Guida di riferimento per il kit MiSeqDx Universal - Support
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1. la temperatura del blocco termico si riduce gradualmente da 95 C a 40 C Tipicamente questo processo richiede 80 minuti Questo raffreddamento graduale essenziale per un ibridazione corretta pertanto per questo processo non si consigliano termociclatori per PCR con raffreddamento attivo ad es Peltier raffreddato termoelettricamente PUNTO DI ARRESTO SICURO Quando il blocco termico raggiunge i 40 C la piastra HYB stabile a una l temperatura di 40 C per 2 ore D 8 N codice 15036910 Rev A ITA Rimozione degli oligonucleotidi non legati Questo processo consiste nella rimozione di oligonucleotidi non legati dal DNA genomico mediante un filtro in grado di selezionare le dimensioni Due fasi di lavaggio con il Tampone di lavaggio stringente garantiscono la rimozione completa degli oligonucleotidi non legati Una terza fase di lavaggio con il Tampone di lavaggio universale rimuove il Tampone di lavaggio stringente residuo e prepara i campioni per la fase di estensione ligazione q y AVVERTENZA Questo set di reagenti contiene formammide una ammide alifatica che una probabile tossina riproduttiva L inalazione l ingestione il contatto con la pelle o con gli occhi possono causare lesioni personali Smaltire i contenitori e i contenuti non utilizzati in conformit alle norme locali di sicurezza vigenti Per ulteriori informazioni vedere le MSDS per questo kit all indirizzo http www illumina com msds Tempo stimat2. necessario cambiare le punte quando si cambia colonna se si fa attenzione a evitare la contaminazione incrociata 2 Sigillare la piastra filtro con un foglio di alluminio adesivo quindi coprire il coperchio per fissare il foglio durante l incubazione 3 4 N codice 15036910 Rev A ITA 3 Incubare l intero gruppo FPU nell incubatore preriscaldato a 37 C per 45 minuti 4 Durante l incubazione della piastra FPU preparare l AMP piastra di amplificazione come descritto nella prossima sezione Guida di riferimento per il kit MiSeqDx Universal 1 0 3 H nebe ipnosjpnuobio Bsp suoize6i suUosua sz Amplificazione mediante PCR Questo passaggio consiste nell amplificazione dei prodotti del processo di estensione ligazione mediante primer che aggiungono sequenze di indici per il multiplex dei campioni oltre a comuni adattatori necessari per la generazione di cluster Tempo stimato Durata totale circa 90 minuti Tempo di intervento dell operatore 30 minuti Materiali di consumo Apparecchio Master Mix per PCR Primer indice A A501 H A508 Primer indice 1 A701 12 A712 PCR polimerasi Sigillo per piastre PCR appropriato 0 05 N NaOH preparato al momento Piastra skirted per PCR a 96 pozzetti Vaschette 36 Quantit 1 provetta 1 provetta per primer 1 provetta per primer 1 provetta Come necessario 1 piastra Come necessario Conservazione tra 25 C e 15 E tra 25 C e 15
3. HYB Piastra LNP Rimozione degli Normalizzazione della libreria oligonucleotidi non legati Tempo di intervento 30 min Tempo di intervento 20 min Elaborazione 60 min Reagenti Reagenti SCA en an ir la lras Lavaggio di normalizzazione della bbreria Output Tampone di conservazione libreria Piastra FPU EtOH NaOH Output Piastra SGP i 1 oligonucieotidi legati e a E Creazione di pool di librerie Reagenti Tempo di intervento 10 min Miscela di estensione ligazione Roagonti Output Tampone di diluizione libreria Piastra FPU Output Provette PAL DAL Amplificazione mediante PCR Tempo di intervento 30 min Durata del cicio 90 min Master Mix per PCR PCR Primer indice NaOH Output Piastra AMP Guida di riferimento per il kit MiSeqDx Universal 1 0 1 Q OjjO00104d SP FIOAB IP OSSNJH Preparazione del foglio campioni per MiSegDx 1 Nella schermata Welcome Benvenuto di Worklist Manager Illumina selezionare Create Worklist Crea lista di lavoro Viene visualizzata la schermata Enter Run Parameters Immetti parametri della corsa Figura 2 Illumina Worklist Manager schermata Enter Run Parameters Immetti parametri della corsa Illumina Worklist Manager Please Enter Run Parameters 2 Nel campo Test Type Tipo di test selezionare MiSeqDx Universal 3 Nel campo Worklist Name Nome lista di lavoro immettere il nome per il foglio campioni Questo un campo obbligatorio Se per il nome del foglio campioni viene utilizz
4. a otto provette per PCR Sigillare l SGP con un sigillo adesivo per piastre e metterla da parte NOTA Dopo l uso conservare la piastra SGP fra 25 C e 15 C La piastra SGP sigillata rimane stabile per un massimo di 3 giorni Combinare e trasferire il contenuto della striscia a otto provette per PCR nella provetta PAL Miscelare energicamente la provetta PAL Etichettare una provetta Eppendorf nuova con DAL_Plate_ID Diluted Amplicon Library libreria di ampliconi diluita Dispensare 585 ul di Tampone di diluizione libreria nella provetta DAL Dispensare 6 ul di Controllo interno PhiX 20 pM nella provetta DAL Con la stessa punta pipettare su e gi per 3 5 volte per sciacquare la punta e assicurare che il trasferimento sia completo Trasferire 9 ul di PAL nella provetta DAL contenente Tampone di diluizione libreria Con la stessa punta pipettare su e gi per 3 5 volte per sciacquare la punta e assicurare che il trasferimento sia completo Mescolare la DAL agitando la provetta molto velocemente NOTA Se si desidera conservare la restante PAL per utilizzarla in futuro porre la provetta PAL a una temperatura fra 25 C e 15 C La PAL si conserva bene per tre giorni La libreria diluita DAL deve essere preparata al momento e utilizzata immediatamente per caricare il MiSeqDx Se conservata la DAL pu comportare una riduzione significativa della densit dei cluster D 4 N codice 15036910 Rev A ITA 14 Centrif
5. un bagnomaria contenente abbastanza acqua deionizzata a temperatura ambiente da immergere la base della cartuccia di reagenti fino alla linea di livello acqua stampata sulla cartuccia stessa Evitare che l acqua superi la linea di massimo livello acqua Figura7 Linea di massimo livello acqua 3 Lasciare la cartuccia di reagenti a scongelare a bagnomaria a temperatura ambiente per circa un ora o fino a completo scongelamento D N codice 15036910 Rev A ITA 4 Rimuovere la cartuccia dal bagnomaria e batterla delicatamente sul banco per far fuoriuscire l acqua in eccesso dalla base Asciugare la base della cartuccia Verificare che sulla parte superiore della cartuccia di reagenti non sia caduta dell acqua Ispezione della cartuccia di reagenti 1 Capovolgere la cartuccia dieci volte per miscelare i reagenti scongelati e poi ispezionare visivamente tutti i serbatoi per accertarsi che siano scongelati NOTA E fondamentale che i reagenti nella cartuccia siano scongelati completamente e miscelati per assicurare il sequenziamento corretto Ispezionare visivamente il reagente nella posizione 1 per accertarsi che sia ben miscelato e privo di precipitati Battere delicatamente la cartuccia sul banco per ridurre le bolle d aria nei reagenti j NOTA I tubi dei pescanti del MiSeqDx vanno fino al fondo di ciascun serbatoio per aspirare i reagenti per questa ragione importante che i serbatoi non contengano bol
6. x g a 20 C per 5 minuti Lavare la piastra filtro come segue a Con una pipetta multicanale dispensare 45 ul di Tampone di lavaggio stringente in ciascun pozzetto contenente il campione Non necessario cambiare le punte quando si cambia colonna se si fa attenzione a evitare la contaminazione incrociata b Coprire la piastra filtro con il coperchio e centrifugare a 2 400 x g a 20 C per 5 minuti Ripetere il lavaggio nel modo seguente a Con una pipetta multicanale dispensare 45 ul di Tampone di lavaggio stringente in ciascun pozzetto contenente il campione Non necessario cambiare le punte quando si cambia colonna se si fa attenzione a evitare la contaminazione incrociata b Coprire la piastra filtro con il coperchio e centrifugare a 2 400 x g a 20 C per 5 minuti c Seil tampone di lavaggio non fa defluire tutto il liquido centrifugare nuovamente la piastra filtro a 2 400 x g a 20 C per 5 minuti Smaltire tutto il materiale defluito contenente formammide raccolto fino a quel momento in un apposito contenitore per rifiuti pericolosi quindi riassemblare 3 D N codice 15036910 Rev A ITA l FPU La stessa piastra MIDI pu essere riutilizzata per il resto del processo di pre amplificazione 8 Con una pipetta multicanale dispensare 45 ul di Tampone di lavaggio universale in ciascun pozzetto contenente il campione Non necessario cambiare le punte quando si cambia colonna se si fa attenzione a evitare la contaminazi
7. 0 SE tra 15 C e 30 C tra 15 C e 30 E tra 15 C e 30 sE Fornito da Illumina Illumina Illumina Illumina Utente Utente Utente Utente 45 IEUJON IZEZZ dll elp SUO BUSI Questo set di reagenti contiene formammide una ammide alifatica che una probabile tossina riproduttiva L inalazione l ingestione il contatto con la pelle o con gli occhi possono causare lesioni personali Smaltire i contenitori e i contenuti non utilizzati in conformit alle norme locali di sicurezza vigenti x y AVVERTENZA Per ulteriori informazioni vedere le MSDS per questo kit all indirizzo http www illumina com msds Preparazione 1 Preparare 0 1 N di NaOH freschi aggiungendo 30 pl di 10 N di NaOH a 2 970 pl di acqua sterile 2 Prelevare Diluente normalizzazione libreria dalla temperatura di conservazione tra 25 C e 15 C e portare a temperatura ambiente Utilizzare un bagnomaria tra 20 C e 25 C in base al bisogno amp NOTA Diluente normalizzazione libreria potrebbe formare precipitati o cristalli visibili Prima dell uso agitare energicamente quindi porre la provetta davanti a una luce ed eseguire un controllo visivo per assicurarsi che tutti i precipitati si siano completamente sciolti 3 Prelevare le Microsfere libreria e il Lavaggio di normalizzazione della libreria dalla temperatura conservazione compresa tra 2 C e 8 C e portare a temperatura ambiente Utilizzare un bagnomaria
