HIV BLOT 2.2
Contents
1. SI Diagnostics HIV BLOT 2 2 TESTE WESTERN BLOT Ce 0123 DATA DE REVIS O 05 05 Observa o altera es MAE 0011 BRA 0 realgadas kit de 18 testes 11030 018 kit de 36 testes 11030 036 NOME E APLICA O O MP Diagnostics MPD HIV BLOT 2 2 um imunoensaio qualitativo para a detec o in vitro de anticorpos contra o v rus da imunodefici ncia humana tipo 1 HIV 1 e tipo 2 HIV 2 no soro e plasma humanos Destina se a ser usado como um teste complementar mais espec fico para amostras de soro ou plasma humanos que apresentaram resultados repetidamente reativos por procedimentos de triagem ou rastreamento como os testes imunoenzim ticos ELISA INTRODU O Existem v rios testes de triagem ou rastreamento para a detec o de anticorpos tanto contra o HIV 1 como contra o HIV 2 os agentes etiol gicos da s ndrome da imunodefici ncia adquirida AIDS Esses testes podem ser extremamente sens veis por m menos espec ficos levando a interpreta es falso positivas Por isso s o necess rios testes independentes complementares de especificidade elevada para confirmar a presen a de anticorpos contra o HIV 1 e ou HIV 2 O kit HIV BLOT 2 2 da MP Diagnostics foi concebido para ser usado como teste complementar mais espec fico para amostras de soro ou plasma humanos que apresentaram resultados repetidamente reativos pelo teste de ELISA Ant genos virais espec ficos do HIV 1 separados2. de padr es de bandeamento espec ficos conforme as recomenda es das autoridades competentes i e Minist rio da Sa de Organiza o Mundial da Sa de etc As diretrizes espec ficas para a interpreta o podem divergir dependendo de normas locais A MPD recomenda seguir as normas aceitas em conformidade com os regulamentos locais A seguir indicam se os crit rios de orienta o recomendados por diversos organismos internacionais de regulamenta o ORG O CRIT RIOS DE REGULAMENTADOR INTERPRETA O Centers for Disease Control Pelo menos uma ENV gp41 e gp120 160 CDC e ASTPHLD e p24 American Food and Drug p24 e p31 e gp41 ou gp120 gp160 Administration FDA Centre National Transfusion Duas bandas ENV com GAG ou POL Sanguine Organiza o Mundial da Sa de Duas bandas ENV com ou sem GAG WHO ou POL Consortium for Retrovirus Uma banda de p24 ou p31 e banda ENV Serology Standardization Cruz Vermelha Americana Uma banda cada de GAG POLe ENV German Association for Control Uma banda ENV e pelo menos uma banda of Viral Diseases DVV GAG ou POL ver tamb m DIN 58 969 parte 41 Para interpretar o HIV BLOT 2 2 MPD recomendamos aplicar as orienta es Os resultados devem ser registrados para cada banda detectada e interpretados como NEGATIVO POSITIVO ou INDETERMINADO p17 p24 p55 ou POL p31 p51 p66 e a banda espec fica de HIV 2 vis vel PA
3. eletrofor tica e nas mesmas fitas incorpora se um pept deo sint tico espec fico do HIV 2 Cada fita de nitrocelulose incubada com soro ou plasma dilu dos e controles Os anticorpos espec ficos contra o HIV 1 e HIV 2 caso estejam presentes nas amostras v o fixar se s prote nas do HIV 1 e ao pept deo do HIV 2 nas fitas As fitas s o lavadas para remover o material n o fixados Os anticorpos que se fixam especificamente s prote nas do HIV podem ser visualizados por uma s rie de rea es que envolvem o uso de anticorpo caprino anti lgG humana conjugado fosfatase alcalina e do substrato BCIP NBT Este m todo suficientemente sens vel para detectar quantidades m nimas de anticorpos espec ficos contra o HIV no soro ou plasma COMPONENTES DO KIT Descri o do Componente Quantidade Fornecida FITAS DE NITROCELULOSE Dispon vel Incorporadas com lisado de em 18 ou HIV 1 com peptideo 36 fitas espec fico do envolt rio do HIV 2 e com uma banda de controle de adi o de soro Mantenha seco e ao abrigo da luz controL CONTROLE NAO REATIVO 1 frasco Soro humano normal 80 ul inativado n o reativo para ant genos superficiais de hepatite B HBsAg nem para anticorpos contra HIV 1 2 e HCV Cont m azida s dica e tiomersal como conservantes gt CONTROLE REATIVO 1 frasco A FORTE 80 u Soro humano inativado contendo t tulo elevado de anticorpos contra HIV 1 e HIV 2 e n o
4. LAVAGEM DILU DA e deixe as imersas durante 5 minutos sobre a plataforma oscilante entre cada lavagem Adicione 2 ml de SOLU O DE CONJUGADO DE TRABALHO a cada po o Cubra a bandeja e incube durante 30 minutos temperatura ambiente 25 3 C na plataforma oscilante Aspire o CONJUGADO dos po os Lave como na etapa 8 Adicione 2 ml de SOLU O DE SUBSTRATO em cada po o Cubra a bandeja e incube a durante 15 minutos na plataforma oscilante Nota A rea o pode ser parada antes de 15 minutos se todas as faixas forem vis veis Aspire o SUBSTRATO e enx g e as fitas pelo menos tr s vezes com gua de grau reagente para interromper a rea o a lavagem insuficiente nesta etapa poder provocar o desenvolvimento de um fundo escuro Usando pin a retire cuidadosamente as fitas e coloque as sobre toalhas de papel Cubra com toalhas de papel e seque Alternativamente deixe as fitas secarem nos po os da bandeja Monte as fitas sobre folha de papel branco n o absorvente N o aplique fita adesiva sobre as bandas reveladas Observe as bandas Ver Interpreta o de Resultados e interprete os resultados Para armazenamento conserve as fitas em local escuro 3x2ml 2 mi 30 minutos 3x2ml 2ml 15 minutos 3x2ml RESUMO DOS PROTOCOLOS DO TESTE Reagentes Temp Amb td Ras Prova R pida Temp Amb Prova Overnight Fita de nitrocelulose 1 Solu o Tamp o de Lavagem 2ml 1 2 m
