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HiSeq 1000 User Guide

1. 66 sha az ES Q DAA Y Eo ARE DAY M 3 E A AM 033 e a Tal els S N ES A di _ Y vba Sn y i q yl rie fl ima A t a ES lt e nora gt PAST cono lt k Pa nel 0 E af Ze ci or sr pal 9 lt td ant Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 2 D gZ oJoydepo Software HiSeq Introduzione Sul computer dello strumento sono installate tre applicazioni software HiSeq Control Software l interfaccia del software di controllo HiSeq HCS guida l utente lungo l intera procedura per specificare i parametri della corsa e caricare la cella a flusso e i reagenti prima di avviare la corsa Mentre la corsa procede HCS fornisce un riassunto delle statistiche sulla qualit rilevate durante lo svolgimento della corsa Real Time Analysis il software integrato per l analisi primaria RTA Real Time Analysis esegue l identificazione delle basi e assegna un punteggio qualitativo a ciascuna base per ciascun ciclo Per maggiori informazioni vedere Panoramica dell Analisi in tempo reale RTA a pagina 128 Sequencing Analysis Viewer il Visualizzatore analisi di sequenziamento SAV fornisce statistiche dettagliate sulla qualit e metriche aggiornate mentre la corsa procede Per maggiori informazioni vedere Visualizzatore analisi di sequenziamento SAV a pagina 131 Novit in HCS v2 0 26 HCS v2 0 introduce le seguenti caratteristiche Nuovo flusso di lavoro per la sostituzione delle guarnizioni Mi
2. Collocare il tappo a imbuto sul nuovo flacone di ICB e caricare il flacone nella posizione 1 assicurandosi che l estremit conica del flacone sia posizionata nella tacca alla base del rack Far scorrere il rack reagenti nello scomparto allineando il rack con la guida sulla parte inferiore dello scomparto N codice 15023355 Rev K ITA 7 Abbassare i pescanti nei flaconi di reagente di sequenziamento come segue a b Cc d Tirare la maniglia verso di s Abbassare la maniglia mentre la si tira verso di s Ispezionare visivamente i pescanti per assicurarsi che non si pieghino mentre si abbassano nei tappi a imbuto Rilasciare la maniglia nell alloggiamento nella parte inferiore della scanalatura Si dovrebbe sentire che la maniglia stata posizionata correttamente nell alloggiamento 8 Chiudere lo sportello dello scomparto dei reagenti e poi selezionare Next Avanti per riprendere la corsa Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 7 7 3 z enya e led nuabeal oJuauwe9LIeo q q A N codice 15023355 Rev KITA Procedure post corsa INTFOAUZIONE loo conoces Depor LIS LIGA II Ol le Age lobi a een iiaa 116 Rimozione e pesatura dei reagenti 00001001 aaora inro rd nnn nr nnn 117 Esecuzione di un lavaggio di manutenzione dello strumento 118 Esecuzione di un lavaggio con acqua iii iii iii iii 122 Porre lo strumento nello stato inattivo idling 0 124 S
3. NOTA Per visualizzare i risultati di indicizzazione nel Visualizzatore analisi di sequenziamento SAV essenziale che all inizio della corsa l utente carichi un foglio campioni Per riportare correttamente le informazioni di indicizzazione SAV v1 8 richiede un foglio campioni Per maggiori informazioni vedere la Guida per l utente del Visualizzatore analisi di sequenziamento n codice 15020619 Nel campo Sample Sheet Foglio campioni inserire il percorso di un foglio campioni valido per la corsa Quando la corsa inizia il software copia il foglio campioni nella cartella della corsa A meno che non si stia utilizzando BaseSpace un foglio campioni facoltativo Per le corse indicizzate il foglio campioni richiesto se si desidera che gli indici siano riportati in SAV se si sta utilizzando BaseSpace richiesto un foglio campioni Per maggiori informazioni sui fogli campioni vedere Panoramica sul foglio campioni a pagina 64 FRI 19 Schermata Sample Sheet Foglio campioni per una cella a flusso High Output Output elevato Please select a sample sheet if you want indexes to be reported Sample Sheet Se alla corsa associato un foglio campioni nel Visualizzatore analisi di sequenziamento SAV v1 8 4 o successiva si possono visualizzare le informazioni specifiche sugli indici Per ulteriori informazioni vedere la Guida per l utente del Visualizzatore analisi di sequenziamento n codice 15020619 Schermata Re
4. basi Ip usuodw 09 suorzeImbyuoo Descrizione generale 10 Significato Questa etichetta assicura che il prodotto conforme agli standard di sicurezza e che stato testato e certificato da un organizzazione di terzi Questa etichetta assicura che il prodotto conforme alle direttive RAEE relative ai rifiuti Per lo smaltimento restituire lo strumento a Illumina N codice 15023355 Rev K ITA Panoramica sequenziamento a singola indicizzazione Il sequenziamento a singola indicizzazione include una Lettura Indici dopo la Lettura 1 Figura 5 Sequenziamento a singola indicizzazione Lettura 1 Lettura Indice i7 Lettura 2 Primer Primer Lettura 2 y Lettura 1 Y HP7 o HP11 i HP60HP10 i Inserto DNA Primer Seq Indice i7 V HP8 o HP12 Indice i7 Lettura 1 La Lettura 1 segue il protocollo standard di sequenziamento Lettura 1 utilizzando reagenti forniti nel kit TruSeq SBS Il primer di sequenziamento Lettura 1 viene appaiato annealing al filamento stampo durante il processo di generazione dei cluster su cBot Nel caso di sequenziamento di librerie Nextera a doppia indicizzazione si deve obbligatoriamente utilizzare il primer di sequenziamento fornito nella confezione TruSeq Dual Index Sequencing Primer Box HP10 che utilizzato su cBot al posto di HP6 Per maggiori informazioni vedere la Guida per l utente di cBot n codice 15006165_ITA Nel caso di sequenziamento di librerie TruSeq LT v2 a singola ind
5. 1 Lettura 1 at cycle al ciclo 23 Sulla schermata Resume Ripresa si dovrebbero vedere queste impostazioni Resume At Riprendi a Read 1 Lettura n 1 N codice 15023355 Rev K ITA Start At Cycle Inizia al ciclo 23 Figura 31 Esempio di ripresa al ciclo 23 Resume At Read 1 Start At Cycle 23 Per una lettura da 101 cicli c un ciclo di FirstBase Prima base seguito da 100 cicli di CompleteCycle Al ciclo 23 si nei 100 cicli di CompleteCycle Dovrebbe essere scelto automaticamente Image 100 cycles w CompleteCycle Imaging 100 cicli con CompleteCycle Figura 32 Esempi di comandi Imaging Image 1 cycles w FirstBase Image 100 cycles w CompleteCycle Chemistry End Dato che in questo esempio la corsa era stata arrestata durante una fase di imaging dovrebbe essere scelto automaticamente Imaging no chemistry Imaging nessuna chimica Figura 33 Esempi di comandi Chimica Imaging no MM Chemistry Deblock Chemistry Buffer Wash Chemistry Incorporation Imaging no chemistry Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 5 9 esJO9 eun Ip DIAAEII 015911 Sospensione pausing di una corsa Dalla schermata Run Overview Panoramica corsa si pu sospendere la corsa possibile che l utente desideri eventualmente sospendere la corsa per verificarne i componenti ad esempio i volumi dei reagenti prima di procedere con la corsa Secondo le normali procedure l utente
6. Preparazione HP8 1 Capovolgere la provetta di HP8 cinque volte per miscelare il reagente 2 Centrifugare brevemente per raccogliere le gocce 3 Etichettare la provetta di HP8 come Reagente n 17 4 Riporre a temperatura ambiente Preparazione HP12 Per il sequenziamento di librerie a doppia indicizzazione e obbligatorio l utilizzo di HP12 1 Capovolgere la provetta di HP12 cinque volte per miscelare il reagente 2 Centrifugare brevemente per raccogliere le gocce 3 Etichettare la provetta di HP12 come Reagente n 17 4 Riporre a temperatura ambiente Preparazione HP9 Per corse a doppia indicizzazione su una cella a flusso unidirezionale single read obbligatorio l utilizzo di HP9 1 Capovolgere la provetta di HP9 cinque volte per miscelare il reagente 2 Centrifugare brevemente per raccogliere le gocce 3 Etichettare la provetta di HP9 come Reagente n 16 4 Riporre a temperatura ambiente Preparazione RMR Preparazione RMR per corse a doppia indicizzazione su una cella a flusso bidirezionale 1 Capovolgere la provetta di RMR cinque volte per miscelare il reagente 2 Etichettare la provetta di RMR come Reagente n 10 82 N codice 15023355 Rev KITA 3 Centrifugare brevemente il reagente a 1 000 rpm giri min per un massimo di un minuto In alternativa battere o scuotere delicatamente la provetta verificando che le gocce di reagente si raccolgano sul fondo J NOTA Non utilizzare il vortex per miscelare l RMR 4 Ri
7. lt 109 Unidirezionale lt 101 8 8 lt 117 doppia indicizzazione Bidirezionale lt 101 lt 101 lt 202 non indicizzata Bidirezionale lt 101 7 lt 101 lt 209 singola indicizzazione g lt 210 Bidirezionale lt 101 8 748 lt 101 lt 225 doppia indicizzazione Numero di cicli per librerie a singola indicizzazione Numero di cicli per librerie a doppia indicizzazione La Lettura Indice 2 di una corsa bidirezionale a doppia indicizzazione include sette cicli addizionali di sola chimica 6 8 N codice 15023355 Rev K ITA Per maggiori informazioni vedere Panoramica sequenziamento a singola indicizzazione a pagina 11 e Panoramica sequenziamento a doppia indicizzazione a pagina 13 Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 6 9 po4 ul SUOIZN Flusso di lavoro del sequenziamento Output elevato Preparare i reagenti SBS Questo include lo scongelamento e il e A A capovolgimento di tutti i reagenti pa Per le corse indicizzate PEZ Preparare i reagenti di indicizzazione Accertarsi di preparare i primer di a sequenziamento appropriati per la libreria e per il tipo di corsa to Output elevato Utilizzando il Software di controllo HiSeq HCS inserire i parametri della corsa Quando il sistema lo chiede caricare i reagenti SBS per la Lettura 1 e per la Lettura 2 salvo l ICB consigliato Per le corse indicizzate Caricare i reagenti di indicizzazione Per le corse a doppia
8. DesignStudio Eco GAIIx Genetic Energy Genome Analyzer GenomeStudio GoldenGate HiScan HiSeq Infinium iSelect MiSeq Nextera NuPCR SeqMonitor Solexa TruSeq TruSight VeraCode la tonalit di arancione e la grafica Genetic Energy del fluire delle basi sono marchi o marchi registrati di Illumina Inc Tutti gli altri marchi e nomi qui contenuti sono di propriet dei rispettivi titolari Questo software contiene la libreria SegAn concessa in licenza a Illumina e distribuita conformemente alle condizioni della seguente licenza Copyright 2010 Knut Reinert FU Berlin Tutti i diritti riservati Sono consentiti la ridistribuzione e l uso nei formati sorgente e binario con o senza modifiche purch siano rispettate le condizioni di seguito riportate 1 La ridistribuzione del codice sorgente deve contenere le informazioni sul copyright riportate sopra il presente elenco di condizioni e le limitazioni di responsabilit riportate di seguito 2 La ridistribuzione in formato binario deve contenere le informazioni sul copyright riportate sopra il presente elenco di condizioni e le limitazioni di responsabilit riportate di seguito nella documentazione e o in altro materiale fornito con la distribuzione 3 I nomi FU Berlin e Knut Reinert non devono essere utilizzati per appoggiare o promuovere prodotti derivati da questo software senza previa ed esplicita autorizzazione scritta QUESTO SOFTWARE VIENE FORNITO DAI TITOLARI DEI DIRITTI
9. HT2 Kit TruSeq PE Cluster Indexing Reagents Box HP8 o HP12 Kit TruSeq PE Cluster Indexing Reagents Box TruSeq Dual Index Sequencing Primer Box HP9 TruSeq Dual Index Sequencing Primer Box RMR Kit TruSeq PE Cluster PE Reagents Box lo NOTA HP8 fornito nel kit TruSeq Cluster non compatibile con le librerie Nextera a doppia indicizzazione E obbligatorio utilizzare l HP12 contenuto nella confezione TruSeq Dual Index Sequencing Primer Box NOTA I primer di sequenziamento forniti nella confezione TruSeq Dual Index Sequencing Primer Box sono compatibili con le librerie non indicizzate e con le librerie a singola indicizzazione Se la cella a flusso in uso contiene una combinazione di librerie non indicizzate a singola indicizzazione e a doppia indicizzazione utilizzare i primer di sequenziamento della confezione TruSeq Dual Index Sequencing Primer Box Scongelamento dei reagenti per l indicizzazione 1 Rimuovere i reagenti dal luogo di conservazione a una temperatura tra 15 C e 25 C Verificare che si stiano utilizzando i primer di sequenziamento appropriati per il tipo di libreria e il tipo di corsa Scongelare i reagenti in un becher riempito con acqua deionizzata a temperatura ambiente per circa 20 minuti o fino al completo scongelamento Preparazione HT2 30 1 2 3 4 Capovolgere la provetta di HT2 cinque volte per miscelare il reagente Etichettare la provetta di HT2 come Reagente n 19 Centrifugare il re
10. N codice 15023355 Rev KITA Assistenza tecnica Per assistenza tecnica contattare l Assistenza tecnica Illumina Tabella 10 Dati di contatto generali Illumina Sito Web Illumina www illumina com Email techsupport illumina com Tabella 11 Numeri di telefono Assistenza clienti Illumina Area geografica Numero di contatto Area geografica Numero di contatto Nord America 1 800 809 4566 Italia 800 874909 Austria 0800 296575 Paesi Bassi 0800 0223859 Belgio 0800 81102 Norvegia 800 16836 Danimarca 80882346 Spagna 900 812168 Finlandia 0800 918363 Svezia 020790181 Francia 0800 911850 Svizzera 0800 563118 Germania 0800 180 8994 Regno Unito 0800 917 0041 Irlanda 1 800 812949 Altri paesi 44 1799 534000 MSDS Le schede di sicurezza sui materiali MSDS sono disponibili sul sito Web Illumina all indirizzo http www illumina com msds Documentazione dei prodotti possibile scaricare ulteriore documentazione relativa ai prodotti in formato PDF dal sito Web Illumina Andare all indirizzo www illumina com support e selezionare un prodotto necessario un login MyTllumina Per registrarsi per un account Mylllumina andare all indirizzo my illumina com Account Register Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 q A 9 291499 EZUA SISSY N codice 15023355 Rev K ITA ACGAAAAGAATGATAACAGTAACACACTTCTGTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTA AATGATAACAG
11. Priming dei reagenti Allentare e rimuovere gli otto tubi di scarico per la cella a flusso appropriata dal contenitore degli scarti Assicurarsi di non includere gli otto tubi per la cella a flusso opposta o i tubi della pompa di condensazione o delle pompe di priming paired end Figura 40 Tubi di scarico per un HiSeq 1000 A Tubi di scarico della cella a flusso per le posizioni 1 8 B Tubo della pompa di condensazione non rimuovere C Tubo della pompa del priming paired end non rimuovere 1 Collocare ogni tubo di scarico in una provetta vuota da 15 ml un tubo per provetta Gli scarti del priming vengono raccolti e misurati dopo la fase di priming 2 Selezionare Next Avanti Si apre la schermata di priming e la fase di priming si avvia automaticamente E possibile monitorare l avanzamento della fase di priming dall apposita schermata N codice 15023355 Rev K ITA 3 Al completamento della fase di priming misurare gli scarti di priming raccolti e confermare che il volume sia 2 ml da ciascuna posizione dei reagenti per il priming ossia un totale di 14 ml Registrare i risultati sul modulo di monitoraggio del laboratorio 4 NOTA Il colore dei rifiuti di priming pu apparire marrone normale Il cambiamento nel colore dei rifiuti non indica tossicit e non ha effetto sulle prestazioni 4 Riposizionare i tubi di scarico nel contenitore degli scarti prima di procedere 5 Selezionare Next Avanti Si pronti per caricare la
