0705 COL1A1 sp1 Box
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1. Dispositivo para utiliza o in vitro Manual de I nstru es oqo oo geneBox 000 DESENVOLVIMENTO E PRODU O DE TESTES DE DIAGN STICO Vers o1l 7 Maio de 2010 Apresenta o usas seios desista pra ia amis nona lan a cia 2 Altera es e melhoramento do produtos sss 2 Controlo da Qualidade 3 Componentes do COL1 Al sp1 Box 1 0 Typing Kit 4 Protocolo de amplifica o por PCR seems 5 Reagentes rra aRar a dra 5 Extrac o de DNA 5 Amplifica o por PCR is 5 Par metros do programa de PCR 6 Protocolo de electroforese em gel de agarose 1 Prepara o do gel a 2 ieeemeeermneecemesa 7 Electrofor SE nar i RD 7 Esquema da placa COL Al sp1 Box 1 0 8 Identifica o da placa COL1 AI sp1 Box 1 0 secre 8 Tabela de interpreta o dos Resultados sss eee eee 9 Guia de resolu o de problemas sees ee eee eee 11 Guia Rais scrierea 12 Avisos precaU ES esenee anraranaaniaa 13 Garantia anseia a as e a o a 14 Avis de Garantia zes snsasaneneaannaana a 15 Declara o de Conformidade CE Folha de dados de seguran a a Refer ncias eee 20 2 20 Folha de Dados de Seguran a 3 3 Material Safety Data Sheet MSDS 12 Informa o ecol gica N o existem dados dispon veis 13 Informa o sobre a elimina o de res duos Elimine o material de acordo com toda a regulamenta o aplic vel os res duos devem ser devidamente trat2. dNTP 600 uM Tamp o da PCR concentra es finais s o 3 3x NH4 2 0 mM MgCl e 0 4 u ul Amplitag DNA polimerase pH 8 3 Glicerol concentra o final 16 6 Vermelho de cresol concentra o final de 300ug ml 4 20 Folha de Dados de Seguran a 1 3 Material Safety Data Sheet MSDS geneBOX R amp D Diagnostic Tests PCR SSP Kits Produtos de tipagem SSP da geneBOX Esta folha de dados de seguran a aplic vel a todos os produtos de tipagem por PCR SSP da geneBOX M 1 Produtos Qu micos e Identifica o da Companhia Data de realiza o Maio 2010 Grupo do produto Produtos de tipagem SSP da geneBOX Manufactura o geneBOX R amp D Diagnostic Tests biocant centro de inova o em biotecnologia n cleo 4 lote 3 3060 197 cantanhede portugal tel fax 351 231 410 946 351 231 410 947 e mail info genebox com 2 Composi o e Informa o sobre os reagentes Componente Qu mico Nome vulgar Placa Acido Desoxiribonucleico Oligonucle tido Vermelho de Cresol Mistura de reac o Desoxiribonucle tidos Nucle tidos Tamp o NH4 Cloreto de Magn sio Mgci2 Vermelho de Cresol Glicerol Taq DNA Polimerase Taq 3 Propriedades f sico qu micas Componente Aspecto Cor Odor Placa seco no fundo do po o vermelho nenhum Mistura de reac o l quido vermelho rosa nenhum 4 Informa o Toxicol gica Qu mico Toxicidade Glicerol LD50 oral 4090 mg kg ratinho LD50 oral 12600 mg kg
3. o utilize o kit com a validade expirada Os componentes dos kits s o resistentes s temperaturas de armazenamento indicadas O armazenamento dos kits a temperaturas n o recomendadas podem levar rupturas no material e contamina o dos reagentes dos kits Os materiais pl sticos fornecidos neste kit s o resistentes gama de temperaturas de utiliza o e armazenamento recomendadas A sua utiliza o em gamas distintas de temperaturas pode causar rupturas impossibilitando a utiliza o normal do kit Verifique a concentra o e qualidade de todas as amostras de DNA antes de utilizar este kit Instru es de gerais de seguran a no laborat rio N o coma beba ou fume dentro do laborat rio Utilize sempre luvas descart veis e mude as com frequ ncia Utilize batas limpas e proteja os olhos sempre que se justifique Lave as m os antes e depois de qualquer manipula o de amostras ou reagentes Lave a rea de trabalho antes e depois de qualquer manipula o N o pipete com a boca 12 20 Tabela de interpreta o de resultados 1 2 A C E G COLIA1 spi 189 790 B D F H COLIA1 spi 189 790 DNA 1 DNA 2 DNA 3 DNA 4 A C E G COLIA1 spi 189 790 B D F H COLIA1 spi 189 790 DNA 1 DNA 2 DNA 3 DNA 4 A C E G COLIA1 spi 189 790 B D F H COLIA1 spi 189 790 DNA 1 DNA 2 DNA 3 DNA 4 A C E G COLIA1
