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SeroCPה - IgG - Savyon Diagnostics

1. o usadas t m de ser reseladas na saqueta de alum nio com o cart o dessecante 4 Durante o armazenamento no frio podem se formar cristais no Tamp o de Lavagem concentrado 20x fen meno perfeitamente normal Dissolver os cristais aquecendo o tamp o a 37 C antes de diluir Uma vez dilu da a solu o pode ser armazenada a 2 8 C at vinte e um dias Colheita do Soro Preparar o soro a partir de amostras colhidas assepticamente por t cnicas standard N o deve ser usado soro inactivado pelo calor N o recomendada a utiliza o de soro lip mico t rbido ou contaminado Soros com part culas e precipitados podem conduzir a falso resultados Tais amostras devem ser limpas por centrifuga o ou filtra o antes de serem testadas Armazenamento As amostras devem ser armazenadas a 2 8 C e testadas em 7 dias recomenda se a adi o de azida s dica 0 1 Se se prever um per odo de armazenamento maior aliquotar e armazenar as amostras a menos de 20 C Evitar ciclos de congelamento descongelamento Procedimento do Teste A Prepara o dos Reagentes 1 Colocar temperatura ambiente todos os componentes e amostras a serem testados Misturar bem os calibradores P10 P50 P75 Controlo Negativo e amostras antes de usar 2 Determinar o n mero total de amostras a testar Para al m das amostras tem de se incluir em todos os testes o seguinte um po o para o Branco um po o de Controlo Negativo e tr s po os de c
2. seguinte forma R BU2 15 BU1 15 BU1 Concentra o em BU ml da 1 amostra BU2 Concentra o em BU ml da 2 amostra Se R 21 55 a diferen a estatisticamente significativa p 0 005 De forma a atingir um perfil de anticorpos compreensivo tamb m devem ser testados anticorpos IgM e IgA Interpreta o dos resultados baseada na combina o da detec o de anticorpos IgM IgG e IgA N vel de anticorpos M pneumoniae N o h indica o de Negativo Negativo Negativo infec o M pneumoniae Negativo Negativo Indica o de ou Positivo ou infec o corrente Positivo Positivo Pao me as Negativo Negativo infec o passada Negativo Indica o de ou Negativo Positivo infec o corrente ou Positivo reinfec o Reac es Cruzadas Tamb m foram testados com o kit SeroMP doentes hospitalizados infectados com patog nios do tracto respirat rio Chlamydia pneumoniae Influenza A Influenza B Parainfluenza 1 2 e 3 bem como Adenovirus e EBV que tinham sido diagnosticados por kits serol gicos comerciais A maioria dos soros apresentou resultados negativos n o se detectou reactividade cruzada significativa Limita es do Teste 1 Para o diagn stico final n o deve ser usado um teste serol gico nico Devem se ter em conta todos os dados cl nicos e laboratoriais 2 As amostras obtidas muito cedo durante a infec o prim ria podem n o conter anticor
3. year prospective study of 346 consective patients Thoras 1996 51 179 184 2 Okada T Kato l Miho l Minami S Kinoshita H Akao l Kemmochi M Miyabe S and Takeyama 1996 Acute Sensorimeural Hearing Loss Cause by M Pneumoniae Acute Otolaryngol Stockh 1996 522 22 25 3 Lieberman D Shvartzman P Lieberman D Ben Yaakov M Lazarovich Z Hoffman S Mosckovitz R Ohana B Leinonen M Luffy D and Boldur 1998 Etiology of Respiratory Tract Infection in Adults in a General Practice Setting Eur J Clin Bicrobiol Infect Dis 17 685 689 4 Raisanen S M Suni J l and Leinikki P O 1980 Serological diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infections by enzyme immunoassay J Clin Pathol 33 836 840 5 Seggav J S Sedmark G V and Krup V 1996 Isotype specific antibody responses to acute M pneumoniae infection Ann