12. che potr continuare solo dopo un intervento dell utente 3 2 N codice 15023355 Rev K ITA Quando si verifica un cambiamento nelle condizioni operative l icona cambia per mostrare l immagine associata e lampeggia per avvertire l utente In tal caso selezionare l icona per aprire la finestra di stato contenente una descrizione generale della condizione segnalata Selezionare Acknowledge Accetta per confermare di aver letto il messaggio e Close Chiudi per chiudere la finestra di dialogo possibile filtrare il tipo di messaggi che appaiono nella finestra di stato selezionando le icone situate lungo il margine superiore della finestra Selezionare un icona per mostrare nascondere la condizione associata NOTA Per maggiori informazioni su problemi noti relativi a errori e avvertenze vedere le note di rilascio per la versione del software di controllo dello strumento che si sta utilizzando Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 3 3 b3SIH 0 01 U09 IP SIEMYLOS JSP e199eJ1a u Schermate configurazione corsa Quando si seleziona Sequence New Run Sequenzia Nuova corsa dalla schermata Welcome Benvenuto il software apre le schermate di impostazione corsa che guidano l utente attraverso le fasi di impostazione della corsa iniziando con le schermate sulla scheda Run Configuration Configurazione corsa Ciascuna schermata di configurazione della corsa contiene elenchi a tendina caselle di controllo o campi di testo
13. della garanzia qui prevista f Articoli di terzi e garanzia Illumina non ha alcun obbligo di garanzia in relazione a qualsiasi articolo proveniente da terzi e fornito all acquirente ai sensi della presente Sono articoli di terzi quelli riportanti marchio o etichetta con il nome di un terzo L eventuale garanzia per gli articoli di terzi fornita dal produttore originale Previa richiesta scritta Illumina tenter di passare eventuali garanzie di tale tipo all acquirente Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 V 9 Indennizzo a Indennizzo per violazione di diritti di terzi da parte di Illumina In conformita ai presenti termini e condizioni comprese a titolo esemplificato ma non esaustivo le esclusioni agli obblighi di indennizzo di Illumina sezione 9 b di seguito e le condizioni degli obblighi di indennizzo sezione 9 d di seguito Illumina sar tenuto i a difendere manlevare e tenere l acquirente indenne da ogni pretesa o azione di terzi basata sulla presunta violazione di diritti di propriet intellettuale validi e applicabili di terzi da parte di questo prodotto quando utilizzato a scopi di ricerca in conformit con i presenti termini e condizioni e in conformit con la documentazione e le specifiche relative e ii a sostenere i costi di qualsivoglia transazione sentenza definitiva e spesa comprese le ragionevoli spese legali che l acquirente debba sostenere in relazione a tale pretesa violazione Qualora questo prodot
14. informazioni vedere File principali di output del sequenziamento a pagina 136 file cif AnalysisFolder Data Ogni file cif binario contiene i risultati Intensities LOOX CX X dell analisi delle immagini eseguita dal software RTA per un ciclo e una tile Questi file devono essere utilizzati nel software di analisi OLB se si desidera eseguire la identificazione delle basi BUSTARD per una descrizione vedere la Guida per l utente del Software offline Basecaller file clocs locs AnalysisFolder Data Intensities L00 Questi file contengono la posizione x y per ogni cluster Il file clocs una versione compressa del file locs file filter AnalysisFolder Data I file filter contengono i risultati di Intensities Basecalls filtraggio per tile Questi file sono utilizzati da CASAVA v1 8 2 o successiva File jpg AnalysisFolder CS in grado di generare immagini in Thumbnail_Images miniatura di nove zone provenienti da LOOX CX X ciascuna tile Le miniature sono generate per ciascun ciclo e base e sono utilizzabili per la risoluzione di eventuali problemi della corsa Per maggiori informazioni vedere Immagini in miniatura thumbnail a pagina 137 file stats AnalysisFolder Data I file stats contengono le statistiche di Intensities Basecalls identificazione delle basi eseguita dal LOOX CX X software RTA per un dato ciclo e una data tile Questi file sono utilizzati da CASAVA v1 8 2 o successiva Guida per l
15. ottenere una finestra di dialogo di conferma della prima base che fornisce l opzione di interrompere il ciclo a questo punto o di continuare Se si seleziona questa opzione occorre confermare i risultati prima che la corsa possa continuare Se non si seleziona la casella di controllo il report prima base generato nel solito modo e la corsa continua senza mostrare la finestra di dialogo per la conferma del report prima base Durante la corsa in qualsiasi momento si pu accedere al report prima base dalla cartella della corsa Per maggiori informazioni vedere Conferma report della prima base a pagina 54 Control Lane Corsia di controllo se applicabile dall elenco a tendina selezionare la corsia sulla cella a flusso che contiene la libreria di controllo Altrimenti selezionare None Nessuna Align to PhiX Allineamento con PhiX permette il report in tempo reale delle percentuali di errore per le corsie del controllo PhiX o per le corsie con aggiunta di PhiX Come impostazione predefinita tutte le corsie sono selezionate per l allineamento in tempo reale da parte di RTA Deselezionare la casella di controllo per le corsie che Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 3 9 esJO9 SUOIZEINBIJUOO ayjeueyos Software HiSeq non abbiano PhiX aggiunto al campione in modo tale che RTA non allinei e non calcoli dei tassi di errore per quella corsia causando percentuali di errore arbitrariamente elevati Per maggiori informazioni vedere Utili
16. 116 lavaggio di manutenzione 116 118 lavaggio strumento 116 122 librerie a doppia indicizzazione 15 primer per 19 20 librerie Nextera 16 librerie TruSeq HT 16 lunghezza lettura 41 M materiali di consumo compatibilit delle versioni 21 forniti dall utente 22 kit di sequenziamento Illumina 17 materiali di consumo forniti dall utente 22 materiali di consumo sequenziamento 17 modulo ottica 4 monitoraggio 104 campioni immagini 104 fluidica corsa 104 intensit dei cluster 104 mostrare file di registro 28 N numerazione delle tile 135 P pagina analisi 131 pagina di analisi 55 131 pagina di stato 104 porre lo strumento nello stato inattivo idling 124 posizioni dei reagenti bidirezionali 111 indicizzazione 90 preparazione dei campioni it per doppia indicizzazione 16 primer di sequenziamento 20 priming preparazione 96 volume degli scarti 96 punteggi qualitativi generazione 130 R reagenti idirezionali 111 caricamento 90 111 117 caricamento ICB 112 caricamento SBS 88 compatibilit delle versioni 21 priming 96 registrazione ID kit 43 schermata Reagents Reagenti 43 sequenziamento 117 tappi a imbuto 19 reibridizzazione primer 143 report contenuti cartelle corse 62 inclusione prima base 39 62 105 requisiti primer 20 N codice 15023355 Rev KITA revisione schermata impostazione corsa 84 ripresa della corsa 30 risoluzione dei problemi 141 risultati analisi 136 risultati base calli
17. 2 sullo strumento tuttavia sono necessari dei reagenti addizionali Rivolgersi all Assistenza tecnica Illumina per valutare meglio se sia appropriata una re ibridazione Lettura 2 Per maggiori informazioni visitare la pagina di supporto HiSeq sul sito Web Illumina e fare clic su Troubleshooting Risoluzione dei problemi necessario un login Mylllumina Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 q A 3 z e1n1197 Jauid SuoIzepIIq ep auolzijadiy Risoluzione dei problemi Se BaseSpace non disponibile Se BaseSpace non disponibile aprire Servizi di Windows e assicurarsi che Illumina BaseSpace Broker sia avviato in caso contrario riavviarlo Se i servizi sono in esecuzione ma non ancora possibile accedere a BaseSpace contattare l assistenza tecnica Illumina q A A N codice 15023355 Rev KITA Indice A Analisi in tempo reale pagina di analisi 55 131 Analisi in tempo reale RTA 26 cartella dell analisi 132 con corsa arrestata 56 pagina di stato 131 risultati dell analisi 133 statistiche durata 130 trasferimento dati 128 archiviazione BaseSpace 35 arresto di una corsa 56 arresto normale 56 assistenza clienti 149 assistenza tecnica 149 B bidirezionali reagenti 106 C caricamento dei reagenti 88 117 caricamento reagenti 111 cartella dell analisi 132 cartella ricette 62 cartelle corse 62 cella a flusso caricamento 91 98 compatibilit delle versioni 21 ID cella a flusso 38 84 leva 93 101 puli
18. D AUTORE E DAI LORO COLLABORATORI NELLO STATO IN CUI SI TROVA SENZA ALCUNA GARANZIA ESPRESSA O IMPLICITA INCLUSE IN VIA ESEMPLIFICATIVA LE GARANZIE DI COMMERCIABILIT O IDONEIT A UNO SCOPO SPECIFICO IN NESSUN CASO I TITOLARI DEI DIRITTI D AUTORE E I LORO COLLABORATORI POTRANNO ESSERE RITENUTI RESPONSABILI DI EVENTUALI DANNI DIRETTI INDIRETTI INCIDENTALI SPECIALI ESEMPLARI O CONSEQUENZIALI INCLUSI A MERO TITOLO ESEMPLIFICATIVO I COSTI DI APPROVVIGIONAMENTO DI BENI O SERVIZI SOSTITUTIVI I DANNI RISULTANTI DA INDISPONIBILIT PERDITE DI DATI PERDITE DI RICAVI O DA INTERRUZIONE DELL ATTIVIT COMMERCIALE INDIPENDENTEMENTE DALLA CAUSA E A PRESCINDERE DALLA INTERPRETAZIONE GIURIDICA CHE INVOCHI INADEMPIMENTO CONTRATTUALE EXTRACONTRATTUALE O LA RESPONSABILIT OGGETTIVA INCLUSI I CASI DI NEGLIGENZA O ALTRO DERIVANTI DALL UTILIZZO DEL PRESENTE SOFTWARE ANCHE NEL CASO IN CUI SIANO STATI INFORMATI N codice 15023355 Rev K ITA DELLA POSSIBILIT DEL VERIFICARSI DI TALI DANNI Leggere prima di usare questo prodotto Questo prodotto il suo utilizzo e disposizione sono soggetti ai seguenti termini e condizioni Se l acquirente non concorda con questi termini e condizioni l acquirente non autorizzato da Illumina ad utilizzare questo prodotto e l acquirente non deve utilizzare questo prodotto 1 Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 Definizioni PI per applicazioni specifiche indica diritti di propriet intellettuale c
19. E possibile scaricare una copia del software SAV dal sito Web Illumina E necessario un login Mylllumina Per una descrizione dettagliata delle metriche disponibili e delle istruzioni d installazione vedere la Guida per l utente del Visualizzatore analisi di sequenziamento n codice 15020619 Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 5 5 25109 BOIUBJOUB d MAINISAO UNY EIELLISUIS Software HiSeq Arresto e riavvio di una corsa 56 Dalla schermata Run Overview Panoramica corsa si pu arrestare la corsa possibile arrestare la corsa in caso di errata impostazione se la qualit dei dati insoddisfacente o se si verifica un errore hardware Se si prevede di riprendere la corsa accertarsi di selezionare le opzioni appropriate di arresto normale unitamente a una delle opzioni RTA che permettono di riprendere la corsa Opzione di arresto Normal Stop End of Lane Chemistry Arresto normale fine corsia chimica Normal Stop End of Cycle Arresto normale fine del ciclo Immediate Stop Arresto immediato Opzione RTA Keep As Is Mantenere come si trova Complete For Run Completare per corsa Complete For Read Completare per lettura Keep As Is Mantenere come si trova Complete For Run Completare per corsa Complete For Read Completare per lettura No option Nessuna opzione In grado di riprendere S La corsa riprende al prossimo comando della chimica o di imaging Non po
20. Refresh Aggiorna in qualunque momento durante la corsa per visualizzare metriche aggiornate mentre la corsa procede Si pu visualizzare SAV in remoto installandolo su un altro computer che abbia accesso alla posizione in rete della cartella di output della corsa E possibile scaricare una copia del software SAV dal sito Web Illumina E necessario un login Mylllumina Per una descrizione dettagliata delle metriche disponibili e delle istruzioni d installazione vedere la Guida per l utente del Visualizzatore analisi di sequenziamento n codice 15020619 Pagina Analysis Analisi La pagina Analysis Analisi riporta il progresso dell analisi e fornisce l accesso alle pi importanti statistiche di durata della corsa Le statistiche vengono aggiornate non appena sono disponibili informazioni nuove sull analisi Le statistiche di durata della corsa sono visibili da qualsiasi computer con accesso alla cartella relativa alla corsa dell esperimento Andare alla cartella lt RunFolder gt Data e aprire il file Status Il file Status Stato viene trasferito alla sottocartella Data Dati nella cartella dell analisi al termine di ogni ciclo elaborato NOTA Il browser potrebbe avvisare l utente sulla presenza di contenuto attivo In questo caso fare clic sull avviso nella barra delle informazioni per sbloccare il contenuto Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 1 31 es109 Ejjap epeInp Ip auolisize1s a ep 06 Be UOIN in tempo reale RT
21. TruSeq SBS Kit v3 Index TruSeq Dual Index Sequencing Primer Box PE Turnaround O Existing Recipe Index tipe Tipo di indice Selezionare No Index Nessun indice per eseguire una corsa non indicizzata A O N codice 15023355 Rev KITA Selezionare Single Index Singolo indice per eseguire una corsa con una Lettura Indici immediatamente dopo la Lettura 1 La lunghezza della Lettura Indici dipende dal kit selezionato dall utente dall elenco a tendina Index Indice Le librerie a singola indicizzazione richiedono sette cicli e le librerie a doppia indicizzazione richiedono otto cicli Selezionare Dual Index Doppio indice per sequenziare librerie a doppia indicizzazione con due Letture Indici da otto cicli immediatamente dopo la Lettura 1 La seconda Lettura Indici include sette cicli di sola chimica prima di otto cicli di imaging Selezionare Custom Personalizzato per eseguire una corsa a singola indicizzazione o a doppia indicizzazione con un numero personalizzato di cicli per ciascuna Lettura Indici Flow Cell Format Formato della cella a flusso Questa opzione appare quando stato selezionato Dual Index Doppio indice oppure Custom Personalizzata per il tipo di indice Selezionare un Flow Cell Format Formato cella a flusso Single Read Unidirezionale o Paired End Bidirezionale Le corse unidirezionali a doppia indicizzazione possono essere eseguite su celle a flusso unidirezionali o su celle a flusso bidire
22. a flusso che era stata rimossa per installare le nuove guarnizioni Selezionare Next Avanti 8 Eseguire una verifica della fluidica a Selezionare la soluzione 2 dall elenco a tendina b Inserire i valori predefiniti seguenti Volume Volume 250 Aspirate Rate Velocit di aspirazione 250 Dispense Rate Velocit di erogazione 2000 c Selezionare Pump Pompa d Ispezionare visivamente la cella a flusso per escludere la presenza di bolle che attraversino le corsie e di perdite vicino ai collettori 9 Fissare insieme le otto linee dei tubi di scarico con parafilm assicurandosi di tenere tutte le estremit allo stesso livello Collocare le estremit dei tubi legati a un flacone da 250 ml 10 Selezionare Next Avanti 11 Quando il lavaggio completato misurare il volume erogato ly NOTA La pompa di priming lavata durante le fasi di lavaggio Tenere separati gli scarti dalla pompa di priming Le tabelle seguenti elencano i volumi di lavaggio provenienti dalle otto linee di tubi di scarico Essi non includono il volume di lavaggio della pompa di priming Posizioni Volume erogato Otto posizioni SBS 32 ml Otto posizioni SBS e dieci posizioni cluster 72 ml Lavaggio con NaOH i ATTENZIONE Per ragioni di sicurezza quando si lavora con grandi volumi di NaOH si devono indossare occhiali di sicurezza 1 Caricare lo strumento con 1 N di NaOH come segue 7 D O N codice 15023355 Rev K ITA a Caricare otto flaconi da 250
