Home

Derivados de aa como ligandos em AC para

1. o das condi es de fermenta o processos upstream crescimento celular e finalmente o isolamento e purifica o processos downstream figura 5 Processos upstream Fermenta o Processos downstream Constru o do vactor Lise celular Selac o da cadeia 7 qua Va O gt Purifica o o VO J Optimiza o do meio On DNA plasmidico ts 29O superentolado puro Figura 5 As duas fases do processo de desenvolvimento do pDNA Adaptado de Prazeres et al 2000 Estas 2 etapas do processo upstream e downstream s o integradas n o devendo ser abordadas individualmente 61 No entanto a optimiza o de cada passo pode ser realizada com vista ao melhoramento do processo global Um processo fermentativo t pico conduz geralmente a uma solu o aquosa dilu da contendo gua como componente principal 80 100 produto s 0 20 subprodutos 0 10 nutrientes residuais 0 5 e biomassa 0 5 O produto de interesse pode encontrar se na solu o aquosa produtos extracelulares ou no interior da c lula produtos intracelulares A localiza o do produto influencia a selec o do processo de isolamento e purifica o Por outro lado consoante a aplica o a que se destinam os bioprodutos e o grau de pureza pretendido as fases de fermenta o e de purifica o t m pesos significativamente diferentes no c
2. o recolhida usando 150 mM de NaCl do ensaio B 3 Frac o recolhida usando 100 mM de NaCl do ensaio C Apesar do pDNA ser uma mol cula poliani nica e do car cter positivo da arginina poder antecipar a presen a de interac es electrost ticas estas n o ocorrem com intensidade suficiente para promover a liga o do pDNA coluna Ao aplicar 120 mM de NaCl constata se que o pDNA elui totalmente figura 28 A linha 1 Nesta concentra o o pDNA permanece retido nas matrizes referidas anteriormente arginina Sepharose e steres met lico et lico e but lico da arginina Sepharose Deste modo foi ainda testada uma concentra o inferior de 80 mM de NaCl e verificou se que j houve interac o do pDNA com a coluna figura 28 B eluindo a 150 mM de NaCl 52 QD foe linha 2 Efectuaram se v rios ensaios e verificou se que nesta matriz o pDNA fica retido a 80 mM de NaCl eluindo a 100 mM de NaCl figura 28 C linha 3 revelando o enfraquecimento da interac o na presen a de ligandos mais complexos Ester octilico da arginina Sepharose A matriz de ster oct lico da arginina Sepharose que est representada na figura 29 a matriz que apresenta o ligando de maior comprimento da cadeia Foi obtida pela liga o da arginina octil esterificada Sepharose pelo bis ep xido E E i s oA N NNN P OH a E ne o i o o A SNA Ngy R o ol HN s yr NH E HN ster oct lico d
3. 2002 Liposomal delivery of nucleic acids in vivo DNA and Cell Biol vol 21 pp 857 867 28 Tomlinson E Rolland A P 1996 Controllable gene therapy Pharmaceutics of non viral gene delivery systems J Control Release vol 39 pp 357 372 29 Anderson W F 1998 Human gene therapy Nature vol 392 pp 25 30 30 Luo D Saltzman W M 2000 Synthetic DNA delivery systems Nat Biotechnol vol 18 pp 33 37 31 Schroder A R Shinn P Chen H Berry C Ecker J R Bushman F 2002 HIV 1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots Cell vol 110 pp 521 529 32 Nakai H Montini E Fuess S Storm T A Grompe M Kay M A 2003 AAV serotype 2 vectors preferentially integrate into active genes in mice Nat Genet vol 34 pp 297 302 33 Mountain A 2000 Gene therapy the first decade Trends Biotechnol vol 18 pp 119 128 34 Prazeres D M F Monteiro G A Ferreira G N M Diogo M M Ribeiro S C Cabral J M S El Gewely M R 2001 Biotechnol Annual Review Elsevier Amsterdam p 1 35 Chattergoon M Boyer J Weiner D 1997 Genetic immunization a new era in vaccines and immune therapeutics FASEB vol 11 pp 753 63 36 Wolf J Malone R Williams P Chong W Acsadi G Jani A 1990 Direct gene transfer into mouse muscle in vitro Science vol 247 pp 1465 1468 37 Danko I Wolff J 199
4. facilmente aplic vel em grande escala mas como desvantagem apresenta o problema da toxicidade Algumas enzimas podem ser usadas para a digest o da parede celular expondo a membrana ruptura por processos f sicos A sua utiliza o 11 comprometida pelo seu elevado custo pela impossibilidade de reciclagem num processo de separa o industrial e pela possibilidade de contamina o do produto final com actividade enzim tica residual A selec o do m todo mais adequado para romper a parede celular de uma dada c lula depende de v rios factores 75 1 Tipo de c lula bact rias leveduras fungos c lulas animais e vegetais 2 Localiza o do produto intracelular 3 Aplica o pretendida para o produto 4 Sensibilidade do produto temperatura e s for as de tens o de corte 5 Facilidade de recupera o do produto dos segmentos celulares 6 Simplicidade do m todo e custos de opera o 7 Quantidade de c lulas a processar A escolha do m todo de desintegra o mais adequado tem um efeito marcante n o s no rendimento como tamb m nos passos posteriores Assim neste passo desej vel uma desintegra o completa da c lula e simultaneamente a obten o de rendimentos e integridade do produto elevadas 62 63 76 77 Neste passo de desintegra o todos os componentes intracelulares s o libertados incluindo pDNA RNA gDNA endotoxinas e prote nas Esta liberta o e recupera o de grandes
5. o 64 65 73 Alguns factores devem ser tamb m controlados de forma a induzir o m nimo stress poss vel durante o crescimento de forma a garantir a manuten o do plasm deo na sua conforma o activa a conforma o sc 1 5 Desintegra o celular Embora alguns produtos biol gicos sejam secretados pela c lula ou libertados durante a sua aut lise muitos outros entre eles vacinas prote nas terap uticas e enzimas requerem a ruptura da c lula hospedeira para libertar o produto desejado Deste modo a ruptura celular assume grande import ncia por ser um dos primeiros passos do isolamento e purifica o de bioprodutos intracelulares sendo crucial a forma como se obt m o produto Este pode ser obtido por tratamento mec nico qu mico f sico qu mico ou enzim tico da parede e da membrana celular Os m todos de ruptura mec nicos relacionam se com a aplica o de tens es de corte entre a c lula e o meio l quido ou entre a c lula e um corpo s lido No primeiro caso a ruptura obtida por colis o cavita o ou impacto a alta velocidade No segundo caso por agita o intensa com pequenos corpos s lidos ex moinho de bolas 74 O tratamento qu mico visa a dissolu o ou fragiliza o da parede celular Apresenta como inconvenientes o custo dos reagentes usados a toxicidade dos mesmos e a dificuldade na sua recupera o reciclagem O tratamento com hidr xido de s dio constitui uma alternativa econ mica de lise
6. Doran P M 1999 Bioprocess Engineering Principles Academic Press New York pp 218 253 63 Goldberg E 1997 Handbook of Downstream Processing Chapman amp Hall 64 Swartz J 1996 Escherichia coli recombinant DNA technology In Neidhardt F editor Escherichia coli and Salmonella Cellular and molecular biology Washington DC ASM Press pp 1693 711 65 Swartz J 2001 Advances in Escherichia coli production of therapeutic proteins Curr Opin Biotechnol vol 12 pp 195 201 66 Riesenber D 1991 High cell density cultivation of Escherichia coli Curr Opin Biotechnol vol 2 pp 380 384 67 Zabriskie D Arcuri E 1986 Factors influencing the productivity of fermentations employing recombinat microorganisms Enz microbial Technol vol 8 pp 706 717 68 Yee L Blanch H W 1992 Recombinant protein expression in high cell density fed batch cultures of Escherichia coli Biotechnol NY vol 10 pp 1550 1556 69 Lee S Y 1996 High cell density culture of Escherichia coli Trends Biotechnol vol 14 pp 98 105 70 Pan J Rhee J Lebeault J 1987 Physiological constraints in increasing biomass concentration of Escherichia coli B in fed batch culture Biotechnol Lett vol 9 pp 89 94 81 71 Luli G W Strohl W R 1990 Comparison of growth acetate production and acetate inhibition of Escherichia coli strains in batch and fed batch fermentations App
7. E editors vol 1 122 Platonova G A Tennikova T B 2005 Chromatographic investigation of macromolecular affinity interactions J Chromatogr A vol 1065 pp 75 81 123 Han Y Forde G M 2008 Single step purification of plasmid DNA using peptide ligand affinity chromatography J Chromatogr B vol 874 pp 21 26 86 124 Boto R E F 2007 Synthesis and Characterization of Carboxycarbocyanines and Their Application as Ligands in Dye Affinity Chromatography for Protein Purification Tese de Doutoramento Universidade da Beira Interior Covilh 125 Pardal A C 2009 Cianinas como Ligandos para a Purifica o de Prote nas por Cromatografia de Afinidade Mestrado em Qu mica Universidade da Beira interior Covilh 126 Schluep T Cooney C L 1998 Purification of plasmid DNA by triplex affinity interactions Nucleic Acids Res vol 26 pp 4524 4528 127 Wils P Escriou V Warnery A Lacroix F Lagneaux D Ollivier M Crouzet J Mayaux J F Scherman D 1997 Efficient purification of plasmid DNA for gene transfer using triple helix affinity chromatography Gene Therapy vol 4 pp 323 330 128 Danquah M K Forde G M 2007 The suitability of DEAE CI active groups on customized poly GMA co EDMA continuous stationary phase for fast enzyme free isolation of plasmid DNA J Chromatogr B vol 853 pp 38 46 129 Frydlov J Kucerova Z Ticha M
8. Global clinical trials e Clinical Trials Using ONA 8 6 t4 2 504 Clinicals Trials Using 0 r r r r r r 0 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 Figura 2 O interesse crescente do pDNA como vector de escolha para ensaios de terapia g nica Adaptado de Ulmer et al 1996 A acentua o da aplica o de pDNA em ensaios pr cl nicos e cl nicos de terapia g nica e vacinas de DNA est na base do aumento da necessidade de obter grandes quantidades de pDNA com elevado grau de pureza 41 42 de acordo com as exig ncias das ag ncias reguladoras como o Food and Drug Administration FDA e European Medical Agencies EMEA 41 43 O pDNA destinado aplica o terap utica deve ser essencialmente puro sem vest gios de DNA gen mico gDNA cido ribonucleico RNA endotoxinas e prote nas do hospedeiro 21 Al m disso o plasm deo deve estar preferencialmente na forma topoisom rica superenrolada sc que um produto mais eficaz para a transfec o de c lulas alvo e na express o gen tica do que as isoformas circular aberta oc linear multim ricas ou parcialmente desnaturadas 21 44 45 Esta conforma o influencia processos fundamentais que ocorrem nas c lulas como a replica o do DNA recombina o e transcri o 46 49 uma vez que possui elevadas quantidades de energia livre de Gibbs G que usada nas reac es biol gicas Esta conforma o plasm dica apresen
9. Industrial scale production of plasmid DNA for vaccine and gene theraphy plasmid design production and purification Enzyme Microb Technol vol 33 pp 865 883 9 Stadler J Lemmens R Nyhammar T 2004 Plasmid DNA purification J Gene Med vol 6 pp 54 66 10 Diogo M M Queiroz J A Prazeres D M F 2005 Chromatography of plasmid DNA J Chromatogr A vol 1069 pp 3 22 11 Liu M A 2003 DNA vaccines a review J Int Med vol 253 pp 402 410 12 US FDA 1996 Points to Consider on Plasmid DNA Vaccines for Preventive Infectious Disease Indications US Food and Drug Administration Rockville MD 13 WHO Guidelines for Assuring the Quality of DNA vaccines 1998 Biologicals vol 26 pp 205 212 14 Cichutek K 2000 DNA vaccines development standardization and regulation Intervirology vol 43 pp 331 338 76 15 Robertson J S Cichutek K 2000 European Union Guidance on the quality safety and efficacy DNA vaccines and regulatory requirements Dev Biol vol 104 pp 53 56 16 Falk L A Ball L K 2001 Current status and future trends in vaccine regulation USA Vaccine vol 19 pp 1567 1572 17 Smith H A 1994 Regulatory considerations for nucleic acid vaccines Vaccine vol 12 pp 1515 1519 18 Smith H A 2000 Regulatory and reviews of DNA vaccine products Dev Biol vol 104 pp 57 62 19 Smith H A 2001 The regulation of
10. Posteriormente incubaram se os tubos temperatura ambiente durante 5 minutos e adicionaram se 2 5 mL de tamp o P3 tabela 4 Homogeneizaram se os tubos invertendo os cuidadosamente 4 6 vezes e posteriormente colocaram se no gelo durante 20 minutos O lisado obtido foi clarificado por centrifuga o durante 30 minutos a 10500 rpm e a 4 C e o sobrenadante resultante foi transferido para novos tubos de centrifuga Recentrifugou se novamente o lisado durante 15 minutos mesma velocidade e temperatura com o objectivo de se obter uma solu o clarificada Para proceder a uma pr purifica o do pDNA preparou se uma coluna ani nica e equilibrou se adicionando 10 mL de tamp o QBT tabela 4 Ap s centrifuga o adicionou se o sobrenadante directamente na coluna e esta foi lavada duas vezes com 30 mL de tamp o QC tabela 4 Posteriormente colocou se um tubo de centrifuga no gelo e eluiu se o pDNA adicionando 15 mL de tamp o QF tabela 4 34 Tabela 4 Composi o dos tamp es utilizados na lise celular pene 50 mM Tris HCl pH 8 0 P1 Tamp o de 2 8 C ap s a adi o de 10 mM EDTA ressuspens o RNase A 100 ug mL RNase A 200 mM NaOH 1 SDS P2 Tamp o lise 15 25 C w v P3 Tamp o de 3 0 M acetato de pot ssio 15 25 C ou 2 8 C neutraliza o pH 5 5 750 mM NaCl Na 15 25 C equilibrio 15 isopropanol v v 0 15 Triton X 100 v v 1 0 M NaCl QC Tamp o de lavagem 50 mM MOPS pH 7 0 15
11. Sepharose O estudo foi iniciado usando as mesmas condi es referidas na figura 20 A 47 Ester metiico da arginina Sepharose 14 16 18 yaw D end nomeadamente 120 mM 300 mM e 500 mM de NaCl com o intuito de verificar se as matrizes se comportam de maneira semelhante ou se a introdu o do grupo ster met lico influencia a reten o Ao utilizar estas condi es verificou se que apesar de em ambas as matrizes o pDNA eluir a 300 mM de NaCl observa se uma maior reten o do pDNA com a matriz de ster met lico da arginina Sepharose figura 22 A do que somente com a arginina Sepharose figura 20 A Como se pode constatar pela figura 22 A o pDNA ficou retido a 120 mM de NaCl eluindo uma frac o a 300 mM de NaCl linha 1 e uma segunda frac o a 500 mM de NaCl linha 2 Com a realiza o deste ensaio verifica se ainda que a frac o mais retida que elui a 500 mM de NaCl se apresenta quase totalmente na conforma o superenrolada o que sugere uma interac o preferencial da matriz com esta isoforma A concentra o de sal inicial foi aumentada para 250 mM de NaCl figura 22 B e verificou se que o plasm deo tamb m ficou retido nestas condi es eluindo a 500 mM de NaCl linha 3 e na figura 22 C est representada a concentra o m nima que promove a elui o total do pDNA linha 4 Pode se ent o concluir que usando esta matriz o pDNA fica retido a 250 mM de NaCl e elui a 400 mM de NaCl Compar
12. es para fins cromatogr ficos requer que o 140 met lico seja imobilizado num suporte insol vel Esta imobiliza o pode ser efectuada ligando um grupo quelante matriz cromatogr fica Existem v rios agentes quelantes usados no IMAC sendo o cido iminodiac tico IDA o mais utilizado Este composto pode ser acoplado a v rias matrizes cromatogr ficas nomeadamente a Sepharose 6B Sepharose 4B ou Sephadex G 100 atrav s de um longo bra o espa ador hidr filo 136 A cromatografia de afinidade com metal imobilizado foi recentemente aplicada para a purifica o do pDNA utilizando uma resina do IDA carregada com Cu 137 Foi citado que as matrizes de IMAC foram capazes de adsorver selectivamente cidos nucleicos de cadeia simples atrav s de interac es de ides met licos com bases azotadas 137 especialmente as que est o presentes nas purinas adenina e guanina 138 enquanto que o pDNA e gDNA mostraram baixa afinidade de liga o para a IMAC 137 Segundo v rios estudos este tipo de cromatografia tem viabilidade para purificar pDNA directamente a partir de um lisado celular alcalino 139 Tan e colaboradores 2007 revelaram que a cromatografia de afinidade com metal imobilizado em particular Cu IDA e Ni IDA altamente eficiente na remo o directa de RNA e endotoxinas do lisado celular 137 A inacessibilidade das bases azotadas arom ticas do pDNA imobilizado em i es met licos dificulta a sua interac o
13. es terap uticas da isoforma sc assim purificada Deste modo ap s estabelecidas as condi es de reten o para cada matriz utilizada procedeu se tentativa de separa o das diferentes isoformas do pDNA nas matrizes que 57 Aboeorvinch 260 camp permitem alguma manipula o da concentra o de sal na gama estabelecida para a reten o e elui o do pDNA Arginina Sepharose A capacidade da arginina como ligando imobilizado na cromatografia de afinidade foi recentemente demonstrada na separa o das isoformas oc e sc do pDNA revelando a presen a de uma interac o espec fica com o plasm deo e um reconhecimento especial da isoforma sc 154 Ap s a liga o do pDNA matriz de arginina a elui o realizou se usando um aumento do gradiente de NaCl ou por adi o de um tamp o suplementado com a arginina 162 Ap s se terem realizado os ensaios preliminares descritos anteriormente para verificar quais as condi es que favoreciam a liga o e elui o do pDNA e sabendo que na matriz de arginina Sepharose o pDNA ficou retido a 150 mM de NaCl eluindo a 200 mM do mesmo sal realizaram se ensaios nessa gama com o intuito de tentar separar as isoformas do pDNA explorando a possibilidade de uma interac o selectiva com alguma destas formas E Gam hawn ADSON IA LIDU TUNI o A A w trend focal Absorvincia 260 van Frac es recolhidas Fracg Ses scolhitas Figura 33 Perfil
14. oc sc utilizando um suporte de ster et lico da arginina Sepharose com as respectivas electroforeses em Pel de dparose a Tos up sgnissosfnlba derme a R Galena ps pagina dis A de qa banged 49 Figura 25 Representa o esquem tica da matriz de ster but lico da arginina DEDRAPOSES iranianos Ri Ed NENS 50 Figura 26 Perfil cromatogr fico obtido ap s injec o de pDNA oc sc utilizando um suporte de ster but lico da arginina Sepharose com as respectivas electroforeses em gel deagarose a O gs nda E Lg IS SE da fa DER aE 51 Figura 27 Representa o esquem tica da matriz de ster hex lico da arginina DEDHALOSC ra ea as a oo SD E ROS O S E Ria RD MO a 52 Figura 28 Perfil cromatogr fico obtido ap s injec o de pDNA oc sc utilizando um suporte de ster hex lico da arginina Sepharose com as respectivas electroforeses em gel de dsarose a O vs devas bb A E ah ed ewes eae vanes 52 Figura 29 Representa o esquem tica da matriz de ster oct lico da arginina SCPMALONG ce a e na eee yaa pe o da ps E rs nd 53 Figura 30 Perfil cromatogr fico obtido ap s injec o de pDNA oc sc utilizando um suporte de ster oct lico da arginina Sepharose com as respectivas electroforeses em seldeagarose a O a E E a ease aoe 53 Figura 31 Perfil cromatogr fico obtido ap s injec o de pDNA oc sc utilizando um suporte de ster hex lico da arginina Sepharose com as
15. pp 1 8 105 Georgiou G Segatori L 2005 Preparative expression of secreted proteins in bacteria status report and future prospects Curr Opin Biotechnol vol 16 pp 538 545 106 Carvin J 1991 Giddings Unified Separation Science A Wiley Interscience Pub John amp Sons Inc New York 107 Huber C G 1998 Micropellicular stationary phases for high performance liquid chromatography of double stranded DNA J Chromatogr A vol 806 pp 3 30 108 Lyddiatt A O Sullivan D 1998 Biochemical recovery and purification of gene teraphy vectors Biochemical Eng vol 9 pp 177 185 109 Eon Duval A Burke G 2004 Purification of pharmaceutical grade plasmid DNA by anion exchange chromatography in an RNase free process J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci vol 804 pp 327 335 110 Prazeres D M F Schluep T Cooney C 1998 Preparative purification of supercoiled plasmid DNA using anion exchange chromatography J Chromatogr A vol 806 pp 31 45 111 Yamakawa H Higashino K i Ohara O 1996 Sequence Dependent DNA Separation by Anion Exchange High performance Liquid Chromatography Anal Biochem vol 240 pp 242 250 112 Lahijani R Hulley G Soriano G Horn N A M 1996 High yield production of pBR322 derived plasmids intended for human gene therapy by employing a temperature controllable point mutation Hum Gene Ther vol 7 pp 197
16. propriedades moleculares da natureza f sico qu micas e termodin micas das biomol culas 130 131 Uma matriz dever apresentar grupos funcionais superficie hidroxilo carboxilo amida etc para uma melhor derivatiza o e imobiliza o dos ligandos ter adsor es n o espec ficas muito reduzidas ser preferencialmente hidrof lica para reduzir as adsor es n o espec ficas e para permitir o uso de meios aquosos ser est vel f sica e quimicamente sob uma grande variedade de condi es como pH temperatura e solventes ser facilmente empacot vel na coluna e ser altamente porosa de modo a permitir quantidades elevadas de imobiliza o de ligandos aumentando deste modo a capacidade de adsor o Os poros devem ser largos uma vez que na maioria dos casos tanto os ligandos como as mol culas a separar s o de tamanho grande 82 125 Se o tamanho dos poros da matriz for demasiado pequeno a liga o do pDNA ser restrito devido falta de acessibilidade dos ligandos na matriz 45 128 Utilizando condi es de imobiliza o e ligandos adequados obt m se separa es superiores s obtidas por cromatografia de fase reversa ou troca i nica A interac o bioespecifica permite isolar um componente a partir de solu es muito dilu das e misturas complexas 5 O seu uso tem vantagem particularmente na purifica o de prote nas terap uticas permitindo um grau de pureza elevado num n mero reduzido de passos e rendiment