8. 30 Utente consigliate quelle con tappo E a Vite Striscia a otto provette per 1 male Cesi Utente BEGER Ke Portaghiaccio da 2 5 1 1 tra 15 C e 30 Utente C D O N codice 15036910 Rev A ITA Preparazione del pool di librerie 1 Predisporre un blocco termico adatto a centrifugare provette da 1 5 ml a 96 C 2 Inun portaghiaccio preparare un bagno di acqua e ghiaccio Raffreddare il Tampone di diluizione libreria nel bagno di acqua e ghiaccio 3 Cominciare a scongelare la cartuccia di reagente MiSeqDx Preparazione di una soluzione di diluizione fresca di NaOH Yy ATTENZIONE L utilizzo di una soluzione di diluizione fresca di NaOH essenziale per denaturare completamente i campioni in vista della generazione dei cluster sul dispositivo MiSeqDx Per denaturare i campioni preparare 1 ml di 0 1 N NaOH Preparando un volume di 1 ml si evita che errori di pipettaggio su volumi piccoli influenzino la concentrazione finale di NaOH 1 Combinare i seguenti volumi in una provetta per microcentrifuga Acqua priva di DNAsi e RNAsi 900 ul 1 0 N di NaOH 100 ul 2 Capovolgere la provetta diverse volte per miscelare Denaturazione e diluizione Controllo interno PhiX 1 Combinarei seguenti volumi per diluire la libreria del Controllo interno PhiX a 2 nM Libreria del Controllo interno PhiX da 10 nM 2 pl 1X tampone TE 8 pl 2 Combinarei seguenti volumi di libreria del Controllo interno PhiX da 2 nM e 0 1 N di NaOH in una prov
9. 4 Li 6 ni a E E E E e e Ce DEDEDE ENE c F EDEDED ED D EDEDED ED EE EDEDED ED F DCEYCEYCEYCE e COTE CCC NEEDED ED EDEDED EDEDED 5 Selezionare Fine Rendimento dei campioni e rappresentazione dell indice Per il Kit MiSeqDx Universal 1 0 Illumina il rendimento dei campioni per corsa di MiSeqDx pu essere tra 8 e 48 campioni I primer di indicizzazione usati durante l amplificazione mediante PCR devono essere scelti in base al rendimento dei campioni finale desiderato per garantire diversit nella sequenza dell indice L NOTA Per la massima efficienza di rendimento eseguire la preparazione della libreria per un massimo di 96 campioni e quindi dividere i campioni in due corse di sequenziamento con un massimo di 48 campioni ciascuno MiSegDx utilizza un LED verde per il sequenziamento delle basi G T e un LED rosso per il sequenziamento delle basi A C Per garantire la corretta registrazione a ogni D a N codice 15036910 Rev A ITA ciclo deve essere letto almeno uno dei due nucleotidi per ogni canale cromatico importante conservare l equilibrio cromatico per ogni base dell indice letta sottoposta a sequenziamento altrimenti potrebbe verificarsi un problema di registrazione durante il sequenziamento della Lettura indici Per scegliere le combinazioni di primer indice per corse a 48 0 96 campioni vedere la Tabella 10 Tabella 10 Combinazioni
10. A Lavaggio con etanolo all 80 durante la fase di pulizia della PCR Preparare sempre al momento etanolo all 80 preparare sempre al momento etanolo all 80 per le fasi di lavaggio L etanolo pu assorbire l acqua dall aria e influire sui risultati Rimuovere tutto l etanolo dai pozzetti assicurarsi che tutto l etanolo venga rimosso dal fondo dei pozzetti in quanto pu contenere residui di contaminanti Utilizzare una pipetta multi canale P20 per rimuovere l etanolo residuo e accelerare l asciugatura Consentire l evaporazione completa consentire un tempo di asciugatura di almeno dieci minuti fuori dal supporto magnetico a temperatura ambiente per l evaporazione completa L etanolo residuo pu influire sulle prestazioni delle reazioni successive Requisiti di input di DNA Per il protocollo del Kit MiSeqDx Universal 1 0 Illumina sono necessari 250 ng di DNA genomico Illumina consiglia vivamente di quantificare il materiale genomico iniziale Quantificazione del DNA di input quantificare il materiale genomico iniziale mediante metodi spettrofotometrici UV basati su letture OD A260 A280 Valutazione della qualit del DNA per quantificare il DNA si utilizzano comunemente le misurazioni dell assorbanza a 260 nm Il rapporto fra l assorbanza a 260 nm e a 280 nm viene utilizzato come indicazione di purezza del campione Il protocollo ottimizzato per DNA con valori del rapporto di assorbanza maggiori di 1 5 Controlli qualit Le buone pr
11. C e 100 C Regolazione della temperatura 0 2 C 3 Centrifuga da tavolo necessaria una centrifuga da tavolo in grado ci mantenere la temperatura di 20 C Come specificato sopra nell area di post amplificazione necessaria un altra centrifuga Qualsiasi centrifuga per piastre che raggiunga le velocit previste dal protocollo da 280 a 2 400 x g accettabile 4 Pipette di precisione necessaria una serie di pipette di precisione Come specificato sopra nell area di post amplificazione necessario un altro set L utilizzo di pipette di precisione necessario per assicurare un erogazione accurata di reagente e campione possibile utilizzare sia pipette mono canale che multi canale se calibrate regolarmente e precise entro un margine del 5 del volume stabilito 5 Materiali di consumo sono necessari i seguenti materiali di consumo Piastre skirted per PCR a 96 pozzetti 0 2 ml polipropilene o equivalente NOTA assicurarsi che la piastra a 96 pozzetti sia compatibile con il supporto magnetico Piastre di conservazione a 96 pozzetti 0 8 ml piastre MIDI Bacinella per soluzione in PVC senza DNAasi RNAasi vaschetta Sigillo adesivo in alluminio Sigillo per piastre PCR appropriato Punte di pipette dotate di barriera aerosol Apparecchiatura e materiali per post amplificazione 1 Termociclatore necessario un termociclatore Il termociclatore deve essere dotato di un coperchio riscaldato e soddisfare le seguenti spec
12. Kit MiSegDx M Universal 1 0 Guida di riferimento PERUSO DIAGNOSTICO IN VITRO DI PROPRIET DI ILLUMINA N codice 15036910 Rev A ITA Febbraio 2014 Introduzione Informazioni preliminari Flusso di lavoro del protocollo Preparazione del foglio campioni per MiSeqDx Ibridazione del pool di oligonucleotidi Rimozione degli oligonucleotidi non legati Estensione ligazione degli oligonucleotidi legati Amplificazione mediante PCR Pulizia della PCR Normalizzazione della libreria Creazione di pool di librerie Le novit Assistenza tecnica 19 20 26 29 34 36 41 45 50 56 illumina Questo documento e il suo contenuto sono di propriet di Illumina Inc e delle aziende a essa affiliate Illumina e sono destinati esclusivamente a uso contrattuale da parte dei clienti di Illumina per quanto concerne l utilizzo dei prodotti qui descritti con esclusione di qualsiasi altro scopo Questo documento e il suo contenuto non possono essere usati o distribuiti per altri scopi e o in altro modo diffusi resi pubblici o riprodotti in alcun modo senza preventiva approvazione scritta da parte di Illumina Mediante questo documento Illumina non trasferisce alcuna licenza sui propri diritti su brevetti marchi di fabbrica copyright o diritti secondo il diritto consuetudinario n alcun diritto similare di alcun terzo AI fine di assicurare un uso sicuro e corretto dei prodotti qui descritti le istruzioni riportate in questo documento devono
13. SE tra 25 C e 15 C tra 25 C e 15 SE tra 25 C e 15 IG IZEULUIOJU qd IUO IE UILUI x Volume di PORTE I e Componente Quantit riempimento Ingredienti attivi Conservazione PCR polimerasi 1 DNA polimerasi proprietaria tra 25 C e 15 C Master Mix per 1 2 8 ml Soluzione acquosa tra 25 C e 15 PCR provetta tamponata contenente salie C dNTP Tabella 2 Scatola 1B Reagenti post amplificazione provetta Componente Quantit ita Ingredienti attivi Conservazione Diluente Soluzione acquosa tra 25 C e 15 normalizzazione provetta tamponata contenente sali C libreria 2 mercaptoetanolo e formammide Tampone di 1 Soluzione acquosa tra 25 C e 15 diluizione provetta tamponata C libreria Controllo 1 Soluzione acquosa tra 25 C e 15 interno PhiX provetta tamponata contenente DNA C genomico PhiX Kit MiSeqDx Universal Scatola 2 Tabella 3 Scatola 2 Reagenti post amplificazione Componente Quantit Indice Conservazione Cartuccia di 2 cartucce Cartuccia monouso che contiene i tra 25 C e 15 reagenti reagenti per la generazione dei cluster e il C MiSegDx sequenziamento da utilizzarsi con MiSeqDx compresi formammide 2 mercaptoetanolo e DMSO lt 2 8 N codice 15036910 Rev A ITA Kit MiSeqDx Universal Scatola 3 Tabella 4 Scatola 3A Reagenti pre amplificazione Componente Quantit Rice Ingredienti attivi Conservazione Tampone di 1 flacone Soluzione acqu
14. SE tra 25 C e 15 CE tra 25 C e 15 CE tra 15 C e 30 C tra 15 C e 30 SE tra 15 C e 30 SE tra 15 C e 30 LE Fornito da Illumina Illumina Illumina Illumina Utente Utente Utente Utente N codice 15036910 Rev A ITA Preparazione 1 Preparare 0 05 N di NaOH freschi aggiungendo 25 ul di 10 N di NaOH a 4975 ul di acqua sterile 2 Determinare i primer indice da utilizzare in base all immagine del grafico stampata da Worklist Manager Illumina 3 Rimuovere il Master Mix per PCR e i primer indice appropriati dal luogo di conservazione tra 25 C e 15 C quindi scongelarli sul banco a temperatura ambiente Per lo scongelamento dei reagenti attendere circa 20 minuti 4 Dopo chei primer indice sono completamente scongelati agitare ogni provetta per miscelare e centrifugare brevemente le provette in una microcentrifuga Utilizzare provette Eppendorf da 1 7 ml come adattatori per la microcentrifuga 5 Disporre i primer in un rack utilizzando le seguenti disposizioni a Disporre le provette con i primer Primer indice A A501 H A508 tappo bianco soluzione trasparente verticalmente allineate alle righe da A a H b Disporre le provette con i primer Primer indice 1 A701 12 A712 tappo arancione soluzione gialla orizzontalmente allineate alle colonne da 1 a 12 Guida di riferimento per il kit MiSeqDx Universal 1 0 37 YO Q1UCIP ALU SUOIZEIyI UN Figura 6 Fissaggio della pia