23. ambiente per circa 20 minuti o fino al completo scongelamento 3 Dopo il completo scongelamento dei reagenti riporre LMX2 BMX AMX2 e RMR su ghiaccio Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 1 O7 z e1n1197 e lad 1 uebes lap suolzeeda d Esecuzione di una corsa di sequenziamento Output elevato 108 Preparazione RMR 1 2 3 Capovolgere la provetta di RMR cinque volte per miscelare il reagente Etichettare la provetta di RMR come Reagente n 10 Centrifugare brevemente il reagente a 1 000 rpm giri min per un un minuto o meno In alternativa battere o scuotere delicatamente la provetta verificando che le gocce di reagente si raccolgano sul fondo NOTA Non utilizzare il vortex per miscelare l RMR 4 Riporre su ghiaccio Preparazione LMX2 1 Capovolgere la provetta di LMX2 cinque volte per miscelare il reagente 2 Etichettare la provetta di LMX2 come Reagente n 11 3 Centrifugare il reagente a 1 000 rpm giri min per un minuto 4 Riporre su ghiaccio Preparazione BMX 1 Capovolgere la provetta di BMX cinque volte per miscelare il reagente 2 Etichettare la provetta di BMX come Reagente n 12 3 Centrifugare il reagente a 1 000 rpm giri min per un minuto 4 Riporre su ghiaccio Preparazione AMX2 1 Capovolgere la provetta di AMX2 cinque volte per miscelare il reagente 2 Etichettare la provetta di AMX2 come Reagente n 13 3 Centrifugare il reagente a 1 000 rpm giri min per un minuto 4 Riporre su ghi
24. con standard internazionale IEC 60320 C13 e fornito con un cavo di alimentazione specifico per il paese Le tensioni pericolose sono rimosse dallo strumento solo quando il cavo di alimentazione scollegato dalla fonte di alimentazione c a Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 T baSIH Ip usuodw 09 uoizenyuon Per ottenere connettori equivalenti o cavi di alimentazione conformi agli standard locali consultare un fornitore di terze parti come Interpower Corporation www interpower com x A ATTENZIONE Non utilizzare mai una prolunga per collegare lo strumento alla fonte di alimentazione Uscita calore Di seguito mostrata la dissipazione termica per uno strumento HiSeq con computer PC e monitor Tabella 1 Dissipazione termica per strumento Descrizione generale Componente Potenza misurata Uscita termica Watt Btu h Strumento 750 2 600 PC e monitor 750 1 400 Totale per strumento PC e 1 500 4 000 monitor a y ATTENZIONE Non operare HiSeq se un qualsiasi pannello rimosso Non toccare la stazione termica nello scomparto di imaging Il riscaldatore a effetto Peltier utilizzato nell area del piano di solito controllata tra la temperatura ambiente 22 C e 85 C L esposizione a temperature al limite superiore di questo range potrebbero causare bruciature Radiazioni laser HiSeq un dispositivo laser di Classe 1 che contiene due laser di Classe 4 I laser di Classe 4 presentano un perico
25. dei reagenti perla Lettura 2 000 00 106 Caricamento reagenti per la Lettura 2 0 111 Capitolo 4 Procedure post corsa iniiiaanaonnrnnnnnnn 145 Introduzione iii iii iii iii 116 Rimozione e pesatura dei reagenti 1010010111 117 Esecuzione di un lavaggio di manutenzione dello strumento 118 Esecuzione di un lavaggio con acqua 00 0 122 Porre lo strumento nello stato inattivo idling 0 124 Spegnimento dello strumento 0 000000 uaaa aa nannaa 125 Capitolo 5 Analisi in tempo reale RTA 127 Panoramica dell Analisi in tempo reale RTA 000 00000 128 Monitoraggio delle statistiche di durata della corsa 000 00 130 Dati di output dell Analisi in tempo reale RTA 132 Capitolo 6 Risoluzione dei problemi 139 Introduzione iii iii 140 Possibili problemi d impostazione della corsa 141 Esecuzione di una verifica della fluidica 00 00 142 Ripetizione dell ibridazione primer Lettura 2 143 Se BaseSpace non disponibile 144 MIC a ole i nei le 145 Assistenza TECNICA osseo pallio dii Le 149 XI N codice 15023355 Rev KITA Descrizione generale Introduzione nn 2 Configurazione e componen
26. fino a quando non deve essere usato Scongelare tra 2 C e 8 C per 16 ore o in bagno d acqua a temperatura ambiente per 90 minuti Kit SBS 50 cicli Scongelare in un bagno d acqua a temperatura ambiente per un ora Scongelare in un bagno d acqua separato a temperatura ambiente per un ora Capovolgere cinque volte per miscelare Lasciare su ghiaccio lontano dai reagenti ICB e SRE fino a quando non deve essere usato 2 Dopo lo scongelamento riporre l SRE e il CMR su ghiaccio finch non si pronti a caricare i reagenti 3 Rimuovere l LFN36 dal luogo di conservazione tra 15 C e 25 C e scongelare in un becher contenente acqua deionizzata a temperatura ambiente per 20 minuti Esecuzione di una corsa di sequenziamento Output elevato F 4 N codice 15023355 Rev K ITA Nome del Kit SBS 200 cicli Kit SBS 50 cicli reagente LEN Scongelare due provette per Scongelare una provetta Una preparare l ICB per la Lettura 1 provetta di LFN prepara ICB per 58 Scongelare le altre due altre provette cicli di sequenziamento quando si prepara l ICB per la Lettura 2 o per una corsa successiva In alternativa scongelare quattro provette per preparare l ICB sia per la Lettura 1 che per la Lettura 2 4 Dopo lo scongelamento riporre l LFN36 su ghiaccio finch non si pronti a preparare l ICB 5 Lasciare l EDP nel luogo di conservazione tra 15 C e 25 C finch non si pronti a preparare l ICB 6 Uti
27. indicizzazione caricare i reagenti per entrambe le Letture Indici i sequenziamen Posizionando nello strumento una cella a flusso usata confermare il flusso corretto alla richiesta dell interfaccia utente di HCS Eseguire il priming dei reagenti SBS e misurare lo scarto del priming Caricare una cella a flusso su cui in precedenza si sono generati cluster sul cBot Confermare il flusso corretto alla richiesta dell interfaccia utente di HCS Esecuzione di una corsa d T O N codice 15023355 Rev KITA Avviare la corsa di sequenziamento Dopo il ciclo 1 ispezionare il report prima base impostazione opzionale e poi proseguire la Lettura 1 Per le corse indicizzate Dopo la Lettura 1 la corsa procede con la Lettura Indici corse a singola indicizzazione o con due Letture Indici corse a doppia indicizzazione Per le corse bidirezionali Preparare i reagenti bidirezionali per la risintesi Lettura 2 Preparare ICB fresco per la Lettura 2 consigliato Per le corse bidirezionali Caricare i reagenti bidirezionali sul rack bidirezionale Caricare ICB fresco nella posizione 1 consigliato Per le corse bidirezionali Continuare la corsa Il software esegue automaticamente il priming dei reagenti bidirezionali la risintesi Lettura 2 e la Lettura 2 Al termine della corsa rimuovere e pesare i reagenti Eseguire un lavaggio di manutenzione dello strumento Durata approssimativa della corsa La tabella seguent
28. interfaccia software dello strumento fornisce varie opzioni per l impostazione della corsa e per il funzionamento dello strumento utilizzando il monitor touch screen o la tastiera integrata Connettivit BaseSpace il Sistema HiSeq dispone ora di un opzione per inviare i dati relativi al sequenziamento e alla salute dello strumento tramite la soluzione genomica sul cloud di BaseSpace in tempo reale per semplificare il controllo della qualit e l analisi dello strumento Il monitoraggio in tempo reale delle corse da qualunque luogo inclusa l assistenza tecnica Illumina velocizza la risoluzione dei problemi BaseSpace facilita la collaborazione permettendo la condivisione istantanea dei risultati con chiunque in qualunque parte del mondo L allineamento e l identificazione di varianti gratuiti e l application store BaseSpace forniscono flussi di lavoro di facile utilizzo per analisi personalizzate per diverse applicazioni biologiche D N codice 15023355 Rev K ITA Destinatari e scopo La presente guida contiene informazioni sul sistema HiSeq e fornisce una panoramica sulle caratteristiche dei componenti e del software dello strumento e istruzioni complete per eseguire una corsa di sequenziamento Questa guida e destinata al personale di laboratorio e agli individui responsabili di Utilizzare lo strumento Eseguire corse di sequenziamento Eseguire la manutenzione dello strumento e dei componenti Addestrare personale sullo strumento Guida per l
29. la chiusura a vuoto I collettori non si sono sollevati Bolle potenziali nel sistema Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 Intervento Chiudere il messaggio d errore e poi ri lanciare il software dello strumento Se il problema persiste riavviare il computer dello strumento Se si riavvia il computer lo strumento deve essere per prima cosa spento per assicurarsi che il drive DoNotEject sia riconosciuto correttamente Se il problema persiste dopo il riavvio del computer dello strumento spegnere lo strumento attendere almeno 60 secondi e poi riavviare lo strumento Rimuovere la cella a flusso e ripetere le fasi di pulizia Verificare che le guarnizioni siano presenti e posizionate correttamente Riposizionare la cella a flusso Riposizionare la cella a flusso e confermare che i fori siano rivolti verso il basso Osservare se presente del precipitato bianco attorno alle guarnizioni Se presente del precipitato sostituire le guarnizioni Prima del lavaggio di manutenzione dello strumento sostituire sempre le guarnizioni Confermare che i gruppi dei pescanti siano completamente abbassati e che ciascun pescante sia a contatto con i reagenti 141 es109 ejjap suoIze sodu p IWa qoJd I IGISSO Risoluzione dei problemi Esecuzione di una verifica della fluidica Il pulsante Check Controllo sulla schermata Welcome Benvenuto permette di eseguire una verifica della fluidica quando non si sta impostando un
30. lavaggio con solvente Load Wash Reagents Caricamento reagenti di lavaggio viene richiesto di caricare i reagenti di lavaggio Wash Lavaggio lo strumento esegue un lavaggio Schermata Storage Archiviazione La schermata Storage Archiviazione permette di definire la posizione in cui i dati della corsa verranno messi e archiviati Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 3 5 esJO9 SUOIZEINBIJUOO ayjeueyos Software HiSeq 36 Figura 15 Schermata Storage Archiviazione Output elevato Please enter Password Connectto BaseSpace 8 Storage and analysis O Run Monitoring Only Enter your Mylllumina account Email walsh illumina com Password If you do not have an account please go to https my ilumina com to sign up A sample sheet is required for BaseSpace runs Save to an output folder C ilumina E 3 Zip BCL files sin aScores 36 reduction in storage space Save Auxiliary Files Save All Thumbnails Connect to BaseSpace Connessione a BaseSpace quando si seleziona questa opzione all utente viene richiesto di inserire le informazioni relative all account Illumina L opzione sottostante Zip BCL files Comprimere file BCL sar selezionata come predefinita Illumina raccomanda di salvare i file anche localmente Per salvare i file localmente selezionare Save to an out put folder Salva su un folder di output e inserire un percorso Storage and analysis Archiviazione e analisi questa opz
31. ml 1 1 ml Si pu utilizzare lo stesso calcolo per qualsiasi corsa a doppia indicizzazione secondo il numero di cicli nella Lettura 1 e nelle Letture Indici e il numero totale di cicli nella Lettura 2 Per corse bidirezionali a doppia indicizzazione includere i sette cicli di sola chimica nella Lettura Indice 2 2 Conservare ciascun volume di ICB LEN e EDP opportunamente secondo quanto necessario Per corse bidirezionali conservare le aliquote calcolate per la Lettura 2 fino a che si pronti a preparare ICB fresco per la Lettura 2 Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 Sgs jua6es lap suorzeJedaJd Esecuzione di una corsa di sequenziamento Output elevato Preparare ICB LEN e EDP come segue a Aggiungere LEN al flacone di ICB b Sciacquare ogni provetta di LEN con ICB per assicurarsi che tutto l LFN sia trasferito Aggiungere EDP alla miscela ICB LFN Sciacquare ogni provetta di EDP con miscela ICB LFN per assicurarsi che tutto l EDP sia trasferito e Tappare il flacone e capovolgere delicatamente diverse volte per miscelare o n f Mettere da parte su ghiaccio fino a quando non si pronti a caricare i reagenti sullo strumento Preparazione ICB per Lettura 1 e Lettura 2 kit da 200 cicli Se si prevede di utilizzare il flusso di lavoro alternativo e caricare ICB per la Lettura 1 e per la Lettura 2 all avvio della corsa per un massimo di 209 cicli attenersi alla procedura descritta qui di seguito per le cors
32. ml con 5 ml di NaOH b Sesi stanno lavando le posizioni cluster caricare dieci provette da 15 ml con 5 ml di NaOH 2 Caricare i flaconi e le provette sullo strumento nel rack appropriato dei reagenti 3 Selezionare Next Avanti per avviare il lavaggio con NaOH 4 Quando il lavaggio con NaOH completo misurare il volume erogato Posizioni Volume erogato Otto posizioni SBS 16 ml Otto posizioni SBS e dieci posizioni 36 ml cluster Lavaggio finale con acqua 1 Caricare lo strumento con acqua da laboratorio come segue a Caricare otto flaconi da 250 ml con almeno 20 ml di acqua da laboratorio b Sesi stanno lavando le posizioni bidirezionali caricare dieci provette da 15 ml con almeno 10 ml di acqua da laboratorio i y ATTENZIONE Non riutilizzare la stessa acqua o i flaconi del lavaggio utilizzati per la prima fase di lavaggio L acqua della prima fase di lavaggio potrebbe essere contaminata da reagenti presenti sui pescanti 2 Caricare i flaconi e le provette sullo strumento nel rack appropriato dei reagenti 3 Selezionare Next Avanti per avviare il lavaggio finale con acqua 4 Quando il lavaggio finale con acqua completato misurare il volume erogato Posizioni Volume erogato Otto posizioni SBS 32 ml Otto posizioni SBS e dieci posizioni 72 ml cluster 5 Liberare i tubi di scarico e riposizionarli nel contenitore per gli scarti Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 q 2 7 0 uaun41s Ojj p suorizuamueu Ip o
33. su tale unit Questa unit contiene file della configurazione hardware e si inizializza ogni volta che lo strumento viene acceso Per garantire uno spazio su disco adeguato archiviare in rete i dati che si trovano sul computer e provengono dalle analisi precedenti Aprire il Software di controllo HiSeq HCS utilizzando l icona del collegamento sul desktop del computer Per l inizializzazione di HCS sono necessari alcuni minuti Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 D 3 baSIH BWA SIS SP OMAY Descrizione generale 24 Una volta inizializzato il software si apre la schermata Welcome Benvenuto e nella parte inferiore sinistra dello schermo appare l icona dell inizializzazione 0 mts N codice 15023355 Rev KITA Software HiSeq Introduzione nn 26 Interfaccia del Software di controllo HiSeq 0000000000000002 ron2o2222221 28 Schermate configurazione corsa 00 000 34 Schermate impostazioni pre corsa i 46 Schermate di avvio della corsa iii 50 Schermata Run Overview Panoramica corsa ii 53 Arresto e riavvio di una corsa 00 000 iii iii iii iii iii iii iii 56 Sospensione pausing di una corsa 000000000 aada aiaia adaa a a aaan 60 Cartelle delle corse occ 62 Panoramica sul foglio campioni oceana e e e EE eea ii iane 64 Spazio disponibile sul disco