17. 0 o 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Frac es ecolhidas Frac es recolhidas Figura 40 Perfil cromatogr fico obtido ap s injec o de pDNA oc sc utilizando um suporte de histidina Sepharose com a respectiva electroforese em gel de agarose a 1 P Amostra de pDNA injectado na coluna 1 Frac o recolhida usando 2 3 M de NH SO do ensaio A 2 Frac o recolhida usando 2 0 M de NH4 2SO do ensaio B Com se pode visualizar pelo cromatograma da figura 40 A n o h interac o do pDNA com esta matriz uma vez que o pDNA eluiu logo a 2 3 M de NH4 SO linha 1 Deste modo aumentou se a concentra o de sal para 3 0 M de NH SO para compreender a reten o figura 40 B e verificou se que houve liga o total do pDNA para as concentra es mais altas de sal nomeadamente 3 0 M e 2 5 M sendo que a sua elui o s ocorreu com a aplica o da concentra o de 2 0 M de NH SO4 Pode se concluir atrav s da an lise destes perfis cromatogr ficos que o aumento da concentra o de sal favorece as liga es entre o pDNA e a matriz de histidina sendo poss vel a reten o do pDNA na coluna Quando se diminui a for a i nica para 2 0 M o pDNA eluiu indiferenciadamente linha 2 ocorrendo uma diminui o da intensidade das interac es Segundo estudos at micos foi recentemente demonstrado que determinados amino cidos podem promover interac es espec ficas com as bases dos cidos nuclei
18. 19 pp 982 986 138 Cano T 2005 Separation of genomic DNA from plasmid DNA by selective renaturation with immobilized metal affinity capture Biotechnol Prog vol 21 pp 1472 1477 139 Tan L Lai W B Lee C T Kim D S Choe W S 2007 Differential interactions of plasmid DNA RNA and endotoxin with immobilised and free metal ions J Chromatogr A vol 1141 pp 226 234 140 Chubb J M Hogan M E 1992 Human therapeutics based on triple helix technology Trends Biotechnol vol 10 pp 132 136 141 Sun J S Hel ne C 1993 Oligonucleotide directed triple helix formation Curr Opin Struct Biol vol 3 pp 345 356 142 Mirkin S M Lyamichev V I Drushlyak K N Dobrynin V N Filippov S A Kamenetskii M D 1987 DNA H form requires a homopurine homopyrimidine mirror repeat Nature vol 330 pp 495 497 143 Wils P Escriou V Warney A Lacroix F Lagneaux D Ollivier M Crouzet J Mayaux J F Schermann D 1997 Efficient purification of plasmid DNA for gene transfer using triple helix affinity Gene Ther vol 4 pp 323 330 144 Klug A 1999 Zinc finger peptides for the regulation of gene expression J Molec Biology vol 293 pp 215 218 88 145 Laity J H Lee B M Wright P E 2001 Zinc finger proteins new insights into structural and functional diversity Curr Opin Struct Biol vol 11 pp 39 46 146 Woodgate J
19. 2008 Interaction of pepsin with aromatic amino acids and their derivates immobilized to Sepharose J Chromatogr B vol 863 pp 135 140 130 Jungbauer A Hahn R 2004 Monoliths for fast bioseparation and bioconversion and their applications in biotechnology J Sep Sci vol 27 pp 767 778 131 Mallik R Hage D S 2006 Affinity monolith chromatography J Sep Sci vol 29 pp 1686 1704 132 Santos P V 2007 Corantes Cian nicos Funcionais Bioaplica es X Jornadas de Qu mica Industrial e V jornadas de Bioqu mica Universidade da Beira interior Covilh 133 Wilson K Walker J M 1994 Principles and Techniques of Practical Biochemistry Cambridge University Press UK 87 134 Hermanson G T Mallia A K Smith P K 1992 Immobilised Affinity Ligand Techniques Academic Press New York 135 Chaga G S 2001 Twenty five years of immobilized metal ion affinity chromatography past present and future J Biochem Biophys Methods vol 49 pp 313 334 136 Martins S Pacheco V Pacheco R Karmali A Brown P R 2000 Differential chromatographic behaviour of recombinant wild type and altered amidases in immobilized metal chelates International J Biochromatogr vol 6 pp 82 85 137 Murphy J C Jewell D L White K I Fox G E Willson R C 2003 Nucleic acid separations utilizing immobilized metal affinity chromatography Biotechnol Prog vol
20. DNA vaccines Curr Opin Biotechnol vol 12 pp 299 303 20 Crystal R G 1995 The gene as the drug Nat Med vol 1 pp 15 17 21 FDA 1996 Addendum to the points to consider in human somatic cell and gene therapy In Points to Consider on Plasmid DNA Vaccines for Preventing Infectious Disease Indications US Food and Drug Administration Rockville MD USA 22 Dufes C Uchegbu I F Schatzlein A G 2005 Dendrimers in gene delivery Adv Drug Deliver Rev vol 57 pp 2177 2202 23 Lampela P Soininen P Urtti A Mannisto P T Raasmaja A 2004 Synergism in gene delivery by small PEIs and three different nonviral vectors Int J Pharmaceut vol 270 pp 175 184 24 Bonadio J Smiley E Patil P Goldstein S 1999 Localized direct plasmid gene delivery in vivo prolonged therapy results in reproducible tissue regeneration Nat Med vol 5 pp 753 759 25 Cohen Sacks H Elazar V Gao J C Golomb A Adwan H Korchov N Levy R J Berger M R Golomb G 2004 Delivery and expression of pDNA embedded in collagen matrices J Controlled Rel vol 95 pp 309 320 26 Hosseinkhani H Inatsugu Y Hiraoka Y Inoue S Shimokawa H Tabata Y 2005 Impregnation of plasmid DNA into three dimensional scaffolds and medium 77 perfusion enhance in vitro DNA expression of mesenchymal stem cells Tissue Eng vol 11 pp 1459 1475 27 Templeton N S
21. arginina e histidina em Sepharose introduzindo v rios grupos alqu licos no grupo carbox lico do amino cido por esterifica o de modo a estudar a influ ncia na interac o com o pDNA Para verificar as interac es que poder o ocorrer na liga o do pDNA arginina e histidina efectuaram se v rias experi ncias cromatogr ficas realizadas em colunas de bancada de modo a averiguar o comportamento do pDNA nas diferentes matrizes Em primeiro lugar testaram se as condi es que favorecem a total liga o elui o do pDNA a cada matriz e dependendo da gama de concentra es estudada procedeu se ao estudo da separa o das diferentes isoformas do pDNA nomeadamente a isoforma oc e a isoforma sc de referir que os ensaios foram realizados utilizando gradiente por passos com diferentes concentra es de sais NH4 2SOq e NaCl 39 ITI 1 Arginina e derivados III 1 1 S ntese de derivados de L Arginina Os steres alqu licos da L arginina 2 figura 14 foram sintetizados por esterifica o seguindo m todos descritos ou adoptados da literatura 159 Os steres foram preparados por adi o da L arginina 1 a uma solu o arrefecida a 10 C de cloreto de tionilo 1 5 equivalentes com um excesso de lcool anidro metanol etanol butanol hexanol e octanol seguido de aquecimento a 60 70 C at o desaparecimento do amino cido de partida 1 3h Os steres 2 foram facilmente obtidos na forma de leo ap s
22. c lulas som ticas Especificamente os vectores s o necess rios uma vez que permitem uma transfec o eficiente controlam o tempo de express o e especificidade das c lulas bem como minimizam preocupa es relativamente seguran a 22 26 Para al m disso os vectores devem ter uma produ o m ssica economicamente rent vel de modo a obterem um impacto cl nico 27 28 Assim para a entrega efectiva dos cidos nucleicos s c lulas alvo e quer os vectores virais retrov rus v rus adeno associados como os n o virais DNA complexado com pol meros cati nicos e l pidos t m sido desenvolvidos para fornecer essa efici ncia 29 30 Durante muitos anos pensava se que os v rus inactivos seriam o ve culo ideal para transportar o material gen tico para o interior das c lulas no entanto estudos sobre a poss vel utiliza o de retrov rus 31 e v rus adeno associados 32 para o transporte de DNA mostram desvantagens como a integra o do vector em regi es codificantes do genoma do hospedeiro Deste modo a utiliza o de vectores virais na entrega de genes levantou quest es de seguran a e de regula o devido sua toxicidade e imunogenicidade bem como a possibilidade de activa o e desactiva o de genes supressores de tumores 29 30 Devido a estas raz es vectores n o virais tais como pol meros cati nicos e l pidos surgiram como uma segunda alternativa originando um aumento na utiliza o destes siste
23. com qualquer matriz de IMAC ao passo que a 24 flexibilidade das endotoxinas induzem elevadas interac es de afinidade para todos os metais de transi o testados 139 Deste modo a prefer ncia de interac o de afinidade com o metal imobilizado segue a seguinte ordem endotoxina gt RNA gt pDNA de referir que as interac es diferenciais entre o pDNA e RNA podem ser atribuidas s propriedades dos cidos nucleicos i es met licos e compostos quelantes 1 6 5 2 Cromatografia de afinidade por h lice tripla A tecnologia da h lice tripla proporciona um amplo leque de possibilidades para aplica es terap uticas devido simplicidade do princ pio geral da mesma 140 A cromatografia de afinidade por h lice tripla THAC baseia se na forma o de uma h lice tripla entre um oligonucleotido ligado covalentemente a uma matriz cromatogr fica e uma sequ ncia de dupla cadeia presente no pDNA a ser purificado O oligonucle tido pirimidina que usado como ligando liga se ao maior espa o na h lice da dupla cadeia de DNA atrav s da forma o de pontes de hidrog nio de Hoogsteen a timina T reconhece especificamente a adenina A formando o tripleto TA T assim como a citosina protonada reconhece especificamente a guanina G para formar o tripleto CG C 141 O interesse das h lices triplas aumentou significativamente com a descoberta de uma estrutura com cadeia tripla chamada H DNA que respons vel por
24. como hidrofobicidade cromatografia de intera o hidrof bica e cromatografia de fase reversa tamanho cromatografia de filtra o em gel carga el ctrica cromatografia de troca i nica e caracter sticas de bioespecificidade cromatografia de afinidade 1 6 1 Cromatografia de interac o hidrof bica A cromatografia de interac o hidrof bica HIC uma t cnica de biossepara o baseada essencialmente na interac o entre uma regi o hidrof bica im vel do ligando e as regi es apolares da superf cie das biomol culas especialmente em prote nas e p ptidos As reas hidrof bicas das mol culas ligam se aos ligandos hidrof bicos da coluna e quanto mais hidrof bico for o constituinte mais forte ser a liga o coluna 83 Como mostra na figura 6 as mol culas mais hidrof bicas ligam se ao ligando ficando retidas na coluna ao passo que as hidrof licas mol culas representadas pela cor azul eluem logo Figura 6 Cromatografia de interac o hidrof bica Adaptado de Affinity Chromatography Principles and Methods A adsor o da prote na ao ligando e a consequente elui o da mesma dependem da elevada ou baixa concentra o de sal que se utilize Em geral as prote nas ligam se s colunas de HIC a elevadas concentra es de sulfato de am nio elu ndo atrav s da diminui o da for a i nica enfraquecendo deste modo a interac o hidrof bica 84 85 Estas interac es s o promovidas pri
25. cromatogr fico obtido ap s injec o de pDNA oc sc utilizando um suporte de arginina Sepharose com as respectivas electroforeses em gel de agarose a 1 P Amostra de pDNA injectado na coluna 1 Frac o recolhida usando 180 mM de NaCl do ensaio A 2 Frac o recolhida usando 200 mM de NaCl do ensaio A 3 Frac o recolhida usando 170 mM de NaCl do ensaio B 4 Frac o recolhida usando 200 mM de NaCl do ensaio B 5 Frac o recolhida usando 200 mM de NaCl do ensaio C No primeiro ensaio cromatogr fico figura 33 A as esp cies elu das no primeiro pico correspondente elui o com 180 mM de NaCl s o vis veis na electroforese linha 1 duas bandas correspondentes s duas isoformas do pDNA oc sc No entanto no segundo pico obtido com a concentra o de 200 mM de NaCl s est presente a 58 o O CT 0 2 6 8 i n o 2 4 6 5 10 12 mw 15 35 o 2 4 5 8 1 12 14 16 18 Erac es acolhidas 14 1 ne ra i ippo houn Absorvinc 260 nm isoforma sc linha 2 Como demonstrado na linha 1 perde se uma frac o da isoforma sc no primeiro passo de elui o e para tentar melhorar este resultado e a liga o do sc matriz realizou se um segundo ensaio diminuindo a concentra o para 170 mM com o intuito da isoforma oc eluir e a 200 mM de NaCl eluir a sc No entanto como se pode visualizar pela figura 33 B apesar de maior quantidade de sc ficar retido em ambos os picos 3 e 4 eluiram indiferenci
26. da cadeia entre outras 154 Comparando os mecanismos de purifica o da isoforma sc do pDNA utilizando a histidina e arginina como ligandos imobilizados constata se que na histidina a interac o foi atribu da exposi o de bases 155 ao passo que na matriz de arginina agarose o pDNA liga se a baixas for as i nicas indicando a presen a de interac es fortes com os grupos fosfato carregados do pDNA A elevada resolu o obtida neste estudo e a utiliza o de baixas concentra es de sal indicam que este m todo pode ser promissor para isolar a isoforma sc do pDNA numa escala preparativa ou anal tica Como os amino cidos promovem interac es espec ficas com os cidos nucleicos h a necessidade de desenvolver novos ligandos para compreender melhor a natureza das interac es envolvidas neste mecanismo de modo a conhecer o fen meno que ocorre entre o reconhecimento dos amino cidos e dos cidos nucleicos 27 CAP TULO II Parte Experimental 28 II 1 Material e m todos II 1 1 O plasmideo pVAX1 LacZ Devem se ter cuidados especiais com a escolha de uma esp cie como hospedeira de um plasm deo de maneira a obter bons rendimentos e a prevenir alguns problemas em etapas posteriores como a purifica o Assim a esp cie deve ser escolhida por forma a minimizar a quantidade de impurezas que necessitam ser removidas 52 Em geral deve ser escolhida uma esp cie hospedeira que tenha sido completament
27. da tecnologia do pDNA Devido singularidade do plasm deo a sua eficiente purifica o ainda um desafio contudo as estrat gias de purifica o utilizando a arginina como ligandos foram produzindo resultados interessantes no que diz respeito purifica o de plasm deos 62 III 2 Histidina e derivados III 2 1 Imobiliza o do ster met lico de L histidina em Sepharose Relativamente imobiliza o do ster met lico da L histidina em Sepharose figura 36 procedeu se de igual modo como para o caso da arginina OH COOCH O O e NA E NE q Hi 3 Figura 36 Imobiliza o do ster met lico da L histidina em Sepharose III 2 2 Matriz com o bra o espa ador sem o amino cido imobilizado Na da figura 37 pode se observar a primeira matriz que foi utilizada ao realizar este trabalho experimental Esta matriz constitu da por um bra o espa ador que cont m o grupo ep xido este bra o est acoplado Sepharose Aa mano O Figura 37 Representa o esquem tica da matriz com o bra o espa ador sem o amino cido 63 Este ensaio foi realizado como um branco cujo objectivo foi estudar o tipo de interac o que pode ocorrer entre o pDNA e o bra o espa ador usando condi es similares s utilizadas nos estudos das restantes matrizes A selec o destas condi es 2 5 M 2 3 M 2 0 M de NH4 2SO 4 e Tris HCl est associada ao comportamento de reten o do pDNA que j fo
28. de nos pr ximos anos Ambas se baseiam no mesmo princ pio de introdu o de cidos nucleicos em c lulas humanas para restaurar cancelar refor ar ou introduzir uma fun o bioqu mica No entanto n o existem ainda m todos eficientes para o tratamento de uma s rie de doen as devido inefic cia de alguns m todos terap uticos convencionais 11 Deste modo surgem estes tratamentos inovadores com o intuito de tentar solucionar esses problemas A aplica o do DNA plasm dico pDNA para a vacina o usando DNA e terapia g nica 12 13 representa a pr xima gera o de biof rmacos Devido ao progresso de ensaios cl nicos tem sido observada uma crescente procura do pDNA com uma boa qualidade para o tratamento destas desordens humanas 14 19 1 2 1 Terapia g nica A tecnologia do DNA recombinante e a sequencia o do genoma humano levaram a descobertas revolucion rias especialmente nestas reas da terapia g nica e nas vacinas de DNA 20 21 A terapia g nica consiste numa estrat gia terap utica na qual os cidos nucle cos s o introduzidos em c lulas humanas a fim de corrigirem a sua informa o gen tica para fins terap uticos 20 como forma de prevenir tratar e curar doen as gen ticas ou doen as adquiridas tais como o cancro e SIDA 21 A terapia g nica tem in meras vantagens para o tratamento deste tipo de desordens mas a sua realiza o exige uma melhoria nos mecanismos de introdu o de DNA ex geno em
29. elution in hydrophobic interaction and ionexchange chromatography Protein Expr Purif vol 54 pp 110 116 162 Sousa F Prazeres D M F Queiroz J A 2008 Binding and elution strategy for improved performance of arginine affinity chromatography in supercoiled plasmid DNA purification Biomed Chromatogr vol 23 pp 160 165 163 Sousa F Prazeres D M F Queiroz J A 2008 Improvement of transfection efficiency by using supercoiled plasmid DNA purified with arginine affinity chromatography J Gene Med vol 11 pp 79 88 164 Schleef M Schmidt T 2004 Animal free production of ccc supercoiled plasmids for research and clinical applications J Gene Med vol 6 pp 45 53 90
30. quantidades da isoforma sc do pDNA s o cruciais a fim de se obterem elevados rendimentos No entanto a sensibilidade do plasm deo a presen a de mol culas de gDNA 78 bem como a elevada viscosidade do lisado 79 s o as maiores preocupa es durante a liberta o do plasm deo 42 Embora muitas t cnicas sejam usadas laboratorialmente poucas s o as suscept veis de aplica o em processos de grande escala Deste modo a quantidade de c lulas um factor importante escala industrial e para que um m todo de desintegra o celular possa ser usado nesta escala deve obedecer aos seguintes requisitos velocidade de desintegra o elevada pois o tempo de opera o um factor essencial para a economia do processo custos de opera o e manuten o baixos e manuten o da integridade dos produtos intracelulares 1 6 Purifica o do DNA plasm dico por cromatografia Foi em meados do s culo passado que pela primeira vez se efectuaram trabalhos cient ficos em que a cromatografia era a base para a separa o de compostos Com origem no grego chroma graphein a cromatografia ou escrita da cor um m todo contempor neo que ganhou relevo por volta de 1903 com o bot nico Mikhail Semenovich Tswett Tswett foi considerado o pai da cromatografia moderna atrav s dos v rios trabalhos experimentais que efectuou particularmente na separa o de extractos de plantas por adsor o diferencial em colunas tendo v
31. que houve interac o do pDNA com a matriz devendo se extens o do bra o espa ador uma vez que quanto 64 maior for o bra o espa ador maior ser a reten o do pDNA usando elevadas concentra es de sal III 2 3 Compara o das condi es de reten o para cada matriz de histidina Antes da execu o dos ensaios para tentar separar as diferentes isoformas do pDNA procedeu se realiza o de ensaios cromatogr ficos de modo a comparar as condi es de reten o elui o da matriz n o modificada e das modificadas Deste modo foram aplicadas diferentes estrat gias utilizando sempre um gradiente decrescente por passos de concentra o de NH4 2SOu Histidina Sepharose A escolha desta matriz que cont m a histidina como amino cido imobilizado figura 39 teve como objectivo a compara o das condi es de reten o e elui o do pDNA entre esta matriz com as matrizes derivadas da histidina por introdu o de novos grupos COOH ama NAT Figura 39 Representa o esquem tica da matriz de histidina Sepharose Come ou se por testar as seguintes condi es 2 3 M de NH4 2SOu 2 0 M de NH4 2SO4 seguido da adi o do tamp o Tris HCl porque segundo trabalhos ja publicados a isoforma oc do pDNA elui a 2 3 M de NH4 SO e a 2 0 M de NH SO4 elui a isoforma sc 155 65 Histidina Sepharose e E 2 S o S zZ amp S E E z E a 1 O E E A i _
32. referir que na matriz de Sepharose s com o bra o espa ador figura 38 o pDNA liga a 2 5 M de sal elu ndo a 2 0 M de NH4 2SO 4 ao passo que nas restantes matrizes figura 40 e 42 a mol cula alvo ret m a 3 0 M de NH SO eluindo a 2 0 M de NH4 2SOx4 Deste modo pode se afirmar que o pDNA interage preferencialmente com as matrizes representadas nas figuras 40 e 42 do que na matriz representada na figura 38 Conclu sse tamb m que ao aumentar a cadeia alqu lica da matriz n o h favorecimento da interac o do pDNA com as matrizes Este facto poder ser explicado pelo baixo rendimento obtido aquando da imobiliza o destas matrizes histidina Sepharose e ster met lico da histidina Sepharose Este acontecimento vai originar uma reduzida percentagem de ligandos imobilizados induzindo fracas interac es do pDNA com as respectivas matrizes No entanto com base nestes resultados testou se ainda a possibilidade de separar as diferentes isoformas do pDNA com as matrizes de histidina nesta gama de concentra es a fim de desenvolver uma estrat gia de purifica o III 2 4 Separa o das diferentes isoformas do DNA plasm dico No decurso dos processos de produ o e recupera o o plasm deo pode sofrer altera es de conforma o que ser o respons veis pela maior ou menor actividade biol gica apresentada pelo plasm deo final Assim apesar de ser produzida maioritariamente a isoforma plasm dic
