador gen tico ABI 3130 3500 com software de an lise de fragmentos GeneMapper matriz de capilares de 36 cm ou 50 cm ABI3500 placas pticas de 96 po os septos de 96 po os cassetes de 96 po os Nota O equipamento de electroforese de capilares deve ser mantido regularmente obedecendo s instru es do fabricante e calibrado de forma a garantir um desempenho ideal Colheita e armazenamento de amostras Efectuou se a avalia o de sangue total EDTA e gotas de sangue seco quanto sua compatibilidade com este teste H relatos de alguns casos em que dispositivos de colheita de amostras afectaram a integridade de determinados analitos e podem interferir com as tecnologias de alguns m todos 9 Recomenda se que cada utilizador zele para que o dispositivo escolhido seja utilizado de acordo com as instru es do fabricante e que os dispositivos de colheita de amostras sejam compat veis com este teste As amostras de sangue devem ser armazenadas a 20 C antes da prepara o do DNA Evite
31. era es importantes Qualidade do DNA O CF EU2vi um ensaio altamente multifacetado e requer uma amplifica o por PCR eficiente para funcionar da melhor forma A qualidade do DNA pode determinar a efici ncia do processo de PCR Os inibidores extra dos concomitantemente com a amostra de DNA podem resultar numa amplifica o insuficiente originando picos fracos e mal equilibrados A Elucigene Diagnostics validou a utiliza o do QlAamp 96 DNA Blood Kit e do QlAamp DNA Mini Kit QIAGEN GmbH com o kit CF EU2v1 Outros kits ou m todos de extrac o de DNA devem ser validados e optimizados para a utiliza o com o CF EU2v1 Nota Consulte o Guia de resolu o de problemas do Elucigene CF EU2v1 para mais informa es CF2EUBYPT 002 Sep 2014 P gina 9 de 26 Elucigene CF EU2v1 Instru es de utiliza o Protocolo do ensaio Controlo da contamina o da PCR O processo de PCR gera um grande n mero de produtos amplificados produtos de amplifica o e acarreta um risco elevado de contamina o que pode falsear os resultados A contamina o pode provir de duas fontes Contamina o cruzada contamina o da amostra com material n o amplificado que provenha do ambiente ou de outras amostras que contenham a sequ ncia alvo Contamina o do produto final contamina o da amostra com produtos de amplifica o de PCR pr vias levando amplifica o dos produtos de amplifica o tanto do alvo como dos conta
32. escritas apenas num doente e ou fam lia As an lises de rotina de todas as muta es poss veis n o s o exequ veis nem rent veis estando assim confinadas an lise das muta es mais comuns O CF EU2v1 um kit de testes da fibrose c stica concebido especificamente para analisar as muta es mais comuns nas popula es de origem europeia No total o ensaio identifica 50 muta es e analisa ainda o segmento poli T do intr o 9 atrav s da determina o exacta da repeti o de TG adjacente O segmento polim rfico de timidina que se encontra na jun o entre o intr o 9 e o ex o 10 influencia a transcri o O n mero de res duos de timidina 5T 7T ou 9T afecta a efici ncia de splicing do ex o 10 se estiver presente o alelo 5T estar ausente uma propor o dos produtos da transcri o do ex o 10 que resulta em prote nas n o funcionais e sintomas de CF vari veis H relatos de que o n mero de repeti es de TG na extremidade 5 do segmento de politimidina pode tamb m influenciar o splicing to ex o 10 7 Se presentes no mesmo alelo da variante 5T quanto maior for o n mero de repeti es de TG maior a propor o de produtos de transcri o do CFTR que n o possuem o ex o 10 O n mero de repeti es de TG pode ser determinado utilizando o CF EU2v1 medindo os picos dos produtos de amplifica o de 5T Princ pios do procedimento O m todo utilizado pelo kit Elucigene CF EU2v1 utiliza uma tecnologia de sistema