34. una verifica della fluidica se per il lavaggio stata caricata una cella a flusso usata N codice 15023355 Rev K ITA Se e stata caricata una cella a flusso usata nella fase precedente eseguire una verifica della fluidica a Selezionare la soluzione 2 dall elenco a tendina b Inserire i valori predefiniti seguenti Volume Volume 250 Aspirate Rate Velocit di aspirazione 250 Dispense Rate Velocit di erogazione 2000 c Selezionare Pump Pompa d Ispezionare visivamente la cella a flusso per escludere la presenza di bolle che attraversino le corsie e di perdite vicino ai collettori Allentare e rimuovere le otto linee di tubi di scarto per la cella a flusso dal contenitore degli scarti Assicurarsi di non includere i tubi per la pompa di condensazione o per la pompa di priming cluster Fissare insieme tutte le linee dei tubi di scarico con parafilm assicurandosi di tenere tutte le estremit allo stesso livello Collocare le estremit dei tubi legati a un flacone da 250 ml Selezionare Next Avanti per avviare il lavaggio con NaOH Posizioni Tempo di esecuzione approssimativo Otto posizioni SBS 20 minuti Otto posizioni SBS e dieci posizioni bidirezionali 60 minuti Quando il lavaggio completato misurare il volume erogato Registrare il volume di erogazione sul modulo di monitoraggio del laboratorio Posizioni Volume erogato Otto posizioni SBS 32 ml Otto posizioni SBS e dieci posizioni cluster 72 ml Riposiziona
35. utente del sistema HiSeq 1000 3 SUOIZNPONU Descrizione generale Configurazione e componenti di HiSeq Configurazione del sistema HiSeq consegnato con un computer dedicato personalizzato con i pi recenti requisiti di sistema Il computer un sotto sistema dedicato dello strumento e non da utilizzarsi n supportato come un computer per uso generico Il sistema HiSeq comprende lo strumento HiSeq che include un monitor un computer dedicato personalizzato con i pi recenti requisiti di sistema uno scanner per codici a barre una tastiera un mouse e un alimentatore universale Componenti Scomparto dei reagenti accoglie i rack che contengono i reagenti per le corse di sequenziamento o soluzioni di lavaggio per i lavaggi dello strumento Scomparto della cella a flusso contiene il piano della cella a flusso a depressione che tiene in posizione la cella a flusso durante le corse di sequenziamento Scomparto della fluidica contiene le pompe della fluidica che erogano i reagenti alla cella a flusso e poi al flacone degli scarti Modulo ottica integrato contiene componenti ottici che consentono l imaging a doppia superficie della cella a flusso per l acquisizione contemporanea di A C G e T mediante epifluorescenza Il fascio di luce del laser di eccitazione passa attraverso l obiettivo e la fluorescenza viene raccolta attraverso lo stesso obiettivo Barra di stato utilizza tre colori per indicare lo stato dello strumento Il b
36. x 101 cicli attenersi alla procedura descritta qui di seguito Per corse a doppia indicizzazione vedere Preparazione ICB per corse a doppia indicizzazione a pagina 77 1 Aliquotare 47 ml di ICB 200 in un flacone di riserva da 250 ml in modo da avere due flaconi di ICB 2 Conservare il flacone di riserva contenente 47 ml di ICB nel luogo di conservazione a una temperatura compresa tra 2 C e 8 C fino a quando si pronti a preparare e caricare i reagenti per la Lettura 2 3 Aggiungere i contenuti di due provette di LEN al flacone originale di ICB 200 4 Sciacquare ciascuna provetta di LEN con ICB 200 per assicurarsi che tutto l LFN sia trasferito 5 Aliquotare 1 1 ml di EDP 200 nella miscela ICB LEN 6 Riporre la porzione non utilizzata di EDP 200 nel luogo di conservazione a una temperatura compresa tra 15 C e 25 C 7 Tappare il flacone e capovolgere delicatamente diverse volte per miscelare 8 Mettere da parte su ghiaccio fino a quando non si pronti a caricare i reagenti sullo strumento Preparazione ICB per 58 cicli kit da 50 cicli Per la preparazione di ICB per un massimo di 58 cicli di sequenziamento attenersi alla procedura descritta qui di seguito 1 Aggiungere il contenuto di una provetta di LFN al flacone di ICB 50 2 Sciacquare la provetta di LFN con ICB 50 per assicurarsi che tutto l LFN sia trasferito 3 Aggiungere il contenuto di una provetta di EDP 50 al flacone di miscela ICB LEN 4 Sciacquare la pr
37. 00000000000 0a r200 nonon 22n 23 Capitolo 2 Software HiSeq 25 introduzione sosse e e nio a E E S asa toath 26 Interfaccia del Software di controllo HiSeq 28 Schermate configurazione corsa oanad anaona aana 34 Schermate impostazioni pre corsa 00000000 ua noana n annaran 46 Schermate di avvio della corsa 00 50 Schermata Run Overview Panoramica corsa 53 Arresto e riavvio di una corsa 0000i i 56 Sospensione pausing di una corsa 0000 000000000000000 60 Cartelle delle corse cnn 62 Panoramica sul foglio campioni 00 0000000000 64 Spazio disponibile sul disco 000 00000000 66 Capitolo 3 Esecuzione di una corsa di sequenziamento Output elevato ila luni i liti A ojtgolo Urael AAA 68 Flusso di lavoro del sequenziamento Output elevato 70 Preparazione dei reagenti SBS _ 0 00000 73 Preparazione dei reagenti per l indicizzazione ee 79 Inserimento dei parametri della corsa 00 84 Caricamento e priming dei reagenti 000001000 88 Caricamento di una cella a flusso 00000000000000 0000a0000aan 98 Monitoraggio di una corsa nnnnnnnnnnnnnnns 104 Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 XI Preparazione
38. 1IY Software HiSeq NOTA Il software riprende la corsa dal punto in cui la stessa era stata interrotta preimpostando la corretta impostazione sulla schermata Resume Ripresa 3 Confermare le impostazioni sulla schermata Resume Ripresa o selezionare il punto appropriato della corsa per riprenderla Resume At Riprendi a presenta un elenco con la lettura o il punto della corsa da cui riprendere Start At Cycle Inizia dal ciclo presenta un elenco con il ciclo da cui riprendere Figura 30 Punti per la ripresa della corsa Paired End Reagents Paired End Prime Paired End Turnaround Read 2 N y ATTENZIONE Ilumina non consiglia di riprendere una corsa al punto d inversione turnaround bidirezionale salvo che per la re ibridazione primer Lettura 2 Per maggiori informazioni vedere Ripetizione dell ibridazione primer Lettura 2 a pagina 143 4 Confermare le impostazioni sulla schermata Resume Ripresa o selezionare i comandi di imaging e della chimica per la ripresa Per maggiori informazioni vedere Esempio di impostazioni per il riavvio di una corsa a pagina 58 5 Selezionare Next Avanti per procedere Il software guida l utente attraverso le fasi rimanenti di impostazione della corsa Esempio di impostazioni per il riavvio di una corsa Se l utente ha arrestato la corsa dopo l imaging della corsia 1 al ciclo 23 di una lettura di 101 cicli il software stabilisce automaticamente le impostazioni per il riavvio come Read
39. 24 dei primi 25 cicli devono avere un valore Chastity di gt 0 6 Le letture possono passare il filtro qualitativo se una sola delle prime 25 basi presenta un valore Chastity inferiore I punteggi qualitativi verranno riportati solo per le letture che passano il filtro qualitativo Per maggiori dettagli vedere Teorie di funzionamento RTA Error Rates Tassi d errore se si era incluso un controllo PhiX RTA genera i tassi d errore dopo il ciclo 25 In Line Controls Controlli in linea se si erano preparati i campioni con i kit preparazione campioni TruSeq RTA eseguir l allineamento dei controlli in linea al ciclo 52 di ciascuna lettura o alla fine della lettura nel caso di lunghezza della lettura inferiore a 52 cicli Index Count Conteggio indici dopo il completamento dell ultima lettura indici RTA riporta il conteggio indici per corsia se si era fornito un foglio campioni Analisi in tempo reale RTA q 3 O N codice 15023355 Rev K ITA Visualizzatore analisi di sequenziamento SAV Il Visualizzatore analisi di sequenziamento SAV Sequencing Analysis Viewer e un applicazione che permette di visualizzare importanti metriche di sequenziamento generate da Real Time Analysis RTA mediante grafici di dispersione diagrammi e tabelle SAV si apre automaticamente sulla pagina di analisi dopo che iniziata l analisi d immagine Le statistiche vengono aggiornate non appena sono disponibili informazioni nuove sull analisi Selezionare
40. 5 ml di PW1 in una provetta conica Sarstedt da 15 ml e aggiungere 150 ul di HP3 Capovolgere la provetta cinque volte per miscelare il reagente Etichettare la provetta conica di HP3 diluito come Reagente n 18 Centrifugare a 1 000 rpm giri min per un minuto Riporre a temperatura ambiente Preparazione HT2 1 2 3 4 Capovolgere la provetta di HT2 cinque volte per miscelare il reagente Etichettare la provetta di HT2 come Reagente n 19 Centrifugare il reagente a 1 000 rpm giri min per un minuto Riporre a temperatura ambiente Preparazione ICB per Lettura 2 kit da 200 cicli Per corse non indicizzate o a singola indicizzazione attenersi alla procedura descritta qui di seguito Per corse a doppia indicizzazione preparare l ICB utilizzando i volumi messi da parte per la Lettura 2 Per maggiori informazioni vedere Preparazione ICB per corse a doppia indicizzazione a pagina 77 110 1 Aggiungere il contenuto di due provette di LFN al flacone contenente 47 ml di ICB 200 Sciacquare ciascuna provetta di LFN con ICB 200 per assicurarsi che tutto l LFN sia trasferito Aliquotare 1 1 ml di EDP 200 nella miscela ICB LEN Tappare il flacone e capovolgere diverse volte per miscelare Mettere da parte su ghiaccio fino a quando non si pronti a caricare i reagenti sullo strumento N codice 15023355 Rev K ITA Caricamento reagenti per la Lettura 2 Dopo il completamento della Lettura 1 e di tutte le eventuali Lett
41. A isi Anal Dati di output dell Analisi in tempo reale RTA I risultati di output di RTA sono salvati sull unit di rete specificata durante le fasi d impostazione della corsa Tutti i risultati dell analisi sono salvati in una cartella di output dell analisi alla quale attribuito lo stesso nome della cartella della corsa sul computer dello strumento La figura che segue illustra l organizzazione della cartella dell analisi in rete incluse le posizioni dei file di output pi importanti caselle blu Figura 49 Cartella Analisi in tempo reale RTA lt NomeEsperimento gt AAMMGG_nomemacchina_XXXX_FC Intensities Thumbnail_ reports Images Status_Files TileStatus RTALogs i iini L001 per corsia A config xml L001 per corsia C1 1 C Corsia Ciclo a bcl files A Matrix Phasing Plots SignalMeans y 5 config xml a control files N codice 15023355 Rev KITA Risultati dell analisi Tabella 9 Contenuto della cartella Analysis Analisi in rete File principale Sottocartella Descrizione file bcl AnalysisFolder Data Ogni file bcl contiene i risultati Intensities Basecalls dell identificazione e della valutazione LOOX CX X qualitativa delle basi eseguite dal software RTA per un ciclo e una tile Questi file sono l input per CASAVA v1 8 2 o per il Convertitore BCL Per maggiori
42. A CTO TOAACOTACOOTAROGAACOTA TCAATTGA GA CTAAATATTAACGTACCA VIRAGAGCIACCETECAA ALGA CGAACTTCTGTTAACCTTAAGATTACT TC TACE TOTAA i i GIICIGITAACOTTAAGATTAGIIGAICCACTGALI CAAOGIAGOGTANOGRACGIAICRATIAGACIAAGOTACCGFGOAACGACGANAAGHA CGAAAAGAATGATAACAGTAACACACTTCTGTTAACCTT TTACTTGA A Us seas q TTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAA GTACCATTAAGAGCTA ATGATAACAGTAACACACTTCTGTTAACCTTAAG MITAC IIGRTOCAGI GATTERAGG ACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTACCGTGCAA CGA ESANA AGAK TGA ACA CTAACACACITON A rd PATATA EATARRA TOEA AATA AACAGTAACACACTTCTGTT AAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTACCGTCTICTG AAGATTACTTGATCCACTGATTCAA ACTA CRAAAACOTATCATTAAGATTACTE GATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAAT GAGACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTACCGTGCAACGA COAARACAA SAT TAACAGTAACACACTTCTGTTAACC TACTTGATCCACTGATTCAACGTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGCTICTGTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAAT TGAGACTAGCAACGA ACGAAAAGAATGATAACAGTAACACACTTCTGTTAACCTIAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTA Illumina San Diego California U S A 1 800 809 ILMN 4566 1 858 202 4566 fuori dal Nord America techsupport illumina com www illumina com
43. ACCATTAAGAGCTACCGTGCAACTIAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAAT TGAGAC TY AAGATTACTTGAT GCTACCGTGCAACGAAAATAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACTTCTETTAACCTTAAGATTACTTGATCCACIF GGAAAAGAATGAI a GS To41e MAAGAGCTACC GATAACAGTAACACACTTCTGTIAACCTTAAGA A Nea CCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTA ICACACTTCTGT ACCATTAAGAGCTACCGTGCAACAGTAACACACT TCTGTTAACCTTAAGATTACT TGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAA AAAGAATGA a Ad ACTGATTCAACG GTACCGTAACGAACGTATCATTAAGATTACTIGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATAT TA CTGTTAACCTTIA O TTGATCCACTGATTCAACGTTAAGATTACTTGATCCACTI GATTEAACG TACCETAACGAACGIATCAATTEAGCTICIGITAAGI AGCAACGACG SAAAAGAATGATAACAGTAACACACTTCTGTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAAAGATTACTTGATO AAGAGCTACC illumina SOLO A USO DI RICERCA DI PROPRIET DI ILLUMINA N codice 15023355 Rev K ITA Maggio 2013 Questo documento e il suo contenuto sono di propriet di Illumina Inc e delle aziende a essa affiliate Illumina e sono destinati esclusivamente a uso contrattuale da parte dei clienti di Illumina per quanto concerne l utilizzo dei prodotti qui descritti con esclusione di qualsiasi altro scopo Questo documento e il suo contenuto non possono essere usati o distribuiti per altri scopi e o in altro modo diffusi resi pubblici o riprodotti in alcun modo senza preventiva approvazione scritta da parte di Illumina Mediante questo documento Illumina non trasferisce alcuna licenza sui propri diritti su brevetti marchi di fabbri
44. ACT Ce oa CGACGAAAAGAATGA Me Uro o GTACCATTAAGAGCTACCGTGCAACAGTAACACACTTCTETTAACCTTAAGATTACTTGATCECACTGATTOAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTACCGTGCAACGACGAAAAG ATACA TAACACACTTCTOTIAACC TRAGATIACITEATOCRE TEALTORACGIAGOG IMACGAACATATCARITCRGACIAAATAT IRACGTACCATTRAGAGOTACCOTCTICTETTAACGITARGATTACITRATOCACIGATTOAI ACGIACCGTAACGAACGTATCATTAAGATTACTTGATCECACTGATTCEAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACT PI EE EN Al CCGTGCAACGACGAAMAAGAAT SS OI CACTICTGTTAACC TACTTGATCCACTGATTCAACGTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAAT TGAGCTICTGTIAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAGCAACGA CGAAAAGAATGATAACAGTAACACACTTETETTAACCTTAAGATTACTTGATECACTGATTCAACGTACCGTAAAGATTACTTI RTECACIGAI TERA GTACCGTAACGAACGTATCAAT TGAGACTAAATATTAACGTACCAT TAAGAGCTA MATGATAA tacos NTTAACGTACCATTAAGAGCTACCGTCTTOETETTAACCT TAAGATTACTTGATCCACTGATTCAA ACGTACCGTAACGAACGTATCATTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATAT TAACGTACCATTAAGAGC TACCGTGCAACGACGAAAAGAATGATAACAGTAACACACTICTGTTAACC ACGAAAAGAATGATAACAGTAACACACTICTGTTAACCTIAAGATTACTIGATCCACTGATTCAACGTACCGTAAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCG TAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTA NT ATG ki AAGATTACTTGATECACTGATTCAACGIT a TC AATTGAGACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTACCGTCTTCTGTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAA TACTTGATCCACTGATTCAACGTTAAGATTACTTGATCCACTGATTOAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGCTTOTETTAACCTTAAGATTACTTGATOCACTGATTOAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAGCAACGA RICAATIGAGAC