15. _ID L ID della piastra deve corrispondere all ID utilizzato per la piastra HYB 5 Pre lavare la membrana della piastra filtro come segue a Con una pipetta multicanale dispensare 45 ul di Tampone di lavaggio stringente in ciascun pozzetto b Coprire la piastra FPU con il coperchio della piastra filtro e tenerla coperta durante ogni fase di centrifugazione cCentrifugare l FPU a 2 400 x g a 20 C per 5 minuti NOTA Illumina consiglia vivamente di tenere a portata di mano piastre filtro di riserva FC 130 1006 nel materiale generale del laboratorio Guida di riferimento per il kit MiSeqDx Universal 1 0 31 eba uou posjpnuolIo 6p SUOIZOLUIY Procedura 1 Una volta completata l ibridazione confermare che il blocco termico si sia raffreddato a 40 C Mentre la piastra HYB si trova ancora nel blocco termico rinforzare i sigilli con un rullo di gomma o un cuneo sigillante Se non si raggiungono i 40 C in 80 minuti continuare a incubare fino al raffreddamento del blocco termico a 40 C Estrarre la piastra HYB dal blocco termico e centrifugare a 1 000 x g a 20 C per 1 minuto per raccogliere il condensato Con una pipetta multicanale impostata su 60 pl trasferire l intero volume di ciascun campione nel centro dei corrispondenti pozzetti precedentemente lavati della piastra filtro Cambiare le punte dopo ciascuna colonna onde evitare una contaminazione incrociata Coprire la piastra filtro con il coperchio e centrifugare a 2 400
16. a 8 campioni Primer indice 1 Primer indice 2 Primer indice 10 A701 A702 A710 Primer indice C Campione 1 Campione 2 Campione 3 A503 Primer indice D Campione 4 Campione 5 Campione 6 A504 Primer indice E Campione 7 Campione 8 A505 Guida di riferimento per il kit MiSeqDx Universal 1 0 D 3 IBO op suoizeredaJd Iluoidueo o xqb sSIN ed Sequenze dei primer indice Tabella 12 Sequenze per Primer indice A A501 H A508 Primer indice Primer indice A A501 Primer indice B A502 Primer indice C A503 Primer indice D A504 Primer indice E A505 Primer indice F A506 Primer indice G A507 Primer indice H A508 Sequenza TGAACCTT TGCTAAGT TGTTCTCT TAAGACAC CTAATCGA CTAGAACA TAAGTTCC TAGACCTA Tabella 13 Sequenze per Primer indice 1 A701 12 A712 Primer indice Primer indice 1 A701 Primer indice 2 A702 Primer indice 3 A703 Primer indice 4 A704 Primer indice 5 A705 Primer indice 6 A706 Primer indice 7 A707 Primer indice 8 A708 Primer indice 9 A709 24 Sequenza ATCACGAC ACAGTGGT CAGATCCA ACAAACGG ACCCAGCA AACCCCTIE CCCAACCT CATTATAC GAAACCCA N codice 15036910 Rev A ITA Primer indice Primer indice 10 A710 Primer indice 11 A711 Primer indice 12 A712 Guida di riferimento per il kit MiSeqDx Universal 1 0 Sequenza TGTGACCA AGGGICAA AGGAGTGG 20 xqb s 2q iuoidureo 0I601jep suoize eda Ibridazione del pool di oligonucleoti
17. a del processo Il processo del Kit MiSeqDx Universal 1 0 Illumina pu essere riassunto nei seguenti passaggi Creazione di un foglio campioni Innanzitutto preparare un foglio campioni da utilizzare su MiSeqDx per identificare ciascun campione e l indice corrispondente Per preparare il foglio campioni utilizzare Worklist Manager Illumina un applicazione basata su una procedura guidata che consente di registrare l ID dei campioni gli indici e altri parametri 4 N codice 15036910 Rev A ITA applicabili alla piastra a 96 pozzetti Il foglio campioni utilizzato anche come guida per impostare la piastra durante il flusso di lavoro del saggio Preparazione delle librerie Preparare le librerie utilizzando il protocollo dettagliato nella presente guida per l utente SUOIZNPOJMU Sequenziamento dei campioni su MiSeqDx Il Kit MiSeqDx Universal deve essere sequenziato su uno strumento MiSeqDx mediante una corsa paired end da 150 cicli Per istruzioni su come eseguire una corsa di sequenziamento su MiSeqDx vedere la Guida di consultazione per lo strumento MiSeqDx n codice 15038353 Sequenziamento automatico e analisi dei dati MiSeq Reporter elabora le individuazioni delle basi generate dal sistema di sequenziamento MiSeqDx Un software integrato sullo strumento e nei processi dello strumento Per ulteriori informazioni sul software vedere la Guida per l utente di MiSegq Reporter n codice 15038356 Strumenti per il monitor
18. aggio Illumina fornisce i seguenti strumenti per il monitoraggio e indicazioni sui campioni nel laboratorio possibile utilizzare il Modulo di monitoraggio del laboratorio per registrare dati come il nome dell operatore le informazioni sui campioni e gli indici gli orari di inizio e fine i numeri di lotto dei reagenti e i codici a barre Worklist Manager Illumina utilizzato per creare il foglio campioni mediante un applicazione basata su una procedura guidata Worklist Manager Illumina presenta una funzionalit atta a registrare i parametri per la piastra campioni come l ID campione gli indici doppi e altre caratteristiche applicabili alla corsa NOTA E possibile scaricare i documenti sul Kit MiSeqDx Universal 1 0 Ilumina descritti sopra dal sito Web Illumina all indirizzo http support illumina com Andare alla pagina di supporto del Kit MiSeqDx Universal 1 0 Illumina e fare clic sulla scheda Documentation amp Literature Documentazione e letteratura Guida di riferimento per il kit MiSeqDx Universal 1 0 D Documentazione possibile scaricare ulteriore documentazione come la Guida di consultazione per lo strumento MiSegDx n codice 15038353 dal sito Web Illumina Fare riferimento alla pagina interna della quarta di copertina di questa guida per maggiori informazioni 6 N codice 15036910 Rev A ITA Informazioni preliminari In questa sezione sono descritti il contenuto del Kit MiSegDx Universal 1 0 Illumina i materia
19. al filtro alla piastra AMP come segue a b Impostare una pipetta multicanale P20 su 20 pl Pipettare i campioni nella prima colonna della piastra filtro su e gi 5 6 volte Trasferire 20 ul dalla piastra filtro alla colonna corrispondente della piastra AMP Pipettare delicatamente su e gi 5 6 volte per miscelare accuratamente il DNA con la soluzione di lavoro per PCR NOTA Inclinare leggermente la piastra FPU per garantire la completa aspirazione ed evitare la formazione di bolle d aria Trasferire le colonne restanti dalla piastra filtro alla piastra AMP in modo simile Le punte devono essere sostituite dopo ogni colonna per evitare la contaminazione incrociata Dopo che tutti i campioni sono stati trasferiti la piastra MIDI di raccolta delle scorie della FPU pu essere smaltita Il colletto adattatore in metallo deve essere pulito e conservato per l uso futuro 7 Coprire la piastra AMP con l apposito sigillo e assicurarlo con un rullo di gomma 8 Centrifugare a 1000 x g a 20 C per 1 minuto 9 Trasferire la piastra AMP sull area di post amplificazione 10 Eseguire la PCR utilizzando il seguente programma su un termociclatore 40 95 C per 3 minuti 25 cicli di 95 C per 30 secondi 62 C per 30 secondi 72 C per 60 secondi 72 C per 5 minuti Mantenere a 10 C PUNTO DI ARRESTO SICURO Se non si procede immediatamente alla pulizia della PCR la piastra AMP l pu restare sul termociclatore per la notte op
20. arazione delle librerie mirate a determinate regioni di interesse genomico Il Kit MiSeqDx Universal previsto per uso con lo strumento MiSegDx SUOIZNPOJMU Informazioni sulla guida Nella presente guida di riferimento sono riportate istruzioni pi dettagliate suggerimenti sulle tecniche e cenni utili ai nuovi utenti formati per guidarli nell esecuzione corretta del protocollo del Kit MiSeqDx Universal La guida ha valore di integrazione e non intesa a sostituire l inserto della confezione Come funziona il kit Per ciascun amplicone previsto un paio di oligonucleotidi personalizzati L ibridazione di questi oligonucleotidi su DNA genomico avviene in una piastra a 96 pozzetti successivamente il processo di estensione e ligazione forma templati di DNA costituiti dalle regioni di interesse affiancate da sequenze di primer universali Mediante i primer indice forniti con il kit i templati di DNA vengono amplificati mediante PCR raggruppati in pool in una singola provetta e sequenziati sullo strumento MiSeqDx Guida di riferimento per il kit MiSeqDx Universal 1 0 3 Custom Custom Probe 1 Region of interest Probe 2 Custom Custom Probe 1 Probe 2 C P7 indexi Index 2 PS P7 Index1 Index2 P5 Ibridazione di sonde oligonucleotidiche personalizzate Estensione e ligazione Aggiunta di indici e adattatori di sequenziamento mediante PCR Amplicone finale pronto per il sequenziamento con MiSeqDx sons Panoramic
21. atiche di laboratorio dispongono che in ogni corsa siano inclusi un campione di DNA di controllo positivo e un campione di controllo negativo non templato Il campione di DNA di controllo positivo deve essere un campione ben caratterizzato con varianti note nella regione di interesse Guida di riferimento per il kit MiSeqDx Universal 1 0 q T NE UILUIDIO IUOIZELUIOJU Acronimi Tabella 9 Kit MiSeqDx Universal 1 0 Illumina Acronimi 18 Acronimo AMP CIR COP DAL FPU LNP NTC PAL POS SGP Definizione Piastra di amplificazione Piastra di pulizia Pool di oligonucleotidi personalizzati Libreria di ampliconi diluita Unit piastra filtro Piastra di ibridazione Piastra di normalizzazione della libreria Controllo con templato negativo Libreria di ampliconi raggruppati in pool Controllo positivo Piastra di conservazione N codice 15036910 Rev A ITA Flusso di lavoro del protocollo Il diagramma seguente illustra il flusso di lavoro del Kit MiSeqDx Universal 1 0 Illumina Fra i vari passaggi sono contrassegnati i punti di arresto sicuri Figura 1 Flusso di lavoro del Kit MiSeqDx Universal 1 0 Illumina Ibridazione del pool Pulizia PCR di oligonucleotidi Tenifo di bdarventa 20 mi Tempo di intervento 15 min Elaborazione 30 min incubazione 80 min Roagenti Reagenti Tampone di eluizione Pool di oligonucietotidi personalizzati eR Microsfere pulizia PCR Tampone di ibridazione EtOH Output Output Piastre