33. remo o do excesso de cloreto de tionilo e do lcool por destila o seguida por uma s rie de dissolu es precipita es usando metanol e ter et lico Os steres 2 tamb m foram obtidos como bases livres s lidas 2 ap s adi o de solu o de carbonato de s dio 2 M COOH COOR COOR H2 H2 Ho SOClp 10 C NaCO 2M _ __ gt ROH HN HN HN Nm am M HN HoN cr HN L Arginina Ester alquilico da L arginina Ester alquilico da L arginina 1 2 2 Figura 14 S ntese dos derivados steres alqu licos de L arginina Na tabela 5 encontram se os diferentes steres alqu licos da L arginina com os respectivos rendimentos observando se que os steres que apresentam maiores rendimentos s o o met lico e et lico 40 Tabela 5 steres alqu licos da L arginina e respectivos rendimentos Esteres alqu licos R n da L arginina a Me 84 b Et 68 c But 34 d Hex 61 er Oct 36 obtidos na forma de base livre ap s adi o de uma solu o de carbonato de s dio 2 M III 1 2 Imobiliza o dos steres de L arginina em Sepharose A imobiliza o dos steres alqu licos da L arginina em Sepharose figura 15 foi levada a cabo usando o m todo de fixa o atrav s do uso de um bis ep xido 160 Neste procedimento uma suspens o de 2 5 g de Sepharose em 2 5 ml de solu o de hidr xido de s dio 0 6M contendo 50 mg de borohidreto de s dio e 2 5 ml do ter de 1 4 butanedioldiglicidilo foi aquecida durante
34. trabalho s o apresentados os resultados sobre a utiliza o de uma s rie de ligandos modificados da histidina e da arginina na purifica o de plasm deos para terapia g nica Referiu se tamb m a prepara o dos derivados da histidina e da arginina onde a natureza hidrof bica s o ampliadas pela sua esterifica o com lcoois com as cadeias alquilicas de maior comprimento ou seja metil etil butil hexil e octil As amostras do plasm deo foram carregadas nas matrizes cromatogr ficas a fim de se alcan arem os respectivos padr es de reten o e de se encontrar a depend ncia da interac o em diferentes for as i nicas Os resultados gerais mostraram que a introdu o de pequenas cadeias alquilicas na arginina e na histidina tais como os steres metil e etil induziu um aumento na reten o do plasm dio No entanto cadeias alquilicas de maior comprimento n o favoreceram a interac o aquando da utiliza o de tamp es de elui o com baixa for a i nica suposto que a complexidade do ligando possa comprometer o acesso do plasm deo aos s tios de liga o Outros estudos ainda est o em desenvolvimento a fim de caracterizarem as interac es induzidas pelos ligandos modificados da histidina e da arginina Palavras chaves Afinidade cromatografia arginina histidina XIV ABSTRACT Current developments in gene medicine and vaccination studies are utilizing plasmid DNA pDNA as vectors For this reason ther
35. uma col nia que cresceu durante a noite temperatura de 37 C em placas de LB agar 35 g L O crescimento da pr fermenta o foi realizado num agitador orbital referida temperatura e a 250 rpm durante aproximadamente 3 horas Quando se atingiu uma densidade ptica a 600 nm de 2 6 iniciaram se as fermenta es a partir de um volume apropriado da pr cultura determinado a partir da seguinte express o Em que D O 0 2 gt Fermenta o As fermenta es para a produ o do plasm deo decorreram temperatura de 37 C e a 250 rpm em erlenmeyers de 1000 mL contendo um volume total de 250 mL do meio l quido com uma concentra o de canamicina de 250 uL A fermenta o foi parada a meio da fase exponencial para uma densidade ptica a 600 nm entre 10 e 12 As c lulas foram separadas do meio de cultura por centrifuga o a 5000G durante 20 minutos e temperatura de 4 C 33 II 2 2 Lise celular do DNA plasm dico usando o kit Qiagen Maxi O pDNA foi isolado das c lulas segundo o protocolo descrito no kit Qiagen Maxi O pellet de c lulas obtido foi ressuspenso em 5 mL de tamp o P1 tabela 4 e ap s a obten o de uma solu o homog nea distribuiu se a mesma quantidade do extracto anterior para tubos de centr fuga De seguida adicionaram se 2 5 mL de tamp o P2 tabela 4 nas paredes dos tubos visto que j estava decorrer lise e homogeneizaram se os tubos invertendo os cuidadosamente 4 6 vezes
36. uma forma super helicoidal nos plasm deos 142 Segundo um estudo sobre a purifica o do plasm deo pXL2563 Wils e colaboradores 1997 verificaram que poss vel purificar este plasm deo atrav s desta t cnica cromatogr fica como tamb m reduzir os n veis de contamina o de RNA gDNA e endotoxinas num nico passo Neste plasm deo h forma o de uma h lice tripla entre um oligonucle tido poly CTT e as correspondentes sequ ncias alvo poly GAA presentes no plasm deo 143 1 6 5 3 Cromatografia de afinidade DNA prote na As interac es DNA prote na t m sido exploradas na cromatografia de afinidade para purificar pDNA Para que as prote nas actuem como ligandos com especificidade para pDNA necessitam de se ligar a sequ ncias espec ficas do DNA As prote nas de dedo de zinco ZF s o a classe de prote nas mais conhecidas que se ligam s sequ ncias alvo do DNA com uma boa especificidade atrav s de um mecanismo molecular 25 conhecido 144 Segundo um estudo efectuado por Laity e colaboradores 2001 as prote nas inicialmente ligam se n o especificamente por interac es electrost ticas e posteriormente movem se at reconhecer o s tio onde ligam especificamente 145 Na verdade a prote na ZF demonstrou que actua como um ligando de afinidade eficaz para o isolamento do pDNA directamente a partir de lisados celulares clarificados A especificidade da sequ ncia do DNA para esta prote na ZF foi d
37. usadas para as matrizes com amino cidos imobilizados n o h interac o do pDNA com o bra o espa ador e nestas matrizes com amino cidos qualquer interac o que ocorra ir envolver o amino cido ou o derivado III 1 4 Compara o das condi es de reten o para cada matriz de arginina O trabalho j descrito de purifica o de pDNA com uma matriz de arginina apresenta a possibilidade de separar duas isoformas de pDNA usando um gradiente crescente de NaCl 154 A introdu o de novos grupos no amino cido poder facilitar a interac o do pDNA com as matrizes envolvendo os novos grupos qu micos Para estudar o efeito da modifica o do amino cido arginina por introdu o de grupos alqu licos e a influ ncia destes novos grupos na interac o com o pDNA realizaram se alguns ensaios cromatogr ficos As amostras de pDNA foram aplicadas nas diferentes matrizes 43 de modo a compreender os respectivos padr es de reten o e elui o assim como o efeito da for a i nica nas interac es Utilizou se um gradiente crescente de concentra o de NaCl e na tabela 6 est o descritas as concentra es que favorecem a liga o e elui o total do pDNA Tabela 6 Quadro resumo sobre as condi es de reten o e de elui o da arginina e derivados Reten o mM de Elui o total mM de NaCl NaCl Arginina Sepharose lt 150 200 Ester metilico da arginina lt 250 400 Sepharose Ester etilico
38. vel estimar o peso molecular de cada fragmento da amostra a analisar A electroforese de DNA normalmente realizada em gel de agarose Quando sujeitos a um campo el ctrico os cidos nucle cos migram em direc o ao p lo positivo uma vez que apresentam carga negativa a pH neutro A agarose funciona como uma rede cujos poros deixam passar mais facilmente as mol culas mais pequenas que v o portanto migrar mais do que as de maiores dimens es A migra o de um fragmento de DNA na forma circular como o caso de um plasm deo n o digerido diferente da migra o do mesmo plasm deo sob a forma linear Por outro lado mol culas com uma conforma o mais compacta migram mais rapidamente do que mol culas com uma conforma o molecular mais relaxada Na maior parte das prepara es com plasm deos n o digeridos poss vel encontrar pelo menos duas formas topologicamente distintas de DNA s o elas a forma oc e a forma sc migrando esta ltima mais rapidamente do que a primeira Para preparar o gel de agarose fez se a mistura de agarose 1 com a solu o tamp o de TAE 40 mM Tris 36 base 20 mM de cido ac tico e ImM de EDTA pH 8 0 Ap s dissolu o colocou se o brometo de et dio que permitiu a visualiza o das bandas de DNA por exposi o luz ultravioleta UV Quando a mistura arrefeceu o gel polimerizou Um detalhe importante a coloca o do pente no gel durante o endurecimento uma vez que o p
39. 1 1980 85 113 Marquet M Horn N A Meek J A Pestka S 1995 Process development for the manufacture of plasmid DNA vectors for use in gene therapy BioPharm vol 20 pp 26 37 114 Colpan M Riesner D 1984 High performance liquid chromatography of high molecular weight nucleic acids on the macroporous ion exchanger nucleogen J Chromatogr vol 296 pp 339 353 115 Lowe C R Lowe A R Gupta G 2001 New developments in affinity chromatography with potential application in the production of biopharmaceuticals J Biochem Biophys Methods vol 49 pp 561 574 116 Kanoun S Amourache L Krishnan S Vijayalakshmi M A 1986 New support for the large scale purification of proteins J Chromatogr vol 376 pp 259 267 117 Schiel J E 2006 Applications of silica supports in affinity chromatography J Sep Sci vol 29 pp 719 737 118 Affinity Chromatography Principles and Methods Amersham Biosciences 119 Clonis Y D 2006 Affinity chromatography matures as bioinformatic and combinatorial tools develop J Chromatogr A vol 1101 pp 1 24 120 Mondal K Gupta M N 2006 The affinity concept in bioseparation envolving paradigms and expanding range of applications Biomol Eng vol 23 pp 59 76 121 K Jones Affinity separation 2000 In Encyclopedia of separation science London Academic Press Inc Wilson I D Cooke M Poole C F Adlard R
40. 1982 Hidrophobic interaction chromatography of serum proteins on Phenyl Sepharose CL 4B J Chromatogr vol 242 pp 385 388 90 Lefort S Ferrara P 1986 Hydorphobic adsorbents for the isolation and purification of biosynthetic human growth hormone from crude fermentation misture J Chromatogr vol 361 pp 209 216 91 Angelova M K Dimov N P Nachev N D Tsvetkov A B 1997 Preparative hydrophobic interaction chromatography as effective stage in the purification of glucagon and insulin Bulg Chem Commun vol 29 pp 90 100 92 Queiroz J A Garcia F A P Cabral J M S 1999 Purification of Chromobacterium viscosum lipase by hydrophobic interaction chromatography Isol Purif vol 3 pp 1 7 83 93 Diogo M M Ribeiro S C Queiroz J A Monteiro G A Tordo N Perrin P Prazeres D M F 2001 Production purification and analysis of an experimental DNA vaccine against rabies J Gene Med vol 3 pp 577 584 94 Li Y Dong X Sun Y 2005 High speed chromatographic purification of plasmid DNA with a customized biporous hydrophobic adsorbent Biochem Eng J vol 27 pp 33 39 95 Deshmukh N R Lali A M 2005 Adsorptive purification of pDNA on superporous rigid cross linked cellulose matrix J Chromatogr B vol 818 pp 5 10 96 Ferreira G N Monteiro G A Prazeres D M F Cabral J M S 2000 Downstream processing of plasmid DNA for gene the
41. 2002 Protein mediated isolation of plasmid DNA by a zinc finger glutathione S transferase affinity linker Biotechnol Bioeng vol 79 pp 450 456 147 Sousa F Prazeres D M F Queiroz J A 2008 Affinity chromatography approaches to overcome the challenges of purifying plasmid DNA Trends in Biotechnol vol 26 pp 518 525 148 Vijayalakshmi M A 1996 Histidine ligand affinity chromatography Mol Biotechnol vol 6 pp 347 357 149 Luscombe N M Laskowski J M Thornton J M 2001 Amino acid base interactions a three dimensional analysis of protein DNA interactions at an atomic level Nucleic Acids Res vol 29 pp 2860 2874 150 Hoffman M M Khrapov M A Cox J C Yao J Tong L Ellington A D 2004 AANT the Amino Acid Nucleotide Interaction Database Nucleic Acids Res vol 32 pp 174 181 151 Wu X Haupt K Vijayalakshmi M A 1992 Separation of immunoglobulin G by high performance pseudo bioaffinity chromatography with immobilized histidine Preliminary report on the influence of the silica support and the coupling mode J Chromatogr vol 584 pp 35 41 152 Delattre C Michaud P Hamze K Courtois B Courtois J Vijayalakshmi M A 2005 Purification of oligouronides using hollow fiber membrane functionalised with L histidine J Chromatogr A vol 1099 pp 121 126 153 Sousa F Freitas S Azzoni A R Prazeres D M F Queiroz J A 2006 S
42. 25 C 15 isopropanol v v 1 25 M NaCl QF Tamp o de elui o 50 mM Tris HCl pH 8 5 15 25 C 15 isopropanol v v Precipitou se o pDNA adicionando 3 5 mL de isopropanol a cada tubo e homogeneizaram se os tubos at ficar tudo homog neo O pDNA precipitado foi isolado por centrifuga o durante 30 minutos a 9300 rpm e a 4 C sendo redissolvido em mL de Tris HCI 10 mM pH 8 0 35 II 2 3 Cromatografia em mini colunas de arginina histidina e respectivos derivados Montagem das minicolunas de arginina histidina e dos seus respectivos derivados Em primeiro lugar lavaram se as minicolunas com gua destilada adicionou se um pouco da mesma gua e aproximadamente 1 mL de cada matriz com a coluna fechada tabela 1 Adicionou se novamente gua esperou se que gel sedimentasse e colocou se o filtro Por fim taparam se as minicolunas 11 2 4 Determina o da Absorv ncia Os valores das absorv ncias foram lidos a um comprimento de onda de 260 nm e concentra o dos cidos nucle cos foi efectuada sabendo que 1 unidade de Abs corresponde a 50 pg mL II 2 5 Electroforese em gel de agarose A electroforese em gel por ac o de um campo el ctrico frequentemente utilizada para separar e estimar o tamanho de fragmentos de cidos nucle cos Atrav s da compara o da dist ncia percorrida pelos fragmentos com a percorrida por fragmentos de peso molecular conhecido padr es de peso molecular poss
43. 4 Direct gene transfer into muscle Vaccine vol 12 pp 149 1502 38 Marcel T Grausz J D 1997 The TCM worlwide gene therapy envolment report end 1996 Human Gene Ther vol 8 pp 775 800 78 39 Ross G Erickson R Knorr D Matulsky A G Parkman R Samulski J 1996 Gene therapy in the United States A five years status report Human Gene Ther vol 7 pp 1781 1790 40 Ulmer J B Sadoff J C Liu M A 1996 DNA vaccines Curr Opin Immunol vol 8 pp 531 536 41 Forde G M 2005 Rapid response vaccines does DNA offer a solution Nat Biotechnol vol 23 pp 1059 1062 42 Prazeres D M F Ferreira G N M Monteiro G A Cooney C L Cabral J M S 1999 Large scale production of pharmaceutical grade plasmid DNA for gene theraphy problems and bottlenecks Trends Biotechnol vol 17 pp 169 174 43 Przybylowski M Bartido S Borquez Ojeda O Sadelain M Rivi re I 2007 Production of clinical grade plasmid DNA for human phase I clinical trials and large animal clinical studies Vaccine vol 25 pp 5013 5024 44 Prazeres D M F Ferreira G N M 2004 Design of flow sheets for the recovery and purification of plasmids for gene therapy and DNA vaccination Chem Eng Process vol 43 pp 609 624 45 Urthaler J Schlegl R Podgornik A Strancar A Jungbauer A Necina R 2005 Application of monoliths for plasmid DNA purification development a
44. 4 110 figura 9 A carga global do pDNA depende do n mero de bases azotadas que comp em a mol cula 51 e em alguns casos a composi o e sequ ncia de bases afectam a elui o padr o de cidos nucle cos na troca ani nica 111 Figura 9 Cromatografia de troca ani nica Adaptado de Affinity Chromatography Principles and Methods A separa o das diferentes isoformas do pDNA por troca ani nica principalmente as isoformas oc e sc confirma a hip tese da reten o dependente da conforma o 44 112 113 sendo a isoforma sc do pDNA mais retida devido maior compacta o e densidade de carga do que a isoforma oc 110 114 Quando se utiliza este tipo de cromatografia para separar o pDNA o lisado clarificado deve ser aplicado numa concentra o de NaCl suficientemente elevada de modo a evitar a liga o de impurezas Sob estas condi es uma quantidade significativa de impurezas eluem imediatamente e a capacidade pode ser aproveitada para a adsor o do pDNA 109 114 Mol culas com elevada densidade como as isoformas do pDNA s o retidas e posteriormente elu das atrav s do aumento da for a i nica da fase m vel Muitas fases estacion rias da AEX t m uma fraca selectividade para a separa o de pDNA e impurezas devido similaridade dos contaminantes do pDNA em termos de estrutura e composi o qu mica gDNA RNA ou carga endotoxinas e a separa o pode ser insuficiente em alguns casos 42 109 Esta falta
45. 8h a 25 C sob agita o A reac o de activa o do ep xido da matriz foi parada por lavagem com uma grande quantidade de gua O suporte cromatogr fico de afinidade final foi obtido por adi o de 0 75 mg do ster de arginina 2 ou 2 3 8 ml de solu o de carbonato de s dio 2 M e 33 mg de borohidreto de s dio que foi aquecido a 70 C sob agita o durante 16 horas seguido por lavagem abundante com gua at as guas de lavagem apresentarem pH neutro m 2a c 2d e Ester alqu lico da L arginina OH COOR as An NH do cdi OH NH 2 Figura 15 Imobiliza o dos steres da L arginina em Sepharose 41 de esperar que a imobiliza o do amino cido via bis ep6xido j ligado Sepharose siga uma reac o Sn2 t picA figura 16 de adi es nucleof licas a um ep xido em meio b sico solu o de carbonato de s dio 2 M Neste caso atrav s da adi o do grupo amino nucleof lico presente no amino cido ao lado menos impedido do ep xido DN Arginina NH C C O Nucle filo se gt a H Figura 16 Reac o Sy2 III 1 3 Matriz com o bra o espa ador sem o amino cido imobilizado Como se pode visualizar atrav s da figura 17 esta matriz constitu da por uma resina altamente reticulada a Sepharose e por um bra o espa ador que cont m o grupo ep xido a aro O Figura 17 Representa o esquem tica da matriz com o bra o espa ador sem o amino cid
46. Hg4 2SO linha 2 e com o tamp o Tris HCl linha 3 Num segundo ensaio e de modo a promover interac es da mol cula com a matriz aumentou se a concentra o para 3 0 M de NH SO e verificou se que esta estrat gia foi eficaz Como se pode visualizar pela figura 42 B o pDNA ficou retido nessa concentra o eluindo totalmente a 2 0 M do mesmo sal linha 4 Ap s a realiza o de v rios ensaios verifica se que ambas as matrizes apresentam as mesmas condi es de reten o elui o ou seja o pDNA liga se a 3 0 M de NH SO e elui a 2 0 M de NH4 2SO ver tabela 8 Com este resultado surgiu o interesse de tentar separar as diferentes isoformas do pDNA com as matrizes de histidina nesta gama de concentra es a fim de desenvolver uma estrat gia de purifica o 68 wD os CHN Tabela 8 Quadro resumo sobre as condi es de reten o e de elui o da histidina e derivado Reten o NH4 2SO4 M Elui o NH SO M Histidina Sepharose 30 2 0 ster met lico da 3 0 2 0 histidina Sepharose Comparando o ensaio do branco figura 38 com os ensaios realizados utilizando as matrizes de histidina Sepharose figura 40 e de ster met lico da histidina Sepharose figura 42 constata se que t m um comportamento semelhante Ocorre interac o do pDNA com as matrizes a elevadas concentra es de sal e medida que a for a i nica diminui o pDNA elui No entanto de
47. M P Costa A Hombach J Carrasco P Pervikov Y Salisbury D Greco M Gust I LaForce M Franco Paredes C Santos J I D Hondt E Rimmelzwaan G Karron R Fukuda K 2006 A global pandemic influenza vaccine action plan Vaccine vol 24 pp 6367 6370 56 Summers D K 1996 The Biology of Plasmids Blackwell Science Ltd Oxford U K 57 Horn N A Meek J A Budahazi G Marquet M 1995 Cancer gene therapy using plasmid DNA purification of DNA for human clinical trials Hum Gene Therapy vol 6 pp 565 573 58 Varley D L Hitchcock A G Weiss A M Horler W A Cowell R Peddie L Sharpe G S Thatcher D R Hanak J A 1999 Production of plasmid DNA for human gene therapy using modified alkaline cell lysis and expanded bed anion exchange chromatography Bioseparation vol 8 pp 209 217 80 59 Lemmens R Olsson U Nyhammar T Stadler J 2003 Supercoilded plasmid DNA selective purification by thiophilic aromatic adsorption J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci vol 784 pp 291 300 60 Branovic K Forcic D Ivancic J Strancar A Barut M Gulija T K Zgorelec R Mazuran R 2004 Application of short monolithic columns for fast purification of plasmid DNA J Chromatog B vol 801 pp 331 337 61 Kelly B D Hatton T A 1991 The fermentation downstream processing interface Bioseparation vol 1 pp 333 349 62
48. Sepharose O pDNA n o interage com estas cadeias alqu licas de maior comprimento eluindo mesmo com a aplica o do tamp o Tris HCl A raz o para este comportamento que poder haver um impedimento estereoqu mico medida que a cadeia alqu lica aumenta A complexidade do ligando pode comprometer o acesso do plasm deo aos s tios de liga o minimizando a interac o III 1 5 Compara o das condi es de reten o nas matrizes de ster hex lico da arginina Sepharose e ster oct lico da arginina Sepharose usando um gradiente de NH4 250z Como foi descrito nas matrizes de ster hex lico da arginina Sepharose e de ster oct lico da arginina Sepharose o pDNA elui com a aplica o de tamp es com baixa for a i nica n o favorecendo as interac es electrost ticas Deste modo para explorar a possibilidade de ocorr ncia de outro tipo de interac o como interac es hidrof bicas entre o pDNA e os amino cidos e particularmente a cadeia alqu lica de maior tamanho efectuou se outro estudo utilizando o NH4 2SOq 54 Ester hex lico da arginina Sepharose Nestes ensaios utilizou se um gradiente de tr s passos que est o representados na figura seguinte e neste caso a elui o promovida por diminui o da for a i nica A B Ester haxilico da arinina Sagharo Ester Sexilnco da arginina Sepharo w E 2 A 3 E 3 i E 3 2 amp i E a E Es gt l i
