Kit para Detecção d cDNA de Influenza A/B
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1. Legenda Inf A 1 Inf A 14 Amostras para analisar Inf A CN Controle Positivo de amplifica o Inf A CP Controle Positivo da amplifica o Inf A1 Inf A 14 Amostras para analisar Inf CN Controle Positivo de amplifica o Inf Controle Positivo da amplifica o Consultando a documenta o do equipamento programar no termociclador os par metros do ciclo t rmico indicando 45 ciclos um volume de rea o de 25 Para equipamentos Applied Biosystems ABI PRISM da s rie 7000 escolher a op o 9600 emulation Ciclo t rmico para amplifica o Fase Temperaturas Tempos Descontamina o 50 C 2 min Desnatura o inicial 95 C 10 min 95 15 seg 45 ciclos 60 1 min Prepara o da amplifica o Realizado na rea de extra o prepara o da rea o de amplifica o Antes de iniciar necess rio Retirar e descongelar os tubos contendo as amostras a serem analisadas Centrifugar os tubos para que o material des a para o fundo do tubo e mant los em gelo Retirar e descongelar os tubos de AmpliMIX Infl A tampa vermelha e AmpliMIX Infl tampa amarela necess rios para o processo lembrando que o conte do de cada tubo suficiente para preparar 24 rea es Centrifugar os tubos por 5 segundos pulso para que os reagentes des am para o fundo e mant los em gelo Rev 04 Out 20132. E RI R S amp SQSSSSSOMOOODUD DOOSOUOSDMHODMDMDPPPP fff DTIPRDTRRD D D D DLDRDRD RDRPDIRCCCDTRRTIIII TUITIRP R P OAA EEE ey Rev 04 Out 2013 e RNAse sem a presen a de DNA e RNA Os reagentes devem ser manipulados em c mara de fluxo laminar Os reagentes necess rios para a amplifica o devem ser preparados de modo a ser utilizados em uma nica vez As pipetas utilizadas para manipular os reagentes devem ser destinadas exclusivamente a este prop sito As pipetas devem ser do tipo de deslocamento positivo ou usar ponteiras com barreira filtro As ponteiras utilizadas devem ser est reis sem a presen a de DNAse e RNAse sem a presen a de DNA e RNA Os produtos de amplifica o devem ser manipulados de modo a limitar ao m ximo a dispers o no ambiente para evitar a possibilidade de contamina es As pipetas utilizadas para manipular os produtos de amplifica o devem ser destinadas exclusivamente para sua rea de trabalho Advert ncias e precau es para componentes espec ficos Os tubos contendo Controle Positivo podem ser congelados e descongelados por no m ximo 12 vezes Um n mero maior de ciclos de congelamento e descongelamento pode causar uma redu o do t tulo O Controle Positivo apresenta as seguintes advert ncias S S 23 25 N o inalar vapores Evitar contato com os olhos PROCEDIMENTO O produto Influenza A B Controle Positivo deve ser usado co
3. Rev 04 Out 2013 RTSO74 Influenza A B Q PCR Alert Kit Instru es de Uso USO PRETENDIDO O kit Influenza A B Q PCR Alert AmpliPROBE parte de um ensaio de amplifica o de cidos nucleicos para a detec o diferencial de cDNA do virus da Influenza A e do virus da Influenza B no produto da rea o de transcri o reversa obtido de RNA extra do de swabs nasais swabs faringeos gargarejo ou sobrenadante de culturas celulares O produto deve ser usado com dados cl nicos e outros testes laboratoriais no diagn stico das infec es por v rus da Influenza A e por virus da Influenza B O produto fornece 48 determina es para o cDNA de influenza A e 48 determina es para cDNA de Influenza B incluindo controles PRINC PIO DE A O E REA O O procedimento envolve para cada amostra uma rea o de amplifica o em Tempo Real para o virus Influenza A e uma rea o de amplifica o em tempo real para o v rus Influenza B As duas rea es produzidas em uma microplaca com um termociclador em tempo real No primeiro po o uma rea o de amplifica o realizada para uma regi o do gene da matriz do virus da Influenza A e para a regi o do RNA gen mico do fago MS2 teste interno de adequa o usando o cDNA produzido na rea o de transcri o reversa das amostras A sonda especifica para o virus Influenza A marcada com o fluor foro FAM ativada quando hibridizada com o produto espec fico da rea
4. Retirar e descongelar um n mero igual de tubos de AmpliPROBE Infl A tampa vermelha e AmpliPROBE Infl tampa amarela e tubos de AmpliMIX Repetir o pulso nesses tubos para que seu conte do des a para o fundo tubo Mant los em gelo Retirar o mesmo n mero de tubos de AmpliMASTER quantos os tubos de AmpliMIX Infl A escrever Infl A e a data no tubo com caneta de tinta permanente Dar um pulso nos tubos para que os reagentes des am para o fundo depois de descongelados Mant los em gelo Retirar o mesmo n mero de tubos de AmpliMASTER quantos os tubos de AmpliMIX Infl escrever Infl e a data no tubo com caneta de tinta permanente Dar um pulso nos tubos para que os reagentes des am para o fundo depois de descongelados Mant los em gelo Retirar e descongelar os tubos de Controle Positivo Infl A e Controle Positivo Infl B Centrifugar os tubos para que os reagentes des am para o fundo depois de descongelados Mant los em gelo Retirar a microplaca de amplifica o que ser usada na se o com o cuidado de manipul la com luvas sem talco e de n o causar danos aos po os Transferir 100 pL de AmpliMIX Infl A tampa vermelha no tubo de AmpliMASTER rotulado infl A Misturar bem e pipetar tr s vezes o volume de 100 pL na mistura Transferir 100 de AmpliPROBE Infl tampa vermelha no tubo de AmpliMASTER rotulado Infl A Misturar bem e pipetar tr s vezes o volume de 100 uL
5. o na rea de extra o prepara o das rea es de amplifica o necess rio uso de EPI adequado a cada uma das reas de trabalho em laborat rio de biologia molecular As amostras devem ser destinadas exclusivamente a este tipo de an lise As amostras devem ser manipuladas em uma c mara de fluxo laminar Os tubos que cont m amostras diferentes nunca devem ser abertos ao mesmo tempo As pipetas utilizadas para manipular as amostras devem ser destinadas exclusivamente a este uso As pipetas devem ser do tipo deslocamento positivo ou usar ponteiras com barreira filtro As ponteiras utilizadas devem ser est reis sem a presen a de DNAse e RNAse sem a presen a de DNA e RNA Os reagentes devem ser manipulados em c mara de fluxo laminar Os reagentes necess rios para a amplifica o devem ser preparados de modo a ser utilizados em uma nica vez As pipetas utilizadas para manipular os reagentes devem ser destinadas exclusivamente para aquela rea de trabalho As pipetas devem ser do tipo de deslocamento positivo ou usar ponteiras com barreira filtro As ponteiras utilizadas devem ser est reis sem a presen a de DNAse e RNAse sem a presen a de DNA e RNA Os produtos de amplifica o devem ser manipulados de modo a limitar ao m ximo a dispers o no ambiente para evitar a possibilidade de contamina es As pipetas utilizadas para manipular os produtos de amplifica o devem ser destinadas exclusivamente para sua rea de
