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Volume 2

1. Cod E iai Membrana de di Osmose Revers RO Figura 2 Esquema do principio da osmose e da osmose reversa Suponhamos que dispomos de um tubo em forma de U com seus dois ramos separados por uma membrana de osmose No ramo esquerdo temos gua com mol culas dissolvidas representadas por pontos De acordo com as leis termodin micas as mol culas iriam se difundir do lado esquerdo para o direito at que suas concentra es ficassem equivalentes Por m estas mol culas n o conseguem atravessar a membrana mas as mol culas de gua sim Dessa forma a gua atravessar 14 de 29 pr prio laborat rio ou em prestadores de servi o Volume II M dulo 2 gua para An lises Qu micas Instrumentais a membrana a partir do ramo direito em dire o ao esquerdo para diluir as mol culas dissolvidas Esse processo continuar at gerar um diferencial de press o press o osm tica entre os ramos equilibrando assim a diferen a de concentra es A osmose reversa exatamente o oposto desse processo a gua contendo ons ou outros contaminantes pressurizada contra uma membrana de osmose reversa e obt m se gua pura no outro lado da membrana press o exercida deve ser superior press o osm tica Membranas de osmose reversa rejeitam tipicamente 90 dos ons monovalentes 95 dos bivalentes e 99 dos polivalentes S o rejeitad
2. 8 2 Condi es ambientais da sala de teste 8 3 Operador 8 4 Ponteiras 8 5 Equipamentos utilizados no teste 8 6 O procedimento de verifica o 9 ANEXO III PROCEDIMENTOS DE DESCONTAMINA O iiit 38 91 9 2 9 3 9 4 95 9 6 9 7 9 8 10 ANEXO IV DEFINI ES 11 GLOSS RIO E ABREVIA ES EREE E AEO A EE Sd R nas 39 Microbiologia e cultura celular Qu mica Biologia molecular Espectro de a o dos m todos me Vantagens e desvantagens Autoclavagem Irradia o UV Solu es Qu Bnicas apeten nnen A NA N ONAE AAEN A EAE O EE EA EENE N 50 ns A E A AT AT 51 12 REFER NCIAS BIBLIOGR FICAS ii itteeeeeseaeseeeeameseesemrsttraa 52 Volume II M dulo 1 Micropipetas Fundamentos e Opera o BR 1 DEFINI O Pipetas operadas por pist o s o equipamentos para aspirar e dispensar volumes espec ficos de l quidos As pipetas de um nico canal possuem apenas um pist o J as pipetas de m ltiplos canais possuem uma s rie de recept culos simultaneamente As pipetas podem ser ajustadas na f brica para dispensar um dado volume ou dispensar volumes selecionados pelo usu rio dentro de uma faixa de volume espec fica por exemplo entre 10 uL e 100 uL As pipetas operadas por pist o podem ser de dois tipos deslocamento de ar e deslocamento positivo 1 1 Tipos de pipet
3. Mau ajuste ou montagem incorreta do vol metro Algumas pipetas podem ser autocla as e outras n o Consulte o manual do fabricante Como vol metro ajustado no valor m ximo especificado para o modelo da pipeta pressione o bot o por todo o curso para verificar a facilidade do movimento sentindo eventuais obst culos ou varia es na fric o o que pode revelar danos como corros o no pist o ou barra de opera es torta Ou a o barulho da mola o que pode indicar seu posicionamento incorreto Problemas e cansas Movimento irregular Anel de fric o danificado N o deslocamento Barra de opera es torta Movimento inadequado Pist o corro do sujo ou riscado Encaixe uma ponteira na pipeta e pressione o bot o do ejetor de ponteiras para verificar a efic cia da eje o Sem movimento Mecanismo de eje o com problema Encaixe indevido da ponteira jetor n o colocado corretamente Dif cil de retirar orros o 3 ETAPA TESTE DO VAZAMENTO Para pipetas que tenham um volume m ximo maior do que 200 ul acerte seu volume no valor m ximo e aspire gua para encher a ponteira da pipeta Observe a ponteira por 20 segundos Se pire gua pi Pp pp P p B aparecer uma gota na ponta da ponteira significa que h vazamento Isto tamb m verdadeiro para pipetas com faixas de volume abaixo de 200uL mas par
4. Para garantir a obten o de resultados confi veis e reprodutivos e estar em conformidade com os requerimentos de Qualifica o de Instala o IQ necess rio que se verifique as condi es que se tem no local para executar a instala o Para isso podemos citar as seguintes condi es Rede el trica necess rio verificar se a rede el trica possui a voltagem apropriada para a especifica o do equipamento A estabiliza o da rede e a posi o dos pinos da tomada fase invertida devem ter aten o especial pois ambas podem influir na opera o e vida til do equipamento Condi es ambientais O instrumento deve ser instalado somente se no local houver condi es devidas de Umidade e Temperatura para o seu funcionamento Al m disso condi es de seguran a devem ser observadas como a proximidade de agentes inflam veis e corrosivos Pureza dos Gase Devem estar de acordo com as necessidades do sistema cromatogr fico principalmente em rela o aos detectores Filtro de Gases Devem ser utilizados para garantir a qualidade dos gases utilizados e das linhas de gases do sistema Devem ser trocados periodicamente Reguladores de Press o Devem garantir as press es m nimas de trabalho especificadas do equipamento Tamb m devem ter dispositivos de seguran a como duplo est gio e diafragmas met licos Conhecimento operacional do equipamento Para a utiliza o correta do equipamento Tabel
5. O comprometimento do usu rio em se submeter a todas as etapas solicitadas A realiza o dos testes de desempenho de acordo com o fabricante do instrumento para assegurar que o instrumento esteja em plenas condi es de funcionamento 65 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica 6 1 4 PQ Qualifica o de desempenho A PQ cons est o de acordo com a necessidade para uso Esta deve ser rigorosa envolvendo testes necess rios e na realiza o de atividades que comprovem que todas as especifica es do instrumento para demonstrar a funcionalidade do instrumento e deve conter detalhes como Testes espec ficos para componentes individuais ou sistema completo Rela o de testes Frequ ncia dos testes Resultados esperados Crit rio de aceita o Como os testes s o documentados Qualifica o necess ria do operador A es em caso de falha nos testes Para algumas t cnicas de instrumenta o anal tica existem rotinas definidas em literatura internacionalmente reconhecida como a EP BP Farmacop ia Europ ia USP Farmacop ia Americana dentre outras que estabelecem par metros a serem determinados a fim de validar um sistema anal tico que poder o ser utilizados pelo usu rio sendo estes muitas vezes executados por fabricantes de instrumentos anal ticos Estaremos abordando os procedimentos normalmente utilizados para Verifica o de Desempenho das
6. um terceiro recipiente que recolher as al quotas que n o ser o pesadas Recomenda se que especialmente para o teste do menor volume da pipeta a propor o m dia entre o di metro e a altura do recipiente para pesagem seja 3 1 ou que o recipiente tenha tampa Algumas empresas fornecem kits de recipientes adequados realiza o do teste gravim trico 8 5 4 gua No teste utiliza se gua destilada ou deionizada nos dois casos deve ser degaseificada gua grau 3 conforme a Norma ISO 3696 temperatura da sala onde ser feita a verifica o Para evitar flutua es 26 de 53 Volume II M dulo 1 Micropipetas Fundamentos e Opera o na temperatura da gua use um recipiente de origem que seja suficientemente grande pois este deve conter gua suficiente para a realiza o de todas as medidas 8 6 O procedimento de verifica o A verifica o da performance analisa tanto a exatid o erro sistem tico como a precis o erro aleat rio Condi es procedimentos e qualifica es previamente descritas neste documento devem ser implantados para garantir a validade dos resultados dos testes Ap s rinsar a ponteira fa a 10 pesagens individuais para cada volume selecionado Para as pipetas de volume vari vel tr s volumes diferentes devem ser selecionados de acordo com a faixa de volume do modelo que est sendo avaliado Estes volumes devem ser o volume nominal m ximo 50 do volume nominal
7. 53 de 53 Manual de Boas Pr ticas em Biodisponibilidade Bioequival ncia Volume Il M dulo 2 Agua para An lises Qu micas E FCA TECNICA Volume II M dulo 2 gua para An lises Qu micas Instrumentais Editor Jos Muradian Filho Millipore Coordena o Cl udia Franklin de Oliveira ANVISA Itapuan Abimael da Silva ANVISA Karen de Aquino Noffs Brisolla ANVISA Karla de Ara jo Ferreira ANVISA Marcelo Cl udio Pereira ANVISA Max Weber Marques Pereira ANVISA Renato Almeida Lopes ANVISA BRR SUM RIO 1 GUA PARA AN LISES QU MICAS INSTRUMENTAIS 1 1 Introdu o 1 2 Os contaminantes da gua 1 2 1 Compostos inorg nicos dissolvidos 1 2 2 Compostos org nicos dissolvidos 1 2 3 Part culas e col ides 1 2 4 Microorganismos 1 2 5 Gases dissolvidos 1 3 Monitoramento e controle da qualidade da gua purificada 1 3 1 Monitora o de contaminantes i nicos inorg nicos condutividade e re 1 3 2 Monitora o de contaminantes org nicos TOC ou COT carbono oxid vel total 10 1 4 Especifica es de qualidade 1 5 Tecnologias de purifica o de gua para laborat rios 1 5 1 Destila o 1 5 2 Deioniza o 1 5 3 Osmose reversa 1 1 5 5 Ultrafiltra o 4 Eletrodeioniza o cont
8. 9 8 1 Descontamina o do porta cone ejetor de ponteiras e porca de conex o Seguem dois exemplos de solu es qu micas e seus protocolos Hipoclorito de s dio O Hipoclorito de s dio possui uma larga atividade antimicrobiana a o antibactericida r pida e tamb m denatura proteases DNA e RNA Al m disso um agente qu mico f cil de utilizar n o t xico nas concentra es utilizadas e possui baixo custo muito importante limpar a pipeta com um detergente como por exemplo Mucapur antes de realizar a desinfec o com hipoclorito de s dio pois o m todo pode perder sua efici ncia na presen a de altas concentra es de material org nico Limpeza Remova o ejetor de ponteiras desrosqueie a porca de conex o e remova o pist o do porta cone Dilua o detergente com gua quente a 50 60 C em a Um banho de ultra som ou em b Um b quer Coloque o porta cone o ejetor de ponteiras e a porca de conex o a No banho de ultra som por 15 min ou b No b quer as pe as devem ser escovadas Retire as pe as e enx gue bem Antes de descartar a solu o de limpeza adicione hipoclorito de s dio 10 solu o e deixe agir por 10 minutos Este procedimento para que a solu o de limpeza seja descontaminada antes de entrar em contato com a rede de gua local Desinfec o Dilua o hipoclorito de s dio em gua destilada a uma concentra o de 10 e coloque em um b
9. Altas vaz es s o obtidas a baixas press es e Reten o na superf cie pode estar sujeita obstru o ou entupimento e Efici ncia independente da vaz o principal vantagem dos filtros de membrana a remo o de 100 de todos os contaminantes com tamanho superior ao do seu di metro de poro As membranas com poro de 0 22 um de di metro s o usadas na ind stria farmac utica h muitos anos para filtra o esterilizante de solu es 1 5 7 Carv o ativado O carv o ativado usado principalmente pela sua capacidade de adsor o de materiais org nicos devido a sua grande rea superficial at 1000 m g Outra fun o a redu o de oxidantes como o cloro livre presentes na gua e que poderiam afetar membranas de osmose reversa ou resinas de troca i nica Trata se portanto de uma tecnologia voltada principalmente para o pretratamento e a prote o de outras etapas CARV O ATIVADO Vantagens Desvantagens e Remo o efetiva de uma ampla gama de e Muito pouco efeito sobre outros subst ncias org nicas mesmo de baixo contaminantes exceto algumas part culas peso molecular por liga o n o espec fica removidas por filtra o em profundidade for as de Van der Waals e Quando todos os s tios est o ocupados estabelece se o equil brio e os org nicos s o liberados e Bact rias podem se desenvolver ap s algum tempo e Grande capacidade devido a grande rea E
10. 9 92 V7 9 97 W8 9 93 V8 9 98 w9 9 95 V9 10 00 W10 9 92 V10 9 97 7 C lculo do volume m dio V 9 89 9 95 9 96 9 91 9 92 9 95 9 97 9 98 10 00 9 97 10 V 9 95 uL 8 An lise da exatid o Erro sistem tico E B V Vo Vo o valor ajustado na pipeta volume nominal Neste exemplo equivale a 10uL E 9 5 10 E 0 05 uL Erro relativo E E V Vo x 100 Vo E 0 05 100 10 E 0 50 9 An lise da precis o repetibilidade erro aleat rio Desvio padr o DP 36 de 53 Volume II M dulo 1 Micropipetas Fundamentos e Opera o DP 1 9 x 9 89 9 95 9 95 9 95 9 96 9 95 9 91 9 95 9 92 9 95 9 95 9 95 9 97 9 95 9 98 9 95 10 00 9 95 9 97 9 95 DP 0 03 uL Coeficiente de varia o CV CV DP V x 100 CV 0 03 9 95 x 100 CV 0 34 10 Colocamos os resultados no relat rio item 8 6 5 Volume 10 uL m mg V UL Pesagem 1 9 84 9 89 Pesagem 2 990 995 Pesagem 3 9 91 9 96 Pesagem 4 9 86 9 91 Pesagem 5 9 87 9 92 Pesagem 6 9 90 9 95 Pesagem 7 9 92 9 97 Pesagem 8 9 93 9 98 Pesagem 9 9 95 10 00 Pesagem 10 9 92 9 97 Volume m dio 9 95 V pL Exatid o V Vo 0 05 Exatid o 0 51 Precis o DP 0 03 Precis o CV 0 34 Na tabela 1 item 8 6 4 temos as seguintes especifica
11. Destila o Deioniza o Osmose Reversa Eletrodeioniza o Cont nua EDI e Ultrafiltra o e Microfiltra o em membrana Carv o Ativado Radia o Ultravioleta 1 5 1 Destila o A destila o um processo cl ssico de purifica o de gua que utiliza a mudan a de fase da gua de l quida para vapor com condensa o para fase l quida Nesse processo muitos contaminantes s o removidos mas ainda assim n o poss vel obter gua ultrapura tipo I utilizando se a destila o Subst ncias org nicas de baixo ponto de ebuli o tamb m passam para a gua destilada Formam se tamb m misturas azeotr picas e at compostos de alto peso molecular s o arrastados com o vapor Al m disso quando o cloro reage com compostos org nicos naturais a altas temperaturas formam se compostos organoclorados que s o igualmente carreados pelo vapor A s lica extra da de destiladores em vidro assim como ocorre com outros ons em destiladores met licos Al m disso o processo de destila o consome grande quantidade de energia e tem um consumo igualmente alto de gua para resfriamento DESTILA O Vantagens Desvantagens e Remove uma grande porcentagem de todos os e Nem todos contaminantes s o removidos e tipos de contaminantes diversos deles s o gerados durante o processo e Produz gua com resistividade entre 0 2 e 1 e N o h controle da qualidade da gua Megohm cm e Inve
12. OBSERVA O Recomendamos que as etapas de 1 a 3 sejam feitas diariamente antes do in cio dos trabalhos e registrados para controle do laborat rio Se forem constatadas anormalidades se deve realizar as etapas 4 e 5 Algumas pe as podem ser trocadas pelo pr prio usu rio sem comprometer a calibra o do instrumento Outras ap s troca exigem a verifica o da calibra o do instrumento e eventualmente ajust lo Esta informa o consta no manual de instru es da pipeta 5 3 Verifica o da performance Para garantir medidas confi veis al m dos procedimentos de limpeza e trocas de pe as o usu rio necessita verificar a performance da pipeta Esta verifica o analisa tanto a exatid o erro sistem tico como a precis o erro aleat rio A verifica o da performance na realidade avalia o conjunto pipeta ponteira operador t cnica de pipetagem Para obtermos resultados confi veis no teste o operador deve ser treinado e qualificado t cnica de pipetagem descrita no cap tulo 3 e as ponteiras devem ser as recomendadas pelo fabricante da pipeta O usu rio deve estabelecer uma freq ncia de teste para suas pipetas com base em necessidades em termos de exatid o e precis o frequ ncia de uso n mero de usu rios para uma mesma pipeta n mero de ciclos em cada utiliza o da pipeta e a natureza dos l quidos pipetados No anexo H descrevemos o m todo gravim trico para avalia o da performa
13. espec ficos contidos no manual 5 2 Troca de pe as Algumas pe as da pipeta t m que ser trocadas periodicamente pois sofrem desgaste e influenciam diretamente a performance da pipeta 5 2 1 Selo s de veda o do pist o Esta s pe a s faz em a veda o entre o pist o e o porta cone na parte superior Devido ao uso se formam microvilosidades na superf cie destas pe as e a veda o deixa de ser perfeita levando a perda de precis o do instrumento Esta s pe a s deve ser trocada s uma vez ao ano consulte o procedimento para troca no manual do fabricante 5 2 2 Porta cone Outro ponto de veda o importante a regi o de contato entre o porta cone e a ponteira Devido ao uso ocorre desgaste da superf cie do porta cone na regi o de encaixe com a ponteira e o contato entre eles se torna deficiente o que prejudica a medida perda de precis o A troca deve ser feita 17 de 53 Volume II M dulo 1 Micropipetas Fundamentos e Opera o sempre que se observar desgaste da regi o de encaixe com a ponteira ou danos na pe a quebra lasca Consultar o manual do fabricante para verificar se o procedimento afeta ou n o a calibra o do instrumento 5 2 3 Outras pe as Outras pe as influenciam na performance da pipeta Abaixo descrevemos um procedimento de verifica o bastante simples que auxilia no reconhecimento de pe as danificadas Alguns procedimentos dever o ser realizados co
14. m2 m1 2 onde M representa a massa molecular da mol cula n o carregada e mA a massa do aduto carregado A por exemplo H Na NH4 Assim as equa es podem ser resolvidas para dar n2 e M A medida da distribui o de cargas em macromol culas nem sempre f cil ou reprodut vel pois pode sofrer altera es com mudan as relativamente pequenas nas condi es de an lise como por exemplo pH adi o de solventes ou sais denatura o parcial da prote na quebra de pontes disulfeto etc 18 942 757 7 998 154 1060 47 100 893 191 8 15 1131 107 75 20 1 848 582 65 l 4 121 828 13 1304 968 35 21 808 221 2 1413 631 800 1000 1200 1400 1600 mz A fonte de electrospray utilizada acoplada a todos os analisadores de massas comuns 53 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica 5 3 2 Analisadores de massas Ap s a entrada das mol culas na fonte de ons e posterior ioniza o se faz necess ria a determina o das respectivas massas dos ons formados a fim de obter o espectro de massas A fun o do analisador de massas promover a separa o dos ons a partir de suas rela es massas carga e transmit los detector Existem diversos tipos de analisadores de massas sendo os mais comuns e amplamente utilizados os Quadrup los e os Ion Traps Os analisadores de massas quadrupolares s o cons
15. mas o usu rio pode elaborar o seu pr prio modelo desde que este contenha as seguintes informa es Identifica o da pipeta Data Condi es do teste temperatura press o umidade relativa As medidas obtidas para cada volume testado Os resultados dos c lculos Resultado da compara o com a tabela de especifica o 33 de 53 Volume II M dulo 1 Micropipetas Fundamentos e Opera o MODELO Identifica o da pipeta Modelo Identifica o do t cnico Empresa T cnico Condi es Data Hora do teste Temperatura C Balan a Modelo Resultados do teste Volume Pesagem 1 Pesagem 2 Pesagem 3 Pesagem 4 Pesagem 5 Pesagem 6 Pesagem 7 Pesagem 8 Pesagem 9 Pesagem 10 Volume m dio V uL Exatid o V Vo Exatid o Precis o DP Precis o CV N mero de s rie Ponteiras utilizadas no teste Nome Nome Umidade N mero de s rie Sensitividade Tel Email Tel Email Press o hPa m mg V uL m mg Vi uL m mg Vi L COMPARADO COM AS ESPECIFICA ES 34 de 53 APROVADA REPROVADA Volume II M dulo 1 Micropipetas Fundamentos e Opera o 8 6 6 Exemplo num rico de verifica o da performance Vamos colocar um exemplo com os c lculos que devem ser feitos na verifica o da perf
16. o nas ind strias farmac uticas no entanto hoje esta preocupa o se estende a todos os tipos de instrumentos utilizados em um laborat rio Da mesma forma que em sistemas de gerenciamento de dados estes trabalhos normalmente s o oferecidos pelos fabricantes de instrumentos anal ticos sendo que existem terminologias distintas utilizadas dentre estes muitas vezes referindo se aos mesmos servi os prestados Como exemplo temos que a Verifica o de Desempenho de um instrumento anal tico poder tamb m ser chamada de Qualifica o Qualifica o de opera o OQ ou Recertifica o No entanto o que h de mais importante que qualquer que seja a terminologia utilizada pelos fabricantes esta dever corresponder a verifica o de desempenho do sistema de instrumenta o anal tica seguindo um procedimento documentado de modo a atender as exig ncias de um sistema de qualidade e de acordo com as GLP Boas Pr ticas Laboratoriais realizado a intervalos de tempo apropriado definido por cada laborat rio em fun o de sua utiliza o e ou trabalho empregado As empresas de instrumenta o recomendam esta verifica o em per odos regulares a cada 6 meses ou 1 ano e sempre que o instrumento for submetido a um servi o ou reparo que possa ter influ ncia direta em seu desempenho A terminologia Valida o existe h muito tempo e apresenta algumas varia es de acordo com o pa s ou empresa A melhor defini o de val
17. on trap para manter os ons confinados e para a separa o das massas an lise de massa Neste tipo de analisador de massa o campo el trico utilizado puramente de RF r diofrequ ncia consistindo de uma onda senoidal de aprox 1 Mhz de freq ncia que aplicada diretamente no eletrodo anular central Desta maneira dependendo da amplitude de RF aplicada se mant m os ons est veis dentro do trap ou incrementando se esta amplitude faremos com que ons de massas maiores sejam ejetados da regi o de confinamento e atinjam desta maneira o detector Uma outra peculiaridade dos Ion traps que se faz necess rio um controle sobre o n mero de ons presentes dentro da estrutura visando evitar rea es destes ons com mol culas ainda presentes Estas intera es podem provocar ligeira modifica o no espectro final de alguns compostos dificultando sua interpreta o identifica o J nos quadrup dlos este problema n o existe visto que ap s sua forma o os ons s o quase que imediatamente jogados fora da fonte de ons n o tendo chance de interagir com mol culas presentes 56 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica Em contrapartida a sensibilidade final no modo de varredura completa full scan maior nos traps devido ao fato de que todos os ons formados s o necessariamente detectados pois estes se encontram confinados J nos quadrup los a s
18. ons A fonte de ons a parte do equipamento mais sujeita sujeira e contamina es pois ela quem recebe a fase m vel com amostra press o atmosf rica e converte em ons para o sistema de v cuo Sua manuten o e limpeza devem ser feitas com base no hist rico de uso de cada equipamento e depender do tipo concentra o e n mero de amostras injetadas De qualquer forma uma vez estabelecido um intervalo de limpeza este deve ser observado e documentado O usu rio deve estar familiarizado com a troca de pe as consum veis de seu sistema Toda interven o de manuten o deve estar relatada em um caderno de atividades logbook 5 5 3 Sistema de nitrog nio O sistema de nitrog nio deve ser verificado em intervalos pr determinados Normalmente opta se pelo gerador de nitrog nio pela vantagem na rela o custo benef cio e estes dispositivos tamb m possuem filtros compressores etc que tamb m requerem manuten o peri dica 5 5 4 Treinamento em cuidados b sicos O treinamento por parte do usu rio pelo exposto al m da opera o do equipamento deve incluir estes cuidados b sicos sendo obstante que o profissional tenha forma o compat vel para este n vel de aprendizado Consultar os manuais tamb m uma tima pr tica pois al m de informar com mais detalhes o funcionamento do equipamento serve para esclarecer v rias d vidas que o usu rio possa ter importante observar os cuid
19. Figura 2 Representa o esquem tica de um analisador quadrupolar linear 54 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica A opera o do quadrup lo bem como do on trap como veremos depois pode ser tratada quali tativamente atrav s do diagrama de estabilidade que correlaciona a amplitude do potencial DC a amplitude do potencial de RF com a trajet ria de um on est vel ou seja um on que consegue passar intacto pelo quadrup lo Isto est representado nas equa es e no gr fico 1 A equa o de movimento para uma part cula carregada pode ser expressa como uma equa o de Mathieu na qual pode se definir os par metros a e q a a 4U myr T a A gt I com 77 z sendo a rela o massa carga do on e toa metade da dist ncia entre as duas barras opostas N o h nenhum par metro de z porque o campo de RF s age no plano x y z o eixo principal do quadrup lo linear x y motion unstable y z motion unstable 5 stability region qua o 4 ee as ur o E Gr fico 1 Diagrama de estabilidade no analisador Neste caso o fon m o nico on que se mant m est vel note que se encontra dentro da regi o de estabilidade do gr fico enquanto que m e m n o conseguem atingir o detector As retas de R 100 2e R 10 representam duas combina es distintas da rela o DC RF atrav s da altera o destas rela es se consegue alterar a resolu o
20. IQ que deve conter as informa es em que o sistema foi instalado e a Qualifica o de Opera o OQ incluindo todos os procedimentos a serem realizados e armazenamento dos registros das verifica es efetuadas Portanto todas as interven es efetuadas dever o ser evidenciadas neste Manual servindo este de hist rico do sistema 6 4 Cromatografia em fase l quida HPLC 6 4 1 Manuten o preventiva de HPLC Antes do in cio do processo de Qualifica o de Opera o OQ do Sistema de HPLC necess rio a realiza o de procedimentos de manuten o preventiva sugeridos pelo fabricante Em um Sistema de HPLC fazem parte da rotina de Manuten o Preventiva Parte eletr nica limpeza das partes eletr nicas e verifica o das tens es de alimenta o e internas verifica o de funcionalidade das l mpadas nos detectores e avalia o de sua vida til Parte hidr ulica Limpeza de tubula es e componentes do sistema pneum tico verifica o e elimina o de poss veis micro vazamentos e eventual substitui o de selos de veda o e filtros de fase m vel e da bomba verifica o de funcionalidade do transdutor de press o e sistema de amortecimento de pulsos quando aplic vel limpeza e verifica o de funcionalidade de sistema de introdu o de amostra 70 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica Parte mec nica Limpeza e lubrifica o de componentes mec nicos do si
21. Isto garante uma conex o perfeita entre a ponteira e o porta cone observe a forma o do selo citado acima Ponteiras em racks Encaixe o porta cone na ponteira e pressione a pipeta para baixo com um movimento rotacional como indicado na figura 12 de 53 Volume II M dulo 1 Micropipetas Fundamentos e Opera o Encaixe em multi canal Para encaixar simultaneamente em todos os canais posicione os porta cones nos colares das ponteiras Fa a um movimento de vai e vem como ilustrado na figura o que assegura conex o adequada de todas as ponteiras em todos os canais 3 4 Pr rinsagem da ponteira Quando uma nova ponteira colocada ou aumenta se o volume a ser aspirado necess rio se fazer uma pr rinsagem da ponteira Para isso basta aspirar e dispensar o l quido algumas vezes Aa o de pr rinsar a nova ponteira garante a exatid o e precis o do volume a ser posteriormente transferido Isto porque quando se aspira um l quido forma se um filme na parede interna da ponteira A natureza desse filme que o causador de erro na primeira medida depende do l quido que est sendo transferido Entretanto este filme se mant m relativamente constante ap s algumas pipetagens com a mesma ponteira preciso pr rinsar a ponteira para maximizar o desempenho da pipeta 3 5 Aspira o aspira o deve ser feita de modo lento e constante mantendo se sempre a mes
22. esquerda dois comprimentos de onda diferentes s o necess rios para gerar os radicais livres hidroxila OH que posteriormente ir o realizar a oxida o dos compostos org nicos 30 CHOH 20He 3 UV 185 l 20 3 0 H we r 20 20 HCHO 2 pe OHe HCOOH HO 20 2H0 pes 22 y UV 254 E pe 4 0He Figura 9 esquerda seqii ncia de rea es para a forma o do radical livre hidroxila direita rea es de oxida o de compostos org nicos Exemplo metanol Ambos os mecanismos descritos na literatura Norrish et al 1965 e Banford et al 1967 requerem a a o de comprimentos de onda de 185 e 254 nm e a presen a de oxig nio na gua A estequiometria de ambos os mecanismos a mesma e leva forma o do mesmo n mero de radicais hidroxila No lado direito da figura apresentamos um exemplo de oxida o de um composto org nico sem carga metanol Trata se de uma das mais simples mol culas org nicas com apenas um tomo de carbono Esta mol cula sob a a o dos radicais livres hidroxila oxidada sucessivamente na escala crescente de oxida o partindo de lcool em seguida alde do cido e por fim g s carb nico e gua Como j vimos anteriormente g s carb nico e gua est o em equil brio com cido carb nico que por sua vez est em equil brio com o on bicarbonato e H A remo o do carbono portanto se d
23. grafo 6 5 1 1 Sistemas de v cuo O sistema de v cuo fundamental para o bom funcionamento de qualquer sistema de espectrometria de massas e portanto devem ser executadas manuten es regulares e estas devem ser registradas no hist rico de funcionamento do equipamento 73 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica Os itens verificados em um sistema de v cuo s o Verifica o e substitui o dos fluidos lubrificantes das bombas auxiliar e alto v cuo Verifica o de mangueiras e conex es de v cuo Medi o e registro de leituras de alto v cuo e pr v cuo de maneira regular 6 5 1 2 Detector de massas Os detectores de massas possuem um programa de sintonia ou auto calibra o autotune que deve ser utilizado para avalia o do estado de funcionamento do equipamento Este programa normalmente gera um relat rio que deve ser arquivado pois isto servir para acompanhar seu desempenho bem como identificar falhas prematuramente como por exemplo a necessidade de limpeza da fonte de ons recomend vel que estes relat rios sejam arquivados com frequ ncia de pelo menos uma vez por semana com reten o igual ao intervalo de verifica o de desempenho Os itens observados neste relat rio s o a exatid o de massas resolu o dos picos e resposta em fun o da massa A limpeza da fonte de ons dever ser feita sempre que necess ria mas deve ser adotada uma frequ ncia m n
24. m disso s o utilizados tamb m para medir a raz o de divis o da amostra splitter quando do uso dos injetores para colunas capilares e tamb m para o controle de vaz o dos gases auxiliares dos detectores 3 Injetores Local onde a amostra efetivamente introduzida no sistema Os injetores podem ser para colunas empacotadas ou para colunas capilares sendo que existem diferentes t cnicas para o seu uso on column flash vaporization split splitiless etc Tamb m pode ser feito o uso de v lvulas de amostragem principalmente para gases A automa o pode ser utilizada para aumentar a produtividade e reprodutibilidade 4 Colunas Nelas ocorre a separa o das subst ncias presentes na amostra Podem ser confeccionadas em vidro a o inox n quel teflon ou s lica fundida e podem ser empacotadas ou capilares As capilares proporcionam melhores separa es 5 Detectores S o dispositivos que monitoram a sa da da subst ncia elu da da coluna gerando um sinal el trico proporcional massa ou concentra o desta subst ncia Podem ser universais ou seletivos Estes detectores est o ligados a amplificadores de sinal chamados eletr metros os quais amplificam o sinal e o transmitem para os dispositivos de sa da de dados 6 Sistema de aquisi o e processamento de dados Local onde se faz a aquisi o dos dados gerados no cromat grafo executa os c lculos necess rios para a quantifica o das subst ncias e ger
25. nesta forma e realizada por resinas de troca i nica 21 de 29 Volume II M dulo 2 gua para An lises Qu micas Instrumentais Observe se que pela convers o do carbono org nico em um on de f cil remo o por deioniza o foi poss vel reduzir o n vel de COT da gua purificada RADIA O UV 185 254 nm Vantagens Desvantagens e Convers o de tra os de contaminantes T cnica de polimento apenas pode ser org nicos em esp cies com carga e ao final em prejudicada se a concentra o de org nicos na Co 185 254 gua de alimenta o for muito alta Destrui o limitada de microorganismos e v rus s Org nicos s o convertidos e n o removidos 254 Baixo uso de energia Efeito limitado sobre outros contaminantes e F cil opera o e Projeto tem de ser adequado para garantir efic cia 22 de 29 Volume II M dulo 2 gua para An lises Qu micas Instrumentais ES PARA GUA PURIFICADA 2 1 Objetivo Esta especifica o cobre requisitos apropriados para gua para usos em m todos de an lise qu mica e testes f sicos Foi baseada nas especifica es da ASTM D1193 99 com altera es Quatro classes foram especificadas Tipo I Tipoll Tipolll TipolV Condutividade m xima 0 056 1 0 0 25 5 0 uS cm a 298K 25 C Resistividade m nima 18 1 0 4 0 0 2 Megohm cm a 25 C PHa25 C 5 0a8 0 COT Carbono Oxid vel Total 10 50
26. normalmente dois metros lineares s o suficientes para acomodar todo o sistema Os HPLC atuais s o geralmente modulares dispostos de maneira que seus m dulos fiquem uns em cima dos outros em formato de torre portanto deve se observar que a bancada n o seja demasiadamente alta pois far com que a torre fique muito alta causando perigo para o operador principalmente na manipula o de fase m vel A estrutura deve ser de forma a suportar em torno de 80 kg de maneira firme sem vibra es ou balan os Os fabricantes de equipamentos fornecem em seus manuais de pr instala o as descri es detalhadas da bancada necess ria 4 4 2 Rede el trica A rede el trica deve ser devidamente aterrada e estabilizada E recomendado o uso de chave magn tica caso haja constantes quedas no fornecimento de energia el trica 47 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica O n mero de tomadas deve ser suficiente e no padr o correto para a instala o do sistema necess ria uma tomada por m dulo al m de tomadas para integrador e no caso de configura es com computador para a CPU para o monitor e para a impressora Para um HPLC tradicional com bomba injetor autom tico forno detector e computador de oito tomadas s o suficientes Deve se deixar uma tomada sobressalente para utiliza o em assist ncia t cnica e ou valida es A figura 7 ilustra o modelo padr o de tomada utilizada em HPLC