4. obter a concentra o exacta Repita a tipagem com um DNA de boa qualidade Contamina o com outros produtos de PCR ou outras amostras de DNA durante a prepara o do PCR Degrada o da amostra de DNA Limpe a zona de trabalho Trabalhe em zonas Pr e P s PCR separadas Utilize batas distintas para a zona Pr e P s PCR Mude de luvas frequentemente Repita a tipagem com um DNA de boa qualidade Reextraia a amostra de DNA de material fresco Repita a tipagem com um DNA de boa qualidade Amostra de DNA muito concentrada Verifique a qualidade e concentra o do DNA Dissolva o DNA em 44H20 de forma a obter a concentra o exacta Repita a tipagem com um DNA de boa qualidade Problemas com tamp o de electroforese Fora de prato ou composi o errada Use um tamp o recomendado novo 11 20
5. rato LD50 oral 1480 mg kg humano 5 Estabilidade e reactividade Condi es a evitar Calor e humidade Incompatibilidades Bases e agentes oxidantes fortes 17 20 Declara o de Conformidade Nome do Produto COL1A1 sp1 Box Numero do Produto GB 07 05 Utiliza o Tipagem gen tica de colag nio tipo al Produ o geneBOX R amp D Diagnostic Tests biocant centro de inova o em biotecnologia n cleo 4 lote 3 3060 197 cantanhede portugal N s geneBOX investiga o e desenvolvimento de testes de diagn stico indubitavelmente declaramos que este produto ao qual se relaciona esta declara o de conformidade est em conformidade com os seguintes documentos normativos ISO 9001 2008 e ISO 13485 2004 Seguindo ainda as indica es da Directiva Europeia 98 79 CE sobre dispositivos m dicos de diagn stico in vitro conformidade de acordo com o Anexo IV transposto para as leis nacionais dos estados membros da Uni o Europeia Europeia A ficha e os documentos t cnicos deste produto s o mantidos na geneBOX biocant centro de inova o em biotecnologia 3060 197 Cantanhede Portugal Sandra Balseiro Directora T cnica 16 20 Protocolo de amplifica o por PCR Reagentes e Amostra de DNA 100 200 naj Ul e PCR Master Mix e gua bi destilada est ril n o fornecida Extrac o de DNA Para a tipagem por SSP necess rio DNA extra puro Recomenda se que o isolamento de DNA seja efe
6. spi 189 790 B D F H COLIA1 spi 189 790 DNA 1 DNA 2 DNA 3 DNA 4 A C E G COLIA1 spi 189 790 B D F H COLIA1 spi 189 790 DNA 1 DNA 2 DNA 3 DNA 4 A C E G COLIA1 spi 189 790 B D F H COLIA1 spi 189 790 DNA 1 DNA 2 DNA 3 DNA 4 A C E G COLIA1 spi 189 790 B D F H COLIA1 spi 189 790 DNA 1 DNA 2 DNA 3 DNA 4 A C E G COLA sp1 189 790 B D F H COLAT spi 189 790 DNA1 DNA2 DNA3 DNA4 9 20 Tabela de interpreta o de resultados 1 2 A C E G COLIA1 spi G 189 790 B D F H COLIA1 spi 1 189 790 10 A C E G COLIA1 spi G 189 790 B D F H COLIA1 spi 1 189 790 11 A C E G COLIA1 spi G 189 790 B D F H COLIA1 spi T 189 790 12 A C E G COLIA1 spi G 189 790 B D F H COLIA1 spi T 189 790 Os pares de primers controlo emparelham com sequ ncias n o polim rficas Os primers de controlo positivo interno amplificam segmentos do gene PIC1 originando fragmentos com 790 pares de bases Na presen a da banda espec fica a banda controlo pode ver diminu da a sua intensidade A reac o de PCR s valida na presen a da banda controlo ou nalguns casos na presen a da banda espec fica Na aus ncia da banda controlo por favor repit