22. ato l ID alfanumerico del codice a barre della cartuccia di reagenti Software operativo MiSeq MOS trover automaticamente il foglio campioni L ID del codice a barre si trova sull etichetta della cartuccia di reagenti proprio sotto il codice a barre Se per il foglio campioni viene utilizzato un qualsiasi altro nome il pulsante Browse Sfoglia in Software operativo MiSeq MOS pu essere utilizzato per trovare il foglio campioni corretto 4 Opzionale Immettere una descrizione per identificare la corsa 5 Assicurarsi che la data corrisponda alla data di inizio della corsa La data attuale appare per impostazione predefinita D O N codice 15036910 Rev A ITA 6 Selezionare Next Avanti Viene visualizzata la schermata Enter Sample Parameters Immetti informazioni campioni Figura 3 Illumina Worklist Manager schermata Enter Sample Information Inserisci informazioni sui campioni Please Enter Sample Information Magda Omens isan Pe j Tutte se Pe Gae Sarla Sarota Nare Serge Sargia Saroe Serge Cisa Au w w sm Co e s A Inserimento di informazioni sui campioni 1 Nella scheda Table Tabella o nella scheda Plate Piastra inserire le seguenti informazioni per ogni pozzetto contenente campione a Sample ID ID campione inserire un ID campione univoco L ID campione viene usato per monitorare il campione dalla preparazione attraverso il sequenziamento fino all analisi Normalmente l ID un codice a
23. barre tuttavia sono accettabili tutti i valori b Index 1 e Index 2 Indice 1 e Indice 2 specificare l adattatore dell indice che verr utilizzato per ogni Lettura indici Ilumina consiglia di utilizzare le combinazioni che producono almeno una base A o C rosso e almeno una base G o T verde per ogni ciclo J NOTA Per informazioni su come scegliere gli indici appropriati vedere Rendimento dei campioni e rappresentazione dell indice a pagina 22 c Manifest Manifest specificare in nome del file manifest che contiene le informazioni relative ai campioni in quel determinato pozzetto Come parte del nome non includere l estensione del file Guida di riferimento per il kit MiSeqDx Universal 1 0 D q IBO op suoizeredald Iluoidueo o xqb sSIw ed 2 Opzionale Per registrare informazioni pi dettagliate sui campioni inserire il nome e la descrizione di un campione 3 Opzionale Per identificare i controlli sulla piastra selezionare Negative Negativo o Positive Positivo dal menu a discesa Control Controllo 4 Andare alla scheda Plate Graphic Schema piastra e utilizzare l opzione Copy to Clipboard Copia in appunti o Print Stampa per acquisire un immagine della piastra campioni Figura 4 Illumina Worklist Manager scheda Plate Graphic Schema piastra Ilumina Nossa VENE Please Enter Sample Information MSeqDx Universal Assay Pate Tab to PaE Ganhe indicates invalid samples UniversalAssay 1
24. di Durante questa fase il pool di oligonucleotidi forniti dall utente che contiene oligonucleotidi a monte e a valle specifici per la regione di interesse ibridizza su campioni di DNA genomico y y AVVERTENZA Questo set di reagenti contiene formammide una ammide alifatica che una probabile tossina riproduttiva L inalazione l ingestione il contatto con la pelle o con gli occhi possono causare lesioni personali Smaltire i contenitori e i contenuti non utilizzati in conformit alle norme locali di sicurezza vigenti Per ulteriori informazioni vedere le MSDS per questo kit all indirizzo http www illumina com msds Tempo stimato Durata totale 1 ora e 35 minuti Tempo di intervento dell operatore 15 minuti Materiali di consumo Apparecchio Quantit Conservazione Fornito da Tampone di ibridazione 1 provetta tra 15 C e 25 Illumina E Pool di oligonucleotidi 5 ul per pozzetto di Determinato Utente personalizzati campione dall utente DNA genomico quantit 5 ul tra 15 C e 25 Utente consigliata 50 ng ul e Piastra skirted per PCR a 96 1 piastra tra 15 C e 30 Utente pozzetti C Sigillo adesivo in alluminio 2 sigilli tra 15 C e 30 Utente C Vaschette sterili Come necessario malb Cem Utente C D 6 N codice 15036910 Rev A ITA Preparazione 1 Portare a temperatura ambiente il pool di oligonucleotidi personalizzati il Tampone di ibridazione i campioni di DNA genomici e il campione di cont
25. dio ipoclorito allo 0 5 candeggina al 10 contribuisce a tale risultato Identificare le aree di post amplificazione a maggior rischio di contaminazione e pulirle ogni giorno con una soluzione di sodio ipoclorito allo 0 5 candeggina al 10 Aree ad alto rischio comprendono in via esemplificativa i seguenti elementi termociclatori area del banco utilizzata per elaborare il DNA amplificato maniglie delle porte maniglie di frigoriferi congelatori mouse di computer tastiere q 4 N codice 15036910 Rev A ITA Pulizia settimanale di tutte le aree del laboratorio Una volta alla settimana eseguire una pulizia profonda delle aree di pre amplificazione e post amplificazione con sodio ipoclorito allo 0 5 candeggina al 10 Pulire i ripiani dei banchi e le superfici del laboratorio Pulire tutti gli strumenti che non vengono puliti ogni giorno Lavare a fondo i pavimenti del laboratorio Assicurarsi che il personale responsabile della pulizia settimanale sia adeguatamente preparato sulla prevenzione della contaminazione da PCR Oggetti caduti sul pavimento Il pavimento contaminato dai prodotti della PCR trasferiti sulle scarpe delle persone provenienti dall area di post amplificazione pertanto qualsiasi oggetto che cada sul pavimento deve essere trattato come contaminato Gli oggetti monouso caduti sul pavimento come provette vuote punte di pipette guanti appendiabiti devono essere smaltiti Gli oggetti non monouso cadut
26. engano inavvertitamente aspirate delle microsfere ridispensare queste ultime sulla piastra e lasciare riposare la piastra sul magnete per 2 minuti o controllare che il surnatante sia scomparso Sigillare la piastra SGP con un sigillo adesivo per piastre e quindi centrifugare a 1 000 x g a 20 C per 1 minuto PUNTO DI ARRESTO SICURO Qualora non si proceda immediatamente alla creazione di un pool di l librerie e al successivo sequenziamento su MiSeqDx conservare la piastra SGP sigillata tra 25 C e 15 C per un massimo di 3 giorni Guida di riferimento per il kit MiSeqDx Universal 1 0 4 Q eusqi eap SUOIZEZZI ELUION Creazione di pool di librerie Nella preparazione per la generazione e il sequenziamento dei cluster vengono combinati volumi uguali di librerie normalizzate diluite in un tampone di ibridazione e denaturate mediante calore prima di essere sottoposte a sequenziamento su MiSeqDx Il campione di controllo PhiX usato a fini di verifica interna per il sequenziamento Tempo stimato Durata totale 10 minuti Tempo di intervento dell operatore 10 minuti Materiali di consumo Apparecchio Quantit Conservazione Fornito da Tampone di diluizione 1 provetta tra 25 C e 15 Illumina libreria IC 10 nM Controllo interno 2 pl tra 25 C e 15 Illumina PhiX sE 0 1 N NaOH preparato al 1ml tra 15 C e 30 Utente momento C 1X tampone TE 8 ul malo Caw Utente T Provette Eppendorf sono 2 provette tra 15 C e
27. engano inavvertitamente aspirate delle microsfere ridispensare queste ultime sulla piastra e lasciare riposare la piastra per 2 minuti o fino a quando il surnatante scomparso 9 Rimuovere la piastra LNP dal supporto magnetico e lavare le microsfere con Lavaggio di normalizzazione della libreria come segue a Con una pipetta multicanale dispensare 45 ul di Lavaggio di normalizzazione della libreria in ciascun pozzetto contenente il campione Non necessario cambiare le punte quando si cambia colonna se si fa attenzione a evitare la contaminazione incrociata Sigillare la piastra LNP con un sigillo adesivo per piastre Agitare la piastra LNP su un agitatore per micropiastre a 1 800 rpm per 5 minuti Posizionare la piastra sul supporto magnetico per un minimo di 2 minuti o finch il surnatante limpido Rimuovere attentamente e smaltire il surnatante in un apposito contenitore per rifiuti pericolosi 10 Rimuovere la piastra LNP dal supporto magnetico e ripetere il lavaggio con Lavaggio di normalizzazione della libreria come segue a Con una pipetta multicanale dispensare 45 ul di Lavaggio di normalizzazione della libreria in ciascun pozzetto Non necessario cambiare le punte quando si cambia colonna se si fa attenzione a evitare la contaminazione incrociata Sigillare la piastra LNP con un sigillo adesivo per piastre Agitare la piastra LNP su un agitatore per micropiastre a 1 800 rpm per 5 minuti Posizionare la pia
28. ensata sulla piastra AMP La soluzione di lavoro per la PCR si mantiene stabile a temperatura ambiente per 10 minuti NOTA Aggiungere sempre la PCR polimerasi al Master Mix per PCR subito prima dell uso Non conservare mai la soluzione di lavoro per PCR combinata Procedura 1 Una volta completata la reazione di estensione ligazione di 45 minuti rimuovere l FPU dall incubatore Rimuovere il sigillo in alluminio e sostituirlo con il coperchio della piastra filtro Si raccomanda di rimuovere il sigillo in allumino prima della centrifugazione per garantire che il surnatante di reazione possa defluire efficacemente nella piastra delle scorie Centrifugare l FPU a 2400 x g a 20 C per 2 minuti Utilizzando una pipetta multicanale aggiungere 25 ul di 0 05 N di NaOH a ogni pozzetto di campione sulla piastra filtro Prestando attenzione che le punte della pipetta entrino in contatto con la membrana pipettare il NaOH su e gi 5 6 volte Le punte devono essere sostituite dopo ogni colonna Coprire e incubare la piastra filtro a temperatura ambiente per 5 minuti Durante l incubazione della piastra filtro utilizzare una pipetta multicanale per trasferire 22 ul della soluzione di lavoro per PCR in ogni pozzetto della piastra AMP contenente i primer indice Sostituire le punte quando si passa da un campione all altro Guida di riferimento per il kit MiSeqDx Universal 1 0 3 Q HOd Q1UeIP a Lu suozeoyduy 6 Trasferire i campioni eluiti d