27. o respeita a seguinte sequ ncia mol culas hidrof bicas menos polares s o elu das primeiro ao passo que mol culas hidrof licas mais polares s o mais retidas Quando a dissolu o da amostra apresenta problemas em solventes polares a inje o em fase reversa dificultada sendo recomendada a separa o em fase normal O solvente para a elui o no modo normal selecionado escolhendo se um solvente fraco e misturando o com um solvente forte para conseguir a for a desejada A presen a de tra os de gua na fase m vel a causa mais comum da pobre reprodutibilidade na reten o quando se trabalha com fase normal especialmente quando se usa s lica n o modificada como fase estacion ria Este problema tem sido resolvido trabalhando se com solventes anidros com um volume conhecido de gua metanol ou cido ac tico para desativar os grupos silan is mais reativos da fase estacion ria Al m de melhorar a reprodutibilidade melhora tamb m o formato do pico O mesmo efeito pode ser obtido adicionando se trietilamina essencial na separa o de aminas em s lica gel 34 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica O uso de s licas quimicamente modificadas em elui o no modo normal tem sido preferido uma vez que elas oferecem s tios de intera o com o soluto al m de uma superf cie mais homog nea em compara o com a s lica gel que tem uma variedade de grupos silan is de diferentes
28. por filtra o microporosa mas podem ser retidos com facilidade por osmose reversa ou ultrafiltra o 1 2 4 Microorganismos Os microorganismos bact rias fungos mofos e leveduras e v rus est o comumente presentes na gua pot vel distribu da em uma cidade Ainda que as empresas de tratamento processem a gua para remover microorganismos nocivos sa de humana a gua fornecida n o de forma alguma est ril Os demais microorganismos remanescentes da potabiliza o podem causar problemas em an lises 1 2 5 Gases dissolvidos Podemos encontrar todos os gases existentes na atmosfera dissolvidos na gua O g s mais importante dissolvido na gua o g s carb nico CO Encontra se em equil brio com o cido carb nico e este com o on bicarbonato Co HO HCO H HCOs Este equil brio origina um on importante o bicarbonato que pode interferir com an lises e prejudicar processos de purifica o A taxa de dissolu o de CO e sua concentra o na gua depende da temperatura quanto menor maior a taxa de dissolu o e absor o e da press o parcial de CO no ambiente em que gua est exposta Outros efeitos dos demais gases presentes no ar causa corros o em tanques tubula es etc Oxig ni e Am nia contaminante originado da aduba o agr cola SO contido em gases de escape de autom veis e emana es de ind strias 1 3 Monitoramento e controle da quali
29. ria e fase m vel fase estacion ria Desta forma a escolha do modo de separa o depende da escolha da fase estacion ria e da fase m vel para cada classe de soluto Dois modos de reten o em cromatografia l quida foram propostos O primeiro Scott e Kucera intera o solvente e o segundo por Snyder competi o solvente Os dois modelos s o equivalentes uma vez que ambos consideram que em uma dada separa o a intera o do soluto com a fase estacion ria permanece constante Portanto a reten o determinada pela composi o da fase m vel 4 2 1 1 Cromatografia em fase normal A fase estacion ria mais polar que a fase m vel o oposto ocorre em cromatografia no modo reverso Os solventes usados s o geralmente uma mistura de solventes org nicos sem a adi o de gua As fases estacion rias s o adsorventes org nicos s lica alumina ou fases polares quimicamente ligadas ciano diol fenil amino Os dois modelos de reten o intera o solvente e competi o solvente t m sido usados com sucesso para descrever o efeito da fase m vel em cromatografia l quida no modo normal Independentemente do modelo usado a reten o em fase normal aumenta com o decr scimo da polaridade da fase m vel A aplica o majorit ria deste modo de cromatografia se d com mol culas neutras embora possa ser utilizada tamb m para a separa o de mol culas ioniz veis ou i nicas A ordem de elui
30. rio xen nio ou merc rio M todo do xido de h lmio Exatid o Fotom trica A exatid o fotom trica determinada pela medida de valores de absorb ncia conhecidos e calculando a diferen a entre o valor esperado e o valor realmente medido pelo instrumento Os m todos utilizados s o M todo de Dicromato de Pot ssio M todo atrav s do Filtro NIST 6 3 Cromatografia em fase gasosa GC 6 3 1 Manuten o preventiva de GC Antes de se realizar a Qualifica o de Opera o OQ de um GC necess rio a realiza o dos procedimentos de Manuten o Preventiva sugeridos pelo fabricante im um Sistema de Cromatografia a G s fazem parte da rotina de Manuten o Preventiva E Sist de C tografia a G s fz te da rotina de M o P ti Limpeza do Sistema Pneum tico e verifica o de vazamentos Limpeza dos circuitos eletr nicos e verifica o das tens es empregadas Limpeza dos Sistemas de Ventila o e verifica o de sua funcionalidade Limpeza do s injetor es e detector es verifica o de vazamentos e tens es empregadas Teste de verifica o de resposta do s detectores 6 3 2 Qualifica o de opera o A Qualifica o de Opera o de um sistema de cromatografia a g s consiste da verifica o das seguintes partes Controle de Fluxos do g s de arraste e auxiliares Controle de Temperaturas do Injetor es Detector es e Forno de Coluna Repetibilidade de sinal
31. todos estes m todos degradam os cidos nucl icos a mol culas de pesos moleculares menores que n o s o normalmente amplificadas entretanto estes m todos n o limpam 42 de 53 Volume II M dulo 1 Micropipetas Fundamentos e Opera o 9 3 3 Nucleases Nucleases s o enzimas que degradam cidos nucl icos Possuem uma larga distribui o sendo encontradas em c lulas procari ticas e eucari ticas vegetais e animais na pele na gua As DNases n o s o muito resistentes n o sendo muito cr ticas para a maioria das aplica es em biologia molecular enquanto que as RNases s o mais dur veis e resistentes ao calor As DNases requerem ons met licos para sua atividade e podem ser inativadas facilmente com alguns tamp es apropriados com agentes quelantes como EDTA As RNases n o precisam de ons met licos pois utilizam o grupo 2 hidroxil como reativo n o sendo portanto f ceis de inativar M todo Agente qu mico A o Nem sempre suficiente para inativar as RNases que pode Autoclavagem recuperar sua atividade ap s v rias formas de tratamento fervura por exemplo Irradia o UV Sem dados na literatura Alquila res duos de histidina dos s tios catal ticos das RNases DEPC A inativando as dietil pirocarbonato forte mas n o um inibidor absoluto 9 3 4 Coment rios sobre os cidos nucl icos e nucleases Todos os m todos mencionados degradam
32. veis dependendo da solu o utilizada partes externas imers o completa Nota Use luvas descart veis durante todo o procedimento de descontamina o 9 6 Autoclavagem Remova o ejetor de ponteiras e desrosqueie a porca de conex o Limpe o porta cone a porca de conex o e o ejetor de ponteiras com um detergente e depois autoclave por 20 min a 121 C 0 1 Mpa Deixe as pe as secarem ou coloque as na estufa a 50 60 C por aproximadamente 30min Nota N o autoclave estas pe as a 134 C pois isto ir danificar as pe as N o autoclave nenhuma outra pe a al m das relacionadas acima 9 7 Irradia o UV L mpadas UV podem ser instaladas no alto da bancada ou em uma capela de biosseguran a onde as manipula es podem ser realizadas A combina o de bulbos de 254 nm e 300 nm durante 20 min pode destruir DNA dupla fita sequ ncias longas s o mais f ceis de inativar 9 8 Solu es qu micas Antes de utilizar uma solu o qu mica tenha certeza da compatibilidade com materiais utilizados na fabrica o das pipetas O fabricante deve fornecer uma lista dos materiais utilizados na fabrica o da pipeta Abaixo alguns exemplos PVDE PBT PC PE POM borracha nitr lica a o inoxid vel ABS PEI e PMP Veja o Gloss rio e Abrevia es Nota n o aconselh vel embeber o selo e o o ring 46 de 53 Volume II M dulo 1 Micropipetas Fundamentos e Opera o
33. veis ponteiras capilares e pist es e as Distritips M todos utilizados para esteriliza o dos consum veis pl sticos das pipetas No laborat rio a autoclavagem o m todo mais comum para a esteriliza o das ponteiras Entretanto este processo leva tempo o tempo da autoclavagem em si o ciclo de secagem e a estabiliza o em temperatura ambiente por algumas horas Nota o processo de autoclavagem deve ser feito a 121 C 20 min 1 MPa N o recomendado realizar a autoclavagem a 134 C pois isto pode danificar os pl sticos Dependendo do tipo de material outros m todos s o utilizados pelo fabricante para deixar os consum veis esterilizados xido de etileno ou mais frequentemente irradia o raios gama Co ou raios beta feixe de el trons Como o processo de fabrica o automatizado at inclusive o est gio final s o normalmente produzidas ponteiras limpas sem nenhum contato manual M todo A o xido de etileno Alquila o amino terminal dos amino cidos resultando em morte celular Irradia o loniza o de componentes celulares importantes incluindo amino cidos Inativa o de templates de DNA atrav s de radicais livres Coment rios O xido de etileno altamente t xico e mutag nico Portanto seu uso tem sido muito questionado por autoridades de sa de e de controle ambiental em muitos pa ses A irradia o usada nos processos indus
34. vel a l mpada de filamento incandescente de tungst nio com inv lucro de vidro O filamento opera a 2600 3000K fornecendo radia o cont nua de 350 a 2500nm A energia emitida na regi o vis vel varia aproximadamente com a quarta pot ncia da voltagem de opera o portanto a fonte requer um rigoroso controle de voltagem para gerar radia o ou reguladores de voltagem eletr nicos As fontes de radia o ultravioleta mais usadas s o as l mpadas de descarga de hidrog nio ou deut rio com janela de quartzo O hidrog nio baixa press o e submetido descarga el trica produz um feixe cont nuo na regi o do ultravioleta A l mpada de deut rio produz um espectro cont nuo de 180 a 380 nm As l mpadas de xen nio de alta frequ ncia trabalham produzindo pulsos de radia o que realizam a cobertura do espectro de 180 a 1100nm 2 3 2 Monocromador ptica Os monocromadores s o dispositivos constru dos a base de redes de difra o que dispersam a radia o complexa em seus comprimentos de onda componentes e ent o isolam a faixa espectral desejada Os monocromadores permitem isolar vontade faixas de comprimentos de onda espectralmente puras e muito estreitas ao longo das regi es ultravioleta vis vel e infravermelho pr ximas O desempenho fotom trico de um espectrofot metro esta diretamente ligado a qualidade do monocromador sistema ptico A configura o do monocromador deve proporcionar uma alt
35. vel lt 1ppb COT reprodut vel n o utiliza reagentes e determinam todos os tipos de compostos org nicos inclusive os vol teis Entretanto este m todo adequado apenas para guas com resistividade maior que 3 Megohm cm A concentra o de COT expressa em ppb partes por bilh o 10 de 29 Volume II M dulo 2 gua para An lises Qu micas Instrumentais 1 4 Especifica es de qualidade Diversos rg os normalizadores possuem suas especifica es de qualidade voltados s atividades espec ficas a que se dedicam Temos as especifica es da ASTM American Society for Testing and Materials direcionadas para a instrumenta o anal tica e para a ind stria eletr nica Temos tamb m as especifica es da United States Pharmacopeia USP voltadas produ o de medicamentos e as da ISO International Organization for Standardization Existem ainda a NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards que em conjunto com o CAP College of American Patologists especifica os tipos de gua utilizados em laborat rios cl nicos A norma da ASTM designa o D 1193 99 a mais adequada para especificar os tipos de gua utilizados em laborat rios qu micos e especialmente an lise instrumental A ASTM historicamente foi o primeiro rg o a propor normas para gua de uso laboratorial dividindo a gua em quatro graus de acordo com as aplica es Tipo I tamb m chamada g
36. volume intermedi rio e o volume m nimo da faixa de volume do modelo estes volumes est o definidos no manual da pipeta Para as pipetas de volume fixo utiliza se apenas o volume nominal 1 Ajuste na pipeta o volume do teste este deve ser mantido durante todo o procedimento 2 Estime a taxa de evapora o para volumes pequenos menores do que 50H Vide a seguir o procedimento Fa a o teste de verifica o registre as massas no Relat rio de Verifica o de Performance Fa a os c lculos registre os resultados no Relat rio de Verifica o de Performance E aa ei Compare os resultados com as especifica es de exatid o e precis o que est o relacionadas nas tabelas 1 e 2 item 8 6 4 Estas etapas ser o detalhadas adiante 8 6 1 Estimando a taxa de evapora o massa m dia evaporada por ciclo de pesagem Para volumes abaixo de 50uL necess rio o uso de um recipiente com tampa O objetivo minimizar controlar e quantificar a perda por evapora o durante o ciclo de pesagem O uso de pin as para a manipula o deste recipiente tamb m aconselh vel A evapora o pode ser estimada realizando se uma s rie de quatro simula es de pesagens na qual se repete o ciclo de pesagem sem que haja dispensa de gua no recipiente para pesagem diferen a total atribu da evapora o calculada e dividida por 4 para se obter uma m dia A faixa expressa em mg ciclo ou se for um nico ciclo
37. 1 0025 1 0025 18 5 1 0023 1 0024 1 0025 1 0025 1 0026 1 0026 190 1 0024 1 0025 1 0025 1 0020 1 0027 1 0027 19 5 1 0025 1 0026 1 0026 1 0027 1 0028 1 0028 200 1 0026 1 0027 1 0027 1 0028 1 0029 1 0029 20 5 1 0027 1 0028 1 0028 1 0029 1 0030 1 0030 Ho 1 0028 1 0029 1 0030 1 0030 1 0031 1 0031 21 5 1 0030 1 0030 1 0031 1 0031 1 0032 1 0032 220 1 0031 1 0031 1 0032 1 0032 1 0033 1 0033 22 5 1 0032 1 0032 1 0033 1 0033 1 0034 1 0035 Bo 1 0033 1 0033 1 0034 1 0035 1 0035 1 0036 23 5 1 0034 1 0035 1 0035 1 0036 1 0036 1 0037 Mo 1 0035 1 0036 1 0036 1 0037 1 0038 1 0038 24 5 1 0037 1 0037 1 0038 1 0038 1 0039 1 0039 250 1 0038 1 0038 1 0039 1 0039 1 0040 1 0041 25 5 1 0039 1 0040 1 0040 LOO 1 0041 1 0042 260 1 0040 1 0041 1 0042 1 0042 1 0043 1 0043 26 5 1 0042 1 0042 1 0043 LOUR 1004H 1 0045 270 1 0043 1 0044 1 0044 1 0045 1 0045 1 0046 275 1 0044 1 0045 1 0046 1 0046 1 0047 1 0047 280 1 0046 1 0046 1 0047 1 0048 1 0048 1 0049 28 5 1 0047 1 0048 1 0048 1 0049 1 0050 1 0050 290 1 0049 1 0049 1 0050 1 0050 1 0051 1 0052 29 5 1 0050 1 0051 1 0051 1 0052 1 0052 1 0053 300 1 0052 1 0052 1 0053 1 0053 1 0054 1 0055 esta m dia obtida a partir do valor da temperatura da gua do recipiente de origem medida no in cio do teste t e da temperatura da gua do recipiente de origem medida ao final do teste t 31 de 53 Volume II M dulo 1 Micropipetas Fundamentos e Opera o 8 6 4 Especifica es TABELA 1 Esta tabela de espe
38. 3 1 Acoplador de fibra ptica Em muitas situa es utiliza se o espectrofot metro para medida de solu es do modo cl ssico atrav s de cubetas mas existem amostras que apresentam uma grande dificuldade de an lise em fun o de seu tipo ou tamanho Para facilitar a an lise destas amostras pode se utilizar um sistema acoplador de fibra ptica onde alguns benef cios s o obtidos e Previne a manipula o de amostras as quais possuam alta temperatura e ou press o ou apresentam n veis de radia o Realiza medidas em amostras muito pequenas como cristal ou amostras muito grandes como janelas de estruturas met licas as quais s o imposs veis de serem feitas em configura es normais de instrumentos Monitoramento em processos qu micos Determina es em sistemas fechados reatores Uma s rie de sensores de fibra ptica s o poss veis de serem utilizados para atingir os objetivos acima como sensores de reflect ncia absorb ncia transmit ncia em vidros e fluoresc ncia 2 3 3 2 Sipper Um sistema composto por bomba perist ltica pode ser utilizado para bombear a solu o da amostra para uma cubeta de fluxo sem a necessidade de transfer ncia manual da amostra para a cubeta diminuindo assim a manipula o da amostra Estas cubetas de fluxo podem estar posicionadas em suportes especais que podem realizar o aquecimento da amostra 2 3 3 3 Suporte para amostras s lidas Este tipo de suporte
39. 8 mm proporcionando melhores resultados 3 2 Princ pio da t cnica A amostra introduzida no sistema atrav s de uma seringa ou uma v lvula de inje o Esta amostra volatilizada logo ap s a sua introdu o no sistema de cromatografia e dissolvida em um g s de arraste inerte fase m vel Dissolvida no g s esta amostra ser arrastada at a coluna cromatogr fica que cont m uma fase l quida ou s lida como fase estacion ria ocorrendo a separa o dos compostos nesta coluna separa o ocorre porque os componentes da amostra t m diferentes afinidades com a fase estacion ria resultando em diferentes velocidades de elui o dos componentes pela coluna ou seja quanto maior a afinidade do componente pela fase estacion ria mais lentamente ele caminha pela coluna e vice versa inje o migra o elui o Figura 1 Esquema b sico de um processo de separa o cromatogr fica 22 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica Ap s os componentes da amostra serem separados chegam ao detector que gera um sinal el trico atrav s de um fen meno f sico qu mico como p ex diferen a de condutividade t rmica ioniza o atrav s de uma chama Estes detectores podem ser seletivos para um grupo qu mico determinado p ex organo clorados podendo ser mais sens veis para a an lise dos mesmos Este sinal amplificado pois geralmente est em uma intensidade muito baixa e
40. a luz do espectro e envia uma pequena quantidade desta luz atrav s do compartimento de amostras A realiza o deste teste feita atrav s do m todo de Tolueno Hexano Stray Light Luz Esp ria A Luz Esp ria definida como sendo a quantidade de luz que chega ao detector quando nenhum comprimento de onda foi selecionado A luz esp ria causa desvios na Lei de Beer Lambert reduzindo a linearidade do sistema Este teste realizado atrav s da medida de transmit ncia que estar passando por uma solu o e em seguida a mesma leitura realizada mas com a fonte desligada O m todo utilizado o do KCl em 200nm Exatid o fotom trica A exatid o fotom trica determinada pela medida de valores de absorb ncia conhecidos e calculando a diferen a entre o valor esperado e o valor realmente medido pelo instrumento O m todo utilizado o do Dicromato de Pot ssio 67 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica 6 2 3 2 Farmacop ia americana Os testes abaix s o relacionados pela Farmacop ia Americana USP para o processo de valida o do instrumento e est o divididos em Controle de comprimentos de onda Testes que possuem o objetivo de verificar a exatid o de posicionamento de comprimento de onda com a finalidade de garantir um baixo desvio de posicionamento do sistema ptico A USP recomenda a realiza o de duas rotinas para verifica o deste item M todo de emiss o da linha de deut
41. alta sensibilidade e incompar vel linearidade O desenho abaixo apresenta um esquema do detector FID 28 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica isolador cer mico probe do ignitor mola ignitora Figura 7 Detector FID A opera o do detector envolve uma mistura de gases ar e hidrog nio formando uma chama com temperatura a cerca de 2000 C onde a amostra queimada Um par de eletrodos fica nas proximidades da chama coletando sinal gerado pela forma o de esp cies ionizadas e el trons oriundos da queima de subst ncias na chama Este detector gera sinal para compostos que tenham carbono e hidrog nio na mol cula com raras exce es como por exemplo CS O detector deve trabalhar aquecido at uma temperatura aproximada de 400 C por m a temperatura escolhida deve garantir que n o haja condensa o das subst ncias elu das da coluna Concentra es t picas a serem analisadas abrange a faixa de baixos valores ppb at altos valores 4 3 3 5 2 Detector de nitrog nio e f sforo NPD ou termo i nico espec fico TSD O detector tem resposta seletiva para compostos contendo tomos de nitrog nio ou f sforo possuindo internamente um sal de rub dio incorporado em uma p rola refrat ria submetida passagem de gases ar e hidrog nio e a p rola quando aquecida eletricamente produz um plasma gasoso temperatura de 600 a 900 C A forma o deste plasma
42. da troca do septo do injetor a qual deve ser feita tipicamente entre 30 a 100 inje es executadas dependendo da t cnica de inje o utilizada manual ou autom tica O insersor de vidro do injetor tamb m representa um item de grande import ncia para o bom desempenho do equipamento desta forma sua substitui o necess ria e a frequ ncia deve ser determinada em fun o da aplica o e utiliza o Outro cuidado importante se refere a utiliza o das colunas que devem ser condicionadas e serem submetidas a uma limpeza t rmica sempre que necess ria Deve se tomar cuidado para n o aquecer a coluna a uma temperatura acima do limite t rmico da fase estacion ria Quanto aos gases al m dos cuidados de pureza conforme mencionado nos pr requisitos importante realizar a substitui o dos filtros de gases quando necess rio e tamb m verificar regularmente a press o no cilindro evitando sua utiliza o at seu t rmino a fim de evitar uma eventual contamina o causada pela entrada de ar ambiente por difus o Nos detectores recomendada uma limpeza a cada seis meses ou sempre que houver queda de desempenho Os procedimentos desta limpeza est o descritos nos manuais de opera o do equipamento 32 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica TA EM FASE L QUIDA LC 4 1 Introdu o A cromatografia l quida de alta efici ncia HPLC surgiu como a aplica o de cromatografia l
43. de 29 Volume II M dulo 2 gua para An lises Qu micas Instrumentais expresso em daltons Este valor usado para caracterizar as membranas UF porque o peso molecular mais f cil de encontrar na literatura do que as dimens es das mol culas O peso molecular relaciona se diretamente ao tamanho da mol cula mas outros fatores tamb m precisam ser considerados forma estereoqu mica e pH da dispers o em que se encontram Isto fundamental no caso de prote nas A tabela a seguir mostra as vantagens e desvantagens da UF ULTRAFILTRA O UF Vantagens Desvantagens e Remo o efetiva gt 99 de todas Quase nenhuma remo o de ons gases e mol culas org nicas com peso molecular org nicos de baixo peso molecular as acima do NMWL Muito eficiente na membranas de UF mais fechadas tem um remo o de pir genos e v rus bem como cut off de 1 000 dalton part culas e N o h risco de incrusta o e Baixo uso de gua e energia e Baixa manuten o procedimentos bem documentados aceitos Figura 8 Representa o de corte transversal de filtro de superf cie e microfotografia de membrana DuraporeQ Foto cortesia de Millipore Ind e Com Ltda Como pode ser visto estas membranas s o muito eficientes na remo o de compostos org nicos de alto peso molecular 1 5 6 Microfiltra o em membrana Existem tr s principais tipos de filtros filtros de profundidade de superf cie e de
44. de energia radiante consistem de mat ria que podem ser excitados por meio de aquecimento el trico ou descarga de alta voltagem No retorno aos n veis energ ticos os materiais excitados emitem f tons com energias correspondentes s diferen as entre as energias dos estados excitados e as energias dos estados fundamentais Alguns materiais apresentam n veis energ ticos t o numerosos e pr ximos que as frequ ncias emitidas formam uma faixa de radia o cont nua relativamente ampla As fontes de radia o utilizadas na constru o de aparelhos para a pr tica da espectrofotometria UV Vis devem preencher certos requisitos A fonte deve fornecer feixe com suficiente pot ncia radiante para permitir a detec o por meios adequados 15 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica A fonte deve gerar uma radia o cont nua isto contendo todos os comprimentos de onda dentro da regi o espectral que o equipamento ir trabalhar A fonte deve ser est vel ou seja a pot ncia do feixe luminoso gerado deve permanecer constante enquanto s o realizadas as determina es Em instrumentos de feixe simples esta condi o essencial para que as medidas da absorb ncia possam ser reprodut veis Nos instrumentos de duplo feixe estes s o medidos simultaneamente ent o uma alta estabilidade da fonte n o t o cr tica A fonte mais satisfat ria para a obten o de radia o cont nua na regi o vis
45. deve ser expresso em mg Evite manipular exces o recipiente O uso de pin as para manipular o recipiente para pesagem aconselh vel As taxas de evapora o geralmente est o entre 0 010 mg e 0 025 mg por ciclo de pesagem Recalcule a taxa de evapora o sempre que as condi es ambientais forem alteradas temperatura press o e umidade O usu rio pode selecionar o n mero de medidas de acordo com as especifica es de exatid o e precis o aceitas pela sua metodologia 27 de 53 Volume II M dulo 1 Micropipetas Fundamentos e Opera o Adicione gua ao recipiente para pesagem at que este esteja com 1 3 do seu volume cheio Coloque o recipiente tampado no prato da balan a Com a pipeta aspire a al quota do recipiente de origem ER FONE po ni Tare a balan a e remova o recipiente para pesagem do prato da balan a o uso de pin as para remov lo aconselh vel 5 Dispense a al quota no recipiente de descarte ou retorne a para o recipiente de origem N o a dispense no recipiente para pesagem 6 Registre o resultado e 7 Repita as etapas de 3 a 8 tr s vezes para obter e e e e 8 Calcule a perda ciclo e e e e e 4 mg 9 A evapora o por ciclo mg deve ser adicionada ao peso m dio antes do c lculo do volume m dio Um exemplo de c lculo da taxa de evapora o dado ao final deste cap tulo 8 6 2 Teste gravim trico As t cnicas de aspira o e dispensa
46. do filtro de massas ou seja a capacidade de diferenciar ou filtrar massas muito pr ximas umas das outras Os par metros a e q s o respectivamente proporcionais aos valores de DC e RF 5 3 2 2 Analisadores de massas quadrupolar ion trap Este analisador de massa tem os mesmos princ pios matem ticos de funcionamento que o quadrup lo convencional ou seja estabilidade de ons dentro de uma trajet ria espec fica 55 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica Por m o grande diferencial que no on trap os ons n o seguem uma trajet ria nica em dire o ao detector e sim ficam apris onados em rbitas dentro da estrutura do trap surgindo assim a raz o da denomina o on trap armadilha de ons Enquanto que no quadrup lo n s temos a forma o dos ons na fonte de ons e posterior expuls o destes ons em dire o ao analisador de massas no trap ocorrem a forma o dos ons e an lise de massas na mesma regi o do espa o Esta regi o do espa o onde se encontram os ons aprisiona dos corresponde a aproximadamente o volume de um cubo de 1 cent metro de lado Na figura abaixo temos a representa o esquem tica do analisador on trap Figura 3 Representa o esquem tica do analisador ion trap Assim como os quadrup los os on traps tamb m se utilizam de campos el tricos estes campos el tricos s o utilizados no
47. duas situa es distintas que exigem procedimentos de limpeza diferentes a Limpeza padr o Os aeross is formados durante a pipetagem se depositam dentro da pipeta prejudicando seu funcionamento normal Este dep sito pode al m de obstruir o orif cio do porta cone prejudicando o deslocamento do ar dentro da pipeta danificar as pe as internas como por exemplo o pist o risc lo corro lo Nas duas situa es a pipeta vai operar fora das especifica es Para evitar esta situa o deve se limpar as pe as internas da pipeta porta cone ejetor pist o selo e o ring Seguir o procedimento recomendado pelo fabricante Um exemplo de procedimento de limpeza est descrito no anexo I Alimpeza a principal ferramenta do usu rio para prolongar a vida til da pipeta e garantir resultados confi veis N o existe uma previs o da frequ ncia de limpeza que deve ser adotada pelo laborat rio isto depende do tipo de material manuseado rotina a que a pipeta submetida n mero de usu rios para a mesma pipeta e erros admiss veis para o procedimento Para garantir resultados confi veis a pipeta al m de limpa freqiientemente deve ser submetida a testes de performance anexo II b Pipeta utilizada na manipula o de materiais cidos ou corrosivos O estado do pist o interfere diretamente nas especifica es da pipeta Uma pipeta com pist o riscado ou corro do n o atinge os padr es estabelecidos para exa
48. e eletrodo de trabalho potenci metr registrador ALA Figura 6 Diagrama esquem tico de um detector eletroqu mico 43 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica 4 3 6 Aquisi o e processamento de dados Como parte integrante do cromat grafo o sistema de aquisi o e processamento de dados permitir ao usu rio verificar e documentar os resultados obtidos Basicamente dever receber o sinal el trico enviado pelo s detector es convert lo s em gr fico s denominado s cromatograma s fazer a integra o dos picos atrav s de par metros pr estabelecidos e a partir de uma curva de calibra o quantificar suas amostras Este gr fico tra ado como sinal em fun o do tempo de reten o apresenta duas caracter sticas importantes primeira o tempo de reten o caracter stico e repetitivo para cada subst ncia a segunda a rea ou altura do pico diretamente proporcional concentra o ou massa da subst ncia Veja a figura abaixo 150 p150 9 69 Tempo de reten o 100 rea do pico 00 3 44 Altura do pico my my 50 Linha de Base 0 2 0 40 6 0 8 0 10 0 12 0 minutos Inicialmente criado um arquivo que cont m todas as informa es necess rias para an lise das subst ncias de interesse tais como Elabora o de texto descrevendo condi es cromatogr ficas como fase m vel e
49. es para 10 uL tabela 1 Volume Erros permiss veis m ximos Erros permiss veis m ximos Nominal sistem tico aleat rio ee eme 1 2 s comparar os resultados obtidos relat rio com o especificado na tabela Neste caso a pipeta testada est aprovada 37 de 53 Volume II M dulo 1 Micropipetas Fundamentos e Opera o OS DE DESCONTAMINA O Os procedimentos descritos a seguir podem ser utilizados para alguns modelos de pipetas em particular aquelas com pist o met lico Por isso necess rio consultar as instru es do fabricante antes de aplicar qualquer um dos m todos descritos aqui INTRODU O Neste documento est o descritas uma s rie de m todos para descontamina o da pipeta especialmente as de pist o met lico Estes m todos podem ser f sicos autoclavagem ou irradia o UV ou qu micos De acordo com o tipo de utiliza o da pipeta deve se escolher o m todo de descontamina o mais eficiente Entretanto considerando o espectro de a o as vantagens e desvantagens destes m todos conclu mos que o m todo mais eficiente a descontamina o qu mica Solu es qu micas comerciais compostas tanto de detergentes como de desinfetantes garantem uma descontamina o eficiente Como o m todo de descontamina o qu mica eficiente r pido e f cil de realizar o recomendamos para os procedimentos de
50. loop que nada mais do que tubula o de volume definido e preciso que pode ser substitu da para permitir a inje o de diferentes volumes de amostra A figura 2 mostra o diagrama esquem tico da v lvula Os seis c rculos menores representam os orif cios internos da v lvula enquanto que o c rculo maior representa a porta de entrada da agulha da seringa de inje o 38 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica Bomba Bomba 1 2 Coluna Coluna 3 Seringa LOOP LOOP Figura 2 Diagrama esquem tico de uma v lvula de inje o A V lvula possui duas posi es carregamento LOAD e inje o INJECT Na posi o LOAD o fluxo da bomba desviado direto para a coluna entra em 2 e sai em 3 Enquanto isto a amostra introduzida na al a de amostragem LOOP pelo orif cio da agulha sendo o excesso imediatamente descartado pela sa da 6 ou seja a precis o de inje o determinada pelo volume de amostra no LOOP Na posi o INJECT a fase m vel agora segue atrav s do LOOP arrastando a amostra para a coluna percurso 2 1 4 3 4 3 3 2 Injetor autom tico Os injetores autom ticos s o dispositivos amplamente utilizados em laborat rios que buscam alta produtividade pois trabalham de maneira n o assistida al m de proporcionarem melhor reprodutibilidade em rela o aos injetores manuais Alguns modelos possuem a capacidade de termostatizar as amostras aumentando a versatilidade do s
51. m ximo e m nimo especificado para aquele modelo de pipeta Fa a a an lise da exatid o e precis o das medidas obtidas Os erros m ximos encontrados devem ser at 2 vezes os valores especificados nas tabelas 1 e 2 deste documento anexo II item 8 6 4 Registre os dados em um relat rio exemplo no anexo II item 8 6 5 identificando o operador que foi testado 21 de 53 Volume II M dulo 1 Micropipetas Fundamentos e Opera o DIMENTO DE LIMPEZA O exemplo a seguir pode ser utilizado por v rios modelos de pipetas em particular aquelas com o pist o met lico sem graxa j para outros modelos ser necess rio adapt lo Siga as instru es do fabricante contidas no manual do usu rio N o deixe de confirmar se as etapas descritas aqui n o comprometem a calibra o da pipeta Aten o N o misture as pe as de uma pipeta com as pe as de outra pipeta 7 1 Desmontagem necess rio que se desmonte a pipeta para fazer a limpeza deve se utilizar luvas quando houver risco de contamina o Segue um esquema geral das pe as das pipetas H RELA O DAS PE AS Figuras 1e 2 A B C D E CF GeH Selos do pist o P S este esquema pode sofrer varia es de acordo com o modelo e marca da pipeta Para maiores detalhes consulte o manual do fabricante 22 de 53 Volume II M dulo 1 Micropipetas Fundamentos e Opera o Retire o ejetor de ponteiras D