7. Refer ncias Pluijm SM van Essen HW Bravenboer N Uitterlinden AG Smit JH Pols HA Lips P Collagen type I alphal Spl polymorphism osteoporosis and intervertebral disc degeneration in older men and women Ann Rheum Dis 2004 63 71 77 Barros ER Kasamatsu TS Ramalho AC Hauache OM Vieira JG Lazaretti Castro M Bone mineral density in young women of the city of Sao Paulo Brazil correlation with both collagen type I alpha 1 gene polymorphism and clinical aspects Braz J Med Biol Res 2002 35 885 893 MacDonald HM McGuigan FA New SA Campbell MK Golden MH Ralston SH Reid DM COL1A1 Spl polymorphism predicts perimenopausal and early postmenopausal spinal bone loss J Bone Miner Res 2001 Sep 16 9 1634 41 Efstathiadou Z Tsatsoulis A Ioannidis JP Association of collagen Ialpha 1 Sp1 polymorphism with the risk of prevalent fractures a meta analysis J Bone Miner Res 2001 16 1586 1592 Langdahl BL Ralston SH Grant SF Eriksen EF An Spl binding site polymorphism in the COLIA1 gene predicts osteoporotic fractures in both men and women J Bone Miner Res 1998 13 1384 1389 e H L euUe genesox 000 DESENVOLVIMENTO E PRODU O DE TESTES DE DIAGN STICO biocant centro de inova o em biotecnologia n cleo 4 lote 3 3060 197 cantanhede portugal tel 351 231 410 946 fax 351 231 410 947 e mail info genebox com www genebox com 20 20 C digo do Produto 0705 COLI Al sp1 Box 1 0 Typing Kit
8. a a tipagem NOTA Se o PCR tiver bandas com tamanhos diferentes dos previstos n o as considere pois pode tratar se de bandas n o espec ficas ou artefactos 10 20 Guia de resolu o de problemas PROBLEMAS SSI VEI S CAUSAS SUGEST ES Bandas controlo e espec ficas fracas Os controlos internos falharam em diversos po os Falsos negativos de uma banda espec fica com o controlo interno normal Detec o de mais de dois alelos espec ficos Esfrega o de bandas Concentra o da amostra de DNA baixa Verifique a qualidade e concentra o do DNA Reextraia a amostra de DNA ou tente n o adicionar gua mistura de reac o Repita a tipagem com um DNA de boa qualidade Presen a de inibidores da Taq polimerase nas amostras de DNA Presen a de inibidores da Taq polimerase nas amostras de DNA Repurifique a amostra de DNA Repita a tipagem com um DNA de boa qualidade Repurifique a amostra de DNA Repita a tipagem com um DNA de boa qualidade Produtos de amplifica o secos Degrada o da amostra de DNA qualidade Amostra de DNA muito concentrada Verifique a selagem das placas Repita a tipagem utilizando um adaptador de silicone para placas de 96 e ou adicione leo mineral Reextraia a amostra de DNA de material fresco Repita a tipagem com um DNA de boa Verifique a qualidade e concentra o do DNA Dissolva o DNA em 44H20 de forma a
9. ados e ou incinerados 14 Informa o sobre o transporte No transporte dos Kits devem estar a seguradas as temperaturas n o devendo ultrapassar os 252C A dura o do transporte n o deve ser superior a 3 dias de modo a garantir que todos os componentes do Kit cheguem em perfeitas condi es aos seus destinat rios 15 Contactos teis N mero Nacional de Emerg ncia 112 Centro de Informa o Anti Venenos 808 250 143 16 Outras informa es As informa es a cima dispon veis s o baseados no n vel de conhecimento actual devendo ser utilizado apenas como guia A geneBOX R amp D Diagnostic Tests n o se responsabiliza por qualquer dano causado pela manipula o inapropriada ou pelo contacto com os referidos produtos Para mais esclarecimentos por favor contactem com o apoio t cnico para o 351 231 410 946 19 20 Folha de Dados de Seguran a 2 3 Material Safety Data Sheet MSDS 6 Protec o pessoal Protec o das m os use luvas apropriadas resistentes a qu micos Protec o dos olhos recomenda se o uso de culos de protec o qu mica 7 Manipula o e armazenamento Manipula o evite o contacto directo com a subst ncia Armazenamento armazene temperatura aconselhada proteja do contacto com a luz Danifica o da embalagem protectora rejeitar o constituinte contido na embalagem 8 Perigos Os componentes da mistura de reac o podem ser perigosos se inalados ingeridos ou ab