6. o de amplifica o para o v rus Influenza A A sonda espec fica para o controle interno marcada com fluor foro VIC ativada quando hibridizada com o produto espec fico da rea o de amplifica o para controle interno A emiss o de fluoresc ncia aumenta medida que o produto espec fico da rea o de amplifica o aumenta e medido e gravado pelo aparelho No segundo po o uma rea o de amplifica o realizada para uma regi o do gene da matriz do v rus da Influenza e para a regi o do RNA gen mico do fago MS2 teste interno de adequa o usando o cDNA produzido na rea o de transcri o reversa das amostras sonda especifica para o virus Influenza marcada com o fluor foro FAM ativada quando hibridizada com o produto espec fico da rea o de amplifica o para o v rus Influenza B A sonda espec fica para o controle interno marcada com fluor foro VIC ativada quando hibridizada com o produto espec fico da rea o de amplifica o para controle interno A emiss o de fluoresc ncia aumenta medida que o produto espec fico da rea o de amplifica o aumenta e medido e gravado pelo aparelho Rev 04 Out 2013 O processamento dos dados determina a presen a de cDNA dos virus de Influenza A ou Influenza B na amostra inicial Assay Chemistry Summary Primer O nm 6 Primer Probe met O Quencher Reporter Minor Grove Binder AS MGB
7. menos podem ser evitados somente com uma boa pr tica de laborat rio e seguindo escrupulosamente as instru es fornecidas nestas instru es Este produto requer pessoal instru do no processamento de amostras biol gicas potencialmente infecciosas e prepara es qu micas classificadas como para evitar incidentes com consequ ncias potencialmente graves para o usu rio ou outras pessoas Este produto requer roupa de trabalho EPI e rea de trabalho adequadas manipula o de amostras biol gicas potencialmente infecciosas e de reagentes classificados como perigosos para evitar incidentes com consequ ncias potencialmente graves para o usu rio ou outras pessoas Este produto requer pessoal instru do para t cnicas de biologia molecular como extra o amplifica o e detec o de cidos nucleicos para evitar resultados incorretos necess rio possuir reas separadas para a extra o prepara o das rea es de amplifica o e para a amplifica o detec o de produtos de amplifica o para prevenir resultados falsos positivos Este produto requer o uso de roupas de trabalho e instrumentos destinados extra o prepara o das rea es de amplifica o e para a amplifica o detec o dos produtos de amplifica o para evitar resultados falsos positivos Um resultado negativo obtido com este produto indica que o cDNA de v rus Influenza ou Influenza n o foi detectado no produto da transcri o
8. o a unidade de medida requisitada e a efici ncia da extra o expressa em d cimos e Ve o volume total do produto da extra o expresso em pL e Va o volume do produto da extra o usado na rea o de amplifica o expresso em UL e Quantity o resultado da rea o de amplifica o da amostra expresso em gEq por rea o e Vc o volume da amostra utilizada na extra o por exemplo com EXTRAgen o par metro do Vc de 0 3 mL e a efici ncia da extra o por exemplo com EXTRAgen o par metro Ee 0 8 efici ncia m nima de 80 e Ve o volume total da extra o do produto por exemplo com EXTRAgen o par metro do Ve de 15 pL e Vt o volume da extra o do produto utilizado na transcri o reversa da rea o por exemplo o RT Kit Plus o par metro 10 pL e Et a efici ncia da rea o de transcri o reversa por exemplo com o RT Kit Plus o par metro 0 5 efici ncia de 50 e Vp o volume total da rea o de transcri o reversa por exemplo com o RT Kit Plus o par metro 25 e Va o volume do produto de rea o de transcri o reversa utilizado na rea o de amplifica o o par metro Va para este produto de 5 Quando o kit de extra o EXTRAgen e o RT Kit Plus utilizado o limite de detec o Produto Limite de detec o EXTRAgen RT Kit plus 625 gEq mL LIMITA ES DO PRO
9. pias de DNA plasm dico MS2 ap ap FP PRE SS TE E Rev 04 Out 2013 Sensibilidade diagn stica efici ncia de detec o e quantifica o nos diferentes subtipos A sensibilidade diagn stica do teste que a efici ncia de detec o e quantifica o nos diversos subtipos est avaliada por compara o de sequ ncia com banco de dados de nucleot deos O teste de alinhamento das regi es selecionadas para a hibridiza o do primer de oligonucleotideos AmpliMIX Infl A e da sonda fluorescente AmpliPROBE com as sequ ncia dispon veis no banco de dados da regi o do gene matriz do virus Influenza A subtipos H1N1 H1N2 H2N2 H3N2 H5N1 H7N7 H9N2 demonstrou preserva o e aus ncia de muta es significativas O teste de alinhamento das regi es selecionadas para a hibridiza o do primer de oligonucleot deos AmpliMIX Infl B e da sonda fluorescente AmpliPROBE com as sequ ncia dispon veis no banco de dados da regi o do gene matriz do virus Influenza B cepas Victoria e Yamagata demonstrou preserva o e aus ncia de muta es significativas A sensibilidade diagn stica do ensaio que a efici ncia da detec o e quantifica o de diferentes subtipos foi avaliada pela an lise de algumas amostras que eram positivas para RNA do virus Influenza 7 do tipo H1N1 7 do subtipo H3N2 ou do v rus da Influenza B das cepas Victoria e Yamagata A sensibilidade diagn stica do e