Allergy Asthma Immuno 77 67 73 6 Samra Z and Gadba R 1993 Diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection by specific IgM antibodies using a new capture enzyme immunoassay Eur J Epidermol 9 97 99 7 Lieberman D Lieberman D Printz S Ben Yaakov M Lazarovich Z Ohana B Friedman M G Dvoskin B Leinonen M and Boldur 2003 Atypical Pathogen Infection in Adults with Acute Exacerbation of Bronchial Asthma Am J Respir Crit Care Med 167 406 410 8 Lieberman D Leibrman D Ben Yaakov M Shmarkov O Gelfer Y Varshavsky R Ohana B Lazarovi
4. Ce SeroMP IgG Ensaio Imunoenzim tico ELISA para a detec o semi quantitativa de anticorpos IgG espec ficos para Mycoplasma pneumoniae em soro humano Manual de Instru es Kit para 96 determina es Ref A261 01M Kit para 192 determina es Ref B261 01M Para uso em Diagn stico In Vitro Armazenar a 2 8 C N o congelar tail Savyon Diagnostics Ltd 3 Habosem St Ashdod 77610 ISRAEL Tel 972 8 8562920 Fax 972 8 8523176 E mail support savyondiagnostics com Utiliza o O kit SeroMP IgG um ensaio imunoenzim tico ELISA semi quantitativo para a determina o de anticorpos IgG espec ficos da esp cie Mycoplasma pneumoniae em soro humano O kit SeroMP IgG da Savyon utilizado como auxiliar no diagn stico de infec es por Mycoplasma pneumoniae O teste tamb m permite o diagn stico de uma infec o corrente pela determina o do aumento de anticorpos IgG em pares de soros colhidos num intervalo de 1 4 semanas Para uso em Diagn stico In Vitro Introdu o O M pneumoniae causa comum de pneumonia adquirida pela comunidade frequentemente caracterizada pelo aparecimento gradual de dores de cabe a febre mau estar e mais tipicamente tosse seca O M pneumoniae comum em todos os grupos et rios contudo mais frequente nas duas primeiras d cadas de vida e raro em crian as com menos de quarto anos de idade Foi considerado como a causa de mais de 30 de to
5. a s dica e menos de 0 05 Proclina como conservantes 1 Frasco 2 0ml 9 Calibrador P75 Soro humano de elevada positividade IgG para M pneumoniae pronto a usar Cont m 75 BU ml de IgG unidades arbitr rias de liga o Cont m menos de 0 1 de azida s dica e menos de 0 05 Proclina como conservantes 1 Frasco 2 0ml 10 Conjugado HRP Concentrado 300 X IgG espec fica da cadeia y anti humana conjugada a HRP Cont m menos de 0 05 Proclina como conservante 1 Frasco 0 2ml 11 Substrato TMB Solu o pronta a usar Cont m 3 3 5 5 tetrametilbenzidina como cromog nio e peroxidase como substrato 1 Frasco 24ml 12 Solu o de Paragem Solu o pronta a usar Cont m 1M H SO 1 Frasco 30ml 13 Revestimento de placa 2 unidades 14 Manual de Instru es 1 Material Necess rio mas n o fornecido 1 Tubos teste limpos para as dilui es das amostras 2 Frascos de pl stico descart veis para a dilui o do Conjugado HRP concentrado 3 Micropipetas ajust veis e pipetas multicanal 5 50 50 200 e 200 10004i e pontas descart veis 4 Bal o de vidro para 1 litro de volume 5 Tubo de ensaio de 50ml de volume 6 Frasco de lavagem 7 Papel absorvente 8 Vortex 9 Banho com tampa a 37 C ou c mara h mida colocada numa incubadora de 37 C 10 Leitor ELISA com filtros de 450 e 620nm 11 Agua destilada ou duplamente desionizada Avisos e Precau es Para uso em Diagn stico In Vi
