kit de extração mini vac automação de 96 amostras
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1. comum ocorrer o ressecamento das amostras As amostras secas devem ser armazenadas em refrigerador a 4 C em ambiente livre de umidade 7 PROCEDIMENTO O procedimento do Biopur Kit de Extra o Mini VAC Automa o 96 amostras abrange as seguintes etapas 1 Lise da amostra 2 Liga o do DNA gen mico membrana da Placa de Liga o 3 Lavagem da membrana e elimina o do etanol 4 Elui o do DNA gen mico Lise Para um melhor resultado as amostras devem estar em temperatura ambiente antes da lise As amostras s o lisadas em condi es de desnatura o em temperaturas elevadas na presen a do Tamp o de Lise e Proteinase K no Equipamento Biomotion Liga o de DNA gen mico Pela adi o do Tamp o de Liga o ao lisado as condi es timas de liga o ser o obtidas Amostras ser o transferidas para Placa de Liga o de DNA B e o DNA gen mico ligar se membrana As condi es timas de pH e salinas da mistura asseguram que contaminantes como as prote nas que podem inibir PCR ou outras rea es diversas n o sejam retidos na membrana de s lica NOTA DNA e RNA s o purificados em paralelo se ambos estiverem presentes na amostra fresca Se for necess rio DNA gen mico livre de RNA a adi o de 20yL de solu o estoque RNase A 20mg mL na amostra antes de adicionar Tamp o de Liga o recomendada Remo o dos Contaminantes Residuais Os contaminantes s o eficientemente removidos usando Tamp2. o cruzada recomendado o uso de ponteiras com filtro N o misturar componentes de kits diferentes se n o forem do mesmo lote Evitar contamina o microbiana dos reagentes do kit Para minimizar risco de contamina es recomendado trabalhar em c mara de fluxo laminar Este kit deve ser usado apenas por pessoal treinado Armazenar os qu micos e pl sticos em condi es pr prias para uso em laborat rio Os res duos gerados pelo uso dos kits n o foram testados Contamina es causadas pelos res duos s o rar ssimas mas n o podem ser completamente descartadas Portanto os res duos devem ser considerados como material infeccioso e devem ser manuseados de acordo com as normas de seguran a regulamentadas Caso necessite de mais informa es a respeito do produto favor entrar em contato com a Biometrix solicitando a Ficha de Informa es de Seguran a de Produto Qu mico FISPQ do produto Ver a seguir classifica o de riscos e frases de seguran a utilizadas internacionalmente que se aplicam aos componentes do BIOPUR Kit de Extra o Mini VAC Automa o 96 amostras PRODUTO RISCOS Tamp o de Lise R36 S2 24 Tamp o de Liga o R11 22 41 67 S16 24 25 26 Proteinase K R36 37 38 42 92 22 24 26 36 37 Tamp o de Lavagem R20 21 22 32 52 53 92 13 61 LEGENDA DE RISCOS R11 Altamente inflam vel R20 21
3. 22 Nocivo por inala o contato com a pele e se ingerido R32 Contato com gases muito t xicos Liberados de cidos R36 Irritante para os olhos R36 37 38 Irritante para os olhos sistema respirat rio e pele R41 Risco s rio de danos aos olhos R42 Pode causar sensibiliza o pela inala o R52 53 Nocivo para organismos aqu ticos pode causar cause efeitos adversos em longo prazo no ambiente aqu tico R67 Vapores podem causar sonol ncia e tonturas S2 Manter fora do alcance das crian as S7 Manter o recipiente bem fechado S13 Mante longe de comida bebida e comida de animais S16 Manter longe de fontes de igni o N o fumar S22 N o inalar o p S24 25 Evitar contato com a pele e olhos S24 Evitar contato com a pele 526 Em caso de contato com os olhos lavar imediatamente com gua abundante e procurar aconselhamento m dico S36 37 Usar roupas e luvas protetoras e adequadas S61 Evitar libera o no meio ambiente Consultar instru es especiais ficha de seguran a 6 AMOSTRAGEM E ARMAZENAMENTO DE ACORDO COM O TIPO DE AMOSTRA BIOL GICA Sangue Total e Creme Leucocit rio Buffy coat Rev 01 Out 2013 Os melhores resultados s o obtidos utilizando amostras frescas Amostras de sangue total conservadas com EDTA e citrato podem ser estocadas em temperatura ambiente por 2 a 3 horas para uma armazenagem r pida at 24 horas as amostras devem ser estocadas a 4 C Para longo per odo de