49. Universidade da Beira Interior Derivados de Amino cidos como Ligandos em Cromatografia de Afinidade para a Purifica o de Plasm deos ngela Paula Duarte Baptista Covilh 2009 Universidade da Beira Interior Derivados de Amino cidos como Ligandos em Cromatografia de Afinidade para a Purifica o de Plasm deos Este trabalho foi elaborado com vista obten o do grau de Mestre em Bioqu mica sob orienta o da professora Doutora Fani Sousa e co orienta o do professor Doutor Renato Boto ngela Paula Duarte Baptista Covilh 2009 N o basta ensinar ao homem uma especialidade Porque se tornar assim uma m quina utiliz vel e n o uma personalidade E necess rio que adquira um sentimento um senso pr tico daquilo que belo do que moralmente correcto Albert Einstein Ill AGRADECIMENTOS Embora uma disserta o seja pela sua finalidade acad mica um trabalho individual h contributos de natureza diversa que n o podem nem devem deixar de ser real ados Por essa raz o desejo expressar os meus sinceros agradecimentos A Deus por me amparar nos momentos dif ceis por me dar for a interior para superar as dificuldades mostrar o caminho nas horas incertas e de me suprir em todas as minhas necessidades A Professora Doutora Fani Sousa orientadora desta disserta o por todo o empenho sabedoria compreens o e acima de tudo exig ncia e paci ncia Gostaria de gratificar a sua com
50. a 250 mM de NaCl Comparando estes resultados com a matriz de ster met lico da arginina Sepharose observa se que esta matriz induz interac es mais fracas com a mol cula alvo uma vez que a gama de concentra o de reten o elui o do pDNA restrita Poderia esperar se que o aumento da cadeia alqu lica nas matrizes favorecesse a reten o do pDNA mas tal facto n o sucedeu para a matriz ster et lico de arginina Sepharose ster but lico da arginina Sepharose Esta matriz foi obtida pela liga o da arginina butil esterificada Sepharose pelo bis ep xido figura 25 o 1 s c E 0 P OH HA E o A 7 o Al NON Ny R o o HN NH E ra ster but lico de L arginina o 1 0 P OH Cc VN o o NH NH emo Y R OH NH Ol S E Figura 25 Representa o esquem tica da matriz de ster but lico da arginina Sepharose Ao utilizar a matriz que est representada na figura 25 aplicaram se as mesmas condi es que foram utilizadas para a matriz de ster et lico da arginina Sepharose de modo a averiguar se esta matriz tem um comportamento semelhante matriz referida anteriormente 50 orsak HOO ten Bur bontico da arginina Sepharose Eus walizo da pr za Septarom Estar butdico da m grina Sepharose P 1 1 seo P 2 2 xo P 3 3 a a0 _ 4 z a 0 H 2 z E 0 z E 2 i 5 H 100 E az Z E as a o 2 4 6 a 0 12 mu 36 4 o ale Sas as Ss Ms Fra
51. a HIC tira vantagem da elevada hidrofobicidade das cadeias simples de cidos nucleicos elevada exposi o das bases arom ticas hidrof bicas quando comparadas com as cadeias duplas de cidos nucleicos Nas cadeias duplas das mol culas de plasm deo as bases arom ticas est o protegidas no interior da h lice diminuindo a interac o com o suporte da HIC 83 93 95 Assim a reten o de cidos nucle cos por HIC afectada principalmente pelo tamanho composi o e estrutura 96 Exemplos bem sucedidos da aplica o de HIC incluem a purifica o de um vector de terapia g nica para a fibrose c stica 83 e de uma vacina de DNA contra a raiva 14 bem como o desenvolvimento e a aplica o de m todos anal ticos 97 98 1 6 2 Cromatografia de fase reversa A cromatografia de fase reversa tem como base de separa o a hidrofobicidade da biomol cula tal como a cromatografia de interac o hidrof bica diferindo desta na densidade de ligandos hidrof bicos ligados matriz e consequentemente uma interac o mais forte com a matriz Assim a cromatografia de fase reversa prefer vel para mol culas pequenas ou p ptidos em que n o hajam problemas de desnatura o ao passo que a cromatografia de interac o hidrof bica usa se para prote nas maiores em que a liga o mais fraca matriz e as condi es mais suaves de elui o previnem a desnatura o e conduzem a recupera es mais elevadas 5 Como a figura 7 m
52. a mais compacta e de maior actividade biol gica 69 isoforma sc 110 outras isoformas como oc linear e desnaturada poder o estar presentes podendo ser estas ultimas menos eficientes na express o do gene a transferir Por esta raz o as ag ncias reguladoras especificam que o pDNA usado como produto terap utico dever apresentar se quase totalmente mais de 97 na conforma o de sc 164 A capacidade da histidina como ligando imobilizado na cromatografia de afinidade foi recentemente demonstrada na separa o das isoformas oc e sc do pDNA tanto em amostras obtidas por isolamento com kits comerciais como a partir de um lisado de E coli 153 155 usando um gradiente decrescente de sulfato de am nio Os resultados mostraram que n o foi reconhecido a isoforma oc do pDNA e gDNA ao passo que a isoforma sc interagiu especificamente com o ligando Uma vez que a interac o da histidina com as bases do DNA podem incluir liga es por pontes de hidrog nio ring stacking empilhamento interac es hidrof bicas e liga es de hidrog nio mediadas pela gua o mecanismo por detr s da interac o espec fica com as bases da isoforma sc foi explicada como uma consequ ncia de deforma es induzidas pela tor o da cadeia O maior grau de exposi o das bases da isoforma sc favorece a interac o com a histidina e a avalia o da efici ncia da cromatografia com base na histidina para purificar pDNA n o est compl
53. a matriz As mol culas n o retidas s o removidas visto estarem fracamente ligadas e a mol cula de interesse fica imobilizada podendo ser recuperada alterando as condi es do processo que favore am a sua elui o 115 figura 11 O processo de elui o pode ser realizado tanto especificamente utilizando componentes competitivos como n o especificamente atrav s da altera o do pH for a i nica ou polaridade dependendo da matriz utilizada e das caracter sticas qu micas das biomol culas 122 Figura 11 Mecanismo de purifica o por afinidade Adaptado de Affinity Chromatography Principles and Methods 20 No entanto o desenvolvimento deste tipo de cromatografia pode ser dif cil caso a elui o do produto seja alcan ada sob condi es extremas 123 Os ligandos s o normalmente ligados covalentemente a um suporte s lido como por exemplo agarose t m origens e natureza diferentes com a propriedade de formarem um complexo espec fico e revers vel com a biomol cula a ser separada ocupando assim um papel muito importante no sucesso de uma purifica o por afinidade Podem ser compostos de elevado peso molecular como inibidores de enzimas e compostos de baixo peso molecular como an logos de substrato Os corantes t m uma interac o de afinidade mais geral sendo utilizados frequentemente em investiga o e usados na purifica o de P interfer o 5 Um ligando ideal deve possuir propriedades adequ
54. a matriz de histidina Sepharose 65 Figura 40 Perfil cromatogr fico obtido ap s injec o de pDNA oc sc utilizando um suporte de histidina Sepharose com a respectiva electroforese em gel de agarose a Figura 41 Representa o esquem tica da matriz de ster met lico da histidina DEDO AA AEE EN MS NA E VN O O Sd malverociae aise 66 Figura 42 Perfil cromatogr fico obtido ap s injec o de pDNA oc sc utilizando um suporte de ster met lico da histidina Sepharose com a respectiva electroforese em Pe lS agarose a lonann RUE EAST TD ADA Sra Ud 68 Figura 43 Perfil cromatogr fico obtido ap s injec o de pDNA oc sc utilizando um suporte de ster met lico da histidina Sepharose com a respectiva electroforese em Dele agarose alori ORE a O a a oy ane 71 XII NDICE DE TABELAS Tabela 1 Tipos de matrizes utilizadas 0 cece eee cee n ene cence nee ne ene ence 30 Tabela 2 Lista dos reagentes utilizados no decorrer do trabalho laboratorial 31 Tabela 3 Composi o dos MEIOS 5 2 0 sesexcassdssieveecessdevecceensasdepecdeeassadaaaesaeds 32 Tabela 4 Composi o dos tamp es utilizados na lise celular 35 Tabela 5 Esteres alqu licos da L arginina e respectivos rendimentos 41 Tabela 6 Quadro resumo sobre as condi es de reten o e de elui o da arginina e GOT V AGIOS so and DESA Ra ER ee Da De 44 Tabela 7 Q
55. adamente as duas isoformas do pDNA Foi ainda testada uma menor concentra o de NaCl 165 mM de NaCl mas n o se verificou uma separa o diferenciada das isoformas figura 33 C linha 5 tendo o pDNA permanecido retido na coluna nestas condi es Ester met lico da arginina Sepharose Com base nos resultados obtidos sobre as condi es de liga o elui o do pDNA na matriz de ster met lico de arginina Sepharose estabeleceu se uma gama de concentra es para testar a elui o diferenciada das duas isoformas do pDNA sabendo que na matriz de ster met lico da arginina Sepharose o pDNA ficou retido a 250 mM de NaCl e eluiu a 400 mM do mesmo sal A B C Ester mentito da arginine Sepharow Ester metilico da arginina Sepharos Ester metilico da arginina Sepharose Gen hoen Absorvine i 260 run Gv fio en ASOT Os N OUT DAS Ee reste sem a ni Figura 34 Perfil cromatogr fico obtido ap s injec o de pDNA oc sc utilizando um suporte de ster met lico da arginina Sepharose com as respectivas electroforeses em gel de agarose a 1 P Amostra de pDNA injectado na coluna 1 Frac o recolhida usando 300 mM de NaCl do ensaio A 2 Frac o recolhida usando 400 mM de NaCl do ensaio A 3 Frac o recolhida usando 270 mM de NaCl do ensaio B 4 Frac o recolhida usando 400 mM de NaCl do ensaio B 5 Frac o recolhida usando 400 mM de NaCl do ensaio C Como se pode visualizar atrav s dos perfis
56. adas de modo que o pDNA possa ficar retido elu ndo posteriormente 123 Existem dois tipos de ligandos os bioespec ficos e os sint ticos Os bioespec ficos apesar de serem extremamente espec ficos em determinados casos s o bastante caros requerem muitas vezes uma pr purifica o s o inst veis qu mica e biologicamente e tendem a ser dif ceis de imobilizar sem alterar a sua actividade e as suas propriedades biol gicas originais Exemplos deste tipo de ligandos s o os nucle tidos como a adenosina trifosfato ATP heparina lectinas DNA RNA Vitamina A e imunoglobulina G IgG 124 125 Como estes ligandos tendem a ser fr geis e est o associados a baixas capacidades de liga o uma nova abordagem visa a concep o de ligandos sint ticos que possam combinar a selectividade de ligandos naturais com uma elevada capacidade e durabilidade dos sistemas sint ticos 115 120 Assim a substitui o dos ligandos naturais por ligandos sint ticos oferece um modo de ultrapassar estas dificuldades uma vez que estes encontram se dispon veis comercialmente numa grande variedade s o muito mais baratos s o facilmente imobilizados especialmente em matrizes que possuem grupos hidroxilo e s o resistentes degrada o biol gica 118 A alta selectividade da liga o por afinidade uma proposta atractiva para a purifica o de biof rmacos como o pDNA T m sido descritas abordagens de afinidade para a purifica o do pDNA ut
57. agarose ccsccscssessssssssssssessesssssessesssssssesssssssssessssssssesssessesseseseeses 36 CAP TULO III Resultados e Discuss o sims rimas rimar iuris 38 UII Arginina ederivados ee RPE DRC RN DIC ees At at Se ced E Aad ges DARDO eed St pnt 40 III 1 1 S ntese de derivados de L Arginind ccccccsessssessesessesssssesssssessessesssssssesssessessesseses 40 III 1 2 Imobiliza o dos steres de L arginina em Sepharose eeeeseeeeeresereereeeeeers 41 III 1 3 Matriz com o bra o espa ador sem o amino cido imobilizado 42 III 1 4 Compara o das condi es de reten o para cada matriz de arginina 43 III 1 5 Compara o das condi es de reten o nas matrizes de ster hex lico da arginina Sepharose e ster octilico da arginina Sepharose usando um gradiente de NH4 2SO4 54 III 1 6 Separa o das diferentes isoformas do DNA plasm dico eemeneenmesmmeneemermen 57 U2 Histidina ederivados ihi iia a E E A aa kes a Demon aed nie 63 III 2 1 Imobiliza o do ster met lico de L histidina em Sepharose eereermermeneneereer 63 III 2 2 Matriz com o bra o espa ador sem o amino cido imobilizado 63 III 2 3 Compara o das condi es de reten o para cada matriz de histidina sms 65 III 2 4 Separa o das diferentes isoformas do DNA plasm dico eemeneenmermeenmeenmermen 69 CAP TULO IV Conclus es gerais e Perspectivas futuras imer
58. amostras bem como o controlo do crescimento celular das fermenta es foram realizadas num espectrofot metro Ultrospec modelo UV Vis vel 3000 A concentra o dos cidos nucle cos foi lida a um comprimento de onda de 260 nm e as amostras provenientes da fermenta o foram lidas a 600 nm Estufa a incuba o das placas para o crescimento da estirpe foi efectuada numa estufa PSelecta a 37 C Potenci metro o pH das solu es foi medido num potenci metro 744 pH Meter da Metrohm V rtex durante a lise celular a homogeneiza o das amostras foi feita num V rtex Mixer 230V da Labnet II 2 Procedimento Experimental II 2 1 Fermenta o de uma estirpe recombinante de E coli DH5a contendo o plasm deo pVAX1 LacZ 6 05 Kpb gt Prepara o dos meios Prepararam se os meios necess rios para se poder efectuar a fermenta o nomeadamente o meio TB Terrific Broth meio l quido e o meio LB Agar Luria Bertani meio s lido tabela 3 Tabela 3 Composi o dos meios Meio Extracto Sais de K HPO z Triptona javedura KH gt PO Glicerol Agua LB Agar p v plv mL mM mL g L Meio TB 1 2 2 4 30 55 248 Meio 100 35 LB Agar 32 gt Pr fermenta o As fermenta es realizadas foram iniciadas a partir de uma pr cultura preparada em erlenmeyers de 250 mL contendo 50 mL do meio de cultura TB e 50 uL de canamicina que foi inoculada a partir de
59. ando esta matriz com a matriz n o modificada arginina Sepharose verifica se que aumentando a cadeia alqu lica h uma maior reten o do pDNA Na matriz n o modificada o pDNA liga se a 150 mM de NaCl eluindo a 200 mM de NaCl e na modificada o pDNA fica retido at 250 mM de NaCl eluindo a 400 mM de NaCl Como as mol culas do plasm deo s o poliani nicas a for a i nica do ambiente que o rodeia tem um efeito profundo na sua estrutura Devido ao facto do pDNA se ligar a baixas for as i nicas indica a presen a de fortes interac es da matriz com os grupos fosfato do pDNA ster et lico da arginina Sepharose A matriz representada na figura 23 foi obtida pela liga o da arginina etil esterificada Sepharose pelo bis ep6xido 48 Abwrviw ii 260 van o 5 1 fE ES oN P OH HAN H cA o o A YY 0 NG R o E HN yy nto LE HN ster et lico de L arginina 2 o 1 0 P OH cw d o o NH NH Al Dee ee fi E NH R OH N o H S E Figura 23 Representa o esquem tica da matriz de ster et lico da arginina Sepharose Estr esco da argirana Sepharose Exes at sco da argirisa Soghasors P y Ma Pos A Crm Ipan Abecewineks 260 vei Cred hoe Absorvitech 260 ren Qo 4 10 12 14 9 4 6 10 12 V 16 18 2 10 12 4 16 18 o 2 ht t2 y ER Frac es acolhidas Frac es ecoltidas Figura 24 Perfil cromatogr fico obtido ap s injec o de pDNA oc sc utiliza
60. atografia os plasm deos s o fraccionados e purificados com base no seu tamanho e conforma o Esta t cnica ideal como opera o final de um processo completo de purifica o uma vez que permite a remo o de contaminantes residuais RNA e gDNA caso o peso molecular do gDNA seja diferente do pDNA a separa o parcial da isoforma superenrolada da circular aberta uma redu o substancial dos n veis de endotoxinas 57 e coloca o plasm deo numa solu o com uma formula o mais adequada Este tipo de cromatografia de capacidade limitada dilui 2 a 3 vezes o plasm deo 108 e apenas alguns g is apresentam uma selectividade adequada para serem utilizados na purifica o de plasm deos 1 6 4 Cromatografia de troca i nica A cromatografia de troca idnica uma t cnica cromatogr fica usada na purifica o de prote nas em grande escala cujo conceito b sico se baseia na separa o de mol culas com base na sua carga As mol culas com cargas diferentes s o retidas de modo distinto Neste tipo de cromatografia existe uma interac o i nica entre a biomol cula e o suporte A for a de liga o que se estabelece entre a biomol cula e o suporte determinada pela for a i nica da fase m vel e pelo n mero de interac es entre os grupos i nicos da prote na e do suporte A elui o fraccionada das biomol culas conseguida atrav s da aplica o de um gradiente de for a i nica de pH ou de ambos Este tipo de c
61. c es mocibidas Frac es recolhidas Feac es ecoin Figura 26 Perfil cromatogr fico obtido ap s injec o de pDNA oc sc utilizando um suporte de ster but lico da arginina Sepharose com as respectivas electroforeses em gel de agarose a 1 P Amostra de pDNA injectado na coluna 1 Frac o recolhida usando 300 mM de NaCl do ensaio A 2 Frac o recolhida usando 300 mM de NaCl do ensaio B 3 Frac o recolhida usando 250 mM de NaCl do ensaio C Neste estudo e ao utilizar a mesma estrat gia de elui o j referida verificou se que o pDNA teve um comportamento semelhante ao observado para a matriz de ster et lico de arginina Sepharose figura 26 O pDNA interagiu com a coluna a 120 mM de NaCl eluindo totalmente a 300 mM de NaCl figura 26 A linhal Ao aumentar a concentra o de sal inicial para 150 mM observou se que o plasmideo tamb m ficou retido figura 26 B Ap s realiza o de v rias experi ncias concluiu se que o pDNA ret m e elui nas mesmas condi es que a matriz ster et lico de arginina Sepharose isto fica retido a 200 mM de NaCl e elui a 250 mM do mesmo sal Com a an lise destes resultados surge a hip tese de que ao aumentar a cadeia alqu lica h uma diminui o das interac es do pDNA com a matriz o que sugere que eventualmente o aumento da cadeia alqu lica pode representar um impedimento do acesso do pDNA regi o do ligando respons vel pela reten o Para confirmar es
62. condicional Aos meus pais Ant nio Batista e Maria Gabriela que desde sempre incutiram me os valores e princ pios ticos e morais dos quais jamais me afastarei A eles agrade o o amor a educa o o carinho a paci ncia o incentivo e todo o esfor o acrescido Foram eles que me transmitiram a renova o di ria da for a necess ria para chegar ao final de cada dia com esperan a Obrigado por acreditarem sempre em mim amo vos muito A minha irm Andreia e ao meu cunhado Rui pelo apoio incondicional da minha eterna jornada de estudante pelo carinho amor paci ncia e pelo consolo em qualquer situa o N o podia deixar de agradecer do fundo do cora o ao meu namorado Z que me acompanha em pensamento em todos os meus momentos Obrigado por me ouvires nos bons e maus momentos pela paci ncia que demonstraste ao longo da minha vida acad mica pela compreens o e principalmente pelo teu amor A todos os meus familiares pelo constante apoio e confian a dedicados O meu profundo e sentido agradecimento a todas as pessoas que contribu ram para a concretiza o desta disserta o estimulando me intelectual e emocionalmente De tudo ficaram tr s coisas A certeza de que estamos sempre a come ar A certeza de que preciso continuar A certeza de que podemos ser interrompidos antes de terminar Fa amos da interrup o um novo caminho Da queda um passo de dan a Do medo uma escada Do sonho uma
63. cos Devido ao facto da histidina interagir com os nucle tidos 149 torna este amino cido capaz de reter e interagir com o DNA na coluna Relativamente ao tipo exacto de interac es que poderiam estar a ocorrer estas podem incluir i liga es de hidrog nio entre o tomo doador de H NtH e o tomo aceitador de H Nz na histidina n o protonada com as arestas das bases ii emparelhamento com o anel imidazol interac es hidrof bicas iii liga es de hidrog nio mediadas pela gua 150 Assim a elui o das isoformas do pDNA quando a concentra o de sal diminui sugere que o emparelhamento das bases com o anel imidazol interac es hidrof bicas 66 yD Pos CHNI s o os efeitos dominantes de referir que na electroforese linha 2 n o se visualiza muito bem a isoforma oc do pDNA devido ao facto de se ter dilu do muito a solu o com o tamp o Tris HCl ster met lico da histidina Sepharose Na figura 41 est representada a matriz de ster met lico da histidina Sepharose que foi obtida pela liga o da histidina metil esterificada Sepharose pelo bis ep xido OH COOCH3 Arann Ko i Figura 41 Representa o esquem tica da matriz de ster met lico da histidina Sepharose Os ensaios que se apresentam de seguida t m como objectivo verificar se a introdu o do grupo metilo contribui ou n o para o aumento do tempo de reten o da mol cula alvo na matriz Na figura 42 A
64. cromatogr ficos anteriores figura 34 efectuaram se ensaios utilizando um gradiente crescente com tr s passos utilizando diferentes concentra es de sal No entanto n o se verificou nenhuma elui o selectiva 59 o 2 a 6 8 10 R 4 16 18 9 2 4 6 Ms rend toed das isoformas do pDNA nestes ensaios Verificou se que o pDNA ligou se coluna quando submetidos a baixas concentra es de NaCl 250 mM de NaCl e h medida que se aumentou o gradiente de concentra o as esp cies eluiram No entanto como se pode visualizar pelas electroforeses em gel de agarose as esp cies elu das no primeiro e segundo pico correspondentes elui o com 300 mM e 400 mM de NaCl s o relativas s isoformas oc e sc do pDNA linha 1 e 2 Como ao utilizar 300 mM de NaCl elu ram as duas isoformas baixou se a concentra o de sal para 270 mM figura 34 B e observou se a elui o de alguma biomol cula pico 3 que por electroforese se verificou ser correspondente elui o conjunta das duas isoformas linha 3 O pico 4 apresenta uma intensidade superior ao anterior indicando a elui o total do pDNA linha 4 Como mostra o perfil cromatogr fico da figura 34 C aquando da diminui o da concentra o para 260 mM de NaCl observou se reten o do pDNA com a coluna obtendo se posteriormente um pico 4 indicando a elui o total do pDNA a 400 mM de NaCl linha 5 Realizaram se ainda alguns ensaios utilizando as matrizes de ster e