52. membrana Filtros de profundidade s o fabricados com fibras aglomeradas e ret m contaminantes em toda a sua espessura Possuem uma alta capacidade mas n o apresentam um limite de reten o muito claro Sua efici ncia est por volta de 95 e varia com a vaz o Al m disso podem liberar contaminantes no filtrado geralmente fibras ou material que foi retido Filtros de superf cie s o geralmente fabricados com m ltiplas camadas de material n o fibroso capturando os contaminantes principalmente na sua superf cie e possuindo uma capacidade intermedi ria de reten o e efici ncia 98 Filtros de tela ou de membrana ret m contaminantes na sua superf cie atrav s de um efeito de peneiramento Possuem baixa capacidade mas promovem 100 de reten o de contaminantes cujo tamanho maior do que seu limite de corte bem definido Filtros de tela t picos s o os de membrana onde a sua integridade pode ser verificada atrav s de testes espec ficos como por exemplo ponto de bolha ou difus o 19 de 29 Volume II M dulo 2 gua para An lises Qu micas Instrumentais MICROFILTRA O EM MEMBRANA Vantagens Desvantagens e Remo o de 100 de todos contaminantes Efeito m nimo sobre outros contaminantes part culas bact rias maiores que o tamanho do poro Teste de integridade dispon vel e Filtra o esterilizante membranas 0 22 um e Manuten o m nima simplesmente substitua quando necess rio
53. menor do que 1 em 1 milh o N vel de Garantia de Esterilidade de 109 Qualquer c lula vegetativa e endosporos Avos A cin tica que leva a inativa o dos v rus ainda n o est esclarecida N O calor degrada os cidos nucl icos enzimas e outras prote nas essenciais A o Podem ocorrer danos a membrana celular 9 2 2 Irradia o UV O comprimento de onda UV est entre 100 nm e 400 nm Existem 3 tipos de radia o UV de acordo com o comprimento de onda UVC 200 nm a 290 nm UVB 290 nm a 320 nm e UVA 320 nm a 400nm Alvos Letal para a maioria dos microorganismos Tabela 82 1 Ac Altera es fotoqu micas nas enzimas celulares UVA e DNA UVC o veja detalhes na tabela 1 3 2 9 2 3 Agentes qu micos A escolha da solu o qu mica deve ser feita considerando se o tipo de microorganismo que se quer eliminar 40 de 53 Volume II M dulo 1 Micropipetas Fundamentos e Opera o Na tabela a seguir est o relacionados os principais microorganismos e alguns agentes qu micos comuns No caso de manipula o de cepas especiais deve se considerar produtos comerciais espec ficos para destru los e ter certeza da compatibilidade qu mica da pipeta com o respectivo produto qu mico veja 3 3 Bact ria Agente Qu mico Micobact rias Esporos Fungos V rus C lulas Gram Gram Hipoclorito de s dio
54. no cap tulo 3 o volume a ser testado 28 de 53 Volume II M dulo 1 Micropipetas Fundamentos e Opera o 2 6 ZR Se o recipiente para pesagem possuir tampa remova a Dispense o volume testado no recipiente para pesagem e recoloque a tampa com o aux lio da pin a Registre a massa m do volume testado Tare a balan a 3 Repita o teste descrito acima do item 2 1 ao 2 7 at completar 10 medidas m a m 4 Ap s a ltima medida verifique e registre a temperatura da gua do recipiente de origem t a press o atmosf rica e a umidade relativa da sala 8 6 3 C lculos 1 C lculo da temperatura m dia Calcule a temperatura m dia 7 da gua destilada a varia o m xima entre t e t 0 2 C 82 2 C lculo da press o m dia Use a press o barom trica m dia B e a temperatura m dia 4 para determinar o Fator Z correspondente na B B B 2 tabela 3 C lculo do volume a partir da massa Multiplique as massas mg depois das corre es das perdas por evapora o para volumes abaixo de 50 uL V Z m 6 pelo fator Z para obter os volumes uL V volumes individuais uL m massas individuais mg e taxa de evapora o mg Z fator Z uL mg 4 C lculo do volume m dio Ap s calcular o volume individual das pesagens calcule n o volume m dio resultado expresso em uL Fac V V Volumes individuais V volume m dio n n mero de pesag
55. os contaminantes da gua s o passos essenciais para a obten o de gua purificada no laborat rio de forma eficaz e econ mica atendendo em especial as necessidades que a aplica o espec fica exige seguir apresentamos em quatro t picos as informa es e conceitos que ajudar o a alcan ar esses objetivos e decidir qual o tipo de gua a ser utilizado em uma an lise instrumental espec fica Os contaminantes da gua Monitoramento e controle da qualidade da gua purificada Especifica es de qualidade Tecnologias que podem ser empregadas para purifica o de gua em laborat rios 1 2 Os contaminantes da gua Como j foi dito os contaminantes t m rela o direta com a an lise que se est realizando e a sensibilidade e limite de detec o do m todo empregado Por exemplo em HPLC Cromatografia L quida de Alta Efici ncia as an lises que utilizam o detector ultravioleta s o sens veis aos compostos org nicos que estejam presentes na gua componente da fase m vel e que absorvem no comprimento de onda utilizado Isso compromete os resultados e a pr pria curva de calibra o Al m disso os compostos org nicos que n o s o detectados nesse comprimento de onda podem ser retidos e se acumular na coluna de HPLC comprometendo sua efici ncia e funcionalidade e provocando os chamados picos fantasmas num cromatograma Para fins did ticos dividimos os contaminantes da gua em cin
56. parcialmente os cidos nucl icos e as nucleases mas nenhum se mostrou 100 eficiente A melhor maneira de evitar contamina o em biologia molecular ter alguns cuidados Separe reas e conjuntos de pipetas para a prepara o da amostra e para condu o dos ensaios Use ponteiras com filtro para evitar a contamina o por aeross is Ou ainda melhor utilize pipetas de deslocamento positivo com capilares e pist es descart veis prote o total contra contamina o cruzada Para protocolos cr ticos de PCR a utiliza o das pipetas de deslocamento positivo requerida quando n o pode haver contamina o 9 3 5 Radioatividade Para contamina o radioativa fraca detergentes espec ficos contendo agentes complexantes podem ser utilizados 43 de 53 Volume II M dulo 1 Micropipetas Fundamentos e Opera o Compara o dos m todos Os m todos s o comparados considerando primeiramente a sua efici ncia em rela o ao contaminante e depois as vantagens e desvantagens 9 4 Espectro de a o dos m todos Considere duas abordagens 1 Eu tenho os materiais necess rios para realizar este m todo no meu laborat rio O quanto ele efetivo leia a tabela verticalmente 2 Eu preciso eliminar este contaminante O que posso fazer leia a tabela horizontalmente M todos F sicos Qu micos e e i E gt E 8 o Contaminantes
57. pipetagem Retire o pist o que dever trazer preso a ele o s selo s Coloque as pe as em um recipiente limpo e fa a a ltima lavagem com gua destilada Seque na estufa a aproximadamente 50 C n o ultrapasse esta temperatura durante no m ximo 2 horas ou deixe secar temperatura ambiente OBSERVA ES Use solu o de detergente com concentra o de 4 para limpeza de pipetas que apresentam pouca sujeira e concentra o de 8 para limpeza de pipetas que apresentarem muita sujeira Para as pipetas que ap s a lavagem continuarem apresentando algum tipo de sujeira limpe com algod o umedecido com lcool isoprop lico tomando cuidado para n o danificar o pist o 39 de 53 Volume II M dulo 1 Micropipetas Fundamentos e Opera o Sempre ap s o uso da pipeta com solu es cidas e ou corrosivas lavar todas as pe as com gua destilada ou etanol Monte a pipeta 9 2 Microbiologia e cultura celular Nestes campos necess ria a elimina o de uma s rie de microorganismos por exemplo v rus bact rias e ou fungos assim como leveduras V rias t cnicas com diferentes espectros e mecanismos de a o podem ser utilizadas 9 2 1 Autoclavagem A caracter stica do ciclo de esteriliza o depende da quantidade inicial de microorganismos a chamada carga microbial Geralmente aceita se que a chance de um organismo vi vel estar presente em um item autoclavado
58. polaridades As fases quimicamente ligadas s o teis para a cromatografia de compostos moderadamente polares Entretanto estes solutos podem tamb m ser eficientemente resolvidos no modo reverso de elui o ea escolha entre elui o no modo normal ou reverso usualmente mais dependente da matriz que do soluto 4 2 1 2 Cromatografia em fase reversa Enquanto na cromatografia em fase normal a fase estacion ria mais polar que a fase m vel no modo reverso a fase m vel mais polar que a fase estacion ria cromatografia em fase reversa mais utilizada em HPLC uma vez que permite a separa o de uma grande variedade de solutos e o uso de fases m veis aquosas fase m vel mais comumente utilizada uma mistura de acetonitrila gua sendo a acetonitrila quando necess ria substitu da por metanol ou tetrahidrofurano THF O uso de apenas estes tr s solventes deve se pequena quantidade de solventes org nicos misc veis em gua J no modo normal h uma maior variedade de solventes dispon veis O princ pio da separa o em fase reversa a hidrofobia e deve se principalmente intera es entre a parte n o polar do soluto e a fase estacion ria isto repuls o desta parte do soluto pela fase m vel aquosa importante ressaltar que a for a do solvente em fase reversa aumenta com o decr scimo da polaridade do solvente Assim temos que a for a da gua solvente mais fraco menor que a do me
59. por pessoal qualificado usando pesos rastre veis a autoridades reconhecidas nacionalmente Empresas Institui es credenciadas pelo INMETRO e pertencentes Rede Brasileira de Calibra o RBC 25 de 53 Volume II M dulo 1 Micropipetas Fundamentos e Opera o A legibilidade da balan a deve ser escolhida de acordo com o volume selecionado na pipeta que est sendo testada i Repetibilidade e Incerteza de Volume selecionado na Legibilidade mg P i ae pipeta sob teste linearidade mg medi o padr o mg de IuL a 10uL gt 10mLa200mL 1 2 2 Em termos pr ticos o volume nominal maior volume selecion vel pelo usu rio pode ser utilizado para a escolha da balan a 8 5 2 Outros equipamentos Term metro incerteza de medi o m xima de 0 2 C Higr metro incerteza de medi o m xima de 10 Bar metro incerteza de medi o m xima de 0 5 kPa 8 5 3 Recipientes Recipientes que ser o utilizados durante o procedimento Recipiente de origem E o recipiente que cont m a gua que ser utilizada para a realiza o das medidas o volume deste recipiente deve ser suficiente para a execu o de TODAS as medidas Recipiente para pesagem o recipiente que ser utilizado para a realiza o da medida o que ser colocado no prato de pesagem da balan a Recipiente de descarte
60. principais t cnicas em instrumenta o anal tica e quando aplicado suas principais rotinas de Qualifica o de Desempenho PQ descritas em literatura internacional 6 2 Espectrofotometria de ultra violeta vis vel UV VIS Para a Verifica o de Desempenho Qualifica o de Opera o de um instrumento anal tico o primeiro passo a ser realizado uma Manuten o Preventiva onde tem como objetivo verificar previamente o estado de funcionamento do instrumento prever e reparar poss vel problema encontrado 6 2 1 Manuten o preventiva A manuten o preventiva de um espectrofot metro de UV Vis parte vital para manter a vida til do instrumento e deve ser realizada em intervalos de 6 meses onde s o realizadas atividades espec ficas por um especialista Uma rotina de manuten o preventiva deve incluir Verifica o dos itens de seguran a do instrumento Inspe o do compartimento de amostras Verifica o das tampas e sensores de prote o Verifica o do sistema ptico Verifica o e limpeza da ptica externa Realiza o dos testes de desempenho do instrumento exatid o e precis o de comprimento de onda corre o de linha de base e ru do fotom trico Verifica o das condi es e alinhamento das l mpadas 66 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica Verifica o eletr nica Verifica o dos diagn sticos internos do instrumento Verifica o de font
61. purifica o de gua desde que devidamente calibrado Nos casos em que se utiliza um destilador que n o possui esse medidor acoplado a medi o dever ser realizada com um condutiv metro port til igualmente calibrado COT carbono oxid vel org nico total Ainda que se especifiquem os valores de COT para todos os tipos de gua apenas a gua Grau tipo I cr tica nesse aspecto pois a gua que entrar em contato com os equipamentos anal ticos e n veis elevados de COT poder o causar resultados prejudicados Este grau necessita portanto de acompanhamento sistem tico dos n veis de TOC A recomenda o que nos casos de equipamentos de ultrapurifica o de gua polidores finais estes j tenham acoplado um medidor de COT em linha devidamente calibrado Nos casos em que isto n o ocorra a medi o dever ser realizada em linha por equipamento utilizando a t cnica de fotooxida o para resistividades maiores que 3 megohm cm Freqgii ncia das medi es 2 2 3 1 Resistividade e condutividade 2 2 3 1 1 Diariamente para gua tipo I II HI ou IV 2 2 3 1 2 No momento da retirada da gua para gua tipo I 2 2 3 2 COT carbono oxid vel total 2 2 3 2 1 Nos casos em que n o h medidor incorporado ao equipamento a medi o de COT dever ser realizada pelo menos uma vez a cada quinzena 2 2 3 2 2 Nos casos em que o equipamento de ultrapurifica o dispor do medidor de TOC a medi o dever se
62. puxando o Desconecte a porca de conex o F separando assim o corpo da pipeta B do porta cone C Remova o conjunto do pist o cuidadosamente e separe os selos do pist o G e H mantendo o porta cone com a parte mais fina para baixo Frequentemente os selos do pist o ficam presos dentro do porta cone Para retir los deve se recolocar o pist o pression lo contra o potta cone como se fosse fazer uma pipetagem Retire o pist o que dever trazer preso a ele os selos 7 2 Limpeza Coloque o porta cone o conjunto do pist o ejetor de ponteiras os selos n o colocar o handle em um b quer completando seu volume com solu o de detergente neutro de 4 a 8 em gua morna 50 C Coloque o b quer no banho de ultra som e deixe aproximadamente 15 minutos caso n o tenha ultra som deixar na solu o por 40 minutos Descarte a solu o de detergente utilizada Lave cada pe a com gua corrente Coloque as pe as em um recipiente limpo e fa a a ltima lavagem com gua destilada Seque na estufa a aproximadamente 50 C n o ultrapasse esta temperatura durante no m ximo 2 horas ou deixe secar a temperatura ambiente OBSERVA ES Use solu o de detergente neutro com concentra o de 4 para limpeza de pipetas que apresentam pouca sujeira e concentra o de 8 para limpeza de pipetas que apresentarem muita sujeira Para as pipetas que ap s a lavagem continuarem
63. que nem s dio nem cloreto conseguem deix la Como resultado temos aqui um sistema em que os ons s o concentrados em algumas c lulas fluxo de descarte e est o praticamente ausentes em outras fluxo de produto Este processo pode ser utilizado para purificar gua mas extremamente lento uma vez que os ons teriam que se mover de uma c lula a uma membrana e em dire o ao eletrodo Para melhorar o desempenho do sistema as c lulas de produto s o preenchidas com resinas de troca i nica de leito misto ani nicas cati nicas Isto permite que haja uma transfer ncia i nica do centro da c lula em dire o membrana semiperme vel em vez de trafegar a baixa velocidade na gua onde os choques devidos aos movimentos brownianos diminuiriam sua progress o Assim os ons pulam de s tio ativo em s tio ativo da resina em dire o ao eletrodo de sinal oposto Esta configura o permite tamb m a captura de subst ncias org nicas de carga fraca As resinas s o continuamente regeneradas pois no campo el trico formado h a gera o de H e OH formando microambientes em torno das resinas Por m o processo de purifica o por eletrodeioniza o cont nua necessita ser alimentado com uma gua j previamente purificada por osmose reversa de forma que a concentra o de sais j esteja atenuada Au 0H m Hr Anodo C todo CI Na Ng o cl Nat H C Nat cr a produto Figura 6 Resinas d
64. quida s teorias e instrumenta es desenvolvidas originalmente para a cromatografia gasosa A cromatografia l quida de alta efici ncia HPLC ocupa atualmente uma posi o de destaque entre os m todos modernos de separa o pois considerada indispens vel sendo a diferen a entre a cromatografia l quida e a cromatografia l quida de alta efici ncia HPLC a utiliza o de fases estacion rias com micropart culas 10 5 ou 3mm esf ricas de prefer ncia Estas fases por serem muito menos perme veis tornaram necess ria a utiliza o de bombas para a elui o da fase m vel 4 2 Princ pio da t cnica A separa o cromatogr fica baseia se na migra o diferencial dos componentes de uma mistura que ocorre devido s diferen as entre duas fases imisc veis a fase m vel e a fase estacion ria e no alargamento de bandas que dependente de processos f sicos e n o da diferen a de equil brio Estas intera es podem ser realizadas por meio de intera es do tipo pontes de hidrog nio intera es eletrost ticas e hidrof bicas ou for as de Van der Waals entre outras A migra o diferencial resulta da diferen a de equil brio dos analitos entre as duas fases imisc veis e determinada pelos fatores que afetam este equil brio Composi o da fase m vel composi o da fase estacion ria e temperatura da separa o Mudan as em qualquer um destes fatores levam a altera es na migra o diferen
65. s o toleradas pelos equipamentos portanto fundamental que se conhe a a estabilidade de tens o e que a mesma seja compat vel com as especifica es necess rias de cada modelo 5 4 3 Condi es ambientais As condi es ambientais para sistemas de LC MS n o se resumem apenas temperatura e umidade Estes tipos de equipamentos requerem tamb m alimenta o de g s e alguns necessitam de circula o de gua refrigerada al m da exaust o A temperatura da sala onde o LC MS ser instalado deve ser controlada sem grandes varia es durante o uso O t pico requerido pelos fabricantes de 25 C com varia o de 2 C Um sistema de LC MS dissipa um calor de 6800 a 8000 BTU s que deve ser levado em conta no dimensionamento do ar condicionado A umidade deve estar abaixo de 95 e n o dever ocorrer condensa o A alimenta o de g s nitrog nio pode vir de cilindros compartimentos de nitrog nio l quido ou de geradores de nitrog nio sendo este ltimo o ma indicado O consumo t pico da ordem de 15 L min e a pureza deve ser de 99 5 para cilindros e 98 0 para as outras fontes de nitrog nio A press o de trabalho deve ser de 80 a 100 psi O local tamb m deve possuir exaust o com capacidade m nima de 15 L min que dever ser conectada na sa da da bomba de v cuo e da fonte de ioniza o 5 5 Cuidados b sicos A manuten o por parte do usu rio de fundamental import
66. s o utilizados solventes com hetero tomos por exemplo H3 COH que devido s transi es eletr nicas s apresentam fracas bandas de absor o Deve se tamb m enfocar este problema partindo se do grau de polaridade do solvente As bandas de absor o de muitas subst ncias s o mais claras e podem mostrar estruturas finas quando a medi o se d em solventes de baixo momento bipolar As intera es solvente soluto s o muito mais fortes quando est o envolvidas fortes for as bipolares A figura 8 mostra dois espectros realizados com fenol em iso octano e etanol onde se pode observar a influ ncia do solvente org nico na determina o de subst ncias 15r 12 o s D6 nar 220 Figura 8 Fenol em iso octano e etanol Uma diferen a de pH tamb m pode provocar varia es neste caso de deslocamento de comprimento de onda 14 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica 2 3 Descri o b sica do sistema O sistema figura 9 que compreende um espectrofot metro de UV VIS constitu do por Fonte de luz Monocromador Compartimento de amostra Detetor pioa ow pH Sistema de leitura e Fenda de Entrada Elemento Dispersivo Fenda de Sa da Figura 9 Espectrofot metro de UV Vis 2 3 1 Fontes de radia o A espectrofotometria de UV Vis requer fontes capazes de produzir radia o cont nua naquelas regi es espectrais de interesse As fontes
67. suficiente para que subst ncias contendo N e P d em resposta ao detector 29 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica COLETOR P ROLA CER MICA PROBE DA P ROLA FLAME TIP H2 e MAKE as COLUNA Figura 8 Detector TSD ou NPD 3 3 5 3 Detector de captura de el trons ECD Este detector sens vel a mol culas que apresentam tomos com muita afinidade eletr nica e possui no seu interior uma fonte radioativa comumente de Ni a qual um emissor de part culas beta Estas part culas causam ioniza o do g s de arraste normalmente nitrog nio e produz uma nuvem de el trons dentro da c lula do ECD Os el trons produzem uma corrente de background est vel atrav s dos eletrodos da c lula do ECD Este sinal amplificado pelo eletr metro do detector Quando uma esp cie absorvente de el trons passa pela c lula h uma diminui o de corrente pois os el trons s o capturados pela esp cie absorvente diminuindo o n mero de el trons na c lula ISOLA O EL TRONS PROBE DA C LULA C LULA ELETRODO COLETOR PROBE DE SINAL ISOLADORES CER MICOS COLUNA Figura 9 Detector ECD 30 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica 3 3 6 Aquisi o e processamento de dados A aquisi o e processamento de dados foram tratados no item 4 6 da t cnica de HPLC 3 4 Requisitos m nimos de instala o e opera o
68. utilizados para colunas capilares do tipo megabore com di metro interno de coluna gt 0 53 mm Toda a amostra injetada diretamente na cabe a da coluna cromatogr fica Com isso eliminada toda e qualquer perda da amostra na transfer ncia para a coluna o injetor indicado para amostras limpas dilu das e com grande varia o de volatilidade dos compostos presentes Figura 3 Injetor empacotado 25 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica 3 3 3 2 Injetores capilares S o injetores desenhados para o uso de colunas capilares Os principais injetores s o Injetor Split Splitless S o os injetores mais utilizados Permitem que se fa a uma divis o da amostra a fim de que se possa trabalhar com as colunas capilares pois estas t m uma capacidade de receber uma pequena quantidade de amostra Existem dois modos de opera o Modo split A amostra injetada dividida entre a coluna e a sa da para descarte do injetor vent A v lvula que executa esta divis o chamada de splitter e utilizada para amostras concentradas em n vel de mg ml Modo splitless Utilizado para amostras dilu das Neste caso o splitter permanecer fechado durante a transfer ncia do soluto para a coluna ap s isso o splitter aberto para o descarte do solvente Figura 4 Injetor split splitless Injetor on column e ou com temperatura program vel Permite dois modos de opera o Inje o o
69. 200 sem limite M ximo ug L A medida do pH da gua grau reagente tipo 1 II e II eliminada das especifica es pelo fato da gua nesses graus de purifica o n o conter componentes em quantidades suficientes para significar a altera o do pH Os m todos de prepara o dos v rios tipos de gua determinam os limites de impurezas e dever o seguir as seguintes especifica es 21 1 2 1 2 2 1 3 Grau tipo I de gua reagente dever ser preparado por um processo de pr purifica o adequado seguido por um polimento realizado com sistema de ultrapurifica o composto por resina de troca i nica de leito misto e membrana final de 0 22um A prepara o deve ser realizada sempre no momento do uso recomendado mas n o obrigat rio que o sistema de ultrapurifica o polimento final possua uma l mpada UV com emiss o de 185 e 254 nm de forma a reduzir ao m ximo os n veis de COT Al m disso tamb m recomendado mas n o obrigat rio que o equipamento de ultrapurifica o polimento final possua um medidor de COT em linha para monitoramento constante dos contaminantes org nicos O abastecimento pretratamento do passo final da gua dever apresentar no m ximo 10 uS cm de condutividade a 25 C Grau tipo II de gua reagente dever ser preparada por processo de osmose reversa combinado por eletrodeioniza o destila o ou troca i nica tendo uma condutividade menor que 1 0 uS cm a 25 C T
70. 3 Padr o externo 46 46 4 3 6 4 Padr o interno 4 4 Requisitos m nimos de instala o e opera o 4 4 1 Requisitos da bancada 4 4 2 Rede el trica 4 4 3 Condi es ambient 4 5 Cuidados b sicos SISTEMAS DE CROMATOGRAFIA ACOPLADOS A DETECTORES DE MASSA 5 1 Introdu o 5 2 Princ pio da t cnica 5 3 Descri o b sica do sistema 5 3 1 Fonte de ioniza o 5 3 1 1 Impacto de el trons El 5 3 1 2 Toniza o qu mica CI 5 3 1 3 Electrospray ES 5 3 2 Analisadores de massas 5 3 2 1 Analisadores de massas quadrupolar 3 2 2 Analisadores de massas quadrupolar ion trap 5 3 2 3 Espectrometria de massas sequencial tandem mass spectrometry 57 5 3 3 Detectores 5 3 3 1 Multiplicadores de el trons 5 3 3 2 Placas microcanais 5 3 3 3 Foto multiplicador 5 Aquisi o e processamento de dado 5 4 Requisitos m nimos de instala o e opera o 5 4 1 Requisitos da bancada 5 4 2 Rede el trica 5 4 3 Condi es ambientais 5 5 Cuidados b sicos 62 5 5 1 Sistema de v cuo 62 5 5 2 Fonte de ons 63 5 5 3 Sistema de nitrog nio 4 Treinamento em cuidados b si 63 5 5 5 Arquivos de sintonia 64 VERIFICA O DE DESEMPENHO DE INSTRUMENTOS ANAL TICOS 6 1 Introdu o 64 65 6 1 1 DQ Qua
71. 32 de 53 Volume II M dulo 1 Micropipetas Fundamentos e Opera o TABELA 2 Esta tabela de especifica es se aplica s pipetas de deslocamento positivo que utilizem capilares e pist es reutiliz veis e ou com volume fixo Volume Erros permiss veis m ximos Erros permiss veis m ximos Nominal sistem tico aleat rio 15 20 15 500 T q 1000 12 12 0 04 4 0 Para volumes intermedi rios aos relacionadas na tabela o valor absoluto dos erros m ximos aceit veis do volume imediatamente maior se aplicam OBSERVA ES O usu rio pode definir os erros m ximos aceit veis sistem tico e rand mico com base na sua metodologia O usu rio deve testar seu equipamento regularmente como por exemplo a cada tr s meses Outros intervalos de tempo entre os testes podem ser estabelecidos desde que n o ultrapasse um ano com base nos seguintes aspectos frequ ncia de uso n mero de usu rios da pipeta natureza agressiva do material transferido os erro m ximos aceitos pelo usu rio Quando o teste for feito ap s manuten o ou reparo do equipamento os erros m ximos aceit veis sistem tico e aleat rio devem obedecer s tabelas relacionadas neste documento tabela 1 e 2 8 6 5 Relat rio do procedimento de verifica o Ap s o teste necess rio que as informa es sejam registradas Anexamos um modelo de relat rio
72. 5 3 o E 2 2 D e g o o o S e g T o ks N amp o gt E e T 5 ka E lt S O E E e e ka o e S 5 S E E G 5 3 5 i E 2 Ed I cidos bases E 7 leos graxas E E E E T a it Bact rias Gram Bact rias Gram Micobact rias SI E Esporos s Fungos V rus C lulas Proteases cidos Nucl icos E R RNases E x Radiatividade E T 44 de 53 Volume II M dulo 1 Micropipetas Fundamentos e Opera o N vel de atividade forte m dio fraco sem atividade SI sem informa o detergentes espec ficos com agentes complexantes Para irradia o UV alguma atividade nenhuma atividade O limite de atividade da irradia o UV dif cil de avaliar j que sua a o n o depende apenas do comprimento de onda entre 100 nm e 400 nm mas tamb m de outros fatores como tempo de exposi o dist ncia da l mpada densidade de emiss o ngulo de exposi o e temperatura atmosf rica 9 5 Vantagens e desvantagens Consulte a tabela a seguir O m todo deve preencher os seguintes requisitos Compatibilidade com os materiais de fabrica o da pipeta A o r pida F cil e seguro de realizar M todo Vantagens Desv
73. Ag ncia Nacional de Vigil ncia Sanit ria ur a 4 DA SAUDE ea MINIST RIO T ANVISA Gerente Geral de Inspe o e Controle de Medicamentos e Produtos Ant nio Carlos da Costa Bezerra Coordena o de Inspe o em Centros de Bioequival ncia Cl udia Franklin de Oliveira E mail bioequivalencia anvisa gov br Ag ncia Nacional de Vigil ncia Sanit ria Manual de Boas Pr ticas em Biodisponibilidade Bioequival ncia Volume Il Bras lia 2002 Direitos reservados da Ag ncia Nacional de Vigil ncia Sanit ria SEPN 515 Edif cio mega Bloco B Bras lia DF CEP 70770 502 Internet www anvisa gov br Copyright O 2002 Ag ncia Nacional de Vigil ncia Sanit ria Permitida a reprodu o total ou parcial desta obra desde que citada a fonte 1 edi o 2002 ISBN 85 88233 06 1 Ag ncia Nacional de Vigil ncia Sanit ria Realiza o Coordena o de Inspe o em Centros de Bioequival ncia Ger ncia Geral de Inspe o e Controle de Medicamentos e Produtos Coordena o Geral Cl udia Franklin de Oliveira Coordena o de Inspe o em Centros de Bioequival ncia Revis o Karla de Ara jo Ferreira Coordena o de Inspe o em Centros de Bioequival ncia Divulga o Unidade de Divulga o Capas Jo o Carlos de Souza Machado Ger ncia de Comunica o Multim dia Diagrama o composi o e impress o Dupligr fica Editora Ltda DF Impresso no Brasil Manual de boas pr t
74. Gilutaralde do Etanol 70 Sal de am nio k x E E quatern rio N vel de atividade forte m dio fraco sem atividade Os mecanismos de a o destes agentes qu micos est o descritos na tabela a seguir Agente qu mico A o Hipoclorito de s dio Oxida componentes celulares Glutaralde do Alquila e inativa prote nas Parece dissolver lip dios da membrana Etanol 70 Denatura prote nas on S Danifica a membrana do microorganismo Sal de am nio quatern rio Denatura prote nas 9 3 Biologia molecular Os bioqu micos e biologistas moleculares est o familiarizados com as fontes de contamina o como proteases cido nucl ico contaminantes DNA RNA nucleases RNases DNases e radioatividade 9 3 1 Proteases Proteases s o enzimas que degradam prote nas V rios m todos de descontamina o e seus mecanismos de a o est o detalhados na tabela a seguir 41 de 53 Volume II M dulo 1 Micropipetas Fundamentos e Opera o M todo Agente qu mico A o O calor denatura as enzimas e outras prote nas essenciais Autoclavagem pesa X Oxida o de prote nas Hipoclorito de s dio e K K a Rompe pontes dissulfeto e outras liga es das prote nas per xido de hidrog nio H202 Glutaralde do Rompe a estrutura das prote nas lcoois Rompe as estru
75. Polymerase Chain Reaction BioTechniques 10 4 442 Part 1 terminology general i prEN ISO FDIS 8655 2 Piston operated volumetric apparatus Part 2 pipettes x prEN ISO FDIS 8655 6 Piston operated volumetric apparatus Part 6 Gravimetric test methods Prince A M and Andrus L 1992 PCR how to kill unwanted DNA BioTechniques 12 3 358 360 Sambrook Fritsch and Maniatis 1989 In Vitro Amplification of DNA by the Polymerase Chain Reaction In Molecular Cloning A Laboratory Manual 2nd ed 14 14 Taibi C T infection existe sa pr vention aussi Guide pratique d hygi ne hospitali re 52 de 53 Volume II M dulo 1 Micropipetas Fundamentos e Opera o Tritt C S 1997 Sterilization methods ttp mm msoe edu tritt be4xx stermeth html Van Bueren J Simpson R A Salman H Farelly H D and Cookson B D 1995 Inactivation of HIVA by chemical disinfectants sodium hypochlorite Epidemiol Infect 115 3 567 579 Le contr le des micro organismes par les agents physiques et chimiques Partie 4 chapitre 5 le contr le des micro organismes Extraction and purification of RNA Extraction purification and analysis of messenger RNA from eukaryotic cells 1 3 7 5 Sterilization and sterility assurance of compendial articles USPXXI Szerilization and sterility assurance general information Avoiding Ribonuclease contamination neb com
76. Q necess rio que os requisitos de instala o e opera o sejam cumpridos neste caso podemos citar o seguinte Rede el trica que atenda as especifica es do fabricante com aten o especial na estabiliza o da rede el trica Instrumento localizado em condi es devidas de umidade e temperatura Conhecimento operacional do instrumento para utiliz lo corretamente 20 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica 2 5 Cuidados b sicos Os cuidados a serem tomados com rela o ao instrumento para preservar a vida til e desempenho atividades a serem executadas do mesmo est o relacionados a dois grupos de atividades que s pelo usu rio e atividades referentes a manuten o preventiva normalmente executadas pelo fabricante Estaremos abordando nesta se o as atividades a serem exercidas pelo usu rio sendo que as atividades a serem exercidas pelo fabricante est o descritas na se o verifica o de desempenho As atividades que s o realizadas no dia a dia pelo usu rio s o de fundamental import ncia para a atenua o de danos que podem ser causados ao instrumento Estas atividades normalmente s o simples e podem ser resumidas em Limpeza externa do instrumento Limpeza do compartimento de amostras Lavagem das cubetas Consultar os manuais fornecedor do instrumento para eliminar d vidas de opera o manuten o Limpeza das janelas de quarto que faze
77. Rafael Eliseo Barrientos Astigarraga Cartesius Silvana Calafatti de Castro Unifag Tha s Reis Machado Jaime Oliveira Ilha Cartesius Itapuan Abimael Silva Anvisa Karen Noffs Brisolla Anvisa Marcelo Cl udio Pereira Anvisa no m dulo Etapa Anal tica os editores Arminda Lucia Siqueira UFMG Chang Chiann GGMEG SP Cicilia Yuko Wada Unicamp Karla de Ara jo Ferreira Anvisa e Gilberto Bernasconi USF Unifag e os colaboradores Reinaldo Charnet Unicamp e Renato Almeida Lopes Anvisa no m dulo Etapa Estat tica os editores Melissa M Silva Nova Anal tica e Walter Pereira Nova Anal tica Fundamentos e Opera o de Micropipetas o editor Jos Muradian Filho Millipore gua para An lises Cl nicas os editores Ivan Jonaitis Agilent Renato Garcia Peres Flowscience Ricardo Lira Flowscience Renato Gouveia Jos Aparecido Soares Varian Josu D M Neto Sync Brasil Juarez Ara jo Filho Sync Brasil Alexandre Rosolia Waters Adauto Silva Varian e Reinaldo Castanheira Agilent Instrumenta o Anal tica e a equipe de coordena o formada por Cl udia Franklin de Oliveira GGIMP Anvisa Marcelo Cl udio Pereira GGIMP Anvisa Max Weber Marques Pereira GGIMP Anvisa Karla de Ara jo Ferreira GGIMP Anvisa Karen Noffs Brisolla GGIMP Anvisa Itapuan Abimael da Silva GGIMP Anvisa e Renato Almeida Lopes GGIMP Anvisa Dr Gonzalo Vecina Neto Manual de Boas Pr ticas em Biodisponib
78. S Nestes instrumentos os ons s o selecionados atrav s da aplica o de pulsos de tens es espec ficas e as dissocia es ocorrem normalmente por colis es com outros gases 5 3 3 Detectores Ap s feita a sele o de ons pelo analisador estes s o direcionados ao detector onde ser o transfor mados em um sinal mensur vel Os detectores podem ser divididos em tr s grupos As placas foto sens veis e as gaiolas de Faraday encontram se no primeiro grupo e relacionam o sinal medido diretamente quantidade do on analisado No segundo grupo encontram se os multiplicadores de el trons os foto multiplicadores e as placas microcanais que amplificam a intensidade do sinal recebido Estes s o os mais utilizados e ser o discutidos aqui O terceiro grupo utilizado nos aparelhos de ICR FTMS e consistem em um detector de radiofrequ ncia que aplicado aos ons aprisionados 5 3 3 1 Multiplicadores de el trons Quando ons positivos ou negativos atingem o dinodo de convers o no qual aplicado um poten cial negativo estes causam a emiss o de diversos el trons secund rios Esses el trons s o acelerados para dentro de um multiplicador de el trons e atingem suas paredes com energia suficiente para arrancar alguns eletr ns Esses el trons atingir o o outro lado da parede liberando assim mais el trons Este efeito cascata continua at que finalmente uma corrente mensur vel criada no final do mult