4. C digo do Produto BP102 96 BP103 384 BP104 1152 Tamp o de Lise 25 mL 100 mL 265 mL Proteinase K 5 x 1 05 mL 18 mL 1x 54 mL solu o de trabalho solu o de trabalho solu o de trabalho Tamp o de Liga o 25 mL 100 mL 265 mL Tamp o de Lavadem l 50 mL 2 x 80 mL 3 x 180 mL P 8 volume final 100 mL volume final 2 x 160 mL volume final 3 x 360 mL Tamp da Lavag m ilt 30 mL 2 x 60 mL 3 x 105 mL P 8 volume final 100 mL volume final 2 x 200 mL volume final 3 x 355 mL Tamp o de Elui o M 25 mL 100 mL 265 mL Placa de Liga o de DNA Tipo B 1 unid 4 unid 12 unid Placa de Coleta de 2 mL 1 unid 4 unid 12 unid Placa de Elui o 1 2 mL 1 unid 4 unid 12 unid Filme Pl stico Adesivo 2 unid 8 unid 24 unid Manual de Instru es 1 unid 1 unid 1 unid Verificar item 9 Preparo dos Reagentes e item 8 Reagentes e Equipamentos necess rios mas n o fornecidos s BIOXPUR Rev 01 Out 2013 4 ARMAZENAMENTO DOS REAGENTES Todos os tamp es e componentes do BIOPUR Kit de Extra o Mini VAC Automa o 96 Amostras exceto a Proteinase k devem ser armazenadas em temperatura ambiente entre 15 e 30 C e s o est veis por at 18 meses nessas condi es Proteinase K A Proteinase K liofilizada deve ser armazenada em geladeira entre 2 e 8 C A Proteinase K reconstitu da deve ser armazenada a 20 C recomenda se dividir a solu o em al quotas para o armazenamento no free
5. estocagem recomendado congelamento das amostras entre 20 e 80 C Congelamentos e descongelamentos seguidos antes da extra o do DNA devem ser evitados Se houver a presen a de crioprecipitados formados no descongelamento de amostras congeladas evitar aspir los na pipetagem pois eles poder o entupir a membrana da Placa de Liga o de DNA Tipo C V rios tipos de tubos prim rios sistema de coleta de sangue e anticoagulantes podem ser usados para a coleta de sangue com exce o de heparina s BIOXPUR Rev 01 Out 2013 Creme Leucocit rio buffy coat a fra o de sangue rica em c lulas brancas Para preparar e extrair a camada de creme leucocit rio recomenda se o seguinte processo usar uma amostra de sangue total anticoagulantes EDTA citrato mas n o heparina com uma fra o sedimento celular proveniente de um repouso durante a noite a 4 C A camada clara logo abaixo ao plasma o creme leucocit rio contendo leuc citos que podem ser facilmente distinguidos dos eritr citos da camada inferior Um fator de enriquecimento de 10 esperado a partir desse processo portanto devido a esse enriquecimento leucocit rio ficar atento para evitar uma sobrecarga no processo de extra o de DNA Fluido Cerebroespinhal CSF e Medula ssea Os melhores resultados s o obtidos de amostras frescas As amostras podem ser armazenadas a 4 C por 2 a 3 horas Para um per odo maior congelar as amostras a 20 C