29. ento della corsa di sequenziamento e analisi dei dati I prodotti per PCR puliti possono essere usati per scopi di ricerca ed eliminazione guasti in caso di problemi a carico dei campioni Se ci si ferma a questo punto sigillare la piastra LNP con un sigillo adesivo quindi centrifugare a 1 000 x g a 20 C per 1 minuto per garantire che tutto il surnatante si trovi in fondo al pozzetto PUNTO DI ARRESTO SICURO Dopo la pulizia della PCR la piastra stabile per circa 3 ore a una f temperatura compresa tra 2 C e 8 C 44 N codice 15036910 Rev A ITA Normalizzazione della libreria Questo processo consiste nel normalizzare la quantit di ciascuna libreria per garantire una rappresentazione pi equilibrata nel pool di campioni Tempo stimato Durata totale 1 ora e 20 minuti Tempo di intervento dell operatore 30 minuti Materiali di consumo Apparecchio Diluente normalizzazione libreria Microsfere libreria Lavaggio di normalizzazione della libreria Tampone di conservazione libreria 0 1 N NaOH preparato al momento Piastra skirted per PCR a 96 pozzetti Provetta conica da 15 ml Sigillo adesivo per piastre Quantit 1 provetta 1 provetta 2 provette 1 provetta 2 ml per 48 campioni 1 piastra 1 provetta Come necessario Guida di riferimento per il kit MiSeqDx Universal 1 0 Conservazione tra 25 C e 15 C tra2 Ce8 C tra2 Ce8 C tra 15 C e 30 TE tra 15 C e 3
30. essarie per ridurre il rischio di contaminazione da PCR Separare fisicamente le zone di pre amplificazione e post amplificazione Separare fisicamente gli spazi del laboratorio dove si eseguono i processi di pre amplificazione estrazione quantificazione e normalizzazione del DNA dagli spazi in cui si eseguono i processi di post amplificazione Non utilizzare mai lo stesso lavandino per lavare le vaschette utilizzate per la pre amplificazione e la post amplificazione Non utilizzare mai lo stesso sistema di purificazione dell acqua per i processi di pre amplificazione e post amplificazione Conservare tutti i materiali usati per i protocolli nella zona pre amplificazione e portarli nella zona post amplificazione secondo necessit Utilizzare apparecchiature e materiali dedicati Dedicare set completi separati di apparecchiature e materiali pipette centrifughe forno blocco termico ecc ai processi di pre amplificazione e post amplificazione e impedirne la condivisione tra le due zone Dedicare aree di conservazione separate congelatori e frigoriferi ai materiali di consumo pre amplificazione e post amplificazione Dato che i reagenti per la pre amplificazione e la post amplificazione vengono consegnati insieme importante disimballarli nella zona di pre amplificazione e quindi spostare i reagenti per la post amplificazione nell apposita area di conservazione Procedure di pre amplificazione e post amplificazione Per impedire la con
31. essere scrupolosamente ed esplicitamente seguite da personale qualificato e adeguatamente addestrato Leggere e comprendere a fondo tutto il contenuto di questo documento prima di usare tali prodotti LA LETTURA INCOMPLETA DEL CONTENUTO DEL PRESENTE DOCUMENTO E IL MANCATO RISPETTO DI TUTTE LE ISTRUZIONI IVI CONTENUTE PU CAUSARE DANNI AL PRODOTTO LESIONI PERSONALI A UTENTI E TERZI E DANNI MATERIALI ILLUMINA NON SI ASSUME ALCUNA RESPONSABILIT DERIVANTE DALL USO IMPROPRIO DEI PRODOTTI QUI DESCRITTI COMPONENTI E SOFTWARE INCLUSI O DA QUALSIASI USO DI TALI PRODOTTI NON ESPLICITAMENTE CONTEMPLATO NELLE LICENZE SCRITTE O NELLE AUTORIZZAZIONI CONCESSE DA ILLUMINA IN OCCASIONE DELL ACQUISIZIONE DEI PRODOTTI STESSI DA PARTE DEL CLIENTE PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO 2012 2014 Illumina Inc Tutti i diritti riservati Illumina e MiSeqDx sono marchi o marchi registrati di Illumina Inc Tutti gli altri marchi e denominazioni qui citati sono di propriet dei rispettivi titolari AMPure Beckman e Beckman Coulter sono marchi di fabbrica o marchi registrati di Beckman Coulter Inc Introduzione Uso previsto Il Kit MiSeqDx Universal 1 0 Illumina un set di reagenti e materiali di consumo usato nell elaborazione dei campioni di DNA genomico umano ottenuto da sangue intero periferico e nel successivo sequenziamento target delle librerie campioni ottenute I reagenti specifici per l analita forniti dall utente sono richiesti per la prep
32. etta per microcentrifuga in modo da ottenere una libreria del Controllo interno PhiX da 1 nM Libreria del Controllo interno PhiX da 2 nM 10 pl 0 1 N NaOH 10 pl Guida di riferimento per il kit MiSeqDx Universal 1 0 5D LA P 00d Ip SUOIZESII 3 Inserire brevemente in un agitatore per miscelare la soluzione della libreria del Controllo interno PhiX da 1 nM 4 Centrifugare la soluzione del templato a 280 x g a 20 C per 1 minuto 5 Incubare per 4 5 minuti a temperatura ambiente per denaturare la libreria del Controllo interno PhiX in filamenti singoli 6 Aggiungere il seguente volume di Tampone di diluizione libreria pre raffreddato nella provetta contenente la libreria del Controllo interno PhiX denaturata per ottenere una libreria del Controllo interno PhiX da 20 pM Libreria del Controllo interno PhiX denaturata 20 pl Tampone di diluizione libreria pre raffreddato 980 ul NOTA La libreria del Controllo interno PhiX da 20 pM denaturata pu essere conservata fino a tre settimane tra 25 C e 15 C in aliquote singole Dopo tre settimane il numero di cluster tende a diminuire Preparazione della cartuccia di reagenti Le istruzioni che seguono descrivono come scongelare la cartuccia di reagenti utilizzando un bagnomaria a temperatura ambiente Il metodo richiede circa un ora 1 Rimuovere la cartuccia di reagenti dal luogo di conservazione con temperatura tra 25 C e 15 C 2 Collocarela cartuccia di reagenti in
33. gitare fino a sospensione completa immediatamente prima dell uso agitare le microsfere finch raggiungono la completa sospensione e il colore appare omogeneo Miscelare a fondo i campioni dopo aver aggiunto le microsfere ai campioni miscelare a fondo pipettando su e gi dieci volte Illumina consiglia anche di utilizzare un agitatore per miscelare a fondo i campioni Consentire un legame massimo per ottenere i risultati migliori incubare le miscele di microsfere campioni a temperatura ambiente per tutta la durata indicata sul protocollo Aspirare lentamente la soluzione trasparente dopo aver posizionato la piastra sul supporto magnetico attendere finch la soluzione diventa trasparente prima di procedere Tenere la piastra sul supporto magnetico durante l aspirazione lenta della soluzione trasparente facendo attenzione a non toccare le microsfere separate Evitare la contaminazione crociata Sostituire le punte fra l erogazione dei reagenti e dei campioni utilizzare sempre punte di pipette nuove fra l erogazione dei reagenti e quella dei campioni Miscelare le piastre seguendo le indicazioni miscelare i campioni con una pipetta multi canale e centrifugare la piastra quando indicato Non agitare le piastre Utilizzare punte dotate di barriera aerosol l utilizzo di punte di pipette dotate di barriera aerosol riduce il rischio di contaminazione crociata da carry over di ampliconi o da campione a campione q 6 N codice 15036910 Rev A IT
34. i sul pavimento come una pipetta o un contenitore di campioni importante devono essere puliti immediatamente e a fondo con soluzione di sodio ipoclorito allo 0 5 candeggina al 10 per rimuovere la contaminazione da PCR Pulire qualsiasi superficie del laboratorio entrata in contatto con l oggetto contaminato Le persone che manipolano qualsiasi oggetto caduto sul pavimento monouso o non devono smaltire i propri guanti da laboratorio e indossarne un paio nuovo Precauzioni Durante la preparazione delle librerie per il sequenziamento mediante il presente protocollo attenersi alle raccomandazioni seguenti Garantire la coerenza Utilizzare pipette multi canali per garantire la coerenza fra i campioni ove possibile utilizzare una pipetta multi canali Calibrare le pipette periodicamente Coerenza per preparazioni di campioni pi piccoli ciascuna provetta di reagente fornita con il kit contiene un volume sufficiente a produrre risultati Guida di riferimento per il kit MiSeqDx Universal 1 0 I lo IZEULUIOJU qd IUO IE UILLI usando pipette manuali e vaschette di reagenti seguendo le tecniche standard di laboratorio Per garantire la precisione dei volumi dei reagenti pipettare singolarmente i reagenti in ciascun pozzetto o pipettare da una striscia a 8 provette per PCR Manipolazione delle microsfere magnetiche Utilizzo a temperatura ambiente prima dell uso lasciare che le microsfere raggiungano la temperatura ambiente A
35. ificazione necessario un altro set L utilizzo di pipette di precisione necessario per assicurare un erogazione accurata di reagente e campione possibile utilizzare sia pipette mono canale che multi canale se calibrate regolarmente e precise entro un margine del 5 del volume stabilito Materiali di consumo sono necessari i seguenti materiali di consumo Piastre skirted per PCR a 96 pozzetti 0 2 ml polipropilene o equivalente NOTA assicurarsi che la piastra a 96 pozzetti sia compatibile con il supporto magnetico Piastre di conservazione a 96 pozzetti 0 8 ml piastre MIDI Provette coniche 15 ml Provette per microcentrifuga Eppendorf sono consigliate quelle con tappo a vite Striscia a otto provette per PCR Bacinella per soluzione in PVC senza DN Aasi RNAasi vaschetta Sigillo adesivo in alluminio Sigillo adesivo per piastre q D N codice 15036910 Rev A ITA Punte di pipette dotate di barriera aerosol Impedire la contaminazione da PCR La PCR comunemente utilizzata in laboratorio per amplificare sequenze specifiche di DNA Se non si adottano misure igieniche adeguate nel laboratorio i prodotti della PCR possono contaminare i reagenti gli strumenti e i campioni di DNA genomico portando a risultati inesatti e inaffidabili La contaminazione da PCR pu interrompere i processi del laboratorio e ritardare sensibilmente il normale svolgimento del lavoro Accertarsi che il laboratorio abbia attuato le misure nec
