IV Encontro Amazônico de Agrárias - Ainfo
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1. I IV EncontroA maz nicodeA gr rias Ufra 26a 3ldemar o de 2 02 Agricultura Familiar mecanismos de desenvolvimentono cen rioamaz nico BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA AOS RECURSOS GEN TICOS ID Sc Maria Rosa Travassos da R Costa 2D Sc Kenny Bonfim Sidney V do Nascimento Biti foto Maria Rosa Travassos Costa Bel m 2012 Encontro Amaz nico de Agr rias Ano 04 N 02 Mar o de 2012 ISBN 978 85 7295 078 7 LISTA DE ABREVIATURAS PCR Polimerase chain reaction Rea o em cadeia da polimerase RAPD Polimorfismo de DNA amplificado ao acaso DNA cido desoxirribonucl ico RNAse ribonuclease ng nanograma Lg micrograma ul microlitro Encontro Amaz nico de Agr rias Ano 04 N 02 Mar o de 2012 ISBN 978 85 7295 078 7 2 1 INTRODU O As t cnicas de Biologia Avan ada t m gerado interesse em diversas reas devido ao seu potencial de uso Entretanto para conseguir apreciar o potencial de utiliza o destas t cnicas no dia a dia necess rio que se conhe a as vantagens limita es e aplica es Neste sentido o minicurso de extra o quantifica o de DNA marcadores moleculares e clonagem tem como objetivo principal atingir estudantes que estejam engajados ou planejem participar ativamente em programas de caracteriza o conserva o e melhoramento visando o uso mais direcionado e apropriado dos recursos gen ticos A extra o de DNA o primeiro passo para a uti2. extra o e sobretudo o manuseio de utens lios de maneira adequada para evitar contamina o A seguir ser o descritas as etapas utilizadas no Laborat rio de Gen tica da Embrapa Amaz nia Oriental para a otimiza o do protocolo de extra o de DNA a partir de sangue total e tecido vegetal 2 1 Extra o de DNA a partir de sangue total Protocolo 1 Coletar amostras de sangue com EDTA para evitar coagula o Conservar o material resfriado at extra o Transferir 150 ul de cada amostra para tubos de 15 ml identificados Adicionar 5 ml de tamp o STE pr aquecido 250 ul de SDS 10 pH 7 2 e 100 ul de ribonuclease 10 mg ml Incubar as amostras a 37 C em cont nua agita o por uma hora agitar de 10em 10 minutos Adicionar 100 ul de proteinase K e deixar overnigth a 55 C em banho maria Misturar levemente em v rtex Levar os tubos temperatura ambiente e adicionar 2 ml de NaCl 5 M Agitar gentilmente por I5segundos Adicionar 5 ml de clorof rmio e agitar por 30 minutos at a homogeneiza o Centrifugar a3000 rpm por 15 min Transferir o sobrenadante e adicionar volume igual de lcool 95 gelado Inverter os tubos gentilmente para precipitar o DNA Transferir a nuvem de DNA para tubos de 1 5 ml Centrifugar durante 10 minutos 4 C e 4 000 rpm Acrescentar 1000u de etanol 70 para remover sais Centrifugar durante 10 minutos 4 C e 4 000 rpm Verificar se h ocorr ncia de impurezas Se
3. o das novas esp cies que poder o ser utilizadas em projetos de an lise da biodiversidade Al m disso a utiliza o de m todos moleculares como o sequenciamento de genes conservados para a identifica o dos recursos gen ticos pode possibilitar ainda desenvolvimento de m todos de diagn stico an lises filogen ticas epidemiologia gen tica de popula es entre outros O sequenciamento de DNA um processo que determina a ordem dos nucleot deos em uma amostra Existem v rios m todos dispon veis e cada um apresenta vantagens e desvantagens Esta t cnica foi descrita primeiramente por Sanger et al em 1977 e considerado um dos feitos cient ficos mais importantes da ci ncia O DNA est presente em todos os seres vivos sejam eles animais vegetais ou microrganismos O gene a unidade fundamental de informa o nos seres vivos um segmento de DNA capaz de codificar a informa o necess ria para a s ntese de um produto biologicamente ativo O DNA respons vel pela hereditariedade e a variabilidade necess ria para o processo evolutivo Para o sequenciamento de qualquer fragmento de DNA pelas t cnicas tradicionais este precisa ser primeiramente inserido ou clonado em um vetor de clonagem Os vetores de clonagem mais simples e os mais utilizados na clonagem de genes s o os baseados em pequenos plasm deos bacterianos H um grande n mero de vetores diferentes dispon veis assim como cepas de Escherichia coli que p
4. o do DNA gen mico de cavalo para a concentra o de 5 ng ul C V C V gt 313 ng ul V 5 ng ul 500 ul V 5 500 313 V 8 ul de DNA 492 ul de gua est ril Exemplo da dilui o do DNA gen mico de cavalo para a concentra o de 2 5 ng ul C Vi CV gt 313 ng ul V 2 5 ng ul 500 ul V 2 5 500 313 V 4 ul de DNA 496 ql de gua est ril 5 QUANTIFICA O DE DNA EM FLUOR METRO O equipamento que usaremos ser o Hoefer DyNA Quant 200 que um fot metro com o filtro de fluoresc ncia com uma fonte fixa de passagem de excita o a 365 nm e um filtro de passagem de emiss o a 460 nm Ele foi desenhado para a quantifica o de baixas concentra es de DNA usando o corante chamado de Hoechst 33258 tamb m chamado de Encontro Amaz nico de Agr rias Ano 04 N 02 Mar o de 2012 ISBN 978 85 7295 078 7 11 bisbenzimida O corante Hoechst 33258 apresenta altera es nas caracter sticas de fluoresc ncia na presen a de DNA que permite a estimativa da concentra o na solu o Na aus ncia de DNA o espectro de excita o do corante Hoechst 33258 possui um pico a 356 nm e o espectro de emiss o possui um pico fraco a 492 nm Quando Hoechst 33258 liga se ao DNA esses picos movem se para 365 nm de excita o e 458 nm de emiss o No po o da cubeta a amostra exposta a luz filtrada 365 nm 7 nm de uma l mpada de merc rio Essa luz excita o complexo corante DNA causando a luz a emitir um pico a 458 nm O filtro de e