6. o de Lavagem e Il e depois a membrana ser seca por cont nuo v cuo Elui o do DNA gen mico O DNA gen mico elu do utilizando Tamp o de Elui o M O DNA elu do est pronto para uso em diferentes aplica es em Biologia Molecular e pode ser armazenado entre 4 e 8 C por no m nimo 2 meses ou at 5 anos se armazenado a 20 C s BIOXPUR Rev 01 Out 2013 8 EQUIPAMENTOS E REAGENTES NECESS RIOS MAS N O FORNECIDOS Proveta 250 mL Micropipeta monocanal e ponteiras com filtro Etanol PA gua ultrapura ou bidestilada ou de inje o PBS 1X opcional 9 PREPARO DOS REAGENTES Kit 1x96 Amostra e Adicionar 1050 uL de gua ultrapura bidestilada ou de inje o ao frasco da Proteinase K e misturar cuidadosamente e Adicionar 50 mL de etanol PA ao Tamp o de Lavagem Misturar cuidadosamente e manter recipiente bem fechado e Adicionar 70 mL etanol PA ao Tamp o de Lavagem Il Misturar cuidadosamente e manter o recipiente bem fechado Kit 4x96 e Adicionar 18 mL de gua ultrapura bidestilada ou de inje o ao frasco da Proteinase K e misturar cuidadosamente e Adicionar 80 mL de etanol PA ao Tamp o de Lavagem Misturar cuidadosamente e manter o recipiente bem fechado e Adicionar 140 mL etanol PA ao Tamp o de Lavagem Il Misturar cuidadosamente e manter o recipiente bem fechado kit 12x96 e Adicionar 54 mL de gua ultrapura bidestilada ou de inje o ao frasco da Proteinase K e mistur
7. ar cuidadosamente e Adicionar 180 mL de etanol PA ao Tamp o de Lavagem Misturar cuidadosamente e manter recipiente bem fechado e Adicionar 250 mL etanol PA ao Tamp o de Lavagem Il Misturar cuidadosamente e manter o recipiente bem fechado 10 PROTOCOLOS Antes de iniciar o procedimento 1 Ligar o equipamento Biomotion Selecionar o protocolo e iniciar o m todo Selecionar o n mero de amostra que ser o extra das come ando sempre com a primeira coluna Uma vez que as colunas requeridas foram selecionadas colocar todos os materiais necess rios na mesa de trabalho como mostrado no painel de controle 5 Preencher os tamp es nos reservat rios como descritos no painel de controle 6 Se todos os tamp es placas ponteiras e amostras estiverem colocados em suas posi es corretamente como descrito no software pressionar START no painel do Biomotion e o protocolo ser executado A wN IMPORTANTE e Colocar todos os reagentes em temperatura ambiente Quando necess rio misturar delicadamente e s BIOXPUR Rev 01 Out 2013 dissolver novamente quaisquer precipita es aquecendo a 30 C at a dissolu o Mexer gentilmente para evitar forma o de espuma e Certificar se que as ponteiras est o carregadas e que as tampas dos racks est o abertas e N o dispensar os volumes necess rios de reagentes nos tubos de reagentes at o exato momento de come ar um ensaio e Manter os reagentes cobertos
8. com as tampas fornecidas Deixar os reagentes nos tubos por per odos prolongados resultar em evapora o especialmente solu es com lcool e forma o de precipita es de sal resultando em perda de condi es de liga o Por esta raz o reagentes preparados muito antes do ensaio devem ser descartados e deve ser carregado na plataforma um tubo novo e limpo com reagentes frescos e Amostras sempre devem ser processadas em lotes de 8 colunas completas Se n o for utilizar todos os po os em uma coluna certificar se de que os po os n o usados contenham l quido substituto tais como gua ou tamp o em volume igual ao volume das amostras e Se houver menos de 96 amostras para extrair ser necess rio cobrir a por o n o usada da Placa de Liga o de DNA Tipo B com um peda o de filme pl stico Cobrir a por o n o usada essencial para uma apropriada opera o de v cuo N o reutilizar a por o n o utilizada da placa O manuseio repetido da placa pode resultar em contamina o cruzada nas extra es futuras PROTOCOLO 1 Extra o de DNA gen mico de 200 uL de sangue total humano o Extra o de DNA gen mico de 100 uL sangue total de outros mam feros Extra o de DNA gen mico de 30 uL de creme leucocit rio buffy coat 1 Transferir 200 uL de sangue total humano ou 100 uL sangue total de outros mamiferos ou 30 uL de buffy coat a cada po o da Placa de Coleta de 2 mL Para amostras que tenham vol