79. a 2 Pureza dos gases Detector Pureza Observa es Condutividade T rmica TCD He 3 ppm H20 5 ppm G s de arraste p o Injetor_ He Ne Ha Ar 99 999 Oz G s do make up He No H Ar Filtro da g s de amante recomendado Captura de El trons ECD N 0 02 ppm H3O 1 ppm O G s de arraste p o Injetor He No 99 999 G s do make up No Filtros de g s de arraste e oxig nio recomendado loniza o de Chama FID Teor de A x hidrocarbonetos G s de arraste p o Injetor He No Ho 99 999 antrola do G s p o detector H2 99 999 Filtro de g s de arraste Ar sint tico Ar respir vel recomendado G s do make up He N Nitrog nio e F sforo NPD ou Termo i nico Espec fico TSD G s de arraste p o Injetor He No G s p o detector Hz 99 999 Filtro de g s de arraste 99 999 recomendado Ar respir vel Ar sint tico G s do make up He No Fotom trico de Chama FPD ou PFPD G s de arraste p o Injetor He Ne Ha 99 999 Filtro de g s de arraste G s p o detector Hz 99 999 recomendado Ar sint tico Ar respir vel G s do make up N A 31 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica 3 5 Cuidados b sicos Para a garantia de bons resultados s o necess rios alguns cuidados com o GC que geralmente s o procedimentos simples por m importantes para o bom funcionamento do equipamento Um dos cuidados mais comuns o
80. a esta faixa de volume se deve adotar o seguinte procedimento ap s observar 20 segundos se h ou n o forma o de gota mergulhe a ponta da ponteira no recipiente com gua O n vel de gua dentro da ponteira n o deve ser alterado Caso ele diminua significa que h vazamentos causa do vazamento pode ser Selos do pist o danificados Pist o riscado ou corro do 19 de 53 Volume II M dulo 1 Micropipetas Fundamentos e Opera o Danos qu micos ou mec nicos no porta cone na regi o onde se encaixa a ponteira Uso de ponteiras n o recomendadas pelo fabricante ver cap tulo 4 4 ETAPA DESMONTAGEM Este processo deve ser adotado caso tenha ocorrido vazamento na etapa 3 Ao desmontar a pipeta pode se avaliar as pe as internas e chegar a uma conclus o sobre a causa do problema pist o danificado selos de veda o ausentes ou comprometidos etc e definir quais pe as devem ser trocadas Abaixo segue um exemplo de roteiro de desmontagem adotado para determinados modelos de pipetas N o deixe de seguir as instru es do fabricante para desmontar a pipeta Puxe para baixo e retire o ejetor de ponteiras em alguns modelos o ejetor n o destac vel Retire a porca de conex o Remova o pist o cuidadosamente Verifique a superf cie do pist o se est corro da e ou riscada e os selos de veda o 5 ETAPA MONTAGEM Monte a pipeta segundo instru es do fabricante
81. a evapora o durante o processo de pesagem An lise gravim trica procedimento geral baseado na determina o da massa das al quotas de gua dispensadas por uma pipeta Os valores s o corrigidos com rela o perda por evapora o e ent o a massa real e o volume s o calculados com base na densidade da gua em temperaturas espec ficas com corre es para a press o atmosf rica do local fator Z Volume nominal maior volume selecion vel pelo usu rio e especificado pelo fabricante Nota isto significa que para uma pipeta de volume vari vel com uma faixa de volume til de 10y a 100 o seu volume nominal 100p Volume selecionado volume ajustado pelo usu rio para a dispensa do volume escolhido dentro da faixa de volume til Nota para as pipetas e volume fixo o volume selecionado igual ao volume nominal Precis o erro aleat rio dispers o dos volumes dispensados ao redor da m dia dos volumes dispensados Tamb m conhecida de acordo com o contexto como desvio padr o reprodutibilidade ou repetibilidade Repetibilidade a dispers o entre os resultados de medidas sucessivas realizadas em um curto espa o de tempo onde n o h altera o dos par metros nem das condi es Reprodutibilidade a dispers o entre os resultados de medidas realizadas em condi es diferentes local ou operador diferente mantendo todos os par metros constantes Especifica es volum tricas erros m ximos a
82. a resolu o do comprimento de onda analisado da amostra e ao mesmo tempo uma maior quantidade de luz transmitida e baixa quantidade de luz esp ria quantidade de luz que n o foi devidamente isolada pelo sistema ptico A configura o do sistema ptico tem que permitir Alta efici ncia de transfer ncia entre a fonte de luz e o monocromador Adequada fenda de sa da do monocromador para evitar a perda excessiva de luminosidade Maior focaliza o do feixe da fonte de luz na amostra 16 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica Na figura 10 abaixo a ilustra o de um monocromador normalmente utilizado na confec o de espectrofot metros de UV Vis Figura 10 Monocromador Czerny Turner Al m desta configura o existem outras tamb m usuais como Littrow Ebert e Concave Grating Estas configura es de monocromadores poder o estar presentes nos seguintes tipos de espectrofot metros de UV VIS Espectrofot metros UV VIS de Simples Feixe Espectrofot metros UV VIS de Arranjo de Diodos Espectrofot metros UV VIS de Duplo Feixe 2 3 2 1 Simples feixe Neste tipo de espectrofot metro a dispers o do feixe de luz do monocromador totalmente focalizada no compartimento da amostra e consequentemente a luz n o absorvida direcionada ao sistema de detec o composto por um detector normalmente do tipo fotodiodo A constru o de instrumentos de feixe simples req
83. a se o cromatograma Podem ser integradores ou softwares de integra o PC 23 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica Injetor Detector Cromatograma Controlador de Press o Pneum ticos Coluna Esta o de Trabalho Forno de Coluna g Figura 2 Sistema de cromatografia em fase gasosa GC 3 3 1 Gases utilizados Existem duas classes de gases que podem ser utilizados no sistema cromatogr fico os gases de arraste fase m vel e os gases auxiliares Como g s de arraste os mais utilizados s o o nitrog nio arg nio hidrog nio e o h lio O g s mais indicado o h lio pois apresenta melhor desempenho cromatogr fico que os outros gases por m alguns fatores s o decisivos na escolha do g s de arraste como Compatibilidade com o detector necess rio analisar se o g s de arraste compat vel com o detector e este pode causar perda de sensibilidade ou ru do excessivo P ex para a an lise de g s Hidrog nio no TCD o Nitrog nio e o Arg nio conferem maior sensibilidade do que o H lio pois a diferen a de condutividade t rmica entre os dois primeiros e o Hidrog nio maior que a diferen a de condutividade t rmica entre o Hidrog nio e o H lio Custo Disponibilidade Desempenho Pureza Deve se respeitar a pureza dos gases dependendo da aplica o Os manuais dos fabricantes cont m as informa es necess rias 24 de 76 Volume II M du
84. ades iguais das mesmas deve se obter reas iguais para todos os picos O c lculo para a amostra o seguinte Conc do componente Yo rea do componente x 100 reas de todos os componentes 4 3 6 2 Normaliza o de rea O princ pio o mesmo da porcentagem de rea por m se faz a corre o da resposta do detector para cada subst ncia utilizando um dos picos como refer ncia de c lculo Para esse m todo necess ria a inje o de um padr o para o c lculo do fator de resposta de cada pico como na f rmula abaixo Fator de resposta do rea do componente x Conc do componente de Refer ncia componente A Conc do componente A rea do componente de Refer ncia Tendo o fator de resposta de cada componente podemos analisar a amostra utilizando a seguinte equa o Concentra o do rea do componente x Fator resposta do componente A componente A reas de todos os componentes x Fat resp todos comp 45 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica 4 3 6 3 Padr o externo O padr o externo o m todo mais comum de calibra o Consiste em fazer a quantifica o da amostra atrav s da inje o de padr es com concentra es conhecidas Faz se a rela o da rea do padr o com a concentra o e se obt m o fator de resposta para cada composto conforme equa o abaixo Fator de resposta do rea do componente componente A Co
85. ados com o segundo quadrup lo Q2 mol cula do g s fonte de ions de colis o Q1 forma o de ions produto espectro de espectro de massas total massas por CID m z Deste modo poss vel por exemplo obter informa es sobre a sequ ncia de um pept deo selecionando o on correspondente ao pept deo protonado denomidado on precurssor e analisando os fragmentos de sua estrutura com Q2 Este processo chamado de varredura de ions produto Muitos outros tipos de varredura ou experi ncias anal ticas podem ser realizadas Por exemplo a procura de todos os precursores de um determinado fragmento denominada varredura de ons 57 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica precursores Isto alcan ado mantendo se Q2 est tico na raz o massa carga do on em quest o e varrendo todos os ons presentes em Q1 enquanto se realiza dissocia es por colis es em q Em outro modo de varredura a identifica o de ons que apresentam uma perda de um fragmento espec fico pode ser realizada varrendo se Q1 e Q2 simultaneamente mantendo se a diferen a de massa entre os quadrup los igual massa do fragmento neutro perdido A segii ncia no tempo pode ser conseguida atrav s de dispositivos on trap e espectr metros de massa ICR tamb m chamados de FTMS Estes instrumentos n o est o de fato limitados a experimentos MS MS mas podem atingir m ltiplos est gios MS MS MS MS ou M
86. ados relativos seguran a quando da manipula o do equipamento O uso de avental luvas e culos de prote o previne danos de consequ ncias graves como a cegueira ou contamina o com amostras por exemplo plasma A descontamina o do sistema obrigat ria quando houver manuten o visando sempre a integridade da sa de da pessoa que ir realiz la 5 5 5 Arquivos de sintonia Os sistemas de LC MS possuem programas de sintonia autotune que devem ser executados em intervalos regulares Estes programas geram relat rios que devem ser arquivados para hist rico de bom funcionamento e ajuda em interven es de reparos Os cuidados b sicos com o equipamento assim como a verifica o de seu desempenho variam muito de um equipamento para outro Desta maneira os melhores procedimentos para realiza o destas tarefas s o aqueles sugeridos pelo pr prio fabricante Estes procedimentos devem ser lidos e um procedimento de opera o padr o POP criado estabelecendo a frequ ncia e o tipo de tarefa a ser realizada Qualquer n o conformidade com este POP dever ser anotada e justificada 63 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica STRUMENTOS ANAL TICOS O DE DESEMPENHO DE IN 6 1 Introdu o Em meados dos anos 90 a verifica o de desempenho de instrumentos come a a ter maior import ncia e o primeiro enfoque foi para sistemas de HPLC em decorr ncia de sua larga utiliza
87. agentes qu micos recomendada detergente e desinfetante em um nico produto O corpo da pipeta deve ser limpo com uma solu o compat vel veja item 3 3 apenas na sua superf cie n o mergulhe o corpo da pipeta na solu o descontaminante A parte inferior da pipeta que inclui pist o ejetor de ponteiras porta cone e porca de conex o com exce o dos selos do pist o tamb m devem ser limpos utilizando se escovas pequenas para limpar a parte interna do porta cone ou podem ser imersos seguindo o procedimentos segui Remova ejetor de ponteiras desrosqueie a porca de conex o e remova o pist o do porta cone Dilua o agente qu mico selecionado de acordo com as instru es do fabricante em um b quer Coloque as partes inferiores pist o ejetor de ponteiras porta cone e porca de conex o desmontadas no b quer Enx gue muito bem primeiramente com gua corrente de torneira e depois com gua destilada Seque a 50 C 60 C por 30 min Deixe as pe as em temperatura ambiente por 15 min antes de montar a pipeta Conclus o O m todo de descontamina o da pipeta selecionado de acordo com seu tipo de aplica o Descontaminar completamente as pe as inferiores e limpar o corpo com a solu o de escolha suficiente para a maioria das aplica es veja 3 3 2 48 de 53 Volume II M dulo 1 Micropipetas Fundamentos e Opera o Ap ndice 1 E os materiais descart
88. agma Seu funcionamento baseia se em um motor el trico conectado a engrenagens que movimentam um sistema de pist es Devido ao fato deste tipo de bomba produzir fluxos pulsantes decorrentes do movimento de ida e volta do s pist o pist es alguns recursos foram desenvolvidos para contornar este problema estes mecanismos s o chamados de amortecedores de pulso As Bombas anal ticas atuais s o projetadas para operar em altas press es e em taxas de fluxo que variam entre 0 01 a 10mL min S o normalmente constru das de material inerte como a o inoxid vel nas cabe as de bombeamento tubula es e conex es safira quartzo cer mica ou tit nio nos pist es rubi nas v lvulas de fluxo check valves e materiais inertes nos diversos selos de veda o existentes 4 3 3 Introdu o de amostra injetor O injetor o m dulo no qual as amostras ser o introduzidas no sistema de HPLC para que seja realizada a separa o na coluna O injetor pode ser manual onde o usu rio introduz a amostra com o aux lio de uma microseringa de ponta reta ou autom tico tamb m chamado auto injetor ou amostrador autom tico o qual capaz de injetar um grande n mero de amostras automaticamente e at mesmo realizar opera es de dilui o derivatiza o ou adi o de reagentes 4 3 3 1 Injetor manual Os injetores manuais mais utilizados s o basicamente do tipo v lvula os quais possuem uma al a de amostragem externa
89. ama extensiva de biomol culas foi investigada por ES A amostra normalmente dissolvida em uma mistura de gua e solvente org nico comumente metanol isopropanol ou acetonitrila podendo ser infundida diretamente ou injetada em fluxo cont nuo ou seja contida no eluente de uma coluna de HPLC ou coluna capilar de CE A fonte de ES simples com a forma o de um spray que acontece em um campo de alta voltagem como mostrado na Figura 5 Em um mecanismo proposto acredita se que a forma o do on o resultado de um processo de evapora o de i nica primeiramente proposto em 1976 Um spray de got culas gerado pela dispers o electrost tica do l quido lan ado pela ponta do capilar Favorecido por um g s aquecido normalmente nitrog nio as got culas sofrem desagrega o perdendo mol culas de solvente no processo e eventualmente produzindo ons individuais Em outro mecanismo proposto a desolvata o das got culas conduz a uma densidade de carga crescente na superf cie da gota que causar uma explos o coulombica que conduz eventualmente ons individuais S T Bomba S S S e a lt Q a MH va O OL st Ns Press o Bomba Atmosf rica Gota Clusters e Gota Menor esp cies i nicas la s Seja qual for o mecanismo proposto os ons s o formados press o atmosf rica e entram em um orif cio localizado no v rtice de um cone que age como uma primeira barreira para a fase de v cuo Um coletor skimmer
90. antagens Autoclavagem Aparelhagem comum Mata mas n o limpa sendo necess rio outro procedimento para limpeza Est gio de secagem ap s o t rmino do ciclo Tempo de espera para estabiliza o temperatura ambiente N o eficiente para todos os microorganismos Mata mas n o limpa sendo necess rio outro procedimento para limpeza Penetra o baixa apenas descontamina o externa Irradia o UV F cil e r pido Porta cone pode ficar amarelado Degrada o de alguns tipos de materiais pl sticos PMP Danifica os cidos nucl icos mas tem seu efeito desconhecido sobre as RNases F cil T xico quando utilizado em grandes concentra es Agentes qu micos Baixo custo Algumas vezes irritante DEPC carcinog nico Abrange toda pipeta Est gio de secagem ap s t rmino do ciclo para P200 e P1000 Aqueles feitos de PVDF Porta cone resistente radia o UV feitos de PBT est o dispon veis Assim sendo os procedimentos qu micos podem ser considerados como os mais aplic veis para a descontamina o das pipetas 45 de 53 Volume II M dulo 1 Micropipetas Fundamentos e Opera o Protocolos De acordo com o m todo utilizado diferentes partes da pipeta podem ser descontaminadas M todo Parte da pipeta Autoclavagem Porta cone porca de conex o ejetor de ponteiras Irradia o UV Partes externas Solu es qu micas Diferentes n
91. apresentando algum tipo de sujeira limpe com algod o umedecido com lcool isoprop lico tomando cuidado para n o danificar o pist o Sempre ap s o uso da pipeta com solu es cidas e ou corrosivas lavar todas as pe as com gua destilada ou etanol 7 3 Montagem Coloque o selo e o ring no pist o encaixando em primeiro lugar o selo Com uma das m os segure o corpo da pipeta na posi o vertical e coloque o pist o Encaixe o porta cone no corpo da pipeta Em seguida coloque e atarraxe a porca da conex Coloque o ejetor de ponteiras pipeta est pronta pata uso 23 de 53 Volume II M dulo 1 Micropipetas Fundamentos e Opera o PADR O DA PERFORMANCE 8 1 Considera es gerais Este anexo descreve o procedimento para verifica o da performance das pipetas utilizando se o m todo gravim trico segundo norma ISO FDIS 8655 Piston operated volumetric apparatus Part 6 Gravimetric tests A utiliza o dos procedimentos descritos neste m todo garante conformidade com as especifica es internacionais para exatid o e precis o O teste de conformidade para verifica o da exatid o e precis o aplic vel a qualquer pipeta defini es no cap tulo 1 Este teste que est de acordo com padr es internacionais analisa o sistema de pipetagem como um todo pipeta ponteira e operador O m todo descrito neste documento inclui um procedimento para
92. arian Walnut Creek 2000 Techniques of Gas Chromatography Varian Walnut Creek 1995 E D Hoffmann J Charette V Stroobant Mass spectrometry Principles and Applications Wiley New York 1996 W Paul H Steinwedel A new mass spectrometer without a magnetic field Z Naturforsch 8a 448 450 1953 E Fischer Three dimensional stabilization of charge carriers in a quadrupole field Z Phys 156 1 26 1959 Snyder L R Kirkland J J Introduction to Modern Liquid Chomatography 2 ed New York John Wiley and Sons 1979 Snyder L R Kirkland J J Glajch J L Practical HPLC Method Development 2 ed New York John Wiley and Sons 1997 Riley C M Efficiency retention selectivy and resolution in chromatography In WAINER LW LOUGH WJ eds High Performance Liquid Chomatography Fundamental Principles and Practice Glasgow Blackie Academic amp Professional 1995 Scott R PW Silica Gel and Bonded Phases Their Production Properties and Use in LC New York John Wiley and Sons 1993 Grant D W Capilary Gas Chromatography West Sussex Jonh Wiley amp Sons 1996 Scott R P W Introduction to Analytical Gas Chromatography New York Marcel Dekker 1981 McNair H M Bonelli E J Basic Gas Chomatography Walnut Creek Varian 1969 Zweig G Sherma J CRC Handbook of Chromatography Volume II Cleveland 1977 Walker John Q Chromatographic Systems 2n
93. as As pipetas podem ser projetadas das seguintes maneiras Em rela o ao volume Volume fixo projetadas pelo fabricante para dispensar apenas seu volume nominal como por exemplo 100uL Volume vari vel projetadas pelo fabricante para dispensar volumes selecionados pelo usu rio dentro de uma faixa espec fica de volume Em rela o ao pist o Pode haver uma camada de ar entre o pist o e a superf cie do l quido pipetas de deslocamento de ar O pist o est em contato direto com o l quido pipetas de deslocamento positivo ou deslocamento direto O capilar e o pist o podem ser reutiliz veis ou descart veis 5 de 53 Volume II M dulo 1 Micropipetas Fundamentos e Opera o PIO DE FUNCIONAMENTO Acopla se a ponteira de pl stico ou de vidro na pipeta Com o pist o no limite inferior posi o de aspira o inferior mergulha se a ponteira no l quido que se deseja transferir Quando o pist o sobe para a posi o de aspira o superior o l quido aspirado O volume do l quido dispensado quando o pist o impulsionado novamente para a posi o inferior O princ pio de funcionamento est detalhado abaixo de acordo com o tipo de pipeta deslocamento de ar ou deslocamento positivo 2 1 Pipetas de deslocamento de ar Quando o bot o de uma pipeta de deslocamento de ar pressionado o pist o localizado dentro do equipamento se move para baixo deslocando o ar em
94. as Pr ticas em Biodisponibilidade Bioequival ncia Claro fica que o objetivo maior deste trabalho o de aperfei oar a qualidade dos ensaios de Biodisponibilidade Bioequival ncia realizados no Brasil e por conseguinte contribuir em parte com a qualidade dos medicamentos gen ricos dispon veis no mercado por meio do fornecimento de subs dios t cnicos amplamente estudados e minuciosamente elaborados Neste sentido esperamos contribuir para a capacita o dos Centros de Biodisponibiliade Bioequival ncia al m de promover a forma o de monitores de estudos para a ind stria farmac utica nacional e ajudar a formar agentes multiplicadores de conhecimento nas universidades brasileiras A realiza o deste manual s foi poss vel gra as ao importante trabalho de in meras pessoas e antecipadamente pe o desculpas por eventual esquecimento de algum nome Foram fundamentais os editores Jos Pedrazzoli J nior USF Unifag e Jo o Ant nio Saraiva Fittipaldi Pfizer e os colaboradores Fernanda Maria Villa a Boueri Anvisa Eliana Regina Marques Zlochevsky Anvisa Cl udia Simone Costa da Cunha Minist rio da Sa de e Beatriz Helena Carvalho Tess Minist rio da Sa de no m dulo Etapa Cl nica os editores Cl udia Franklin de Oliveira GGIMP Anvisa Rui Oliveira Macedo UFPA Fl vio Leite T amp E Anal tica e Pedro Eduardo Froehlich UFRGS e os colaboradores Pedro de Lima Filho GGMEG SP Davi Pereira de Santana UFPE
95. auto da Silva VARIAN Celso Ricardo Camargo SINC BRASIL Demian Rocha Ifa SINC BRASIL Ivan Jonaitis AGILENTTECHNOLOGIES a Jos Apareido Soares VARIAN Luiz Rinalo Bizaio VARIAN Renato Guv a AGILENT TECHNLOGIES Renato eres FLOWSERVICE Ricardo Lira FLOWSERVICE Robson Sanches Bizi VARIAN Coordena o Ed Cl udia Franklin de Oliveira ANVISA Itapuan Abimael da Silva ANVISA Karen de Aquino Noffs Brisolla ANVISA Karla de Ara jo Ferreira ANVISA s Marcelo Cl udio Pereira ANVISA Max Weber Marques Pereira ANVISA g Renato Almeida Lopes ANVISA O BBBR SUM RIO 1 INTRODU O 2 ESPECTROFOTOMETRIA DE ULTRA VIOLETA VIS VEL UV VIS 2 1 Introdu o 2 2 Princ pio da t cnica 2 2 1 Espectro luminoso 2 2 2 Processos de absor o 2 2 3 Espectro de absor o UV Vi 2 2 4 Efeito de solventes 2 3 Descri o b sica do sistema 2 3 1 Fontes de radia o 2 3 2 Monocromador ptica w16 2 3 2 1 Simples feixe 2 3 2 2 Arranjo de diodo 2 3 2 3 Duplo feixe 2 3 3 Compartimento de amostras 2 3 3 1 Acoplador de fibra ptica 2 3 3 2 Sipper 2 3 3 3 Suporte para amostras s lidas 2 3 2 3 4 Aquisi o de dados 2 4 Requisitos m nimos de instala o e opera o Acess rios de reflect ncia 2 5 Cuidados b sicos 3 CROMATOGRAFIA EM FASE GASOSA GC 3 1 In
96. boneto saturado produz um composto o qual possui uma banda de absor o entre 180 e 1000nm Por exemplo n octano um hidrocarboneto saturado o qual transparente nesta regi o entretanto se um grupo nitrila introduzido no radical octil o composto octil nitrila produzido O grupo nitrila classificado como um crom foro e apresentaria sinais de absor o de luz na faixa no ultravioleta A tabela 2 ilustra um pequeno grupo de simples crom foros com seus comprimentos de onda m ximos e absortividade molar A absortividade molar a medida de intensidade da banda de absor o Como se pode observar a intensidade de absor o de diversos crom foros varia acentuadamente de um grupo para outro Entretanto todos os membros de uma classe normalmente possuem bandas de absor o de igual intensidade e ocorrem em um faixa espectral relativamente estreita Por exemplo os dados mostrados para o cido ac tico s o t picos de cidos carbox licos saturados provenientes de cido f rmico para cido este rico C1 a C18 todos possuem bandas de absor o na regi o de 204 a 210nm e absortividades molares de 40 a 75 12 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica Tabela 2 Grupo de crom foros Grupo Estrutura Exemplo A Max nm e Carbonil cetona RRC O Acetona 271 16 Carbonil alde do RHC O Acetalde do 293 12 Carboxil RCOOH cido ac tico 204 60 Alceno gt C C lt Eti
97. cial A classifica o da cromatografia l quida de acordo com a fase estacion ria levou a uma grande variedade de tipos A primeira grande divis o feita foi cromatografia de adsor o e cromatografia de parti o referindo se s fases estacion rias s lida e l quida respectivamente Levando se em conta a natureza das intera es e os fen menos acima descritos os modos de separa o podem ser classificados em Cromatografia em fase reversa em fase normal por pareamento de ons troca i nica e por exclus o No caso das fases estacion rias serem l quidas estas podem estar simplesmente adsorvidas sobre um suporte s lido ou imobilizadas sobre ele No primeiro caso a cromatografia referida como cromatografia de parti o A cromatografia de parti o perdeu espa o para a cromatografia de fases quimicamente ligadas devido maior estabilidade conferida por estas quando comparadas com as fases l quidas adsorvidas Estas fases com suportes modificados s o consideradas parte por diferirem dos outros dois modos em seu mecanismo de separa o O grande desenvolvimento cromatogr fico obtido a partir das fases l quidas quimicamente ligadas fez com que estas sejam as fases majoritariamente usadas em HPLC anal tico 33 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica 4 2 1 Modos de separa o Existe sempre uma depend ncia entre as intera es soluto fase m vel soluto fase estacion
98. cifica es se aplica s pipetas de deslocamento de ar de volume fixo e para pipetas de deslocamento positivo que utilizem capilares e pist es reutiliz veis Esta tabela tamb m pode ser utilizada pata as pipetas de deslocamento de ar de volume vari vel O volume nominal nestas pipetas o maior volume selecion vel pelo usu rio e especificado pelo fabricante Por exemplo uma pipeta com a faixa de volume especificada de 10 uL a 100 uL o volume nominal 100 uL Os erros m ximos aceit veis para o volume nominal se aplicam a todos os volumes da faixa especificada se considerarmos uma pipeta com uma faixa de volume de 10 uL a 100 uL o erro sistem tico m ximo aceit vel para qualquer volume selecionado de 0 8 uL e o erro aleat rio m ximo aceit vel para qualquer volume selecionado de 0 3 uL Volume Erros permiss veis m ximos Erros permiss veis m ximos Nominal sistem tico aleat rio h uL uL E 5 0 5 0 005 4 0 2 5 1 2 1 0 1 0 0 8 Ea 9 8 IO me 9 8 40 a mm 08 80 d Na 08 16 m LM 0 8 40 0 6 60 0 3 30 0 Para volumes intermedi rios aos relacionadas na tabela o valor absoluto dos erros m ximos aceit veis do volume imediatamente maior se aplicam Por exemplo para determinar os erros m ximos aceit veis para 25 uL usa se os valores especificados para 50 uL
99. co B como THF clorof rmio diclorometano acetona metil t butil ter A reten o neste caso tamb m alterada pelo percentual do solvente B Existem outras modalidades de cromatografia de compostos i nicos ou cromatografia de exclus o por tamanho permea o e filtra o em gel aplicadas a separa es de mol culas por tamanho como por exemplo pol meros biopol meros prote nas pept deos etc e por raz o da pequena aplica o em separa es de f rmacos e medicamentos n o ser o discutidas neste trabalho Outro aspecto importante envolvendo as separa es cromatogr ficas em HPLC o modo de separa o isocr tico ou gradiente No modo isocr tico as condi es de separa o permanecem inalteradas durante toda a corrida cromatogr fica ficando restrita a uma nica composi o de solvente No modo gradiente h uma varia o na composi o da fase m vel e ou no fluxo durante a corrida cromatogr fica Existem v rios par metros importantes a serem considerados durante o desenvolvimento de um m todo cromatogr fico como resolu o cromatogr fica seletividade fator de reten o etc Estes par metros s o de extrema import ncia no desenvolvimento valida o e utiliza o de m todos cromatogr ficos em HPLC 4 3 Descri o b sica do sistema Um sistema de HPLC basicamente composto por m dulos com fun es espec ficas e cuidadosamente projetados para proporcionar versatilidade
100. co classes 5 de 29 Volume II M dulo 2 gua para An lises Qu micas Instrumentais 1 2 1 Compostos inorg nicos dissolvidos S o basicamente os sais dissolvidos na gua os ons inorg nicos presentes Podem estar sob a forma de c tions ou nions nions on cloreto CD fon hipoclorito HCIO Nitratos nitritos carbonatos Sulfatos Silicatos etc C tions S dio Na C lcio e Magn sio Ca Mg Ferro Fe Alum nio AI Metais pesados Pb Ni Cr Hg etc 1 2 2 Compostos org nicos dissolvidos Esta classe de contaminantes pode ter sua origem na Natureza ou em decorr ncia da polui o ou do pr prio processo de potabiliza o da gua para consumo humano Origem natural Aqui se encontram os materiais org nicos provenientes da decomposi o de vegetais e animais A decomposi o de vegetais ocorre muito comumente nos mananciais abertos represas reservat rios onde a gua captada para posterior tratamento Podemos citar entre outros exemplos taninos ligninas fen is cidos h micos mistura complexa de macromol culas com estrutura de pol mero fen lico Aqui tamb m est o inclu dos as prote nas enzimas nucleases por exemplo amino cidos e seus derivados Origem n o natural Trata se dos compostos org nicos que t m sua origem nas atividades humanas Podemos destacar todos os tipos de pesticidas sol veis em gua fungicidas inseticidas herbicida
101. coluna utilizados Programa o de par metros para integra o dos cromatogramas Ap s estabiliza o do sistema padr es s o injetados para verifica o de desempenho Visto que est tudo em ordem um padr o contendo todos os componentes a serem quantificados injetado para que possa ser criada uma tabela onde o sistema informado sobre os picos a serem analisados atrav s de seus respectivos tempos de reten o Esta tabela necess ria para a cria o de uma curva de calibra o 44 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica seguir os padr es para elabora o desta curva s o injetados e a mesma armazenada finalizando a cria o deste arquivo de an lise As amostras devem ser injetadas tomando se o cuidado de injetar padr es de controle em intervalos regulares possibilitando a verifica o da estabilidade do sistema A seguir ser feita uma abordagem sobre os quatro m todos que podem ser utilizados para calibra o Porcentagem de rea Normaliza o de rea Padr o Externo Padr o Interno 4 3 6 1 Porcentagens de rea A porcentagem de rea o m todo mais simples de c lculo pois n o requer padr o baseado no princ pio de que a resposta do detector proporcional quantidade de subst ncia que passa pela c lula do mesmo S pode ser utilizado para subst ncias que t m a mesma resposta no detector ou seja se injetadas quantid
102. contato com ele para fora da pipeta o volume de ar expulso igual ao volume ajustado na pipeta O volume de ar que permanece dentro da pipeta inversamente proporcional ao volume da amostra quanto menor o volume de ar dentro da pipeta maior o volume do l quido que ser aspirado a Ajuste do volume v lido somente para as pipetas de volume vari vel O usu rio ajusta o volume desejado O pist o se move para a posi o apropriada P S nas pipetas de volume fixo este posicionamento feito na f brica Volume selecionado por exemplo 100 pL Posi o do pist o ap s ajuste do volume Porta cone Regi o preenchida por ar Ponteira 6 de 53 Volume II M dulo 1 Micropipetas Fundamentos e Opera o b Preparo para aspira o Pressiona se o bot o O pist o se desloca para baixo e expele um volume de ar igual ao volume selecionado nas pipetas de volume fixo o volume de ar expelido igual ao volume nominal da pipeta Pist o se desloca para o limite inferior Volume de ar expulso igual ao volume selecionado c Aspira o do l quido Mergulha se a ponteira no l quido at que o orif cio fique submerso Ao se liberar o bot o o pist o retorna para a posi o inicial e forma se no interior da pipeta um v cuo parcial A press o atmosf rica for a a entrada do l quido pelo orif cio da ponteira O pist o retorna para a posi o inicial Forma o de um v cuo parcial Vo
103. corre o das perdas por evapora o para pequenos volumes abaixo de 50 uL Tamb m na convers o para volume das massas obtidas na balan a s o feitas corre es referentes temperatura e press o no momento da execu o do teste O usu rio deve estabelecer uma rotina para testar suas pipetas com base em necessidades em termos de exatid o e precis o frequ ncia de uso n mero de usu rios para uma mesma pipeta n mero de ciclos em cada utiliza o da pipeta e a natureza dos l quidos pipetados N o existe um intervalo padronizado entre uma checagem e outra Cabe ao usu rio definir este intervalo A norma ISO FDIS 8655 define que a periodicidade m nima de uma vez por ano A pipeta deve ser desmontada e montada de acordo com instru es no manual do fabricante pelo menos uma vez antes de se realizar o teste de verifica o A pipeta deve ser operada de acordo com o manual do fabricante 8 2 Condi es ambientais da sala de teste A sala de teste laborat rio deve ser limpa e ter controle de temperatura e umidade para que as condi es ambientais do local onde ser feita a verifica o e a temperatura dos equipamentos utilizados sejam est veis e homog neas antes e durante todo o procedimento A pipeta e a gua utilizada no teste gravim trico devem estabilizar na temperatura da sala de verifica o pelo menos 2 horas antes do in cio do procedimento Idealmente a verifica o deve ser feita nas s
104. d ed Academic Press INC San Diego California USA 1977 76 de 76