5. C 11 Ribonuclease A 10 ug ml em tamp o TE 1 ml Juntar 10 ul de Tris HCI 1M pH 8 0 2 ul de EDTA 0 5 M pH 8 0 1 ul de RNAse 10 mg ml e 987 ul de gua est ril Armazenar a 4 C 12 Solu o de NaCl 5M 1 0 litro Dissolver 292 2 g de NaCl em 800 ml de gua est ril Ajustar o volume para 1 litro com gua est ril Dividir o volume em vasilhames autoclavar e armazenar a 4 C 13 Solu o de NaCl 0 25 M 1 0 litro Dissolver 14 61 g de NaCl em 800 ml de gua est ril Ajustar o volume para 1 litro com gua est ril Dividir o volume em vasilhames autoclavar e armazenar a 4 C 14 Tamp o de extra o TE 100ml 1 ml de Tris HC1 IM pH 8 1 ml de EDTA 0 1M pH 8 0 Completar com gua destilada para 100ml e autoclavar por 20 minutos 15 Tamp o de extra o STE 1000ml 20 ml de NaCl 5M 10 ml de Tris HCI 1M pH 8 0 10ml de EDTA 0 1M pH 8 0 Completar para 1000ml e autoclavar por 20 minutos 16 Tris 1M pH 8 0 1 litro Dissolver 121 1 g de Tris base em 800 ml de gua est ril Ajustar o pH para 8 0 adicionando aos poucos aproximadamente 42 ml de HC concentrado Aguardar a solu o esfriar at a temperatura ambiente antes de fazer o ajuste final do pH Ajustar o volume da solu o para 1 0 litro com gua est ril Dividir o volume em vasilhames de 250 ml e esterilizar por autoclavagem Armazenar a temperatura ambiente Ao final se a solu o apresentar colora o amarelada descarte a e obte
6. Pesar e adicionar 10 uL da solu o Membrane Binding Solution para cada 10 mg de gel 3 Incubar a 65 C at dissolver completamente o gel 4 Inserir a minicoluna no tubo coletor e transferir o dissolvido para a minicoluna 5 Incubar 1 minuto a temperatura ambiente 6 Centrifugar por 1 minuto a 13500 rpm neste passo o DNA ficar preso na pequena membrana situada no fundo da minicoluna e o restante passar para o tubo coletor 7 Descartar o que ficou no tubo coletor 8 Adicionar 700 uL da solu o Membrane Wash Solution ethanol added para lavar 9 Centrifugar por 1 minuto a 13500 rpm 10 Descartar o que passou para o tubo coletor 11 Adicionar 500 uL da solu o Membrane Wash Solution ethanol added para lavar 12 Centrifugar por 5 minuto a 13500 rpm 13 Descartar o que passou para o tubo coletor 14 Centrifugar por 1 minuto a 13500 rpm para retirar o res duo de etanol 15 Transferir a minicoluna para um tubo tipo eppendorf de 1 5 mL 16 Adicionar 50 uL de gua ultra pura 17 Incubar a temperatura ambiente por 1 minuto 18 Centrifugar por 1 minuto a 13500 rpm 19 Descartar a minicoluna e estocar o DNA 20 C 20 Quantificar 1 uL em gel de agarose 9 SEQUENCIAMENTO E CLONAGEM T cnicas moleculares de classifica o e identifica o est o contribuindo de forma significativa para o entendimento das rela es filogen ticas entre as diferentes esp cies assim como para uma melhor classifica
7. o na embalagem Ent o se dilui pela f rmula C Vi CV Onde C concentra o estoque Vi volume de DNA estoque a ser pipetado C gt concentra o de trabalho e V gt volume final de solu o C 458 ug ml 458 ng ul Exemplo para C2 50 ng ul e V2 100 ul 458 V 50 100 Vi 10 92 ul de lambda Vre 89 08 de TE Pode se diluir para diversas concentra es como 100 ng ul e 200 ng ul Utiliza se normalmente tr s concentra es no in cio do gel para compara o 3 2 Quantifica o Encontro Amaz nico de Agr rias Ano 04 N 02 Mar o de 2012 ISBN 978 85 7295 078 7 9 O volume da solu o de DNA a ser quantificado aplicado no gel Geralmente utiliza se de 2 a 5 ul da solu o estoque dependendo da quantidade total de DNA obtida na extra o Esta pode ser empiricamente julgada pela quantidade de precipitado obtido e pela viscosidade da solu o onde o DNA est ressuspenso Prepara se o DNA na seguinte concentra o Amostras DNA ul Tamp o de gua est ril ul carregamento ul Gen tipo 1 3 3 4 Gen tipo 2 3 3 4 Gen tipo 3 3 3 4 Gen tipo 4 3 3 4 3 3 Eletroforese a migra o de mol culas carregadas em um campo el trico que determinada pelo tamanho da mol cula e sua carga A movimenta o atrav s de um gel que funciona como um filtro separando as mol culas A separa o dos fragmentos depende da concentra o da agarose do taman
8. de neutralizar as cargas negativas do DNA e da membrana bacteriana facilitando a passagem do vetor pela membrana no momento do choque t rmico que portanto tem a mesma fun o do choque el trico Encontro Amaz nico de Agr rias Ano 04 N 02 Mar o de 2012 ISBN 978 85 7295 078 7 18 Protocolo l Adicionar 2 uL da rea o de liga o em 50 uL de c lula competente Misturar gentilmente 2 Incubar no gelo por 20 minutos 3 Transferir para banho maria 42 C por 45 a 50 segundos 4 Retornar para o gelo imediatamente e incubar por 2 minutos 5 Adicionar 950 uL de meio LB l quido 6 Incubar por 1 a 1 30 horas a 37 C a 150 rpm 7 Centrifugar por 30 segundos para baixar as c lulas esse processo maximiza a efici ncia de obten o de c lulas transformadas com o DNA de interesse 8 Retirar com a pipeta 900 uL do sobrenadante 9 Ressuspender o restante delicadamente e plaquear em placa de petri contendo LB s lido com ampicilina 100 ug mL IPTG 0 1 mM e X gal 40ug mL 10 Incubar a 37 C por 16 horas 9 Considera es finais Este trabalho uma abordagem pr tica no qual apresentada uma descri o condensada dos protocolos de biologia molecular que foram otimizados nos Laborat rios de Gen tica e Fitopatologia da Embrapa Amaz nia Oriental Devido s particularidades do material e as condi es intr nsecas de cada laborat rio as propostas s o pass veis de altera o ou substitui o pelos us