9. do BIOPUR Kit de Extra o Mini VAC Automa o 96 amostras para as aplica es conforme descritas neste manual assegurando um produto de consistente qualidade 12 INFORMA ES PARA PEDIDO PRODUTO TAMANHO DA EMBALAGEM C DIGO DO PRODUTO BIOPUR Kit de Extra o Mini VAC Automa o 96 amostras 4X96 BIOPUR Kit de Extra o Mini VAC Automa o 96 amostras 12X96 384 extra es BP103 384 1152 extra es BP104 1152 13 INFORMA ES DO FABRICANTE SR Com rcio de Produtos para Laborat rios Ltda EPP Rua Para so do Norte 866 CEP 83 324 221 Pinhais PR Tel 41 2108 5295 Fax 41 3667 2660 E mail assessoriacientificaesrprodulab com br Site www srprodulab com br CNPJ 04 645 160 0001 49 Respons vel T cnica Franciele Camila Kimura CRF PR 19247 14 DISTRIBUIDOR Biometrix Diagn stica Ltda Rua Estrada da Graciosa 1081 Curitiba Paran Brasil CEP 82 840 360 Tel 41 2108 5250 Fax 41 2108 5252 DDG 0800 726 0504 E mail biometrixebiometrix com br Site www biometrix com br CNPJ 06 145 976 0001 39 Respons vel T cnica Edna Cristina Kurokawa Guimar es Ferreira CRQ PR 09302336 Aprova o 08 10 2013 T roafada Wan prova do 3 X C Rafaela Wassmansdorf Laborat rio Assinado por Rafaela Wassmansdorf
10. oleta de 2 mL Completar o volume at 200 uL com PBS 1X ou gua ultrapura bidestilada ou de inje o 2 Colocar a Placa de Coleta de 2 mL na posi o da placa de amostras na plataforma do Biomotion e iniciar o procedimento conforme instru es do equipamento B Tratar material desidratado por exemplo l mina hematol gica como segue Umidificar o material desidratado com uma gota de PBS 1X 2 Adicionar 180 uL de PBS 1X em um microtubo de 1 5 mL n o fornecido 3 Raspar material citol gico no microtubo utilizando a borda de uma l mina limpa 4 Dissolver o res duo resultante por pipetagem repetitiva 5 Transferir o material dissolvido em um po o da Placa de Coleta de 2 mL 6 Completar com PBS 1X ou gua ultrapura bidestilada ou de inje o o volume at 200 pL 7 Colocar a Placa de Coleta de 2 mL na posi o da placa de amostras na plataforma do Biomotion e iniciar o procedimento conforme instru es do equipamento No final do procedimento armazenar a Placa de Elui o 1 2 mL com as amostras de DNA para futuros testes Limpeza P s Ensaio Materiais pl sticos descart veis e res duos de l quidos 1 Descartar materiais pl sticos e res duos de l quidos de acordo com as instru es do laborat rio por tipo de amostras e risco de reagente 2 N o adicionar alvejante ou solu es cidas diretamente nas solu es que contenham guanidina Tamp o de Lise e Tamp o de Lavagem 1 ou res duo de e
11. om fenol e clorof rmio ou precipita o em etanol O procedimento foi desenvolvido para evitar contamina o cruzada de amostras e permitir um manuseio seguro de amostras potencialmente contaminantes Devido alta pureza o DNA gen mico extra do fica pronto para uso em um grande painel de aplica es em Biologia Molecular ou poder ser armazenado a 20 C para uso subsequente Aplica es em Biologia Molecular e PCR e An lise RFLP e Digest o por enzima de restri o e Hibridiza o e An lises SNP e Genotipagem O produto indicado para uso por profissionais treinados em t cnicas de biologia molecular Quaisquer resultados gerados utilizando o procedimento de prepara o de amostras em conjunto com qualquer an lise de diagn stico devem ser interpretados considerando outras conclus es cl nicas e laboratoriais Para minimizar irregularidades nos resultados de diagn sticos controles adequados devem ser empregados Rev 01 Out 2013 2 CARACTER STICAS DO PRODUTO AMOSTRA INICIAL RENDIMENTO TEMPO RAZ O 1 200 uL sangue total de humanos g 1 100 uL de sangue total de outros mam feros 2 10 HS A penae 1 200 uL de fluido cerebroespinhal da qualidade origem Ro e idade da amostra 70 minutos 1 7 2 0 1 30 uL creme leucocit rio buffy coat 1 25 uL sangue de n o mamiferos 1 20 uL de medula ssea seu transporte e armazenamento A quantidade de DNA pu