5. The Cavendish Singapore Science Park Singapore 118259 Tel N 65 6775 0008 Fax N 65 6775 4536 E mail enquiry ap mpbio com Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D 66386 St Ingbert Alemanha Tel N 49 68 94 58 1020 Fax N 49 68 94 58 1021 E mail info O mt procons com EC REP Escrit rios Regionais MP Biomedicals Suisse S A Halle de Fret Aeroport P O Box 1015 1211 Genebra 5 Su a Tel N 4122 788 1908 Fax N 4122 788 1986 E mail mpbiosuisse mpbio com E U A Patente 5 721 095 O nome e o logotipo Genelabs s o licenciados da Genelabs Technologies Inc 9 FIGURA 1 gp 160 _ hood gp 120 _ p 66 W p55 _ psi gp 41 p 39 pw p17 Controle ps Ea soro HIV 2 q g R Controle Reativo Forte Reativo para HIV 1 e HIV 2 Controle Reativo Fraco Reativo somente para HIV 1 Controle N o Reativo Um soro soropositivo para HIV 2 caracter stico 10 27 Zyd eulajoid ap Je njso Lyu ewn JOS op apepiligissod e ajsixa g Lpd ouuoo ejesdisjui OBN Z esnyp epueq ewn 9 Lyd siod Lpdb 9 oeN L SIBJIA ogu seul loid e eaea 9 S9 ap ensouiv s Do 0E nb sorew oedeqnou ap einyesoduia py 1s 1 o ajueanp eya dwoou usbene7 g eBuo oynu lu Be 1 op ogdegnou 2 S9 ap ensouiv z opeBn uoo op No ajse ep exsowe ep og iniip eu oug opeuop
6. e incorporados em fitas por procedimentos eletrofor ticos seguidos de eletrotransfer ncia combinados na mesma fita com um pept deo sint tico espec fico do HIV 2 permitem observar melhor as respostas mediadas por anticorpos para prote nas virais espec ficas Cada fita inclui tamb m um controle interno de adi o de amostra para minimizar o risco de falso negativos provocados por erros operacionais e para assegurar a adi o de amostras DESCRI O DE S MBOLOS USADOS Os s mbolos gr ficos usados ou encontrados nos produtos e embalagens MP Diagnostics est o indicados a seguir Estes s o os s mbolos mais comuns em dispositivos m dicos e respectivas embalagens Estes s mbolos s o explicados com mais detalhes no British and European Standard BS EN 980 2008 7 Usar at Dispositivo Sin nimos m dico Data de Validade para diagn stico in vitro C digo do lote Lot Sin nimos N mero de N mero do lote cat logo C digo da remessa Aten o y kimites de A ri temperatura e Us E Representante bal U C 9rostno EC REP Autorizado na Comunidade z E Europ ia Y Cont m o suficiente para lt n gt testes CHI Comsulio ss instru es de uso Q N o reutilize PRINC PIOS QU MICOS E BIOL GICOS DO PROCEDIMENTO As fitas de nitrocelulose s o incorporadas com prote nas antig nicas separadas e fixadas do HIV 1 parcialmente purificado e inativado por procedimentos de transfer ncia blotting
7. reativo para HBsAg nem para anticorpos contra HCV Cont m azida s dica e tiomersal como conservantes contRoL weak CONTROLE REATIVO 1 frasco FRACO 80 ul Soro humano inativado que cont m t tulo baixo de anticorpos APENAS contra HIV 1 e n o reativo para HBsAg e anticorpos contra HIV 2 e HCV Cont m azida s dica e timerosal como conservantes pur stock 1ox SOLUGAO TAMPAO 1 frasco ESTOQUE CONCENTRADA 20 ml 10x Solu o tamp o Tris com soro caprino normal inativado pelo calor Cont m timerosal como conservante Bur wasn 20x SOLUGAO TAMPAO DE 1 frasco LAVAGEM CONCENTRADA 70 ml 20x Tris com Tween 20 Cont m timerosal como conservante CONJUGADO 1 frasco Anticorpo caprino anti lgG 120 ul humana conjugado a fosfatase alcalina Cont m azida s dica como conservante suss ciriNBT SUBSTRATO 1 frasco A Solu o de 5 bromo 4 cloro 3 100 ml indolil fosfato BCIP e azul de nitrotetraz lio NBT P PARA BLOTTING 10 embalagens Leite desnatado em p 1 g cada Bandejas de incuba o 9 po os cada 2 ou 4 bandejas Manual de Instru esl 1 exemplar Pinca 1 par Nota O volume de reagentes fornecido suficiente para 4 processamentos AVISOS E PRECAU ES Para uso exclusivo em diagn stico in vitro 2 Exclusivamente para uso profissional 3 Solicitamos consultar a documenta o dos produtos para informa es sobre componentes potencialmente peri
8. 4 503 505 M G Sarngadharan M Popovic L Bruch J Schupbach and R C Gallo 1984 Antibodies reactive with human T Lymphotropic retroviruses HTLV III in the serum of patients with AIDS Science 224 506 608 CDC 1985 Provisional public health service inter agency recommendations for screening donated blood and plasma for antibody to the virus causing Acquired Immune Deficiency Syndrome United States Morbidity and Mortality Weekly Report 34 1 1 5 WHO Collaborating Group on HIV 2 1990 WHO Weekly Epidem Rec 10 p74 75 Sarngadharan and R C Gallo 1984 Serological Analysis of subgroup of Human T Lymphotropic retroviruses HTLV III associated with AIDS Science 224 503 505 F Clavel D Guetard F Brun Vezinet et al 1986 Isolation of a new human retrovirus from West African patients with AIDS Science 233 343 346 F Clavel 1987 HIV 2 the West African AIDS virus AIDS 1 135 140 R S Tedder A Hughes T Corrah et al 1988 Envelope cross reactivity in Western Blot for HIV 1 and HIV 2 may not indicate dual infection Lancet 11 927 930 Bottiger B A Karlsson F Andreasson et al 1990 Envelope cross reactivity between Human Immunodeficiency Virus Type 1 and Type 2 detected by different serological methods Correlation between cross neutralization and reactivity against the main neutralizing site J Virol 64 7 3492 3499 MP Biomedicals Asia Pacific Pte Ltd 85 Science Park Drive 04 01