9. houver repetir a lavagem com etanol 70 Retirar o l quido e deixar secando temperatura ambiente por um per odo aproximado de doze horas ou em estufa 37 C por 20 minutos Ressuspender o DNA com 200 a 400 ul de tamp o TE sendo o volume de acordo com a medusa observada pellet Guardar em geladeira a 4 C at a quantifica o Estocar em freezer 2 2 Extra o de DNA vegetal Protocolo 1 Coletar amostras de tecido fresco colocando as em sacos pl sticos identificados Colocar os sacos em isopor com gelo Congelar previamente cadinhos e pistilos de porcelana 20 C Lavar as amostras folhas em gua corrente com hipoclorito 10 e em seguida com gua destilada enxugar Colocar nitrog nio l quido e PVP Polivinilpirrolidone nas folhas j cortadas presentes no cadinho e quebrar o tecido com o pistilo O tecido n o deve descongelar Colocar o material macerado em tubo falcon at a marca de 3ml previamente identificados Adicionar 100 ul de beta mercaptoetanol se necess rio pois depende da esp cie vegetal Adicionar 3ml de solu o extratora ao tubo e levar ao vortex Colocar em banho maria 65 0C por ilhota invertendo os tubos a cada 10 minutos Deixar esfriar na capela Adicionar 3ml da solu o de clorof rmio lcool isoam lico 24 1 Agitar por invers o 120 vezes e centrifugar a 1000rpm 1Omin Encontro Amaz nico de Agr rias Ano 04 N 02 Mar o de 2012 ISBN 97
10. nio e 700 ul de lcool isoprop lico Precipita o dos cidos nucl icos pode guardar em freezer Centrifugar a 13000rpm 4 C por 10 min Descartar lcool isoprop lico secar em papel Acrescentar 1ml de lcool 70 Centrifugar por 2 minutos a 13000rpm 4 C Descartar lcool Secar em papel Ressuspender em gua ultra pura 50 ul 2 3 Preparo do Whash Buffer 200ml 23 36g de NaCl 400 ul de EDTA 0 5M pH 8 0 2000 ul 2ml de Tris HCI pH 8 0 Ap s o preparo autoclavar e ao esfriar adicionar 0 1g de BSA Encontro Amaz nico de Agr rias Ano 04 N 02 Mar o de 2012 ISBN 978 85 7295 078 7 5 2 4 Problemas comumente encontrados poss veis causas e solu es durante a extra o de DNA Etapa do Processo Problema Encontrado Poss veis Causas e Solu es Coleta de amostras Oxida o das amostras Selecione tecido tenro de plantas jovens e mantenha amostras de tecido em gelo at o in cio do processo de extra o ou liofiliza o Macera o Amostras de dif cil Pulveriza o total necess ria Utilize macera o ou tecido tenro fa a uso de moedores el tricos pulveriza o ou agitadores de alta pot ncia para facilitar o processo de macera o Tamp o de Suspens o do tecido Verifique se a propor o tamp o de Extra o macerado em tamp o de extra o tecido macerado adequada extra o n o ocorre por completo Verifiqu
11. sal diss dico EDTA n o dissolve enquanto o pH da solu o n o se aproxima de 8 0 Dividir o volume em vasilhames de 250 ml esterilizar por autoclavagem e armazenar a 4 C 7 Gel de agarose a 1 0 para quantifica o Pesar 1 0 g de agarose e diluir em 100 ml de TBE 1X trizma base 0 1 M cido b rico IM e EDTA 0 5 M ou TAE 1 X trizma base 0 1 M cido ac tico glacial IM e EDTA 0 5M Dissolver em microondas at a solu o estar l mpida Adicionar de 2 ul a 3 ul de brometo de et dio a 10 mg ml e usar na quantifica o ap s o gel solidificar 8 Gel de agarose a 3 0 para corrida de eletroforese de marcadores microssat lites Semelhante ao gel de agarose a 1 0 mas pesar 3 0 g de agarose O gel se solidifica mais rapidamente 9 Proteinase K 50 ug ml Estoque 20 mg ml A quantidade de tamp o a ser usada na dilui o obtida pela f rmula TxCFP CIPx10 onde T Volume do tamp o a ser usado N de amostras x 700 ul 10 CFP Concentra o final da proteinase 50 ug ml CIP Concentra o inicial da proteinase 20 mg ml 10 Ribonuclease A 10mg ml Iml solu o estoque Encontro Amaz nico de Agr rias Ano 04 N 02 Mar o de 2012 ISBN 978 85 7295 078 7 21 Dissolver 10 mg de RNAse A em 1 0 ml de acetato de s dio 0 01M pH 5 2 Ajustar o pH para 7 4 adicionando Tris HCI IM pH 8 0 Aquecer at 100 C por 15 minutos Deixar esfriar lentamente temperatura ambiente Armazenar a 20
12. 12 10 X TNE 10 ml gua mQ destilada 90 ml 2 Zerar o instrumento Prepare um branco usando 2 ml da solu o de trabalho A baixa concentra o Seque o lado da cubeta com len o de papel Insira a cubeta no po o feche a tampa e aperte o bot o lt ZLERO gt Depois que aparecer O zero no display remova a cubeta 3 Calibrar Instrumento Aplique 2 ul da solu o de DNA padr o nos 2 ml de Solu o de Trabalho A Misture com pipetagem v rias vezes Coloque a cubeta no po o feche a tampa e aperte o bot o lt CALIB gt Digite 100 e aperte lt ENTER gt Depois que o valor aparecer no display remova a cubeta 4 Zerar o instrumento Retire a cubeta esvazie e limpe Seque a cubeta sobre len o de papel Adicione 2 ml da Solu o de Trabalho A baixa concentra o Insira a cubeta no po o e feche a tampa e aperte o bot o lt ZERO gt Depois que aparecer O zero no display remova a cubeta 5 Ler amostra Adicionar 2 ul da amostra e misture bem Coloque a cubeta no po o e feche a tampa e registre a leitura 6 Ler as amostras subseqiientes Repetir os passos 4 e 5 para cada amostra Importante Ligue o instrumento 15 minutos para estabilizar a l mpada antes de medir Use luvas pois o corante pode ser mutag nico Todas as solu es devem estar temperatura ambiente antes de medir a fluoresc ncia Preparar a solu o de trabalho fresca para uso do dia Filtrar o tamp o TNE antes de acrescenta