10. ata de produ o ver validade do lote na embalagem Armazenamento a 4 C a mistura de reac o permanece est vel durante 15 dias a partir da data de recep o temperatura ambiente a mistura de reac o permanece est vel durante 3 dias a partir da data de recep o A mistura de reac o nunca deve ser deixada ou armazenada com a tampa aberta 3 DNA O DNA extra do por salting out ou por qualquer outro m todo deve ser armazenado a 4 C ou 202C Ao optar pela congela o das amostras devem ser evitadas ciclos repetidos de congela o descongela o de modo a impedir a degrada o da amostra As amostras de DNA armazenadas em dH 0 permanecem est veis durante pelo menos 4 semanas a 42C ou 2 anos a 202C As amostras de DNA armazenadas em tamp o TE permanecem est veis durante pelo menos 2 anos a 42C ou 5 anos a 20 C 14 20 Protocolo de electroforese em gel de agarose Prepara o do gel de agarose a 2 1 Dissolver 4 gramas de p agarose em 200 ml de tamp o TAE 1X 2 Dissolver completamente a agarose aquecendo a no microondas 3 Arrefe a o gel at aproximadamente 502C 4 Adicione pelo menos 20 pl de brometo de et dio 10 mg ml ou 2 ql de Sybr Safe 10000x concentrado agarose Agite at estar completamente incorporado 5 Numa superf cie nivelada monte a placa do gel com 96 po os 6 Verta uma camada de gel com cerca de 5mm 7 Deixe o gel arrefecer TT Aten o
11. bter milh es de c pias de DNA a partir de uma pequena quantidade de amostra Infelizmente isto tamb m verdade para o DNA contaminante que pode comprometer performance da nossa reac o Consequentemente pr ticas laboratoriais espec ficas podem evitar a presen a de amplifica es inespec ficas Em baixo encontram se descriminadas as recomenda es da Genebox Separe fisicamente as reas de pr PCR e de p s PCR O fluxo Laboratorial deve ser sempre unidireccional da rea pr PCR para a rea p s PCR Deve sempre utilizar se equipamentos espec ficos para cada area de trabalho prepara o de amostras pr amplifica o amplifica o e p s amplifica o Todos os equipamentos utilizados na rea de p s PCR n o devem sais desta zona Utilize micropipetas luvas e batas espec ficas para cada rea Utilize preferencialmente luvas sem talco uma vez que o talco pode inibir a reac o de PCR Utilize pontas de filtro de forma a minimizar contamina es cruzadas Verifique periodicamente as micropipetas de forma a assegurar a varia o de pipetagem inferior a 5 Utilize micropipetas adaptadas a cada volume de pipetagem Verifique periodicamente os termocicladores de forma a assegurar a varia o de temperaturas inferiores a 1 Abra e feche os reagentes com cuidado Depois de utilizar armazene os restantes componentes do kit s temperaturas recomendadas devidamente fechados N
12. ctuado utilizando kits de extrac o com marca o CE que garantam um r cio DO 260 280 maior do que 1 6 e uma concentra o entre 100ng 200 ng yl Alternativamente o DNA pode ser extra do utilizando sais de Brometo de Trimetilamonia DTAB CTAB ou por salting out dissolvendo o em Tamp o TE Devem ser asseguradas o mesmo n vel de DO e de concentra o N O UTILIZE SANGUE HEPARINIZADO COM ESTE M TODO Amplifica o por PCR 1 Agite brevemente os tubos de DNA e da mistura de reac o 2 Junte e 7 pl da PCR Master Mix e 15 pl de gua bi destilada est ril e e 24ylda amostra de DNA conc 100 200 ng ul num tubo de 0 7 ml ou 1 5 ml 3 Agite vigorosamente durante 15 segundos 4 Pipete 10 pl da mistura para cada po o da placa de tipagem 2 pares de primers 5 Repita os passos anteriores para cada uma das amostras DNA num total de 48 amostras por placa 6 Sele a placa de tipagem com um autocolante e coloque num aparelho PCR de 96 po os 5 20 Par metros do programa PCR Desnatura o 96 2C 1 min 1 Desnatura o 96 2C 25 seg 21 Emparelhamento 65 C 45 seg Extens o 72 2C 30 seg Extens o 72 2C 10 min 1 7 No final da PCR guarde a placa a 2 8 C 8 Detecte os produtos do PCR com uma electroforese em gel de agarose a 2 Aviso de garantia geneBOX investiga o e desenvolvimento de teste diagn sticos responsabiliza se perante os seus clientes pelos defeitos no material e compon