6. ade 5 e podem ter maior utilidade que os IgM no diagn stico de uma infec o corrente nos adultos 6 A Savyon Diagnostics Ltd desenvolveu testes ELISA IgG IgA and IgM semi quantitativos que permitem seguir as altera es dos n vies de anticorpos no soro humano O antig nio utilizado no teste SeroMP uma prepara o da membrana de M pneumoniae que cont m a prote na de membrana P1 que o principal imunog nio 7 8 9 10 11 O teste SeroMP permite a detec o precoce e rigorosa de anticorpos IgG IgA e IgM espec ficos de M pneumoniae Princ pio do Teste As placas de microtitula o SeroMP s o revestidas com frac o purificada de prote nas da membrana de M pneumoniae Os soros a serem testados s o dilu dos e incubados na placa SeroMP Neste passo os anticorpos espec ficos para M pneumoniae ligam se aos antig nios imobilizados Os anticorpos n o espec ficos s o removidos por lavagem Adiciona se IgG anti humana conjugada a peroxidase de rabano picante HRP Neste passo o conjugado HRP liga se ao complexo antig nio anticorpo pr ligado O conjugado n o ligado removido por lavagem Ap s a adi o do substrato TMB este hidrolizado pela peroxidase produzindo uma solu o azul do Substrato reduzido Ap s a adi o da solu o de paragem a cor azul passa a amarela e deve ser lida num leitor ELISA ao comprimento de onda de 450 620nm A absorv ncia proporcional aos n ve
7. alibradores P10 P50 P75 3 Retirar a placa de microtitula o da saqueta de alum nio cortando uma extremidade pr xima da marca Deixar o n mero de tiras necess rias de acordo com o n mero de amostras a serem testadas no suporte de 96 po os 4 Diluir o Tamp o de Lavagem Concentrado 1 20 com gua destilada ou duplamente desionizada Por exemplo para preparar um litro de tamp o de lavagem adicionar 50ml de Tamp o de Lavagem Concentrado a 950ml de gua destilada ou duplamente desionizada B Incuba o das amostras e controlos Diluir cada amostra 1 105 com o Diluente de Soro fornecido Adicionar 10 ul de amostra a 200ul de Diluente de Soro 1 21 e de seguida diluir novamente adicionado 25ul da dilui o 1 21 a 100 de Diluente de Soro Dispensar 50ul de Branco diluente de soro Controlo Negativo tr s calibradores P10 P50 P75 e amostras dilu das 1 105 em po os separados da tira teste Cobrir as tiras e incubar 1h a 37 C numa c mara h mida Eliminar o conte do l quido dos po os Lavagem Encher cada po o com tamp o de lavagem at ao cimo e deitar fora o l quido repetir tr s vezes 10 Secar as tiras e suporte batendo suavemente sobre papel absorvente limpo q o co ON C Incuba o com o conjugado 11 0 conjugado IgG anti humano HRP concentrado deve ser dilu do pouco tempo antes de usar Diluir 1 300 com diluente de conjugado Por exemplo para duas tiras preparar um m nimo
8. ca 1 unidades 14 Manual de Instru es 1 Kit para 192 Determina es Ref B261 01M 1 Placa de microtitula o revestida com antig nio M pneumoniae 96 po os separ veis 8x12 revestidos com antig nios M pneumoniae embalados numa saqueta de alum nio com um cart o dessecante 2 Placas 2 Tamp o de Lavagem Concentrado 20X Tamp o PBS Tween 2 Frascos 100ml cada 3 Diluente de Soro azul Solu o tamp o pronta a usar Cont m menos de 0 05 Proclina como conservante 1 Frasco 60ml 4 Diluente do Conjugado verde Solu o tamp o pronta a usar Cont m menos de 0 05 Proclina como conservante 1 Frasco 80ml 5 Controlo Positivo Um soro humano IgG positivo para M pneumoniae pronto a usar Cont m menos de 0 05 Proclin e menos de 0 1 de azida de s dio como conservantes 1 Frasco 2 0ml 6 Controlo Negativo Soro humano IgG negativo para M pneumoniae pronto a usar Cont m menos de 0 05 Proclina e menos 0 1 azida s dica como conservantes 1 Frasco 2 0ml 7 Calibrador P10 Soro humano de baixa positividade IgG para M pneumoniae pronto a usar Cont m 10 BU ml de IgG unidades arbitr rias de liga o Cont m menos de 0 1 de azida s dica e menos de 0 05 Proclina como conservantes 1 Frasco 2 0ml 8 Calibrador P50 Soro humano de m dia positividade IgG para M pneumoniae pronto a usar Cont m 50 BU ml de IgG unidades arbitr rias de liga o Cont m menos de 0 1 de azid