9. DR O INTERPRETA O Nenhuma banda viral espec fica presente NEGATIVO Detec o de anticorpos contra p17 NEGATIVO UNICAMENTE e aus ncia total de outras bandas Detec o de 2 ENV HIV 1 POSITIVO gp160 gp41 e gp120 e GAG p17 p24 p55 ou POL p31 p51 p66 Detec o de 2 ENV HIV 1 POSITIVO gp160 gp41 e gp120 e GAG com IND CIOS DE HIV 2 Quaisquer bandas virais especificas presentes mas o padr o n o satisfaz os crit rios para POSITIVO INDETERMINADO Quaisquer bandas virais espec ficas presentes mas o padr o n o satisfaz os crit rios para POSITIVO e a banda espec fica de HIV 2 vis vel INDETERMINADO com INDICIOS DE HIV 2 LIMITA ES DO M TODO A detec o de anticorpos contra HIV 1 n o constitui um diagn stico da s ndrome de imunodefici ncia adquirida AIDS Um BLOT NEGATIVO n o garante aus ncia do agente causador da AIDS Embora um blot POSITIVO para anticorpos contra o HIV 1 indique infec o pelo v rus o diagn stico de AIDS s pode ser feito clinicamente se a pessoa reunir as caracter sticas que definem a AIDS estabelecida pelo Center for Disease Control EUA pela Organiza o Mundial da Sa de ou por outras autoridades competentes Sabe se que pessoas que se tornaram soropositivas h pouco tempo podem apresentar padr es incompletos mas desenvolver o crescente reatividade tanto no n mero quanto na intensidade das bandas quando s o acompanhada
10. OR FAVOR NOTE A extremidade numerada das fitas deve s er colocada na parte inferior como mostrado na Figura i e as bandas gp120 gp160 s o as mais afastadas da extremidade n umerada PESO GENE ANT GENO DESCRI O MOLECULAR gp 160 ENV Forma polim rica Glicoproteina da gp41 difusa e larga gp 120 ENV Membrana externa Glicoprote na difusa p66 POL Transcriptase Banda discreta Reversa p55 GAG Prote na precursora Banda discreta p51 POL Transcriptase Banda discreta reversa logo abaixo de p55 p39 GAG Fragmento de p55 Banda discreta gp41 ENV Transmembrana Glicoproteina difusa p31 POL Endonuclease Dupla p24 GAG Proteina central Banda larga p17 GAG Proteina central Banda larga Alguns dos antigenos mencionados na tabela acima derivam de uma mesma proteina precursora e podem ter epitopos sobrepostos Isto deve ser considerado quando se interpreta o padr o por exemplo 1 pouco prov vel detectar gp41 na aus ncia de gp160 porque a gp160 a forma polim rica da gp41 e a concentra o de gp160 mais elevada do que a de gp41 no HIV BLOT 2 2 MPD A gp41 aparece como uma banda difusa Qualquer banda n tida e discreta na regi o da gp41 n o deve ser interpretada como uma banda gp41 Muitas amostras normais e n o infectadas pelo HIV apresentam se reativas a este ant geno que n o pertence ao HIV mas que parece ter origem na linhagem de c lu
11. R pertinentes s o R20 21 22 Nocivo por inala o em contato com a pele e em caso de ingest o 1 Evite a contamina o microbiana dos reagentes ao abrir e retirar al quotas dos frascos originais 2 N o pipete com a boca 3 Manuseie as amostras de testes as fitas de nitrocelulose e os Controles Reativos Fracos e N o Reativos como agentes potencialmente infecciosos 4 Use vestu rio de laborat rio e luvas descart veis durante a realiza o do teste Descarte as luvas em sacos pl sticos para lixo biol gico perigoso A seguir lave bem as m os 5 altamente recomend vel que este teste seja realizado numa c mara adequada para material biol gico perigoso 6 Mantenha todo o material longe de alimentos e bebidas 7 Em caso de acidente ou contato com os olhos lave imediatamente com gua em abund ncia e procure ajuda m dica 8 Consulte imediatamente um m dico caso ocorra ingest o de materiais contaminados ou contato destes com feridas abertas ou outras solu es de continuidade da pele 9 Enxugue imediatamente derramamentos de materiais infecciosos com papel absorvente e limpe imediatamente a rea contaminada com solu o de hipoclorito de s dio a 1 antes de continuar o trabalho O hipoclorito de s dio n o deve ser usado em derramamentos contendo cidos a n o ser que a rea seja primeiro enxugada com papel absorvente O material usado inclusive as luvas descart veis deve ser descartado como ma