105. dade da gua purificada Como j dissemos os contaminantes presentes na gua poder o causar interfer ncias importantes nas determina es anal ticas Por isso mesmo importante quantific los e assegurar que atendam s especifica es de qualidade Al m disso essa quantifica o uma medida da efici ncia do processo de purifica o de gua 7 de 29 Volume II M dulo 2 gua para An lises Qu micas Instrumentais Neste t pico ser considerada basicamente a detec o de contaminantes inorg nicos ons e org nicos H uma variedade imensa de contaminantes inorg nicos e analis los individualmente seria muito dif cil e trabalhoso E poss vel fazer uma determina o da contamina o i nica total de uma solu o aquosa utilizando um par metro apenas a condutividade que a condut ncia espec fica ou sua rec proca a resistividade resist ncia espec fica Igualmente existem in meros contaminantes org nicos que podem ocorrer na gua purificada Aqui tamb m um nico par metro pode ser utilizado para quantific los COT Carbono Org nico Oxid vel Total ou TOC Total Oxydizable Carbon Quantificam se bact rias e outros microorganismos utilizando se m todos que empregam a filtra o em membranas microporosas e posterior incuba o com meios de cultura ou mais recentemente quimioluminesc ncia Os resultados s o expressos em ufc mL unidades formadoras de c
106. de um filme de poliamida na parte externa do tubo o que d grande flexibilidade coluna fase estacion ria depositada na parede interna podendo ser um filme ou um adsorvente s lido Este tipo de coluna tem grande capacidade de separa o e grande variedade de subst ncias que se podem separar por cada tipo de coluna A escolha da fase determina a seletividade da coluna Centenas de fases estacion rias est o dispon veis no mercado as quais t m diversos nomes no mercado Geralmente s o escolhidas de acordo com a polaridade das subst ncias que se ir analisar Fases estacion rias polares geralmente s o mais reativas sendo assim com temperatura limite de trabalho menor que as apolates FILME DE POLIAMIDA 7f TUBO DE SILICA FUNDIDA FASE ESTACION RIA WCOT PLOT SCOT FILME NA PAREDE LEITOPOROSO SUPORTE NA PAREDE TUBO ABERTO TUBO ABERTO TUBO ABERTO Figura 6 Tipos de colunas capilares Para escolher a coluna mais adequada deve se analisar os seguintes par metros Comprimento e di metro interno das colunas Espessura do filme capilar Fase estacion ria l quida Suportes S lidos Fases Estacion rias S lidas 27 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica 3 3 4 1 Forno de colunas O forno o local onde fica armazenada a coluna cromatogr fica Para cada tipo de an lise deve se estabelecer uma temperatura de trabalho do forno ao qual os com
107. descontamina o de rotina Procedimento de descontamina o Os tipos de contamina o podem ser da amostra para o operador de uma amostra para outra ou da amostra para a pipeta Isto pode afetar a seguran a do operador da amostra e consequentemente o resultado do experimento ou finalmente a pipeta Existem muitos m todos para eliminar contaminantes mas existem algumas d vidas em rela o a sua efici ncia e sua compatibilidade com as pipetas Neste documento procuramos esclarecer as d vidas relacionadas ao processo de descontamina o considerando a variedade de aplica es das pipetas Assim diferentes campos de aplica o ser o comentados qu mica microbiologia e biologia molecular e m todos qu micos ou f sicos ser o discutidos A efici ncia do m todo pode ser explicada atrav s do seu mecanismo de a o Quando mais de um m todo for proposto ser feita uma compara o entre eles para auxiliar na escolha do mais adequado Ap s a escolha do m todo de descontamina o consulte os protocolos no final deste cap tulo 38 de 53 Volume II M dulo 1 Micropipetas Fundamentos e Opera o Campo de aplica o 9 1 Qu mica Simplesmente lavando as pipetas com gua destilada as contamina es por cidos bases tamp es ou solventes org nicos s o eliminadas Pode haver necessidade de remo o de outros produtos tais como leos e graxas Ent o necess rio utilizar detergen
108. dmiss veis s o os extremos permitidos superior e inferior para o desvio entre o volume dispensado e o volume nominal ou o volume selecionado Faixa de volume til parte do volume nominal que pode ser dispensado dentro do erro m ximo especificado na Norma Internacional ISO DIS 8655 O valor superior da faixa de volume til sempre o volume nominal O valor inferior 10 do volume nominal se n o estiver especificado de forma diferente pelo fabricante Recalibra o ajuste feito pelo operador um procedimento definido pelo fabricante e que pode ser executado pelo usu rio final para garantir que a pipeta opere conforme as especifica es publicadas Pesagem pesar significa determinar a massa de uma al quota Fator Z fator de convers o UL mg considerando se a densidade da gua em contato com o ar em fun o da temperatura e da press o Ex Designa o abreviatura de um instrumento projetado para dispensar volumes In Designa o abreviatura de um instrumento projetado para aspirar volumes 50 de 53 Volume II M dulo 1 Micropipetas Fundamentos e Opera o OSS RIO E ABREVIA ES Gloss rio Detergente mol culas org nicas que tornam sol veis res duos insol veis leos e gorduras S o agentes de limpeza eficientes a maioria n o elimina microorganismos Descontamina o desinfec o de artigos infectados permitindo sua manipula o uso redu o dos microorganismo
109. do s Detector es Repetibilidade do Amostrador Autom tico quando aplicado C lculos efetuados pelo Sistema de Dados 6 3 2 1 Controle de fluxos Esta verifica o efetuada para que possamos obter repetibilidade nos tempos de reten o dos compostos analisados repetibilidade no volume de amostra introduzido na coluna cromatogr fica 68 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica no caso de injetores do tipo split e repetibilidade de resposta do detector Normalmente os cromat grafos poder o estar configurados com controladores eletr nicos de fluxo EFC ou com controladores manuais Os materiais necess rios para sua verifica o em ambos os casos s o Medidor de Fluxo Digital Calibrado Coluna cromatogr fica de refer ncia ou espec fica para teste As verifica es dos controles de fluxo dever o incluir n o somente o fluxo de g s de arraste que passa pela coluna mas tamb m incluir os fluxos da purga de septo da taxa de divis o no caso de um injetor split splitless fluxo do make up e auxiliares do detector Hidrog nio e Ar no caso de um detector FID Estes testes normalmente s o efetuados utilizando determinadas condi es previamente definidas em procedimentos documentados 6 2 2 Controle de temperaturas O forno de colunas a parte de maior import ncia e influ ncia em uma an lise cromatogr fica pequenas varia es de temperatura no forno pod
110. dos logo ap s a sa da da coluna e s o respons veis por gerar os sinais el tricos proporcionais aos compostos que por ele passam V rios tipos de detectores t m sido usados em HPLC dependendo das caracter sticas f sicas ou f sico qu micas da amostra e da fase m vel Um detector ideal deve possuir as seguintes caracter sticas 40 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica Alta sensibilidade e baixo limite de detec o Resposta r pida a todos os solutos e Insensibilidade a mudan as de temperatura e na vaz o da fase m vel Resposta independente da fase m vel Pequena contribui o ao alargamento do pico pelo volume extra da c lula do detector Resposta que aumente linearmente com a quantidade de soluto N o destrui o do soluto Seguran a e conveni ncia para o uso Informa o qualitativa do pico desejado Baixo custo Dificilmente todas estas caracter sticas podem ser encontradas em um nico detector portanto deve se escolher o detector mais adequado amostra e que re na maior n mero das caracter sticas citadas Os detectores dispon veis no mercado mais utilizados s o Detectores de absorv ncia no ultravioleta e vis vel UV VIS Detectores de fluoresc ncia Detectores eletroqu micos Detectores de massas Outros Detectores de ndice de refra o Detectores de condutividade el trica 4 3 5 1 Detectores de UV VIS Estes det
111. e COT Carbono Medi o de Notas Megaohm cm a Org nico Total COT realizada 25 C ppb por 27 de 29 Volume II M dulo 2 gua para An lises Qu micas Instrumentais Anexo 3 Modelo de formul rio de controle para equipamentos de purifica o de gua para obten o de gua grau tipo II III ou IV DATA Hora Condutividade Registrado Notas MicroSiemens cm por 25 C 28 de 29 Volume II M dulo 2 gua para An lises Qu micas Instrumentais NCIAS BIBLIOGR FICAS American Society for Testing and Materials D1193 99 Standard Specification for Reagent Water 1999 Millipore site na Internet http millipore com H20 Millipore Ind stria e Com rcio Ltda Semin rios de Purifica o de gua para Laborat rios Norrish et al Proc Roy Soc Ser A 288 316 1965 Banford et al Photochemistry and Reaction Kinetics P G Ashmore et al Ed Cambridge 1967 29 de 29 Manual de Boas Pr ticas em Biodisponibilidade Bioequival ncia Volume Il M dulo 3 Instrumenta o Anal tica E FICHA T CNICA Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica Editores e Colaboradores Ad
112. e carbono o resultado intermedi rio entre os vistos anteriormente Na espectrofotometria de ultravioleta vis vel os compostos mais interessantes s o usualmente os que possuem mais de um crom foro especialmente quando os crom foros s o conjugados sistemas conjugados Os compostos com no m nimo dois crom foros conjugados apresentam uma absor o na faixa do vis vel Carboidratos saturados gorduras leos teres simples cidos a maioria dos carboidratos e prote nas n o absorvem luz na faixa vis vel j que suas estruturas n o apresentam crom foros Mol culas com o mesmo crom foro e com estrutura eletr nica similar apresentam espectros de absor o parecidos A presen a de v rios grupos crom foros vizinhos modifica o car ter do espectro de absor o molecular As poss veis resultantes podem ser divididas em 4 grupos Efeito Batocromo Deslocamento das bandas de absor o em dire o faixa vermelha do espectro ocasionando uma intensifica o da colora o Efeito Hipsocromo Deslocamento das bandas de absor o em dire o faixa violeta do espectro de comprimento de onda menor Efeito Hipercromo Aumento da intensidade das bandas de absor o Efeito Hipocromo Diminui o da intensidade das bandas de absor o 13 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica Os auxocromos s o grupos nos quais quando introduzidos em um sistema como crom foro incre
113. e col ides e Baixos custos de opera o devido a pouca Membranas de Osmose Reversa est o sujeitas utiliza o de energia el trica a incrusta es e obstru es em longo prazo se n o forem apropriadamente protegidas e Manuten o m nima e Consumo de gua semelhante ao dos destiladores at recentemente e Bom controle de par metros de opera o Figura 3 Esquema do fluxo tangencial em um sistema de osmose reversa O nico uso de energia el trica neste processo destinado apenas a movimentar a bomba de pressuriza o portanto um consumo bastante baixo se comparado ao da destila o As membranas de osmose tamb m podem sofrer incrustra es e obstru o devido precipita o de sais principalmente carbonato de c lcio reduzindo a vaz o e danificando a estrutura da membrana Por isso faz se necess rio um controle dos ons incrustantes para evitar esse tipo de problema 15 de 29 Volume II M dulo 2 gua para An lises Qu micas Instrumentais 1 5 4 Eletrodeioniza o cont nua Se mergulharmos dois eletrodos nodo e c todo numa solu o de NaCl por exemplo e aplicarmos uma diferen a de potencial entre os dois eletrodos os ons Na e Cl ir o migrar em dire o ao c todo e ao nodo respectivamente Existem membranas denominadas membranas de troca i nica perme veis seletivamente a c tions ou a nions que permitem controlar essa migra o Esta
114. e de alimenta o e rede el trica Verifica o de cabos e conectores Limpeza dos circuitos eletr nicos e verifica o de desgaste corros o ou defeitos Verifica o das partes mec nicas Realiza o de testes dos motores no interior do instrumento rios Verifica o de funcionamento e comunica o com acess 6 2 2 Qualifica o de opera o OQ A OQ de um espectrofot metro de Ultravioleta Vis vel consiste na verifica o das seguintes partes Exatid o de comprimento de onda Precis o de comprimento de onda Desvio de linha de base Ru do fotom trico 6 2 3 Qualifica o de desempenho PQ Estaremos citando abaixo algumas das rotinas descritas para PQ que poder o ser utilizadas em espectrofot metros de UV Vis estabelecidas na EP e USP 6 2 3 1 Farmacop ia europ ia Os testes abaixo s o relacionados pela Farmacop ia Europ ia e Brit nica EP BP para o processo de valida o do instrumento e est o divididos em Exatid o de comprimentos de onda Testes que possuem o objetivo de verificar a exatid o de posicionamento de comprimento de onda com a finalidade de garantir um baixo desvio de posicionamento do sistema ptico A EP BP recomenda a realiza o de duas rotinas para verifica o deste item M todo de emiss o da linha de deut rio xen nio ou merc rio M todo do perclorato de h lmio Resolu o do monocromador Teste que verifica se o monocromador do instrumento separa
115. e troca i nica preenchendo as c lulas de produto 17 de 29 Volume II M dulo 2 gua para An lises Qu micas Instrumentais ELETRODEIONIZA O CONT NUA EDI Vantagens Desvantagens e Remove eficientemente material inorg nico Necessita de pr purifica o dissolvido e Requer manuten o m nima e N o requer regenera o das resinas e Baixo custo de opera o e Excelente pr tratamento para sistemas de ultrapurifica o de gua 1 5 5 Ultrafiltra o o o 2 00 e e e my my 1 a SR e e 100 e e Figura 7 Representa o do corte esquem tico de um ultrafiltro mostrando a propor o entre a camada ativa de separa o 1 e a camada de suporte 100 I Filtro de me de Superf cie embrana Durapore Ultrafiltros s o membranas polim ricas assim tricas com uma camada ativa muito fina 1 micrometro de espessura na parte superior e uma camada de suporte mais espessa 100 micrometros As membranas de ultrafiltra o UF operam sob press o Nestas condi es mol culas pequenas conseguir o atravessar a camada ativa enquanto as maiores ser o retidas O limite desse corte denominado Limite Nominal de Peso Molecular Nominal Molecular Weight Limit NMWL e 18
116. ectores funcionam baseados na quantidade de luz que absorvida pelo soluto em um determinado comprimento de onda caracter stico da mesma Podem ser divididos em tr s tipos basicamente de comprimento de onda fixo de comprimento de onda vari vel dearranjo de diodos 4 3 5 1 1 Detectores de comprimento de onda fixo s o sens veis S o os mais simples de todos e n o s o muito comuns de se encontrar atualmente po s varia es de composi o de fase m vel que compromete seu uso em sistemas de gradiente O comprimento de onda selecionado atrav s de filtros pticos de comprimento de onda espec ficos 41 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica 4 3 5 1 2 Detectores de comprimento de onda vari vel S o os mais utilizados atualmente por possibilitar seu uso tanto em sistemas isocr ticos quanto em gradiente S o utilizados pela maioria dos laborat rios nos quais a amostra e seu respectivo comprimento de onda s o conhecidos A figura 3 mostra o diagrama esquem tico de um detector de comprimento de onda vari vel rede de difra o l mpada cela fotodiodo Figura 3 Diagrama esquem tico de detector de comprimento de onda vari vel 4 3 5 1 3 Detectores de arranjo de diodos S o detectores que t m a capacidade de gerar espectros de absov ncia em uma velocidade compat vel com o fluxo do eluente Fornece dados em tr s dimens es absorv ncia x tempo x comprimento de o
117. eguintes condi es 1 Temperatura est vel gua pipeta e ambiente entre 15 e 30 2 Umidade Relativa acima de 50 24 de 53 Volume II M dulo 1 Micropipetas Fundamentos e Opera o 8 3 Operador 8 3 1 Opera o da pipeta Um procedimento adequado de pipetagem contribui significantemente para a reprodutibilidade dos resultados no teste de verifica o Operadores sem experi ncia podem ter varia es importantes nos resultados Para resultados confi veis o operador deve ser bem treinado e qualificado Os aspectos da t cnica de pipetagem foram discutidos no cap tulo 3 8 3 2 Treinamento O teste de conformidade deve ser feito por um operador qualificado Se necess rio contate uma empresa especializada para solicitar treinamento ao operador 8 4 Ponteiras A pipeta que ser testada deve ser operada segundo as instru es fornecidas pelo manual de opera o Novamente com base no manual de opera o que acompanha a pipeta que ser testada tenha certeza antes de come ar o teste que ela est limpa montada corretamente e de estar utilizando as ponteiras recomendadas pelo fabricante Consulte o cap tulo 4 para maiores detalhes 8 5 Equipamentos utilizados no teste Para garantir a integridade do procedimento de verifica o todos os equipamentos utilizados durante o procedimento devem ser verificados regularmente 8 5 1 Balan a As balan as devem ser calibradas e certificadas
118. ens 29 de 53 Volume II M dulo 1 Micropipetas Fundamentos e Opera o 5 Exatid o erro sistem tico Diferen a entre o volume m dio do teste e o volume ajustado na pipeta Para pipetas de volume fixo substitua V por volume nominal A exatid o pode ser expressa em mL ou como porcentagem 6 Precis o erro aleat rio Dispers o dos volumes dispensados ao redor da m dia dos volumes dispensados Tamb m conhecida de acordo com o contexto como desvio padr o reprodutibilidade ou repetibilidade Como porcentagem tamb m conhecido como coeficiente de varia o CV 30 de 53 V v e erro m dio V volume m dio V volume ajustado e 100 V V V Vi volumes individuais V volume m dio calculado como no item anterior n n mero de medidas DP desvio padr o CV DP V x 100 Volume II M dulo 1 Micropipetas Fundamentos e Opera o C lculos fator Z Z fator de convers o mL mg t C m dia da temperatura B press o atmosf rica hPa B hPa 800 853 907 960 1013 1067 t C Z ul mg Z ul mg Z qu mg Z ul mg Z uimg Z U mg 150 1 0018 1 0018 1 0019 1 0019 1 0020 1 0020 15 5 10018 1 0019 1 0019 1 0020 1 0020 1 0021 16 0 1 0019 1 0020 1 0020 1 0021 1 0021 1 0022 16 5 1 0020 1 0020 1 0021 1 0022 1 0023 170 1 0021 1 0021 1 0022 1 0022 1 0023 17 5 1 0022 1 0022 1 0023 1 0023 1 0024 180 1 0022 1 0023 1 0024 1 0024
119. ente arranhe a ponta da ponteira na parede interna do recipiente 3 7 Eje o de ponteiras Descarte a ponteira pressionando o bot o do ejetor de ponteiras Deve se tomar todas as precau es necess rias quando se trabalha com materiais contaminados e ou radioativos O procedimento adequado deve ser estabelecido pelo pr prio laborat rio de acordo com o tipo de material pipetado considerando os aspectos de seguran a do usu rio e do local de trabalho 14 de 53 Volume II M dulo 1 Micropipetas Fundamentos e Opera o BR 4 PONTEIRAS A qualidade dos resultados diretamente influenciada pela qualidade da ponteira utilizada Bons resultados exigem n o s ponteiras de boa qualidade mas tamb m a mais adequada ao modelo e marca de pipeta utilizada 4 1 Ponteiras para pipetas de deslocamento de ar O fabricante deve indicar qual marca de ponteira o usu rio deve utilizar para alcan ar as especifica es indicadas no manual de opera o da pipeta As ponteiras de pl stico para pipetas de deslocamento de ar devem ser utilizadas uma nica vez N o se deve limpar ou reutilizar estas ponteiras pois suas caracter sticas metrol gicas n o podem ser garantidas 4 2 Ponteiras para pipetas de deslocamento positivo O fabricante deve indicar qual marca de ponteira o usu rio deve utilizar para alcan ar as especifica es indicadas no manual de opera o da pipeta O enca
120. er o resultar em varia es significativas no tempo de reten o e consequentemente afetando a repetibilidade anal tica Os materiais necess rios para esta verifica o s o Medidores de Temperatura Calibrados Coluna cromatogr fica de refer ncia ou espec fica para teste Amostra padr o de refer ncia As verifica es de temperaturas dos Injetor es e Detector es s o efetuados atrav s das medi es em temperaturas operacionais fazendo o uso de medidores de temperatura sendo que no forno de colunas al m da utiliza o de medidores de temperatura s o feitos testes de repetibilidade de tempo de reten o em condi es e amostra de refer ncia previamente definidos 6 3 2 3 Precis o de sinal do s detector e Esta verifica o tem como objetivo avaliar a repetibilidade do detector no entanto na maior parte dos procedimentos utilizados este poder servir de verifica o de repetibilidade do sistema em sua totalidade Os materiais necess rios para esta verifica o s o Coluna cromatogr fica de refer ncia ou espec fica para teste Amostra padr o de refer ncia Esta verifica o normalmente efetuada em uma determinada condi o anal tica realizando inje es consecutivas de uma amostra padr o de refer ncia O objetivo efetuar o c lculo de desvio padr o relativo em porcentagem dos valores de reas desta amostra padr o 69 de 76 Volume II M dulo 3 I
121. est o descritas no cap tulo 3 Embora v rios m todos alternativos de pipetagem sejam poss veis sempre utilize o modo normal modo direto n o utilizar o modo reverso Para todas as pipetas evite segurar ou esquentar o porta cone com a m o durante o teste Para pipetas multi canal encaixe as ponteiras em todos os canais mas teste um canal por vez E registre os resultados para cada canal 1 Prepara o 1 1 Coloque gua do recipiente de origem no recipiente para pesagem a uma profundidade de no m nimo 3 mm 1 2 Me a e registre a temperatura da gua do recipiente de origem a press o do ar e a umidade relativa da sala Se o recipiente para pesagem possui tampa coloque a 1 3 Encaixe uma nova ponteira 1 4 Selecione e ajuste o volume que ser testado este n o dever ser alterado durante o teste 1 5 Pr rinse a ponteira aspirando a al quota do recipiente de origem e dispensando no recipiente de descarte 5 vezes para equilibrar a umidade do ar dentro da atmosfera da pipeta 1 6 Coloque o recipiente para pesagem com gua no prato da balan a e tare a m 0 2 Ciclo do teste Cada ciclo do teste deve demorar menos de 1 minuto Entretanto um ritmo constante durante a opera o de pesagem deve ser mantido o ritmo do ciclo e entre os ciclos 2 1 Encaixe uma nova ponteira na pipeta 2 2 Pr rinse a ponteira aspirando e dispensando no recipiente de descarte uma vez 2 3 Aspire como especificado
122. fici ncia depende da vaz o superficial 1 5 8 Radia o ultravioleta UV As radia es UV apresentam comprimentos de onda entre 100 e 400 nm divididos em quatro campos ondas ultracurtas curtas UV C m dias UV B e longas UV A Podem ser produzidas facilmente por l mpadas com baixa press o de vapor de merc rio que emitem radia es em dois comprimentos de onda 185 e 254 nm As radia es com comprimento entre 200 e 300 nm destroem microorganismos pela quebra da cadeia de DNA Isso se processa de forma mais intensa no comprimento de 260 nm Portanto o comprimento de 254 nm possui uma efici ncia bem pr xima 80 do considerado timo para essa finalidade 20 de 29 Volume II M dulo 2 gua para An lises Qu micas Instrumentais Por m necess rio um projeto bastante criterioso para que essa efici ncia seja realmente alcan ada levando em considera o principalmente capacidade de penetra o da radia o UV da ordem de 1 cm preciso promover uma vaz o suficiente para que essa penetra o ocorra respeitando o tempo de resid ncia da gua na c mara de exposi o Uma outra aplica o muito importante da radia o UV a redu o dos n veis de COT Carbono Oxid vel Total TOC da gua purificada Na verdade a UV n o destr i os compostos org nicos diretamente mas gera oz nio oxidar as subst ncias presentes na gua Como pode ser visto na figura abaixo
123. fine se ent o o comprimento de onda l como sendo a dist ncia percorrida pela onda para que os dois m ximos atinjam o ponto fixo de observa o O comprimento de onda usualmente expresso em nan metros nm Figura 1 Comprimento de onda As radia es Ultravioleta Vis vel UV Vis constituem uma parte relativamente pequena do espectro eletromagn tico no qual est o inclu dos outras formas de radia es como ondas de r dio conforme figura 2 Os limites destas regi es s o determinados pelos limites pr ticos de m todos experimentais de produ o e detec o das radia es A diferencia o das regi es espectrais tem significado adicional para o qu mico no sentido de que as intera es f sicas seguem diferentes mecanismos e fornecem diferentes tipos de informa es Quando uma radia o incidida em uma subst ncia semitransparente a radia o somente parcialmente transmitida A radia o restante refletida ou absorvida em diversos ngulos figura 3 dependendo da subst ncia e do comprimento de onda da radia o O tipo e a quantidade de radia o que absorvida a que possui maior import ncia anal tica Infelizmente n o h um m todo direto para determinar a radia o absorvida entretanto pode se obter a informa o indiretamente pela medida da radia o transmitida 8 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica pa um 4 Cosmic ra
124. ia o incidente essencial que o sinal el trico produzido seja diretamente proporcional pot ncia do feixe incidente isto R kP k Em que R a resposta el trica do detector em unidades de corrente resist ncia ou f e m A constante k uma medida da sensibilidade do detector em termos da resposta el trica por unidade de pot ncia radiante Certos detectores acusam uma pequena reposta k chamada corrente escura mesmo quando n o est o recebendo radia o incidente Os detectores de energia radiante usados atualmente na constru o de instrumentos de medida s o fotodiodos ou fotomultiplicadoras Os sinais detectados pela fotomultiplicadora ou fotodiodos ap s amplificados geram um gr fico de comprimento de onda por intensidade de transmit ncia ou absorb ncia chamado de espectro de ultravioleta vis vel Com este espectro poss vel sua identifica o comparando se a um espectro de uma subst ncia padr o ou a obten o da quantifica o fixando se um comprimento de onda e obtendo o respectivo valor de transmit ncia ou absorb ncia Este valor ser proporcional concentra o do componente presente na amostra e fazendo se uso de um padr o de concentra o conhecida determinada sua concentra o real 2 4 Requisitos m nimos de instala o e opera o Para garantir a obten o de resultados confi veis e estar em conformidade com os requerimentos da Qualifica o de Instala o I
125. iativa da cria o pela coordena o de n cleos de discuss o com o objetivo de esgotar o esclarecimento de todos os aspectos relevantes condu o dos estudos e integra o de suas fases Esses n cleos contaram com a participa o de 40 especialistas das reas de Farm cia Medicina Estat stica e Qu mica E neste contexto que surge este Manual de Boas Pr ticas em Biodisponibilidade Bioequival ncia composto por seis grandes t picos apresentados de maneira did tica buscando transpor as dificuldades dos centros e por conseguinte complementar as diretrizes j previstas na legisla o sanit ria brasileira para a realiza o dos estudos Os n cleos de trabalho iniciaram as discuss es em setembro de 2001 cada um deles cuidando de uma das tr s etapas do processo Cl nica Anal tica e Estat stica sob a coordena o da Dra Cl udia Franklin de Oliveira e inestim vel colabora o da professora S lvia Storpirts Nos meses subsequentes foram realizadas diversas reuni es de modo a promover debates t cnicos e a alcan ar consenso nas quest es Desta forma cada grupo elaborou um conjunto de t picos relevantes que devessem constar no manual Posteriormente todos foram objeto de cuidadosa pesquisa e os resultados relatados de modo a propiciar um bom entendimento por parte do p blico alvo O manual completo levou 11 meses para ser conclu do Este processo envolveu a participa o no total de cerca de 50
126. icas em biodisponibilidade bioequival ncia Ag ncia Nacional de Vigil ncia Sanit ria Ger ncia Geral de Inspe o e Controle de Medicamentos e Produtos Bras lia ANVISA 2002 2v QV38 1 Equival ncia terap utica 2 Bioequival ncia 3 Disponibilidade biol gica 4 Medicamentos I Ag ncia Nacional de Vigil ncia Sanit ria Ger ncia Geral de Inspe o e Controle de Medicamentos e Produtos BR PREF CIO Atualmente se acham em execu o no Brasil in meros estudos cl nicos com o objetivo de avaliar a Biodisponibilidade Bioequival ncia de produtos farmac uticos A partir de junho de 2001 a Anvisa por meio da Coordena o de Inspe o em Centros de Bioequival ncia ligada Ger ncia geral de Inspe o e Controle de Medicamentos e Produtos passou a avaliar estes centros em inspe es peri dicas a fim de garantir a qualidade dos estudos No decorrer das atividades de inspe o que a princ pio tinham car ter orientativo a coordena o observou a necessidade de esclarecer alguns pontos que restavam como d vidas t cnicas para os centros em especial a relativa padroniza o de m todos anal ticos an lise estat stica dos estudos armazenamento de amostras biol gicas confinamento de volunt rios e estudos de estabilidade de f rmacos entre outros A partir da identifica o desta necessidade e buscando prevenir o comprometimento da qualidade dos trabalhos realizados surgiu a inic
127. ida o o conjunto de atividade e ou informa es documentadas que evidenciam um alto grau de seguran a que o processo sistema no qual foi produzido est dentro de especifica es pr determinadas e com os devidos atributos de qualidade Portanto valida o n o somente um processo de verifica o de desempenho qualifica o qualifica o de opera o OQ ou recertifica o mas sim um processo que deve incluir as seguintes fases Qualifica o do Projeto DQ Design Qualification Qualifica o da Instala o IQ Instalation Qualification Qualifica o de Opera o OQ Operation Qualification Qualifica o do Desempenho PQ Performance Qualification 64 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica 6 1 1 DQ Qualifica o de projeto Na qualifica o do projeto do instrumento deve se ter acesso a detalhes de desenvolvimento do instrumento como Utiliza o de rigorosos m todos de especifica o e projeto durante o desenvolvimento do sistema Completa documenta o dos procedimentos de garantia de qualidade e controle de qualidade Utiliza o de pessoal experiente e qualificado Plano compreens vel de teste do instrumento Dados de controle relat rios de erros e procedimentos corretivos aplicados durante desenvolvimento e confec o do sistema Hist rico de desenvolvimento do sistema Estas informa es devem ser fornecidas pe
128. iderados de varredura ou seja a partir da entrada de uma mistura de ons com diferentes rela es massa carga m z e diferentes abund ncias s o aplicados campos el tricos fazendo com que em um determinado momento somente ons de uma massa especifica consigam sair ilesos Variando se os valores do campo el trico aplicado se consegue fazer com que ons distintos sejam selecionados e registrados J os analisadores tipo Ion Trap n o podem ser considerados como instrumentos de varredura puros pois nestes os fons s o armazenados antes de sua varredura propriamente dita 5 3 2 1 Analisadores de massas quadrupolar O instrumento baseado em quatro barras paralelas numa rea quadrangular onde o feixe de ons focalizado no eixo central destas barras um potencial el trico fixo DC e um potencial de r diofrequ ncia RF s o aplicados nestas barras diagonais e opostas Para uma dada combina o de RF e DC ons de uma espec fica faixa de massas m z t m seu caminho alterado do eixo central Um espectro de massas obtido das componentes de tens o DC e RF de maneira sincronizada ou seja mantendo a rela o RF DC constante O potencial 4 aplicado aos pares opostos de barras determinado por t U V cos dt onde U uma tens o DC e V cos q t a tens o dependente do tempo na qual V a amplitude de RF e 4 a freq ncia de RF sa da para o detector M4 feixe de ons Arquitetura Quadrupolar
129. ilar Volume selecionado por exemplo 100 uL b Preparo para aspira o 9 de 53 Volume II M dulo 1 Micropipetas Fundamentos e Opera o c Aspira o do liquido O orif cio do capilar imerso abaixo da superf cie do l quido Ao se liberar o bot o o pist o se move para cima e a press o do ambiente for a a entrada do l quido pelo orif cio do capilar Volume aspirado Capilar imerso d Dispensa do liquido Pressiona se novamente o bot o O pist o se move para baixo e expulsa o l quido para fora do y Recipiente de destino Volume dispensado capilar 10 de 53 Volume II M dulo 1 Micropipetas Fundamentos e Opera o 3 T CNICA DE OPERA O Uma boa t cnica de pipetagem fundamental para garantir bons resultados A seguir um roteiro sobre alguns aspectos da t cnica que devem ser considerados durante a opera o 3 1 Como guardar a pipeta A pipeta deve ser guardada na posi o vertical por dois motivos Evita se que ela entre em contato com superf cies que podem estar contaminadas como por exemplo a bancada de trabalho ao se deitar a pipeta sobre a bancada ou no interior de uma gaveta pode se transferir para o corpo do instrumento contaminantes que estejam neste local e estes podem ser transferidos ao experimento posteriormente Se n o for feita a eje o da s ponteira s e houver sobrado uma quantidade residual do l quido no inter
130. ilidade Bioequival ncia Volume Il M dulo 1 Micropipetas E FCA TECNICA Volume II M dulo 1 Micropipetas Fundamentos e Opera o Editores Melissa M Silva Nova Anal tica Valter A Pereira Nova Anal tica Coordena o Cl udia Franklin de Oliveira ANVISA Itapuan Abimael da Silva ANVISA Karen de Aquino Noffs Brisolla ANVISA Karla de Ara jo Ferreira ANVISA Marcelo Cl udio Pereira ANVISA Max Weber Marques Pereira ANVISA Renato Almeida Lopes ANVISA o SUM RIO 1 DEFINI O 1 1 Tipos de pipetas is 2 PRINC PIO DE FUNCIONAMENTO 2 1 Pipetas de deslocamento de ar 2 2 Pipetas de deslocamento positivo 3 T CNICA DE OPERA O 3 1 Como guardar a pipeta 3 2 Ajuste do volume 3 3 Encaixe da ponteira 3 4 Pr rinsagem da ponteira 3 5 Aspira o 3 6 Dispensa 3 7 Eje o de ponteiras 4 PONTEIRAS 4 1 Ponteiras para pipetas de deslocamento de ar 4 2 Ponteiras para pipetas de deslocamento positivo 5 MANUTEN O 51 Limpeza 5 2 Troca de pe as 5 3 Verifica o da performance 6 SUGEST ES DE PROCEDIMENTOS 7 ANEXO I EXEMPLO DE PROCEDIMENTO DE LIMPEZA sue 22 22 23 23 7 1 Desmontagem 7 2 Limpeza 7 3 Montagem 8 ANEXO II VERIFICA O PADR O DA PERFORMANCE 8 1 Considera es gerais