45. ATAACAGTAACACACTICTGTIAACCTTY TTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATAT TAACGTACCA AGARDA CCGTCTTCTGTTAACCTITAAGATTACTT CATECACTGATT CAM GIACCGTRAOGAACGIATCATIAAGATIACITGRTOGACIGATTORACGIAGOGIARGGAAGGIAT CAT GAGAC RATA ACO TACEN MACAO TAC GI GORACGRCGAMRACAATGATAACAGIAACACAC TI CTGTTAAGE TTI PI TERIGORLT ER TTCAACGTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGCTTCTGTTAACCTTAAGATTACTT QAI REATI QATTA CTICO E e INTERNI GARAGIAGCARCGACG ZAAAAGAA BACAGIAACAGACI TEA TB AGCITARGATTACITCATCORCIGALTCARCCTA CCA RRAGATL ACTTGATCCACTGAT TCAACGTACCGTAACGAA on CCATTAAGAGCTACC GAT MACAGTRACA CACTTCTGTTAACCTTAAGATTACTTGATECACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTA ESTO HON GTTAACCTTAAGATTACTT CATECACTY GATTCAACC Co A n TT A A OT A TA TGA CRAN TOT TAL SAAAAGAATGATAACAGTAACACACTICTGTTAACCTIAAGATTACTT GA ETAS TOAT e TACO SAAGA TOET a GAI GRAGGI ACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACG SINS ACCAT TAAGAGCTACCGTGCAACAGTAACACACTICTGTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAAT TGAGACTAAATATTAACGTACCAT TAAGAGCTACCGTGCAACGACGAAAAGAATGAT GATAACAGTAACACACTTCTGTTAAC a TAE ica ACTTGATCOROTGATTCANOG RI AAA TTCAACGTTAAGATTACTTGATCCACTI TRARRE ACCGTAACGAACGTATCAATTGAGCTTETETTAACCTTAAGA TEUIO OE TRATTA ALOE ACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAGCAACGACG GAGACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGTCTGTT GATTACTTGATECACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTACCGTGCAACGAAAAGAATGATAACAGTA GIACCGTAA CGAACATATOATTARGATTACIIGAIGCACT RIT CAAO
46. Check close Door Sequence Please close the door Once the instrument door is shut press Next to begin sequencing Y Vacuum Engaged Y Door Closed 44 x b gt BA CANCEL HELP NEXT 5 P N codice 15023355 Rev K ITA Schermata Run Overview Panoramica corsa La schermata Run Overview Panoramica corsa fornisce una panoramica dell avanzamento della corsa dello stato della fluidica dello stato dell imaging e delle intensit secondo il ciclo Figura 28 Schermata Run Overview Panoramica corsa per una cella a flusso High Output Output elevato 7 Analysis Extracted 0 Called O Scored 0 View Data Cycle 1 of 101 Cyele Fluidics gt Images Incorporation 10 x a cs 3 041 db Mon Jan 10 2 1PM Cycle Configuration S Read Type Single Read Run Read Cycles 101 Output Folder D lilumina Basecalls 110110_Velocity Simulator_0186_AHS12645 Doo Temperature Intensty Fiovcell 1 HS12645 Cycle 1 Chemistry FirstBase Incorporation Pumping Reagent IC La n HELP STOP Avanzamento della corsa Fluidica e temperatura Configurazione corsa Analisi Immagini muou gt Questa schermata contiene le seguenti sezioni per il monitoraggio della corsa Run Progress Avanzamento corsa fornisce una rappresentazione visiva dell avanzamento della corsa ed elenca il numero di cicli completati L avanzamento della corsa indicato da una barra grafica d avan
47. Esecuzione di una verifica della fluidica a pagina 142 Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 31 b3SIH 0 01 U09 IP SIEMYOS JSP e199eJ1a u Software HiSeq Indicatori di attivit Nell angolo inferiore destro la schermata Welcome Benvenuto contiene una serie di icone che indicano quale attivit lo strumento sta eseguendo Figura 13 Indicatori di attivit Da sinistra a destra le icone rappresentano i motori X Y e Z la funzionalit dell elettronica la videocamera il sistema della fluidica e le funzioni di elaborazione 6506000086 Figura 14 Indicatori di attivit Da sinistra a destra le icone rappresentano la temperatura della cella a flusso A la temperatura del vano refrigerato per i reagenti lo stato di cloud computing BaseSpace e la temperatura della cella a flusso B Icone di stato Le icone di stato sono poste nell angolo superiore destro di ciascuna schermata e segnalano eventuali cambiamenti delle condizioni operative durante l impostazione o l esecuzione della corsa Icona di Nome dello stato Descrizione stato Stato OK Nessun cambiamento Le condizioni del sistema sono normali Informazione Solo a fini informativi Non si richiede alcun intervento Attenzione Informazione che richiama l attenzione dell utente Avvertenza Le avvertenze non provocano l arresto della corsa ma possono subordinarne il proseguimento a un intervento dell utente Errore In genere gli errori provocano l arresto della corsa
48. GTACCGIAROGAAGGIAT CANTI GAGAGTAAATA TAA CGTACCAT RAGAGCIACOGI GCAROGA COAANAGARI GAY AACAGTAACACACTTCTGTTAACCTTE dl ER ATTCAACGTTAAGATTACTTGATCCACT SATON GT PANEON TIEN IRTE AACCTTAAGATTACTTI A STI CARE GIA GO RIANG GRATA FRA LT REA CI SGCAACGACG AAAAGAA AACAGTAACACACTTCTGTTAACCTTAA ACTTGATCC AACGTACCGTAAAGATTACT TGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAAT TGAGAC TACCATTAAGAGCTACC GNTAAGAGIAAGACACI TOI GTTAROCI TRAGAITACTTGTIGRI CCACIGATIGAACGIAGOGIATCAATTGAGACIAAAIAI TAX GGIACCATAAGAGCIAGOGICHICTGIIBACCITRAGATIACITGATOUACISATICAACGIACOGI ISO VISAN et SOSRAGATIARLIGA O y En MAACGAACGTATCAA TGA nica NEIN PATANG TACCATTAAGAGCTA SAL CTGTT ETIA GATTACTTGATCCACTI GATA ACCGTAACGA AATGATAACAGTAACACACTTCTGTTAA AAGATTI GATCCACTGATTCAACGTA TTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATAT TAACGTACCAT TAAGAGCTACC GRTRACAGIRACACACI TO TSH AACOT IRAGA TAGITGAT OCAGTSAI TCAACGTACCGTAAOGAACOTATCAAT TGAGAG TAAATAT POAOGTAGGRI TAAGAGG TACUGT GT TOTT TAACC IAAGA TACITGATCOACIGATIGAACE TGAGACTAAA AACGTTGTIAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTTCTGTTAACCTIY SS ARAN GATTCAACGTACCGTA MATCAATTGAGA NC TRAATATT AACGTACTIAACCTIAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTCTICTGTIAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAAT TGAGACTAACGACGA GACTAAATAT TAACGTACCATTAAGAGCTACAACCTTAAGAT TACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAAT TGAGACTAAATATTAACGTACCAT TAAGAGCTACCGTGCAACGACGAAAAGAATGATAACAGTAACACA o A MAA a
49. Hardware indica strumenti accessori o periferiche Illumina Illumina indica Illumina Inc o un affiliata Illumina come applicabile Prodotto indica il prodotto che accompagna questo documento ad esempio hardware materiali di consumo o software Acquirente la persona o l entit che acquisisce legittimamente e legalmente questo prodotto da Illumina o da un rivenditore autorizzato Illumina Software indica il software con marchio Illumina ad esempio software operativo per l hardware o software di analisi dei dati Il software viene concesso in licenza e non venduto e pu essere soggetto a condizioni ulteriori indicate nel contratto di licenza per l utente finale Specifiche indica le specifiche scritte da Illumina per questo prodotto in vigore alla data di spedizione del prodotto medesimo da parte di Illumina Diritti per l utilizzo a solo scopo di ricerca In conformit con i presenti termini e condizioni e se non altrimenti concordato per iscritto da un funzionario Illumina all acquirente viene concesso esclusivamente un diritto non esclusivo non trasferibile personale che non pu essere fatto oggetto di sublicenza ai sensi della PI base Illumina esistente alla data di spedizione di questo prodotto da parte di Illumina a utilizzare unicamente questo prodotto presso l impianto dell acquirente a scopo di ricerca interna il che comprende i servizi di ricerca forniti a terzi e unicamente in conformit con la documentazione di que
50. Interfaccia del Software di controllo HiSeq L interfaccia HCS visualizza la schermata di configurazione della corsa Figura 8 Interfaccia HCS schermata Welcome Benvenuto Welcome Please select the appropriate option to start SEQUENCE inmazed A Pulsante del menu della schermata Welcome Benvenuto B Riquadro interfaccia principale C Indicatori di attivit Menu della schermata Welcome Benvenuto Il pulsante del menu della schermata Welcome Benvenuto posto nell angolo superiore sinistro della schermata Welcome fornisce le seguenti opzioni View Visualizza fornisce opzioni per visualizzare l interfaccia a schermo intero o in una finestra o per minimizzare l interfaccia Tools Strumenti fornisce l accesso alla finestra Options Opzioni e al file Show Log Options Opzioni dalla finestra Options Opzioni possibile definire il templato del nome della cartella della corsa le posizioni delle cartelle predefinite e il server nome utente e password di LIMS relativi alla corsa Vedere Menu della finestra Options Opzioni a pagina 29 D 8 N codice 15023355 Rev KITA Show Log File File Show Log il file Show Log un file di testo utilizzato per la risoluzione dei problemi Scanner Scanner attiva il comando per inizializzare il software manualmente About Info su fornisce informazioni sull hardware dello strumento sulle versioni del software e su come mettersi in contatto con l Assistenza tecnic
51. LLUMINA NEI CONFRONTI DELL ACQUIRENTE O DI TERZI DERIVANTE O IN CONNESSIONE CON I PRESENTI TERMINI E CONDIZIONI INCLUSI A TITOLO ESEMPLIFICATIVO MA NON ESAUSTIVO QUESTO PRODOTTO E IL SUO UTILIZZO E L ADEMPIMENTO DI ILLUMINA AI SENSI DELLA PRESENTE A TITOLO DI RESPONSABILIT CONTRATTUALE ILLECITO INCLUSA LA NEGLIGENZA RESPONSABILIT OGGETTIVA O ALTRO IN NESSUN CASO POTR SUPERARE L IMPORTO CORRISPOSTO A ILLUMINA PER QUESTO PRODOTTO Limitazioni sulle garanzie fornite da Illumina NEI LIMITI CONSENTITI DALLA LEGGE E IN CONFORMIT CON LA GARANZIA ESPLICITA DEL PRODOTTO PREVISTA DAI PRESENTI TERMINI E CONDIZIONI ILLUMINA NON FORNISCE ED ESCLUDE ESPRESSAMENTE QUALSIASI GARANZIA ESPLICITA IMPLICITA O DI LEGGE IN RELAZIONE A QUESTO PRODOTTO COMPRESE A TITOLO ESEMPLIFICATIVO MA NON ESAUSTIVO GARANZIE IMPLICITE DI COMMERCIABILIT IDONEIT PER UN SCOPO SPECIFICO NON VIOLAZIONE DI DIRITTI ALTRUI O DERIVANTI DA ADEMPIMENTO RAPPORTI COMMERCIALI UTILIZZO O ATTIVIT COMMERCIALE SENZA LIMITAZIONE DELLA GENERALIT DI QUANTO SOPRA ILLUMINA ESCLUDE QUALSIASI DICHIARAZIONE O GARANZIA DI QUALSIVOGLIA TIPO IN RELAZIONE ALL UTILIT DI QUESTO PRODOTTO PER L IMPIEGO DA PARTE DELL ACQUIRENTE IV N codice 15023355 Rev K ITA 8 Garanzia sul prodotto Tutte le garanzie sono personali per l acquirente e non possono essere trasferite o cedute a terzi inclusi affiliati dell acquirente medesimo Tutte le garanzie sono relative a impianti speci
52. PC Attenersi alla seguente procedura per porre la fluidica in uno stato di sicurezza e per spegnere il sistema 1 Eseguire un lavaggio di manutenzione completo per lavare completamente lo strumento Per maggiori informazioni vedere Esecuzione di un lavaggio di manutenzione dello strumento a pagina 118 Rimuovere la cella le celle a flusso dal piano della cella a flusso Usando una salvietta imbevuta di alcol o un tessuto che non lasci fibre imbevuto di etanolo o isopropanolo pulire la superficie del supporto della cella a flusso fino a quando non completamente pulita ATTENZIONE Non far sgocciolare l alcol nei fori della pompa a vuoto o intorno ai collettori Se necessario utilizzare un panno da laboratorio a bassissimo rilascio di particelle per asciugare il piano Caricare 10 ml di acqua da laboratorio in ciascuna posizione dei rack reagenti quindi abbassare i pescanti nell acqua Spegnere lo strumento Quando l utente pronto a riavviare lo strumento caricare l acqua in tutte le posizioni dei reagenti accendere lo strumento ed eseguire un lavaggio con acqua Per maggiori informazioni vedere Esecuzione di un lavaggio con acqua a pagina 122 Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 q 2 D o jusun41s Ojj p ojuauuubads 7 D 6 N codice 15023355 Rev K ITA Analisi in tempo reale RTA Panoramica dell Analisi in tempo reale RTA 00000002122 Monitoraggio delle statistiche di durata della
53. TAACACACT TCTGTIAACCTTAAGATTACTTGTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTACCGTCTICTGTIAACCTIAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACC a SO e ACGAAAAGAATGATAACAGTAACACACTICTGTTAACCTIAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCAT TAAGAGCTA ATGATAACAGTAACACACTTCTGTTAACCTTAAGATTACTTGATECACTGATTOAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTACCGTCTTOETETTAACCTTAAGATTACTTGATECACTGATTCAA ATGA SAE ATAT TOA TOTT ASCETTAAGATTACI TO ATOCAGTRATI CARGO RE TAA CGA NC TRTO ARTI AGACTAA RIANTARGGIACCAL IRAGRGCI CIS TATTA TAT IGATOCAO ATTENTO GTATCAATTGAGACTAAATAT TAACGTACTTAACCTIAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGIACCGTAACGAACGTCTTCTGTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAAT TGAGACTAACGAC GAGACTAAATATTAACGTACCAT TAAGAGCTACAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAAT TGAGACTAAATAT TAACGTACCAT TAAGAGCTACCGTGCAACGACGAAAAGAATGATAACAGTAACA A O a TAAT OTAS o a TA IO ATO SA CIOATTCAA GTACCATTAAGAGCTACCGTGCAACTTAACCTIAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACG TACCATTAAGAGCTACCGTGCAACGACGAACTICTGTT E SAGCTACCGTGCAACGAAAATAACCTIAAGATTACTTGATCCACTGATITCAACGTACTICTGTTAACCTIAAGA TAC TIAICCACTOM TCAACOTACOGTAACOAN CGTATCAA TTCAGACIMA GO TACO TOCAACGACGAMAAC N CSAAAAGAMTOATAACAGTAACACAOTTOTOTIMACCTIAAGATIACTTGATCACTCATICAACOTACCGTAMAGATTACITOATCCAC ICA TOAACCIACOCTAACGAACGTATOMA IGAGACIAAATATTAACOTACCATTAAGACCTA ATGATAACAGTAACACACTTCTGTTAACCTTAAG O E CGTATCAATTGAG
54. TRAATAT ACTA OC ATTAAGAGTCTGTIAACCTIBAGATACTIGATOCACTGATICAMOOTACCOTAACOAACOTATOAATIGAGACTAAATATIAACG TACCATAAGAGCTACCO TRORACGARAAGAAT GATAACAC ACGTACCGTAACGAACGTATCATTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTA a CGACGAAAMAGAA FRASE gi CACTICTGTTAACC TACTTGATCCACTGATTCAACGTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAAT TGAGCTICTGTIAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAGCAACGA O O ETAT OAE TAGATA N EAE O a CARI AG CI RASIALTA ROGIA CCA VES ye MAATGATAACAGTAACACACTTCTGTIAACCTTAAGATTACTT E li CTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTACCGICTICTGTIAACCTIAAGATTACTT I ITA CC TCCACTGATTCAACGTACCAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTACCGTCTICTGTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAAC SAMA GAATOATAACAGIAACACACTICTOTIAACCIAAGANTACTTOATOCACTOATTCAACOTACOSTAMAGATTACTIGALOCACIGATICAACGTACOCTAACOMACGTATCA A IGAGACIAMATATTAACOTACCATIAAGACOTA C e l DEE R a Rie i GATTACTTGATCCACTGATTCAA AATTGAGACTAAATATTAACGTTGTIAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTTICT AAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCE CAIGA A ICACACTAAATATTAACGTACITAAO Ti AAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTCTICTGTIAACCTTAAGATTACTIGATCCACT CRTTCAACGT A ECCTAROGAACGTATORATI GAGACTAACGAG Ie rrr_O_NLN T XXXK k tTti a A TOT CISA N TORTO TGATTOAACG GTAACGAACGTATCAATTGAGA A ACC AACCTTAAGATTACT TGATCCACTGAT TCAA GIACCATTAAGAGCTACCGTGCAACTTAACCTTAAGATTACTT AC
55. Usare lo scanner portatile per codici a barre per scansionare l ID della cella a flusso o del kit di reagenti oppure inserire l ID utilizzando la tastiera di tipo Software HiSeq touch screen L icona della tastiera si trova a destra dei campi per il testo I Quando si finito di inserire le informazioni su ciascuna schermata il pulsante Next Avanti diventa attivo Selezionare Next Avanti per passare alla schermata successiva o selezionare Back Indietro per tornare alla schermata precedente In qualunque momento durante le fasi di impostazione della corsa possibile selezionare Cancel Annulla per annullare abort l impostazione della corsa e ritornare alla schermata Welcome Benvenuto Sostituzione delle guarnizioni Al termine di una corsa il software apre le schermata Gasket Change Sostituzione delle guarnizioni che guidano l utente nell esecuzione di un lavaggio di manutenzione 1 Load Gasket Caricamento guarnizione viene richiesto di caricare una nuova guarnizione 2 Load Wash Reagents Caricamento reagenti di lavaggio viene richiesto di caricare i reagenti di lavaggio 3 Load Wash Flow Cell Caricamento cella a flusso per il lavaggio viene richiesto di caricare una cella a flusso non per il sequenziamento e di inserire l ID della cella a flusso per il lavaggio 4 Fluidics Check Verifica fluidica viene richiesto di selezionare una soluzione Utilizzare i valori predefiniti per Volume Volume Aspiration Ra