10. 9 Transferir depositando cuidadosamente no fundo dos po os de Controle Positivo 5 de gua ultrapura 10 Transferir depositando os cuidadosamente no fundo de seu respectivo po o 5 Controle Positivo Inf A e 5 uL Controle Positivo Inf B conforme posi o definida na planilha elaborada 11 Selar a Microplaca de amplifica o com a L mina adesiva de amplifica o 12 Transferir a placa de amplifica o para o termociclador de tempo real que deve estar em rea espec fica de amplifica o detec o e inicie o ciclo de amplifica o As informa es sobre procedimentos adicionais relevantes para executar a medi o e o tempo na qual ela pode ser realizada N o h outros procedimentos al m dos acima mencionados CALIBRA O DO PROCESSO N o o caso pois n o existe procedimento de calibra o para a metodologia em quest o C LCULOS E OBTEN O DOS RESULTADOS An lise qualitativa dos resultados Os valores de fluoresc ncia emitidos pela sonda espec fica para o v rus Influenza A FAM Infl A detector pela sonda especifica para o virus Influenza FAM Infl detector e pela sonda especifica do controle interno VIC IC detector nas rea es de amplifica o devem ser analisadas pelo software do instrumento Antes da an lise consultar a documenta o do instrumento e Ajustar manualmente o intervalo de c lculo do n vel de fundo de fluoresc ncia Baseline do cicl
11. Cr AmpliTaq Gold DNA Polymerase Non Target Template Target Template A partir do momento que a sonda for ligada parte espec fica do gabarito de DNA depois da desnatura o alta temperatura e resfriamento da rea o os primers se anelam ao DNA A TagPolimerase ent o adiciona nucleot deos e remove a sonda TaqMan do DNA gabarito Isso separa o quencher do rep rter e permite ao rep rter emitir sua energia Isso ent o quantificado usando um computador Quanto mais ocorrer a desnatura o e anelamento mais oportunidades a TaqMan tera de se ligar e em contra partida mais luz emitida ser detectada O corante do rep rter liberado 4 gt 1 da dupla fita de DNA criada pela Taq 4 iniciados Polimerase Longe do corante P Tr from TaqMan quencher a luz emitida do corante a reporter em estado excitado pode 3 agora ser observada A padroniza o do sistema foi realizado nos instrumentos da Applied Biosystems ABI PRISM s rie 7000 complementary strand template DNA 5 pE E as Rev 04 Out 2013 COMPONENTES FORNECIDOS Componente Descri o Quantidade Composi o A Mistura de primers de Oligonucleotideos PCR Alert E AmpliMIX oligonucleotideos 2x 110 uL TRIS base e cloridrato RTSO74 M tampa VERMELHA Glicerol Triton X 100 Bee Mistura de primers de Oligonucleotideos PCR Alert i AmpliM
12. negativas para RNA de Influenza A ou Influenza e foi maior que 95 para os virus Influenza A e Influenza B A especificidade diagn stica foi avaliada usando como material de refer ncia 23 amostras de swabs far ngeos que eram negativas para RNA de Influenza A e Influenza B atrav s de um ensaio de amplifica o em tempo real Cada amostra foi usada para realizar todo o procedimento de an lise extra o transcri o reversa e amplifica o com produtos da Nanogen Advanced Diagnostics S P A Os resultados finais est o resumidos na tabela que segue abaixo Rea o Amostras N Positivas Negativas Infl A Swabs faringeos positivos para o virus da 23 0 20 Influenza A Infl B Swabs faringeos positivos para o virus da 23 0 20 Influenza OMETRIX DIAGNOSTICA Tr s amostras negativas foram invalidas e tamb m inibidas mesmo ap s extra o de uma segunda al quota e mesmo com outros ensaios de amplifica o de cidos nucleicos Especificidade anal tica marcadores interferentes em potencial A especificidade anal tica do teste que a rea o cruzada com outros marcadores interferentes em potencial foi avaliada pela compara o das sequencias com nucleot deos do banco de dados O teste de alinhamento das regi es selecionadas para a hibridiza o do primer de oligonucleot deos Infl A AmpliMIX e da sonda fluorescente Infl A AmpliPROBE com as sequ ncias disponibilizadas no banco de
13. reversa obtida do RNA extra do da amostra mas a amostra pode conter cDNA de v rus Influenza ou Influenza B a uma titula o inferior ao limite de detec o do produto veja cap tulo Caracter sticas de Desempenho neste caso o resultado ser um falso negativo Como para qualquer outro dispositivo diagn stico os resultados obtidos com este produto devem ser interpretados considerando todos os dados cl nicos e os outros exames de laborat rio relativos ao paciente Como para qualquer outro dispositivo diagn stico existe um risco latente de obter resultados n o v lidos falsos positivos e falsos negativos com este produto Este risco residual n o pode ser eliminado ou reduzido Em situa es particulares EEE PP PP PP PES E SE Rev 04 Out 2013 como diagn sticos de urg ncia o risco residual pode contribuir a decis es incorretas com consequ ncias graves para o paciente CONTROLE INTERNO DE QUALIDADE Controles de Amplifica o absolutamente necess rio confirmar cada sess o de amplifica o com rea o de Controle Positivo e uma rea o de Controle Positivo Para o Controle Positivo utilize gua bidestilada est ril n o fornecida com o produto adicionada rea o no lugar do DNA extra do da amostra Para o Controle Positivo utilize o produto Influenza A B Positive Control Controles de Qualidade recomendado validar todo o procedimento de an lise para cada sess o de extra o e amplific
14. trabalho Advert ncias e precau es espec ficas para os componentes Os tubos de teste contendo AmpliPROBE s o descart veis e sendo assim devem ser usados apenas uma vez na prepara o da mistura de rea o A AmpliPROBE possui os seguintes avisos de seguran a S S 23 25 N o aspirar g s fuma a vapor aerossol Evitar o contato com os olhos CUIDADOS COM A AMOSTRA BIOL GICA Este produto deve ser usado com cDNA obtido do RNA extra do das seguintes amostras biol gicas swabs nasais swabs far ngeos gargarejo ou de sobrenadante de SS fPIPI PR SFT E EOOCSSOSRSZRRERIRMIAIIAUAITITIUTUIDDDIRDRDZERERID FJQPQ lt SSTRTZUDITRPRPPA AAHDASA O OM RRRO P S E L Rev 04 Out 2013 culturas celulares Os swabs faringeos e nasais destinados extra o de RNA devem ser preparados segundo a indica o do laborat rio dilu das em meio de transporte para culturas celulares ou solu o fisiol gica est ril ou PBS est ril transportadas a 2 8 C e conservadas a 2 8 C por um m ximo de quatro horas em caso contrario devem ser congeladas e conservadas a 20 C por um m ximo de trinta dias ou ainda a 70 C por per odos mais longos As amostras de gargarejo destinadas a extra o de RNA devem ser preparadas segundo as indica es do laborat rio em solu o fisiol gica est ril transportado a 2 8 C e conservadas a 2 8 C por um m ximo de quatro horas em caso contrario devem ser congeladas e con