9. ch Z and Boldur 2002 Serological evidence of Mycoplasma pneumoniae infection in acute exacerbation of COPD Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 44 1 6 9 Lieberman D Leibrman D Ben Yaakov M Lazarovich Z Ohana B Friedman M G Dvoskin B Leinonen M and Boldur 2003 Age and Ageing 32 95 101 10 Lieberman D Leibrman D Koronsky Ben Yaakov M Lazarovich Z Friedman M G Dvoskin B Leinonen M Ohana B and Boldur 2002 A comparative study of the etiology of adult upper and lower respiratory tract infections in the community Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 42 21 28 11 Lim T H Muhlestein J B Carlquish J F Ohana B Lipson M Horne B D Anderson J L 2002 Mycoplasma Pneumoniae High IgA Titer but Not IgG Predicts Increased Hazard of Death or Myocardial Infarction Among Patients with Angiographically Defined Coronary Artery Disease Abstract presented at the 51st Annual Scientific Session of the American College of Cardiology March 17 20 2002 Atlanta Georgia Ce European Authorized Representative Obelis s a Boulevard G n ral Wahis 53 Tel 32 2 732 59 54 Fax 32 2 732 60 03 E mail mail obelis net 03 02 11 M261 01P
10. de 3ml de conjugado da seguinte forma misturar 10ul de conjugado IgG anti numano HRP concentrado com 3ml de Diluente do Conjugado 12 Dispensar 50ul de conjugado dilu do em cada po o 13 Cobrir as tiras e incubar 1h a 37 C numa c mara h mida 14 Deitar fora o conte do l quido e lavar como descrito nos passos 9 10 D Incuba o com o Substrato TMB 15 Dispensar 100ul de Substrato TMB em cada po o cobrir as tiras e incubar temperatura ambiente por 15 minutos 16 Parar a reac o adicionando 100uI de solu o de paragem 1M H2SO a cada po o E Determina o dos Resultados 17 Determinar a absorvancia a 450 620nm e registar os resultados A determina o n o deve exceder 30 minutos ap s a paragem da reac o cromog nica Nota Antes da leitura deve ser removida qualquer bolha de ar A base da placa ELISA deve ser cuidadosamente limpa Valida o do Teste Para que o teste seja v lido devem ser reunidos os seguintes crit rios Caso isso n o aconte a o teste deve ser considerado inv lido e deve ser repetido 1 D O p75 gt 0 9 2 Razao D 0O pi9 D O CN gt 1 5 3 Raz o D O pso D O CN gt 4 4 Raz o D O pzs D O CN gt 5 5 5 CP dever ser gt 40 UA ml C lculo dos Resultados M todo manual com papel gr fico quadricular 1 Colocar os valores de absorv ncia DO dos e calibradores P10 P50 e P75 no eixo Y versus a sua concentra o BU ml no eixo X 2 Desenhar a melhor linha a
11. dos os casos de pneumonia 1 O M pneumoniae tamb m tem sido associado com doen as n o respirat rias como meningite encefalite pancreatite 03 02 11 M261 01P perda de audi o sensor neural s ndrome agudo de brainstem 2 Devido sua ocorr ncia comum o M pneumoniae deve ser considerdao em todos os casos de pneumonia mas sendo os sintomas de diferentes agentes id nticos s o necess riaos instrumentos de diagn stico adicionais tais como testes serol gicos 3 A t cnica ELISA technique sens vel espec fica e permite a determina o diferencial de anticorpos IgG IgA e IgM espec ficos 4 Os anticorpos M pneumoniae IgM espec ficos aumentam cedo ap s o aparecimento da doen a atingem n veis m ximos em uma a quarto semanas e depois diminuem para n veis sem significado diagn stico em poucos meses 5 Devido ao r pido aparecimento e tempo de vida relativamente curto dos anticorpos IgM a sua detec o permite o diagn stico da infec o aguda com uma nica amostra Os doentes jovens tendem a ter n veis de IgM mais elevados que os adultos 6 Os n ves de IgG aumentam mais lentamente que os IgM mas permanecem elevados por muito mais tempo assim um aumento significativo em duas amostras consecutivas colhidas com pelo menos 2 semanas de intervalo pode indicar uma infec o corrente ou re infec o mesmo na aus ncia de IgM Os anticorpos IgA apresentam os n veis mais elevados em doentes com mais id