13. 8 85 7295 078 7 4 Pipetar o sobrenadante para um novo tubo Adicionar ao sobrenadante etanol 95 gelado o mesmo volume do sobrenadante 3ml Homogeneizar por invers o aparecem as fitas de DNA Centrifugar a 1000rpm 1Omin Remover o lcool e adicionar ao pellet 3ml de etanol 95 gelado Centrifugar a 1000rpm 1Omin Remover o lcool e deixar secar na bancada de um dia para o outro se houver necessidade pode se secar o pellt em estufa a 37 C por aproximadamente 2 horas e ressuspender em seguida No dia seguinte ressuspender o DNA com TE contendo RNAse Levar estufa a uma temperatura de 37 C agitando de 10 em 10min Guardar em geladeira a 4 C at a quantifica o Estocar em freezer Protocolo 2 Whash Buffer 1600 Betamercaptoetanol 1 gota Macerar o material folha meristema at ficar l quido Transferir o macerado para eppendorf de 2ml Centrifugar a 13000rpm a 4 C por 10 min Descartar sobrenadante Adicionar 800ul de CTAB Vortexar at desprender o material do fundo do eppendorf Levar ao banho maria por 30 min Adicionar 800 ul de clorof rmio lcool isoam lico 24 1 Vortexar para homogeneizar Centrifugar a 13000rpm 4 C por 10 min Retirar sobrenadante com micropipeta e transferir pra outro eppendorf j com 800 ul de clorof rmio lcool isoam lico Centrifugar a 1300rpm 4 C por 10 min Transferir sobrenadante e acrescentar 70 ul de acetato de am
14. TIS T FRITSCH E F SAMBROOK J Molecular Cloning A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor NY 1982 SANGER F NICKLEN S COULSON A R DNA sequencing with chain terminating inhibitors Proceedings of the National Academy of Sciences 74 5463 5467 1977 SOUZA A L F amp BRUSAMARELLO L C C Sequenciamento de DNA decifrando o manual de instru es dos seres vivos Gen tica na Escola v 1 p 45 52 2009 Anexos Solu es B sicas para Biologia Molecular Neste item est o descritas algumas solu es de uso corrente na Biologia Molecular Vale ressaltar os cuidados necess rios durante o preparo de solu es Ter sempre solu es estoque com frascos devidamente identificados com pH e data As mesmas devem ser trocadas com aproximadamente 6 meses de preparo Para o preparo das solu es utilizar sempre gua est ril Ap s pesar os reagentes nunca complete imediatamente com gua para o volume final Deve se primeiro corrigir o pH para depois completar o volume Nunca manipular eppendorfs contendo DNA sem luva para evitar a degrada o do mesmo Uma solu o IM P M do reagente para 1 litro de solu o 1 Brometo de et dio 10 mg ml Adicionar lg de brometo de et dio a 100 ml de gua est ril Agitar vigorosamente em agitador magn tico at ter certeza de que o corante esteja dissolvido Armazenar a temperatura ambiente em recipiente de cor escura ou envolvido em folha de alum
15. agens repetidas Encontro Amaz nico de Agr rias Ano 04 N 02 Mar o de 2012 ISBN 978 85 7295 078 7 6 com etanol Pellet de DNA muito grande n o dissolve em tamp o TE ou TBE DNA complexado com outras subst ncias polissacar deos Deixar em temperatura ambiente de um dia para o outro ou aquecer por 65 C por 30 minutos Ap s este per odo quantificar o DNA dissolvido e verificar se a concentra o estimada suficiente para os experimentos a serem desenvolvidos Caso seja transferir o sobrenadante para outro tubo e descartar o pellet n o dissolvido Caso n o seja ressuspender pellet fazer lavagens com NaCl 1 a 5 lavagens repetidas com etanol Eletroforese Po o do gel n o comporta todo o volume da rea o Verifique dimens es do dente do pente utilizado e o volume esperado Verifique o volume e consegiente espessura do gel Verifique se a superf cie onde o gel foi preparado est nivelada Funda novamente a agarose e prepare novo gel adicionando o volume de agarose necess rio ou nivelando a superf cie Visualiza o do gel na luz U V ap s a eletroforese Nada aparece no gel nem mesmo padr o de fragmentos de tamanho conhecido Verifique se o brometo de et dio foi adicionado ao gel e no tamp o de carregamento Caso negativo core o gel por algumas horas em uma solu o dilu da de brometo de et dio 0 5 ug ml com agita o branda Ver
16. as Ano 04 N 02 Mar o de 2012 ISBN 978 85 7295 078 7 14 Figura 3 Exemplo de corrida de marcadores microssat lites em gel de agarose a 3 onde foi usado um primer para nove gen tipos Recursos necess rios Neste item est o descritos os recursos m nimos necess rios para se desenvolver a extra o de DNA gua est ril para o preparo das solu es Agitador magn tico com aquecimento Autoclave Banho maria Balan a eletr nica Centr fuga refrigerada Estufa com temperatura regul vel Freezer 20 C Forno de microondas M quina de fazer gelo em escama Mini cubas para quantifica o de DNA Pipetas autom ticas 20 ul 50 ul 200 ule 1000 ul Potenci metro Refrigerador duplex V rtex Utens lios de laborat rio vidrarias bandejas eppendorfs ponteiras luvas esp tulas tesouras m scaras suporte para eppendorfs 8 ELUI O OU PURIFICA O DE DNA DE GEL DE AGAROSE Este protocolo designado para extrair e purificar DNA de 70pb at 10kb de gel de agarose para posteriormente serem clonados e sequenciados OBS Nesse tipo de procedimento normalmente s o utilizados Kits de extra o e o recomendado que se siga o protocolo de cada fabricante Encontro Amaz nico de Agr rias Ano 04 N 02 Mar o de 2012 ISBN 978 85 7295 078 7 15 Protocolo do fabricante PROMEGA WizardSV Gel and PCR Clean Up System 1 Cortar a banda de DNA do gel de agarose 2
17. as Ap s esse per odo determinar absorb ncia a 600nm da suspens o bacteriana em um espectrofot metro O n mero de c lulas n o deve ultrapassar 108 c lulas mL ou seja Asoo entre 0 3 e 0 4 Importante Os 50 mL de meio LB l quido devem estar em um frasco de 200mL e pr aquecido a 37 C Nas etapas seguintes as c lulas devem permanecer no gelo e as centrifuga es devem ser feitas a 4 C 7 Centrifugar durante 5 minutos a 3000 rpm a 4 C descartar o sobrenadante e inverter o tubo em um papel de filtro previamente esterilizado durante 20 segundos para eliminar tra os de meio 8 Ressuspender cuidadosamente as c lulas em 15 mL da solu o de CaCh 0 1M gelado para cada 50mL de suspens o 9 Centrifugar durante 5 minutos a 3000 rpm a 4 C 10 Ressuspender cuidadosamente as c lulas em 1 mL da solu o de CaCh 0 1M glicerol 10 gelado 11 Distribuir em tubos tipo eppendorf em al quotas de 50 uL transferir imediatamente os tubos para nitrog nio l quido e manter a 70 C at que as c lulas sejam usadas 11 TRANSFORMA O DE ESCHERICHIA COLI POR CHOQUE T RMICO o processo em que ser o introduzidas mol culas de DNA em uma c lula hospedeira c lula competente Na transforma o com cloreto de c lcio ou choque t rmico como mais conhecida as bact rias e o vector contendo o inserto s o misturados com uma solu o de cloreto de c lcio e sofrem um choque t rmico Os ons de c lcio t m a fun o