15. 5 para o v rus da Influenza A e FSH SF TS PPSM PF TRY PP TT MPS EE T TT T F R OORD gt PE DBR O PSSSAOOAAOAO IIPIR RPRAAPDARADD Z ZFPPMCCRDRDADRIRIIRTRXTRRTRM R RPRPBOAB e L Rev 04 Out 2013 igual a 95 6 para o v rus da Influenza B A sensibilidade diagn stica foi avaliada utilizando como material de refer ncia 20 swabs faringeos positivos para RNA do virus Influenza e 24 swabs far ngeos positivos para RNA do v rus Influenza B testados usando um ensaio de amplifica o em tempo real Cada amostra foi empregada para realizar a todos os procedimentos de an lise extra o transcri o reversa e amplifica o com produtos Nanogen Advanced Diagnostics S P A Os resultados s o mostrados na tabela a seguir Rea o Amostras N Positivas Negativas Infl A Swabs faringeos positivos para o virus da 20 20 0 Influenza Infl B Swabs faringeos positivos para o virus da 24 22 1 Influenza Uma amostra que foi positiva o v rus Influenza foi invalida e tamb m inibida por outros ensaios de amplifica o de cidos nucleicos A amostra que foi negativa para o v rus da Influenza B pode ser explicado por perda na titula o durante armazenamento Sensibilidade diagn stica amostras negativas A especificidade diagn stica do ensaio confirmado as amostras cl nicas negativas foi avaliada pela an lise algumas amostras cl nicas que eram
16. ARMAZENAMENTO Refer ncia Componente odeio Quantidade Estocagem Infl A Q PCR Alert AmpliMIX RTSO74 M 4x 110 uL 20 C Infl B Q PCR Alert AmpliPROBE RTSO074 P 4x 110 uL 20 C Q PCR Alert AmpliMASTER 4x 340 uL 2 8 C Microplaca para amplifica o RTS000 3 Ambiente ore it Temp L mina adesiva para amplifica o 3 Ambiente PRECAU ES Este kit reservado para uso exclusivo em diagn stico in vitro Manuseio ao manusear o kit e as amostras utilizar EPI adequado ao tipo de laborat rio onde os testes ser o realizados devido natureza da amostra material biol gico humano Tratar como potencialmente infeccioso por ser amostra de origem humana N o beber ou comer na rea de trabalho A rea de trabalho deve ser um ambiente limpo e com ventila o adequada Trabalhar dentro de capela de exaust o fluxo laminar N o manusear o kit sem luvas Advert ncias e precau es gerais Manipular e eliminar todas as amostras biol gicas reagentes e materiais usados como se fossem agentes infecciosos Evitar o contato direto com as amostras biol gicas Evitar a forma o de aerossol durante o procedimento evitar respingar material ao redor da rea de trabalho ou fora dela O material que est em contato com as amostras biol gicas deve ser tratado com Hipoclorito de s dio a 3 pelo menos por 30 minutos ou ainda tratado em autoclave a 121 C durante uma hora a
17. CESSO Use somente cDNA produzido pela transcri o reversa do RNA extra do das seguintes amostras humanas swabs nasais swabs far ngeos gargarejo ou sobrenadante de cultivo celular __________ TE EEE ESS SSS Rev 04 Out 2013 N o utilizar com este produto o cDNA obtido pela transcri o reversa de RNA extra do de amostras contaminadas por mucoproteinas mucoproteinas inibem a rea o de amplifica o de cidos nucleicos e pode causar resultados inv lidos N o est o dispon veis dados pertinentes a eventuais fen menos de inibi o por parte dos medicamentos antibi ticos antivirais quimioterapicos ou imunossupressores Os resultados obtidos com este produto dependem da correta coleta transporte armazenamento e prepara o das amostras para evitar resultados incorretos necess rio portanto ter particular aten o durante estas fases e seguir atentamente as instru es fornecidas com os produtos para a extra o dos cidos nucleicos Devido sua alta sensibilidade anal tica o m todo de amplifica o em tempo real dos cidos nucleicos utilizados neste produto est sujeito contamina o por amostras cl nicas positivas para virus Influenza A e Influenza controles positivos e at mesmo produtos da rea o de amplifica o As contamina es levam a resultados falsos positivos O produto foi desenvolvido de forma a limitar as contamina es mesmo assim estes fen
18. IX oligonucleotideos 2x 110 pL TRIS base e cloridrato RTSO74 M tampa AMARELA Glicerol Triton X 100 Influenza Q See Oligonucleot deos PCR Alert fluorescentes TRIS base marcadas FAM 2 110 uL AmpliPROBE com VIC tampa e cloridrato Glicerol RTSO74 P VERMELHA Triton X 100 Influenza B Q e Oligonucleot deos PCR Alert fluorescentes TRIS base marcadas FAM 2x 110 uL AmpliPROBE com VIC tampa e cloridrato Glicerol RTSO74 P AMARELA Triton X 100 TRIS base e cloridrato Glicerol MgCl Pescas Desoriboxinucleotideos poe ie 4x 340 pL trifosfatos ROX Uracil Q PCR Alert N glicosilase AmpliMASTER Taq DNA polimerase hot RTSOOO start Microplaca com oe 96 pocinhos de 0 2 mL i Plastico Pp Lampa adesa 3 Pl stico e cola vedante MATERIAIS NECESS RIOS E N O FORNECIDOS Equipamentos Capela de fluxo laminar Agitador tipo V rtex Microcentr fuga de mesa 12 000 14 000 RPM Micropipetas simples volume vari vel Real Time ABI PRISM 7000 completo com microcomputador Material de Consumo EPI Ponteiras com filtro gua ultrapura Tubos de microcentrifuga o 1 5 mL a 2 0 mL POMETRIX DIAGN STICA OMETRIX DIAGNOSTICA Rev 04 Out 2013 Amostras DNA extra do por metodologia definida pelo usu rio seguindo as normas e padr es de amostras exigidos na descri o abaixo CONDI ES DE
19. PSBSTZSSREUIUDI DRUSFPP PSSSD DJPT B PBEB U E ee Rev 04 Out 2013 ADVERT NCIAS E PRECAU ES Este produto exclusivamente para uso in vitro Advert ncias e precau es gerais Manusear e descartar todas as amostras biol gicas como potencialmente infecciosas Evitar o contato direto com amostras biol gicas Evitar respingos Os materiais que entram em contato com amostras biol gicas devem ser tratados com hipoclorito de s dio 3 por no m nimo 30 minutos ou autoclavados a 121 C por uma hora antes de serem descartados Manusear e descartar todos os reagentes e materiais como potencialmente infecciosos Evitar contato direto com reagentes Evitar respingos Os res duos devem ser tratados e descartados de acordo com normas de seguran a Res duos l quidos contendo cidos ou bases devem ser neutralizados antes do descarte Usar jaleco luvas e culos de prote o Nunca pipetar solu es com a boca N o comer beber fumar ou aplicar cosm ticos dentro da rea de trabalho Lavar as m os cuidadosamente ap s manusear amostras e reagentes Descartar as sobras de reagentes e res duos de acordo com as normas de seguran a Ler as instru es de uso antes de utilizar o produto Seguir as instru es N o usar produtos ap s o prazo de validade estabelecido Somente usar os reagentes fornecidos no kit e aqueles recomendados pelo fabricante N o misturar reagentes de diferentes lotes N o utili