12. rificado obtido pelo BIOPUR Kit de Extra o Mini VAC Automa o 96 amostras depende do tipo de amostra e do n mero de c lulas presentes na amostra que varia conforme a idade do paciente e seu estado de sa de e conforme condi es de transporte armazenamento e idade das amostras Normalmente uma amostra de 200 uL de sangue total contagem de c lulas brancas intervalo de 3 x 10 a 1 x 10 c lulas mL de um indiv duo sadio rende de 3 a 10 ug de DNA O rendimento t pico do Kit de 2 a 8 ug de DNA Se uma amostra de sangue total tratada com solu es tamp o contendo anticoagulantes a contagem total de leuc citos diminuir e o rendimento de DNA do processo de extra o ser reduzido O rendimento pode ser aumentado se o tempo de incuba o com o Tamp o de Elui o pr aquecido for prolongado Para a maioria das amostras de sangue total uma nica elui o com 200 uL de Tamp o de Elui o o suficiente Para amostras com elevada concentra o de c lulas brancas aproximadamente 80 do DNA ser elu do nos primeiros 200 uL e os outros 20 na elui o seguinte de 200 pL O rendimento e a qualidade do DNA gen mico extra do aplic vel em qualquer sistema de detec o de diagn stico molecular Os testes de diagn stico devem ser realizados de acordo com as especifica es do fabricante 3 COMPOSI O DO KIT INFORMA ES 1x 96 PRINCIPAIS Amostra Do Edo
13. s BIOXPUR Rev 01 Out 2013 KIT DE EXTRA O MINI VAC AUTOMA O DE 96 AMOSTRAS Instru es de Uso 1 USO PRETENDIDO O BIOPUR Kit de Extra o Mini VAC Automa o 96 Amostras a ferramenta ideal para extra o autom tica r pida e confi vel de DNA gen mico empregando placa filtro de 96 po os e o Equipamento Biomotion Devido ao alto grau de pureza o DNA extra do est pronto para ser utilizado em an lises de diagn stico in vitro e em outras aplica es aplicado para as seguintes amostras e Sangue total humano e Sangue total de mam feros e Creme leucocit rio buffy coat e Fluido cerebroespinhal CFS e Sangue de n o mam feros tais como aves e peixes e Medula ssea N o existe estudo de valida o publicado para a extra o de DNA gen mico de c lulas isoladas ou oriundas de cultura tecidos swabs manchas secas de sangue ou fluidos corp reos livres de c lulas como fluido sinovial e urina fezes e de bact rias fungos parasitas ou purifica o de RNA total A aplica o do kit para extra o e purifica o de DNA viral n o foi avaliada Para outras valida es entrar em contato com nosso Laborat rio O BIOPUR Kit de Extra o Mini VAC Automa o de 96 amostras designado para o processamento de m ltiplas amostras simultaneamente O procedimento realizado em plataforma automatizada necessitando assim m nima intera o com o usu rio al m disso n o requer uma extra o c
14. ume menor que 200 uL completar o volume com PBS 1X ou gua ultrapura bidestilada ou de inje o IMPORTANTE Homogeneizar a Placa de Coleta 2 mL selada cuidadosamente no vortex Uma agita o incompleta reduzir a qualidade e rendimento do DNA extra do 2 Colocar a Placa de Coleta de 2 mL na posi o da placa de amostras na plataforma do Biomotion e iniciar o procedimento conforme instru es do equipamento PROTOCOLO 2 e Extra o de DNA gen mico de 25 uL de sangue de n o mam fero 1 Transferir 25 uL de sangue total de n o mam fero para cada po o da Placa de Coleta de 2 mL Completar