18. e se a temperatura do banho maria est ajustada a 60 C Agite tubos gentilmente para facilitar o contato do tamp o com o tecido macerado Forma o de fases Ap s a adi o de isopropanol lcool isoam lico e centrifuga o n o ocorre a forma o de Verifique se as concentra es de reagentes utilizadas foram adequadas excesso de espuma indica que o lcool isoam lico n o foi adicionado adequadamente Verifique se o tempo e condi es de centrifuga o foram adequados Precipita o do DNA Rendimento fases Quantidade de DNA precipitado muito pequena rendimento escasso Verifique se o tecido amostra preferencialmente oriundo de partes tenras de plantas jovens Verifique se a propor o inicial de tamp o de extra o e a amostra de tecido foi adequada Verifique se a macera o pulveriza o da amostra de tecido foi completa Novo ciclo de precipita o auxiliada por CTAB pode ser necess ria Utilize condi o de baixa temperatura na etapa de precipita o lcool et lico gelado ambiente de baixa temperatura Verifique se o tempo destinado precipita o foi eficiente Pellet DNA precipitado apresenta colora o escura de DNA contaminado por compostos secund rios pigmentos e ou outras subst ncias oxidadas Repetir as etapas de lavagem do DNA com etanol N o resolvido resuspender e re precipitar o DNA e prosseguir com lav
19. formamida ou DMSO dimetilsulf xido Aliquotar em tubos tipo eppendorf revestidos com papel alum nio para proteger da degrada o pela luz Armazenar a 20 C OBS De acordo com Maniatis et AL solu o de X Gal n o precisam ser esterilizadas 22 Ampicilina 100 mg mL 10 mL Dissolver 100 mg de Ampicilina em 10 mL de gua destilada Esterilizar por filtra o em filtro de 0 22 mm em tubos tipo eppendorf Armazenar a 20 C Encontro Amaz nico de Agr rias Ano 04 N 02 Mar o de 2012 ISBN 978 85 7295 078 7 23
20. gia molecular pois s o pequenos e de f cil manipula o Antes da clonagem em paralelo deve se preparar os insertos o que se deseja clonar DNA gen mico cDNA um gene espec fico etc e o vetor que pode ser de diferentes tipos Importante A quantidade de vetor e inserto ir depender de quantifica o pr via estes dever o ser adicionados a rea o de liga o na propor o de quatro mol culas de inserto para cada uma mol cula de vetor O tamanho dos mesmos tamb m influenciar na rea o de liga o Desta forma deve se atentar para as recomenda es de cada fabricante 10 1 Componentes da rea o Vetor Plasm deo que ir receber o inserto Inserto o fragmento de DNA elu do do gel ap s o procedimento da rea o de PCR Enzima T4 DNA Ligase a enzima que catalisa a rea o de liga o do inserto com o vetor Tamp o prop cia o pH ideal para o funcionamento da enzima Vetor X uL Inserto X uL Tamp o 10X 1 0 uL T4 DNA Ligase 0 5 uL HO X uL Volume final 10uL 10 C LULAS COMPETENTES DE Escherichia coli PARA CHOQUE T RMICO protocolo Manual de Transforma o Gen tica de Plantas A compet ncia natural das bact rias para receber o DNA do meio circundante um fen meno raro verificando se apenas em determinadas esp cies e em condi es fisiol gicas espec ficas Assim necess rio desenvolver essa capacidade ou seja necess rio tornar as c lulas competentes para viabilizar a intr
21. ho do fragmento e da voltagem aplicada durante a eletroforese Vale lembrar que esses fatores s o interligados ou seja uma concentra o inadequada de agarose afetar a mobiliza o das mol culas e assim por diante 3 4 Interpreta o do gel Observe a intensidade das bandas dos gen tipos em rela o intensidade das concentra es padr o de DNA lambda Quando n o se utiliza RNase observa se uma linha de RNA na parte inferior do gel Figura 1 RNA Figural DNA gen mico com presen a de RNA importante avaliar a qualidade do DNA o mesmo n o deve migrar no gel Se os fragmentos de DNA ocorrerem ao longo da linha da canaleta o DNA est degradado Normalmente a degrada o ocorre pelo manuseio e armazenamento inadequado per odo de armazenamento muito longo dentre outros fatores Quanto mais DNA ocorrer ao longo da linha maior a degrada o Amostras de DNA com razo vel degrada o devem ser descartadas figura 2 Encontro Amaz nico de Agr rias Ano 04 N 02 Mar o de 2012 ISBN 978 85 7295 078 7 10 Figura 2 PCR com DNA gen mico degradado 4 DILUI O DO DNA GEN MICO QUANTIFICADO Ap s a quantifica o o DNA dilu do pela f rmula C1 V C2 V2 onde C a concentra o lida de DNA V o volume a ser pipetado do DNA concentrado C a concentra o de trabalho V2 o volume final correspondente entre 500 ul a 1000 ul Exemplo da dilui
22. ificar a concentra o de brometo de et dio utilizada deve ser de 20 ug ml Verifique se o padr o de fragmentos de tamanho conhecido foi adicionado Verifique se a eletroforese n o procedeu por muito tempo com consequente elimina o do DNA do gel Verifique se o DNA n o se encontra retido nos po os de carregamento Concentra o de DNA adicionada ao gel pode ter sido muito baixa Verifique se n o foi adicionado um excesso de TE ou TBE ao pellet de DNA dilundo a solu o excessivamente Amostra de DNA n o sai do po o de carregamento do gel DNA anda contaminado polissacar deos Aparece arraste vertical ao inv s de banda Isto ocorre quando se usa gua no lugar de tamp o TBE ou comete se erros na dilui o Encontro Amaz nico de Agr rias Ano 04 N 02 Mar o de 2012 ISBN 978 85 7295 078 7 7 caracter stica de DNA intacto do tamp o TBE durante o preparo do gel de eletroforese Banda nica de DNA intacto presente mas ocorre arraste vertical em dire o ao p lo positivo DNA de baixa qualidade desnaturado Obter amostra de boa qualidade Banda nica de DNA intacto presente mas ocorre arraste vertical com banda de intensa colora o na parte inferior menor comprimento DNA n o foi tratado com RNAse ou RNAse inativa Tratar com nova RNAse e correr outro gel antes de iniciar experimentos de an lise de DNA Visuali