20. Parainfluenza 2 2 para o virus da Parainfluenza 3 1 para o virus Parotitis e 1 para Adenovirus Cada amostra foi usada para realizar o procedimento completo para an lise extra o transcri o reversa e amplifica o com produtos Nanogen Advanced Diagnostics S P A Os resultados sao referidos na tabela seguinte Rea o Amostras N Positivas Negativas Swabs far ngeos negativos para Infl A v rus da Influenza A e positivos para 30 0 28 outros pat genos Duas amostras negativas foram inv lidas e tamb m foram inibidas com outros ensaios de amplifica o de cidos nucleicos A especificidade anal tica do ensaio foi determinada utilizando como material de refer ncia 32 amostras de swabs faringeos negativos para RNA de v rus Influenza B mas positivos para cidos nucleicos de outros pat genos incluindo 13 para v rus Influenza A 13 para RSV 1 para v rus Parainfluenza 1 1 para v rus da Parainfluenza 2 2 para v rus Parainfluenza 3 1 para v rus Parotitis e 1 para Adenovirus Cada amostra foi usada para realizar o procedimento completo para an lise extra o transcri o reversa e amplifica o com produtos Nanogen Advanced Diagnostics S P A Os resultados s o referidos na tabela seguinte Rea o Amostras N Positivas Negativas Swabs far ngeos negativos para o Infl B virus da Influenza e positivos para 32 0 31 outros pat genos Uma amostra negativa foi inval
21. a o pelo processamento de uma amostra negativa e uma positiva que j foram testadas ou atrav s de material de calibra o de refer ncia VALORES DE REFER NCIA OBTIDOS EM POPULA ES SADIAS OU VALORES DEMOGR FICOS EPIDEMIOL GICOS ESTAT STICOS DESEJ VEIS TERAP UTICOS OU T XICOS N o existe este tipo de dado para a metodologia em quest o CARACTER STICAS DE DESEMPENHO Sensibilidade Anal tica limite de detec o A sensibilidade anal tica deste teste permite identificar a presen a de aproximadamente 10 mol culas de DNA alvo nos 5 uL de DNA extra do e acrescentado rea o de amplifica o Em termos de limite de detec o a sensibilidade anal tica do ensaio foi testada usando um DNA plasm dico contendo o produto de amplifica o de Influenza A Influenza B e do fago MS2 cuja concentra o inicial foi medida atrav s de espectrofot metro O DNA plasmidico de Influenza A e Influenza foram dilu dos a uma titula o de 10 c pias 5 em DNA contendo o produto de amplifica o do fago MS2 um t tulo de 50 000 c pias 5 Esta amostra foi usada em 50 repeti es para realizar a amplifica o com produtos Nanogen Advanced Diagnostics S P A Os resultados finais sao resumidos na tabela seguinte Rea o Amostras N Positivos Negativos 10 c pias DNA plasm dico Influenza A dida 50 000 c pias de DNA plasm dico MS2 ag a9 10 c pias DNA plasm dico Influenza id 50 000 c
22. a do da amostra mas n o poss vel descartar que a sua presen a em titula o inferior ao limite de detec o do produto veja dados em Caracter sticas de Desempenho Neste caso o resultado ser um falso negativo Os resultados obtidos com este teste devem ser interpretados considerando todos os dados cl nicos e os outros testes de laborat rio relativos ao paciente Obs Quando cDNA do v rus da Influenza A ou B detectado na rea o de amplifica o da amostra a amplifica o do Controle Interno pode resultar em cT gt 35 ou indeterminado De fato a baixa efici ncia da rea o de amplifica o do Controle SIOMETRIX DIAGNOSTICA DS rfrf fT tfT PRPR E isEss SSSSSSSSSSSSSUUDUDDDSUDSMDDMDMDOUPU RI fh DR DRgRARARIRI RTZ I I ZDIDID TD CP lt P gt E Z ZP DJP ODPTRPTPT PZDPDPrEA A2PAD U RAR ArRfTARFPSSE ECECEPR AR lt lt ODDTDRIRDIRPAI RR EOEBOABB e L Rev 04 Out 2013 Interno pode ser ocasionada pela alta efici ncia da rea o de amplifica o do cDNA do v rus da Influenza ou Neste caso a amostra adequada e o resultado positivo do teste v lido C lculo do Limite de Detec o Quando um m todo particular de extra o usado o limite de detec o deve ser calculado de acordo com a seguinte f rmula Ve x Vp x 10 gEq Limite de detec o gEq ml Vc x Vt x Va x Ee x Et e Vc a quantidade de amostra usada na extra o em rela
23. a amostra s o utilizados para detectar a presen a do DNA alvo enquanto os valores cT das sondas espec ficas para o controle interno s o usados para validar a extra o transcri o reversa amplifica o e detec o Verificar no software do instrumento que o cT foi determinado por um r pido e regular crescimento dos valores de fluoresc ncia e n o por picos ou incremento de sinal background Este produto est apto a detectar uma quantidade m nima de 10 c pias de cDNA de v rus Influenza A e 10 c pias de cDNA de v rus Influenza B por rea o de amplifica o correspondentes a 10 c pias de Equivalentes de genomas por rea o Verificar dados sobre Caracter sticas de Desempenho Os valores de cT para cada amostra s o interpretados a fim de detectar os EE RD U P BUDUD TRY ER RT ES amp SSSSSS MMMM LIJHIHHFFFFFV N V T T N NNSSSDODOD D HMDRDMMDDHHI reeeeBrBZHRRRCDRRRIZTUD UDLDZ A TSD IOO PPDOOEOGLPJPRSDPSPSPRPS EEE EEB Rev 04 Out 2013 virus Influenza e Influenza como mostrado na tabela seguinte a 664 _ od i Adequa o da Resultado do cDNA de ya a o Controle amostra teste Influenza A FAM interno VIC a oa inadequado inv lido Indeterminado cT Indeterminado lt 35 adequado venda ias E negativo DETECTADO ai adequado PRESENTE Indeterminado positivo cT Determinado
24. a inibi o causada por drogas antivirais antibi ticos quimioter picos ou imunossupressores PROCESSO DE MEDI O O Influenza A B Q PCR AlertPROBE deve ser usado com os produtos Q PCR Alert AmpliMASTER e Influenza Q PCR Alert AmpliMIX para obter a mistura de rea o A AmpliPROBE est pronta para uso sendo assim deve ser adicionada diretamente mistura de rea o O procedimento completo envolve prepara o e execu o de amplifica o em tempo real em dois po os diferentes de uma microplaca com um termociclador em tempo real e descrito em detalhe no manual de instru es com o Influenza A B Q Rev 04 Out 2013 PCR Alert AmpliMIX As caracter sticas de desempenho e limita es do procedimento do ensaio completo para detec o e dosagem de cDNA dos virus de Influenza A e Influenza B s o descritos em detalhes no manual de instru es com o Influenza A B Q PCR Alert AmpliMIX As t cnicas de utiliza o dos reagentes e dos demais componentes do produto descrevendo os volumes utilizados os tempos requeridos em cada etapa ou fase as condi es ambientais bem como os ajustes dos instrumentos de medi o do produto da t cnica ou da rea o Preparo da etapa de amplifica o real time Realizado na rea de amplifica o detec o dos produtos da amplifica o Antes de iniciar a sess o necess rio Consultando o manual do equipamento ligar o termociclador para tempo real