65. da arginina lt 200 250 Sepharose Ester butilico da arginina lt 200 250 Sepharose Ester hexilico da arginina lt 80 100 Sepharose Ester octilico da arginina 0 Sepharose De seguida encontram se alguns exemplos de cromatogramas obtidos para cada amino cido e respectivos derivados As frac es obtidas de cada um dos picos foram analisadas por electroforese em gel de agarose a 1 de modo a identificar as esp cies que estavam a eluir e assim concluir acerca da interac o do pDNA com as diferentes matrizes 44 Arginina Sepharose Comparando esta matriz com a que esta representada na figura 17 verifica se que cont m a arginina como amino cido imobilizado figura 19 A escolha desta matriz teve como objectivo a compara o das condi es de reten o e elui o do pDNA entre esta e as matrizes derivadas da arginina por introdu o de novos grupos OH COOR Me E AW NH oN e OH NH2 Figura 19 Representa o esquem tica da matriz de arginina Sepharose Com a utiliza o desta matriz com arginina imobilizada espera se encontrar uma interac o com o pDNA A estrat gia de elui o usada foi seleccionada com base nos estudos publicados sobre a purifica o de pDNA com matriz de arginina uma vez que est descrito que o pDNA interage com a matriz aquando da adi o de baixas concentra es de NaCl e h medida que a for a i nica aumenta o pDNA elui 154 A B Arginina Sep
66. de selectividade torna a purifica o do pDNA muito dif cil de conseguir num nico passo 96 Na maior parte dos casos necess rio um segundo passo cromatogr fico ou passos de pr purifica o para obter o grau de pureza exigido 1 6 5 Cromatografia de afinidade A cromatografia de afinidade AC desempenha um papel poderoso na separa o biotecnol gica usa ligandos bioespec ficos para isolar e ou purificar biomol culas com base na sua fun o biol gica ou estrutura qu mica preservando deste modo a actividade biol gica das biomol culas 115 117 De todas as t cnicas de purifica o usadas correntemente a AC considerada como sendo a mais selectiva 82 115 118 121 Permite a separa o de biomol culas com base numa interac o revers vel entre a biomol cula alvo e um ligando espec fico ligado a uma matriz cromatogr fica figura 10 As interac es espec ficas que ocorrem entre os ligandos imobilizados na matriz e a mol cula alvo s o resultado de interac es electrost ticas interac es hidrof bicas for as de Van der Walls e ou liga es de hidr og nio 122 Figura 10 Cromatografia de afinidade Adaptado de Affinity Chromatography Principles and Methods Quando a amostra que cont m as biomol culas alvo aplicada na coluna ocorre uma captura selectiva dessas biomol culas pelo ligando uma vez que ocorrem condi es que favorecem a liga o espec fica para com o ligando imobilizado n
67. e seguida um decl nio no n mero de c lulas fase de decaimento ou morte celular 6 o N mero de C lulas lo Tempo Figura 1 Fases do crescimento de um microorganismo em cultura descont nua Adaptado de Ferreira E C 1995 O objectivo geral de um processo biotecnol gico com crescimento microbiano muitas vezes designado de fermenta o minimizar a dura o da fase de lat ncia e maximizar a taxa de crescimento e a dura o da fase exponencial comum perspectivar a obten o da dimens o para uma dada popula o no final do crescimento A din mica dos processos de fermenta o consequ ncia da cin tica de crescimento dos microorganismos da hidrodin mica e tipo de reactor do modo de alimenta o de substratos e nutrientes 4 Um processo biotecnol gico pode ser dividido em tr s fases prepara o do extracto que inclui a redu o de tamanho e fraccionamento esteriliza o das mat rias primas e do equipamento para crescimento do microrganismo produ o do microorganismo e a forma o do bioproduto desejado recupera o e purifica o do produto que consiste no seu isolamento e purifica o a partir do meio de fermenta o 5 Os microorganismos s o fontes muito importantes de produtos biotecnol gicos e t m sido desenvolvidas novas tecnologias de modo a 1 Aumentar a produ o desses produtos atrav s da tecnologia do cido desoxirribonucleico DNA recombinantes hiperpr
68. e L arginina o E Tw OH OH Ni Figura 29 Representa o esquem tica da matriz de ster oct lico da arginina Sepharose Ester ocalico ds arginina Sepharose ster oct lico da arginina Sepharose A Fs a Q v E o E 3 a E 5 2 lt 4 6 5 1 n a 1 15 o 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Pracgdes ecothidas Frac es recolhidas Figura 30 Perfil cromatogr fico obtido ap s injec o de pDNA oc sc utilizando um suporte de ster oct lico da arginina Sepharose com as respectivas electroforeses em gel de agarose a 1 P Amostra de pDNA injectado na coluna 1 Frac o recolhida usando 120 mM de NaCl do ensaio A 2 Frac o recolhida usando Tris HCI do ensaio B 3 Frac o recolhida usando 50 mM de NaCl do ensaio B 53 Gare 152 N Pelos cromatogramas obtidos e pelas respectivas an lises das frac es em electroforese em gel de agarose figura 30 verificou se que o pDNA n o se ligou coluna quando submetido a baixas concentra es de NaCl figura 30 A Mesmo utilizando o tamp o Tris HCl a mol cula alvo eluiu quase totalmente figura 30 B linha 2 Analisando os cromatogramas obtidos nos ensaios com as cadeias alqu licas de menor comprimento verifica se que o pDNA fica retido ao utilizar baixas concentra es de NaCl e h medida que a for a i nica aumenta o pDNA elui Mas tal facto n o se verifica nas matrizes ster hex lico da arginina Sepharose e ster oct lico da arginina
69. e caracterizada que esteja livre de qualquer contamina o e que n o seja prejudicial para o ambiente para o produto final para os pacientes e para as pessoas que est o envolvidas na produ o e manipula o 156 A bact ria E coli considerada como um hospedeiro ideal pois ao longo da hist ria cient fica tem reconhecida seguran a na utiliza o em produtos farmac uticos 157 158 O microrganismo utilizado neste estudo foi a estirpe de E coli DH5a contendo o plasm deo pVAX1 LacZ Invitrogen Este plasm deo cont m 6050 pares de bases e possui o gene de resist ncia canamicina como marca selectiva figura 13 pVAX1 lacZ 6050 bp Figura 13 Representa o esquem tica do plasm deo pVAX1 LacZ 29 II 1 2 Reagentes Nas tabelas seguintes apresentam se respectivamente os v rios tipos de matrizes e reagentes utilizados durante a realiza o deste trabalho experimental bem como os respectivos fornecedores Tabela 1 Tipos de matrizes utilizadas Arginina e derivados Histidina e derivados Arginina Sepharose Histidina Sepharose Ester metilico da arginina Sepharose Ester metilico da histidina Sepharose Ester et lico da arginina Sepharose Ester butilico da arginina Sepharose Ester hexilico da arginina Sepharose Ester octilico da arginina Sepharose 30 Tabela 2 Lista dos reagentes utilizados no decorrer do trabalho labo
70. e has been an increasing trend towards larger and larger doses of pDNA utilized in human trials Several chromatography based processes have been proposed but the affinity chromatography AC is considered the most specific technique of separation of pDNA since it allows the isolation of this biomolecule from a mixture due to the biospecific recognition by the immobilized ligand It can be said that the recent success of this technique for the purification of pDNA lies on the biospecificity and the use of amino acids as immobilized ligands have recently yielded interesting results Thus amino acid based AC represents a particularly promising approach to purify biomolecules since it combines the selectivity of a naturally occurring biological interaction with the simplicity of a single small molecule Histidine and arginine have already revealed their high applicability to isolate the supercoiled pDNA and therefore proved the presence of specific interactions between pDNA for both amino acids In this communication we present our last results on the use of a serial of arginine modified ligands in AC for the purification of plasmids for gene therapy We report the preparation of histidine and arginine derivatives where the hydrophobic nature are enlarged by their esterification with alcohols with increasing lengths of alkyl chain namely methyl ethyl butyl hexyl and octyl one Plasmid samples were loaded onto the chromatographic matrices in order t
71. elective purification of supercoiled plasmid DNA from clarified cell lysates with a single histidine agarose chromatography step Biotechnol Appl Biochem vol 45 pp 131 140 154 Sousa F Matos T Prazeres D M F Queiroz J A 2008 Specific recognition of supercoiled plasmid DNA in arginine affinity chromatography Anal Biochem vol 374 pp 432 434 89 155 Sousa F Tomaz C T Prazeres D M F Queiroz J A 2005 Separation of supercoiled and open circular plasmid DNA isoforms by chromatography with a histidine agarose support Anal Biochem vol 343 pp 183 185 156 Schleef M 1999 Issues of large scale plasmid DNA manufacturing In Recombinant proteins monoclonal antibodies and therapeutic genes wiley VCH Weinheim 157 Vyas V V Gupta S Sharma P 1994 Stability of recombinat shuttle plasmid in Bacillus subtilis and Escherichia coli Enzyme Microb Technol vol 16 pp 240 246 158 Zhang J Greasham R 1999 Chemically defined media for commercial fermentations Appl Microbiol Biotechnol vol 51 pp 407 421 159 Boissonnas R A Guttmann S Huguenin R L Jaquenoud P A Sandrin E 1958 Helv Chim Acta vol 41 pp 1867 1882 160 Hermanson G T Mallia A K Smith P K 1992 Immobilized Affinity Ligand Techniques Academic Press New York 161 Arakawa T Tsumoto K Nagase K Ejima D 2007 The effects of arginine on protein binding and
72. emonstrada anteriormente e tal que o plasm deo que cont m as sequ ncias alvo pode ser isolado enquanto que outro plasm deo que partilha 7 pares de bases pb das 9 pb da sequ ncia de reconhecimento n o reconhecido 146 Nesta experi ncia a prote na ZF foi fundida com a glutationa S transferase GST ZnF e imobilizada em Sepharose O baixo rendimento obtido foi atribu do ao restrito acesso e mobilidade da prote na de fus o na matriz de Sepharose 1 6 5 4 Cromatografia de afinidade DNA amino cidos A AC baseada em amino cidos representa uma abordagem promissora uma vez que combina a selectividade de uma interac o biol gica com a simplicidade de uma pequena mol cula baseadas em amino cidos 147 Vijayalakshmi et al foram os primeiros investigadores a utilizarem pequenos ligandos moleculares para a purifica o de imunoglobulinas e para uma variedade de prote nas 148 Mas o conceito de utilizar ligandos menos selectivos tem sido aplicado para a purifica o do pDNA nomeadamente usando a histidina e arginina como ligandos imobilizados que como previsto por estudos at micos interagem preferencialmente com bases espec ficas de cidos nucle cos 149 150 Os suportes cromatogr ficos e as membranas derivatizadas com histidina foram utilizados pela primeira vez para a purifica o de prote nas 116 151 e oligossacar deos 152 No caso da purifica o de pDNA e segundo Sousa e colaboradores a
73. ensaio B 3 Frac o recolhida usando 2 0 M de NH4 2SOx do ensaio B Analisando os cromatogramas correspondentes matriz de ster hex lico da arginina Sepharose figura 35 verifica se que como j tinha sido referido anteriormente as elevadas concentra es de sulfato de am nio favorecem a reten o do plasm deo Ao tentar separar as isoformas do pDNA utilizando as concentra es descritas na figura A 3 0 M 2 3 M e 2 0 M de NH4 2SOx verificou se que continuou retido a 2 3 M de NH gt SO4 elu ndo totalmente aquando da adi o de 2 0 M de NH4 2SOx correspondente ao primeiro pico linha 1 Ao diminuir a concentra o de sal usada neste passo interm dio para 2 2 M NHy4 2SO figura B observa se a elui o das esp cies em dois picos linha 2 e 3 de referir que ambas as isoformas eluem nestas condi es apesar de na electroforese n o serem muito vis veis as bandas correspondentes isoforma oc linha 2 e 3 Utilizaram se as mesmas condi es para a matriz de ster oct lico da arginina Sepharose e observou se que os resultados s o semelhantes aos do ster hex lico da arginina Sepharose Como se pode visualizar atrav s das figuras 33 35 n o se conseguiu separar diferencialmente as duas isoformas do pDNA O facto de estes estudos serem realizados em colunas de bancada sem o controlo da temperatura tamb m pode influenciar o resultado na medida em que a separa o das isoformas req
74. ente cria po os que ser o utilizados para a coloca o das amostras As amostras utilizadas neste trabalho experimental foram corridas com uma pot ncia de 120 V utilizando a solu o TAE como tamp o de corrida Por fim os g is foram visualizados atrav s de uma c mara cujo modelo CV A5S0C 37 CAP TULO III Resultados e Discuss o 38 Alguns tipos de cromatografia de afinidade foram j implementados para a purifica o de plasm deos como a IMAC a THAC ou a cromatografia com prote na imobilizada e mais recentemente uma nova abordagem de cromatografia de afinidade com amino cidos imobilizados foi desenvolvida combinando a selectividade da interac o biol gica e de ocorr ncia natural entre prote nas e DNA com a utiliza o de amino cidos como ligandos mais simples 147 As estrat gias de purifica o de pDNA utilizando amino cidos como ligandos imobilizados em matrizes cromatogr ficas produziram recentemente resultados interessantes demonstrando que a purifica o de pDNA para posterior aplica o terap utica nomeadamente terapia g nica e vacinas de DNA poss vel utilizando estas matrizes Deste modo este trabalho teve como principal objectivo o estudo do comportamento de suportes cromatogr ficos de afinidade usando amino cidos e derivados como ligandos espec ficos para purificar o pDNA Com a colabora o do grupo de org nica procedeu se s ntese e imobiliza o de derivados de amino cidos de
75. er hex lico da arginina Sepharose e ster oct lico da arginina Sepharose desfavorecem a interac o com o plasm deo nos casos em que se utilizaram tamp es de elui o com baixa for a i nica n o favorecendo as interac es electrost ticas Ent o efectuou se outro estudo utilizando elevadas concentra es de NH4 2SO 4 para explorar a possibilidade de ocorr ncia de outro tipo de interac o como interac es hidrof bicas entre o pDNA e as matrizes de cadeia alqu lica de maior tamanho Verificou se que utilizando estas condi es houve interac o do pDNA com as respectivas matrizes Conclu se assim que as matrizes que apresentam a cadeia alqu lica de maior tamanho causam uma diminui o da reten o para baixas concentra es de sal possivelmente 73 devido a um impedimento estereoqu mico mas explorando a interac o hidrof bica que envolvem estas cadeias poss vel promover a interac o com o pDNA Ao se tentar separar as diferentes isoformas do pDNA verificou se que os resultados n o foram totalmente satisfat rios E necess rio melhorar as condi es de forma a obter a isoforma sc do pDNA purificada Ainda est o em desenvolvimento estudos conducentes caracteriza o das interac es induzidas pelos ligandos modificados da histidina e arginina A implementa o de novas estrat gias terap uticas parcialmente dependente da evolu o da tecnologia do pDNA Devido singula
76. eral da arginina e o bra o espa ador e neste caso em particular a cadeia alqu lica associada arginina desempenhando um papel importante na liga o do pDNA s matrizes 131 55 Ow Fostul Ester octilico da arginina Sepharose Aplicando a mesma estrat gia que a descrita anteriormente para a matriz de ster hex lico da arginina Sepharose figura 32 A obtiveram se os seguintes cromatogramas dos ensaios realizados na matriz ster octilico de arginina Sepharose com um gradiente decrescente de concentra o de sulfato de am nio Ester oculico da arginina Sepharose Ester octlico ds arginina Sepharose o i gt 5 2 5 2 E 2 E N 2 a 1 g 03 o a PA oc 2 z 19 E c o 0 o 2 4 6 a to 12 14 t 18 Fru essecolhidas Frac es recolhidas Figura 32 Perfil cromatogr fico obtido ap s injec o de pDNA oc sc utilizando um suporte de ster oct lico da arginina Sepharose com as respectivas electroforeses em gel de agarose a 1 P Amostra de pDNA injectado na coluna 1 Frac o recolhida usando 2 0 M de NH SO do ensaio A 2 Frac o recolhida usando 2 0 M de NH SO do ensaio B Pelo cromatograma obtido e pela electroforese correspondente figura 32 A linha 1 verificou se que o pDNA n o se ligou coluna quando submetido s condi es descritas 2 0 M 1 0 M de NH4 2SO e Tris HCl No entanto ao aumentar tamb m a concentra o inicial pa
77. erificado a n tida separa o de diversos pigmentos corados Desde ent o enormes avan os t m sido concretizados no desenvolvimento e aperfei oamento desta importante t cnica de separa o 80 A descoberta da cromatografia por M Tswett foi um passo decisivo na evolu o do uso da adsor o como t cnica de separa o tendo possibilitado importantes aplica es anal ticas e preparativas em v rias reas cient ficas Apesar da disponibilidade de diferentes m todos de purifica o de biomol culas actualmente a t cnica de cromatografia tem sido utilizada com frequ ncia devido ao seu elevado poder de resolu o Estima se actualmente que mais de 50 das an lises efectuadas em todo o mundo envolvam t cnicas cromatogr ficas cujo princ pio b sico envolve uma separa o de misturas por interac o diferencial dos seus componentes entre uma fase estacion ria l quido ou s lido e uma fase m vel l quido ou g s Em todos os sistemas cromatogr ficos existem tr s elementos fundamentais nomeadamente a fase estacion ria a fase m vel e a amostra a separar A separa o dos componentes da amostra geralmente conseguida por elui o em que as for as de liga o matriz s o perturbadas atrav s da altera o da composi o da fase m vel de um modo cont nuo gradiente linear ou de um modo descont nuo gradiente por passos 81 A cromatografia uma das t cnicas mais poderosas e vers teis 82 uma ve
78. estes componentes possuem a capacidade de induzir respostas imunol gicas e biol gicas indesej veis devem ser eliminados ao longo de purifica o 10 A purifica o de plasm deos exige tamb m a remo o de qualquer subst ncia usada ao longo do processamento que possa induzir efeitos t xicos aquando da sua utiliza o posterior em estudos de transfec o 163 A realiza o deste trabalho demonstra que o plasm deo pVAX1 LacZ 6 05 kpb foi inserido e amplificado na E coli DHS a Ap s a produ o do pDNA por fermenta o a recupera o pode ser feita utilizando v rias t cnicas como a precipita o por surfactantes ou extrac o de sistema por duas fases aquosas mas a cromatografia a t cnica preferida para realizar uma prepara o final de plasm deo com o desejado grau de purifica o 10 Foram efectuados v rios passos de reten o elui o de modo a determinar as condi es espec ficas de liga o do pDNA As diversas experi ncias realizadas para estabelecer essas condi es revelaram extrema sensibilidade do comportamento de reten o elui o do pDNA no que diz respeito for a i nica do tamp o utilizado Verificou se que uma ligeira altera o na concentra o de NaCl pode modificar a reten o do plasm deo A introdu o de pequenas cadeias alquilicas como os steres met lico e et lico da arginina induz uma maior reten o do plasm deo As cadeias alqu licas de maior comprimento st
79. eta sem um controlo rigoroso da qualidade do plasm deo Assim o plasm deo obtido utilizando esta t cnica de purifica o foi caracterizado sendo garantida a sua qualidade por meio da redu o do gDNA e endotoxinas para n veis aceit veis 153 Baseando nos nestes resultados e uma vez j estabelecidas as condi es que favorecem a reten o elui o do pDNA procedeu se tentativa de separar as diferentes isoformas ster met lico da histidina Sepharose Trabalhando na gama anteriormente referida fixou se um gradiente por passos entre 3 0 M e 20 M estabelecendo se esta gama de concentra es para testar a elui o diferenciada das duas isoformas do pDNA De seguida apresenta se o perfil cromatogr fico desta estrat gia e a respectiva electroforese indicando as esp cies que eluiram 70 Ester met lico da histidina Sepharose Absorvincia 260 run CAD Pos CHN 10 12 14 16 18 Frac es ecolhidas Figura 43 Perfil cromatogr fico obtido ap s injec o de pDNA oc sc utilizando um suporte de ster met lico da histidina Sepharose com a respectiva electroforese em gel de agarose a 1 P Amostra de pDNA injectado na coluna 1 Frac o recolhida usando 2 3 M de NH4 2SO 2 Frac o recolhida usando 2 0 M de NH SO Neste ensaio cromatogr fico figura 43 obtiveram se dois picos em que o primeiro corresponde s esp cies elu das quando se utilizou 2 3 M de NH4 SO e o segundo corres