36. ifiche di prestazione Intervallo di controllo della temperatura tra 4 C e 99 C Accuratezza del controllo 0 25 C da 35 C a 99 C Guida di riferimento per il kit MiSeqDx Universal 1 0 q q NE UILUIDIO IUOIZELUIOJU Agitatore per micropiastre nell area adibita al laboratorio post amplificazione necessario un agitatore di micropiastre L agitatore di piastre deve soddisfare le seguenti specifiche di prestazione Velocit massima di miscelazione 3 000 rpm giri min Intervallo di velocit di miscelazione 200 3 000 rpm giri min Centrifuga da tavolo necessaria una centrifuga da tavolo in grado ci mantenere la temperatura di 20 C come specificato sopra nell area di pre amplificazione necessaria un altra centrifuga Qualsiasi centrifuga per piastre che raggiunga le velocit previste dal protocollo da 280 a 2400 x g accettabile Blocco termico necessario un blocco termico per le provette Il blocco termico deve soddisfare le seguenti specifiche di prestazione Intervallo di temperatura ambiente 5 C 99 C Regolazione della temperatura 0 1 C a 37 C 0 4 C a 60 C Supporto magnetico necessario un supporto magnetico per una piastra a 96 pozzetti Le prestazioni migliori si osservano quando i magneti si trovano sul lato del supporto e non nella parte inferiore Pipette di precisione necessaria una serie di pipette di precisione come specificato sopra nell area di pre ampl
37. inazione incrociata Sigillare la piastra con un sigillo adesivo per piastre Agitare la piastra CLP su un agitatore per micropiastre a 1 800 rpm per 2 minuti NOTA Assicurarsi che tutti i campioni siano completamente risospesi Se vi sono campioni in cui le microsfere non sono completamente risospese pipettare delicatamente su e gi per risospenderle e ripetere i due passaggi precedenti Incubare a temperatura ambiente da 15 C a 30 C per 2 minuti Posizionare la piastra CLP sul supporto magnetico per un minimo di 2 minuti o finch il surnatante limpido Guida di riferimento per il kit MiSeqDx Universal 1 0 4 3 dOd FIISP ezinda 21 22 23 24 Etichettare la nuova piastra MIDI LNP_Plate_ID Piastra di normalizzazione della libreria Utilizzando una pipetta multicanale P20 e punte fini trasferire delicatamente 20 ul di surnatante dalla piastra CLP alla piastra LNP Cambiare le punte tra i campioni onde evitare una contaminazione incrociata 4 NOTA Qualora nelle punte vengano inavvertitamente aspirate delle microsfere ridispensare queste ultime sulla piastra e lasciare riposare la piastra sul magnete per 2 minuti o controllare che il surnatante sia scomparso Opzionale Trasferire i restanti 10 ul di surnatante dalla piastra CLP a una nuova piastra ed etichettare la piastra con il nome della corsa e la data Conservare questa piastra a una temperatura compresa tra 25 C e 15 C fino al completam
38. le Riporre la cartuccia in ghiaccio o conservarla a una temperatura compresa tra 2 C e 8 C fino a 6 ore finch non si pronti a impostare la corsa Per risultati ottimali procedere direttamente caricando il campione e impostando la corsa Preparazione dei campioni per il sequenziamento 1 Portare il Tampone di diluizione libreria a temperatura ambiente Agitare il Tampone di diluizione libreria energicamente e assicurarsi che tutti i precipitati si siano completamente sciolti Se la piastra SGP stata conservata congelata scongelarla fino a raggiungere la temperatura ambiente Centrifugare la piastra SGP a 1000 x g a 20 C per 1 minuto per raccogliere il condensato Guida di riferimento per il kit MiSeqDx Universal 1 0 D 9 gi IP OOd IP SUOIZESIO OIUDI 10 11 12 13 Etichettare una provetta Eppendorf nuova con PAL_Plate_ID Pooled Amplicon Library libreria di ampliconi raggruppati in pool Determinare i campioni da raggruppare in pool per il sequenziamento Per il sequenziamento possibile utilizzare al massimo 48 campioni contemporaneamente Se la piastra SGP stata conservata congelata utilizzare una pipetta multi canale P200 impostata su 40 ul per mescolare ciascuna libreria da sequenziare pipettando su e gi per 3 5 volte Sostituire le punte quando si passa da un campione all altro Trasferire 5 ul di ciascuna libreria da sequenziare dalla piastra SGP colonna per colonna a una striscia
39. li di consumo e le apparecchiature utilizzate le raccomandazioni per il DNA input e le migliori pratiche da adottare durante il protocollo Kit MiSeqDx Universal Indice Il Kit MiSeqDx Universal 1 0 Illumina contiene i componenti elencati nella Tabella 1 e nella Tabella 8 Conservare i componenti del kit alla temperatura indicata e in aree designate per la pre amplificazione e la post amplificazione Dato che i reagenti per la pre amplificazione e la post amplificazione vengono consegnati insieme importante disimballare i reagenti nell area di pre amplificazione e quindi spostare i reagenti per la post amplificazione nell apposita area di conservazione Kit MiSeqDx Universal Scatola 1 Tabella 1 Scatola 1A Reagenti pre amplificazione Componente Tampone di ibridazione Miscela di estensione ligazione Primer indice A A501 H A508 Primer indice 1 A701 12 A712 spa Volume di Quantit riempimento 1 4 32 ml provetta 1 4 8 ml provetta 1 192 ul provetta per primer 1 128 ul provetta per primer Guida di riferimento per il kit MiSeqDx Universal 1 0 Ingredienti attivi Soluzione acquosa tamponata contenente sali e formammide Soluzione acquosa tamponata contenente una miscela proprietaria di DNA polimerasi DNA ligasi e dNTP Primer per PCR con sequenze indice e adattatori di sequenziamento Primer per PCR con sequenze indice e adattatori di sequenziamento Conservazione tra 25 C e 15
40. luire sui risultati Procedura 1 10 11 12 Centrifugare la piastra AMP a 1 000 x g a 20 C per 1 minuto per raccogliere il condensato Etichettare la nuova piastra MIDI CLP_Plate_ID Piastra di pulizia Capovolgere 10 volte le Microsfere per la pulizia della PCR Agitare energicamente e quindi capovolgere ancora 10 volte Controllare visivamente la soluzione per assicurarsi che le microsfere siano ben risospese Utilizzando una pipetta multicanale aggiungere 45 ul di Microsfere per la pulizia della PCR a ogni pozzetto di campione della piastra CLP Utilizzando una pipetta multicanale impostata su 60 pl trasferire il prodotto per PCR dalla piastra AMP alla piastra CLP Sostituire le punte quando si passa da un campione all altro Sigillare la piastra CLP con un sigillo adesivo per piastre Agitare la piastra CLP su un agitatore per micropiastre a 1 800 rpm per 2 minuti Incubare a temperatura ambiente da 15 C a 30 C senza agitare per 10 minuti Posizionare la piastra su un supporto magnetico per un minimo di 2 minuti o finch il surnatante scomparso Con la piastra CLP sul supporto magnetico e una pipetta multicanale impostata su 100 pl rimuovere attentamente e smaltire il surnatante Sostituire le punte quando si passa da un campione all altro NOTA Qualora nelle punte vengano inavvertitamente aspirate delle microsfere ridispensare queste ultime sulla piastra e lasciare riposare la piastra sul mag
41. nete per 2 minuti o controllare che il surnatante sia scomparso Con la piastra CLP sul supporto magnetico lavare le microsfere con etanolo all 80 appena preparato come segue 4 2 N codice 15036910 Rev A ITA 13 14 15 16 17 18 19 20 a Con una pipetta multicanale dispensare 200 pl di etanolo all 80 appena preparato in ciascun pozzetto contenente il campione Non necessario sostituire le punte se si fa attenzione a evitare la contaminazione incrociata In questa fase non occorre risospendere le microsfere b Incubare la piastra sul supporto magnetico per un minimo di 30 secondi o finch il surnatante limpido c Rimuovere attentamente e smaltire il surnatante Con la piastra CLP sul supporto magnetico eseguire un secondo lavaggio come segue a Con una pipetta multicanale dispensare 200 pl di etanolo all 80 appena preparato in ciascun pozzetto contenente il campione b Incubare la piastra sul supporto magnetico per un minimo di 30 secondi o finch il surnatante limpido c Rimuovere attentamente e smaltire il surnatante Utilizzare una pipetta multicanale P20 impostata su 20 ul per rimuovere l eccesso di etanolo Rimuovere la piastra CLP dal supporto magnetico e asciugare all aria le microsfere per 10 minuti Con una pipetta multicanale dispensare 30 ul di Tampone di eluizione in ciascun campione e agitare brevemente Non necessario sostituire le punte se si fa attenzione a evitare la contam
42. nte E necessario conservare il Diluente normalizzazione libreria e il Microsfere libreria residuo separatamente alle temperature rispettivamente raccomandate Per conservare la stabilit le microsfere di Microsfere libreria non devono mai essere congelate o miscelate con Diluente normalizzazione libreria qualora non vengano utilizzate immediatamente Utilizzando una pipetta multicanale dispensare 45 ul della soluzione di lavoro di Diluente normalizzazione libreria Microsfere libreria combinata in ogni pozzetto della piastra LNP contenente le librerie Non necessario cambiare le punte quando si cambia colonna se si fa attenzione a evitare la contaminazione incrociata Sigillare la piastra LNP con un sigillo adesivo per piastre Agitare la piastra LNP su un agitatore per micropiastre a 1 800 rpm per 30 minuti NOTA Questa incubazione di 30 minuti fondamentale per una corretta normalizzazione della libreria Le incubazioni con una durata superiore o inferiore ai 30 minuti possono influenzare la rappresentazione della libreria e la densit dei cluster Posizionare la piastra su un supporto magnetico per un minimo di 2 minuti o finch il surnatante scomparso Con la piastra LNP sul supporto magnetico utilizzando una pipetta multicanale impostata su 80 ul rimuovere attentamente e smaltire il surnatante in un apposito contenitore per rifiuti pericolosi 4 IEUJON IZEZZ di elp SUO EuSkI NOTA Qualora nelle punte v