12. do adicionadas retorne a bandeja posi o horizontal original Certifique se que as fitas mant m se sempre midas durante o procedimento Alternativamente caso n o deseje inclinar a bandeja as amostras podem ser adicionadas na extremidade superior ou inferior do po o Desta forma a leitura da fita n o ser afetada caso tenham se desenvolvido manchas escuras Procedimento 1 Adicione 2 ml de SOLU O TAMP O 2 mi DE LAVAGEM DILUIDA a cada poco 2 Usando pin a retire cuidadosamente o n mero necess rio de FITAS do tubo e coloque as em cada po o com a face numerada voltada para cima Inclua fitas para controles Reativo Forte Reativo Fraco e N o Reativo 3 Incube as fitas durante 1 e 2 minutos 2 minutos temperatura ambiente 25 3 C sobre uma plataforma oscilante velocidade de 12 a 16 ciclos por minuto Remova a solu o tamp o por aspira o Nota N o permita que as tiras sequem a falha pode resultar em marcas aquosas em tiras desenvolvidas para alguns esp cimes 4 Adicione 2 ml de SOLU O TAMP O 2 ml PARA BLOTTING a cada po o 5 Adicione 20 ul de cada soro de paciente 20 ul ou de controle nos po os apropriados Deve se ter cuidado para ter a certeza que as amostras n o s o adicionadas diretamente sobre as fitas 6 Cubra a bandeja com a tampa fornecida 60 minutos e incube durante 1 hora temperatura ambiente 25 3 C na plataforma oscilante 7 Retire cuidadosamente a tampa ev
13. eo do HIV 2 com soros positivos para HIV 1 amostras de soros de doadores normais e soros com outras infec es virais TIPO DE AMOSTRA N MERO REATIVIDADE PARA O PEPTIDEO DO HIV 2 POSITIVA NEGATIVA Soropositivo para HIV 1 197 162 181 Doadores Normais 208 0 208 Soropositivo para HTLV 1 CMV EBV IgM V zoster IgG Sarampo Rub ola Caxumba Adenovirus HSV Dengue Total 455 CIMA OQ O oj oa aja O O O O O O O O O o alala QI O QI OI Q O md for 439 aQuando analisadas pelo Western Blot para HIV 2 da MPD 6 destas amostras apresentaram reatividade com ENV e GAG ou POL 9 reagiram apenas com GAG e ou POL e 1 amostra era negativa Um total de 15 pain is comerciais de soroconvers o de HIV 1 foram testados com HIV Blot 2 2 MPD e os resultados mostraram que o HIV Blot 2 2 MPD foi capaz de detectar anticorpos contra HIV antecipadamente ou na mesma amostra em todos os pain is ISEN O DE RESPONSABILIDADE EXPL CITA LIMITADA O fabricante n o oferece nenhuma outra garantia expressa sen o a de que o kit de teste funcionar como um ensaio de diagn stico in vitro dentro das especifica es e limita es descritas neste Manual de Instru es do Produto quando usado em conformidade com as instru es nele contidas O fabricante isenta se de qualquer garantia expressa ou impl cita incluindo as garantias expressas ou imp
14. ero de amostras 197 PERFIL HIV BLOT 2 2 HIV 1 WB SOROLOGICO NUMERO DUPONT ORTHO NUMERO GAG POLe ENV 192 97 5 188 95 4 p24 p31 gp41 e ou 187 94 9 179 90 9 gp120 gp160 ENV e GAG ou POL 197 100 0 197 100 0 Tabela 2 Estudo da especificidade da reatividade de ant geno viral de HIV 1 com amostras de doadores normais e soros com outras infec es virais TIPO DE N MERO Positivos REATIVIDADE PARA HIV 1 AMOSTRA INDETERMINADA NEGATIVA Doadores Normais 208 E q HTLV 1 CMV EBV IgM V zoster IgG Sarampo Rub ola Caxumba Adenov rus HSV Dengue Total 258 CIMA Q O QI O O a loln lala ln alalaloO AJAO O O S 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 N mk 237 Todas exibiam apenas as bandas p24 ou p17 Tabela 3 Estudo da sensibilidade da banda do pept deo do HIV 2 com amostras soropositivas para HIV 2 N mero de amostras 178 Western Blot HIV 2 Reatividade para o pept deo do HIV 2 Perfil sorologico Positiva Negativa GAG POL e 2 ENV 160 0 GAG POL e 1 ENV 18 0 Soros definidos como positivos pelo NEW LAV Blot 2 da Diagnostics Pasteur Dados fornecidos pelos Drs Oliviero E Varnier e Flavia Lillo Laborat rio de Retrov rus Humanos Universidade de G nova Tabela 4 Estudo da especificidade da banda do pept d
15. fopueg z 1s 1 o Gjueinp SEpB1lA WEJO SEL SV sey seu seoueiq seyouew ap olu ultAloAu s q seojoadse ogu sepueg SeplAjoAuasap sey seu enfe o p seyouey Lpdb ap ogibos eu eJS19SIp epiyiu epueg seson iajep Sed oanebou ajoJuos OU s uI 9A oAUu s p 0J0S ep ejojuoo ap sepueq sep SejusssjIp sepueg senno ap eduesaid no elouasne ep opuenb ey ep opuny ou s A oAu s p oge lioj ewn pepisu u exieq wejuaseide no weajoauesep as ogu sepeiedsa sepueg Z AIH ep ogdeo pu Was S W AJOAU S P seoyloedse o eu sepueg seu seu senso seyouew op olu ullAloAu s q SVINH IgOqId AG OV NIOS VAVd V THS V L
16. gosos INFORMA ES DE SA DE E SEGURAN A CUIDADO Este kit cont m material de origem humana Nenhum m todo de teste pode oferecer garantia total que os produtos de sangue humano n o transmitam infec es MANUSEIE AS AMOSTRAS ASSIM COMO OS CONTROLES REATIVOS FORTES REATIVOS FRACOS E OS CONTROLES N O REATIVOS COMO AGENTES POTENCIALMENTE INFECCIOSOS Recomenda se que os componentes e as amostras do teste sejam manuseados de acordo com as boas pr ticas de laborat rio O descarte dever ser realizado de acordo com procedimentos de seguran a vigentes O Controle Reativo Forte o Controle Reativo Fraco e o Controle N o Reativo cont m timerosal e azida s dica enquanto a Solu o Tamp o Estoque Concentrada e a Solu o Tamp o de Lavagem Concentrada cont m timerosal e o Conjugado cont m azida s dica A azida s dica pode reagir com o cobre e o chumbo usados em alguns sistemas de canaliza o formando sais explosivos Embora as quantidades usadas neste kit sejam pequenas o descarte de materiais contendo azida deve ser feito por lavagem com volumes relativamente altos de gua de forma a evitar a forma o de azida met lica no sistema de canaliza o As frases de risco R pertinentes s o R22 Nocivo se ingerido O Substrato cont m 5 bromo 4 cloro 3 indolil fosfato e azul de nitrotetraz lio classificado pelas Diretivas da Comunidade Econ mica Europ ia CEE aplic veis como nocivo Xn As frases de risco