56. a Exit Esci chiude l interfaccia CS Figura 9 Pulsante del menu Menu della finestra Options Opzioni Dalla finestra Options Opzioni possibile definire il templato del nome della cartella della corsa le posizioni delle cartelle predefinite e il server nome utente e password per LIMS relativi alla corsa Figura 10 Menu della finestra Options Opzioni Run ID Template YY MM DD _ SERIAL _ RUN _ FCPOSXFCSERIAL Reset Default Output Folder SPECIFY NETWORK PATH Li Default Output Folder2 Default Temp Folder 1 D llumina HiSegTemp Run Setup Folder LIMS Server LIMS Username ll dada da LIMS Password lcd Run ID Template Templato del nome cartella corsa il nome utilizzato per il nome di una cartella della corsa Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 pe 9 b3SIH 0 01 U09 IP SIEMYLOS JSP e199eJ1aju Software HiSeq Default Output Folder Cartella di output predefinita la posizione predefinita in cui salvare le corse con la cella a flusso A Questo puo essere cambiato corsa per corsa Default Output Folder2 Cartella di output predefinita 2 la posizione predefinita in cui salvare le corse con la cella a flusso B Questo pu essere cambiato corsa per corsa Default Temp Folder1 Cartella temporanea predefinita 1 la posizione in cui possono essere scritti i file temporanei durante una corsa Run Setup Folder Cartella impostazioni corsa la posizione in cui HiSeq prender i moduli cam
57. a cartella attribuito lo stesso nome della cartella della corsa sul computer dello strumento File di registro per eventi copia File di registro per analisi delle immagini e identificazione delle basi Contiene i risultati RTA della identificazione delle basi Contiene informazioni sulla corsa e specifiche rispetto all analisi delle immagini File di configurazione per RTA in formato xml Contiene le informazioni di registro della corsa Ogni volta che il file di registro raggiunge dimensioni troppo grandi circa 5 MB CS avvia un nuovo file di registro Quando l utente avvia una corsa una copia della ricetta spostata nella cartella Recipe Ricetta Se l utente interrompe la corsa e la riavvia successivamente la ricetta riprende da dove la corsa era stata interrotta Contiene immagini in miniatura di nove zone provenienti da ciascuna tile utilizzabili per la risoluzione di eventuali problemi della corsa 63 S109 P alle Wed Software HiSeq Panoramica sul foglio campioni Il foglio campioni un file generato dall utente in formato csv comma separated values valori separati da virgola che contiene informazioni relative a una corsa di sequenziamento Il foglio campioni viene copiato nella cartella della corsa e utilizzato successivamente per l analisi L utilizzo di un foglio campioni opzionale Se si decide di impiegare un foglio campioni lo stesso va creato prima di avviare la corsa NOTA Per vis
58. a corsa Utilizzare questa opzione durante l installazione dello strumento e durante la risoluzione dei problemi della fluidica 1 Caricare sullo strumento una cella a flusso usata Per maggiori informazioni vedere Caricamento di una cella a flusso usata a pagina 93 2 Caricare otto flaconi da 250 ml con soluzione di lavaggio o con acqua da laboratorio e caricare i flaconi sul corrispondente rack reagenti Caricare il rack sullo strumento 3 Selezionare Check Controllo sulla schermata Welcome Benvenuto 4 Selezionare la soluzione 5 SB2 dall elenco a tendina Se si sta eseguendo una verifica della fluidica con installata una cella a flusso usata si pu selezionare la soluzione 2 che acqua 5 Inserire i valori predefiniti seguenti Volume Volume 250 Aspirate Rate Velocit di aspirazione 250 Dispense Rate Velocit di erogazione 2000 6 Selezionare Pump Pompa Se necessario mettere in pausa la verifica della fluidica selezionare Pause Pausa 7 Ispezionare visivamente la cella a flusso per escludere la presenza di bolle che 142 attraversino le corsie e di perdite vicino ai collettori Se si notano bolle eccessive verificare la presenza di ostruzioni nelle guarnizioni dei collettori ridurre la velocit di aspirazione a 100 e pompare altri 250 ul di acqua nella cella a flusso N codice 15023355 Rev KITA Ripetizione dell ibridazione primer Lettura 2 possibile ripetere l ibridazione del primer Lettura
59. a di sequenziamento Output elevato Preparazione dei reagenti per la Lettura 2 Prima della conclusione della Lettura 1 e di ogni eventuale Lettura Indici preparare i reagenti per la risintesi Lettura 2 e ICB fresco per la Lettura 2 La preparazione dei reagenti richiede meno di 30 minuti 4 NOTA Per prestazioni ottimali Ilumina raccomanda di preparare ICB Incorporation Mix fresco per la Lettura 2 Preparazione dei reagenti bidirezionali paired end Il sequenziamento bidirezionale richiede i reagenti bidirezionali paired end forniti nel kit TruSeq Cluster Le librerie Nextera a doppia indicizzazione richiedono HP11 primer per sequenziamento Lettura 2 fornito nella confezione TruSeq Dual Index Sequencing Primer Box Tipo di libreria Lettura 2 Librerie Nextera HP11 Librerie TruSeq HT HP7 o HP11 Librerie TruSeq LT v2 HP7 o HP11 Librerie TruSeq Small RNA HP7 o HP11 La preparazione dei reagenti bidirezionali richiede meno di 30 minuti NOTA HP fornito nel kit TruSeq PE Cluster non compatibile con le librerie Nextera a doppia indicizzazione E obbligatorio utilizzare l HP11 contenuto nella confezione TruSeq Dual Index Sequencing Primer Box PE 1 06 N codice 15023355 Rev K ITA Tabella 7 Reagenti bidirezionali Reagenti Nome del kit RMR LMX2 BMX AMX2 AT2 HP7 o HP11 HP3 HT2 y Kit TruSeq PE Cluster PE Reagents Box Nota Per le corse bidirezionali a doppia indicizzazione non necessa
60. a per segnalare la non conformit ii fornire la propria collaborazione a Illumina allo scopo di confermare o diagnosticare la non conformit e iii restituire questo prodotto a Illumina anticipando le spese di trasporto in base alle istruzioni di Illumina o se concordato tra le parti consentire al riparatore autorizzato di Illumina di accedere al prodotto al fine di confermare la non conformit e procedere alla riparazione e Esclusivit della tutela in garanzia Illumina provveder a sua discrezione a riparare o a sostituire il prodotto non conforme del quale abbia confermato la copertura in garanzia Ai materiali di consumo riparati o sostituiti si applica una garanzia di 30 giorni L hardware pu essere riparato o sostituito con hardware o componenti funzionalmente equivalenti ricondizionati o nuovi anche se solo un solo componente dell hardware sia non conforme Qualora l hardware venga sostituito interamente il periodo di garanzia per la sostituzione il periodo pi breve tra i 90 giorni successivi alla data di spedizione e la durata restante della garanzia hardware originale Qualora venga sostituito o riparato unicamente un componente il periodo di garanzia per il suddetto componente il periodo che termini pi tardi tra i 90 giorni successivi alla data di spedizione e la durata restante della garanzia hardware originale Quanto sopra esaurisce i mezzi di tutela a disposizione dell acquirente e gli obblighi di Illumina ai sensi
61. accio N codice 15023355 Rev K ITA Preparazione APM2 1 Capovolgere la provetta di APM2 cinque volte per miscelare il reagente 2 Etichettare la provetta di APM2 come Reagente n 14 3 Centrifugare il reagente a 1 000 rpm giri min per un minuto 4 Riporre a temperatura ambiente Preparazione AT2 1 Capovolgere la provetta di AT2 cinque volte per miscelare il reagente 2 Etichettare la provetta di AT2 come Reagente n 15 3 Centrifugare il reagente a 1 000 rpm giri min per un minuto 4 Riporre a temperatura ambiente Preparazione HP7 Capovolgere la provetta di HP7 cinque volte per miscelare il reagente Etichettare la provetta di HP7 come Reagente n 16 Centrifugare il reagente a 1 000 rpm giri min per un minuto A Q N e Riporre a temperatura ambiente Preparazione HP11 Per il sequenziamento di librerie Nextera a doppia indicizzazione obbligatorio l utilizzo di HP11 1 Capovolgere la provetta di HP11 cinque volte per miscelare il reagente 2 Etichettare la provetta di HP11 come Reagente n 16 3 Centrifugare il reagente a 1 000 rpm giri min per un minuto 4 Riporre a temperatura ambiente Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 q O 9 z e1n1197 e 13d nuabeal lap suoIzesedaJd Esecuzione di una corsa di sequenziamento Output elevato Preparazione HP3 1 DD 0 A Q Capovolgere la provetta di HP3 cinque volte per miscelare il reagente e quindi centrifugare a impulsi Trasferire 2 8
62. aconi da 250 ml con pi acqua da laboratorio rispetto alla quantit di reagenti presenti all inizio della corsa per assicurare che i pescanti siano sciacquati b Sesi stanno lavando posizioni cluster caricare dieci provette da 15 ml con 10 ml da acqua da laboratorio c Caricare i flaconi e le provette sullo strumento nel rack appropriato dei reagenti 4 Rimuovere la cella a flusso dal piano della cella a flusso e metterla da parte Questa stessa cella a flusso sar ricaricata prima di avviare il lavaggio dello strumento NOTA Le guarnizioni non dovrebbero essere cambiate durante le fasi di lavaggio con NaOH e del secondo lavaggio dovrebbero essere tenute installate fino al completamento della corsa di sequenziamento Installare sempre nuove guarnizioni dei collettori prima di eseguire un lavaggio di manutenzione dello strumento 5 Assicurarsi di indossare i guanti protettivi e rimuovere le guarnizioni anteriore e posteriore Applicare una leggera pressione con il dito su un lato della guarnizione L altro lato salter fuori Utilizzare delle pinzette per afferrare e rimuovere ciascuna guarnizione Figura 48 Rimozione delle guarnizioni usate dei collettori Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 q q 9 0 uaun s 0jjep suorizuanueu Ip o Bbene un ip auolizn9asy Procedure post corsa 6 Posizionare due nuove guarnizioni negli alloggiamenti sul lato anteriore e posteriore del supporto della cella a flusso 7 Caricare la cella
63. agente a 1 000 rpm giri min per un minuto Riporre a temperatura ambiente N codice 15023355 Rev K ITA Preparazione HP3 per corse a singola indicizzazione 1 DD 0 A Q Capovolgere la provetta di HP3 cinque volte per miscelare il reagente e quindi centrifugare a impulsi Trasferire 3325 ul di PW1 in una provetta conica Sarstedt da 15 ml e aggiungere 175 ul di HP3 Capovolgere la provetta cinque volte per miscelare il reagente Etichettare la provetta di HP3 diluito come Reagente n 18 Centrifugare a 1 000 rpm giri min per un minuto Riporre a temperatura ambiente Preparazione HP3 per corse a doppia indicizzazione DD 0 A Q NOTA AI fine di preparare HP3 sufficiente per entrambe le Letture indici Index Reads di una corsa a doppia indicizzazione le istruzioni per la preparazione HP3 differiscono rispetto a quelle per le corse a singola indicizzazione Capovolgere la provetta di HP3 cinque volte per miscelare il reagente e quindi centrifugare a impulsi Trasferire 3 8 ml di PW1 in una provetta conica Sarstedt da 15 ml e aggiungere 200 ul di HP3 Capovolgere la provetta cinque volte per miscelare il reagente Etichettare la provetta di HP3 diluito come Reagente n 18 Centrifugare a 1 000 rpm giri min per un minuto Riporre a temperatura ambiente Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 81 SUOIZEZZIOIpul 19d 1 uaBea lap uoizesed ld Esecuzione di una corsa di sequenziamento Output elevato
64. agents Reagenti La schermata Reagents Reagenti registra informazioni sui reagenti utilizzati per la corsa Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 A 3 esJO9 SUOIZEINBIJUOO ayjeueyos Software HiSeq Figura 20 Schermata Reagents Reagenti in modalit Output elevato Please enter valid SBS Kit barcode or Reagents barcodes Reagent Kit ID Indexing Reagent Kit 1D SBS Kit O 200 Cycles O 50 Cycles O Custom Cycles Remaining 225 Prime SBS Reagents Reagent Kit ID ID kit reagenti inserire l ID del kit reagenti SBS dalla confezione 1 oppure dalla confezione 2 del kit SBS utilizzando lo scanner per codice a barre la tastiera oppure la tastiera di tipo touch screen Indexing Reagent Kit ID ID kit reagenti di indicizzazione inserire l ID del kit reagenti di indicizzazione utilizzando lo scanner per codice a barre la tastiera oppure la tastiera di tipo touch screen L ID del kit reagenti di indicizzazione il codice a barre del kit di reagenti utilizzato per una corsa di indicizzazione SBS Kit Kit SBS selezionare il Kit SBS che si sta utilizzando per la corsa a 200 cicli o 50 cicli o il numero di cicli che si desidera definire La selezione dell utente compila automaticamente il campo SBS Cycles Remaining Cicli SBS rimanenti secondo il numero di cicli supportato da quel kit Cycles Remaining Cicli rimanenti questo campo compilato automaticamente secondo il kit SBS che si sta utilizzando Se si sta utilizza
65. ati dai file immagine non elaborati e includono le basi identificate per ciclo Per impostazione predefinita le immagini vengono eliminate dal computer dello strumento dopo l analisi Per l analisi a valle i dati delle immagini non elaborate non sono necessari Se per una qualsiasi ragione l analisi d immagine accumula un ritardo eccessivo il software arresta la corsa di sequenziamento e pone la cella a flusso in uno stato sicuro Il sequenziamento riprende una volta che i problemi di analisi d immagine siano stati risolti Basecalling_Netcopy_complete Il trasferimento dei dati completato quando i file Basecalling_Netcopy_complete sono presenti nel livello base della cartella della corsa Deve essere presente un file generico denominato Basecalling_Netcopy_complete txt pi un file per ciascuna lettura Analisi dei dati RTA 128 Lo script configureBclToFastq pl di bcl2fastq e CASAVA v1 8 ha la capacit di convertire i file da bcl a fastq e di effettuare il de multiplexing dei dati indicizzati simultaneamente Tuttavia lo script configureBclToFastq pl di CASAVA 1 8 non compatibile con i file bcl compressi Bcl2fastq gestir la conversione bcl ed effettuer il de multiplexing sia dei file bcl compressi che non compressi N codice 15023355 Rev KITA Per l analisi di dati di output di RTA da corse di sequenziamento a doppia indicizzazione richiesto CASAVA v1 8 2 o successiva oppure bcl2fastq 1 8 3 o successiva Per maggiori in
66. ativi per un ciclo e per una tile Questi file possono essere utilizzati successivamente per l analisi su un computer che non coincide con quello dello strumento NOTA Se si sta utilizzando CASAVA v1 7 o precedente necessario convertire i file bcl al formato _qseq txt in OLB o mediante il Convertitore BCL per rendere possibile l analisi a valle Per maggiori informazioni vedere la Guida per l utente del Convertitore BCL o la Guida per l utente del Software offline Basecaller Questa fase non necessaria con CASAVA v1 8 2 o successiva File di statistica Un file di statistica Stats un file binario che contiene la statistica di identificazione delle basi per i cluster che superano il filtro Questi file sono utilizzati dal Convertitore BCL e da CASAVA v1 8 File filtro I file filtro filter sono file binari che contengono i risultati del filtro Questi file sono utilizzati dal Convertitore BCL e da CASAVA v1 8 File controllo I file controllo control sono file binari che contengono i risultati del controllo Questi file sono utilizzati dal Convertitore BCL e da CASAVA v1 8 q 3 6 N codice 15023355 Rev K ITA Immagini in miniatura thumbnail CS pu essere configurato in modo da generare immagini in miniatura thumbnail in formato jpg Si generano immagini in miniatura per ciascun ciclo e base CS raccoglie immagini da nove zone di una tile Le nove immagini sono combinate in un unica miniatura e sono u