23. liza o do mesmo em t cnicas moleculares Neste aspecto a qualidade e integridade do DNA s o fundamentais para o sucesso nas etapas posteriores Existem diferentes protocolos de extra o de DNA que variam em fun o da esp cie e do tecido a ser utilizado A maneira de coletar e acondicionar o tecido assim como o estado do mesmo fundamental para o sucesso da extra o Um dos aspectos importantes para o desenvolvimento das t cnicas moleculares a quantidade de DNA necess ria nas rea es que varia em fun o da t cnica molecular a ser utilizada No caso de uma rea o de RAPD Random Amplified Polymorphic DNA por exemplo s o necess rios somente alguns nanogramas de DNA enquanto para an lise de RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism s o necess rias quantidades de DNA na ordem de microgramas Normalmente os componentes da solu o de extra o variam de acordo com o protocolo utilizado sendo que cada solu o deve conter um tamp o para estabilizar o pH um sal para dissociar as prote nas um detergente para solubilizar as membranas e um agente inativante das DNAses cuja fun o proteger o DNA gen mico Ap s a extra o torna se necess rio quantificar o DNA para verificar a quantidade e a ocorr ncia de degrada o no mesmo Entre as t cnicas dispon veis para estimar a concentra o de DNA as mais utilizadas s o a leitura em espectrofot metro e a an lise comparativa em gel de agarose corado com br
24. miss o colocado em frente ao fotodetector permite apenas fluoresc ncia de 460 15 nm a ser detectada Portanto a fluoresc ncia medida um indicador direto de concentra o de DNA A medida de fluoresc ncia n o uma unidade absoluta e sim relativa a um branco e a um padr o com concentra o conhecida 1 Preparar as solu es necess rias para o ensaio e a solu o DNA padr o calf thymus DNA SOLU ES ESTOQUES Tamp o 10 X TNE Solu o Estoque 100 mM Tris 10 mM EDTA 2 M NaC 100 ml 1 211 g de Tris base PM 121 14 0 372 g de EDTA sal diss dico dihidratado PM 372 20 11 689 g de NaCl Completar volume at 80ml com gua mQ HCI concentrado at pH 7 4 com HCI concentrado Completar volume at 100 ml Filtrar antes do uso 0 45 um Armazenar a 4 C por at 3 meses Solu o de Corante Hoescht 33258 1 mg ml USE M SCARA E LUVAS Hoescht 33258 10 mg Agua mQ 10 ml N o filtrar Armazenar a 4 C por at 6 meses protegendo da luz Padr o de DNA calf thymus 100 ug ml Solu o estoque Ing ul de padr o 100 ul 10 x TNE 100 ul Agua mQ 800 ul Solu o de Trabalho 1 X TNE Baixa concentra o A Concentra o final do DNA a medir entre 10 a 500 ng ml 0 1 ug ml de H 33258 em 1 X TNE 0 2 M NaCl 10 mM Tris base 1 mM EDTA pH 7 4 Solu o estoque de H 33258 10 ul Encontro Amaz nico de Agr rias Ano 04 N 02 Mar o de 2012 ISBN 978 85 7295 078 7
25. nha Tris de melhor qualidade O pH da solu o de Tris dependente da temperatura e decresce aproximadamente 0 03 unidades de pH para cada aumento de 1 C de temperatura Por exemplo Uma solu o de 0 05 molar tem valores de pH 9 5 8 9 e 8 6 a 5 C 25 C e 37 C respectivamente Encontro Amaz nico de Agr rias Ano 04 N 02 Mar o de 2012 ISBN 978 85 7295 078 7 22 17 Meio de cultura LB 1 litro Dissolver 10g de triptona 5g de extrato de levedura e 10g de Cloreto de s dio NaCl em 800mL de gua destilada Ap s completamente dissolvido completar o volume para 1L e esterilizar o meio em autoclave durante 20 minutos a 121 C Para meio s lido acrescentar 16g L de Agar 18 CaCb0 1M 100 mL Dissolver 1 47g de CaCh 2H50 ou 1 11g de CaCl anidro em 90mL de gua destilada Completar o volume at 100mL e esterilizar por autoclavagem 19 CaCl 0 1M Glicerol 10 100 mL Dissolver 1 47g de CaCh 2H50 ou 1 11g de CaCl anidro em 50mL de gua destilada Adicionar 10mL de glicerol Completar o volume at 100mL e esterilizar por autoclavagem 20 IPTG 100 mM PM 238 3 Thiogaloctoside isoprop lico ou beta thiogalactopyranoside D 10 mL Dissolver 0 238 de IPTG em 10 mL de gua destilada Esterilizar por filtra o em filtro de 0 22 mm em tubos tipo eppendorf Armazenar a 20 C 21 X Gal 20 mg mL 5 bromo 4 cloro 3 indolil p D galactopiranosideo 10 mL Dissolver 200mg de X Gal em 10 mL de dimetil
26. nio Obs O brometo de et dio um poderoso mutag nico e moderadamente t xico Durante o uso deste produto ou solu o que o contenha recomend vel o uso de luvas e para a pesagem deve se utilizar m scaras apropriadas Ap s o uso deste produto todos os recipientes devem ser descontaminados utilizando se m todos apropriados 2 Bromophenol blue Azul de bromofenol Tamp o de carregamento 10 ml Adicionar 0 042 g de azul de bromofenol a 7 0 ml de TAE 1x e 3 0 ml de glicerol Estocar a temperatura ambiente Encontro Amaz nico de Agr rias Ano 04 N 02 Mar o de 2012 ISBN 978 85 7295 078 7 20 3 Clorof rmio lcool Isoamil 24 1 Juntar 24 partes de Clorof rmio a uma parte de lcool isoamil 4 CTAB brometo de hexadeciltrimetilamonio 20 100 ml Adicionar 20 g de CTAB a 80 ml de gua est ril Aquecer at 60 80 C para facilitar a dissolu o Ajustar o volume para 100 ml com gua est ril N o necess rio esterilizar Armazenar a temperatura ambiente 5 Etanol 70 1000 ml Diluir 736 8 ml de lcool comercial a 95 em 263 20 ml de gua est ril 6 EDTA dissodium ethylenediaminetetra acetate 2H 0 0 5 M 1 0 litro Adicionar 186 1 g de dissodium ethylenediaminetetra acetate 2H gt 50 EDTA a 800 ml de gua est ril Agitar vagarosamente em agitador magn tico Mantendo a solu o sobre o agitador magn tico ajustar o pH para 8 0 com a adi o de NaOH aproximadamente 20 g de NaOH peletizada O