17. in 1 2 min Solu o Tamp o para Blotting 2 ml Amostra 20 ul 60 min Overnight 16 20 horas Solu o Tamp o de Lavagem 3x2ml 3x5min 3 x 5 min Conjugado 2 ml 60 min 30 min Solu o Tamp o de Lavagem 3x2ml 3x5min 3 x 5 min Substrato pronto para uso 2 ml 15 min ou menos 15 min ou menos Agua destilada 3x2ml QUANTIDADE NECESS RIA DE REAGENTES PARA QUANWTIDADES DIFERENTES DE FITAS Reagentes N MERO DE FITAS A USAR 3 6 9 15 20 27 36 Solu o Tamp o 60 100 140 240 300 400 520 de Lavagem 1X ml Solu o Tamp o 20 40 60 80 100 120 160 para Blotting 1X ml Conjugado ul 11 117 23 35 45 59 77 Substrato ml 11 17 23 35 45 59 77 P para Blotting g 1 2 3 4 5 6 8 CONTROLE DE QUALIDADE Recomenda se processar os controles N o Reativo Reativo Forte e Reativo Fraco junto a cada teste independentemente do n mero de amostras sob an lise Para que todos os resultados obtidos nos testes sejam considerados v lidos as seguintes condi es dever o ser preenchidas 1 CONTROLE N O REATIVO N o se devem observar bandas espec ficas para HIV 1 e HIV 2 nas fitas de controle N o Reativo A banda para o controle de soro deve ser vis vel Fig 1c 2 CONTROLE REATIVO FORTE Todas as bandas de peso molecular relevantes devem estar e
18. ipe ogu ojeusans p opeuoppe ogu ope6n uoo g VSI13 oAnIsod osIeJ un Jas pod ls ap emsoue v 9 luel ioso puulojeleld ep JeBn wa epesn eamejos euuoezela S openbapeu ojusueuszeuue no ojueurejoBuoosep ojusuejoBuoo ap solol9 soldninuu e opiA p s nozile nieus p no 8s noJouejop SH ls 8 op esowe v SOLBAOS Sounul sox l duuo2 WeWJO 1s 1 op sexsouwe sv g opeBniuoo ojad epeuluejuoo ls 1 op ensouuv Z s op ensouue ep og iniip eu OZ euuosejejd ep sen wa epesn eagejos ewed olejsoj op OBSEIJUBOUOD eye woo enbe no s ju fe sefepueg 9 ojnpal ejusbe no esusjui AN zn e oedisodxe e opinop ojensgns op ojeuoou Hd S eueuunu 5B woo opeuluejuoo opeBn uoo r epenbepeu einyesodwe e op isodxo e opinop slaaejsul sajuabeoH g ope niuoo op og iniip eu oz ejuewepinop sopesedaid WeJo ogu s lu Be 1 SOL sejusbeou 1s 1 Op sedejo se nu ejuswepenbepeu sepeae Se s lu uueolsiJ Buniolq eed oedwe oednjos ep sejue o OLSA oedipe ep I gud e sode weseoes se sy L yeoo OU se sep ojusueuszeuue ep sepenbapeu seg ipuoo e s en p ew jqosd o nb j akaoud 9 opn op jenu einu qe e sode odw ouso wn ap siodep WaJaA OAUasEp OS seinos seyoueu es opnluoo SOUO QL lu uu elo9lu WBJOS Sell Sp soqn so opuenh soBuni ap olu uuI9s 15 oe opiAap seinosa seyouew wejuasaidy s oedoajap e Jeya ered ajualoyns
19. itando respingos ou misturar as amostras Incline a bandeja para aspirar a mistura dos po os Troque as ponteiras de aspira o entre as aplica es de amostras para evitar contamina o cruzada 10 11 12 13 14 15 16 Lave cada fita 3 vezes com 2 ml de SOLU O TAMP O DE LAVAGEM DILU DA e deixe as imersas durante 5 minutos sobre a plataforma oscilante entre cada lavagem Adicione 2 ml de SOLU O DE CONJUGADO DE TRABALHO a cada po o Cubra a bandeja e incube durante 1 hora temperatura ambiente 25 3 C na plataforma oscilante Aspire o CONJUGADO dos po os Lave como na etapa 8 Adicione 2 ml de SOLU O DE SUBSTRATO em cada po o Cubra a bandeja e incube a durante 15 minutos na plataforma oscilante Nota A rea o pode ser parada antes de 15 minutos se todas as faixas forem vis veis Aspire o SUBSTRATO e enx g e as fitas pelo menos tr s vezes com gua de grau reagente para interromper a rea o a lavagem insuficiente nesta etapa poder provocar o desenvolvimento de um fundo escuro Usando pin a retire cuidadosamente as fitas e coloque as sobre toalhas de papel Cubra com toalhas de papel e seque Alternativamente deixe as fitas secarem nos po os da bandeja Monte as fitas sobre folha de papel branco n o absorvente N o aplique fita adesiva sobre as bandas reveladas Observe as bandas ver Interpreta o de Resultados e interprete os resultados Para armazenament
20. l citas em rela o capacidade de comercializa o de utiliza o ou utilidade impl cita para quaisquer outros fins A responsabilidade do fabricante limita se substitui o do produto ou ao reembolso do pre o de compra do produto O fabricante n o ser considerado respons vel pelo comprador nem por terceiros por quaisquer danos preju zos ou perdas de car ter econ mico causados pelo uso ou aplica o do produto PROBLEMAS T CNICOS QUEIXASPROBLEMAS TECNICOS QUEIXAS Caso haja algum problema t cnico ou queixa solicitamos proceder da seguinte forma 1 Anote o n mero de lote do kit e a data de validade 2 Conserve o kit e os resultados obtidos 3 Contate o escrit rio MP Biomedicals mais pr ximo ou o seu distribuidor local REFER NCIAS 1 10 V C W Tsang K Hancock M Wilson D F Palmer S Whaley J S Mc Dougal and S Kennedy March 1985 Developmental Procedure Enzyme linked Immunoelectro transfer Blot technique for HTLV III LAV antibodies CDC Altanta H Towbin T Staehlin and J Gordon 1979 Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets procedure and some applications Proc Natl Acad Sci USA 76 4350 4354 J Schupbach M Popovic R V Gilden M A Gonda M G Sarngadharan and R C Gallo 1984 Serological Analysis of subgroup of Human T Lymphotropic retroviruses HTLV II associated with AIDS Science 22