131. ima de limpeza que depender de como o equipamento est sendo utilizado tipo de amostra n mero de amostras etc 6 5 1 3 Cromat grafo A manuten o preventiva do cromat grafo deve ser feita junto com a do detetor de massas e o procedimento j foi descrito nos cap tulos respectivos GC ou HPLC 6 5 2 Qualifica o de opera o A Qualifica o de Opera o fundamental para garantir que equipamento encontra se funcionando conforme s especifica es do fabricante e portanto deve ser realizada em intervalos regulares Os fabricantes recomendam que esta frequ ncia seja de no m nimo uma vez ao ano ou ap s uma grande interven o de reparo O especialista que executou este tipo de interven o ter ferramentas para recomendar que seja feita uma Qualifica o de Opera o ap s o reparo ou n o Esta avalia o dever estar documentada Os itens avaliados em uma Qualifica o de Opera o s o Precis o do injetor Linearidade do injetor Teste de contamina o de amostra para amostra carry over Linearidade do detector opcional Exatid o de massa Sensibilidade 74 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica 6 5 2 1 Precis o do injetor Este teste feito executando v rias inje es de um padr o conhecido e verificando a reprodutibilidade de rea e ou altura Toma se entre seis e dez medidas e calcula se o desvio padr o relativo que dever estar dent
132. io da Linha de Base Este teste tem como finalidade garantir a especifica o de sensibilidade do detector uma vez que estes fatores est o diretamente correlacionados a esta medi o Poder ser utilizado o m todo de monitoramento e medi o de linha de base em intervalos de tempo definidos e verifica o com valores padr o 6 4 2 2 Qualifica o da bomba 6 4 2 2 1 Exatid o de fluxo da fase m vel Este teste tem como objetivo garantir que o fluxo programado o fluxo real de opera o da bomba Poder ser determinada pela medida volum trica do fluxo bombeado em um determinado per odo de tempo 6 4 2 2 2 Teste de rampa e queda de press o O Teste de Rampa verifica as v lvulas de entrada e sa da vazamento nas conex es e a capacidade da bomba em operar a alta press o 6 4 2 2 3 Exatid o da mistura de gradiente Este teste tem como finalidade verificar a exatid o da composi o est tica e din mica das misturas de fase m vel durante uma an lise em sistemas de gradiente Poder ser utilizado o teste de se bombear duas fases m veis em diferentes propor es ao longo do tempo e verificar a real composi o estabelecida 72 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica 6 4 2 3 Qualifica o do forno de colunas 6 4 2 3 1 Exatid o de temperatura do forno Com o objetivo de verificar a exatid o de temperatura do forno poder ser utilizado o m todo de se programar uma temperatura
133. ior da s ponteira s ao se deitar a pipeta este l quido pode escorrer para o interior do instrumento contaminando e danificando as pe as internas e ou o porta cone Exemplos de suportes a 3 2 Ajuste do volume Para evitar o erro de paralaxe o ajuste do volume deve ser feito ou com a pipeta na posi o horizontal Caso o operador prefira ajustar o volume com a pipeta na posi o vertical deve estar com um dos olhos fechado Quando diminuir o volume cuidadosamente chegue ao valor desejado e n o ultrapasse a marca Quando aumentar o volume ultrapasse o valor desejado 1 3 de volta e depois cuidadosamente diminua o volume at chegar ao desejado n o ultrapassando a marca 11 de 53 Volume II M dulo 1 Micropipetas Fundamentos e Opera o 3 3 Encaixe da ponteira O encaixe da ponteira deve ser feito de acordo com as instru es do fabricante garantindo a forma o de um selo adequado entre a ponteira e o porta cone da pipeta P S Entenda se por selo um anel opaco que se forma ao redor de todo o colar da ponteira indicando perfeita conex o entre o porta cone e a ponteira Um selo incompleto levar a resultados pouco precisos Abaixo sugest es para o encaixe das ponteiras Ponteiras soltas Segure a ponteira pelo colar com cuidado para n o tocar na ponta e encaixe a no porta cone e a pressione contra ele com um movimento rotacional como indicado na figura abaixo
134. iplicador de el trons el trons secund rios s ida de el trons 58 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica 5 3 3 2 Placas microcanais Placas microcanais consistem em uma placa contendo microcanais cil ndricos paralelos O lado de entrada destes microcanais mantido com um potencial negativo de aproximadamente 1kV em rela o ao lado de sa da A multiplica o dos el trons iniciada pela colis o de um on nesses canais proporcionada por uma subst ncia semi condutora que reveste cada canal e gera el trons secund rios Canais curvos previnem a acelera o de ons positivos em dire o ao lado de entrada O efeito cascata dentro dos canais pode multiplicar o n mero de eletr ns na ordem de 10 e o uso de v rias placas acopladas permite uma amplifica o que pode chegar at 10 Na sa da de cada canal um nodo de metal coleta a corrente de el trons e o sinal transmitido ao processador Esses detectores microcanais t m tamb m como caracter stica um tempo de multiplica o de sinais extremamente baixo tornando os apropriados para a detec o em instrumentos com analisador por tempo de v o el tron multiplicador el trons secund rios AV4 NE a sa da de a el trons ons de diferntes raz es massa carga diferentes separados no espa o 59 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica 5 3 3 3 Foto multiplicador Este tipo de detector co
135. istema cromatogr fico 4 3 4 Colunas 4 3 4 1 Fases estacion rias base de s lica A s lica sem d vida o material mais importante utilizado nas fases estacion rias para HPLC um material vers til podendo ter sua superf cie modificada por deriva o qu mica sendo que desta forma pode dar origem a diversos materiais muito interessantes como fases estacion rias para cromatografia l quida pois possibilita o trabalho com diferentes mecanismos de separa o 39 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica A s lica uma forma amorfa altamente porosa e parcialmente hidratada preparada usualmente pela hidr lise cida do silicato de s dio seguida por emulsifica o em uma mistura lcool gua e subsequente condensa o quando ent o lavada e seca para o uso A superf cie da s lica fun o de suas condi es de prepara o s licas com grande n mero de silan is livres s o mais cidas que as s licas com grupos hidroxilados ligados A s lica bastante utilizada em cromatografia em fase normal n o sendo recomendada para o uso em fase reversa 4 3 4 2 Fases quimicamente modificadas S o as fases mais utilizadas na atualidade pois sua aplica o a separa es de compostos polares foi amplamente difundida devido dificuldade que se tinha com a utiliza o das colunas base de s lica Com o advento das fases quimicamente ligadas esta lacuna pode se
136. itua o distinta ou seja enquanto que o quadrup lo est varrendo a faixa de massas visando produzir um espectro os ons que n o se mant m est veis s o perdidos e portanto n o produzem sinal detect vel poss vel no entanto aumentar significativamente a sensibilidade do quadrup lo fazendo com que este fique sempre fixo em uma massa ou algumas poucas massas de interesse sendo esta t cnica denominada SIM Single Ion Monitoring 5 3 2 3 Espectrometria de massas sequencial tandem mass spectrometry A espectrometria de massas sequencial Tandem Mas Spectrometry MS MS ou MS onde n 2 3 usa dois ou mais est gios de an lise de massa um para pr selecionar um on e o outros para analisar os fragmentos induzidos por exemplo por colis o CID com um g s inerte como arg nio ou h lio Esta an lise pode ser sequencial no espa o ou no tempo Seq encial no espa o significa ter v rios analisadores de massa em s rie Muitas combina es s o poss veis as mais comuns dentre essas s o o triplo quadrup lo Q1qQ2 os de 4 setores e os instrumentos h bridos Nesta simbologia Q representa um quadrup lo filtro de massas e q um quadrup lo de apenas RF c mara de colis o No caso do triplo quadrup lo um on de interesse gerado na fonte de ioniza o selecionado com o primeiro quadrup lo Q1 dissociado na c mara de colis o q com energias de at 300 eV e os produtos de fragmenta o analis
137. ixe entre o pist o e o capilar deve ser ideal selo perfeito entre capilar e pist o assim como o deslocamento do pist o no interior do capilar o que garante dispensa por igual do l quido aspirado Estas ponteiras podem ser reutilizadas ou descart veis ao se trocar a ponteira deve se trocar simultaneamente o capilar e o pist o 15 de 53 Volume II M dulo 1 Micropipetas Fundamentos e Opera o e 5 MANUTEN O Neste cap tulo estaremos abordando tr s etapas fundamentais do procedimento de manuten o limpeza troca de pe as e verifica o da performance OBSERVA O E necess rio fazer uma adequa o entre as informa es presentes neste cap tulo e o manual de instru es do fabricante Em particular devem ser observados os seguintes pontos Verificar se as pe as aqui relacionadas podem ser submetidas lavagem Procedimento de montagem e desmontagem da pipeta Como trocar as pe as danificadas Verificar se qualquer um destes procedimentos altera a calibra o da pipeta Se alterarem necess rio realizar a verifica o da performance do instrumento vide anexo 1 e eventual ajuste do equipamento segundo instru es do fabricante 5 1 Limpeza E necess rio criar uma rotina de limpeza e inspe o das pe as da pipeta Para que se possa obter sempre os melhores resultados necess rio que as pe as da pipeta estejam em boas condi es de funcionamento Existem
138. leno 193 10000 Nitrato ONO2 Etil nitrato 270 12 sulf xido gt S 0 Cicloexil Metil Sulf xido 210 1500 Se um ou mais crom foros ocorrem em uma mol cula suas posi es relativas determinam o efeito produzido no espectro O 1 hexano possui uma absortividade molar de 10000 em 180nm e 1 5 hexadieno possui uma absortividade molar de 20000 no mesmo comprimento de onda O 2 4 hexadieno com banda em outra regi o possui uma absortividade molar de 25500 em 227nm A posi o e a intensidade da banda de absor o do 1 5 hexadieno s o aproximadamente o que n s podemos esperar de duas mol culas individuais de propileno Obviamente os dois grupos de crom foros est o amplamente espa ados e n o interagem Entretanto quando os dois crom foros est o conjugados como no 2 4 hexadieno o efeito n o o esperado de duas mol culas individuais Observa es similares de um grande n mero de compostos t m realizado a argumenta o b sica para algumas regras gerais Quando dois crom foros em uma mesma mol cula est o separados por mais de um tomo de carbono o espectro de absor o uma somat ria simples do espectro de cada um dos depois crom foros Quando dois crom foros em uma mesma mol cula est o adjacentes o m ximo de absor o encontrado em altos comprimentos de onda e a intensidade incrementada Quando dois crom foros em uma mesma mol cula est o ligados a um mesmo tomo d
139. lifica o de projeto 6 1 2 IQ Qualifica o de instala o 6 1 3 OQ Qualifica o de opera o 6 1 4 PQ Qualifica o de desempenho 66 6 2 Espectrofotometria de ultra violeta vis vel UV VIS 66 6 2 1 Manuten o preventiva 66 6 2 2 Qualifica o de opera o OQ 6 2 3 Qualifica o de desempenho PQ 6 2 3 1 Farmacop ia europ ia 6 2 3 2 Farmacop ia americana 6 3 Cromatografia em fase gasosa GC 6 3 1 Manuten o preventiva de Gi 6 3 2 Qualifica o de opera o 6 3 2 1 Controle de fluxos 6 3 2 2 Controle de temperaturas 68 6 3 2 3 Precis o de sinal do s detector es 6 3 2 4 Precis o do amostrador autom tico 6 3 2 5 C lculos efetuados pelo sistema de dados 6 4 Cromatografia em fase l quida HPLC 6 4 1 Manuten o preventiva de HPLC 6 4 2 Qualifica o de opera o 6 4 2 1 Qualifica o do detector 6 4 2 2 Qualifica o da bomba 6 4 2 3 Qualifica o do forno de colunas 6 4 2 4 Qualifica o do amostrador autom tico 6425 Sistema de dados ras dress ias eras fornos sil A a 6 5 Sistemas de cromatografia acoplados a detectores de massas 6 5 1 Manuten o preventiva de sistemas detectores de m 6 5 1 1 Sistemas de v cuo 6 5 1 2 Detector de m 6 51 6 5 2 Qualifica o de opera o Cromat grafo 6 5 2 1 Precis o do injetor 6 5 2 2 Linearidade d
140. lo 3 Instrumenta o Anal tica 3 3 2 Controladores de fluxo e press o O fluxo ou a press o do g s de arraste um par metro importante que depende do di metro e do comprimento da coluna Deve ser controlado durante a an lise Para este controle s o utilizadas v lvulas controladoras de fluxo ou press o O ajuste deste par metro pode ser feito manualmente com o aux lio de um medidor de fluxo ou um bolh metro ou eletronicamente atrav s de software cujo objetivo obter a melhor efici ncia cromatogr fica Para os gases auxiliares necess rio fazer o controle pois o ajuste do fluxo fundamental para atingir o melhor desempenho 3 3 3 Injetores A fun o b sica de um injetor introduzir a amostra no sistema cromatogr fico No injetor a amostra entra em contato com o g s de arraste e se dissolve no mesmo Para isso no caso de amostras l quidas necess rio que o injetor esteja aquecido tal qual que garanta a total volatiliza o da amostra Existem dois tipos de classes de injetores os injetores para colunas empacotadas e os injetores para colunas capilares Para amostras gasosas a inje o pode ser feita com o aux lio de uma v lvula de amostragem de g s que pode ter ou n o um injetor em s rie com a v lvula Para cada classe de injetores existem op es dependendo da aplica o 1 Injetores empacotados S o utilizados como o nome diz com colunas empacotadas Podem ser
141. los fabricantes dos instrumentos por m com o objetivo de verifica o de suas especifica es e adequa o ao uso proposto 6 1 2 IQ Qualifica o de instala o A qualifica o de instala o consta da verifica o de toda documenta o e informa es para a instala o do instrumento e software de acordo com especifica es do sistema descritas nos pr requisitos de instala o e regulamenta es loca s O IQ estabelece que o instrumento recebido assim como foi especificado adequadamente instalado e em condi es de opera o Esta atividade deve incluir Verifica o dos itens recebidos de acordo com a documenta o adequada Arquivamento de todos os detalhes de descri o e identifica o dos componentes do sistema incluindo diagramas de conex o do instrumento C pias do certificado de teste do usu rio e declara o de conformidade A Qualifica o de Instala o IQ est sendo abordada em cada t cnica de instrumenta o anal tica deste cap tulo como Requisitos M nimos de Instala o 6 1 3 OQ Qualifica o de opera o A Qualifica o de Opera o deve estar documentada verificando que o sistema est de acordo com as especifica es operacionais Um sistema de acompanhamento deve ser utilizado para verificar A realiza o do treinamento operacional que deve ocorrer ap s a instala o e antes do in cio de opera o em rotina do instrumento
142. lume de l quido aspirado Orif cio da ponteira submerso no l quido 7 de 53 Volume II M dulo 1 Micropipetas Fundamentos e Opera o d Dispensa do l quido Pressiona se novamente o bot o O pist o se move para baixo deslocando o ar e aumentando a press o interna da pipeta O ar comprimido expulsa o l quido para fora da ponteira Recipiente de destino e Segundo est gio Em algumas pipetas de deslocamento de ar o pist o pode se deslocar um pouco abaixo do limite inferior consequentemente deslocando uma quantidade adicional de ar o que permite a expuls o das ltimas gotas do l quido O termo mais conhecido pelos usu rios para este deslocamento adicional segundo est gio 2 2 Pipetas de deslocamento positivo As pipetas de deslocamento positivo funcionam como uma seringa N o h volume de ar entre o pist o e l quido Como n o h ar para contrair ou expandir a for a de aspira o sempre constante e inalterada pelas propriedades f sicas do l quido a ser manipulado Este tipo de equipamento ideal para a manipula o de l quidos viscosos ou de alta densidade 8 de 53 Volume II M dulo 1 Micropipetas Fundamentos e Opera o a Ajuste do volume O usu rio ajusta o volume desejado O pist o se move para baixo at a posi o de in cio Porta cone Capilar Pist o Posi o de in cio Pressiona se o bot o O pist o desce at o final do cap
143. m a interface dos feixes de luz com o compartimento de amostras e Autiliza o de material de seguran a durante o manuseio de amostras no instrumento essencial para a seguran a do operador O material de prote o individual necess rio composto por avental e seguran a luva cir rgica e culos de prote o com vis o ampla O instrumento deve possuir itens de consumo para que se necess rio o pr prio operador possa executar atividades como troca de l mpadas Os principais itens de consumo necess rios para estarem junto ao instrumento s o L mpadas de deut rio e tungst nio ou l mpada de xen nio Cubeta de quartzo 21 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica RAFIA EM FASE GASOSA GC 3 1 Introdu o Cromatografia em fase gasosa uma t cnica anal tica utilizada para separar mistura de subst ncias qu micas O objetivo da t cnica obter uma separa o que ajude a identificar e quantificar as subst ncias presentes na mistura Como principal elemento utilizado na t cnica de cromatografia em fase gasosa GC as primeiras colunas cromatogr ficas utilizadas eram constitu das de um empacotamento em um tubo de comprimento t pico entre 1 a 5 m e de di metro de 2 a 4 mm Com o avan o da instrumenta o anal tica atualmente utiliza se tubos abertos de s lica fundida capilares com comprimentos variados entre 10 a 100 m e di metros internos entre 0 1 a 0
144. m base no manual do fabricante por exemplo desmontagem montagem Ressaltamos mais uma vez a import ncia de se certificar se ou n o necess rio recalibrar a pipeta ap s qualquer um destes procedimentos esta informa o se encontra no manual do fabricante 1 ETAPA APAR NCIA GERAL gt gt gt gt Bot o Para 4 3 de opera es Bot o do ejetor Volumetro Ejetor de ponteiras Porta cone 4 Ponteira Verifique se n o h nenhum defeito aparente PE A O QUE VERIFICAR CAUSA Queda Longa exposi o a vapores corrosivos Barra de opera es Torta ou corro da Autoclavagem afeta a apar ncia e a funcionalidade em algumas marcas e modelos Desalinhamento e clareza dos Vol metro P n meros Ejetor de ponteiras Corro do ou quebrado Longa exposi o a vapores corrosivos Longa exposi o a vapores corrosivos Porta cone Danos f sicos ou qu micos Desgaste natural devido ao uso 18 de 53 Volume II M dulo 1 Micropipetas Fundamentos e Opera o 2 ETAPA TESTAR AS FUN ES Gire o vol metro totalmente percorrendo toda a faixa volum trica da pipeta Verifique se o m nimo e o m ximo volumes ajust veis correspondem real faixa volum trica da pipeta Problemas e cansas Ajuste imposs vel de ser feito Pipeta autoclavada Ajuste de volume incorreto
145. ma profundidade de imers o da ponteira durante a aspira o e entre uma amostra e outra Recomenda se que a profundidade de imers o seja em torno de 2 a 3 mm abaixo da superf cie do l quido Alguns fabricantes sugerem que a profundidade de imers o deve variar de acordo com o volume de trabalho como discriminado na tabela abaixo Faixa de Volume Profundidade recomendada 0 5 uL a 10 yL j lt 1mm 11 pla 100 pL 101uL a 1000 pL 2 4mm 1001uL a 5000 pL 5001 uL a 10 mL Volume II M dulo 1 Micropipetas Fundamentos e Opera o A pipeta deve ser mantida na posi o vertical durante toda a aspira o Aguarde de 1 a 2 segun dos antes de retirar a ponteira do l quido Se do lado de fora da ponteira restarem got culas do l quido limpe as usando papel macio se a metodologia permitir Cuidado para n o encostar no orif cio da ponteira 3 6 Dispensa Encoste a ponta da ponteira na parede interna do recipiente e incline a pipeta aproximadamente 30 a 45 Pressione o bot o continuamente at o final do primeiro est gio Aguarde alguns segundos de 1 a 3 dependendo da viscosidade do l quido ent o pressione o bot o at o segundo est gio purga para eliminar got culas que possam ter permanecido na ponteira Mantenha o bot o pressionado at o final Retire a pipeta de dentro do recipiente mantendo a ponteira em contato com a parede interna do recipi
146. malmente a ioniza o ocorre atrav s da transfer ncia de um pr ton mol cula formando esp cies denominadas pseudo on moleculares Como esta forma de ionizar bem mais 51 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica suave do que o impacto de el trons o espectro produzido cont m poucos fragmentos e quase somente o pseudo on molecular servindo portanto para determina o de peso molecular e ou an lises quantitativas Este tipo de ioniza o acoplado CG 5 3 1 3 Electrospray ES A Ioniza o por eletrospray teve um grande impacto na utiliza o da espectrometria de massas em pesquisas biol gicas durante os ltimos anos Foi o primeiro m todo a estender a faixa de massa til de instrumentos para mais de 50 000 Da Embora introduzida em sua forma presente em 1984 a t cnica volta a investiga es da dispers o eletricamente assistida de l quidos no come o deste s culo Na realidade uma descoberta principal aconteceu quase desapercebida em 1968 quando Malcolm Dole e colaboradores puderam trazer macromoleculas fase gasosa em press o atmosf rica Isto foi poss vel borrifando uma solu o da amostra em um pequeno tubo com um forte campo el trico na presen a de um fluxo de nitrog nio morno para ajudar na desolvata o e medindo ent o os ions formados Mais adiante experi ncias inovadoras neste campo conduziram introdu o da fonte de ioniza o por ES Desde ent o uma g
147. meiro existe o risco de contamina o durante a amostragem e o m todo n o pode ser facilmente adaptado para medi es em linha dif cil como foi mencionado remover os ltimos tra os de CO no est gio de purga Compostos org nicos vol teis tamb m s o carreados pelo nitrog nio e portanto n o s o computados no COT total Os reagentes de oxida o utilizados s o mantidos em uma sala normal e portanto sujeitos a contamina o com CO A tubula o do instrumento e a coluna sofrem uma lenta e cumulativa contamina o por materiais org nicos que s o adsorvidos e liberados de forma incontrol vel Por fim a t cnica requer o uso de muito nitrog nio de alta pureza o que extremamente dispendioso A segunda t cnica desenvolvida pela Anatel Corporation mais simples e envolve a oxida o de compostos org nicos pela radia o UV A radia o UV de comprimento de onda 185 nm converte O em oz nio O que um agente oxidante forte Oz nio por sua vez regir com a gua para formar com a participa o da radia o UV de 254 nm radicais livres hidroxila que ent o reagir o com os compostos org nicos oxidando os at g s carb nico A queda de resistividade ou aumento de condutividade resultante ent o medida e correlacionada para leitura de COT As principais vantagens deste m todo que ele permite medi es em linha de forma r pida e autom tica sendo bastante sens
148. mentam o comprimento de onda da banda de absor o m xima que o efeito batocromo Os auxocromos n o possuem banda de absor o pr pria em baixos comprimentos de onda Por exemplo o grupo hidroxil um auxocromo lcoois s o transparentes e utilizados como solventes em baixos comprimentos de onda entretanto se um grupo Hidroxil introduzido em um sistema contendo um crom foro isto causar um efeito batocromo Os auxocromos t picos o os grupos de amina e seus derivados substitu dos halog neos grupo alcalino e outros 2 2 4 Efeito de solventes As an lises espectrofotom tricas na regi o do UV s o realizadas geralmente em solu es Habitualmente trabalha se em baixas concentra es do analito de interesse e os solventes utilizados necessitam de um alto grau de pureza j que devido a sua alta concentra o em rela o ao analito suas impurezas podem provocar distor es nos resultados Al m disso os solventes para a espectrofotometria UV devem possuir um alto grau de estabilidade ptica n o sendo aconselh vel utiliza o de solventes de grau de pureza comercial que dificilmente preenchem os requisitos acima mencionados Os solventes mais usados na espectrofotometria de UV que devem ser elaborados especificamente para este fim s o os carboidratos saturados como n hexano cujas absor es eletr nicas provocadas pelas transi es dos el trons se d o fora da faixa a ser analisada tamb m
149. mento do equipamento serve para esclarecer v rias d vidas que o usu rio possa ter importante observar os cuidados relativos seguran a quando da manipula o do equipamento O uso de avental luvas e culos de prote o previnem danos de consequ ncias graves como a cegueira ou contamina o com amostras por exemplo plasma A descontamina o do sistema obrigat ria quando houver manuten o visando sempre a integridade da sa de da pessoa que ir realiz la 49 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica tOMATOGRAFIA ACOPLADOS A DETECTORES DE MASSA 5 1 Introdu o A cromatografia uma t cnica fundamental de separa o em ci ncias da vida e reas correlatas da qu mica Os detectores tradicionais como ultravioleta vis vel eletroqu mico ndice de refra o HPLC e ioniza o de chama conditividade t rmica etc GC s o amplamente utilizados para quantifica o de compostos pois geram dados em duas dimens es resposta x tempo Os detectores de massas possuem a caracter stica de gerarem dados em tr s dimens es resposta x tempo x esp cie i nica ou seja espectro de massas que podem dar informa es important ssimas quanto ao peso molecular da amostra sua estrutura molecular identidade quantidade e sua pureza Dados de espectros de massa adicionam especificidade s an lises tanto na parte quantitativa quanto qualitativa Para a grande maioria do
150. mposto por dois dinodos de convers o uma tela fosforescente e um foto multiplicador Este detector assim como o multiplicador de el trons e as placas microcanais permite a detec o de ons positivos e negativos Na detec o os ons s o acelerados de encontro ao dinodo que tem uma polaridade inversa a do on desta maneira el trons s o ent o liberados e acelerados em dire o tela fosforescente onde s o convertidos em f tons Os f tons s o ent o detectados pelo fotomultiplicador A superf cie da tela fosforescente recoberta por uma fina camada de alum nio condutor a fim de evitar a forma o de cargas as quais poderiam previnir que novos el trons a atinjam A amplifica o atinge valores de 10 a 1 ph tons emitidos fotomultiplicador 5 3 4 Aquisi o e processamento de dados A aquisi o e processamento de dados s o feitos integralmente atrav s de programas computacionais espec ficos Estes programas s o respons veis por tarefas que v o desde o controle do tempo em que um on monitorado at a constru o de curvas de calibra o onde as reas ou alturas de picos de amostras desconhecidas s o intrerpoladas gerando o dado quantitativo requisitado Cada fabricante possui seu programa de aquisi o e tratamento de dados com recursos e limita es diferentes Portanto a compreens o destes programas e posterior cria o de procedimentos de opera es padr o POP s o impresci
151. n column Para amostras com larga faixa de peso molecular eliminando o efeito de discrimina o de massa Inje o on column com temperatura program vel Para amostras termol beis com baixa temperatura de ebuli o ou com baixas concentra es Conhecido no mercado como Injetor PTV ou SPI NER VIDRO RIGERA O corpo oo o s DE amina Figura 5 Injetor com temperatura program vel 26 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica 3 3 4 Colunas A coluna a principal parte do sistema cromatogr fico pois nela que ocorre a separa o dos componentes presentes na amostra pois atrav s das diferentes afinidades das subst ncias com a fase estacion ria migrando com velocidades diferentes pela coluna Podem ser classificadas em dois grupos Colunas empacotadas S o as colunas mais antigas de cromatografia Geralmente s o fabricadas em tubos de a o inox ou vidro podendo ser empregados outros materiais na sua confec o Na parte interna deste tubo recebe um recheio que pode ser um adsorvente ou um suporte s lido impregnado com um filme de uma subst ncia que tenha baixa press o de vapor Hoje em dia s o pouco utilizadas devido ao menor desempenho em rela o s colunas capilares sendo mais utilizadas em an lise de gases inorg nicos Colunas Capilares S o as colunas mais utilizadas atualmente S o geralmente fabricadas em tubos de s lica fundida recobertos
152. nce das pipetas refer ncia norma ISO FDIS 8655 Piston operated volumetric apparatus Part 6 Gravimetric test methods 20 de 53 Volume II M dulo 1 Micropipetas Fundamentos e Opera o OES DE PROCEDIMENTOS e Pipetas operadas por pist o s o equipamentos para aspirar e dispensar volumes espec ficos de l quidos Para se assegurar a confiabilidade dos resultados necess rio implantar a seguinte rotina Verifica o da apar ncia geral teste das fun es e o teste do vazamento etapas 1 2 e 3 descritos no item 5 2 3 deste documento Se forem constatadas anormalidades realizar as etapas 4 e 5 do mesmo procedimento Limpeza peri dica das pe as da pipeta A peridiocidade da limpeza deve ser estabelecida de acordo com frequ ncia de uso n mero de usu rios para uma mesma pipeta n mero de ciclos em cada utiliza o da pipeta e a natureza dos l quidos pipetados Recomendamos aos laborat rios que realizem a limpeza a cada tr s meses se houve ac mulo de sujeira nestes tr s meses reduzir os intervalos entre uma limpeza e outra muito importante que o laborat rio mantenha registros das limpezas realizadas o qual deve conter o n mero de s rie da pipeta data da limpeza e o procedimento utilizado Troca de pe as Os selos do pist o devem ser trocados anualmente se o n mero de pipetagens ultrapassarem 100 000 os selos devem ser trocados em um per odo de tempo menor que deve se
153. ncentra o do componente A Com este fator de resposta gerado ap s inje o do padr o injeta se a amostra Com a rea gerada na amostra divide se esta rea pelo fator de resposta gerado pelo padr o e obt m se a concentra o da amostra atrav s da equa o Concentra o do rea do componente componente A Fator de resposta do componente 4 3 6 4 Padr o interno O padr o interno o m todo mais preciso de calibra o pois corrige as varia es de volume atrav s de uso de um padr o de refer ncia que adicionado na mesma quantidade tanto no padr o como na amostra A escolha deste padr o de refer ncia deve obedecer as seguintes condi es N o deve estar presente na amostra N o haver nenhum componente na amostra que tenha tempo de reten o muito pr ximo ao padr o Ser puro n o reativo e de prefer ncia ser do mesmo grupo funcional do componente a ser determinado Por estas condi es muitas vezes n o poss vel utilizar este m todo por m quando utilizado produz resultados bem precisos mesmo utilizando inje o manual O c lculo consiste em determinar o fator de resposta relativa de cada componente com a inje o do padr o atrav s da equa o Fator de resposta do rea do componente x Cone do padr o interno componente A Conc do componente A rea do padr o interno 46 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica Com os fatore
154. ncia para um bom funcionamento e durabilidade de qualquer equipamento Para um sistema de LC MS devem ser observados al m dos cuidados b sicos para o HPLC j descritos no cap tulo 4 alguns itens imprescind veis descritos a seguir 5 5 1 Sistema de v cuo Os sistemas de alto v cuo possuem geralmente tr s bombas sendo uma delas a auxiliar mec nica e as outras duas turbo moleculares A bomba mec nica requer a substitui o do fluido no m nimo a cada seis meses independentemente se usada ou n o Algumas tamb m possuem filtros e estes tamb m devem ser substitu dos e ou verificados em intervalos definidos pelo fabricante tipicamente seis mese J as bombas turbomoleculares alto v cuo s o mais espec ficas e dependem do modelo e das recomenda es de cada fabricante Algumas possuem lubrifica o permanente outras precisam ser lubrificadas em intervalos regulares Outras ainda requerem que seus rolamentos sejam substitu dos em intervalos pr determinados Portanto fundamental que as instru es de manuten o sejam obtidas com o fornecedor e que o processo seja documentado e acompanhado pois uma falha nestes sistemas pode comprometer todo o equipamento de forma definitiva 62 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica Leituras de valores de v cuo pr v cuo e alto v cuo devem ser feitas diariamente e seus valores anotados em um logbook semanalmente 5 5 2 Fonte de
155. nd veis para condu o de qualquer estudo Detalhes sobre o processo de quantifica o dos compostos podem ser consultados no item 4 6 da t cnica de HPLC 60 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica 5 4 Requisitos m nimos de instala o e opera o O prop sito dos requisitos m nimos de instala o de assegurar que o local de instala o seja devidamente avaliado e preparado com os itens de consumo e suprimentos necess rios para uma perfeita instala o Os fabricantes fornecer o uma lista de verifica o para ser acompanhada antes da data da instala o Esta lista ser espec fica do instrumento adquirido por m em linhas gerais o que deve ser observado est descrito nos itens seguintes 5 4 1 Requisitos da bancada A bancada onde ser colocado o LC MS deve ser dimensionada de maneira a acomodar bem o equipamento e proporcionar conforto ao usu rio que nela trabalha As dimens es desta bancada devem ser compat veis com as dimens es do LC MS mais o sistema de dados computador e impressora Normalmente tr s metros lineares s o suficientes para acomodar todo o sistema A estrutura deve ser de forma a suportar o peso do equipamento com seguran a portanto deve se considerar uma margem de 20 acima do peso do equipamento de maneira firme sem vibra es ou balan os Deve se considerar tamb m espa o livre na parte posterior da bancada n o deve estar encostada na pa
156. nda S o utilizados em pesquisa e desenvolvimento quando n o se conhece qual o melhor comprimento de onda deseja se obter seu espectro para sua caracteriza o biblioteca e obten o da porcentagem de pureza de picos O diagrama esquem tico ilustrado na figura 4 rede de difra o fixa E C lula arranjo de diodos l mpada Figura 4 Diagrama esquem tico de um detector de arranjo de diodos 42 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica 4 3 5 2 Detector de fluoresc ncia Os detectores de fluoresc ncia s o espec ficos pois o soluto tem que fluorescer e um dos mais sens veis dentre os mais utilizados em HPLC Na figura 5 apresentado um diagrama esquem tico deste tipo de detector C lula de amostra fonte de luz detector lo absor o log l9 1 cta E detector emiss o Figura 5 Esquema do detector de fluoresc ncia Existem detectores de fluoresc ncia no mercado que t m a capacidade de gerar espectros de fluoresc ncia de excita o e emiss o durante a corrida cromatogr fica 4 3 5 3 Detectores eletroqu micos S o os mais sens veis dentre os detectores e tamb m os mais delicados para se trabalhar As mol culas a serem analisadas devem possuir caracter sticas que possibilitem a oxida o ou a redu o A detec o efetuada atrav s de eletrodos conforme ilustra a figura 6 eletrodo auxiliar fase m vel e