27. o gel de agarose em concentra o de 3 A concentra o maior utilizada para permitir que haja separa o de produtos com menor diferen a de tamanho j que alelos de locos de microssat lite podem variar em apenas um par de nucleot deos Entretanto mesmo a uma alta concentra o de agarose n o poss vel obter esse n vel de discrimina o e por isso a maioria das an lises de marcadores microssat lites feita em gel vertical de poliacrilamida A corrida em gel de agarose pode ser usada na fase de sele o de primers pois assim poss vel baratear uma fase da an lise de microssat lites A interpreta o dos g is feita da seguinte forma alelos com o mesmo padr o de migra o s o considerados iguais e cada alelo recebe um c digo O n mero m ximo de alelos a ser observado por individuo depende da ploidia da esp cie e do n vel de endogamia dos materiais No gel da Figura 3 pode se considerar que h diferentes alelos pelo seu diferente padr o de corrida e que apenas os indiv duos 2 e 5 s o heterozigotos A quantidade de locos ou primers microssat lites a serem analisados depende da caracter stica da esp cie e principalmente do n vel de variabilidade dos gen tipos esp cies com base gen tica mais estrita precisam ser analisadas com mais primers De posse da base de dados obtida da interpreta o dos g is s o realizadas as an lises de acordo com os objetivos da pesquisa Encontro Amaz nico de Agr ri
28. ocesso de extra o torna se necess rio proceder quantifica o para verificar a quantidade de DNA obtida que uma etapa fundamental para a efici ncia da rea o de PCR rea o de polimerase em cadeia e seus variantes Este procedimento necess rio porque a concentra o de DNA inadequada implicar em falhas nas etapas subsegiientes O DNA em excesso na rea o RAPD pode resultar na falha completa da rea o devido alta concentra o de impurezas agregadas ou perfis eletrofor ticos com arraste e bandas pouco definidas Por outro lado a baixa concentra o de DNA resultar em amplifica o errada ou n o amplifica o de certos segmentos com perfis de eletroforese n o reproduz veis Ferreira amp Grattapaglia 1995 Vale ressaltar que a quantidade de DNA obtida varia em fun o do genoma e da efici ncia do protocolo de extra o utilizado Ap s a quantifica o e qualifica o do DNA devem ser feitas solu es de trabalho adequadas concentra o exigida no protocolo que ser utilizado 3 1 Dilui o do DNA lambda Geralmente utiliza se como padr o o DNA lambda intacto fazendo a dilui o para uma concentra o de trabalho E importante que se aplique no gel quantidades crescentes de DNA padr o que cubram o intervalo de concentra o no qual espera se que as amostras se enquadrem Exemplo de dilui o do DNA lambda sem corte Concentra o estoque do DNA lambda 458ug ml verificar a concentra
29. odem ser obtidas em fornecedores comerci veis Os vetores funcionam como um ve culo que transporta o gene para o interior da c lula Encontro Amaz nico de Agr rias Ano 04 N 02 Mar o de 2012 ISBN 978 85 7295 078 7 16 hospedeira c lula competente que normalmente uma bact ria embora outras c lulas vivas possam ser utilizadas O vetor de clonagem possui elementos que permitem sua autorreplica o bem como alguns genes marcadores resist ncia a antibi ticos que servem para sele o das bact rias que receberam o vetor Dentro da c lula hospedeira o vetor multiplica se produzindo v rias c pias id nticas de si pr prio e do fragmento de DNA inserto ligado a ele Ap s v rias divis es celulares cada c lula cont m uma ou mais c pias da mol cula de DNA recombinante Este DNA isolado e est pronto para ser sequenciado Souza amp Brusamarello 10 REA O DE LIGA O VETOR INSERTO O protocolo mais tradicional para clonagem molecular consiste em ligar os dois fragmentos de DNA utilizando a enzima T4 DNA Ligase que catalisa liga es fosfodi ster ou seja catalisa a liga o covalente entre dois fragmentos de DNA Os vetores de clonagem ou plasm deos s o mol culas de DNA circular extra cromossomais que servem como ve culo que transporta o gene de estudo para o interior de uma c lula hospedeira geralmente uma bact ria carregando consigo informa es gen ticas Estes DNAs s o muito utilizados em biolo
30. odu o do DNA recombinado rDNA no hospedeiro selecionado Ao processo de entrada de DNA livre isto DNA em solu o fora do inv lucro celular na c lula d se o nome de transforma o Dentro da c lula hospedeira o vetor Encontro Amaz nico de Agr rias Ano 04 N 02 Mar o de 2012 ISBN 978 85 7295 078 7 17 multiplica se produzindo numerosas c pias id nticas n o s de si pr prio mas tamb m do gene que transporta Quando a c lula hospedeira se divide a sua descend ncia recebe c pias das mol culas de DNA plasmidial continuando depois a replica o dos vetores Ap s um grande n mero de divis es celulares produzido uma col nia ou clone de c lulas hospedeiras id nticas Cada c lula no clone cont m uma ou mais c pias da mol cula de DNA recombinante O gene transportado pela mol cula recombinante agora conhecido como sendo clonado Protocolo Importante Todo o procedimento deve ser feito em fluxo laminar l Com o aux lio de uma al a de platina estriar de uma suspens o bacteriana crescida por 16 horas em uma placa de petri contendo meio LB 2 Incubar durante 16 horas a 37 C 3 Transferir uma col nia isolada para tubo contendo meio LB l quido agitar suavemente para dispersar a col nia no meio 4 Incubar durante 16 horas a 37 C sob agita o de 250 rpm 5 Transferir ImL da suspens o bacteriana para 50mL de meio LB 6 Incubar a 37 C sob agita o de 250 rpm por 2 a 2 5 hor