80. harose z Arginina Sepharose 08 500 o 08 2 300 1 aco 06 4 g gt 06 Bp 5 n Zz 5 200 amp ma g a a a na S g 04 amp 200 5 E 100 2 02 Z i 100 2 02 r o o 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 o 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Frac es recolhid Frac es recolhidas Figura 20 Perfil cromatogr fico obtido ap s injec o de pDNA oc sc utilizando um suporte de arginina Sepharose com as respectivas electroforeses em gel de agarose a 1 P Amostra de pDNA injectado na coluna 1 Frac o recolhida usando 300 mM de NaCl do ensaio A 2 Frac o recolhida usando 200 mM de NaCl do ensaio B 45 yr oe n Analisando a figura 20 A observa se que a coluna foi equilibrada com 120 mM de NaCl em 10 mM de tamp o Tris HCI pH 8 0 Ap s a aplica o do pDNA verifica se que o pDNA ficou retido a 120 mM de NaCl eluindo totalmente a 300 mM de NaCl pico 1 Como o plasm deo ficou retido a 120 mM de NaCl testou se a hip tese de aumentar a concentra o de sal inicial para verificar o perfil de reten o Deste modo aumentou se a concentra o para 150 mM de NaCl figura 20 B e observou se que nesta condi o ocorre interac o do pDNA com a matriz eluindo totalmente a 200 mM do mesmo sal pico 2 As frac es foram agrupadas de acordo com os cromatogramas obtidos e analisados por electroforese em gel de agarose onde se observou a elui o do plasm deo de interesse linha 1 e 2 Foram ainda realizad
81. i descrito para a matriz de histidina Utilizando elevadas concentra es de sal o pDNA interage com a matriz eluindo aquando da diminui o da concentra o de sal 155 Assim o ensaio controlo sem o amino cido foi realizado seguindo a mesma estrat gia Matnz com bra o espa ador sem o amino cido imobilizado Absorvancia 260 nm CAD Po SHNI O 2 4 6 B 10 12 14 16 18 20 22 24 Frac es racolhidas Figura 38 Perfil cromatogr fico obtido ap s injec o de pDNA oc sc utilizando um suporte de Sepharose com a respectiva electroforese em gel de agarose a 1 P Amostra de pDNA infectado na coluna 1 Frac o recolhida usando 2 0 M de NH4 SO 2 Frac o recolhida usando Tris HCl A coluna foi equilibrada com 2 5 M de NH4 2SO4 em 10 mM de tamp o Tris HCl pH 8 0 Ap s a aplica o do pDNA verifica se que o pDNA ficou retido a 2 5 M e a 2 3 M de NH SO figura 38 Foi realizado um passo de elui o a 2 0 M de NH SO4 linha 1 da figura 38 destinada a eluir as esp cies com baixa afinidade A elui o das esp cies que se ligaram foi realizada seguidamente com a aplica o do tamp o Tris HCl linha 2 da figura 38 As frac es foram agrupadas de acordo com os cromatogramas obtidos e analisados por electroforese em gel de agarose Verifica se que ambas as isoformas do plasm deo elu ram maioritariamente a 2 0 M de NH SO4 havendo outra elui o com Tris HCl Ao testar estas condi es verificou se
82. ilizando oligonucleot deos imobilizados para formar uma h lice tripla 126 127 Apesar da elevada selectividade este m todo geralmente caracterizado pela fraca liga o cin tica e limitado para sequ ncias de bases espec ficas de DNA aumentando assim os custos E poss vel desenhar e criar ligandos de afinidade est veis capazes de discriminar e de se ligarem selectivamente a biomol culas alvo na presen a de impurezas Varley e seus 21 colaboradores mostraram que um ligando com uma constante de dissocia o optimizada facilita a purifica o do pDNA por AC A constante de dissocia o optimizada para mecanismos de liga o por afinidade para uso num sistema cromatogr fico de 10 M a 10M Se a constante for superior a este valor os contaminantes podem ser co purificados tornando o mecanismo insuficientemente selectivo para o alvo Caso a constante seja baixa o rendimento da liga o baixo Os actuais sistemas de purifica o industriais normalmente utilizam v rias etapas de filtra o e tr s etapas cromatogr ficas exigindo um rendimento de pelo menos 90 58 Uma purifica o fi vel por afinidade exige n o s ligandos optimizados mas tamb m a selec o de uma matriz estacion ria adequada 128 nomeadamente a natureza e activa o da matriz as propriedades do bra o espa ador e mecanismos de imobiliza o de ligandos 129 A escolha da matriz e as condi es a serem utilizadas depender das
83. imobilizado e as mol culas alvo Deste modo a liga o nunca pode ser efectuada pelo s tio activo mas sim por um s tio pouco cr tico Utilizam se frequentemente cadeias espa adoras e mol culas de baixo peso molecular que s o introduzidas entre a matriz e o ligando com o intuito de aumentar a acessibilidade do ligando s macromol culas com as quais deve interactuar uma vez que os s tios activos de muitas subst ncias biol gicas est o localizados profundamente dentro da mol cula 123 23 Relativamente activa o da matriz s o referidos v rios processos sendo os mais utilizados os m todos que empregam o brometo de cianog nio ep xidos carbonildiimidaz is cloreto de p toluenossulfonilo divinilsulfonas e cloreto de cian rilo 115 125 134 1 6 5 1 Cromatografia de afinidade com metais imobilizados A cromatografia de afinidade com metais imobilizados IMAC favorece as interac es de afinidade entre os i es met licos imobilizados num suporte atrav s de compostos quelantes e as mol culas alvo de modo a permitir uma separa o eficiente entre as mol culas alvo e outros compostos presentes numa mistura 135 O princ pio da IMAC baseia se no facto de que os metais de transi o Cu Ni Zn e Co poderem coordenar com alguns amino cidos tais como a histidina ciste na e triptofano atrav s dos grupos dadores de electr es nas cadeias laterais desses amino cidos A utiliza o destas interac
84. impulso surgiu nas duas ltimas d cadas com o acentuado desenvolvimento na biologia molecular 3 e no controlo dos processos fermentativos 4 Assim n o s se criaram novas aplica es para a biotecnologia como se melhorou a efici ncia e a economia das j estabelecidas ind strias biotecnol gicas A produ o num processo biotecnol gico pode dividir se em duas categorias reac es de crescimento microbiano reac es microbiol gicas e reac es catalisadas por enzimas reac es bioqu micas ou bio transforma es O crescimento dos organismos num reactor decorre atrav s do fornecimento ao meio l quido de certos nutrientes ou substratos fontes de carbono azoto oxig nio vitaminas micronutrientes na presen a de condi es ambientais favor veis temperatura pH arejamento agita o Um reactor portanto um tanque onde ocorre uma ou v rias reac es biol gicas geralmente em meio l quido A figura 1 representa a varia o do n mero de c lulas vivas ao longo do tempo para o crescimento de um dado microorganismo em cultura descont nua S o evidenciadas as v rias fases do crescimento uma primeira fase ap s inocula o em que n o se verifica crescimento fase de lat ncia 1 uma fase de acelera o 2 uma fase de crescimento exponencial 3 seguida de desacelera o 4 para se atingir uma fase estacion ria 5 em que se alcan a o m ximo crescimento celular Eventualmente poder ocorrer d
85. jun o de duas cadeias de DNA anti paralelas resulta numa estrutura em dupla h lice que estabilizada por liga es por pontes de hidrog nio entre nucle tidos complementares de cadeias opostas As bases arom ticas dos nucle tidos est o inseridas umas sobre as outras e orientadas para o interior da mol cula perpendicularmente estrutura a car fosfato O interior da h lice dupla portanto altamente hidrof bico devido presen a das bases arom ticas 47 Os plasm deos podem existir sob diferentes conforma es topol gicas figura 4 nomeadamente na conforma o sc a conforma o oc linear e multimeros A isoforma sc surge quando o eixo da h lice do pDNA est enrolado tridimensionalmente sobre si pr prio formando esta mol cula de ordem superior 10 caso o plasm deo sofra um corte numa das cadeias a estrutura sc perde se originando uma estrutura oc e se o corte for em ambas as cadeias a estrutura passa a ser linear 47 a b c i Figura 4 Representa o das diferentes isoformas do pDNA a superenrolada b linear e c circular aberta Adaptado de Schleef et al 2004 I 4 Produ o de DNA plasmidico O processo de desenvolvimento para a produ o do pDNA geralmente come a numa pequena escala com a constru o e selec o de vectores de express o apropriados produ o de microrganismos seguido pela selec o e optimiza
86. l Environ Microbiol vol 56 pp 1004 1011 72 Cherrington C A Hinton M Chopra I 1990 Effect of short chain organic acids on macromolecular synthesis in Escherichia coli J Appl Bacteriol vol 68 pp 69 74 73 Chen W Frazen P A 1999 Automated high yield fermentation of plasmid DNA in Escherichia coli United States Patent No 5955323 Sep 21 74 Belo I Santos J A L Cabral J M S Mota M 1996 Optimization of bead mill disruption of Escherichia coli TB 1 cells for cytochrome b5 recovery Biotechnol Prog vol 4 pp 15 21 75 Schutte H Kula M R 1993 Cell disruption and isolation of non secreted products In Stephanopoulos Ed Biotechnology bioprocessing vol 3 pp 505 526 76 Kennedy J F Cabral J M S 1993 Recovery Processes for Biological Materials John Wiley amp Sons New York 77 Prave P Faust U Sittig W Sukatsch D A 1987 Basic Biotechnology Verlag Chemie Weinheim pp 279 321 78 Levy M S 1999 Effect of shear on plasmid DNA solution Bioprocess Eng vol 20 pp 7 13 79 Ciccolini L A et al 1998 Time course of SDS alkaline lysis of recombinant bacterial cells for plasmid release Biotechnol Bioeng vol 60 pp 768 770 80 Ettre L S 2000 Chromatography the separation technique of the 20th century Chromatog vol 51 pp 7 17 81 Garcia F A P Pires E M V 1993 Recovery Processes for Biological Materia
87. ls John Wiley amp Sons New York 82 Narayanan S R 1994 Preparative affinity chromatography of proteins J Chromatogr A vol 658 pp 237 258 82 83 Diogo M M Queiroz J A Monteiro G A Martins S A Ferreira G N Prazeres D M F 2000 Purification of a Cystic Fibrosis Plasmid Vector for Gene Therapy Using Hydrophobic Interaction Chromatography Biotechnol and Bioengineering vol 68 pp 576 583 84 Jungbauer A 2005 Hydrophobic interaction chromatography of proteins III Unfolding of proteins upon adsorption J Chromatogr A vol 1079 pp 221 228 85 Xiao Y 2007 Generalizing a two conformation model for describing salt and temperature effects on protein retention and stability in hydrophobic interaction chromatography J Chromatogr A vol 1157 pp 197 206 86 Van Oss C J Good R J Chaudhury M K 1986 The role of Van der Waals forces and hydrogen bonds in hydrophobic interaction between biopolymers and low energy surfaces J Colloid Interface Sci vol 111 pp 378 390 87 Narhi L O Kita Y Arakawa T 1989 hydrophobic interaction cromatography in alkaline pH Anal Biochem vol 182 pp 266 270 88 Commings D E Miguel A G Lesser B H 1979 Nuclear proteins VI Fractionation of chromosomal non histone proteins using hydrophobic chromatography Biochem Byophys Acta Amsterdam vol 563 pp 253 260 89 Hrkal Z Rejnkova L
88. mas para entrega dos cidos nucleicos s c lulas alvo apresentando se deste modo como o sistema de transfer ncia g nica mais atractivo para fins comerciais 33 Embora os genes terap uticos possam ser transportados por v rios tipos de vectores 33 os vectores de pDNA s o considerados mais seguros mais simples de usar e mais f ceis de produzir em grande escala 34 Estudos realizados por Chattergoon e seus colaboradores verificaram que a transfec o afecta a fisiologia da c lula 35 Neste caso particular foi estudada a capta o e express o in vivo de transgenes inseridos num plasm deo injectado no m sculo da perna de camundongos 36 A express o de prote nas heter logas foi detectada 60 dias ap s a injec o indicando que os genes eram expressos in vivo durante um per odo alargado de tempo sugerindo potenciais aplica es terap uticas 36 37 Desde ent o a injec o intramuscular de pDNA tem sido amplamente utilizada na terapia g nica e em vacinas de DNA Deste modo o n mero de protocolos aprovados utilizando m todos de entrega de genes com base em vectores de pDNA aumentou cerca de 25 desde 1995 ao passo que o n mero de protocolos aprovados usando vectores virais decresceu 38 39 Em particular o pDNA est a ganhar um grande interesse figura 2 uma vez que apresenta um perfil de seguran a adequado n o induz toxicidade e mais simples de desenvolver que os sistemas virais actuais 40 gt
89. mobiliza o dos steres da L arginina em Sepharose 41 Figura 16 Reac o Si tie onda cenas lt Ds ON ad eect gua nan aaa ads 42 Figura 17 Representa o esquem tica da matriz com o bra o espa ador sem o AMINDACI OS sustenta sera RARE eae DAR ced Ri e DR AEE EREE 42 Figura 18 Perfil cromatogr fico obtido ap s injec o de pDNA oc sc utilizando um suporte de Sepharose e respectiva electroforese em gel de agarose a 1 43 Figura 19 Representa o esquem tica da matriz de arginina Sepharose 45 Figura 20 Perfil cromatogr fico obtido ap s injec o de pDNA oc sc utilizando um suporte de arginina Sepharose com as respectivas electroforeses em gel de agarose E Ee O RD RREO DR PAR DO PRENDE RR E RD ROMAN O ORI NPR 45 Figura 21 Representa o esquem tica da matriz de ster met lico da arginina Sepharose kered ni ds a apa a a Rs LU a add p 47 Figura 22 Perfil cromatogr fico obtido ap s injec o de pDNA oc sc no suporte de ster met lico da arginina Sepharose com as respectivas electroforeses em gel de agarose a To aaa mitane teea tena mae aaa cego nn a dO SR Ren den saanesoanaeassavs len A NAER iiai 47 Figura 23 Representa o esquem tica da matriz de ster et lico da arginina Sepharose E is UE DA O RD a O eon ee pee eyes Deaton eon we 49 Figura 24 Perfil cromatogr fico obtido ap s injec o de pDNA
90. ncipalmente pelas for as de van der Waals 86 A exig ncia de uma elevada concentra o de sal muitas vezes vista como uma desvantagem especialmente no que diz respeito aplica o industrial deste m todo porque o uso do sal est associado a elevados custos e a um maior impacto ambiental 84 85 Embora o sulfato de am nio seja o sal mais utilizado na HIC outros sais como o glutamato de s dio sulfato de s dio sulfato de guanidino aspartato de s dio e cloreto de s dio tamb m s o utilizados 87 O desenvolvimento de grande variedade de fases estacion rias para HIC tem proporcionado um aumento da aplica o desta cromatografia como passo final de purifica o para remover contaminantes de amostras quase puras o que poder ser extremamente til na purifica o de biomol culas como prote nas terap uticas DNA agentes pirog nicos nomeadamente endotoxinas prote nas s ricas prote nas nucleares hormonas prote nas recombinantes e enzimas 88 92 A purifica o de plasm deos usando a cromatografia de interac o hidrof bica tem por base de separa o as diferen as de hidrofobicidade do pDNA e das impurezas RNA e gDNA desnaturado Atrav s de matrizes derivatizadas com ligandos hidrof bicos e usando um eluente de elevada for a i nica poss vel eluir e separar em primeiro lugar pDNA na conforma o sc e oc de RNA gDNA endotoxinas formas de plasm deo desnaturado e oligonucle tidos 83 Basicamente
91. nd transfer to production J Chromatogr A vol 1065 pp 93 106 46 Boles T C White J H Cozzarelli N R 1990 Structure of plectonemically supercoiled DNA J Mol Biol vol 213 pp 931 951 47 Sinden R R 1994 DNA Structure and Function Academic Press Inc San Diego USA 48 Summers D K 1996 The Biology of Plasmids Blackwell Science Ltd Oxford UK 49 Vologodskii A V Levene S D Klenin K V Frank Kamenetskii M Cozzarelli N R 1992 Conformational and thermodynamic properties of supercoiled DNA J Mol Biol vol 227 pp 1224 1243 79 50 Murphy J C Wibbenmeyer J A Fox G E Willson R C 1999 Purification of plasmid DNA using selective precipitation by compactation agents Nature Biotechnol vol 17 pp 822 823 51 Han Y Liu S Ho J Danquah M K Forde G M 2009 Using DNA as a drug Bioprocessing and delivery strategies Chemical Eng Research and Design vol 87 pp 343 348 52 Wang Z Le G Shi W Wegrzyn G 2001 Medium design for plasmid DNA production based on stoichiometric model Process Biochem vol 36 pp 1085 1093 53 Mor G 1998 Plasmid DNA a new era in vaccinology Biochem Pharm vol 55 pp 1151 1153 54 Robinson H Hunt L Webster R 1993 Protection against a lethal influenza virus challenge by immunization with a haemagglutinin expressing plasmid DNA Vaccine vol 11 pp 957 60 55 Kieny
92. ndo um suporte de ster et lico da arginina Sepharose com as respectivas electroforeses em gel de agarose a 1 P Amostra de pDNA injectado na coluna 1 Frac o recolhida usando 300 mM de NaCl do ensaio A 2 Frac o recolhida usando 300 mM de NaCl do ensaio B 3 Frac o recolhida usando 250 mM de NaCl do ensaio C 4 Frac o recolhida usando 500 mM de NaCl do ensaio C Analisando os perfis cromatogr ficos da figura 24 verifica se tamb m que o ppNA liga se matriz utilizando baixas concentra es de sal e medida que a for a i nica do tamp o aumenta o plasm deo elui Relativamente figura 24 A testaram se as seguintes condi es 120 mM de NaCl 300 mM de NaCl e 500 mM de NaCl O pDNA ficou retido a baixas concentra es de sal eluindo totalmente 300 mM de NaCl linha 1 Na figura 24 B observa se que o pDNA retido a 150 mM de NaCl e a 200 mM de NaCl eluindo a 300 mM de NaCl linha 2 O resultado apresentado na figura 24 C mostra que o plasm deo retido a 150 mM eluindo maioritariamente a 250 mM de NaCl linha 3 e a 500 mM de NaCl linha 4 Este ltimo perfil cromatogr fico serviu para identificar a 49 Fesc es scomtssas Eser etuico ds arginina Sepharose n l4 16 Ge iow concentra o m nima que favorece a elui o da mol cula alvo Assim se conclui que concentra es de NaCl inferiores a 200 mM de NaCl favorecem a reten o do pDNA mas a sua elui o imediatamente promovida
93. o Este ensaio foi realizado como branco de modo a estudar o tipo de interac o que pode ocorrer entre o pDNA e o bra o espa ador usando condi es similares s utilizadas nos estudos das restantes matrizes Equilibrou se a coluna com Tris HCl adicionaram se 100 uL da amostra e posteriormente aumentou se a for a i nica utilizando as concentra es de 200 mM e 500 mM de NaCl A selec o destas condi es est 42 associada ao comportamento de reten o do pDNA que j foi descrito para a matriz de arginina 161 A liga o ocorre para baixa for a i nica e a sua elui o promovida por aumento da concentra o de sal Assim o ensaio controlo sem o amino cido foi realizado seguindo a mesma estrat gia Matriz com bra o espa ador sem o amino cido imobilizado 0 2 1 P 1 21 400 E fem amp i E a a a sc E 200 S E 5 2 o 0 o 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Frace Ges recolhidas Figura 18 Perfil cromatogr fico obtido ap s injec o de pDNA oc sc utilizando um suporte de Sepharose e respectiva electroforese em gel de agarose a 1 P Amostra de pDNA injectado na coluna 1 Frac o recolhida usando coluna de Sepharose Tris HCl Como se pode visualizar atrav s da figura 18 o pDNA elui imediatamente aquando da aplica o do Tris HCl indicando fracas interac es da mol cula com esta matriz e particularmente com o bra o espa ador Este resultado indica que segundo as condi es
94. o 0 o 2 45 mu ua a a o 2 a on Frac es recolhidas Frac es recolhidas Figura 31 Perfil cromatogr fico obtido ap s injec o de pDNA oc sc utilizando um suporte de ster hex lico da arginina Sepharose com as respectivas electroforeses em gel de agarose a 1 P Amostra de pDNA injectado na coluna 1 Frac o recolhida usando 2 0 M de NH 2SO do ensaio A 2 Frac o recolhida usando 2 0 M de NH SO do ensaio B No primeiro ensaio figura 31 A verificou se que o perfil cromatogr fico apresenta um pico aquando da elui o com 2 0 M de NH SO 0 que sugere uma fraca interac o do pDNA com a matriz nestas condi es No segundo ensaio aumentou se a concentra o de sal inicial para 3 0 M e observou se que este aumento de concentra o favorece a liga o do pDNA matriz de ster hex lico da arginina Sepharose sendo poss vel a sua reten o na coluna Quando se diminuiu a concentra o de sal para 20 M de NH4 2SO4 o pDNA eluiu indiferencialmente figura 31 B linha 2 sem que ocorra selectividade em rela o a qualquer das isoformas Pode se ent o concluir que o pDNA interage com esta matriz a 3 0 M de NH4 SO eluindo a 2 0 M de NH4 2SO4 Segundo ja descrito a matriz de arginina promove m ltiplas interac es com o pDNA incluindo n o s interac es electrost ticas como tamb m interac es hidrof bicas Estas interac es s o poss veis uma vez que envolvem a parte alif tica da cadeia lat
95. o achieve the respective retention patterns and to find the dependence of the interactions at different ionic strengths The general results revealed that the influence of the introduction of small alkyl chain like methyl and ethyl esters on the histidine and arginine amino acid induced an increasing of the plasmid retention However higher length alkyl chains did not favoured the interaction when low ionic strength elution buffers were used We supposed that the complexity of the ligand may compromise the access of plasmid molecules to the binding sites Further studies are still ongoing in order to fully characterize the interactions induced by all the novel arginine modified ligands Keywords Affinity chromatography arginine histidine XV LISTA DE ABREVIATURAS A adenina Abs absorv ncia AC cromatografia de afinidade AEX cromatografia de troca ani nica ATP adenosina trifosfato C citocina DNA cido Desoxirribonucleico E coli Escherichia coli EMEA European Medical Agencies FDA Food and Drug Administration G guanina gDNA DNA gen mico HIC Cromatografia de interac o hidrof bica IDA cido iminodiac tico IgG imunoglobulina G IMAC cromatografia de afinidade com metais imobilizados LB agar Luria Bertani nm nam metros oc circular aberta pb pares de bases pDNA DNA plasm dico RNA cido ribonucleico rpm rota es por minuto sc superenrolado XVI SEC cromatografia de e