67. azione 250 Dispense Rate Velocit di erogazione 2000 Selezionare Pump Pompa Ispezionare visivamente la cella a flusso per escludere la presenza di bolle che attraversino le corsie e di perdite vicino ai collettori Se si notano bolle eccessive verificare la presenza di ostruzioni nelle guarnizioni dei collettori e ripetere il processo a Selezionare la soluzione 6 SB2 per evitare di esaurire 1 SB2 dalla posizione 5 b Ridurre la velocit dell aspirato a 100 e pompare altri 250 ul di SB2 verso la cella a flusso Dopo aver confermato il flusso corretto selezionare Next Avanti per procedere Assicurarsi che la leva della cella a flusso sia verde e chiudere lo sportello dello scomparto della cella a flusso Confermare che le caselle di spunta Vacuum Engaged Pompa a vuoto attiva e Door Closed Sportello chiuso siano selezionate e poi selezionare Next Avanti Selezionare Start Avvio per avviare la corsa di sequenziamento Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 q O 3 OSSN J e e j9o eun IP oJuaue91es Monitoraggio di una corsa Utilizzare la schermata di panoramica della corsa per monitorare l analisi integrata sullo strumento la fluidica e l imaging Progress Bar Barra di avanzamento utilizzare la barra di avanzamento per monitorare quanti cicli sono stati completati Flow Cell Image Immagine cella a flusso utilizzare l immagine della cella a flusso per monitorare di quali corsie stato eseguito l imag
68. ca copyright o diritti secondo il diritto consuetudinario n alcun diritto similare di alcun terzo Il Software viene concesso in licenza conformemente alle condizioni del contratto Illumina Sequencing Software License Agreement fornito in un documento separato Se l utente non accetta le condizioni specificate in tale contratto Illumina non concede la licenza d uso del Software e l utente deve astenersi dall installare o utilizzare il Software Al fine di assicurare un uso sicuro e corretto dei prodotti qui descritti le istruzioni riportate in questo documento devono essere scrupolosamente ed esplicitamente seguite da personale qualificato e adeguatamente addestrato Leggere e comprendere a fondo tutto il contenuto di questo documento prima di usare tali prodotti LA LETTURA INCOMPLETA DEL CONTENUTO DEL PRESENTE DOCUMENTO E IL MANCATO RISPETTO DI TUTTE LE ISTRUZIONI IVI CONTENUTE PU CAUSARE DANNI AL PRODOTTO LESIONI PERSONALI A UTENTI E TERZI E DANNI MATERIALI ILLUMINA NON SI ASSUME ALCUNA RESPONSABILIT DERIVANTE DALL USO IMPROPRIO DEI PRODOTTI QUI DESCRITTI COMPONENTI E SOFTWARE INCLUSI O DA QUALSIASI USO DI TALI PRODOTTI NON ESPLICITAMENTE CONTEMPLATO NELLE LICENZE SCRITTE O NELLE AUTORIZZAZIONI CONCESSE DA ILLUMINA IN OCCASIONE DELL ACQUISIZIONE DEI PRODOTTI STESSI DA PARTE DEL CLIENTE SOLO A USO DI RICERCA 2013 Illumina Inc Tutti i diritti riservati Illumina IlluminaDx BaseSpace BeadArray BeadXpress cBot CSPro DASL
69. cella di flusso con cluster Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 9 Fi 1 usbes rap Bulud a ozuswesep Esecuzione di una corsa di sequenziamento Output elevato Caricamento di una cella a flusso La fase successiva consiste nel rimuovere la cella a flusso usata e nel caricare la cella a flusso che si desidera sequenziare Per caricare la cella a flusso eseguire le fasi seguenti Y v v vw Rimozione di una cella a flusso usata a pagina 98 Pulizia del vano portacella a pagina 99 Pulizia della cella a flusso a pagina 100 Caricamento della cella a flusso a pagina 101 Conferma del flusso corretto a pagina 103 Materiali di consumo forniti dall utente Panno per la pulizia delle lenti Salviette con alcol o etanolo al 70 Panno da laboratorio a bassissimo rilascio di particelle Rimozione di una cella a flusso usata 1 2 98 Aprire lo sportello dello scomparto della cella a flusso Figura 41 Leva della cella a flusso in posizione 1 Spostare lentamente la leva della cella a flusso in posizione 1 per sbloccare i collettori N codice 15023355 Rev K ITA 3 Spostare lentamente la leva della cella a flusso in posizione 0 per sbloccare la pompa a vuoto e rilasciare la cella a flusso Figura 42 Leva della cella a flusso in posizione 0 4 Sollevare la cella a flusso usata dal supporto della cella a flusso Pulizia del vano portacella 1 Indossare un nuovo paio di guanti in lattice privi di pol
70. cesso o tentare di determinare le modalit di funzionamento di questo prodotto o iv trasferire a terzi o concedere in sublicenza qualsiasi software come sopra definito o qualsiasi software di terze parti L acquirente accetta inoltre che il contenuto e le modalit di funzionamento di questo prodotto sono di propriet di Illumina e che questo prodotto include o incorpora segreti commerciali di Illumina Le condizioni e le limitazioni incluse nei presenti termini e condizioni sono condizioni di vendita negoziate e conseguentemente controllano la vendita e l utilizzo di questo prodotti da parte dell acquirente Limitazione di responsabilit NEI LIMITI CONSENTITI DALLA LEGGE IN NESSUN CASO ILLUMINA O I SUOI FORNITORI POTRANNO ESSERE RITENUTI RESPONSABILI NEI CONFRONTI DELL ACQUIRENTE O DI TERZI PER COSTI DI ACQUISIZIONE DI PRODOTTI O SERVIZI SOSTITUTIVI LUCRO CESSANTE PERDITA DI DATI O OPPORTUNIT COMMERCIALI O PER DANNI INDIRETTI SPECIALI ACCIDENTALI ESEMPLARI CONSEGUENTI O PUNITIVI DI QUALSIASI TIPO DERIVANTI O COLLEGATI A TITOLO ESEMPLIFICATIVO MA NON ESAUSTIVO CON LA VENDITA DI QUESTO PRODOTTO IL SUO UTILIZZO L ADEMPIMENTO DI ILLUMINA AI SENSI DELLA PRESENTE O CON UNO O PI DEI PRESENTI TERMINI E CONDIZIONI QUALUNQUE NE SIA LA DERIVAZIONE O LA CAUSA E INDIPENDENTEMENTE DAL TITOLO DI RESPONSABILIT CONTRATTUALE PER ILLECITO INCLUSA LA NEGLIGENZA RESPONSABILIT OGGETTIVA O ALTRO LA RESPONSABILIT TOTALE E COMPLESSIVA DI I
71. cli per un kit da 200 cicli selezionare 50 Cycles 50 cicli per un kit da 50 cicli Selezionare Used Kit Kit usato per un kit parziale e poi inserire il numero di cicli SBS rimanenti o il numero di cicli per il quale si prevede che i reagenti durino 4 NOTA Se l utente sta combinando quattro kit SBS da 50 cicli per una corsa a doppia indicizzazione selezionare Used Kit Kit usato invece di 50 Cycles 50 cicli per impostare correttamente il contatore dei cicli 5 Il campo Cycles Remaining Cicli rimanenti compilato automaticamente in base al kit SBS che si sta utilizzando Se si sta utilizzando un kit parziale inserire il numero di cicli per il quale si prevede che i reagenti durino Il software esegue un conteggio alla rovescia sul numero di cicli inserito Quando il numero di cicli comincia a essere basso il software chiede all utente di caricare reagenti freschi Per maggiori informazioni vedere Sostituzione dei reagenti durante una corsa a pagina 60 di NOTA Se si sta avviando una nuova corsa utilizzando meno di un kit completo di reagenti fare in modo di essere poi presenti nel momento in cui i reagenti saranno necessari Selezionare Prime SBS Reagents Priming reagenti SBS per eseguire il priming dei reagenti prima di avviare una corsa Eseguire sempre il priming dei reagenti prima di caricare una cella a flusso nuova 6 Selezionare Next Avanti Schermata Review Revisione Rivedere le informazioni della corsa Se
72. come segue a b e d Tirare la maniglia verso di s Abbassare la maniglia mentre la si tira verso di s Ispezionare visivamente i pescanti per assicurarsi che non si pieghino mentre si abbassano nei tappi a imbuto Rilasciare la maniglia nell alloggiamento nella parte inferiore della scanalatura Si dovrebbe sentire che la maniglia stata posizionata correttamente nell alloggiamento 10 Selezionare la casella di spunta contrassegnata come PW1 25mL loaded in Position 2 Caricato 25 ml di PWI in Posizione 2 Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 8 Q ua bea rap Bulud a ozuswesep 11 Eseguire una delle operazioni seguenti Se si sta eseguendo una corsa indicizzata selezionare Next Avanti Il software chiede all utente di caricare i reagenti per l indicizzazione Se si sta eseguendo una corsa non indicizzata chiudere lo sportello dello scomparto dei reagenti e selezionare Next Avanti Il software passa al priming dei reagenti Caricamento dei reagenti di indicizzazione Se si sta eseguendo una corsa indicizzata caricare i reagenti di indicizzazione prima di avviare la corsa 1 Prima di iniziare registrare il peso di ogni reagente sul modulo di monitoraggio del laboratorio 2 Sollevare i pescanti per il rack reagenti PE effettuando i seguenti movimenti a Tirarela maniglia verso di s b Spingere la maniglia verso l alto mentre la si tira verso di s c Rilasciare la maniglia nell alloggiamento nella part
73. corsa 0 Dati di output dell Analisi in tempo reale RTA Ln 7 a 15 74 ti n da Y YY ag n S E FFA Urga a si A eanan rl Ao A a e a E os af n sE ATA lt phi a pao ns m ti AA este E per amp sr Se nd S DH Cio eo Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 1 DT G ojoydeo Analisi in tempo reale RTA Panoramica dell Analisi in tempo reale RTA Il software integrato per l analisi primaria RTA Real Time Analysis esegue l analisi delle immagini e l identificazione delle basi e assegna un punteggio qualitativo a ciascuna base per ciascun ciclo L analisi viene eseguita durante i cicli di chimica e di imaging di una corsa di sequenziamento il che fa risparmiare tempo di analisi a valle permettendo di decidere velocemente se la corsa sta avanzando come previsto L analisi in tempo reale RTA viene eseguita automaticamente sul computer dello strumento ed configurata attraverso l interfaccia CS all inizio di una corsa NOTA Se per qualsiasi motivo l analisi RTA smette di funzionare il software riprende automaticamente l analisi durante il ciclo successivo nel punto appropriato della cella a flusso Non riavviare l applicazione manualmente Trasferimento dei dati L output di una corsa di sequenziamento costituito da un gruppo di file di identificazione delle basi qualitativamente valutate file bcl che sono gener
74. data di consegna se precedente di seguito la Garanzia hardware base Per componenti aggiornati si intendono componenti modifiche o miglioramenti apportati da Illumina all hardware precedentemente acquisito dall acquirente Illumina garantisce che i componenti aggiornati saranno conformi alle relative specifiche per un periodo di 90 giorni dalla data di installazione I componenti aggiornati non estendono la garanzia dell hardware a meno che l aggiornamento non sia stato eseguito da illumina presso i propri stabilimenti nel qual caso all hardware aggiornato spedito all acquirente si applicher la garanzia hardware di base c Esclusioni dalla garanzia Le garanzie di cui sopra non si applicano qualora la mancata conformit sia dovuta a i abuso uso improprio negligenza colpa incidente conservazione inadeguata o uso contrario alla documentazione o alle specifiche ii movimentazione installazione manutenzione o riparazione impropria a meno che eseguita da personale Illumina iii modifiche non autorizzate iv eventi di forza maggiore o v utilizzo con un articolo di terzi non fornito da Illumina a meno che la documentazione o le specifiche del prodotto indichino espressamente tale articolo come adatto per l utilizzo con il prodotto d Procedure per l applicazione della garanzia A scopo di idoneit in relazione alla riparazione o alla sostituzione in garanzia l acquirente deve i rivolgersi prontamente al Servizio assistenza Illumin
75. della cella a flusso Index Indice questa impostazione determinata dall opzione di indicizzazione selezionata Tuttavia per le corse a singola indicizzazione l utente deve obbligatoriamente specificare il nome del kit per assicurare che alla corsa sia applicato il corretto numero di cicli di indicizzazione Per le librerie non indicizzate o a singola indicizzazione selezionare Multiplexing Primer Box Questo imposta la corsa per l esecuzione di una Lettura Indici a sette cicli Per le librerie a doppia indicizzazione selezionare TruSeq Dual Index Sequencing Primer Box Questo imposta la corsa per l esecuzione di una Lettura Indici a otto cicli Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 8 D es109 eJjep uny weed lap ojuauasu Esecuzione di una corsa di sequenziamento Output elevato NOTA Selezionare l impostazione TruSeq Dual Index Sequencing Primer Box per il sequenziamento di qualsiasi libreria a doppia indicizzazione Nextera o TruSeq HT indipendentemente dai primer di sequenziamento che saranno utilizzati per la corsa Qualsiasi altra impostazione produce una Lettura Indici con meno di otto cicli Per maggiori informazioni su quali primer di sequenziamento utilizzare per la corsa vedere Primer di sequenziamento secondo il tipo di corsa a pagina 20 c PE turnaround chemistry Chimica di inversione PE questa impostazione determinata dall ID della cella a flusso Selezionare la casella di spunta Use Existing Recipe Usa r
76. della cella a flusso sia in posizione OFF Figura 35 Leva della cella a flusso in posizione 0 3 Indossare un nuovo paio di guanti in lattice privi di polvere 4 See presente una cella a flusso utilizzata in una corsa precedente rimuoverla e metterla da parte La si pu utilizzare per verificare il corretto flusso prima di caricare la cella a flusso con cluster 5 Usando una salvietta imbevuta di alcol o un tessuto che non lasci fibre imbevuto di etanolo o isopropanolo pulire la superficie del supporto della cella a flusso fino a quando non completamente pulita x ATTENZIONE y Non far sgocciolare l alcol nei fori della pompa a vuoto o intorno ai collettori Se necessario utilizzare un panno da laboratorio a bassissimo rilascio di particelle per asciugare il piano Esecuzione di una corsa di sequenziamento Output elevato Q 2 N codice 15023355 Rev KITA 6 Ispezionare visivamente il supporto della cella a flusso per assicurarsi che sia privo di fibre e che i fori della pompa a vuoto siano privi di ostruzioni Figura 36 Posizioni dei fori della pompa a vuoto Caricamento di una cella a flusso usata 1 Sciacquare con acqua da laboratorio la cella a flusso usata Asciugarla con salviette per la pulizia delle lenti o con un panno che non lasci fibre 2 Pulire la cella a flusso usando panni imbevuti di alcol e salviette per la pulizia delle lenti NOTA Non rimuovere o sostituire le guarnizioni dei collettori in quest
77. e Aggiornate le descrizioni software a HCS v1 4 Aggiunte le informazioni seguenti e Descrizione per la verifica dell orientamento della cella a flusso e Durate approssimative delle corse per HCS v1 4 e Compatibilit della versione software e delle versioni dei kit di reagenti per diversi tipi di cella a flusso e Informazioni relative ai reagenti contenuti nel kit TruSeq SBS v3 inclusa la descrizione del flusso di lavoro alternativo per SBS v3 per il caricamento dei reagenti e Istruzioni per porre lo strumento nello stato inattivo idling Aggiornate le informazioni seguenti e Posizioni dei reagenti con i nomi dei reagenti SBS v 3 e Istruzioni per spegnere lo strumento e Aumentata la quantit d acqua richiesta per il lavaggio di manutenzione dello strumento Disponibile solo in inglese Versione iniziale Disponibile solo in inglese N codice 15023355 Rev K ITA Sommario Cronologia revisioni ie viii A OO xi Capitolo 1 Descrizione generale 0111an 1 Introduzione 2 cs ici po Ile sleale 2 Configurazione e componenti di HiSeq 4 Panoramica sequenziamento a singola indicizzazione 11 Panoramica sequenziamento a doppia indicizzazione 13 Materiali di consumo per il sequenziamento 00 17 Materiali di consumo forniti dall utente 00 0 22 Avvio del sistema HiSeq 0000