21. las humanas utilizadas para cultivar o HIV 2 A banda p55 geralmente detectada quando existe reatividade forte para p24 e ou p17 As bandas visualizadas como p42 e p39 s o ambas fragmentos de GAG e n o devem ser interpretadas como gp41 ENV 3 As bandas POL p66 p51 e p31 s o geralmente detectadas simultaneamente Contudo as sensibilidades de p66 e p31 s o maiores que a de p51 4 A reatividade cruzada do HIV 2 vari vel mas tipicamente exibe reatividade com ant genos GAG e ou POL No entanto em alguns casos pode ocorrer reatividade cruzada com a banda gp160 mas raramente com a gp41 5 Existe tamb m uma banda de alto peso molecular com aproximadamente 160 kDa que se presume ser uma prote na precursora de GAG POL Isto observado em alguns soros com t tulos elevados para HIV 2 ou indeterminados reativos somente para GAG mas o padr o da banda uma banda discreta diferente da banda difusa da gp160 do ENV O procedimento de interpreta o envolve as seguintes etapas 1 Confirmar se a banda de soro controle est vis vel Se o controle estiver negativo os resultados dever o ser considerados inv lidos visto que isto indica um erro t cnico tal como n o adi o de amostra conjugado ou substrato 2 Identifica o dos pesos moleculares de todas as bandas da fita de teste usando as fitas de Controle REATIVO FORTE e ou FRACO como guia 3 Ainterpreta o da fita do teste baseia se pois na detec o
22. o conserve as fitas em local escuro 3x2ml 2ml 60 minutos 3x2ml 2ml 15 minutos 3x2ml PROCEDIMENTO ALTERNATIVO TESTE OVERNIGHT Procedimento 1 2 Adicione 2 ml de SOLU O TAMP O DE LAVAGEM DILU DA a cada po o Usando pin a retire cuidadosamente o n mero necess rio de FITAS do tubo e coloque as em cada po o com a face numerada voltada para cima Inclua fitas para controles Reativo Forte Reativo Fraco e N o Reativo Incube as fitas durante 1 e 2 minutos temperatura ambiente 25 3 C sobre uma plataforma oscilante velocidade de 12 a 16 ciclos por minuto Remova a solu o tamp o por aspira o Nota N o permita que as tiras sequem a falha pode resultar em marcas aquosas em tiras desenvolvidas para alguns esp cimes Adicione 2 ml de SOLU O TAMP O PARA BLOTTING a cada po o Adicione 20 ul de cada soro de paciente ou de controle nos po os apropriados Cubra a bandeja com a tampa fornecida e incube overnight 16 20 horas temperatura ambiente 25 3 C na plataforma oscilante 2 mi 2 minutos 2 mi 20 ul overnight 10 11 12 13 14 15 16 Retire cuidadosamente a tampa evitando respingos ou misturar as amostras Incline a bandeja para aspirar a mistura dos po os Troque as ponteiras de aspira o entre as aplica es de amostras para evitar contamina o cruzada Lave cada fita 3 vezes com 2 ml de SOLU O TAMP O DE
23. o sepueib sealyead seuoz w seoueuq seyouew ap ojusubins o wesneo nb seyjoq uIgjuoS z seou Wejuaseldy seu s uu AlOAu s p ounose opuny noja 1s 1 o ejueinp SEPRIIA WPBIO SE SV Z opeuol9Ipe ogu OJOS epeznuo og puIuejuoo Jod opessed 48 Wapod jonuoo no efapueg ep sodod sep 0410S ap lonuo5 ap epueq ap epugsny e lduiooSu usbeneT z seque epidwoueju 9 oedea e sepinjonussapJedns seua seAnisod sepueq 1s 1 ep eJsouwe ejad opesneo elas eus goJd o enb jenpaoJd 3 woq OANISOd jo uoo sojed opesneo eles puu l qoid o enb joapnoJd 3 sepeyueue no sepeouu sepeogluep seja openbepeul Ojusweuszeuue e OPIAep sobuny no seu l oeq Jod e ep opdeulwejuos sepio ul Au 9 S9 ap sexsouwe w s unw sox duuo5 ap oe5eldio 1iq Z oxleq oapisod joluoo s op sexsowe seunbje w qJ 06 08 p 22199 e sepeoljllu pi wes0 adoj nua op sopesoo 6 ap souebjue sepeuniDo sepueg g Ha ogy YTH oldu x 10d sesja sopesedaid w s lu s 1d 6 H seulsjoJd woo e epeznio esowy g seueIpouueju sepepyuenh op soJsel e abeou OUO oynu PISO el souue v OANISOd l olnluo2 o nbijUH A 1s 1 ep ensouue ep soBuni no seu l5eq Jod ope euluueluoo L oedeouqe e ajueinp 1olqsue1on l piSu 1 li lul p Buimolg esed od op oediniip BIN osn op Sejue ajuswepenbopeu sepene se
24. r realizado temperatura ambiente 25 C 3 C 15 Certifique se que as fitas de teste est o dispostas com os n meros nas fitas voltados para cima 16 Para a prova de Western Blot importante usar um agitador de plataforma oscilante e n o um agitador rotativo Caso contr rio o desempenho do kit ficar comprometido A velocidade e o ngulo de inclina o recomendados para o agitador s o de 12 a 16 ciclos por minuto e 5 a 10 graus respectivamente 17 Se usar equipamento autom tico confira se est aferido antes do uso 18 Certifique se que as amostras s o adicionadas longe da fita A bandeja pode ser agitada e a amostra adicionada no local onde a solu o tamp o for coletada na extremidade inferior Isto evitar a forma o de manchas escuras devido adi o de amostra na fita 19 Evite o uso de congeladores do tipo frost free para armazenar reagentes e amostras 20 N o recomendamos o uso de amostras dilu das ou liofilizadas pois podem fornecer resultados falsos Se formarem parte ou a totalidade do painel QC dever ser efetuada a valida o INSTRU ES DE ARMAZENAMENTO 1 Conserve o kit HIV BLOT 2 2 MPD e seus componentes entre 2 C e 8 C quando n o estiverem em uso 2 Todos os reagentes e fitas do teste permanecem est veis at a data de validade fornecida no kit se conservados entre 2 C a 8 C N o congele os reagentes A Fitas com ant geno Evite a exposi o desneces