12. e 0 1 de azida de s dio como conservantes 1 Frasco 2 0ml 6 Controlo Negativo Soro humano IgG negativo para M pneumoniae pronto a usar Cont m menos de 0 05 Proclina e menos 0 1 azida s dica como conservantes 1 Frasco 2 0ml 03 02 11 M261 01P 7 Calibrador P10 Soro humano de baixa positividade IgG para M pneumoniae pronto a usar Cont m 10 BU ml de IgG unidades arbitr rias de liga o Cont m menos de 0 1 de azida s dica e menos de 0 05 Proclina como conservantes 1 Frasco 2 0ml 8 Calibrador P50 Soro humano de m dia positividade IgG para M pneumoniae pronto a usar Cont m 50 BU ml de IgG unidades arbitr rias de liga o Cont m menos de 0 1 de azida s dica e menos de 0 05 Proclina como conservantes 1 Frasco 2 0ml 9 Calibrador P75 Soro humano de elevada positividade IgG para M pneumoniae pronto a usar Cont m 75 BU ml de IgG unidades arbitr rias de liga o Cont m menos de 0 1 de azida s dica e menos de 0 05 Proclina como conservantes 1 Frasco 2 0ml 10 Conjugado HRP Concentrado 300 X IgG espec fica da cadeia y anti humana conjugada a HRP Cont m menos de 0 05 Proclina como conservante 1 Frasco 0 2ml 11 Substrato TMB Solu o pronta a usar Cont m 3 3 5 5 tetrametilbenzidina como cromog nio e peroxidase como substrato 1 Frasco 14ml 12 Solu o de Paragem Solu o pronta a usar Cont m 1M H gt SO 1 Frasco 15ml 13 Revestimento de pla
13. is de anticorpos espec ficos que est o ligados aos antig nios de revestimento Po os da placa de microtitula o revestidos com antig nios M pneumoniae 4 Adicionar 50ul de Controlo Negativo 50ul de cada calibrador P10 P50 P75 e amostras dilu das Cobrir a placa e incubar 1h a 37 C com 100 de humidade Lavar 3 vezes com Tamp o de Lavagem Adicionar 50ul de Conjugado HRP dilu do 1 300 Cobrir a placa e incubar 1h a 37 C com 100 de humidade Lavar 3 vezes com Tamp o de Lavagem Adicionar 100ul de Substrato TMB Cobrir a placa e incubar 15min tempertaura ambiente Adicionar 100ul de Solu o de Paragem Ler as absorv ncias a 450 620nm Y Calcular e interpretar os resultados Conte do do kit Kit para 96 Determina es Ref A261 01M 1 Placa de microtitula o revestida com antig nio M pneumoniae 96 po os separ veis 8x12 revestidos com antig nios M pneumoniae embalados numa saqueta de alum nio com um cart o dessecante 1 Placa 2 Tamp o de Lavagem Concentrado 20X Tamp o PBS Tween 1 Frascos 100ml 3 Diluente de Soro azul Solu o tamp o pronta a usar Cont m menos de 0 05 Proclina como conservante 1 Frasco 30ml 4 Diluente do Conjugado verde Solu o tamp o pronta a usar Cont m menos de 0 05 Proclina como conservante 1 Frasco 40ml 5 Controlo Positivo Um soro humano IgG positivo para M pneumoniae pronto a usar Cont m menos de 0 05 Proclin e menos d