25. aes Ferreira CRQ PR 09302336 Aprova o 24 12 2013 YD OW Mauricio Cichon Laboratorio Assinado por Mauricio Cichon WORKSHEET 12 11 10
26. dados de outros organismos que n o o v rus de Influenza A incluindo o virus Influenza B o v rus que mais se assemelha ESP EE TT TT P TDTPPTPFPRRCRYY E EFE MMMMMMJJJMJYJSMMSRMRMRSDSDMDMRMRMS JJJ D DMDMMDHRITRRIHRIHIIRTRPRIRIID II I gt P RD D ADSSGSGDRSGRDIOOOOPPIIIRP OP P rFr P PTHSSS PITTD RABEABB FF SEE Rev 04 Out 2013 com o virus Influenza A mostraram sua especificidade e a falta de homologia significativa O teste de alinhamento das regi es selecionadas para a hibridiza o do primer de oligonucleotideos Infl AmpliMIX e da sonda fluorescente Infl AmpliPROBE com as sequ ncia disponibilizadas no banco de dados de outros organismos que n o o v rus de Influenza incluindo o virus Influenza A o virus que mais se assemelha com o v rus Influenza B mostrou sua especificidade e a falta de homologia significativa A especificidade anal tica do ensaio que sua reatividade cruzada com outros marcadores interferentes potenciais foi avaliada usando amostras cl nicas positivas para cidos nucleicos de outros pat genos A especificidade anal tica do ensaio foi determinada utilizando como material de refer ncia 30 amostras de swabs faringeos negativos para RNA de virus Influenza A mas positivos para cidos nucleicos de outros pat genos incluindo 11 para o v rus da Influenza 13 para RSV 1 para o virus da Parainfluenza1 1 para o virus da
27. iagnostics S P A DESCRI O DO PRODUTO O kit fornece os componentes Influenza Controle Positivo Uma solu o estabilizada de plasm deos contendo a sequ ncia requerida dividida em dois tubos de al quotas prontas para uso Cada tubo de teste cont m 65 de solu o suficiente 12 sess es Os plasm deos cont m uma regi o amplificada do gene matriz da Influenza A A detec o do DNA alvo durante a rea o de amplifica o confirma a habilidade de identificar a presen a do cDNA do virus Influenza A Influenza B Controle Positivo Uma solu o estabilizada de plasm deos contendo a sequ ncia requerida dividida em dois tubos de al quotas prontas para uso Cada tubo de teste cont m 65 de solu o suficiente para 12 sess es Os plasm deos cont m uma regi o amplificada do gene matriz da Influenza B A detec o do DNA alvo durante a rea o de amplifica o confirma a habilidade de identificar a presen a do cDNA do virus Influenza B O kit possibilita a execu o de 12 rea es para Influenza e 12 rea es para Influenza usando 5 uL por rea o MATERIAIS FORNECIDOS Rev 04 Out 2013 Componente Descri o Quantidade Composi o Influenza A Solu o de Plasm deo TRIS base Controle plasmideo 1 x 65pyL TRIS cloridrato EDTA Positivo RNA total de levedura Influenza B Solu o de Plasmideo TRIS base Controle plasm deo 1 x65 pL TRIS cloridrato EDTA Posit
28. ica que o DNA alvo n o foi detectado corretamente Um problema ocorreu durante a fase de amplifica o ou detec o volume das misturas de rea o incorreto degrada o da sonda degrada o do Controle Positivo dispensa o incorreta do Controle Positivo configura o incorreta da posi o do Controle Positivo configura o incorreta do ciclo t rmico o que pode ter levado a resultados falsos negativos A sess o inv lida e deve ser repetida da fase de amplifica o Os valores cT de uma sonda espec fica para Influenza A e Influenza B na rea o de amplifica o com controles negativos s o usados para validar a amplifica o e detec o como mostrado nas tabelas seguintes Rea o Controle Positivo Infl A ange Infl FAM Resultado do teste Amplifica o Detec o cT Indeterminado NEGATIVO CORRETO Rea o Controle Positivo Infl B T z Infl B FAM Resultado do teste Amplifica o Detec o cT Indeterminado NEGATIVO CORRETO Se o resultado da rea o de amplifica o do Controle negativo diferente de indeterminado isso significa que o DNA alvo foi detectado Problemas ocorreram durante a fase de amplifica o contamina o os quais podem ter levado a resultados falsos positivos A sess o inv lida e deve ser repetida a partir da fase de amplifica o Os valores cT das sondas espec ficas para os v rus de Influenza A e Influenza B nas rea es de amplifica o de cad
29. ida e tamb m inibida por outros ensaios de amplifica o de cidos nucleicos REFER NCIAS BIBLIOGR FICAS ZHANG W EVANS D H 1991 J Virol Methods 33 165 189 EEE e FS PS PP EP EGP EM SE SH Rev 04 Out 2013 IDENTIFICA O DO DISTRIBUIDOR Biometrix Diagn stica Ltda Estrada da Graciosa 1081 Curitiba PR CEP 82840 360 Tel 41 2108 5250 Fax 41 2108 5252 DDG 0800 7260504 E mail biometrix biometrix com br Website www biometrix com br CNPJ 06 145 976 0001 39 INFORMA ES DO FABRICANTE Nanogen Advanced Diagnostics S P A C so Torino 89 d 10090 Buttigliera Alta TO Italia REGISTRO ANVISA 80298490092 RESPONSAVEL TECNICA Edna Cristina Kurokawa Guimaraes Ferreira CRQ PR 09302336 Aprova o 24 12 2013 x Mauricio Cichon Laborat rio Assinado por Maur cio Cichon ED PMJMXKMRMMSMD SS Rev 04 Out 2013 CTRO74 Influenza A B Controle Positivo Instru es de Uso USO PRETENDIDO O produto Influenza A B Controle Positivo destinado ao uso como um controle positivo em ensaios qualitativos de amplifica o de cidos nucleicos para a detec o do cDNA do V rus da Influenza A Influenza A e do cDNA do V rus da Influenza Influenza com os produtos PCR Alert Influenza PCR Alert AmpliMIX e Influenza PCR Alert AmpliPROBE da Nanogen Advanced D