157. no forno e efetuar a medi o com um term metro eletr nico calibrado com ponta flex vel que se adapte ao compartimento interno do forno 6 4 2 4 Qualifica o do amostrador autom tico 6 4 2 4 1 Precis o do amostrador autom tico Com o objetivo de garantir a precis o especificada do amostrador autom tico poder ser utilizado o teste de inje o de amostras sucessivas de uma solu o padr o obtendo se o RSD entre as reas dos picos o qual recomenda se que seja menor que 1 6 4 2 5 Sistema de dados A Qualifica o de Sistema de Dados para HPLC dever ser realizada seguindo os mesmos procedimentos que a do GC Uma vez conclu da a Qualifica o de Operac o de um sistema de Cromatografia a G s todos estes registros dever o ser armazenados em local de f cil acesso 6 5 Sistemas de cromatografia acoplados a detectores de massas 6 5 1 Manuten o preventiva de sistemas detectores de massas Assim como os sistemas anteriores a manuten o preventiva dos sistemas detectores de massas deve ser executada antes do processo de Qualifica o de Opera o OQ Cada fabricante fornece uma lista de verifica o checklist do equipamento em quest o e esta deve ser solicitada e preenchida a cada interven o de manuten o preventiva Os itens que s o verificados em uma manuten o preventiva s o basicamente divididos em tr s m dulos Sistema de v cuo Detector de massas Cromat
158. nstrumenta o Anal tica 6 3 2 4 Precis o do amostrador autom tico As condi es para verifica o de Amostradores Autom ticos s o similares verifica o de repetibilidade de sinal de detectores desta forma os resultados obtidos em RSD dos valores de reas ser o duplamente utilizados 6 3 2 5 C lculos efetuados pelo sistema de dados As verifica es normalmente efetuadas em Sistemas de Dados referem se aos c lculos utilizados na esta o de trabalho que s o C lculo dos Tempos de Reten o C lculo das Contagens de reas C lculo de Eventos de Tempo C lculo dos Coeficientes das Curvas de Calibra es para Padroniza o Externa e Interna C lculo das Notmaliza es de reas Corrigidas Normalmente estas verifica es s o efetuadas por arquivos protegidos fornecidos pelo fabricante do sistema de dados estes arquivos quando utilizados permitem verificar se os c lculos efetuados est o em conformidade com resultados definidos nestes arquivos refer ncia Uma vez conclu da a Qualifica o de Opera o de um s stema de Cromatografia a G s todos estes registros dever o ser armazenados em local de f cil acesso habitual que os fabricantes possuam para fornecimento Manuais contendo toda a documenta o de conformidade do sistema de cromatografia incluindo informa es para a Qualifica o de Projeto e Desenvolvimento do sistema DQ a Qualifica o de Instala o
159. ntre n veis de energia eletr nica s o encontradas na parte de energia alta baixo comprimento de onda ou seja regi o de ultravioleta vis vel do espectro eletromagn tico e Absor es associadas a transi es entre n veis de energia vibracional s o encontradas entre os dois anteriores na regi o do infravermelho Os v rios tipos de transi es de energia n o s o independentes mas est o interligados Estados de energia rotacional s o sobre posicionados nos estados vibracionais e ambos est o sobre posicionados nos estados eletr nicos 2 2 3 Espectro de absor o UV Vis A presen a de insatura es ou liga es m ltiplas s o amplamente reconhecidas como um processo caracter stico da absor o ultravioleta enquanto o composto saturado for transparente Na teoria molecular de orbitais os el trons envolvidos na forma o de liga es simples como a liga o C H s o chamados de el trons sigma 6 Liga es duplas como C O envolvem el trons pi ml Na regiao do infravermelho pr ximo as transi es envolvendo el trons pi proporcionam uma melhor observa o das bandas de absor o El trons n o ligados na mol cula contidos em tomos como oxig nio ou nitrog nio s o chamados de el trons 7 e as intera es entre el trons pi e n s o respons veis por um grande n mero de bandas de absor o ultravioleta caracter sticas Um crom foro um grupo no qual quando introduzido um hidrocar
160. nu 1 5 6 Microfiltra o em membrana 1 5 7 Carv o ativado 1 5 8 Radia o ultravioleta UV 2 ESPECIFICA ES PARA GUA PURIFICADA 2 1 Objetivo 2 2 Monitoramento da qualidade dos diversos tipos de gua 2 3 Calibra o e qualifica o 2 4 Recomenda es de armazenagem 2 5 Manuten o dos equipamentos de purifica o de gua 2 6 Formul rios de controle 2 7 Documentos de refer ncia 3 REFER NCIAS BIBLIOGR FICAS Volume II M dulo 2 gua para An lises Qu micas Instrumentais QU MICAS INSTRUMENTAIS 1 1 Introdu o A gua tal como se encontra na Natureza cont m diversas outras subst ncias que n o a mol cula H O sais compostos org nicos microorganismos part culas gases dissolvidos Isso se deve basicamente a sua t o conhecida caracter stica de solvente universal No laborat rio as v rias utiliza es dadas gua requerem maior ou menor grau de pureza Esse grau de pureza definido em fun o da aplica o do m todo de an lise seus interferentes e sua sensibilidade e limite de detec o Assim que a gua purificada e a sua qualidade s o fatores cr ticos para a prepara o de solu es em geral tamp es fases m veis em cromatografia brancos e tamb m outros usos mais comuns como lavagem de vidraria enx gie final os quais nem por isso s o menos importantes Definir conhecer remover e controlar
161. o do analito e da fase estacion ria Compatibilidade com o sistema de detec o Baixa viscosidade Dissolu o da amostra Baixo custo Dentre os solventes utilizados para a cromatografia l quida o que vem merecendo bastante aten o quanto a suas caracter sticas e pureza tem sido a gua sendo desej vel a utiliza o de gua ultrapura permitindo uma maior confiabilidade nos resultados Sua resistividade uma excelente indica o de qualidade sendo tipicamente 18 2 MO cm a 25 C Entretanto os compostos org nicos devem ser 37 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica monitorados uma vez que podem interferir na sensibilidade dos detectores UV muito utilizados em an lises por HPLC Outro fator importante a utiliza o desta gua sempre imediatamente j que o armanezamento da mesma modifica a condi o de gua ultrapura 4 3 2 Sistema de bombeamento de solventes A principal fun o da Bomba impulsionar a fase m vel atrav s da coluna Como as colunas possuem recheio compactado composto por part culas de di metro muito pequeno da ordem de 3 a 10 um elas oferecem uma grande resist ncia a passagem da fase m vel portanto o sistema de bombeamento dever ser capaz de ultrapassar esta barreira e proporcionar um fluxo constante reprodutivo e sem pulsa es A maioria das bombas utilizadas s o do tipo reciprocantes tamb m chamadas de bombas de pist o ou diafr
162. o injetor 6 5 2 3 Carry over 6 5 2 4 Linearidade do detecto 6 5 2 5 Exatid o de massas 6 5 2 6 Sensibilidade 7 REFER NCIAS BIBLIOGR FICAS 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica BR 1 INTRODU O A utiliza o de t cnicas de instrumenta o anal tica nos laborat rios uma necessidade n o apenas para caracterizar uma subst ncia ou garantir a qualidade de um produto mas tamb m para um aumento de produtividade de an lises com isto temos um crescente n mero de instrumentos com alto grau de automa o podendo ser operados remotamente Contudo temos que ter a consci ncia de que para uma boa utiliza o e desempenho destes instrumentos s o necess rias algumas regras b sicas como saber o prop sito de sua utiliza o uma adequada instala o evid ncias de seu desempenho pessoal treinado em sua opera o seguir as orienta es do fabricante com cuidados b sicos a serem tomados pelo operador e rotinas de substitui o de materiais consum veis pessoal que tenha s lidos conhecimentos na t cnica numa eventual implementa o de um m todo anal tico um programa de manuten es preventivas e de verifica o de desempenho compat vel com sua utiliza o em rotina avalia o de par metros que assegurem uma cont nua garantia da qualidade dos resultados obtidos enfim um planejamento detalhado sempre com evid ncias do que est sendo realizado Estam
163. obilidade dos ons na solu o e essa mobilidade inversamente proporcional a resistividade ou diretamente proporcional condutividade 8 de 29 Volume II M dulo 2 gua para An lises Qu micas Instrumentais Gr fico 1 Varia o da Resistividade e Condutividade em fun o da temperatura Resistividade Megohm cm 100 4 EA 90 4 A 25 C a resistividade da gua ultrapura 80 igual a 18 2M Q cm 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Temperatura graus C Da a necessidade de se saber qual a temperatura da gua ao se comparar essas medi es Condutiv metros eresistiv metros instalados nos equipamentos de purifica o de gua em geral possuem um circuito de compensa o de temperatura para 25 C o que permite uma leitura direta medida que a gua fica mais pura ou seja sua condutividade diminui ou sua resistividade aumenta maior a tend ncia e a velocidade com que a gua ir agregar contaminantes do meio ambiente voltando ao seu estado natural Por isso imprescind vel que a gua ultrapura n o seja armazenada e seja obtida no momento da sua utiliza o O gr fico 2 mostra essa avidez da gua altamente purificada para retomar contaminantes ilustrada pela queda acentuada da resistividade ap s apenas alguns minutos da purifica o Essa queda de resistividade ocorre pela contamina o com g s carb nico atmosf rico que na gua entra em equil brio com o on bica
164. ol nias por mL A quantidade de part culas control vel atrav s de tecnologias de remo o espec ficas microfiltra o ultrafiltra o e osmose reversa Nos processos de purifica o de gua isso suficiente e em geral n o h preocupa o em quantificar as part culas presentes atrav s das tecnologias adequadas para isso e que garantam que todas as part culas acima de um determinado tamanho sejam removidas 1 3 1 Monitora o de contaminantes i nicos inorg nicos condutividade e resistividade A condu o de corrente el trica depende dos ons presentes na gua Quanto mais pura estiver a gua menor a concentra o desses ons e portanto menor a condutividade Para uma condutividade baixa teremos sua rec proca a resistividade alta uma vez que s o express es diferentes do mesmo fen meno Portanto C 1 R ou R 1 C Unidades de medida Condutividade micromho cm ou microSiemens cm Resistividade Megohm em A condutividade da gua no limite te rico de purifica o isto quando praticamente todos os ons foram removidos restando apenas H e OH de 0 055 microSiemens cm ou 18 2 Megohm cm a 25 C Esta a chamada gua ultrapura do tipo I ASTM O gr fico 1 mostra que a temperatura um fator importante na medi o da condutividade Quanto menor a temperatura maior a resistividade portanto menor a condutividade Isso ocorre por que a baixas temperaturas ocorre uma menor m
165. onda na regi o do vis vel Intervalo de nm Cor 400 465 Violeta 465 482 Azul 482 487 Azul esverdeado 487 493 Turquesa 493 498 Verde azulado 498 530 Verde 530 559 Verde amarelado 559 571 Amarelo verde 571 576 Amarelo esverdeado 576 580 Amarelo 580 587 Laranja amarelado 587 597 Alaranjado 597 617 Laranja avermelhado 617 780 Vermelho 2 2 2 Processos de absor o Partindo do princ pio que a luz uma forma de energia a absor o de um f ton de luz por uma mol cula resulta em um incremento de energia AE na energia contida na mol cula A quantidade do incremento exatamente igual energia do f ton que AE hn O processo de absor o representado esquematicamente no diagrama de n veis de energia simplificada na figura 4 E AE hv Eo Figura 4 Diagrama de energia 10 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica Se a mol cula est inicialmente no estado normal ou estado fundamental E antes da intera o o processo de absor o aumenta a energia contida a um n vel mais alto ou um estado excitado E O processo de troca de energia pela luz absorvida n o atenuado mas ocorre na forma de m ltiplas unidades de energia chamadas quantum O quantum hen caracter stico para cada esp cie absorvida Para ser absorvido por uma mol cula o f ton de energia deve corresp
166. onder precisamente diferen a AE entre os dois estados de energia O potencial energ tico total de uma mol cula excluindo a energia do n cleo pode ser considerado como sendo a soma das energias eletr nicas vibracional e rotacional As energias eletr nicas est o associadas com transi es de el trons no interior do tomo ou mol cula Esta somat ria de energias est representada na figura 5 como uma troca de orbitais Omo Figura 5 Energia eletr nica As energias vibracional e rotacional est o associadas com vibra es e rota es moleculares Na figura 6 uma simples mol cula diat mica ilustrada no movimento de compress o e alongamento vibra o Na figura 7 est exemplificada uma rota o molecular gt 00 o o 000 Figura 6 Energia vibracional Figura 7 Energia rotacional 11 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica A diferen a entre os estados de energia rotacional relativamente pequena muito menor do que as diferen as entre os estados de energia eletr nica A diferen a entre estados de energia vibracional intermedi ria aos estados anteriores consequentemente e Absor es associadas a transi es entre n veis de energia rotacional s o geralmente encontradas na parte de baixa energia ou alto comprimento de onda do espectro eletromagn tico ou seja regi o do infravermelho afastado e Absor es associadas a transi es e
167. ormance Tomaremos como base a verifica o hipot tica de 10 uL em um pipeta de deslocamento de ar de volume vari vel 1 Como o volume testado menor do que 50 uL a taxa de evapora o deve ser determinada item 8 6 1 N mero de medidas 04 e e e e Taxa de evapora o m dia e e 0016 e 0 021 e 0 018 e 0 017 e e e e e 4 mg e 0 016 0 018 0 021 0 017 4 e 0 018 mg por ciclo 2 Registra se a temperatura e a press o inicial do teste Ti 21 5 C Pi 1013 3 Realiza se 10 medidas item 8 6 2 e os valores s o registrados W1 9 84 W6 9 90 W2 9 90 W7 9 92 W3 9 91 W8 9 93 W4 9 86 W9 9 95 W5 9 87 W10 9 92 4 Registra se a temperatura e a press o final do teste Tf 21 5 C Pf 1013 5 C lculo da press o e temperatura m dia T Ti Tf 2 P Pi P 2 T 21 5 21 5 2 P 1013 1013 2 T 215 C P 1013 Estes valores de temperatura e press o m dios ser o utilizados na determina o do fator de convers o Z 35 de 53 Volume II M dulo 1 Micropipetas Fundamentos e Opera o 6 Convers o da massa para volume Vi Wi e xZ Para uma temperatura de 21 5 C e uma press o atmosf rica de 1013 hPa o fator Z igual a 1 0032 uL mg Massa mg Volume uL W1 9 84 V1 9 89 W2 9 90 V2 9 95 w3 9 91 V3 9 96 W4 9 86 V4 9 91 w5 9 87 V5 9 92 We 9 90 V6 9 95 W7
168. os abordando neste cap tulo as principais t cnicas de instrumenta o anal tica utilizadas num laborat rio de bioequival ncia para que o profissional desta rea possa iniciar seu estudo e ter este material como refer ncia Um outro prop sito foi o de abordar a verifica o de desempenho de cada instrumento e conceitos de valida o aplicados a instrumenta o anal tica 7 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica VIOLETA VIS VEL UV VIS 2 1 Introdu o A espectrofotometria de Ultravioleta Vis vel uma t cnica anal tica baseada na propriedade que muitas esp cies i nicas ou moleculares possuem de absorver radia es ultravioleta e vis vel em solu o As radia es nestas regi es envolvem f tons com energia suficiente para provocar transi es dos el trons de val ncia em fun o de perturba es que passam a ocorrer A perturba o produzida pelos campos el tricos e magn ticos propaga se pelo espa o originando a express o radia o eletromagn tica Deve se ter em mente que os campos el tricos e magn ticos s o campos perpendiculares entre si e que os valores de propaga o onde ocorrem os m ximos e os m nimos dos campos s o sempre coincidentes ou seja os campos est o em fase como uma onda Na figura 1 pode se verificar que enquanto se propaga para a direita com velocidade V um ponto qualquer fixo sobre o eixo X passa a ter sucessivamente picos e vales da onda De
169. os tamb m 99 dos compostos org nicos com peso molecular superior a 300 v rus e bact rias A fim de obter um fluxo cont nuo de mol culas de gua nessa membrana torna se necess rio remover os contaminantes de forma regular Isto pode ser realizado atrav s do chamado fluxo tangencial figura 3 que permite que parte do fluxo de gua percorra a superf cie da membrana promovendo assim uma verdadeira varredura e impedindo o ac mulo de contaminantes Nos equipamentos essa configura o apresenta se na forma de membranas enroladas em espiral constituindo um cartucho em que os canais de permeado e rejeitado est o perfeitamente separados e estanques Isso permite que se obtenha uma rea grande de separa o em um volume relativamente pequeno permitindo assim a constru o de sistemas compactos Sistemas de osmose reversa removem uma porcentagem razo vel de todos os tipos de contaminantes por m essa remo o justamente por ser percentual n o suficiente para se obter os n veis de pureza requeridos para gua sequer do tipo II na maior parte dos casos No quadro a seguir s o mostradas as vantagens e desvantagens desse processo OSMOSE REVERSA Vantagens Desvantagens e Remove uma percentagem razo vel de todos Contaminantes n o s o suficientemente os tipos de contaminantes da gua ons removidos para satisfazer as exig ncias da org nicos pir genos v rus bact rias gua tipo II part culas
170. parando se a massa obtida atrav s do equipamento com o valor te rico do padr o escolhido Cada fabricante tem seus padr es recomendados e crit rios de aceita o para este teste 2 6 Sensibi dade O teste realizado injetando um padr o conhecido e verificando a rela o sinal ru do do pico especificado no cromatograma obtido Cada equipamento possui diferente valor para aprova o neste teste 75 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica NCIAS BIBLIOGR FICAS Apostila do Curso de Espectrofotometria de UV Vis Varian Brasil 1992 Apostila do Curso de Espectrofotometria de UV Vis Varian Brasil 1998 Apostila do Curso de Treinamento de Espectroscopia Parte A Testes de performance Varian Brasil 1999 Manual de Pr Instala o de Espectrofot metros UV Vis Varian Brasil 1998 Instru o de Trabalho Manuten o Preventiva Cary 1 100 3 300 ITST 02 AT Otto Alcides Ohlweiler Qu mica Anal tica Quantitativa Livros T cnicos e Cient ficos Editora 2 Edi o RJ 1980 Cienfuegos F Vaitsman D An lise Instrumental Interci ncia RJ 2000 Carol II Collins Gilberto L Braga e Pierina S Bonato Introdu o a M todos Cromatogr ficos Editora da UNICAMP 6 ed Campinas SP 1995 Validation Overview 85 101741 00 Varian 1999 Back to Basics Micromass UK 1996 Varian CP 3800 Gas Chromatograph Regulatory Compliance Documentation V
171. ponentes de interesse de uma amostra apare am separados e com elui o num menor tempo poss vel Um bom forno tem precis o de medida e grande variedade de programa o de rampa A utiliza o de criogenia possibilita a an lise de compostos mais vol teis 3 3 5 Detectores Existem diversos tipos de detectores os universais Condutividade T rmica TCD Espectrometria de Massas MS e os considerados seletivos ou at espec ficos Ioniza o de Chama FID Captura de El trons ECD Termo i nico TSD ou Nitrog nio F sforo NPD Fotom trico de chama FPD ou PFPD e outros Tabela 1 Tipos de detetores e sua utiliza o Detector Tipo M nimo detect vel Faixa Aplica es Linear FID fluxo de massa 10 10gcs 108 107 Compostos contendo C e H TSD ou NPD fluxo de N 2x10 g Ns N 105 NeP massa P 10 gPs P 104 FPD ou PFPD fluxo 10 10 gS s7 S 10 S e P 26 elementos da tabela de massa 10 gPs P 10 peri dica ECD concentra o 10 107 g lindano 10 Halogenados e estruturas espec ficas de dupla liga o e triplas TCD concentra o 10 10 g ml 10 10 Todos os compostos PID concentra o 10 g benzeno gt 10 Arom ticos Fen is Ser o apenas abordados os mais utilizados em cromatografia em fase gasosa GC 3 3 5 1 Detector de ioniza o de chama FID Este detector o mais utilizado apresentando simplicidade operacional
172. profissionais de diversas reas do conhecimento entre pesquisadores de universidades p blicas t cnicos da Anvisa e fabricantes de instrumenta o laboratorial e equipamentos todos estes colaboradores a Anvisa registra sua gratid o pela contribui o impar a um trabalho t o singular A estrutura final consta de dois volumes e cada qual possui tr s m dulos O primeiro volume traz detalhadas tecnicamente cada uma das etapas dos estudos de Biodisponibilidade Bioequival ncia na sequ ncia natural de sua condu o M dulo 1 Etapa Cl nica M dulo 2 Etapa Anal tica e M dulo 3 Etapa Estat stica O segundo volume abrange aspectos importantes no que diz respeito instrumenta o laboratorial e equipamentos utilizados na execu o da etapa anal tica considerados cr ticos no processo Neste volume o M dulo 1 refere se Fundamentos e Opera o de Micropipetas o M dulo 2 aborda a gua para An lises Qu micas Instrumentais e o M dulo 3 possui conte do relacionado Espectrofotometria de Ultra Violeta Vis vel Cromatografia em Fase L quida LC Cromatografia em Fase Gasosa GC Sistemas de Cromatografia Acoplados a Detectores de Massa e Verifica o de Desempenho de Instrumentos Anal ticos importante ressaltar o ineditismo mesmo em n vel internacional da reuni o de informa es provenientes de diversas disciplinas em um nico comp ndio buscando a sintetiza o de todos os aspectos que envolvem as Bo
173. quer grande Coloque o porta cone ejetor de ponteiras e porca de conex o no b quer e deixe agir por 30 min Enx gue muito bem primeiramente com gua corrente da torneira e depois com gua destilada Deixe secar a 50 C 60 C por aproximadamente 30 min Deixe em temperatura ambiente por 15 min antes de montar a pipeta para que as pe as resfriem antes da montagem da pipeta Nota a solu o de hipoclorito deve ser descartada ap s 3 dias 47 de 53 Volume II M dulo 1 Micropipetas Fundamentos e Opera o Glicina Tamp o HCI pH2 2 Prepare a solu o da seguinte maneira Tamp o 10x 30 6g de NaCl 39 2g de glicina completar com gua destilada at o volume de 523 ml Adicione HCI 1N em quantidade suficiente para um volume final de 1000mL Remova ejetor de ponteiras desrosqueie a porca de conex o e remova o pist o do porta cone Coloque o porta cone a porca de conex o e o ejetor de ponteiras no tamp o dilu do 1x dilui o 1 10 do tamp o descrito previamente a 95 C por 30 min Enx gue muito bem primeiramente com gua corrente de torneira e depois com gua destilada Deixe secar a 50 C 60 C por 30 min Deixe em temperatura ambiente por 15 min antes de montar a pipeta 9 8 2 Descontamina o da parte inferior e do corpo da pipeta Para a maioria das aplica es a descontamina o da parte inferior e do corpo da pipeta suficiente Uma mistura de
174. r D1125 Test Methods for Electrical Conductivity and Resistivity of Water D1129 Termninology Relating to Water D1293 Test Methods for pH of Water D4453 Practice for Handling of Ultra Pure Water Samples D4779 Test Method for Total Organic and Inorganic Carbon in High Purity Water by Ultraviolet UV or Persulfate Oxidation or Both and Infrared Detection D5391 Test Method for Electrical Conductivity and Resistivity of a Flowing High Purity Water Sample D5542 Test Method for Trace Anions in High Purity Water by Ion Chromatography D5997 Test Method for On Line Monitoring of Total Carbon Inorganic Carbon in Water by Ultraviolet Persulfate Oxidation and Membrane Conductivity Detection 25 de 29 Volume II M dulo 2 gua para An lises Qu micas Instrumentais Anexo 1 Modelo de formul rio de controle para equipamentos de ultrapurifica o de gua polimento final que disp em de medidor de COT acoplado DATA Hora Resistividade COT Carbono Registrado Notas Megaohm cm a Org nico Total por 25 C ppb 26 de 29 Volume II M dulo 2 gua para An lises Qu micas Instrumentais Anexo 2 Modelo de formul rio de controle para equipamentos de ultrapurifica o de gua polimento final que n o disp em de medidor de COT acoplado DATA Hora Resistividad
175. r estimado a partir da rotina do laborat rio O porta cone deve ser trocado a cada 2 anos ou quando a regi o de encaixe com a ponteira estiver desgastada Estas trocas devem ser registradas o registro deve conter o n mero de s rie da pipeta a data da troca e os dados sobre a nova pe a lote ou n mero da nota fiscal de compra Pe as que afetem a performance da pipeta por exemplo pist o vol metro haste quando necessitarem de troca ou reparo devem ser enviadas para assist ncia t cnica especializada e este reparo deve ser devidamente registrado al m do registro da nova calibra o da pipeta Verificar periodicamente a performance da pipeta exatid o e precis o conforme descrito no anexo II Esta verifica o deve ser feita a cada 3 meses e ser devidamente registrada exemplo de registro no anexo I item 8 6 5 deste documento Os erros m ximos encontrados podem ser at 2 vezes maior do que os erros estabelecidos nas tabelas 1 e 2 deste documento anexo II item 8 6 4 quando houver troca de pe as que afetem a calibra o da pipeta o procedimento de verifica o deve ser executado veja item acima troca de pe as Teste do operador Como a t cnica de opera o fundamental na obten o de bons resultados necess rio testar e registrar a t cnica de pipetagem do operador Para isso com um equipamento que esteja operando dentro das especifica es do fabricante realize 10 medidas no volume
176. r preenchida e atualmente pode se afirmar que aproximadamente 90 das separa es cromatogr ficas sejam realizadas com a utiliza o destas fases que possuem um mecanismo interessante de reten o de solutos por intera es que n o se baseiam apenas em polaridade A utiliza o de grupos octadecil leva forma o de fase octadecilsilano conhecida como ODS ou C sendo que este grupo confere fase um car ter apolar em rela o s lica n o modificada A reten o nestas fases dependente da quantidade de carbono presente geralmente expressa em porcentagem Desta porcentagem e da quantidade de silan is residuais depender a qualidade da separa o a que se aplica Esta deriva o por raz es est ricas n o atinge todos os grupos silan i s Os grupos restantes em alguns casos ao interagir com o soluto causam problema de cauda nos picos Este problema pode ser eliminado reagindo se s lica ap s a deriva o com trimetilclorosilano que por ser menor tem acesso a alguns destes grupos formando trimetilsilanos Embora n o seja poss vel a deriva o de todos os grupos silan is este processo chamado capeamento end capping Algumas an lises requerem estabilidade de temperatura de coluna e para isto est o dispon veis no mercado dispositivos para este fim e s o conhecidos como forno ou compartimento de coluna 4 3 5 Detectores Detectores s o os dispositivos transdutores que est o liga
177. r realizada no momento da retirada da gua 2 3 Calibra o e qualifica o 2 3 1 Cada um dos sistemas de purifica o de gua dever ter seus medidores calibrados e dever o ser qualificados nos aspectos Instala o Opera o e Desempenho 24 de 29 Volume II M dulo 2 gua para An lises Qu micas Instrumentais 2 4 Recomenda es de armazenagem 2 41 gua grau tipo I N o deve ser armazenada pois sua degrada o muito r pida Dever ser preparada no momento do uso 2 4 2 gua grau tipo II III e IV poder o ser armazenadas em reservat rio protegido contra contamina es externas da atmosfera Recomenda se fortemente que o per odo de armazenamento dessa gua purificada n o exceda vinte e quatro horas a partir de sua prepara o 2 5 Manuten o dos equipamentos de purifica o de gua Dever o ser seguidas todas as indica es do fabricante principalmente com rela o troca de material de consumo e limpezas eventualmente necess rias recomend vel estabelecer um programa de manuten o preventiva para cada equipamento e manter um registro das substitui es de material de consumo e das manuten es realizadas 2 6 Formul rios de controle Os anexos 1 e 2 trazem modelos de formul rios de controle para registro das medi es de resistividade ou condutividade e TOC 2 7 Documentos de refer ncia D1193 Standard Specifications for Reagent Wate
178. rapidez reprodutibilidade e alta sensibilidade s an lises a que se destina Os sistemas de HPLC atualmente existentes no mercado podem variar desde os mais simples onde as inje es das amostras s o feitas manualmente at os mais complexos com m dulo de amostragem autom tica e controlados por computadores com softwares capazes de controlar as fun es do sistema adquirir processar e imprimir os dados mantendo os de forma organizada para futuras refer ncias 36 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica Para uma melhor compreens o de um sistema de HPLC podemos divid lo em seis m dulos princip 00 0000 Figura 1 Representa o esquem tica de um sistema de HPLC Reservat rio da fase m vel Sistema de bombeamento de solventes Bomba Introdu o da amostra Injetor Compartimento para coluna pio w p A Sistema de detec o 6 Sistema de dados 4 3 1 Fase m vel A fase m vel utilizada em cromatografia l quida de extrema import ncia para a obten o de uma separa o desejada pois tem contacto com o analito que esta sofrendo separa o bem como com a coluna cromatografica e o sistema como um todo H uma grande variedade de solventes utilizados no entanto existem algumas propriedades desej veis para seu uso em HPL Alta pureza N o decomposi
179. rbonato cuja presen a promove o aumento da condutividade ou diminui o da resistividade Gr fico 2 Contamina o da gua ultrapura por gases atmosf ricos CO 20 C 20 Resistvidade M Q m 10 20 40 60 80 100mi Volume II M dulo 2 gua para An lises Qu micas Instrumentais 1 3 2 Monitora o de contaminantes org nicos TOC ou COT carbono oxid vel total Existem atualmente dois tipos de analisadores de COT Os analisadores que utilizam a oxida o f sico qu mica e os que utilizam a tecnologia patenteada pela Anatel Corporation A determina o de COT por m todos f sico qu micos envolve primeiramente a remo o de CO da gua a ser testada atrav s de purga com nitrog nio Isto traz um problema dif cil remover todo o CO O segundo passo envolve a adi o de reagentes per xidos e a a o de um catalisador UV ou calor para iniciar a rea o de oxida o Uma vez completada esta oxida o o g s carb nico por ela produzido removido da amostra de gua por borbulhamento com nitrog nio e recolhido por adsor o em uma coluna A seguir realizada uma desor o da coluna atrav s de aumento de temperatura e carreamento com um fluxo de nitrog nio puro A presen a de CO detectada por espectrometria infravermelha e a concentra o determinada pela integra o do pico Este m todo apresenta diversas limita es na medi o de COT em gua ultrapura Pri
180. recolhe os ons e os guia ao espectr metro de massas 52 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica A forma o do spray a parte mais importante da t cnica de ES normalmente aconselh vel filtrar todos os solventes e concentra es altas de eletr lito devem ser evitadas porque estes podem conduzir a supress es na ioniza o e condi es operacionais inst veis Altos fluxos compativeis queles utilizados em HPLC hoje podem ser utilizados atrav s de um g s de nebuliza o aquecido para ajudar na forma o do spray Para macromol culas cada um dos ons que normalmente entra no espectr metro de massas tem um alto n mero de carga Como os espectr metros de massas medem as rela es massa carga em lugar de massa poss vel para mol culas de altas massas moleculares terem n meros suficientes de carga para ca rem na faixa de 77 gde um quadrup lo linear tipicamente m z 20 4000 Como mostrado na Figura 6A ons de altas massas moleculares t m frequentemente uma distribui o larga de estados de carga A figura mostra o espectro de massas da mioglobina de cavalo massa molecular 16951 5 em baixa resolu o com cargas observadas de 12 a 21 Esta distribui o de ons permite o c lculo da massa molecular do analito original atrav s de dois ons vicinais com valores 7 7 ml e m2 com n1 e n2 cargas respectivamente Se m1 lt m2 e n2 n1 1 ent o M nl mi mA n2 m2 mA 1 n2 mi mA
181. rede para acomoda o de itens necess rios ao funcionamento do equipamento como por exemplo bombas de v cuo e sistema de refrigera o e circula o de gua Os fabricantes de equipamentos fornecem em seus manuais de pr instala o as descri es detalhadas da bancada necess ria 5 4 2 Rede el trica A rede el trica deve ser devidamente aterrada e estabilizada E recomendado o uso de chave magn tica caso haja constantes quedas no fornecimento de energia el trica O n mero de tomadas deve ser suficiente e no padr o correto para a instala o do sistema Deve se considerar al m do m dulo de LC MS tomadas para o sistema de HPLC e sistema de dados incluindo a impressora O padr o de tomada para o LC MS vai depender da tens o necess ria para seu funcionamento Geralmente estes sistemas como consomem grandes pot ncias requerem alimenta o de 220 VAC com capacidade para 1 5 a 2 KVA apenas para o m dulo de MS importante observar se o equipamento requer 220 VAC em uma nica fase single fase ou em duas split fase Com rela o ao consumo deve se obter com o fabricante do respectivo LC MS o consumo de energia por m dulo e total e dado em Watts ou VA ou KVA Deve se consultar um profissional da rea el trica para o dimensionamento e distribui o de capacidade do sistema el trico 61 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica As oscila es de rede el trica n o