31. ometo de et dio Este trabalho tem como objetivo descrever algumas das metodologias de biologia molecular utilizadas no Laborat rio de Gen tica da Embrapa Amaz nia Oriental LABGEN e Laborat rio de Fitopatologia visando identifica o classifica o e conserva o de recursos gen ticos levando se em considera o as peculiaridades observadas uma abordagem pr tica sendo que os protocolos apresentados s o pass veis de altera o pelo usu rio conforme as particularidades do seu trabalho e necessitam do m ximo de crit rio para a execu o 1 Pesquisadora Dra Gen tica e Biologia Molecular Embrapa Amaz nia Oriental Cx Postal 48 Bel m PA mrco Ocpatu embrapa br 2 Analista Dra Gen tica e Biologia Molecular Embrapa Amaz nia Oriental Cx Postal 48 Bel m PA kenny Ocpatu embrapa br 3 Graduando em Ci ncias Biol gicas pela Universidade Federal do Par Bolsista Laborat rio de Gen tica Embrapa Amaz nia Oriental svn live hotmail com 2 EXTRA O DE DNA No processo de caracteriza o gen tica das esp cies utilizando se t cnicas moleculares uma das etapas principais a extra o de DNA j que qualquer problema na mesma compromete os passos subsegiientes Por outro lado o xito nesta etapa depende de v rios fatores como a adequa o do protocolo a qualidade do material usado no processo de Encontro Amaz nico de Agr rias Ano 04 N 02 Mar o de 2012 ISBN 978 85 7295 078 7 3
32. r o corante 6 MICROSSAT LITES 6 1 Componentes da rea o DNA molde a amostra de DNA dos indiv duos a serem analisados Enzima Taq DNA polimerase a enzima que catalisa a rea o de amplifica o do DNA molde Tamp o prop cia o pH ideal para o funcionamento da enzima MgCh atua como co fator da enzima e sua concentra o influencia a reproducibilidade da t cnica pois afeta a efici ncia de amplifica o da enzima Primer uma segii ncia de nucleot deos e que ao se anelar por complementariedade de bases serve como iniciador da rea o de amplifica o Usa se um par de primers um para a sequ ncia forward e outra para a sequ ncia reverse que podem estar separados ou usados em conjunto Oligonucleot deos ANTPs s o os nucleot deos constituintes do DNA Adenina Guanina Citosma e Timina que s o incorporados segii ncia do primer durante a rea o de amplifica o Encontro Amaz nico de Agr rias Ano 04 N 02 Mar o de 2012 ISBN 978 85 7295 078 7 13 gua usada para completar o volume da rea o BSA Ou albumina bovina s rica funciona como estabilizador da rea o Usa se de 10 a 100ug ml 6 2 Protocolo gua 6 4 ul Tamp o 2 ul MgChb 0 4 ul DNTP 3 ul DNA 3 ul BSA 3 ul Primer forward Primer reverse 2 ul Taq 0 2 ul Total 17 ul de mix e 03 ul de DNA 7 PREPARO DO GEL Para a eletroforese dos produtos gerados por microssat lites ser utilizad
33. u rios 10 Literatura Consultada FERREIRA M E GRATTAPAGLIA D Introdu o ao uso de marcadores moleculares em an lise gen tica Bras lia EMBRAPA CENARGEN 1996 220p COSTA M R Jose Luis Vega Pla PEDRO PABLO MARIA IRACILDA DA CUNHA SAMPAIO COSTA M R JUAN VICENTE DELGADO BERMEJO Variabilidad gen tica de caballos brasile os REVISTA DE SANIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS DE ESPA A V 61 p 221 222 2005 COSTA M R MARQUES J R F Jose Luis Vega Pla JUAN VICENTE DELGADO BERMEJO MARIA IRACILDA DA CUNHA SAMPAIO PEDRO PABLO VARIABILIDADE GEN TICA DE EQUINOS DA AMAZ NIA BRASILEIRA Biotecnologia Ci ncia amp Desenvolvimento Online v 35 p 48 51 2005 ALBUQUERQUE M S M EGITO A A MARQUES J R F ANA CIAMP MARIANTE A S COSTA M R CASTRO PAIVA CONTEL SILVA VARIABILIDADE GEN TICA EM B FALOS DETERMINADA POR MARCADORES RAPD Pesquisa Agropecu ria Brasileira v 41 p 623 628 2005 COSTA M R Caracteriza o gen tica de egii deos da ra a marajoara por microssat lites Tese de doutorado Universidade Federal do Par 2007 93p Encontro Amaz nico de Agr rias Ano 04 N 02 Mar o de 2012 ISBN 978 85 7295 078 7 19 DOYLE amp DOYLE 1987 modificado por Patroc nio E 2007 Protocolo para Extra o de DNA em Tecido Vegetal FERREIRA M E GRATTAPAGLIA D Introdu o ao uso de marcadores RAPD e RFLP e an lise gen tica Bras lia EMBRAPA CENARGEN 1995 pp 220 MANIA
34. za o do gel na luz U V ap s a eletroforose Arraste intenso na parte central da banda nica de DNA intacto e fraco nas laterais Eletroforose submarina foi conduzida com imers o insuficiente do gel i e pouco volume de tamp o recobrindo gel o que criou um gradiente de temperatura corra novamente certificando se de que se tenha pelo menos 1 5 cm de tamp o recobrindo o gel para cobrir o gel que trabalham com corrente elevada por muito tempo e portanto mais sujeitas a aquecimento excessivo Ap s a fotografia do gel de eletroforese Fotografia polaroid excessivamente clara ou escura Repita a fotografia alterando o tempo de exposi o e ou a abertura utilizada Gel aparece fora de foco Repita a fotografia focalizando cuidadosamente a superf cie superior do gel sob luz branca com algo escrito Verifique o estado e limpeza das lentes da c mera fotogr fica utilizada Verifique se o gel n o se movimentou durante a fotografia em fun o da pel cula de l quido entre o gel e o trasiluminador 2 5 Componentes b sicos do tamp o Tris Hcl estabiliza o pH por volta de 8 0 NaCl auxilia na dissocia o de prote nas SDS atua como detergente para solulibilizar as membranas EDTA atua como agente inativante de DNAses 3 QUANTIFICA O VISUAL DE DNA EM GEL DE AGAROSE Encontro Amaz nico de Agr rias Ano 04 N 02 Mar o de 2012 ISBN 978 85 7295 078 7 8 Ap s o pr
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