33. gene com E techsupport Delucigene com Limita es do procedimento 1 Os resultados obtidos com este ou com qualquer outro teste de diagn stico devem ser utilizados e interpretados apenas no contexto do quadro cl nico global A Elucigene Diagnostics n o respons vel por quaisquer decis es cl nicas que sejam tomadas 2 A aus ncia de detec o de muta es por este kit n o constitui garantia de que n o estejam presentes outras muta es do gene CFTR E poss vel a exist ncia de outras muta es n o detectadas por este kit 3 As muta es variam de frequ ncia entre popula es diferentes Os dados de frequ ncia das muta es nas popula es est o dispon veis no The Cystic Fibrosis Genetic Analysis Consortium 6 O utilizador deste kit deve salientar estes aspectos quando reporta os resultados ao m dico que efectua o diagn stico respons vel pelo aconselhamento gen tico CF2EUBYPT 002 Sep 2014 P gina 24 de 26 Elucigene CF EU2v1 Instru es de utiliza o Exonera o de responsabilidade Os resultados deste e de outros ensaios de diagn stico devem ser interpretados em conjunto com outros dados laboratoriais e cl nicos de que o m dico disponha Estes reagentes Elucigene s o fornecidos para fins de diagn stico in vitro Pode encontrar mais pormenores sobre a interpreta o dos dados nos procedimentos do Guia de an lise do software do Elucigene CF EU2v1 www elucigene com products CF2EUB
34. minantes Os laborat rios que realizam PCR devem estar cientes destas fontes de contamina o e implementar procedimentos que reduzam significativamente o risco de contamina o Os m todos para controlar a contamina o est o bem documentados 10 e incluem a concep o f sica dos laborat rios o fluxo de trabalho os procedimentos de manuseamento de amostras e as abordagens qu micas e enzim ticas E essencial seguir procedimentos de laborat rios bons e bem definidos para controlar a contamina o da PCR devendo estes ser implementados antes da an lise de amostras cl nicas Procedimento de amplifica o Nota Para minimizar o risco de contamina o as etapas 3 5 t m de ser realizadas numa rea isenta de produtos de PCR de prefer ncia numa c mara de fluxo laminar 1 Programe o termociclador para um ciclo de etapa nica para activar o HoiStart Tag a 94 durante 20 minutos ligado a um programa de ciclos de amplifica o de 1 minuto a 94 LC desnatura o 2 minutos a 58 hibrida o e 1 minuto a 72 C extens o para 30 ciclos Este deve estar ligado a um ficheiro de tempo de atraso de 20 minutos a 72 LC extens o no ciclo final necess rio incluir se um controlo negativo em cada execu o de PCR 3 Descongele as misturas de iniciadores e a mistura principal para PCR e centrifugue um pouco para recolher o conte do do fundo das ampolas Agite suavemente no v rtex para misturar e volte a centrifug
35. presen a de duas muta es causadoras de doen a no gene CFTR ou dois valores quantitativos anormais de cloro na iontoforese da transpira o estimulada pela pilocarpina gt 60 mEq l ou determina es da diferen a de potencial nasal transepitelial NPD caracter sticas de CF A taxa de detec o da muta o CFTR varia segundo o m todo anal tico e a heran a tnica Em alguns indiv duos sintom ticos apenas se detecta uma ou nenhuma muta o causadora de doen a em alguns portadores a muta o causadora de doen a n o detect vel CF2EUBYPT 002 Sep 2014 P gina 3 de 26 Elucigene CF EU2v1 Instru es de utiliza o As doen as relacionadas com o CFTR s o transmitidas de forma autoss mica recessiva Irm os de um probando com fibrose c stica t m uma probabilidade de 25 de estarem afectados uma probabilidade de 50 de serem portadores assintom ticos e uma probabilidade de 25 de n o serem afectados e n o portadores Os testes de gen tica molecular de muta es causadoras de doen a s no gene CFTR s o utilizados para a detec o de portadores em programas de rastreio na popula o Existem testes pr natais para gravidezes com maior risco de sofrer anomalias relacionadas com o CFTR se forem conhecidas muta es causadoras de doen a na fam lia Desde a descoberta do gene CFTR em 1989 5 foram descritas mais de 1700 muta es e variantes do gene 6 Muitas destas muta es s o privadas tendo sido d