96. o o NH NH A dd mu Y R OH NH O s E Figura 21 Representa o esquem tica da matriz de ster met lico da arginina Sepharose Neste estudo come ou se por testar as mesmas condi es referidas para o ensaio representado na figura 20 A para comparar o perfil de reten o entre as matrizes A estrat gia de elui o usada foi semelhante apresentada para a matriz anterior ou seja aumentando a concentra o A B C co da arginina 3 P ra a em Eves metlico ds grina Saphir ose 1 so 00 28 P 3 390 w gt 8 8 b 2 a 8 8 w ren fp ex Absocvine ta 260 rm o gt r 200 oor kyn Absorvinc ia 260 run 2 4 2 o 2 6 8 10 12 14 436 18 o 2 46 8 amp 8 0 1 14 16 1 6 8 10 1 Frac bes acolt tas E Prac es meolhidas Frac es ecolhidas Figura 22 Perfil cromatogr fico obtido ap s injec o de pDNA oc sc no suporte de ster met lico da arginina Sepharose com as respectivas electroforeses em gel de agarose a 1 P Amostra de pDNA injectado na coluna 1 Frac o recolhida usando 300 mM de NaCl do ensaio A 2 Frac o recolhida usando 500 mM de NaCl do ensaio A 3 Frac o recolhida usando 500 mM de NaCl do ensaio B 4 Frac o recolhida usando 400 mM de NaCl do ensaio C Na figura 22 est o representados alguns cromatogramas obtidos no estudo de caracteriza o da reten o e elui o do pDNA na matriz de ster met lico da arginina
97. odu o por manipula o gen tica 2 Aumentar o grau de extrac o do produto do meio de fermenta o 3 Integrar a fermenta o com a recupera o e purifica o de modo a obter um produto puro e econ mico A aplica o da tecnologia de DNA recombinante permitiu a obten o de produtos heter logos nomeadamente vacinas prote nas terap uticas enzimas Apesar da disponibilidade das t cnicas de clonagem existe uma s rie de passos desde a introdu o da informa o gen tica num vector e num organismo hospedeiro at obten o do produto Consequentemente todos os passos do processo a montante e a jusante t m de ser optimizados de modo a obter o bioproduto com as caracter sticas desejadas e economicamente rent vel 6 7 I 2 O interesse do DNA como agente terap utico Desenvolvimentos recentes na biologia molecular permitiram a evolu o de novas tecnologias para a produ o de biomol culas complexas Um dos passos mais importante e economicamente dispendioso o isolamento e purifica o de mol culas alvo Ao longo dos ltimos anos tem se testemunhado um esfor o acrescido no desenvolvimento de novos m todos para a purifica o de plasm deos 8 10 Este esfor o tem sido motivado principalmente pela introdu o de terapias moleculares tais como a terapia g nica e as vacinas de DNA Apesar destas metodologias ainda enfrentarem alguns problemas t m o potencial para revolucionar a ind stria da sa
98. os superiores s t cnicas cromatogr ficas convencionais 115 Esta t cnica apresenta outras vantagens tais como a possibilidade de reutiliza o e a facilidade de armazenamento seco do gel 132 Contudo este m todo tamb m 22 apresenta algumas limita es sobretudo no que diz respeito origem biol gica dos ligandos 115 A alta selectividade e resolu o desta t cnica torna a capaz de purificar num nico passo figura 12 e a recupera o do material activo bastante elevada 133 Processo actual Processo melhorado Fementa o Lise alcalina Condicionado Concentra o Adi o de NH4 S0 gt Filtra o Cromatografia de interac o 1 1 1 7 hidrof bica v Cromatografia de afinidade l Cromatografia de exclus o aa PE y Ajuste da concentra o opcional Figura 12 Processos para a purifica o do pDNA Adaptado de Han et al 2008 Para que o ligando seja est vel precisa de estar covalentemente ligado matriz por algum grupo funcional que possa ser f cil e convenientemente derivatizado na sua prepara o A activa o definida como um processo de modifica o qu mica da matriz de modo que o produto resultante reaja formando uma liga o covalente com o ligando escolhido Esta liga o deve ser efectuada num s tio de modo que n o afecte as interac es espec ficas entre o ligando
99. os v rios ensaios aplicando a mesma estrat gia de elui o por passos de modo a determinar as condi es espec ficas de liga o do pDNA coluna Concluiu se assim que na matriz de arginina Sepharose o pDNA liga se matriz a 150 mM de NaCl eluindo a 200 mM de NaCl As interac es que ocorrem entre o DNA e a matriz promovem estabilidade conduzindo a uma elevada efic cia do suporte da arginina de se ligar ao pDNA a baixa for a i nica 154 Estudos at micos realizados numa estrutura complexa de DNA prote na mostraram que a arginina promove interac es com a guanina via liga es de hidrog nio for as van der Waals ou liga es de hidrog nio mediada pela gua 149 161 Como a arginina se trata de um amino cido b sico cont m um grupo carregado positivamente o grupo guanidino que facilmente se liga aos grupos fosfato do pDNA carregados negativamente induzindo interac es electrost ticas Ester met lico da arginina Sepharose No decorrer deste estudo utilizaram se matrizes com amino cidos modificados com cadeia alquilica de tamanho crescente Na figura 21 est representada a matriz do ster met lico da arginina Sepharose a qual foi obtida pela liga o da arginina metil esterificada Sepharose pelo bis ep xido 46 Aloury xia 260 tem o S 1 E Ex p i HN E e e i o o Al o Na R o O HN pm HN ster met lico de L arginina s o LE IL O P OH c N Ho A
100. ostra as mol culas mais hidrof bicas e de menor densidade ficam retidas na matriz ao passo que as menos hidrof bicas e de maior densidade eluem Figura 7 Cromatografia de fase reversa Adaptado de Affinity Chromatography Principles and Methods A cromatografia de fase reversa tornou se tamb m uma ferramenta anal tica essencial no controlo de processo de purifica o de produtos farmac uticos As biomol culas s o elu das atrav s da aplica o de gradientes com solventes org nicos como acetonitrilo metanol ou n propanol de polaridade decrescentes Os solutos s o eluidos por ordem decrescente de polaridade ou hidrofobicidade crescente 99 100 Quando a mol cula alvo polar como o caso dos cidos nucleicos s o adicionados ao eluente da coluna i es org nicos cuja fun o consiste em estabilizar as interac es i nicas das mol culas de plasm deo formando pares de i es hidrof bicos n o polares que se ligam resina de fase reversa 101 Algumas limita es desta t cnica s o o consumo elevado de solventes org nicos precau es que t m de ser tomadas no seu manuseamento e a utiliza o de misturas org nicas para eluir as mol culas de plasm deo 5 1 6 3 Cromatografia de filtra o em gel A separa o de bioprodutos por cromatografia de filtra o em gel ou exclus o molecular SEC obtida pelas diferen as de tamanho das biomol culas que se pretendem separar n o havendo interac o des
101. penas a isoforma sc do pDNA interage com a histidina observando se a ocorr ncia de interac es hidrof bicas e liga es por pontes de hidrog nio entre a histidina e as bases do DNA 153 Devido estrutura da isoforma sc as bases desta ficam mais expostas que as bases da isoforma oc do pDNA facilitando deste modo as interac es espec ficas com a histidina Ao utilizar um gradiente de sal adequado a isoforma oc elui ao passo que a isoforma sc do pDNA interage com a histidina Esta liga o pode ser uma consequ ncia de 26 deforma es induzidas pela tor o da cadeia da isoforma sc na qual exp e algumas bases tornando as dispon veis para interagir com a histidina 153 Trabalhos efectuados com a arginina demonstraram que esta ao actuar como ligando tamb m reconhece e separa eficientemente as isoformas sc e oc do pDNA Estudos efectuados que usaram matrizes de arginina para purificar pDNA revelaram a presen a de interac es espec ficas com o plasm deo e mais importante ainda um reconhecimento significativo da isoforma sc O mecanismo subjacente envolve n o s interac es electrost ticas e hidrof bicas entre o suporte e a mol cula de pDNA mas tamb m o bioreconhecimento das bases dos cidos nucleicos atrav s da arginina Estes mecanismos de reconhecimento espec fico devem se em parte s caracter sticas da arginina nomeadamente sua capacidade para interagir nas diferentes conforma es ao comprimento
102. pet ncia participa o nas discuss es correc es e sugest es que fez com que conclu sse este trabalho Ao Professor Doutor Renato Boto co orientador desta disserta o pela partilha do saber e as valiosas contribui es para o trabalho Muito obrigado pelos conselhos e boa vontade em atender as minhas d vidas Ao Senhor Vice Reitor Professor Doutor Paulo Almeida expresso o meu imenso e profundo reconhecimento por todo o apoio rigor e exig ncia demonstrada como tamb m todas as oportunidades e dificuldades proporcionadas em cada momento da presente disserta o Por todos os encorajamentos disponibilidade e ensinamentos derivados da sua s lida experi ncia e forma o cient fica com que sempre me presenteou o meu bem haja A Mestre Angela Sousa pelo acolhimento no laborat rio pela sua simpatia e disponibilidade Para ela vai a minha amizade e o meu agradecimento pelo prazer que foi conviver e trabalhar com ela no laborat rio As minhas colegas de laborat rio pela ajuda incondicional que me prestaram pela partilha dos anseios dificuldades e oportunidades vivenciadas ao longo deste ano Mariana e Joana pela realiza o dos suportes de arginina e histidina e por toda a ajuda que me disponibilizaram minha amiga e patroa Sandra Almeida por todo o apoio pela disponibilidade que demonstrou estando sempre disposta a ajudar no que fosse preciso Obrigado pelo exemplo profissional e pela amizade in
103. ponde elui o de 2 0 M de NH4 2SO4 Apesar de se obter dois picos n o se obteve diferencia o na elui o das diferentes isoformas como se pode visualizar atrav s das linhas 1 e 2 A impossibilidade de separar as duas isoformas do pDNA nestas condi es pode estar associada ao facto de a matriz n o apresentar elevada percentagem de ligandos imobilizados Este factor j se revelou importante nos estudos de liga o elui o uma vez que n o se verificaram diferen as de comportamento de reten o do pDNA entre esta matriz e a matriz de Sepharose s com o bra o espa ador sem o ligando derivado de amino cido O facto de estes estudos serem realizados em colunas de bancada sem o controlo da temperatura tamb m pode influenciar o resultado na medida em que a separa o das isoformas requer um controlo rigoroso de todos os par metros Para melhorar os resultados e eventualmente atingir o objectivo de separar a isoforma sc da oc poderiam iniciar se os estudos num sistema que permita o controlo de condutividade e temperatura 71 CAP TULO IV Conclus es gerais e Perspectivas futuras 72 O processo de produ o do pDNA est geralmente associado fermenta o crescimento de culturas de E coli contendo o plasm deo de interesse sendo um processo que conduz produ o n o s do plasm deo mas tamb m de todo um conjunto de componentes celulares do hospedeiro gDNA RNA prote nas e endotoxinas Como
104. ponte E da procura Um encontro Fernando Sabino VI NDICE GERAL RESUMO sialon Si DS A an ES XIV ABSTRACT parir oni ia nd dd di XV LISTA DE ABREVIATURAS as iu a da dO O Tua XVI CAPITOLO TOD UCD ssa ando state a a tea tnd Se 1 I 1 Processos BIOLECNOLOGICOS iiinsimasmasiasiesim ace diiopineeea sendo inda adia tear dp 2 1 2 O interesse do DNA como agente terapeUtico secscecssecsessseessessesssessesseessecsessssesssesessseessseseesseeses 4 21 Terapia MEIGA sairia fc Sl ta dd Dr a 5 TZ Vacinasde DNA merienn E E scene neainmonenmontnaae 7 1 3 Caracter sticas do DNA plasm dico irsriasasisnaiiisniiiids oiii sas cais 8 1 4 Produ o de DNA plasmidi o sis ssieutisnsse ised mca gana sado ado gana Dera 9 IS Desintegra o COU imien ar E peta satis taraia ant eo E eae eo 11 1 6 Purifica o do DNA plasm dico por cromatografia emeneemeneenereeereeereeremereeemeremerteeres 13 1 6 1 Cromatografia de interac o hidrof bica c ccccssessessssssesesessssssesessessssssesessesssssssssesesseses 14 L6 2 Cromatografia de fas TEVOrSA asc sesismsasizasa isso sta sediada san o sara sina Finasa depara sansa saca gana da 16 1 6 3 Cromatografia de filtra o em gel scescccsscsssessessesesssssesssssssessesssessessssssssssssssssesesseses 16 1 6 4 Cromatografia de troca t6Micd ssessessessscsssssesssessessessessesssssssssssssssessesssessesssssessessssssessessesesies 18 1 6 5 Cromatografia de afinidade csccsivisisssrsorussksswissnivso
105. ra 3 0 M de NH4 SO4 figura B o pDNA ficou retido eluindo a 2 0 M de NHg4 2SO 4 linha 2 Pode se concluir que estas matrizes de maior comprimento t m um comportamento semelhante relativamente reten o e elui o aquando da utiliza o de um gradiente decrescente de NH4 2SO4 M O resultado global encontra se descrito na tabela 7 Tabela 7 Quadro resumo sobre os tempos de reten o utilizando o NH4 2SO4 Reten o NH4 2SO4 M Elui o NH4 2SO M Ester hex lico da arginina 3 0 2 0 i Sepharose Ester oct lico da arginina 3 0 2 0 Sepharose 56 Pode se ent o concluir que a matriz de arginina promove m ltiplas interac es com o pDNA incluindo n o s interac es electrost ticas e hidrof bicas mas tamb m o bioreconhecimento das bases dos nucle tidos atrav s do ligando arginina 131 As caracter sticas da arginina nomeadamente a capacidade de interagir em diferentes conforma es o comprimento da cadeia lateral e a capacidade para produzir boas geometrias de liga es de hidrog nio s o respons veis pelas m ltiplas interac es que podem ocorrer entre o ligando arginina e as mol culas de pDNA 163 Neste caso em particular verific mos ainda que uma cadeia alqu lica de maior tamanho causa uma diminui o da reten o para baixas concentra es de sal possivelmente devido a um impedimento estereoqu mico mas explorando a interac o hidrof bica que envolve es
106. rapy and DNA vaccine applications Trends Biotechnol vol 18 pp 380 388 97 Luliano S Fischer J R Chen M Kelly W J 2002 Rapid analysis of a plasmid by hydrophobic interaction chromatography with a non porous resin J Chromatogr A vol 972 pp 77 86 98 Diogo M M Queiroz J A Prazeres D M F 2003 Assessment of purity and quantification of plasmid DNA im process solutions using high performance hydrophobic interaction chromatography J Chromatogr A vol 998 pp 109 117 99 Sofer G Hagel L 1997 Handbook of Process Chromatography A Guide to Optimization Scale Up and Validation Academic Press San Diego USA 100 Brown P R Krstulovic A M 1979 Pratical aspects of revesed phase liquid chromatography applied to biochemical and biomedical research Anal Biopchem vol 99 pp 1 21 101 Meyer V R 1994 Pratical High Performance Liquid Chromatography John Wiley amp Sons Inc West Sussex U K 102 Xindu G Wang L 2008 Liquid chromatography of recombinant proteins and protein drugs J Chromatog B vol 866 pp 133 153 84 103 Ejima D Yumioka R Arakawa T Tsumoto K 2005 Arginine as an effective additive gel permeation chromatography J Chromatogr A vol 1094 pp 49 55 104 Tsumoto K Ejima D Kumagai I Arakawa T 2003 Practical considerations in refolding proteins from inclusion bodies Protein Expr Purif vol 28
107. ratorial Reagentes Fornecedor Pa s Sepharose Seaken UK Brometo de et deo Sigma Espanha Extracto de levedura Sigma Aldrich Espanha Glicerol Sigma Aldrich Espanha Mi Molecul Veco eae icro amp Molecular Biology Espanha Panreac Qu mica SA Triptona Espanha Tris HCl Sigma Espanha Panreac Quimica SAU aes o Cloreto de s dio Espanha Panreac Qu mica SAU Sulfato d ni ulfato de am nio Espanha Panreac Qu mica SAU I l sopropano Espanha II 1 3 Equipamentos Ao longo do trabalho experimental para al m do material corrente de laborat rio foram utilizados os seguintes equipamentos Agitador orbital O crescimento celular da pr fermenta o e da fermenta o foi realizado num agitador orbital temperatura de 37 C com 250 rota es por minuto rpm Autoclave para esteriliza o dos utens lios e meios necess rios realiza o do trabalho foi utilizada uma autoclave Uniclave 88 Balan a a pesagem de todos os reagentes foi realizada numa balan a anal tica ADD 110 L 31 Centr fugas As centrifuga es efectuadas para o isolamento e lise das fermenta es foram realizadas numa centr fuga Sigma modelo 3 18K e na ultracentrifuga Optima L 100 x P Para concentrar e ou diluir as amostras utilizou se a centr fuga Heraeus Multifuge modelo 1S R Espectrofot metro UV Vis A medi o dos valores das absorv ncias das
108. respectivas electroforeses em gel de agarose a Foinn sranie n e a n r E a EE 55 Figura 32 Perfil cromatogr fico obtido ap s injec o de pDNA oc sc utilizando um suporte de ster oct lico da arginina Sepharose com as respectivas electroforeses cm gel deagcarosea a RS A E Riad 56 Figura 33 Perfil cromatogr fico obtido ap s injec o de pDNA oc sc utilizando um suporte de arginina Sepharose com as respectivas electroforeses em gel de agarose Figura 34 Perfil cromatogr fico obtido ap s injec o de pDNA oc sc utilizando um suporte de ster met lico da arginina Sepharose com as respectivas electroforeses em gel de a caros a Lo gua quo ectama Tao Des a a DS DR 59 Figura 35 Perfil cromatogr fico obtido ap s injec o de pDNA oc sc utilizando um suporte de ster hex lico da arginina Sepharose com as respectivas electroforeses emgel dedparose a LB isa seis saad cock eed alors feita east aa deed algo tat ei ana sa ada 61 Figura 36 Imobiliza o do ster met lico da L histidina em Sepharose 63 Xl Figura 37 Representa o esquem tica da matriz com o bra o espa ador sem o AMINOACI O she EN ss SS ND ai COS ae A oe Ba ct a tn Rak ih 63 Figura 38 Perfil cromatogr fico obtido ap s injec o de pDNA oc sc utilizando um suporte de Sepharose com a respectiva electroforese em gel de agarose a 1 64 Figura 39 Representa o esquem tica d
109. revelarem ser eficazes a escala de produ o aumentar e a preven o de epidemias ir exigir uma taxa de vacina o superior a 60 55 1 3 Caracter sticas do DNA plasm dico Os plasm deos s o mol culas de DNA extra cromoss micas de cadeia dupla covalentemente fechadas codificando uma variedade de fun es que n o s o essenciais para a sobreviv ncia do hospedeiro mas incrementam a habilidade deste para a sobreviv ncia em condi es at picas 56 Os plasm deos s o incorporados e produzidos em bact rias como a Escherichia coli E coli que crescem por fermenta o e quando recuperados encontram se naturalmente na forma sc mas existe tamb m uma frac o na forma oc 42 O baixo conte do de pDNA lt 3 nas c lulas de E coli e a sua similaridade relativamente s propriedades de carga e tamanho com os principais contaminantes RNA e gDNA tornam o processo de purifica o um desafio 57 59 Os plasm deos s o mol culas muito grandes Mr gt 10 tamanho na ordem dos um quando comparados com as prote nas 42 e a replica o n o est sincronizada com a replica o do cromossoma do hospedeiro bacteriano Os plasm deos variam muito no n mero de c pias 1 1000 c pias por c lula dependendo da origem de replica o e do tamanho 60 Cada cadeia desta mol cula um pol mero linear desoxirribonucleico ligado por liga es fosfodi ster Estes grupos fosfato apresentam carga negativa para pH gt 4 A
110. ridade do plasm deo a sua eficiente purifica o ainda um desafio contudo as estrat gias de purifica o utilizando amino cidos como ligandos foram produzindo resultados interessantes no que diz respeito purifica o de plasm deos Para melhorar as condi es de purifica o do pDNA prop e se a realiza o de estudos de purifica o em sistemas como por exemplo o FPLC uma vez que este sistema permite controlar par metros como a temperatura condutividade entre outros que podem ser importantes na separa o de componentes estrutural e quimicamente semelhantes 74 CAP TULO V Bibliografia 75 1 European Federation of Biotechnology 1994 EFB Newsletter 2 EFB General Assenbly 1989 EFB Newsletter 3 Flaschel E Friehs E K 1993 Improvement of downstream processing of recombinant proteins by means of genetic engineering methods Biotech Adv vol 11 pp 31 78 4 Ferreira E C 1995 Identifica o e Controlo Adaptativo de Processos Fermentativos Disserta o de doutoramento Faculdade de Engenharia da Universidade do Porto Porto 5 Lima N Mota M 2003 Biotecnologia Fundamentos e Aplica es Lidel edi es t cnicas Ida 6 Doran P M 1999 Bioprocess Engineering Principles Academic Press New York pp 218 253 7 Goldberg E 1997 Handbook of Downstream Processing Chapman amp Hall 8 Prather K J Sagar S Murphy J Chartrain M 2003