25. s ria das fitas de ant genos a luz B Reagentes e Conserve os reagentes em seus recipientes originais e mantenha os tampados ao armazen los e Aplique todos os reagentes ainda frios e volte a armazen los entre 2 C e 8 C o mais r pido poss vel e Quando o substrato for conservado entre 2 C e 8 C poder o se formar precipitados Isto n o afetar o desempenho do kit Cuidado Evite a exposi o desnecess ria do substrato luz COLETA TRANSPORTE E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS Podem ser usadas amostras de soro ou plasma coletadas em EDTA heparina ou citrato de s dio Antes do armazenamento certifique se que os co gulos e ou as c lulas sang neas foram separadas por centrifuga o As amostras devem ser conservadas entre 2 C e 8C se o teste for realizado dentro de 7 dias ap s a coleta ou congeladas a 20 C se for previsto que o teste ser realizado em mais de 7 dias ap s coleta prefer vel usar amostras l mpidas e n o hemolisadas Amostras lip micas ict ricas ou contaminadas part culas devem ser filtradas 0 45um ou centrifugadas antes do teste As amostras dos pacientes podem ser inativadas mas esta n o uma exig ncia para um desempenho timo do teste Inative da seguinte forma 1 Afrouxe as tampas dos recipientes de amostra 2 Aque a a amostra a 56 C durante 30 minutos em banho maria 3 Deixe a amostra esfriar antes de reapertar as tampas 4 A amostra pode ser man
26. s por per odos de dois a seis meses A maioria dos blots com resultados POSITIVOS apresentar o outras bandas virais espec ficas Os blots INDETERMINADOS n o dever o ser usados como base para o diagn stico de infec o por HIV Recomenda se que todos os BLOTS INDETERMINADOS sejam reanalisados usando se a amostra original e amostras subsequentes Os doadores de sangue com blots INDETERMINADOS devem ser novamente testados usando se uma amostra nova ap s dois a seis meses Sabe se tamb m que anticorpos espec ficos para p24 e p31 diminuem no decurso da AIDS ocasionando uma mudan a na interpreta o do blot de POSITIVO para INDETERMINADO Em tais situa es a interpreta o dos resultados deve portanto ser baseada em testes de blot e avalia es cl nicas subsequentes Devido sua natureza altamente espec fica a N O REATIVIDADE de amostras com o pept deo espec fico do envolt rio do HIV 2 num blot viral classificado como Indeterminado n o exclui a possibilidade de infec o por outras cepas de HIV 2 As amostras que indicam infec es por HIV 2 devem ser posteriormente analisadas com o Kit de Western Blot para HIV 2 CARACTER STICAS ESPEC FICAS DE DESEMPENHO O desempenho do HIV BLOT 2 2 MPD para a detec o de anticorpos contra HIV 1 ou HIV 2 foi avaliado em estudos cl nicos Tabela 1 Estudo da sensibilidade da reatividade do ant geno viral de HIV 1 com amostras soropositivas para HIV 1 N m
27. sultados err neos Use t cnicas ass pticas como por exemplo pipetas ou ponteiras de pipetas descart veis para retirar al quotas dos frascos 5 Em cada processamento de amostras de pacientes deve se testar os controles do kit em paralelo 6 Use uma ponteira de pipeta nova para cada al quota de amostra para evitar contamina o cruzada 7 Para melhores resultados aplique todos os reagentes enquanto ainda estiverem frios e retorne os ao armazenamento entre 2 C e 8 C o mais depressa poss vel 8 Recomenda se que a vidraria a ser usada com os reagentes seja lavada com cido clor drico 2M e enxaguada abundantemente com gua destilada ou deionizada antes do uso 9 Use somente gua de qualidade grau reagente deionizada ou destilada para diluir os reagentes 10 Todos os reagentes devem ser bem misturados antes do uso 11 Asolu o de Conjugado de Trabalho a Solu o Tamp o de Lavagem Dilu da e a Solu o Tamp o para Blotting devem ser preparadas logo antes do uso 12 Asolu o de Conjugado de Trabalho deve ser preparada usando um recipiente ou b cher de polipropileno 13 N o exponha os reagentes nem realize testes em reas que apresentem altos n veis de vapores de desinfetantes qu micos e g vapores de hipoclorito durante as etapas de armazenamento ou de incuba o O contato inibe a rea o colorida Da mesma forma n o exponha os reagentes luz intensa 14 O teste dever preferencialmente se