13. de DNA que apresente marca o CE de modo a obter um DNA extra puro 2 Tag Polimerase O COL1 A1 sp1 Box 1 0 Typing Kit foi intensivamente testado utilizando a Taq da Reagente 5 Reagente 5 Lisboa Portugal 3 Mistura de reac o Para uma boa performance da tipagem com o COL1A1 spl Box 1 0 Typing Kit obrigat rio a utiliza o da PCR Master Mix fornecida com o Kit 4 Procedimentos de amplifica o No fim da PCR examine o grau de evapora o e de condensa o da mistura de reac o da PCR Se as perdas de volume forem superiores a 20 n o devem ser validados os resultados obtidos De forma a prevenir esta situa o devem adicionar previamente leo mineral mistura de reac o ou utilizar um adaptador de silicone para placas de 96 Tamb m se deve ter em aten o a temperatura de aquecimento do aparelho Se a temperatura de aquecimento n o for suficiente v o se verificar problemas de condensa o 5 Termociclador Recomenda se utiliza o de qualquer Termociclador que apresente as seguintes caracter sticas heating rate superior a 2 5 C sec cooling rate superior a 1 5 C sec gama de temperatures 4 100 C uniformidade de temperaturas 0 5 C heated lid superior a 1002C 6 Validade Como especificado na embalagem Se os problemas persistirem por favor contactem com o apoio t cnico para o 351 231 410 946 13 20 Avisos e precau es A amplifica o por PCR permite nos o
14. entes dos seus produtos aplicados em condi es normais Os produtos da empresa que apresentam esta garantia devem ser substitu dos sem encargos para o cliente Esta garantia aplica se s para produtos que sejam manipulados e armazenados de acordo com as especifica es e recomenda es de utiliza o As reclama es devem ser enviadas por escrito directamente para a geneBOX e devem ser acompanhadas por uma c pia da guia de transporte ou factura do produto Este produto n o pode ser reformulado reembalado ou revendido em nenhuma forma sem o expresso consentimento da geneBOX investiga o e desenvolvimento de teste diagn sticos 15 20 geneBOX investiga o e desenvolvimento de teste diagn sticos garante que os primers presentes no kit de tipagem COL1A1 sp1 Box apresentam as especificidades dadas nas folhas e tabelas de interpreta o de resultados do produto 1 Placa de Tipagem Armazenamento a 15 a 302C os primers desidratados permanecem est veis durante 12 a 19 meses a partir da data de produ o ver validade do lote na embalagem temperatura ambiente os primers desidratados permanecem est veis durante 3 a 4 semanas a partir da data de recep o Quando o selante removido os primers desidratados permanecem est veis durante 2 dias no m ximo desde que n o humede am 2 Mistura de Reac o Armazenamento a 20 C a mistura de reac o permanece est vel durante 18 meses a partir da d