14. pos detect veis Se se suspeitar de infec o por Mycoplasma deve se obter uma segunada amostra 2 4 semanas mais tarde e ser testada em paralelo com a amostra inicial 3 Subst ncias de interfer ncia N o recomendada a utiliza o de soro lip mico t rbido ou contaminado Soros com part culas e precipitados podem conduzir a falso resultados Tais amostras devem ser limpas por centrifuga o ou filtra o antes de serem usadas 03 02 11 M261 01P Caracteristicas de Performance Sensibilidade e Especificidade A sensibilidade e especificidade do SeroMP IgG foi calculado com soros 31 obtidos de doentes com pneumonia e 28 de dadores saud veis que foram testados com resultados concordantes Resultados de consenso por 2 ensaios ELISA comerciais Resultados de consenso Positivo Negativo SeroMP Positivo 29 0 IgG Negativo 2 28 Sensibilidade 29 31 x 100 93 5 Especificidade 28 28 x 100 100 Concord ncia 57 59 x 100 97 Precis o Precis o intra ensaio no mesmo ensaio N de Valor CV replicados M dio 1 247 0 185 Precis o inter ensaio entre ensaios N de Valor CV replicados M dio 1 138 0 189 132 Bibliografia 1 Liberman D Schlaffer F Boldur l Liberman D Horowitz S Friedman M G Leioninen M Horowitz O Manor E and Porath A 1996 Multiple pathogens in adult patients admitted with Community aquired pneumonia a one
15. trav s dos pontos 3 Usando a curva standard interpolar os valores de concentra o das amostras testadas em BU ml a partir de cada absorv ncia medida ver exemplo 1 03 02 11 M261 01P Exemplo 1 Interpola o dos resultados Ler o valor de absorvancia da amosira no eixo Y e projectar uma linha horizontal para a curva de calibra o Da zona interceptada projectar uma linha vertical para o eixo X Ler a concentra o da amostra em BU ml mo so me Sero MP IgG Calibration o o y 0 0172x 0 3189 gt R2 1 0000 OD 450 620 nm o _ md q o IgG BU mI Interpreta o dos Resultados diagn stica Negativo Aus ncia de indica o lt 10 BU ml Anticorpos IgG de infec o n o detect veis M pneumoniae Borderline Testar uma segunda gt 10 BU ml amostra colhida 2 4 lt 20 BU m semanas mais tarde em paralelo com a primeira amostra Quando a segunda amostra borderline o resultado deve ser considerado negativo Positivo Indica o de infec o gt 20 BU ml N veis M pneumoniae relevantes de corrente ou passada anticorpos IgG 1 Para diferenciar entre infec o corrente e passada recomenda se obter uma segunda amostra ap s 2 4 semanas Se o valor BU ml da segunda amostra aumentar significativamente indicativo de infec o corrente Para avaliar se a diferen a entre as duas medi es significativa a raz o entre os soros deve ser calculada da
16. tro 1 Este kit cont m soros humanos que foram testados e considerados negativos por t cnicas aprovadas pela FDA para antig nio HBV e para anticorpos HCV e HIV 1 e 2 Dado que nenhum m todo pode oferecer completa seguran a que os produtos derivados de sangue humano n o transmitem infec o todos os componentes de sangue humano fornecidos neste kit t m de ser manuseados como soro ou sangue potencialmente infecciosos de acordo com as recomenda es publicadas no manual CDC NIHS Biosafety in Micro Biological and Biomedical Laboratories 1988 2 A solu o Substrato TMB material irritante para a pele e membranes mucosas Evitar contacto directo 3 Todos os componentes deste kit foram calibrados e testados por lote N o recomend vel misturar componentes de lotes diferentes uma vez que isso pode afectar os resultados 03 02 11 M261 01P 4 O cido sulf rico dilu do 1M H gt SO4 um agente irritante para os olhos e pele Em caso de contacto com os olhos lavar abundantemente com gua e consultar um m dico Armazenamento e Validade dos Reagentes 1 Todos os reagentes fornecidos devem ser armazenados a 2 8 C Os frascos de reagentes fechados s o est veis at a data indicada na embalagem do kit A exposi o durante algumas horas temperatura ambiente de componentes originalmente tapados ou selados n o prejudica os reagentes NAO CONGELAR 2 Uma vez aberto a validade do kit de 90 dias 3 As tiras n

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