o volume para 200 uL com Tamp o PBS 1X ou gua ultrapura bidestilada ou de inje o IMPORTANTE Homogeneizar a Placa de Coleta 2 mL selada cuidadosamente no vortex Uma agita o incompleta reduzir a qualidade e rendimento do DNA extra do 3 Colocar a Placa de Coleta de 2 mL na posi o da placa de amostras na plataforma do Biomotion e iniciar o procedimento conforme instru es do equipamento No final do procedimento armazenar a Placa de Elui o 1 2 mL com as amostras de DNA para futuros testes s BIOXPUR Rev 01 Out 2013 PROTOCOLO 3 e Extra o de DNA gen mico de 200 pL de fluido cerebroespinhal CFS e Extra o de DNA gen mico de 20 uL medula ssea A Adicionar material fresco 1 Transferir 200 uL de fluido cerebroespinhal ou 20 uL de medula ssea para cada po o da Placa de C
15. xtra o A guanidina produz compostos reativos e gazes t xicos quando misturada com alvejantes ou cidos Para qualquer item contaminado com esses tamp es limpar com detergente e gua para remover todos os tra os de guanidina antes da limpeza com alvejante ou solu es cidas Partes n o descart veis Caixa de descarte de ponteiras Reservat rio de res duo Vac Frame 1 do Biomotion 1 Enxaguar totalmente com gua fria e corrente e deixar secar 2 As partes reutiliz veis devem ser lavadas assegurando que elas estejam livres de RNA DNA e RNase DNase Tenha certeza que elas estejam secas antes de reutilizar 3 Se uma limpeza futura for necess ria enxaguar com gua corrente para remover o sal deixar secar e limpar com solu o de hipoclorito de s dio de 1 concentra o final do alvejante por mais 30 minutos Enxaguar totalmente com bastante com gua livre de RNase em grau de Biologia Molecular ou miliQ e deixar secar Ou 4 Lavar por 1 minuto em NaOH 0 1M EDTA 1mM seguindo por 1 minuto de lavagem em HCI 0 4M ent o enxaguar abundantemente com gua livre de RNase em grau de Biologia Molecular ou miliQ IMPORTANTE N o autoclavar ou esterilizar por calor as partes reutiliz veis reservat rio Biomotion 400mL Vac Frame 1 e Biomotion e Caixa de descarte de ponteiras N o exceder 100 C 8 s BIOXPUR Rev 01 Out 2013 11 CONTROLE DE QUALIDADE O fabricante e o distribuidor garantem a fun o correta
16. zer Congelamentos e descongelamentos repetidos devem ser evitados Esta solu o pode eventualmente apresentar aspecto leitoso principalmente em fun o de repetidos ciclos de congelamento e descongelamento armazenamento prolongado ou dilui o errada situa es tais que devem ser evitadas Entretanto verificou se que esse aspecto leitoso n o interfere no desempenho do produto N o recomendado dar spin na solu o leitosa pois pode haver forma o de pellet levando perda de atividade Tamp es de Lavagem Os Tamp es de Lavagem I e Il nos quais foi adicionado etanol devem ser apropriadamente fechados e armazenados em temperatura ambiente entre 15 e 30 C Antes de cada uso ter certeza que os componentes est o em temperatura ambiente Se alguma solu o apresentar precipitado dissolv lo com cuidadoso aquecimento at 30 C 5 INFORMA O DE SEGURAN A Sempre que estiver trabalhando com solu es qu micas e amostras biol gicas EPIs s o recomendados conforme normas de seguran a regulamentadas Depois de receber o kit verificar se as embalagens dos componentes est o danificadas ou se h vazamento dos l quidos Se os frascos de tamp es estiverem danificados ou com vazamento usar luvas e culos de prote o ao descart los para evitar acidentes N o usar componentes danificados pois eles podem gerar baixo rendimento Sempre trocar as ponteiras entre as transfer ncias de l quidos para evitar a contamina
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