43. nti Illumina Area geografica Numero di contatto Area geografica Nord America 1 800 809 4566 Italia Austria 0800 296575 Paesi Bassi Belgio 0800 81102 Norvegia Danimarca 80882346 Spagna Finlandia 0800 918363 Svezia Francia 0800 911850 Svizzera Germania 0800 180 8994 Regno Unito Irlanda 1 800 812949 Altri paesi Schede di sicurezza sui materiali MSDS Numero di contatto 800 874909 0800 0223859 800 16836 900 812168 020790181 0800 563118 0800 917 0041 44 1799 534000 Contattare l Assistenza tecnica Illumina per le schede di sicurezza SDS Documentazione dei prodotti La documentazione dei prodotti in formato PDF pu essere scaricata dal sito Web Illumina Andare al sito www illumina com support e selezionare un prodotto quindi fare clic su Documentation amp Literature Documentazione e letteratura Guida di riferimento per il kit MiSeqDx Universal 1 0 EIUS EZUE SISSY Illumina Emergo Europe San Diego Califomia 92122 U S A Molenstraat 15 1 800 809 ILMN 4566 2513 BH L Aia 1 858 202 4566 fuori dal Nord America Paesi Bassi techsupport illumina com www ilumina com
44. ntrolli positivi e negativi corrispondano nello schema della piastra Guida di riferimento per il kit MiSeqDx Universal 1 0 z T Ip osjnuos ijo Ip jood jep suozepua Utilizzando una pipetta multicanale aggiungere 5 ul del pool di oligonucleotidi personalizzati a tutti i pozzetti contenenti il DNA genomico Cambiare le punte dopo ciascuna colonna onde evitare una contaminazione incrociata Utilizzando una pipetta multicanale aggiungere 40 ul di Tampone di ibridazione a ogni campione nella piastra HYB Pipettare delicatamente su e gi 3 5 volte per miscelare Cambiare le punte dopo ciascuna colonna onde evitare una contaminazione incrociata NOTA Controllare che eventuali cristalli o precipitato in Tampone di ibridazione si siano sciolti NOTA Non mescolare il pool di oligonucleotidi personalizzati e il Tampone di ibridazione per la conservazione Quando combinati il pool di oligonudeotidi personalizzati diventa instabile anche se conservato congelato Sigillare la piastra HYB con un foglio di alluminio adesivo e assicurare la chiusura con un rullo di gomma o un cuneo sigillante Centrifugare a 1 000 x g a 20 C per 1 minuto Inserire la piastra HYB nel blocco preriscaldato a 95 C e incubare per 1 minuto Ridurre la temperatura del blocco termico preriscaldato a 40 C e proseguire l incubazione fino a quando il blocco di calore raggiunge i 40 C Il tempo di rampa di circa 80 minuti NOTA k Durante l incubazione
45. o Durata totale 20 minuti Tempo di intervento dell operatore 20 minuti Materiali di consumo Apparecchio Quantit Conservazione Fornito da Miscela di estensione 1 provetta tra 25 C e 15 Illumina ligazione C Tampone di lavaggio 1 flacone ima 2 Cere Illumina stringente Tampone di lavaggio 1 provetta tra2 Ce8 C Illumina universale Piastra filtro 1 piastra tra 15 C e 30 Illumina KE Colletto adattatore 1 piastra tra 15 C e 30 Illumina C Guida di riferimento per il kit MiSeqDx Universal 1 0 D Q ebs uou iposjpnuolIo 6p SUOIZOLUIY Apparecchio Quantit Conservazione Fornito da Piastra MIDI 1 piastra tra 15 C e 30 Utente AE Vaschette Come necessario tra 15 C e 30 Utente C Preparazione 1 Prelevare Miscela di estensione ligazione dalla temperatura di conservazione compresa tra 25 C e 15 C e scongelare a temperatura ambiente Miscela di estensione ligazione viene utilizzato nella fase di estensione ligazione e impiega circa 20 minuti per scongelarsi 2 Estrarre Tampone di lavaggio stringente e Tampone di lavaggio universale dalla temperatura di conservazione compresa tra 2 C e 8 C e tenerli da parte a temperatura ambiente 3 Assemblare l unit piastra filtro FPU nell ordine seguente dall alto verso il basso 3 O N codice 15036910 Rev A ITA Figura 5 Unit piastra filtro A Coperchio B Piastra filtro C Colletto adattatore D Piastra MIDI 4 Etichettare la piastra filtro FPU_Plate
46. one incrociata 9 Coprire la piastra filtro con il coperchio e centrifugare a 2 400 x g a 20 C per 10 minuti J NOTA Accertarsi che tutto il liquido sia defluito dopo la centrifugazione Ripetere la centrifugazione se necessario I residui di tampone di lavaggio potrebbero inibire le successive reazioni enzimatiche Guida di riferimento per il kit MiSeqDx Universal 1 0 3 3 nebe uouipnosponuofio 6p SUOIZOLUIY Estensione ligazione degli oligonucleotidi legati Questo processo collega gli oligonucleotidi ibridati a monte e a valle Una DNA polimerasi si estende dall oligonucleotide a monte fino alla regione target e successivamente si lega all estremit 5 dell oligonucleotide a valle mediante una DNA ligasi Il risultato consiste nella formazione di prodotti contenenti le regioni di interesse target affiancate da sequenze necessarie per l amplificazione Tempo stimato Durata totale 50 minuti Tempo di intervento dell operatore 5 minuti Materiali di consumo Apparecchio Quantit Conservazione Fornito da Miscela di estensione 1 provetta tra 25 C e 15 Illumina ligazione C Sigillo adesivo in alluminio 1 sigillo ma IoC eM Utente E Vaschette Come necessario tra 15 C e 30 Utente 2C Procedura 1 Utilizzando una pipetta multicanale aggiungere 45 ul di Miscela di estensione ligazione a ogni pozzetto di campione della piastra filtro La reazione di estensione ligazione si verifica sulla membrana della piastra filtro Non
47. osa tamponata tra 2 C e 8 C lavaggio contenente sali 2 stringente mercaptoetanolo e formammide Tampone di 1 Soluzione acquosa tamponata tra 2 C e 8 C lavaggio provetta contenente sali universale Tabella 5 Scatola 3B Reagenti post amplificazione Volume di riempimento Microsfere per la 1 provetta Soluzione acquosa tra2 Ce8 C pulizia della PCR tamponata contenente microsfere paramagnetiche in fase solida e polietilene glicole Lavaggio di 2 provette 4 8 ml Soluzione acquosa tra 2 C e 8 C normalizzazione tamponata contenente sali della libreria 2 mercaptoetanolo e formammide Microsfere 1 provetta 1 2 ml Soluzione acquosa tra 2 C e 8 C libreria tamponata contenente microsfere paramagnetiche in fase solida Cella a flusso 2 1 cella a Substrato di vetro con tra 2 C e 8 C MiSeqDx contenitori flusso oligonucleotidi legati covalentemente Kit MiSeqDx Universal Scatola 4 Componente Quantit Ingredienti attivi Conservazione Tabella 6 Scatola 4 Reagenti post amplificazione Componente Quantit Volume di Ingredienti attivi Conservazione riempimento Soluzione SBS 2 flaconi 353 1 ml Soluzione acquosa tamponata tra 2 C e 8 C MiSeqDx PR2 Guida di riferimento per il kit MiSeqDx Universal 1 0 9 IZeuJO U qd IUO ING UILUI Kit MiSeqDx Universal Scatola 5 Tabella 7 Scatola 5 Reagenti pre amplificazione Componente Quantit a Ingredienti attivi Conservazione Piastra filt
48. primer indice per corse di sequenziamento a 48 campioni o 96 campioni Righe A H Primer indice A A501 Primer indice B A502 Primer indice C A503 Colonne 1 6 Primer indice 1 A701 Primer indice 2 A702 Primer indice 3 A703 Colonne 7 12 Primer indice 6 A706 Primer indice 7 A707 Primer indice 8 A708 Primer indice 4 A704 0 Primer indice D A504 Primer indice 9 A709 Primer indice E A505 Primer indice 5 A705 Primer indice 11 A711 Primer indice F A506 Primer indice 10 A710 Primer indice 12 A712 Primer indice G A507 Primer indice H A508 Se si sequenziano meno di 48 campioni in una corsa di sequenziamento selezionare gli indici appropriati in base alle relative sequenze per conservare il bilanciamento cromatico nei canali verde e rosso Vedere la Tabella 12 e la Tabella 13 Come requisito minimo le corse con 8 o 48 campioni devono includere una combinazione di primer di indicizzazione identificata nella Tabella 11 Per elaborare in maniera accurata corse pi piccole devono essere presenti almeno otto campioni Se non sono disponibili sei campioni univoci esclusi i controlli positivi e negativi accettabile completare la corsa con replicati o qualsiasi campione di DNA genomico umano Per il set minimo di indici bilanciati per colore da usare nelle corse di sequenziamento a 8 campioni vedere la Tabella 11 Tabella 11 Combinazioni primer indice per corse di sequenziamento
49. pure pu essere conservata a una temperatura compresa tra 2 C e 8 C per massimo 48 ore N codice 15036910 Rev A ITA Pulizia della PCR Questo processo consiste nel purificare i prodotti della PCR dagli altri componenti della reazione mediante le Microsfere per la pulizia della PCR Tempo stimato Durata totale 50 minuti Tempo di intervento dell operatore 20 minuti Materiali di consumo Apparecchio Quantit Tampone di eluizione 1 provetta Microsfere per la pulizia 400 ul per 8 della PCR campioni Etanolo all 80 preparato al 5 ml per 8 campioni momento Piastre MIDI a 96 pozzetti 2 Sigillo adesivo per piastre Come necessario Vaschette Come necessario Preparazione NOTA Conservazione tra 15 C e 30 C tra2 Ce8 C tra 15 C e 30 C tra 15 C e 30 SE tra 15 C e 30 SE tra 15 C e 30 LE Fornito da Illumina Illumina Utente Utente Utente Utente Rileggere la sezione Precauzioni all inizio del presente protocollo relativamente alla gestione delle microsfere magnetiche e al lavaggio con etanolo all 80 durante la pulizia della PCR 1 Portare le Microsfere per la pulizia della PCR a temperatura ambiente 2 Preparare etanolo all 80 fresco dall etanolo assoluto Guida di riferimento per il kit MiSeqDx Universal 1 0 41 dOd FIISP ezinda NOTA Preparare sempre al momento l etanolo all 80 per le fasi di lavaggio L etanolo pu assorbire l acqua dall aria e inf