15. este reagente um forte agente mutag nico leia atentamente a MSDS do produto Electroforese Submirja o gel na tina de electroforese com tamp o TAE 1X Remova os pentes com cuidado do gel Adicione 10 ul do produto de PCR em cada po o sa O IN da Ligue a tina de electroforese corrente com uma voltagem m dia 115V 5 Deixe a electroforese correr por cerca de 20 minutes ou at 0 corante estar a 2 3 da linha 6 Ponha o gel no transiluminador 7 Fotografe o gel e identifique o 8 Use a Tabela de interpreta o de resultados para interpretar os resultados 7 20 Esquema da placa COL1 A1 sp1 Box 1 0 00000000000 0000000000 60 00000000000 00000000000 00000000000 0000000000 60 00000000000 00000000000 S 2 j I dentifica c o da placa COL1 A1 sp1 Box 1 0 Posi o Gene Local polim rfico 8 20 Guia T cnico 1 Pureza e Concentra o do DNA Para obter bons resultados com o COL1 A1 sp1 Box 1 0 Typing Kit a pureza da amostra de DNA cr tica Ter uma amostra pura significa obter uma raz o 260nm 280nm de DO superior a 1 6 e uma por o de DNA superior a 9 4 kb A elevada degrada o do DNA ou uma raz o 260nm 280nm inferior a 1 5 requer uma nova extrac o de DNA Cada amostra de DNA deve ter aproximadamente 100 a 200 ng l Concentra es elevadas de DNA provocam um decl nio consider vel na especificidade da PCR Recomenda se o uso de qualquer kit de extrac o
16. sorvidos pela pele Este material pode causar irrita o da pele dos olhos e do tracto respirat rio A ingest o de grandes quantidades desta mistura pode causar dores de est mago v mitos ou diarreia 9 Medidas de Primeiros Socorros No caso de contacto com os olhos deve lavar imediatamente os olhos com gua abundante por cerca de 15 minutos Deve consultar o seu m dico No caso de contacto com a pele deve lavar imediatamente a zona afectada com gua corrente e sab o Lave a roupa contaminada antes da sua utiliza o No caso de ingest o lave a boca com gua abundante Deve contactar o seu m dico se necess rio No caso de inala o mudar a v tima para um local arejado Se se encontrar inanimado aplique respira o artificial Se apresentar dificuldades respirat rias aplique oxig nio Deve consultar o seu m dico 10 Medidas a tomar em caso de inc ndio Meios de extin o gua di xido de carbono p qu mico seco ou espuma apropriada Meios de extin o n o aconselhados n o existem restri es conhecidas Perigos espec ficos de exposi o em caso de inc ndio podem emitir fumos t xicos de di xido e mon xido de carbono nitrog nio f sforo cloreto de hidrog nio e g s hidrog nio Equipamento especial de combate ao inc ndio quando s o libertadas grandes quantidades de subst ncia trabalhe apenas com protec o adequada para olhos e pele 11 Medidas a tomar no caso de derrame acidental Preca
17. u es pessoais evite o contacto directo com a subst ncia Limpeza limpe normalmente a rea afectada n o s o necess rios cuidados adicionais Protec o da pele use uma bata de laborat rio 18 20 Apresenta o Este kit cont m placas com misturas de primers desidratadas e PCR Master Mix para efectuar a tipagem gen tica do polimorfismo sp1 do gene do colag nio tipo a 1 COLIAI Altera es e melhoramento do Produto Este produto pode ser melhorado de modo a aumentar o seu rendimento As altera es adi es ou modifica es de primers em rela o ao lote anterior est o detalhadas na tabela abaixo Tubo primers motivo N A Controlo de Qualidade A Devido inexist ncia de linhas celulares controlo n o foram feitos testes normais de controlo da qualidade Contudo a Genebox testou as misturas de primers com v rios DNAs padr o obtendo amostras positivas e negativas para cada uma das muta es A Genebox garante a qualidade e a fiabilidade do seu kit COL1 A1 sp1 Box 3 20 e Placas de tipagem de COLI Al 48 tipagens 1 placa 48 amostras conservar de 15 a 302C e PCR Master Mix com Taq DNA Polimerase 1 X 340 ul conservar de 15 a 30 C e Selantes de Placas 1 selantes de PCR transparentes e Manual de instru es 1 Manual de Instru es com pares de primers espec ficos desidratados Componentes da PCR Master Mix Nucle tidos concentra o final de cada
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