30. ivo RNA total de levedura e Armazenar a 20 C ou inferior MATERIAIS NECESSARIOS E NAO FORNECIDOS Fluxo laminar Luvas descartaveis sem talco Microcentrifuga de bancada 12 000 14 000 RPM Micropipetas est reis e ponteiras com filtro ou deslocamento positivo 0 5 10 uL 2 20 uL 5 50 pL 50 200 pL Agua bidestilada est ril Real Time ABI PRISM 7000 completo com computador ACESSORIOS Os reagentes para a extracao de RNA das amostras a serem analisadas e os reagentes otimizados para amplifica o e detec o do DNA n o est o inclusos neste produto Para realizar estes passos anal ticos os produtos a seguir s o recomendados e EXTRAgen EXTGO1 kit para extra o de cidos nucleicos de amostras n o celulares total de 50 extra es e CPE RNA Controle Interno CTRRNA 2 controle positivo de extra o para RNA gen mico de amostras n o celulares total de 50 extra es e PCR Alert AmpliMASTER RTS000 combina o de reagentes otimizados microplacas e adesivos para PCR em tempo real e determina o al lica total de 96 rea es e Influenza PCR Alert AmpliMIX gt RTSO74 M primers oligonucleot deos para PCR em tempo real total de 48 rea es e Influenza PCR Alert AmpliPROBE RTS074 P sondas fluorescentes para PCR em tempo real total de 48 rea es S BB BEBES e IEEE EEB E ERP
31. ligar o computador de controle iniciar o software e abrir a sess o quantifica o absoluta Consultando o manual do equipamento configurar o detector para a sonda o virus da Influenza A com o rep rter como FAM e o quencher como nenhum NFQ Quencher n o fluorescente e cham lo de Inf A Configurar o detector para a sonda para o v rus da Influenza B com o rep rter como FAM e o quencher como nenhum NFQ Quencher fluorescente e cham lo de Inf B Configurar o detector para a sonda a ser usada no controle interno com o rep rter como VIC e o quencher como nenhum NFQ Quencher n o fluorescente Para cada po o usado na microplaca configurar os detectores tipo de fluoresc ncia a serem medidas a refer ncia passiva como ROX normaliza o da fluoresc ncia medida e o tipo da rea o amostra Controle Positivo de amplifica o Controle Positivo de amplifica o padr o de quantidade conhecida Adicionar estas informa es planilha adicionada no fim deste manual de instru es ou imprimir a disposi o da microplaca A planilha deve ser seguida cuidadosamente durante a transfer ncia da rea o de mistura e amostras nos po os Ilustra se a seguir a t tulo de exemplo como pode ser organizada a an lise de 14 amostras Rev 04 Out 2013 D eee Co
32. m a mistura de rea o obtida com os produtos Q PCR Alert AmpliMASTER Influenza PCR Alert AmpliMIX gt Influenza Q PCR Alert AmpliPROBE gt O Controle Positivo Influenza A e o Controle Positivo Influenza B estao prontos para o uso portanto devem ser usados adicionando 5 diretamente na mistura de rea o O procedimento completo envolve prepara o e execu o de rea o de amplifica o com termociclador com sistema ptico de detec o de fluoresc ncia descrito em detalhes nas instru es de uso do produto Influenza A B Q PCR Alert AmpliMIX bem como informa es sobre as caracter sticas de desempenho e limita es do procedimento NOTA Os Controles Positivos podem ser congelados e descongelados por no m ximo 12 vezes REFER NCIAS BIBLIOGR FICAS ZHANG W EVANS D H 1991 J Virol Methods 33 165 189 EDS g L S EPE ESSE SS Rev 04 Out 2013 IDENTIFICA O DO DISTRIBUIDOR Biometrix Diagn stica Ltda Estrada da Graciosa 1081 Curitiba PR CEP 82840 360 Tel 41 2108 5250 Fax 41 2108 5252 DDG 0800 7260504 E mail biometrix biometrix com br Website www biometrix com br CNPJ 06 145 976 0001 39 INFORMA ES DO FABRICANTE Nanogen Advanced Diagnostics S P A C so Torino 89 d 10090 Buttigliera Alta TO Italia REGISTRO ANVISA 80298490093 RESPONSAVEL TECNICA Edna Cristina Kurokawa Guimar
33. na mistura Misturar em Vortex em baixa velocidade por 5 segundos evitando forma o de espuma Centrifugar os tubos por 5 segundos pulso para que todo l quido v para o fundo Repita o procedimento do 1 ao 4 adicionando o reagente AmpliMIX Infl tampa amarela e o reagente AmpliPROBE Infl B tampa amarela ao tubo de AmpliMASTER rotulado com Infl Transferir 20 pL da mistura de rea o Infl A obtida para o fundo de cada po o Inf A na placa de amplifica o conforme estabelecido na planilha lembre se que deve haver um po o para o Controle Positivo e um para Controle Positivo Transferir 20 uL da mistura de rea o Infl obtida para o fundo de cada po o Inf na placa de amplifica o conforme estabelecido na planilha lembre se que deve haver um po o para o Controle Positivo e um para Controle Positivo NOTA Caso n o seja utilizada toda a mistura de rea o armazene no escuro a 20 C por no maximo um m s em um tubo rotulado como Infl A ou Infl conforme o caso Congele e descongele a mistura de rea o somente uma vez 8 OMETRIX DIAGNOSTICA Transferir cuidadosamente 5 de cDNA da primeira amostra no poco Infl A e 5 pL de cDNA da primeira amostra no po o inf conforme posi o definida na planilha elaborada Prossiga da mesma forma para as demais amostras de cDNA EP TR SS D E awe E E EEE PV Rev 04 Out 2013
34. nsaio foi avaliada usando o material de refer ncia de amostras de swabs far ngeos positivos para RNA do virus influenza A 7 do subtipo H1N1 e 7 do subtipo H3N2 e amostras de tamp es faringeos positivos para o RNA do v rus Influenza B 17 da cepa Victoria e 7 da cepa Yamagata tipificados com um m todo de amplifica o Cada amostra foi usada para realizar o procedimento completo para an lise extra o transcri o reversa e amplifica o com os produtos Nanogen Advanced Diagnostics S P A Os resultados finais sao resumidos na tabela seguinte Rea o Amostras N Positivas Negativas Swabs far ngeos positivos para o virus da Influenza A H1N1 Swabs faringeos positivos para o virus dida da Influenza A H3N2 13 0 Infl Swabs faringeos positivos para virus 17 16 0 da Influenza B Victoria Inf B Swabs faringeos positivos para o virus 7 6 1 da Influenza Yamagata Uma amostra que era positiva para o v rus da Influenza B foi invalida e tamb m foi inibida por outros ensaios de amplifica o de cidos nucleicos A amostra que foi negativa para Influenza B pode ser explicada por perda na titula o durante armazenamento Sensibilidade diagn stica amostras positivas A sensibilidade diagn stica do teste confirmando amostras cl nicas positivas foi verificada analisando algumas amostras cl nicas que eram positivas para RNA do virus Influenza A ou Influenza e foi maior que 9