182. riologie m dicale Pusage des tudiants en m decine Edition C et R Gilson Guide to Pipetting 8003534 prEN ISO FDIS 8655 1 Piston operated volumetric apparatus Guyomard S Goury V Laizier J Darbord J C Defining of the pyrogenic assurances level PAL of irradiated medical devices 1987 International Journal of Pharmaceutics 40 173 174 Hanne A Krupp G Removing DNA contamination from pipettes Bionews Eppendorf No 8 Hayatsu H Pan S K and Ukita T 1971 Reaction of sodium hypochlorite with nucleic acids and their constituents Chem Pharm Bull 19 10 2189 2192 Heinrich M 1991 PCR carry over BFE 8 10 594 597 Jette L P Ringuette L Ishak M Limmer M and Saint Antoine P 1995 Evaluation of three glutaraldehyde based disinfectants used in endoscopy J Hosp Infect 30 4 295 303 J rgen H and Kaiser K 1996 Avoiding viral contamination in biotechnological and pharmaceutical processes Nature Biotechnology 16 1077 1079 Kwok S and Higuchi R 1989 Avoiding false positives with PCR Nature 339 237 238 Leuci C 1998 Int r t des EVC dans le secteur biom dica Caontchoncs et plastiques 769 Manual de opera o da Pipetman P marca Gilson LT801117 Mifftin T E Control of contamination Molecular Bio Products Ou Chin Yih Moore J L and Schochetman G 1991 Use of UV irradiation to reduce false positivity in
183. ro de padr es pr estabelecidos 6 5 2 2 Linearidade do injetor Neste teste s o feitas v rias inje es de um padr o de concentra o conhecido e varia se o volume injetado Observa se ent o a linearidade em fun o do volume injetado utilizando uma curva de calibra o onde o fator de correla o utilizado para fazer a avalia o do teste Compata se ent o os resultados com valores pr estabelecidos de aceita o 6 5 2 3 Carry over O teste de carry over ou contamina o de amostra para amostra executado injetando um padr o de concentra o elevada e em seguida apenas solvente O resultado ideal que na inje o de solvente n o apare a res duo do padr o injetado anteriormente Os limites s o estabelecidos normalmente como menor ou igual a uma determinada rea ou altura 6 5 2 4 Linearidade do detector Um detector de massas torna se n o linear quando o aumento da concentra o de amostra n o produz um aumento proporcional na forma o e detec o dos ons O teste feito tra ando se diferentes concentra es e plotando se o resultado em uma curva de calibra o onde avaliado o fator de correla o comparando o com resultados pr determinados de aceita o 6 5 2 5 Exatid o de massas A exatid o de massas avaliada atrav s da inje o de um padr o conhecido quer seja pelo sistema de auto calibra o quer seja pelo injetor de amostras Os resultados s o avaliados com
184. roca i nica ou osmose reversa e adsor o org nica podem ser necess rios associados destila o se a pureza n o for atingida por um nico passo de destila o Grau tipo III de gua reagente dever ser preparado por osmose reversa seguida por eletrodeioniza o cont nua destila o troca i nica ou uma combina o destes seguidos por um polidor com um filtro de membrana de 45um O uso deste filtro torna se necess rio apenas em casos que a contamina o microbiol gica requerida 23 de 29 Volume II M dulo 2 gua para An lises Qu micas Instrumentais 2 1 4 Grau tipo IV de gua reagente poder ser preparado por osmose reversa destila o troca i nica osmose reversa seguida de eletrodeioniza o cont nua eletrodi lise ou uma combina o destes A escolha de um dos v rios tipos podem ser determinada pelo m todo ou por investiga o Esta especifica o n o pretende abranger os aspectos referentes a seguran a associados com a aplica o de responsabilidade do usu rio estabelecer o padr o apropriado de seguran a e pr ticas saud veis e determinar a aplicabilidade dos limites de regulamenta o priorit rios ao uso 2 2 Monitoramento da qualidade dos diversos tipos de gua 2 2 1 2 2 2 2 2 3 Condutividade e resistividade Para a medi o da condutividade ou resistividade dever ser utilizado o condutiv metro ou resistiv metro do pr prio equipamento de
185. s 4 Padr o de tomadas para o cromat grafo l quido Figura 7 Padr o de tomadas para HPLC Com rela o ao consumo deve se obter com o fabricante do respectivo HPLC o consumo de energia por m dulo e total e dado em Watts ou VA ou KVA Deve se consultar um profissional da rea el trica para o dimensionamento e distribui o de capacidade do sistema el trico As oscila es de rede el trica n o s o toleradas pelos equipamentos portanto fundamental que se conhe a a estabilidade de tens o e que a mesma seja compat vel com as especifica es necess rias de cada modelo 4 4 3 Condi es ambientais As condi es ambientais basicamente se resumem em temperatura e umidade A temperatura da sala onde o HPLC ser instalado deve ser controlada sem grandes varia es durante o uso O t pico requerido pelos fabricantes de 25 C com varia o de 2 C A umidade deve estar abaixo de 95 e n o dever ocorrer condensa o 4 5 Cuidados b sicos A manuten o por parte do usu rio de fundamental import ncia para um bom funcionamento e durabilidade de um cromat grafo Ap s a utiliza o do equipamento deve ser adotado um procedimento de limpeza que depende do tipo de fase m vel utilizada e o mesmo vale para a coluna cromatogr fica que deve receber aten o especial por se tratar do principal componente do sistema Para a limpeza da mesma siga cuidadosamente as instru es contidas no man
186. s hidrocarbonetos poliarom ticos PAHs bifenis policlorados PCBs EDTA agente quelante que est presente em formula es de sab es detergentes e cosm ticos citratos em regi es pr ximas a culturas agr colas c tricas 1 2 3 Part culas e col ides As part culas podem ser r gidas areia pedras terra ou deform veis restos vegetais Sua caracter stica como contaminante o fato de ser escudo protetor para microorganismos contra a a o dos raios UV e agentes de desinfec o S o tamb m um ve culo para esses microorganismos j que as bact rias por exemplo podem aderir s part culas Nas an lises instrumentais as part culas tamb m podem causar s rios problemas diretamente Em HPLC por exemplo existe sempre o risco de entupimento da coluna e de dano ao pist o da bomba de inje o Como se isso n o bastasse as part culas imobilizadas na entrada da coluna podem se transformar em outra fase estacion ria prejudicando de forma imprevis vel as caracter sticas de reten o da coluna e a separa o propriamente dita 6 de 29 Volume II M dulo 2 gua para An lises Qu micas Instrumentais Col ides s o suspens es est veis de part culas org nicas ou inorg nicas com tamanho que varia entre 0 1 a 0 00 mm apresentando a caracter stica de todas as part culas possu rem a mesma carga e mesmo sinal A repuls o que decorre disso mant m a suspens o est vel S o de dif cil remo o
187. s Gamenaravs xerays far intrarea Microwaves Radiowaves h a a i Ra feno vi o do ds dt 3 TO EE SAS E os 9 o o 10 g g a i a ao of ao iot io of ao i0 10 10 10 0 nanometres ES Energy increases Wavelength increases Figura 2 Espectro eletromagn tico Radia o Absorvida Radia o Radia o Incidente Transmitida Radia o Refletida Figura 3 Radia o absorvida transmitida e refletida Se a intensidade de uma luz transmitida representada graficamente em fun o do comprimento de onda um espectro de absor o da subst ncia obtido Esta a absor o seletiva da radia o a qual fornece a base para an lise quantitativa e qualitativa por espectrofot metro de absor o molecular 9 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica 2 2 Princ pio da t cnica 2 2 1 Espectro luminoso A luz vis vel a regi o do espectro eletromagn tico cujas radia es s o capazes de sensibilizar a retina A radia o vis vel compreende as radia es cujos comprimentos de onda est o situados entre 400 e 700nm embora estes limites n o sejam fixos em virtude da capacidade de percep o variar de acordo com o observador Nesta faixa de comprimentos de onda pode se separar em subgrupos de acordo com a cor produzida em uma pequena faixa do espectro como na tabela abaixo Tabela 1 Faixas de comprimentos de
188. s compostos os detectores de massas s o mais sens veis e de longe mais espec ficos do que os detectores tradicionais Podem analisar v rios compostos e identificar componentes em cromatogramas n o separados reduzindo assim a necessidade da cromatografia perfeita Os dados espectrais de massas podem complementar dados de outros tipos de detectores Enquanto dois compostos podem ter os espectros similares em UV ou em Massas como no caso de LC MS incomum isto acontecer simultaneamente portanto os dois tipos de dados em conjunto podem ser utililizados para identificar confirmar e quantificar compostos com grande certeza de resultados Alguns espectr metros de massas possuem a caracter stica de executar multiplos est gios de espectrometria de massas em uma nica amostra Eles podem gerar um espectro de massas selecionar um on espec fico e a partir deste gerar um novo espectro Alguns t m a capacidade de repetir este ciclo por diversas vezes at que sua estrutura seja determinada MS MS ou MS 5 2 Princ pio da t cnica O espectr metro de massas funciona basicamente atrav s da ioniza o das mol culas e sua fragmenta o Ap s isto os ons resultantes s o identificados de acordo com sua rela o massa carga Os tr s componentes chave no processo s o a fonte de ons o analisador e o detector A fonte de ons tem a fun o de gerar ons H v rios tipos de fonte de ons em cromatografia acoplada de
189. s de resposta calculados injeta se a amostra com padr o interno e com as reas obtidas calcula se a concentra o do componente utilizando a equa o Concentra o do rea do Concentra o Fator de resposta componente componente A x do padr o interno x do componente A rea do padr o interno Existem atualmente duas op es para aquisi o e processamento de dados que s o o integrador e o computador pessoal com software dedicado Ambos possibilitam executar as mesmas tarefas por parte do usu rio sendo que a diferen a b sica entre eles o sistema operacional preciso salientar a import ncia de poder transferir os dados cromatogramas obtidos de uma plataforma para outra pois para fins de interc mbio interlaboratorial isto n o pode ser um empecilho para compara o ou an lise de resultados 4 4 Requisitos m nimos de instala o e opera o Para garantir a obten o de resultados confi veis e reprodutivos e estar em conformidade com os requerimentos de Qualifica o de Instala o IQ necess rio que se verifique as condi es que se tem no local para executar a instala o Para isso podemos citar as seguintes condi es 4 4 1 Requisitos da bancada A bancada onde ser colocado o HPLC deve ser dimensionada de maneira a acomodar bem o equipamento e proporcionar conforto ao usu rio que nela trabalha As dimens es do HPLC mais o sistema de dados integrador ou computador
190. s membranas s o fabricadas com fragmentos de resinas de troca i nica inclu dos em uma matriz de polietileno Esses fragmentos de resinas cati nicas ou ani nicas permitem assim a passagem de c tions ou nions respectivamente Se introduzirmos essas membranas no sistema de NaCl e eletrodos que descrevemos teremos o controle da migra o dos ons Na e CI como mostra a figura a seguir Membrana Ani nica Membrana Cati nica Anodo cr Chlod Anodo C todo Figura 4 Controle da migra o de ons por membranas de troca i nica Na membrana ani nica somente os ons cloreto de nosso modelo conseguem atravessar Ao contr rio na cati nica somente os ons s dio Se montarmos um sistema em que alternamos as duas membranas e mantemos os eletrodos temos o chamado sistema de eletrodi lise figura 5a ka nt q Kid CI N Anodo m Tua C todo on q A Membrana Ani nica NEI produto C Membrana Cati nica Figura 5 Sistema de eletrodi lise 16 de 29 Volume II M dulo 2 gua para An lises Qu micas Instrumentais Na c lula seguinte prosseguindo direita vemos que os ons cloreto conseguem sair assim como os ons s dio Aqui observamos claramente uma deple o de ons e a eletroneutralidade tamb m mantida pois para cada on cloreto temos um s dio deixando a mesma c lula Na pr xima c lula ao contr rio os ons est o se acumulando uma vez
191. s para um n vel aceit vel Nota a descontamina o qu mica implica em um processo pr vio de limpeza com um detergente para que o processo de descontamina o possa ser eficiente Desinfec o elimina o seletiva de alguns tipos de microorganismos para prevenir a sua transmiss o redu o do n mero de microorganismos infectantes abaixo do n vel necess rio para causar uma infec o Esteriliza o elimina o completa de todos os organismos por exemplo c lulas esporos e v rus Abrevia es DNA cido Desoxirribonucleico EDTA cido Etileno DiaminoTetraac tico RNA cido Ribonucleico Materiais ABS Estireno Butadieno Acrilonitrila PBT PoliButileno Tereftalato PC PoliCarbonato PE PoliBtileno PEI Imida Polieter PMP PoliMetilPenteno POM PoiOxiMetileno PP PoliPropileno PVDF Fluoreto de PoliViniliDeno 51 de 53 Volume II M dulo 1 Micropipetas Fundamentos e Opera o R NCIAS BIBLIOGR FICAS Cimino G D Metchette K C Tessman J W Hearst J E and Isaacs S T 1990 Post PCR sterilization a method to control carryover contamination for the polymerase chain reaction Nucleic Acids Research 19 1 99 107 Deragon J M Sinnet D Mitchell G Potier M Labuda D 1990 Use of irradiation to eliminate DNA contamination for PCR Nucleic acids research 18 20 6149 Ferron A 1992 Spectre d activit des antiseptiques et d sinfectants Bact
192. stema de bombeamento a amostrador autom tico 6 4 2 Qualifica o de opera o O processo de Qualifica o de Opera o que ser aqui demonstrado est representado esquematicamente na Figural Figura 1 Visualiza o esquem tica do processo de verifica o de Desempenho de um Sistema de HPLC 71 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica Como um sistema de HPLC normalmente constitu do por v rios m dulos em cada um destes m dulos dever ser realizada a Qualifica o de Opera o Assim a conclus o do processo de Valida o ocorrer com a realiza o da Qualifica o de Desempenho PQ que sempre dever ser realizada utilizando se todo o sistema de HPLC na realiza o de atividades que comprovem que todas as especifica es do instrumento est o de acordo com a necessidade para uso 6 4 2 1 Qualifica o do detector Os par metros mais importantes que devem ser verificados em um detector de Absorb ncia s o Exatid o do Comprimento de Onda Este teste tem como objetivo de verificar a exatid o na sele o de comprimento de onda com a finalidade de garantir um baixo desvio no posicionamento da grade de difra o do sistema ptico Precis o de Comprimento de Onda Poder ser utilizado o m todo de emiss o da linha de deut rio ou xen nio ambos considerados padr o natural ou utilizando um padr o certificado de uma subst ncia crom fora N vel de Ru do e Desv
193. stimento m dio Altos custos de opera o energia e gua e Processo muito conhecido e percebido como e Manuten o regular ou pretratamento s o f cil de operar fundamentais para garantir o desempenho 12 de 29 Volume II M dulo 2 gua para An lises Qu micas Instrumentais 1 5 2 Deioniza o H 0H gt H 0 Figura 1 Esquema do processo de deioniza o em leito misto O processo de deioniza o realizado utilizando se resinas globulares porosas de troca i nica com di metros entre 0 3 e 0 8 mm Essas resinas s o fabricadas com cadeias polim ricas contendo liga es cruzadas de estireno e divinilbenzeno nas quais est o ligados grupos qu micos carregados Nas resinas ani nicas ou seja as resinas que capturam nions esses grupos s o de am nio quatern rio Nas cati nicas resinas que capturam c tions utilizam se grupos sulf nicos No in cio de um processo de deioniza o quando a resina n o foi ainda utilizada os ons ligados aos grupos negativos das resinas cati nicas s o os pr tons H e os ons ligados s ani nicas s o as hidroxilas OH Durante o processo c tions presentes na gua Na Ca etc ir o se ligar resina cati nica e deslocar o pr ton H enquanto que os nions CI NO ir o se ligar resina ani nica e deslocar as hidroxilas A deioniza o um processo muito eficiente para a remo o de ons e a
194. t de alguns compostos org nicos ionizados Entretanto as resinas constituem um excelente suporte para crescimento bacteriano Como a gua de alimenta o n o est ril o resultado que a contamina o bacteriol gica da gua ap s uma coluna de deioniza o pode ser 1000 vezes maior do que a da gua de entrada 13 de 29 Volume II M dulo 2 gua para An lises Qu micas Instrumentais DEIONIZA O Vantagens Desvantagens Efetiva na remo o de ons Resistividade 1 10 Megohm cm Instala o simples Baixo investimento Regener vel N o remove part culas material org nico ou microorganismos Resinas regeneradas podem gerar part culas org nicos ou promover o crescimento de bact rias e Troca i nica padr o origem da resina desconhecida e Altos custos de opera o regenera o transporte e Qualidade da gua vari vel gl bulos danificados A regenera o das resinas pode ser realizada no que realizam esse processo trocando uma coluna esgotada por outra regenerada Isto pode ser fonte de contamina o i nica residual origin ria de utiliza es em que a gua de entrada ou do pr prio ambiente a que essas resinas estiveram expostas Resinas de um nico uso portanto n o regener veis s o as mais indicadas para evitar todos esses problemas 1 5 3 Osmose reversa o Press o Da a o 8 Osmose Reversa
195. tanol acetonitrila tetrahidrofurano e diclorometano observada a ordem crescente vide tabela 1 O diclorometano por n o ser sol vel em gua n o usado em fase reversa mas por ser um solvente muito forte s vezes usado para limpar as colunas de fase reversa que tenham sido contaminadas por solutos fortemente retidos Tabela 1 Compara o entre for as de diferentes fases m veis Solvente Hexano Heptano 0 00 Cloroformio 0 26 Diclorometano 0 30 Eter et tico 0 38 Metil t butil ter 0 48 Acetato de etila 0 48 Dioxano 0 51 Acetonitrila 0 52 THF 0 53 1 ou 2 propanol 0 60 Matanol 0 70 35 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica A Acetonitrila al m de poder ser usada em uma baixa faixa de absor o no ultravioleta apresenta a viscosidade o que desej vel Deste modo juntamente com metanol e solu es aquosas com baix THF estes s o os solventes mais usados para controlar a seletividade e separa o no modo reverso de elui o Quando por algum motivo n o se usa gua na fase m vel e utiliza se fases estacion rias apolares a cromatografia dita cromatografia n o aquosa de fase reversa Ela s usada quando se trabalha em solutos muito hidrof bicos como lip dios e pol meros e o solvente normalmente consiste em uma mistura de solventes polares como acetonitrila ou metanol solvente com um solvente mais fra
196. tectores de massas Cada tipo espec fico para uma certa classe de compostos H tamb m v rios tipos de analisadores respons veis pela separa o dos ons e detectores respons veis pela gera o de sinais mensur veis Cada um deles possue suas vant gens e desvant gens dependendo do tipo de informa o que se esta buscando Os detalhes dos tipos mais comuns de fontes analisadores e detectores ser o discutidos seguir 50 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica 5 3 Descri o b sica do sistema SISTEMA DE DADOS DS 5 3 1 Fonte de ioniza o A fonte onde ir ocorrer a ioniza o e fragmenta o das mol culas Muitas t cnicas de ioniza o existem entre v rias podemos citar Bombardeamento de tomos FAB Desors o por Laser LD Termospray TS Feixe de part culas etc Por m os tipos de fontes mais utilizados s o 5 3 1 1 Impacto de el trons El A fonte de Impacto de El trons EN utiliza um filamento que respons vel pela emiss o de el trons com uma energia definida de 70 eV como a energia do feixe de el trons bem maior que o primeiro potencial de ioniza o na maioria dos compostos da amostra esta ionizada e depois fragmentada Este tipo de ioniza o acoplado CG 5 3 1 2 Ioniza o qu mica CI A fonte de Ioniza o Qu mica CI utiliza agentes l quidos ou gasosos para promover uma rea o com as mol culas nor
197. tem por objetivo permitir a realiza o de obten o de resultados anal ticos em amostras s lidas que possuam transpar ncia como vidros pl sticos e lentes De f cil conex o ao instrumento este suporte pode possuir tamb m uma vers o na qual a amostra transparente caminha em frente ao feixe ptico com a finalidade de obter se um perfil de homogeneidade da amostra Um dispositivo rotat rio pode ser utilizado para verificar o comportamento desta mesma amostra s lida e transparente mas com ngulos distintos de radia o incidentes 19 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica 2 3 3 4 Acess rios de reflect ncia Amostras s lidas que n o sejam transparentes pode ser analisadas e o perfil espectro de reflect ncia da amostra pode ser obtido Existem diversos tipos de acess rios de reflect ncias dispon veis e que podem ser acoplados aos espectrofot metros como por exemplo reflect ncia especular reflect ncia difusa reflect ncia temperatura e press o controladas reflect ncia de p s e cremes e compara o de colora o de amostras s lidas 2 3 4 Aquisi o de dados Os dispositivos fotossens veis usados nos instrumentos para a medida da transmit ncia convertem a energia radiante em um sinal el trico Os detectores fotossens veis devem responder energia radiante em uma faixa espectral ampla Eles devem ser sens veis a baixos n veis de ilumina o e responder rapidamente rad
198. tes Detergentes surfactantes ani nicos s o mol culas org nicas com uma extremidade polar hidrof lica e outra n o polar hidrof bica Devido a sua estrutura eles tornam res duos insol veis graxa por exemplo em sol veis sendo portanto agentes de limpeza eficientes 9 1 1 Procedimento de limpeza padr o maiores detalhes consultar anexo I Este procedimento deve ser utilizado para eliminar os contaminantes provenientes do uso da pipeta por exemplo prote nas e tamp es e que n o requerem tratamento especial para serem eliminados tais como microorganismos radiatividade e outros abordados adiante Retire o ejetor de ponteiras puxando o Desconecte a porca de conex o separando assim o corpo da pipeta do porta cone Remova o conjunto do pist o cuidadosamente e separe o s selo s mantendo o porta cone com a parte mais fina para baixo Coloque o porta cone o conjunto do pist o o ejetor de ponteiras o s selo s em um b quer n o colocar o corpo da pipeta completando seu volume com solu o de detergente de 4 a 8 em gua morna 50 C Coloque o b quer no banho de ultra som e deixe aproximadamente 15 minutos caso n o tenha ultra som deixar na solu o por 40 minutos Descarte a solu o de detergente utilizada Frequentemente o s selo s ficam presos dentro do porta cone Para retir los deve se recolocar o pist o pression lo contra o porta cone como se fosse fazer uma
199. tid o e precis o Materiais cidos como 16 de 53 Volume II M dulo 1 Micropipetas Fundamentos e Opera o por exemplo cido sulf rico cido clor drico cido n trico fenol ou corrosivos como por exemplo hidr xido de s dio solventes clorados podem danificar o pist o Pist o danificado leva a resultados n o confi veis Para se evitar danos ao pist o recomenda se limpar as pe as da pipeta logo ap s a manipula o deste tipo de l quido po Ao contr rio do procedimento descrito no item a para esta limpeza n o necess rio a utiliza o de um agente qu mico basta utilizar gua destilada e Desmonte a pipeta de acordo com as instru es do fabricante Jogue gua destilada sobre as seguintes pe as ejetor porta cone pist o selos do pist o Deixe secar temperatura ambiente ou em estufa at 40 Monte a pipeta de acordo com instru es do fabricante OBSERVA ES Confirme se as pe as em quest o podem ser lavadas e se o procedimento afetar sua calibra o ou seja se necess rio executar o procedimento de verifica o da performance logo ap s a limpeza O procedimento descrito no item b acima particularmente indicado para pipetas com pist o met lico Para pist es de outros materiais vidro pl stico cer mica usual a presen a de graxa de silicone para veda o do pist o desta forma se recomenda verificar e seguir os procedimentos
200. transmitido para uma esta o de dados onde se visualiza este sinal em um gr fico de intensidade de sinal em fun o de tempo Este gr fico denominado cromatograma O sinal proporcional concentra o ou massa de cada composto sendo que pode haver respostas diferentes de composto para composto nem sempre o composto que tem mais quantidade gera o maior sinal Da a possibilidade de se quantificar a amostra O GC permite a an lise de diversos tipos de subst ncias desde alguns gases inorg nicos como O CO CO NO e etc como tamb m milhares de subst ncias org nicas de diversos grupos funcionais como p ex lcoois cetonas aminas arom ticos e outros Com o uso de detectores altamente seletivos poss vel determinar quantidades muito pequenas dos componentes em quest o na amostra como p ex na ordem de picogramas n vel de tra os como tamb m pode se determinar em quantidades maiores como p ex na ordem de porcentagem 3 3 Descri o b sica do sistema Os m dulos que constituem um sistema b sico s o os seguinte 1 Sistema de gases Os gases mais utilizados como fase m vel g s de arraste s o o h lio o hidrog nio o arg nio e o nitrog nio Outros gases podem ser utilizados O uso de gases auxiliares se faz necess rio dependendo do detector a ser utilizado 2 Controladores de fluxo e de press o S o utilizados para manter a uniformidade da vaz o da fase m vel Al
201. triais para esteriliza o n o deixa os materiais radioativos A escolha da dosagem baseada em determina es experimentais regulares Ap ndice 2 Pirog nicos contamina o por pirog nicos pode ser preocupante em alguns procedimentos farmac uticos nos quais aparelhos m dicos s o utilizados para prepara es parenterais mencionado em in meros m todos da Pharmacop ia Pir genos s o endotoxinas produzidas por bact rias Gram negativas e s o qu mica e fisicamente est veis Muito pouco tem sido publicado sobre como elimin los A utiliza o de raios gama em altos n veis de energia m nimo de 25 kGy parece eliminar os riscos da contamina o por pirog nicos Em outras palavras para que um produto possa ser certificado como livre de pirog nicos ele tem que ser fabricado e controlado como um equipamento m dico 49 de 53 Volume II M dulo 1 Micropipetas Fundamentos e Opera o BO io ANEXO IV DEFINI ES Exatid o erro m dio ou erro sistem tico diferen a entre o volume dispensado e o volume nominal ou o volume selecionado na pipeta Calibra o conjunto de opera es que estabelecem a rela o entre o volume dispensado e o volume nominal ou selecionado correspondente na pipeta Volume morto de ar nas pipetas de deslocamento de ar o volume de ar entre a parte inferior do pist o e a superf cie do l quido Taxa de evapora o estimativa da perda de gua causada pel
202. trodu o 3 2 Princ pio da t cnica 3 3 Descri o b sica do sistema 3 3 1 Gases utilizados 3 3 2 Controladores de fluxo e press o 3 3 3 Injetores 3 3 3 1 Injetores empacotados 3 3 3 2 Injetores capilares 3 3 4 Colunas 3 3 4 1 Forno de colunas 3 3 5 Detectores 3 3 5 1 Detector de ioniza o de chama FID 3 3 5 2 Detector de nitrog nio e f sforo NPD ou termo i nico espec fico TSD 3 3 5 3 Detector de captura de el trons ECD 3 3 6 Aquisi o e processamento de dados 3 4 Requisitos m nimos de instala o e opera o 3 5 Cuidados b sicos nr iniri eiaa CROMATOGRAFIA EM FASE L QUIDA LC 4 1 Introdu o 4 2 Princ pio da t cnica 4 21 Modos de separa o 4 2 1 1 Cromatografia em fase normal 4 2 1 2 Cromatografia em fase reversa 43 Descri o b sica do sistema 4 3 1 Fase m vel 4 3 2 Sistema de bombeamento de solvente Introdu o de amostra injetor 4 3 3 1 Injetor manual 4 3 3 2 Injetor autom tico 4 3 4 Coluna 4 3 4 1 Fases estacion rias base de s ica 4 3 4 2 Fases quimicamente modificada 43 5 Detectores 4 3 5 1 Detectores de UV VIS 4 3 5 2 Detector de fluoresc ncia Detectores eletroqu mico 4 3 6 Aquisi o e processamento de dado 4 3 6 1 Porcentagens de rea 4 3 6 2 Normaliza o de rea 4 3 6
203. turas terci rias e quatern rias das prote nas Pa erga Rompe as estruturas terci rias e quatern rias das prote nas Acidos e lcalis Desequil brio do balan o de cargas 9 3 2 cidos nucl icos DNA e RNA A especificidade e a sensibilidade das t cnicas de PCR e RT PCR possuem uma desvantagem f cil contamina o dos reagentes e das amostras causando erros sistem ticos M todo Agente qu mico A o Os cidos nucl icos s o degradados a mol culas de pesos Ai lavagem utociavage moleculares menores Danos aos cidos nucl icos cross linking de pirimidinas adjacentes na mesma fita base timina em particular As bases do d mero deixam de formar pares ligados por pontes de hidrog nio deixando de servir como primers ou templates Irradia o UV isa e i para a s ntese dos cidos nucl icos Resultado Processo de reparo em excesso Falha do processo de replica o O hipoclorito de s dio reage de maneira inespec fica com os cidos nucl icos As bases e os nucleot deos livres s o destru dos algumas vezes formam se derivados clorados ocorrendo desestabiliza o e quebra da h lice do DNA Hipoclorito de s dio Rompe a estrutura dos cidos nucl icos Alquila os cidos nucl icos Glutaralde do Outro m todo Glicina Tamp o HCI pH 2 A a o desta solu o n o documentada veja protocolo mais adiante Nota
204. ua ultrapura ou gua grau reagente utilizada para aplica es cr ticas de laborat rio inclu das a as an lises instrumentais por HPLC Tipo II para aplica es pouco exigentes tais como enx g e de vidraria an lise qualitativa ou ainda s ntese org nica Tipo III para aplica es gerais em laborat rio prepara o de meios de cultura e enx g e final de vidraria em aplica es n o cr ticas Tipo IV abastecimento de sistemas produtores de gua grau reagente Condutividade m xima 0 056 1 0 0 25 5 0 uS cm a 298K 25 C Resistividade m nima 18 1 0 4 0 0 2 Megohm cm a 298K 25 C PH a 298K 25 C E 5 0 a 8 0 COT Carbono Oxid vel Total 100 50 200 sem limite M ximo ug L S dio m ximo ug L 1 5 10 50 Cloretos m ximo pg L 1 5 10 50 S lica Total m ximo ug L 3 3 500 sem limite Contamina o Microbiol gica quando o n vel das bact rias necessita ser controlado o tipo de grau dever ser promovido como se segue Tipo A TipoB TipoC Contagem m xima de bact rias heterotr ficas 10 1000mL 10 100mL 100 10mL Endotoxinas Eu mL lt 0 03 0 25 n o se aplica 11 de 29 Volume II M dulo 2 gua para An lises Qu micas Instrumentais 1 5 Tecnologias de purifica o de gua para laborat rios Para purificar a gua at os n veis especificados na ASTM e os demais rg os diversas tecnologias est o dispon veis
205. ual 48 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica O sistema que requer um cuidado maior o que trabalha com solu o tamp o como fase m vel Ap s o uso do mesmo imprescind vel que seja utilizada gua 100 para completa remo o da solu o tamp o e depois a utiliza o de uma mistura por exemplo metanol ou acetonitrila 70 e gua 30 Isto porque deixando o sistema apenas com gua possibilitaria o surgimento de fungos O usu rio deve estar familiarizado com a troca de pe as consum veis de seu sistema Toda interven o de manuten o deve estar relatada em um caderno de atividades logbook Aqui est o relatadas as principais partes de consumo para cada m dulo Bomba Selos pist es filtros Injetor manual Selo do rotor al a de amostra loop conex es Injetor autom tico Filtros septos selo do rotor partes de unidade de seringa quando houver frascos para amostras e reagentes agulha al a de amostra Detectores UV Vis vel e fluoresc ncia L mpadas lentes o rings Detector eletroqu mico Eletrodos solu o de KCI o rings O treinamento por parte do usu rio pelo exposto al m da opera o do equipamento deve incluir estes cuidados b sicos sendo obstante que o profissional tenha forma o compat vel para este n vel de aprendizado Consultar os manuais tamb m uma tima pr tica pois al m de informar com mais detalhes o funciona
206. uer componentes est veis de alta qualidade no tocante precis o Os espectrofot metros de leitura direta operam com precis o moderada em torno de 1 em transmit ncia s o instrumentos relativamente baratos de opera o simples e r pida e de f cil manuten o O instrumento de feixe simples necessita incorporar um circuito de zero para a medida de transmit ncia com a finalidade de melhorar a precis o de trabalho 17 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica 2 3 2 2 Arranjo de diodos Este tipo de espectrofot metro possu uma configura o simples de monocromador figura 11 utilizando apenas uma grade de difra o e um sistema de detec o composto por v rios fotodiodos um feixe de luz policrom tico inicialmente incide no compartimento de amostra e logo depois a luz transmitida direcionada ao monocromador que ap s a dispers o da luz incide no sistema de detec o Figura 11 Monocromador policrom tico 2 3 2 3 Duplo feixe Os espectrofot metros de feixe duplo partem a radia o original no espa o por meio de um espelho ou no tempo por meio de um espelho setorial rotativo Este tipo de espectrofot metro normalmente empregado para an lises que necessitam de maior precis o anal tica O feixe de luz disperso no monocromador figura 12 sincronizado por um dispositivo ptico que far com que o feixe incida ora em um compartimento da amostra tamb m chamado de fei
207. xe anal tico ora em outro compartimento de refer ncia tamb m chamado de feixe de refer ncia A luz transmitida em ambos os compartimentos sincronizada novamente ao sistema de detec o com isto poderemos eliminar interfer ncias como oscila es da fonte de energia varia es de tens o el trica bem como do pr prio solvente utilizado no preparo da amostra Desta maneira flutua es na pot ncia da fonte resposta do detector e ganho do amplificador s o compensados pela observa o da diferen a entre os sinais Os espectrofot metros de duplo feixe s o mec nica e eletronicamente mais complicados do que os de feixe simples e consequentemente de constru o e manuten o mais caras Grade de difra o 4 m Fenda de Entrada ae Dispositivo ptico Q l de Sincronismo f Compartimento de Amostra Figura 12 Monocromador de duplo feixe 18 de 76 Volume II M dulo 3 Instrumenta o Anal tica 2 3 3 Compartimento de amostras O compartimento de amostras de espectrofot metro UV Vis possui uma grande variedade de conex es e acess rios que permitem uma amplia o nas aplica es poss veis do instrumento O compartimento de amostras b sico vem equipado com suporte de amostra retangular para cubeta de quartzo de 10mm De acordo com a aplica o poss vel introduzir suportes de amostras para cubetas de tamanhos vari veis para cubetas de 1 a 100mm de comprimento 2 3

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