111. romatografia pode ser utilizada ap s a separa o das c lulas ou dos fragmentos celulares produto intracelular A cromatografia de troca i nica usada na purifica o para um grande n mero de antibi ticos amino cidos e prote nas de fermenta es e cultura de c lulas 5 A cromatografia de troca ani nica AEX continua a ser uma das t cnicas mais utilizadas para a capta o purifica o e quantifica o do pDNA possuindo as vantagens de uma r pida an lise e separa o n o requer a utiliza o de solventes org nicos regenera o simples com hidr xido de s dio e da grande disponibilidade comercial de fases estacion rias 10 Estes factores contribu ram para a popularidade da utiliza o da AEX para purificar pDNA 109 tanto numa escala preparativa como anal tica 9 A estrutura poliani nica do DNA plasm dico pode ser explorada por este tipo de cromatografia usando ligandos fortes de troca ani nica 51 como aminas quatern rias acoplados a matrizes polim ricas 110 A AEX baseia se na interac o dos grupos fosfatos do DNA carregados negativamente com uma fase estacion ria com ligandos carregados positivamente 110 Ap s liga o um gradiente de sal utilizado para quebrar as liga es dos cidos nucleicos com a coluna e eluir os diferentes cidos nucleicos na ordem crescente da sua densidade de carga uma propriedade que por sua vez fun o do comprimento e da conforma o da cadeia 3
112. rusntsseisvnivnsnusnicsntavnisnseusntennteselsbeesedoanbesotss 20 1 6 5 1 Cromatografia de afinidade com metais imobilizados memenesesesmeermenenmeas 24 1 6 5 2 Cromatografia de afinidade por h lice tripla ciesesmeseeemmerserermeamereremmementeatas 25 1 6 5 3 Cromatografia de afinidade DNA prote na 25 1 6 5 4 Cromatografia de afinidade DNA amino cidos csesmeeeeememenermeseeeeeermensermeas 26 CAP TULO II Parte Experimental resmas rturraerraa 28 111 Material e m todos cnisia n E R E ance ceanaN a 29 ILA 1 O plasm deo PVAXA LACZ sesssssssssssssssssssssassssssssssssssssssssssussssssnassssssnasessussssesssie 29 ED Te 2s ALT A E dias eai ie hai iA Me dpe en ia ap vida 30 ELA Bo Equipamentos sceswcusssesdesses svete sees ama gcsivcesscsess ta iene atari geek skonis tssk Eesi SENER EVEEN SEREEN Sak 31 II 2 Procedimento Experimental ists cos sxcarss ra rr gy neo bavaneea aa aca ede 32 II 2 1 Fermenta o de uma estirpe recombinante de E coli DH5a contendo o plasmideo PVAXI L ACT 6 05 Kp oocssescsssessscsssesssessssssnsssssscsssssscsscasssssesssesasesssescnsssssssessessssssessenseessee 32 11 2 2 Lise celular do DNA plasmidico usando o Rit Qiagen Maxi scecsesssesseeseeseesseeseesseenes 34 11 2 3 Cromatografia em mini colunas de arginina histidina e respectivos derivados 36 II 2 4 Determina o da ADSOIV NCIA superado Tapada a Ra dotada asd 36 I1 2 5 Electroforese em gel de
113. sa 72 CAP TULO V Bib aati a ie iara dna ci de RA ic ddr is 75 VIII NDICE DE FIGURAS Figura 1 Fases do crescimento de um microorganismo em cultura descont nua 3 Figura 2 O interesse crescente do pDNA como vector de escolha para ensaios de terapia CONICA dos curpstiduessayceuinGin TESEU ET pa a 6 Figura 3 Resposta imune vacina o pelo pDNA cece eee e eee ene eeneeeeneeeas 7 Figura 4 Representa o das diferentes isoformas do pDNA ccc sees eee eens 9 Figura 5 As duas fases do processo de desenvolvimento do pDNA 9 Figura 6 Cromatografia de interac o hidrofObica 2 cece cece nee ene eee eeenes 14 Figura 7 Cromatografia de fase reversa cc cece cece eee eee e eee ne ence nace eee eee 16 Figura 8 Cromatografia de filtra o em gel 2c cece cence eee e nee neeeaeenees 17 Figura 9 Cromatografia de troca aniOnicCa 0 cece cece cece eee ee ence crer 19 Figura 10 Cromatografia de afinidade e cece eee e cece eee eee ene e ee eeaeeees 20 Figura 11 Mecanismo de purifica o por afinidade ccc cece rererere sesse 20 Figura 12 Processos para a purifica o do pDNA 00 cece cece e eee iii 23 Figura 13 Representa o esquem tica do plasm deo pVAX1 LacZ 29 Figura 14 S ntese dos derivados steres alqu licos de L arginina 40 Figura 15 I
114. sfer ncia de oxig nio do fermentador Isto resulta numa maior densidade celular num maior rendimento de produ o de plasm deo e de melhor qualidade A estrat gia de fermenta o deve ser estabelecida de forma a obter elevadas densidades celulares em condi es que permitam a replica o e estabilidade plasm dica aumentando se deste modo o n mero de c pias durante o crescimento celular 73 Ao optimizar o rendimento do pDNA para uso terap utico h que ter em conta tr s factores cultura m ssica n mero elevado de c pias de plasm deos e qualidade do plasm deo Relativamente ao primeiro factor obviamente uma maior densidade celular 10 rende mais plasm deo por unidade de volume de cultura A massa de cultura pode ser melhorada atrav s da optimiza o de v rios par metros como o pH percentagem de oxig nio dissolvido temperatura concentra o e tipo de nutrientes presentes no crescimento A express o de um gene de interesse inserido num plasm deo indesej vel durante o processo de fermenta o e em alguns casos a express o de derivados de plasm deo pode dificultar o crescimento e consequentemente afecta a produ o do pDNA 52 67 A produ o econ mica de plasm deos em larga escala a partir da E coli exige tamb m a optimiza o do n mero de c pias do plasm deo rendimento espec fico muito importante conseguir rendimentos espec ficos elevados e impacto positivo nos processos de purifica
115. t lico da arginina Sepharose e ster but lico da arginina Sepharose sob as seguintes condi es 200 mM de NaCl gt 230 mM de NaCl gt 250 mM de NaCl mas n o foi igualmente poss vel alcan ar a separa o das diferentes isoformas do pDNA Ester hex lico da arginina Sepharose Efectuaram se uma s rie de experi ncias cromatogr ficas de modo a averiguar o comportamento das isoformas do pDNA nesta matriz Os ensaios iniciaram se com a adi o de 3 0 M de NH4 2SO usando gradientes por passos tr s passos nos quais o perfil terminava com a aplica o da concentra o de 2 0 M de NH SO De seguida est o representados os cromatogramas onde cada um dos picos cromatogr ficos foi posteriormente analisado por elecroforese de modo a identificar que tipo de esp cies estava a eluir figura 35 60 Eser hexdico da argiina Septarose Euer hexdico da arginina Sepharose o 2 3 22 e o 2 8 10 12 14 16 u HO Pos CTIN Abscevincs 260 ran o 5 k WO Pos CHNy Ahtorvinch 250 nm o 2 4 6 8 10 12 is 16 18 Fracg des scolhitss Fa a scoltsam Figura 35 Perfil cromatogr fico obtido ap s injec o de pDNA oc sc utilizando um suporte de ster hex lico da arginina Sepharose com as respectivas electroforeses em gel de agarose a 1 P Amostra de pDNA injectado na coluna 1 Frac o recolhida usando 2 0 M de NH 2SO4 do ensaio A 2 Frac o recolhida usando 2 2 M de NH SO do
116. ta cadeia poss vel promover a interac o com o pDNA III 1 6 Separa o das diferentes isoformas do DNA plasm dico O estabelecimento de processos biotecnol gicos confi veis e econ micos para purificar plasm deos requer a profunda compreens o e a melhoria das diversas opera es unit rias envolvidas O desenvolvimento de cada t cnica visa tirar partido de todos os m todos envolvidos a fim de explorar todas as potencialidades nos avan os realizados para melhorar o futuro do processo global contribuindo para os melhores resultados da aplica o terap utica do pDNA Ao explorar as interac es que ocorrem entre os amino cidos e as mol culas de cidos nucleicos pretende se n o s isolar o pDNA das impurezas presentes no extracto da E coli como tamb m purificar de uma forma eficiente a isoforma do plasm deo biologicamente activa a isoforma sc do pDNA Considerando as particularidades do pDNA e os desafios impl citos na sua purifica o necess rio ajustar todas as condi es cromatogr ficas para melhorar o desempenho da estrat gia de purifica o garantindo a estabilidade da isoforma sc do pDNA durante o processo As condi es de reten o elui o bem definidas s o fundamentais para melhorar o desempenho da purifica o e para alcan ar uma maior efici ncia e selectividade na cromatografia de afinidade com base na arginina imobilizada podendo representar um impacto significativo em aplica
117. ta possibilidade realizaram se alguns estudos com derivados de arginina de maior cadeia alqu lica Ester hex lico da arginina Sepharose A escolha desta matriz figura 27 teve como objectivo a avalia o da capacidade de reten o do pDNA num suporte com ligandos de cadeia mais longa Esta matriz foi obtida pela liga o da arginina hexil esterificada Sepharose pelo bis ep6xido 51 Oe ro end Absorvincih 200 vem 5 i Cc E r 07m NAN P OH a Ho Te A oa R o a HN nt E HN ster hex lico de L arginina 3 Figura 27 Representa o esquem tica da matriz de ster hex lico da arginina Sepharose A s ntese de derivados de arginina de maior comprimento e a sua imobiliza o permite verificar se a reten o do pDNA ou n o influenciada pelo tamanho da cadeia A B C Esse haxilico da argisies Sepharose Esser hexilico da arginins Sepharose Este haxslico da argirsea Sa pharo w 1 soo 05 gt 0 Gam torn o e o Pa w 8 8 Coad D end Absorvaes it 260 rm o 2 4 6 8 10 iz 2 a OB i days do aes ea 6 ee na as e Pracgdes ecothicas Fracgdesmcothicas Feegtes ace Figura 28 Perfil cromatogr fico obtido ap s injec o de pDNA oc sc utilizando um suporte de ster hex lico da arginina Sepharose com as respectivas electroforeses em gel de agarose a 1 P Amostra de pDNA injectado na coluna 1 Frac o recolhida usando 120 mM de NaCl do ensaio A 2 Frac
118. ta um comportamento din mico em que as dimens es e forma desta podem variar e apresentam ramifica es que se formam e retraem rapidamente 46 49 As mol culas de plasm deo podem se deformar ou expandir atrav s do aumento ou diminui o da for a i nica do solvente respectivamente 49 ou pela modifica o do tipo de contra i es cati es 50 1 2 2 Vacinas de DNA A imuniza o por DNA foi introduzida como um novo m todo no in cio da d cada de noventa V rios investigadores demonstraram que as vacinas de DNA cont m genes espec ficos que codificam prote nas alvo e podem activar quer a imunidade mediada por c lulas quer as respostas humorais 8 obtendo deste modo uma elevada protec o contra as doen as 51 53 e conferindo um maior controlo sobre o processo de imuniza o 8 figura 3 Ao contr rio das vacinas vivas atenuadas nestas vacinas n o h ind cios de risco de invers o causando doen a 54 ge E ai Sintese intema do N p ptido proteina foreign AR a a A Liberta o do RN p ptidoproteina foreiga a od i H Estimula o das c lulas gt B naive Figura 3 Resposta imune vacina o pelo pDNA Adaptado de Chartrain et al 2003 Recentemente a utiliza o de v rias vacinas de DNA para o tratamento de certas doen as tais como a hepatite tuberculose SIDA influenza e mal ria t m progredido para uma avalia o cl nica Se este tipo de vacinas
119. tas com a matriz cromatogr fica A amostra e a fase m vel s o aplicadas na coluna e as mol culas mais pequenas difundem se nos poros da matriz ficando retidas medida que a fase m vel passa 16 atrav s da coluna as mol culas que s o maiores que os poros da matriz s o incapazes de se difundir nestes e passam atrav s da coluna figura 8 No entanto a separa o por SEC depende n o s do tamanho mas tamb m da conforma o das biomol culas Apesar de poder ser utilizada em qualquer passo do processo de isolamento e purifica o normalmente usada no princ pio do processo para dessaliniza o da solu o quando necess rio ou no fim como passo de polimento final 5 A principal vantagem que este tipo de cromatografia pode ser utilizada para a purifica o de todo o tipo de prote nas em que a separa o procede sob condi es de elui o isocr tica sem interac es moleculares entre prote nas e a fase estacion ria garantindo deste modo que a prote na purificada conserva a sua bioactividade usada como t cnica para determina o do peso molecular de prote nas podendo tamb m ser aplicada para a renatura o de prote nas Esta t cnica permite uma transfer ncia eficiente de bioprodutos para um novo solvente no entanto o processo envolve sempre dilui o da amostra pelo que implica um passo de concentra o adicional 102 Figura 8 Cromatografia de filtra o em gel Adaptado de Affini
120. ty Chromatography Principles and Methods Para uma SEC ideal n o existe qualquer interac o entre as prote nas e a fase estacion ria mas na pr tica existem algumas interac es selectivas resultando n o s na reten o parcial de prote nas como tamb m numa redu o da recupera o m ssica ou bioactividade de prote nas recombinantes rPRT As eventuais interac es inespec ficas podem ser minimizadas por adi o de uma baixa concentra o de NaCl ou de arginina como foi recentemente descrito 103 Ao utilizar NaCl ou fosfato em concentra es moderadas induz um aumento de for a i nica reduzindo deste modo interac es electrost ticas entre prote nas e as colunas 104 No entanto o uso de elevadas concentra es podem tamb m aumentar as interac es hidrof bicas entre as prote nas e a matriz A inclus o de ureia ou de solventes org nicos outra abordagem que dever enfraquecer as interac es hidrof bicas mas tamb m ir aumentar as interac es i nicas e pH extremos t m sido utilizados para melhorar a separa o por SEC 105 106 Cada uma destas condi es pode alterar a conforma o proteica ou estado de agrega o induzindo conclus es erradas que n o reflectem o estado actual das prote nas 17 No entanto a capacidade de resolu o da SEC limitada 107 e no caso dos plasm deos o isolamento da isoforma superenrolada de plasm deos numa nica etapa dif cil 96 Neste tipo de crom
121. uadro resumo sobre os tempos de reten o utilizando o NH4 2SOx4 56 Tabela 8 Quadro resumo sobre as condi es de reten o e de elui o da histidina e COTIV AGO sau Sees ete ia E A ted aia nade a a a NE 69 XIII RESUMO Estudos sobre medicina gen tica e vacina o est o a utilizar o DNA plasm dico pPDNA como vector e devido a este facto tem havido uma procura crescente de doses de pDNA para ensaios cl nicos T m sido propostos v rios processos baseados na cromatografia mas a cromatografia de afinidade considerada a t cnica mais espec fica para a separa o do pDNA uma vez que permite o isolamento desta biomol cula a partir de uma mistura devido ao reconhecimento bioespec fico pelo ligando imobilizado Pode se dizer que o recente sucesso desta t cnica para a purifica o do pDNA baseia se na bioespecificidade e a utiliza o de amino cidos como ligandos imobilizados produziu recentemente resultados interessantes Assim a cromatografia de afinidade baseada em amino cidos representa sobretudo uma abordagem promissora para purificar biomol culas pois combina a selectividade de uma interac o biol gica que ocorre naturalmente com a simplicidade de uma nica mol cula pequena A histidina e a arginina j revelaram a sua grande aplicabilidade para isolar a isoforma superenrolada do pDNA e portanto indicando a presen a de interac es espec ficas entre o pDNA para ambos os amino cidos Neste
122. uer um controlo rigoroso de todos os par metros Segundo Fani e seus colaboradores 2008 este par metro afecta as interac es do pDNA com a arginina influenciando deste modo a reten o do pDNA e respectivas isoformas a reten o destas aumenta com o aumento da temperatura 61 154 Para melhorar os resultados e atingir uma separa o diferenciada da isoforma sc e oc poderiam iniciar se os estudos num sistema como por exemplo o FLPC uma vez que permite o controlo de certos par metros que ao longo da realiza o deste trabalho n o foram explorados Apesar de n o se ter conseguido separar as diferentes isoformas do pDNA sabe se que a matriz de arginina j foi aplicada de forma eficiente para separar as isoformas do pDNA revelando a presen a de um reconhecimento particular da isoforma sc As caracter sticas da arginina nomeadamente a capacidade de interagir em diferentes conforma es o comprimento da cadeia lateral e a capacidade para produzir boas geometrias de liga es de hidrog nio s o respons veis pela m ltiplas interac es que podem ocorrer entre o ligando e as mol culas de pDNA Fani et al 2009 O mecanismo subjacente envolve n o s interac es electrost ticas e hidrof bicas entre o suporte e o pDNA como tamb m o bioreconhecimento das bases dos cidos nucleicos atrav s do ligando da arginina 154 A implementa o de novas estrat gias terap uticas parcialmente dependente da evolu o
123. usto global do processo Apesar da grande variedade de produtos que se podem obter por fermenta o a recupera o e purifica o do bioproduto segue um esquema gen rico formado por uma s rie de passos para a obten o desses bioprodutos com as caracter sticas desejadas Assim o processo de recupera o e purifica o de um bioproduto obtido por fermenta o consiste em tr s etapas principais separa o concentra o e purifica o 62 63 T m sido extensamente estudados m todos de fermenta o para a produ o de plasm deos usando E coli 64 65 em que a produ o do pDNA maioritariamente realizada em erlenmyers ou em fermentadores usando estrat gias de batch ou fedbatch 66 69 Os processos de produ o de pDNA que apliquem uma metodologia de fermenta o batch resultam normalmente em baixos rendimentos e baixo conte do de plasm deos Quando uma cultura m dia colocada neste tipo de fermentador normalmente a capacidade de transfer ncia de oxig nio deste excedida resultando num ambiente limitado de oxig nio Esta falta de oxig nio desencadeia o metabolismo da E coli levando produ o de subprodutos t xicos que limitam o crescimento induzindo a morte celular 70 72 A fermenta o por fedbatch fornece nutrientes ao longo de um per odo de tempo mais alargado de modo a alcan ar o controlo da disponibilidade de nutrientes para um n vel compat vel com as capacidades de tran
124. utilizaram se as seguintes condi es 2 5 M de NH4 2SOu 2 3 M de NH4 2SOz 2 0 M de NH SO4 e Tris HCl e na figura B est o representadas as condi es de 3 0 M de NH SO4 2 5 M de NH4 2SOu 2 0 M de NH4 2SO e Tris HCl 67 Absorv ncia 260 run Estas metilico da histidina Sepharose Ester metilico da histidina Sepharose 4 Absorvincia 260 run O 2 4 6 3 10 12 14 16 18 20 22 24 4 A SD RA SAR AMA oe ek 8 a Frac e lhidas Frac es escolhidas ere Figura 42 Perfil cromatogr fico obtido ap s injec o de pDNA oc sc utilizando um suporte de ster met lico da histidina Sepharose com a respectiva electroforese em gel de agarose a 1 P Amostra de pDNA injectado na coluna 1 Frac o recolhida usando 2 5 M de NH SO do ensaio A 2 Frac o recolhida usando 2 0 M de NH SO do ensaio A 3 Frac o recolhida usando Tris HCl do ensaio A 4 Frac o recolhida usando 2 0 M de NH SO4 do ensaio B Ap s a aplica o da primeira estrat gia para verificar as condi es que favoreciam a reten o elui o do pDNA utilizando esta matriz verificaram se que as condi es de reten o elui o do pDNA n o foram eficientes uma vez que como se constata pela figura 42 A o pDNA eluiu logo ap s a adi o da concentra o de 2 5 M de NHa 2SO4 pico 1 linha 1 Com a diminui o da for a i nica verifica se a forma o de mais dois picos representando a elui o do pDNA a 2 0 M de N
125. xclus o molecular T timina TB Terrific Broth THAC cromatografia de afinidade por h lice tripla UV ultravioleta V volt XVII 1 1 Processos Biotecnol gicos Nos ltimos anos tem se assistido a um r pido desenvolvimento na rea da Biotecnologia com o aparecimento de novos processos a aplicar a n vel industrial que recorrem a microrganismos 1 2 Actualmente os processos biotecnol gicos t m uma grande aplica o em sectores tais como o agro alimentar a qu mica fina e farmac utica a energia e o ambiente sendo utilizados para a produ o de uma vasta gama de produtos com diferentes valores comerciais Um processo biotecnol gico pode ent o definir se como aquele em que h uma utiliza o de micrOorganismos fermentos bact rias etc e ou enzimas podendo ter como objectivo a s ntese de compostos qu micos intracelulares prote nas ou extracelulares antibi ticos lcool a produ o de biomassa caso da produ o de fermento de padeiro de alimentos bebidas de energia biog s etanol ou ainda a despolui o biol gica de efluentes degrada o da mat ria poluente pelos microorganismos Grande parte das t cnicas usadas em biotecnologia econ mica segura pouco consumidora de energia e para muitos processos os res duos s o biodegrad veis e n o t xicos A biotecnologia n o uma pr tica recente uma vez que tem vindo a ser correntemente praticada nos ltimos anos mas o seu grande
126. z que permite a separa o tanto de mol culas pequenas como de macromol culas prote nas ou cidos nucle cos bem como de misturas muito complexas Os processos cromatogr ficos normalmente conduzem a selectividades elevadas e al m disso as condi es de opera o s o suaves ocorrem temperatura ambiente os eluentes usados s o solu es aquosas e n o se observam tens es de corte que danifiquem os bioprodutos Apresentam tamb m a vantagem de se poderem usar pequenas quantidades 13 de amostra sem haver no geral perigo de decomposi o dos diferentes componentes dando uma precis o qualitativa e quantitativa elevada Os factores que influenciam a efici ncia de um processo cromatogr fico s o a qualidade do suporte cromatogr fico a dispers o axial e a dificuldade de estabelecimento de equil brio entre as fases m vel e estacion ria Os suportes mais utilizados em cromatografia s o polissac ridos dextrano agarose e celulose pol meros sint ticos como poliacrilamida poliestireno materiais inorg nicos s lica porosa hidroxiapatite e vidro poroso e materiais comp sitos poliacrilamida agarose dextrano bisacrilamida s lica porosa dextrano Podem distinguir se v rios tipos de processos cromatogr ficos tendo em conta a natureza das interac es envolvidas e que s o descritos em seguida 5 A escolha do tipo de cromatografia depende das caracter sticas biol gicas e f sico qu micas das biomol culas

Derivados de aa como ligandos em AC para

Contents

Download Pdf Manuals

Related Search

Related Contents