36. ragmentos CF2EUBYPT 002 Sep 2014 P gina 15 de 26 Elucigene CF EU2v1 Instru es de utiliza o O Guia do software de an lise do Elucigene CF EU2v1 apresenta mais orienta es detalhadas acerca das defini es do software da an lise e a interpreta o O s tio Web da Elucigene Diagnostics disponibiliza procedimentos do Guia do software de an lise para os softwares GeneMapper e para o GeneMarker www elucigene com producis Os resultados da mistura A mutante determinam se um indiv duo portador de alguma muta o o que mostrado pela presen a de um pico azul A mistura mutante cont m tamb m iniciadores do alelo normal F508 pelo que esta mistura consegue determinar se um indiv duo apresenta F508 normal apenas pico verde se homozig tico para o mutante F508del apenas pico azul ou se heterozig tico para F508del pico azul e pico verde Se for observada qualquer outra muta o os resultados da mistura B estirpe selvagem podem ser analisados para determinar se a mistura homozig tica ou heterozig tica A presen a de um pico verde para um determinado alelo na mistura de estirpe selvagem indica que o indiv duo heterozig tico e a aus ncia de um pico verde indica que homozig tico para aquela muta o em particular S o inclu dos marcadores STR hipervari veis vermelhos em ambas as misturas Isto permite a compara o entre a amostra amplificada com a mistura mutante e a amostra amplific
37. s e introduza a imediatamente no analisador gen tico Nota As defini es de injec o de amostras podem ser modificadas consoante a quantidade de produto de amplifica o produzido durante a PCR que pode variar devido quantidade de DNA gen mico inicialmente introduzida Pode aplicar se menos produto de amplifica o coluna para an lise reduzindo o tempo ou a tens o de injec o Inversamente pode aplicar se mais produto de amplifica o coluna para an lise aumentando o tempo ou a tens o de injec o Amostras previamente amplificadas podem ser reinjectadas diversas vezes para rean lise consulte o Guia de resolu o de problemas do Elucigene CF EU2v1 para mais Informa es CF2EUBYPT 002 Sep 2014 P gina 12 de 26 Elucigene CF EU2v1 Instru es de utiliza o Instrumentos ABI 3130 necess rio criar um m dulo de execu o e um protocolo para CF EU2 que podem depois ser utilizados em cada execu o de CF EU2 Crie o m dulo execu o de CF EU2 no Module Manager gestor de m dulos do software do software de recolha de dados 3130 Certifique se de que s o seleccionadas as seguintes caracter sticas e Type Tipo regular e Template Modelo FragmentAnalysis36 POP7 e Insira as defini es descritas na tabela abaixo M dulo de capilares de 36 cm Nome do par metro Valor Intervalo 1 Oven Temperature Temperatura da estufa 60 int 18 65 C 2 Poly_Fill_Vol Vol_Ench_Poli 6500 6500
38. strumento ver acima Nota Para mais informa es acerca da configura o opera o e resolu o de problemas do instrumento queira consultar o Manual de utiliza o do analisador gen tico 3130 da Applied Biosystems Instrumentos ABI 3500 necess rio criar um Instrument Protocol protocolo do instrumento para CF EU2 que pode depois ser utilizado em cada execu o do CF EU2v1 CF2EUBYPT 002 Sep 2014 P gina 13 de 26 Elucigene CF EU2v1 Instru es de utiliza o Crie o instrument Protocol protocolo do instrumento para CF EU2 atrav s da biblioteca de protocolos do instrumento 3500 Certifique se de que s o seleccionadas as seguintes caracter sticas e Run Module M dulo de execu o FragmeniAnalysisdO POP7 e Insira as defini es descritas na imagem abaixo E Eder bmtrument Protocol CREU tem Setup on instrument Protocol 4 i pplicabdon Type Fragment Csplav length SE cm Payme POP gt Iye Yet G5 hd instmamernt Protocol f operties kam Module Fragment nah sni PoP Piot IN CEE D npt Temi R tag h f tage E Val ES Iye itay h kk Run Tene hec LIM Prefun Time Cues A Inpectian Tune he U Data Delay re Ade amd paris Aumente o tempo de injec o para 36 segundos para a an lise de DNA extra do de gotas de sangue seco Para executar as amostras crie uma placa de amostras clicando em Create Plate from Template criar placa a partir de modelo no Dashboard painel

Elucigene® CF-EU2v1 Instruções de utilização

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