50. ro 2 piastre N D Piastra di microtitolazione in tra 15 C e 30 polipropilene con una IC membrana di polietersulfone modificata Tabella 8 Scatola 5 Reagenti post amplificazione Volume di Componente Quantit riempimento Ingredienti attivi Conservazione Tampone di 1 4 8 ml Soluzione acquosa tamponata tra 15 C e 30 eluizione provetta C Tampone di 1 3 5 ml Soluzione acquosa tamponata tra 15 C e 30 conservazione provetta E libreria Apparecchiatura e materiali Apparecchiatura e materiali di consumo forniti venduti separatamente 1 Strumento MiSeqDx n catalogo DX 410 1001 2 Kit TruSeq Index Plate Fixture n di catalogo FC 130 1005 3 Kit TruSeq Index Plate Fixture amp Collar n di catalogo FC 130 1007 4 Tappi sostitutivi per adattatore indice n di catalogo DX 502 1003 Apparecchiatura e materiali richiesti non forniti Apparecchiatura e materiali per pre amplificazione 1 Blocco termico necessario un blocco termico per una piastra a 96 pozzetti Il blocco termico deve soddisfare le seguenti specifiche di prestazione Sono q O N codice 15036910 Rev A ITA accettabili i blocchi termici con coperchi riscaldati Intervallo di temperatura ambiente 5 C 99 C Regolazione della temperatura 0 1 C a 37 C 0 4 C a 60 C 2 Incubatore di campioni necessario un incubatore forno per ibridazione L incubatore deve soddisfare le seguenti specifiche di prestazione Intervallo di temperatura tra 10
51. rollo positivo 2 Inserire in un agitatore il pool di oligonucleotidi personalizzati e il Tampone di ibridazione e agitare vigorosamente per assicurarsi che tutti i precipitati si siano completamente disciolti quindi centrifugare brevemente le provette per raccogliere il liquido NOTA Prima di utilizzare il Tampone di ibridazione porre la provetta davanti a una luce ed eseguire un controllo visivo per assicurarsi che tutti i precipitati si siano completamente sciolti 3 Impostare un blocco termico per piastra a 96 pozzetti su 95 C 4 Preriscaldare un incubatore a 37 C per prepararsi alla fase di estensione ligazione 5 Creare la piastra campioni in base all immagine stampata da IEM Controllare la corrispondenza della posizione dei controlli positivi e negativi Ilumina consiglia di analizzare i campioni in lotti non inferiori a otto NOTA L uso dei controlli consente all Assistenza tecnica Illumina di garantire un assistenza efficace nella risoluzione dei problemi L Assistenza tecnica Illumina non fornisce assistenza salvo queste reazioni di controllo fossero incluse nella corsa Procedura 1 Etichettare una nuova piastra PCR a 96 pozzetti HYB_Plate_ID 2 Aggiungere 5 ul di campione o controllo a 50 ng ul 250 ng totali ai pozzetti appropriati nella piastra HYB Seguire il layout della piastra generato per la corretta selezione dei pozzetti 4 NOTA Verificare che il layout dei campioni di DNA e le posizioni dei co
52. stra indice A Primer indice A A501 H A508 tappi bianchi B Primer indice 1 A701 12 A712 tappi arancioni C Piastra AMP 6 Etichettare una nuova piastra per PCR a 96 pozzetti AMP piastra di amplificazione 7 Aggiungere i primer indice alla piastra AMP come segue a Utilizzando una pipetta multicanale dispensare 4 ul dei primer indice selezionati A A501 H A508 soluzione trasparente nel pozzetto appropriato in una colonna della piastra AMP La sostituzione delle punte tra le colonne non necessaria b Per evitare la contaminazione incrociata smaltire i tappi bianchi originali e applicare tappi bianchi nuovi c Utilizzando una pipetta multicanale dispensare 4 ul dei primer indice selezionati 1 A701 12 A712 soluzione gialla nella riga appropriata della piastra AMP Le punte devono essere sostituite dopo ogni riga per evitare la contaminazione incrociata 3 8 N codice 15036910 Rev A ITA d Per evitare la contaminazione incrociata smaltire i tappi arancioni originali e applicare tappi arancioni nuovi Rimuovere tutte le provette di primer indice dall area di lavoro Preparare una soluzione di lavoro per la PCR Master Mix per PCR PCR polimerasi nel modo seguente a Per 96 campioni aggiungere 56 ul di PCR polimerasi a 2 8 ml di Master Mix per PCR b Capovolgere 20 volte la soluzione di lavoro per la PCR preparata per miscelarla Nella prossima sezione questa soluzione di lavoro verr disp
53. stra sul supporto magnetico per un minimo di 2 minuti Rimuovere attentamente e smaltire il surnatante in un apposito contenitore per rifiuti pericolosi 11 Utilizzare una pipetta multicanale P20 impostata su 20 ul per rimuovere l eccesso di Lavaggio di normalizzazione della libreria 12 Rimuovere la piastra LNP dal supporto magnetico e dispensare 30 pl di 0 1 N di NaOH in ogni pozzetto per eluire il campione 13 Sigillare la piastra LNP con un sigillo adesivo per piastre 48 N codice 15036910 Rev A ITA 14 15 16 17 18 19 20 Agitare la piastra LNP su un agitatore per micropiastre a 1 800 rpm per 5 minuti Durante l eluizione di 5 minuti etichettare una nuova piastra per PCR con 96 pozzetti SGP_Plate_ID Piastra StoraGe Dispensare 30 ul di Tampone di conservazione libreria a ciascun pozzetto da usare nella piastra SGP Dopo l eluizione di 5 minuti assicurarsi che tutti i campioni nella piastra LNP siano completamente risospesi Se i campioni non sono completamente risospesi pipettare delicatamente i campioni su e gi oppure battere delicatamente la piastra sul banco per risospendere le microsfere quindi agitare per altri 5 minuti Posizionare la piastra LNP sul supporto magnetico per un minimo di 2 minuti Utilizzando una pipetta multicanale impostata su 30 pl trasferire il surnatante dalla piastra LNP alla piastra SGP Pipettare delicatamente su e gi 5 volte per miscelare NOTA Qualora nelle punte v
54. taminazione da PCR importante adottare procedure di laboratorio e attenersi alle pratiche migliori Illumina consiglia di pulire ogni giorno e Guida di riferimento per il kit MiSeqDx Universal 1 0 3 IZEULUIOJU qd IUO IE UILLI ogni settimana le aree del laboratorio con sodio ipoclorito allo 0 5 candeggina al 10 x y ATTENZIONE Onde evitare la degradazione del campione o del reagente accertarsi che tutti i vapori della soluzione detergente si siano dissipati completamente prima di iniziare qualsiasi processo Pulizia quotidiana dell area di pre amplificazione Una pulizia quotidiana dell area di pre amplificazione con sodio ipoclorito allo 0 5 candeggina al 10 contribuisce a eliminare i prodotti della PCR entrati nell area di pre amplificazione Identificare le aree di pre amplificazione a maggior rischio di contaminazione e pulirle con una soluzione di sodio ipoclorito allo 0 5 candeggina al 10 prima di iniziare qualsiasi processo di pre amplificazione Aree ad alto rischio comprendono in via esemplificativa i seguenti elementi ripiani dei banchi maniglie delle porte maniglie di frigoriferi congelatori mouse di computer tastiere Pulizia quotidiana dell area di post amplificazione Ridurre la quantit di prodotti della PCR nell area di post amplificazione contribuisce a ridurre il rischio di contaminazione nell area di pre amplificazione La pulizia quotidiana dell area di post amplificazione mediante so
55. tra 20 C e 25 C in base al bisogno 4 Agitare Microsfere libreria energicamente per 1 minuto con inversione intermittente fino a risospensione delle microsfere e assenza di pellet sul fondo della provetta quando quest ultima viene capovolta Procedura 1 Per 96 campioni dispensare 4 4 ml di Diluente normalizzazione libreria in una provetta conica fresca da 15 ml Se si stanno analizzando meno di 24 campioni utilizzare una provetta nuova da 1 5 ml 2 Utilizzare una pipetta P1000 impostata su 1 000 ul per risospendere completamente le Microsfere libreria pipettando su e gi 10 volte Pal 6 N codice 15036910 Rev A ITA Guida di riferimento per il kit MiSeqDx Universal 1 0 NOTA 5 fondamentale risospendere completamente il pellet di microsfere della libreria in fondo alla provetta L uso di una provetta P1000 garantisce che le microsfere vengano risospese in modo omogeneo e che non ci sia massa di microsfere sul fondo della provetta Questo fondamentale per ottenere una densit dei cluster omogenea sulla cella a flusso 3 Per 96 campioni pipettare 800 ul di Microsfere libreria nella provetta contenente Diluente normalizzazione libreria Miscelare bene capovolgendo la provetta 15 20 volte NOTA Per risospendere le microsfere completamente nella fase 2 necessaria una provetta P1000 impostata su 1 000 ul Miscelare solo le quantit specificate di Diluente normalizzazione libreria e Microsfere libreria per il test corre
56. ugare la provetta DAL a 1000 x g a 20 C per 1 minuto per raccogliere il contenuto 15 Incubare la provetta DAL in un blocco termico a 96 C per 2 minuti 16 Dopo l incubazione capovolgere la provetta DAL 1 2 volte per mescolarla quindi porla immediatamente in un bagno di acqua e ghiaccio 17 Tenere la provetta DAL nel bagno di acqua e ghiaccio per 5 minuti i NOTA necessario eseguire la fase di denaturazione mediante calore immediatamente prima di caricare la DAL nella cartuccia di reagente del MiSeqDx per assicurare che il templato sia caricato in modo efficace sulla cella a flusso del MiSeqDx Guida di riferimento per il kit MiSeqDx Universal 1 0 D H LA IP 00d IP SUOIZESII Le novit Una volta raggruppate in pool le librerie di ampliconi con il PhiX diluito e denaturato le librerie sono pronte per essere caricate sulla Cartuccia di reagenti MiSeqDx nell apposito serbatoio etichettato con Load Samples Carica campioni La corsa di sequenziamento viene quindi impostata mediante l interfaccia Software operativo MiSeq MOS Vedere la Guida di consultazione per lo strumento MiSegDx n codice 15038353 per istruzioni al riguardo HD 6 N codice 15036910 Rev A ITA Assistenza tecnica Per assistenza tecnica contattare l Assistenza tecnica Illumina Tabella 14 Dati di contatto generali Illumina Sito Web Illumina www illumina com E mail techsupport illumina com Tabella 15 Numeri di telefono Assistenza clie
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