28. terial biol gico potencialmente perigoso N o esterilize em autoclave material que contenha hipoclorito de s dio 10 Antes do descarte esterilize em autoclave a 121 C e 15 p s i durante 30 minutos todo o material contaminado utilizado Alternativamente descontamine o material em solu o de hipoclorito de s dio a 5 durante 30 60 minutos antes de descartar em sacos para lixo biol gico perigoso 11 Descontamine todos os produtos qu micos e reagentes usados adicionando um volume suficiente de hipoclorito de s dio para obter uma concentra o final de pelo menos 1 Deixe agir durante 30 minutos para garantir uma descontamina o eficiente 12 N o recomend vel reutilizar as bandejas de incuba o PRECAU ES ANAL TICAS 1 Para garantir um desempenho perfeito do teste necess rio SEGUIR RISCA os procedimentos descritos neste Manual de Instru es A inobserv ncia destes procedimentos podem acarretar resultados an malos 2 N O MODIFIQUE OU SUBSTITUA REAGENTES DE UM LOTE DE KIT PARA OUTRO Os controles o conjugado e as fitas de Western Blot s o combinadas entre si para oferecer um desempenho perfeito Use somente reagentes fornecidos com o kit 3 N o use componentes do kit ap s a data de validade impressa na caixa do kit 4 Evite a contamina o microbiana dos reagentes ao abrir e retirar al quotas dos frascos originais A contamina o reduz prematuramente a vida til dos kits e fornece re
29. tida congelada at o momento da an lise Recomendamos que as amostras dos pacientes n o sejam submetidas a m ltiplos ciclos de congelamento e descongelamento antes das an lises MATERIAIS ADICIONAIS NECESS RIOS MAS N O FORNECIDOS gua deionizada ou destilada e Luvas descart veis e Plataforma oscilante com velocidade de agita o na faixa de 12 a 16 oscila es por minuto e com capacidade de inclina o entre 5 e 10 para lavagem uniforme das membranas Pipetadores e ponteiras de volumes adequados Sistema de aspira o e conten o em hipoclorito de s dio Banho maria a 56 C opcional Hipoclorito de s dio para descontamina o PREPARA O DOS REAGENTES 1 SOLU O TAMP O DE LAVAGEM DILU DA a A SOLU O TAMP O DE LAVAGEM DILU DA deve ser preparada logo antes do uso b Dilua 1 volume de SOLU O TAMP O DE LAVAGEM CONCENTRADA 20X com 19 volumes de gua grau reagente Misture bem 2 SOLU O TAMP O PARA BLOTTING a A SOLU O TAMP O PARA BLOTTING deve ser preparada logo antes do uso b Dilua 1 volume de SOLU O TAMP O ESTOQUE CONCENTRADA 10X com 9 volumes de gua grau reagente Misture bem c Adicione 1 g de P PARA BLOTTING a cada 20 ml de SOLU O TAMP O ESTOQUE dilu da preparada na etapa 2 b acima Agite para dissolver completamente o p d Agite novamente antes de aplicar 3 SOLU O DE CONJUGADO DE TRABALHO Nota Prepare a sol
30. u o num recipiente ou b cher de polipropileno a A SOLU O DE CONJUGADO TRABALHO dever ser preparada logo antes do uso b Prepare a SOLU O DE CONJUGADO DE TRABALHO diluindo o CONJUGADO a 1 1000 em SOLU O TAMP O PARA BLOTTING por exemplo 5 ul de CONJUGADO para 5 ml de SOLU O TAMP O PARA BLOTTING 4 SOLU O DE SUBSTRATO pronta para uso a Distribua diretamente o volume necess rio a partir do frasco Use uma pipeta limpa Feche bem ap s o uso PROCEDIMENTO DO TESTE PROVA R PIDA Nota a Os usu rios podem usar o assay r pido ou de noite funcionar os testes As faixas do HIV s o mais tornadas e mais faixas podem aparecer com o assay de noite mas o desempenho total dos dois assays o mesmo b Aspire todos os reagentes e produtos qu micos usados para um recipiente de conten o com hipoclorito de s dio c Todas as incuba es devem ser realizadas em plataforma de agita o por oscila o Cuidado Algumas amostras provocam manchas escuras no ponto da fita em que s o aplicadas Para evitar este problema deve se i Aplicar a amostra somente ap s a adi o da SOLU O TAMP O PARA BLOTTING ii Inclinar a bandeja ligeiramente elevando a extremidade superior ou inferior da bandeja A Solu o Tamp o para Blotting fluir para a extremidade mais baixa da bandeja Adicione a amostra onde a Solu o Tamp o para Blotting coletada Quando todas as amostras tiverem si
31. videntes A Figura 1a fornece um guia das posi es relativas de bandas visualizadas com o HIV BLOT 2 2 MPD e permite a identifica o das bandas observadas com o CONTROLE REATIVO FORTE As bandas observadas s o p17 p24 p31 gp41 p51 p55 p66 9p120 9p160 Outras bandas associadas a antigenos do centro core viral p39 p42 tamb m podem estar visiveis Cuidado para nao interpretar estas bandas erroneamente como gp41 Os ant genos de envolt rio gp41 gp120 gp160 sendo t picas de glicoprote nas aparecem como bandas difusas A banda de soro controle estar vis vel A banda espec fica de HIV 2 tamb m dever estar vis vel como mostrado na Figura ta 3 CONTROLE REATIVO FRACO O controle Reativo Fraco fornece uma medida da sensibilidade do kit Devem aparecer bandas fracas em p24 e ou gp41 e em gp120 gp160 Bandas fracas adicionais podem ou n o estar presentes A banda de soro controle estar vis vel Fig 1b INTERPRETA O DE RESULTADOS NOTA As fitas reveladas devem estar completamente secas para evitar erros de interpreta o A presen a ou aus ncia de anticorpos contra o HIV 1 na amostra determinada pela compara o de cada fita de nitrocelulose sob teste com as fitas de controle analisadas com os controles N O REATIVO REATIVO FORTE e REATIVO FRACO A Figura 1a apresentada como uma ajuda para a identifica o das v rias bandas reveladas na fita que reagiu com o Controle REATIVO FORTE P
Download Pdf Manuals
Related Search