35. ntes de ser eliminado O material descart vel se combust vel deve ser incinerado Os res duos l quidos que cont m cidos ou bases devem ser neutralizados antes da elimina o N o pipetar nenhuma solu o com a boca Lavar bem as m os depois de haver manipulado as amostras e os reagentes Eliminar reagentes e res duos conforme as normas vigentes Ler todas as instru es fornecidas no kit antes de realizar o teste Respeitar as instru es fornecidas no kit durante a execu o do teste Respeitar a data de validade do kit Utilizar somente os reagentes presentes no kit e aqueles aconselhados pelo 4 Rev 04 Out 2013 fabricante N o intercambiar reagentes procedentes de diferentes lotes N o utilizar reagentes procedentes de kits de outros fabricantes Advert ncias e precau es para a biologia molecular Os procedimentos de biologia molecular como a extra o a transcri o reversa a amplifica o e a detec o de cidos nucleicos requerem pessoal especializado para evitar o risco de resultados incorretos em particular por causa da degrada o dos cidos nucleicos das amostras ou da contamina o das amostras por parte de produtos de amplifica o necess rio dispor de uma rea separada para a extra o prepara o das rea es de amplifica o e para a amplifica o detec o dos produtos de amplifica o reas de pr e p s PCR Nunca introduzir um produto de amplifica
36. o 6 ao ciclo 15 NOTA No caso de uma amostra positiva com um alto t tulo de v rus Influenza ou Influenza a fluoresc ncia FAM da sonda espec fica para RSV pode come ar a crescer antes do 15 ciclo Neste caso o intervalo de c lculo da baseline deve ser adaptado do ciclo 6 ao ciclo em que a fluoresc ncia FAM come ar a aumentar Configurar manualmente o limiar da fluoresc ncia Threshold para os detectores de Infl A e Infl FAM para 0 2 Configurar manualmente o limiar da fluoresc ncia Threshold VIC para 0 1 Os valores de fluoresc ncia emitidos pelas sondas espec ficas na rea o de amplifica o e o valor Threshold permitem determinar o cT ciclo Threshold o ciclo em que a fluoresc ncia atinge o valor Threshold Os valores cT das sondas espec ficas para os v rus de Influenza A e Influenza B Rev 04 Out 2013 nas rea es de amplifica o Infl A e Infl B com controles positivos s o usados para validar a amplifica o e detec o como mostrado nas tabelas seguintes Rea o Controle Positivo Infl A lt a A Inf A FAM Resultado do teste Amplifica o Detec o lt 25 POSITIVO CORRETO Rea o Controle Positivo Infl B Infl FAM Resultado do teste Amplifica o Detec o lt 25 POSITIVO CORRETO Se resultado da rea o da amplifica o do Controle Positivo for cT gt 25 ou indeterminado isso signif
37. servadas a 20 C por um m ximo de trinta dias ou ainda a 70 C por per odos mais longos As amostras de sobrenadante de cultura celular destinadas para extra o do RNA devem ser conservadas a 2 8 C por um m ximo de quatro horas em caso contrario devem ser congeladas e conservadas a 20 C por um m ximo de trinta dias ou ainda a 70 C por per odos mais longos Recomenda se subdividir em mais al quotas as amostras para conservar congeladas de modo a n o submet las a ciclos de congelamento descongelamento repetidos Instru es para pr tratamento das amostras cl nicas se aplic veis e para a extra o de DNA est o no manual de instru o do EXTRAgen Cuidados de armazenamento e transporte visando estabilidade da amostra As amostras de swabs nasais swabs far ngeos gargarejo ou sobrenadante de culturas celulares que ser o usadas para extra o de DNA devem ser colhidas de acordo com as dire es do laborat rio em solu o fisiol gica est ril transportadas a 2 8 C e armazenadas a 2 8 por no m ximo tr s dias As precau es com o manuseio e descarte da amostra A amostra deve ser tratada como potencialmente infecciosa Os fatores interferentes que contraindiquem o uso da amostra O cDNA deve ser obtido a partir do RNA que n o contenha mucoproteinas para evitar fen menos de inibi o e a possibilidade de frequentes resultados n o v lidos N o h dados dispon veis pertinentes
38. v lido lt 35 adequado a PRESENTE positivo R 3 A 4 f ca a mostram Adequa o da Resultado do cDNA de V rus Influenza B l Controle amostra teste influenza B FAM interno VIC cT gt 35 ou a inadequado inv lido Indeterminado cT Indeterminado lt 35 adequado sro o negativo DETECTADO el 39 o adequado vando PRESENTE Indeterminado positivo cT Determinado v lido lt 35 adequado metas PRESENTE positivo Se o resultado da rea o de amplifica o de uma amostra cT indeterminado para o cDNA de dos v rus de Influenza A ou Influenza B e cT gt 35 ou indeterminado para o cDNA do controle interno isso significa que n o foi poss vel detectar suficientemente o cDNA do controle interno Neste caso problemas ocorreram na fase de amplifica o amplifica o insuficiente ou nula ou na fase de transcri o reversa inv lida ou ineficiente ou na fase de extra o perda de DNA presen a de inibidores degrada o da amostra de DNA o que podem ter levado a resultados falsos negativos A amostra n o adequada o teste inv lido e deve ser repetido a partir da extra o de uma nova amostra Se o resultado da rea o de amplifica o de uma amostra cT Indeterminado para o cDNA de virus Influenza A ou Influenza B e cT lt 35 para o cDNA do controle interno isso significa que o cDNA do v rus Influenza A ou Influenza B n o foi detectado no cDNA extr
39. zar reagentes de outros fabricantes Advert ncias e precau es de biologia molecular Os procedimentos de biologia molecular como a extra o a transcri o reversa a amplifica o e a detec o de cidos nucleicos requerem pessoal especializado para prevenir o risco de resultados incorretos em particular devido degrada o dos cidos nucleicos das amostras ou devido contamina o das amostras por produtos de amplifica o necess rio dispor de uma rea separada para a extra o prepara o das rea es de amplifica o e para a amplifica o detec o dos produtos de amplifica o reas de pr e p s PCR Nunca introduzir um produto de amplifica o na rea de extra o prepara o das rea es de amplifica o necess rio uso de EPI adequado a cada uma das reas de trabalho em laborat rio de biologia molecular Nunca transferir materiais da rea de amplifica o detec o para a rea de extra o prepara o de rea es As amostras devem ser empregadas exclusivamente a este tipo de an lise As amostras devem ser manipuladas em uma c mara de fluxo laminar Os tubos que cont m amostras diferentes nunca devem ser abertos ao mesmo tempo As pipetas utilizadas para manipular as amostras devem ser destinadas exclusivamente a este uso As pipetas devem ser do tipo deslocamento positivo ou usar ponteiras com barreira filtro As ponteiras utilizadas devem ser est reis sem a presen a de DNAse
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