78. e a singola indicizzazione 1 2 8 Aggiungere i contenuti di quattro provette di LEN al flacone di ICB 200 Sciacquare ciascuna provetta di LEN con ICB 200 per assicurarsi che tutto l LFN sia trasferito Aggiungere il contenuto di una provetta di EDP 200 al flacone di miscela ICB LEN Sciacquare la provetta di EDP 200 con miscela ICB LEN per assicurarsi che tutto l EDP sia trasferito Tappare il flacone e capovolgere delicatamente diverse volte per miscelare Mettere da parte su ghiaccio fino a quando non si pronti a caricare i reagenti sullo strumento N codice 15023355 Rev K ITA Preparazione dei reagenti per l indicizzazione Il sequenziamento con indicizzazione richiede reagenti di indicizzazione basati sul tipo di librerie che si stanno sequenziando e sul numero di Letture Indici da eseguire Tutti i tipi di librerie richiedono HP3 e HT2 che sono forniti nel kit TruSeq Cluster Le librerie Nextera a doppia indicizzazione richiedono primer addizionali per sequenziamento forniti nella confezione TruSeq Dual Index Sequencing Primer Box Per il sequenziamento su una cella a flusso unidirezionale utilizzare il kit unidirezionale single read per il sequenziamento su una cella a flusso bidirezionale utilizzare il kit bidirezionale paired end Le librerie TruSeq HT a doppia indicizzazione richiedono HP9 primer Lettura Indice 2 contenuto nella confezione TruSeq Dual Index Sequencing Primer Box Single Read nel caso si eseg
79. e della tile un numero di quattro cifre che codifica la posizione sulla cella a flusso La prima cifra codifica la superficie 1 per la superficie superiore 2 per la superficie inferiore La seconda cifra codifica la striscia 1 per la prima striscia 2 per la seconda striscia 3 per la terza striscia solo sulla cella a flusso v3 4 NOTA Una striscia una colonna di tile Sono utilizzate due strisce per corsia per superficie sulla cella a flusso v3 sono utilizzate tre strisce per corsia per superficie Le ultime due cifre codificano la tile da 01 a 16 con HCS v2 0 La numerazione delle tile inizia da 01 sul lato di output della cella a flusso proseguendo fino a 16 sul lato di input Figura 50 Numerazione delle tile Nome tile Superficie 1 2 07 gt Tile 1 superiore da01a16 2 inferiore I Striscia 1 prima 2 seconda 3 terza L esempio indica una tile sulla superficie superiore della cella a flusso nella seconda striscia settima tile Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 1 3 5 VU ajess odua ul s jeuy 112p Indino Ip Neg Analisi in tempo reale RTA File principali di output del sequenziamento I seguenti tipi di file di output contengono i dati dell analisi primaria generati dal software RTA Real Time Analysis File di identificazione delle basi Un file di identificazione delle basi base call bcl contiene le identificazioni delle basi e i punteggi qualit
80. e elenca la durata approssimativa di una corsa di sequenziamento Output elevato secondo la lunghezza delle letture e la versione del software dello strumento Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 TT ojenaja indino ojuauwerzuanbes jap OJOAB IP OSSNJH Esecuzione di una corsa di sequenziamento Output elevato te Formato corsa 1x36 2x50 2x100 HCS v2 0 o successive con Cella a flusso v3 Circa 2 giorni Circa 5 giorni Circa 10 giorni N codice 15023355 Rev K ITA Preparazione dei reagenti SBS La prima fase nell impostazione di una corsa prevede la preparazione dei reagenti SBS La preparazione dei reagenti richiede lo scongelamento durante la notte a una temperatura tra 2 C e 8 C o a temperatura ambiente in un bagno d acqua deionizzata per circa 90 minuti Una volta scongelati i reagenti sono pronti per l utilizzo Incorporation Mix prima dell utilizzo NOTA f I reagenti TruSeq SBS v3 rendono possibile un flusso di lavoro alternativo che prevede il caricamento di tutti i reagenti SBS all avvio di una corsa di sequenziamento bidirezionale sia per la Lettura 1 che per la Lettura 2 Nonostante nella Lettura 2 questo flusso di lavoro SBS alternativo fornisca prestazioni di sequenziamento accettabili Ilumina raccomanda per prestazioni ottimali di preparare e caricare ICB fresco all inizio della Lettura 2 Kit SBS per sequenziamento a doppia indicizzazione Un Kit SBS da 200 cicli fornisce reagenti suff
81. e relativa o iv qualsiasi pretesa oggetto di esclusione Condizioni degli obblighi di indennizzo Gli obblighi di indennizzo delle parti sono condizionali al fatto che la parte che richiede l indennizzo i informi tempestivamente la controparte in forma scritta della pretesa o dell azione relativa ii conferisca alla controparte controllo e autorit esclusivi in relazione alla difesa e alla transazione di tale pretesa o azione iii non ammetta la violazione di qualsivoglia diritto di propriet intellettuale altrui senza il preventivo consenso scritto della controparte iv non concluda alcuna transazione o compromesso relativo a qualsivoglia pretesa o azione senza il preventivo consenso scritto della controparte e infine v fornisca ragionevole assistenza alla controparte nella difesa della pretesa o azione a condizione che la parte indennizzata venga rimborsata dalla controparte per le ragionevoli spese effettivamente sostenute per fornire tale assistenza Articoli di terzi e indennizzo Illumina non ha alcun obbligo di indennizzo in relazione a qualsiasi articolo proveniente da terzi e fornito all acquirente Sono articoli di terzi quelli riportanti marchio o etichetta con il nome di N codice 15023355 Rev K ITA un terzo Gli eventuali diritti di indennizzo dell acquirente in relazione ad articoli di terzi saranno quelli previsti ai sensi degli obblighi di indennizzo del produttore o del licenziante originale Previa richiesta scritta Ill
82. e superiore della scanalatura Si dovrebbe sentire che la maniglia stata posizionata correttamente nell alloggiamento 3 Far scorrere il rack reagenti fuori dallo scomparto dei reagenti usando la maniglia del rack 4 Posizionare ciascuna provetta dei reagenti sul rack nella posizione numerata associata secondo il tipo di corsa che si sta eseguendo Tabella 4 Corsa a singola indicizzazione Posizione Reagente Descrizione 17 HP8 o HP12 Miscela primer sequenziamento Indice 1 17 18 HP3 Soluzione di denaturazione 19 HT2 Tampone di lavaggio Tabella 5 Corsa a doppia indicizzazione su una cella a flusso unidirezionale Esecuzione di una corsa di sequenziamento Output elevato Posizione Reagente Descrizione 16 HP9 Miscela primer sequenziamento SR Indice 2 15 17 HP8 o HP12 Miscela primer sequenziamento Indice 1 17 18 HP3 Soluzione di denaturazione 19 HT2 Tampone di lavaggio 9 O N codice 15023355 Rev K ITA Tabella 6 Corsa a doppia indicizzazione su una cella a flusso bidirezionale Posizione Reagente Descrizione 10 RMR Resynthesis Mix 17 HP8 o HP12 Miscela primer sequenziamento Indice 1 17 18 HP3 Soluzione di denaturazione 19 HT2 Tampone di lavaggio NOTA Posizionare le provette riempite con acqua deionizzata nelle posizioni non utilizzate del rack 5 Rimuovere i tappi da ogni provetta di reagente 6 Far scorrere il rack reagenti nello scomparto allineando il rack con la guida sulla parte inferiore dello sco
83. eagente Reagent kit ID ID kit reagente per i nuovi reagenti che si stanno caricando Il numero di cicli per i quali si prevede che i reagenti dureranno 6 O N codice 15023355 Rev K ITA NOTA 4 Sulla schermata Change Reagents Cambia reagenti la casella di spunta priming disabilitata Il priming non necessario 5 Selezionare Next Avanti per passare al caricamento dei reagenti Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 61 es409 eun Ip Buisned suorsuadsos Software HiSeq Cartelle delle corse Ciascuna corsa di sequenziamento genera una cartella della corsa che contiene i file dei dati e i file di registro Nome e percorso cartella della corsa Durante l impostazione della corsa il software chiede all utente di inserire il percorso della cartella della corsa Per impostazione predefinita alla cartella viene assegnato un nome nel seguente formato AAMMGG_ lt Nome workstation gt _ lt Numero corsa gt _ lt ID cella a flusso gt Esempio 110114 _SN106_0716_A90095ACXX Il numero della corsa viene incrementato di uno ogni volta che si esegue una corsa su un dato strumento L ID della cella a flusso inserito durante le fasi d impostazione della corsa viene aggiunto alla fine del nome della cartella della corsa La cartella della corsa scritta secondo il percorso di output specificato nella schermata Scan Scansione durante l impostazione della corsa La cartella temporanea della corsa per la cella a flusso A sc
84. ella di spunta Vacuum Engaged Pompa a vuoto attiva sia selezionata sulla schermata caricamento cella a flusso per il priming e poi selezionare Next Avanti Conferma del flusso corretto Dopo aver caricato la cella a flusso usata verificare il flusso corretto La verifica del flusso corretto conferma che la cella a flusso e le guarnizioni sono installate correttamente e che il collettore posizionato correttamente 1 Selezionare la soluzione 2 acqua da laboratorio dall elenco a tendina x ATTENZIONE Si pu usare acqua per confermare il flusso corretto solo su una cella a flusso usata Non usare mai acqua per confermare il flusso corretto su una cella a flusso con cluster 2 Confermare i valori predefiniti seguenti Volume Volume 250 Aspirate Rate Velocit di aspirazione 250 Dispense Rate Velocit di erogazione 2000 3 Selezionare Pump Pompa Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 9 5 1 jusbes lap Bulud a OQUELUEILIEI Esecuzione di una corsa di sequenziamento Output elevato 90 4 Ispezionare visivamente la cella a flusso per escludere la presenza di bolle che attraversino le corsie e di perdite vicino ai collettori Se si notano bolle eccessive verificare la presenza di ostruzioni nelle guarnizioni ridurre la velocit di aspirazione a 100 e pompare altri 250 ul di acqua nella cella a flusso Se il problema persiste rimuovere la cella a flusso ripetere le fasi di pulizia e ricaricare la cella a flusso
85. enti a b Tirare la maniglia verso di s Spingere la maniglia verso l alto mentre la si tira verso di s Rilasciare la maniglia nell alloggiamento nella parte superiore della scanalatura Si dovrebbe sentire che la maniglia stata posizionata correttamente nell alloggiamento 3 Far scorrere il rack reagenti fuori dallo scomparto dei reagenti usando la maniglia del rack 4 Rimuovere ogni flacone dal rack dei reagenti e registrare il peso sul modulo di monitoraggio del laboratorio Y NOTA Il colore dei rifiuti del reagente di sequenziamento pu apparire marrone Si potrebbe anche osservare una leggera decolorazione sui tappi a imbuto o in eventuali fuoriuscite Il cambiamento nel colore dei rifiuti non indica tossicit e non ha effetto sulle prestazioni AVVERTENZA Un componente nel kit dei reagenti cluster contiene formammide una ammide alifatica che una probabile tossina riproduttiva L inalazione l ingestione il contatto con la pelle o con gli occhi possono causare lesioni personali Lo smaltimento dei contenitori e dei contenuti non utilizzati avviene secondo gli standard di sicurezza in vigore nel proprio paese Per maggiori informazioni vedere le MSDS per questo kit all indirizzo http www illumina com msds Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 1 1 T 1 usBea lep eunzesad uoizowIy Procedure post corsa Esecuzione di un lavaggio di manutenzione dello strumento Per garantire prestazio
86. enti sufficienti per un massimo di 58 cicli Kit N di catalogo Kit TruSeq SBS v3 HS 200 cicli N di catalogo FC 401 3001 Kit TruSeq SBS v3 HS 50 cicli N di catalogo FC 401 3002 Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 q T ojuauwerizuanbes j 1ad ownsuo Ip enaze Descrizione generale NOTA Per corse di sequenziamento bidirezionali a doppia indicizzazione fino a 209 cicli totali e sufficiente un kit SBS da 200 cicli Per corse nelle quali il numero totale superi i 209 cicli come corse bidirezionali a doppia indicizzazione da 101 cicli con 225 cicli totali possibile usare quattro kit SBS da 50 cicli Per maggiori informazioni vedere Kit SBS per sequenziamento a doppia indicizzazione a pagina 73 Reagenti per indicizzazione I reagenti di indicizzazione per il sequenziamento di librerie a singola indicizzazione o di librerie a doppia indicizzazione sono forniti nel Kit TruSeq Cluster SR oppure PE Un kit fornisce reagenti sufficienti per il sequenziamento di una cella a flusso Kit N di catalogo Kit TruSeq SR Cluster v3 cBot HS N di catalogo GD 401 3001 Kit TruSeq PE Cluster v3 cBot HS N di catalogo PE 401 3001 t NOTA Per tutte le corse di sequenziamento che utilizzano librerie Nextera e per le corse a doppia indicizzazione che utilizzano librerie TruSeq HT su una cella a flusso unidirezionale sono richiesti primer di sequenziamento addizionali per le Letture Indici Per maggiori informazioni vedere Prim
87. er il priming e Priming Software HiSeq Schermata Load Reagents Caricamento reagenti La schermata Load Reagents Caricamento reagenti chiede all utente di caricare i reagenti SBS Se si specificato il numero di cicli per l indicizzazione il software chiede all utente di caricare nel rack bidirezionale i reagenti per l indicizzazione Dopo la Lettura 1 di una corsa bidirezionale il software si pone in pausa per permettere il caricamento dei reagenti bidirezionali I reagenti bidirezionali devono obbligatoriamente essere caricati prima della risintesi Lettura 2 Figura 21 Schermata Load Reagents Caricamento reagenti per una cella a flusso High Output Output elevato RUN CONFIGURATION PRE RUN SETUP INITIATE RUN Load Reagents p Load Prime Flow Cell p Prime FI O EA se 3230 j Pw1 25mL loaded in Position 2 x v CANCEL NOTA In preparazione del risciacquo post corsa alla fine di una corsa di sequenziamento importante caricare 25 ml di PW1 o di acqua da laboratorio nella posizione 2 quando si O A 6 N codice 15023355 Rev KITA L caricano i reagenti SBS all inizio della corsa Il risciacquo post corsa non sostituisce il lavaggio post corsa dello strumento Schermata Load Prime Flow Cell Caricamento cella a flusso per il priming La schermata Load Prime Flow Cell Caricamento cella a flusso per il priming chiede all utente di caricare una cella a flusso usata per eseguire la fase di pri
88. er di sequenziamento per librerie a doppia indicizzazione a pagina 19 Reagenti bidirezionali Tutte le corse di sequenziamento bidirezionali richiedono i reagenti bidirezionali forniti nel kit TruSeq PE Cluster Kit Un kit fornisce reagenti sufficienti per il sequenziamento di una cella a flusso bidirezionale Kit N di catalogo Kit TruSeq PE Cluster v3 cBot HS N di catalogo PE 401 3001 NOTA Le librerie Nextera a doppia indicizzazione richiedono il primer per sequenziamento Lettura 2 fornito nella confezione TruSeq Dual Index Sequencing Primer Box Primer TruSeq per sequenziamento a doppia indicizzazione Per maggiori informazioni vedere Primer di sequenziamento per librerie a doppia indicizzazione a pagina 19 7 8 N codice 15023355 Rev K ITA Accessori per il sequenziamento Il Kit TruSeq Cluster cBot HS contiene un kit di accessori che include i seguenti componenti utilizzati per impostare una corsa di sequenziamento sul sistema HiSeq ICB Instrument Tube un flacone da 250 ml utilizzato per la ripartizione e la preparazione dell ICB Flow Cell Gaskets quattro guarnizioni per cella a flusso da installare prima di eseguire un lavaggio di manutenzione dello strumento Funnel Caps otto tappi a imbuto utilizzati durante il caricamento dei reagenti SBS Primer di sequenziamento per librerie a doppia indicizzazione Le librerie Nextera a doppia indicizzazione e le librerie TruSeq HT a doppia indicizzazione presentano requisi
89. essamente concessi all acquirente nell ambito della presente o in violazione da parte dell acquirente dei presenti termini e condizioni iii l utilizzo di questo prodotto in combinazione con altri prodotti materiali o servizi non forniti da Illumina iv l utilizzo di questo prodotto per eseguire saggi o altri processi non forniti da Illumina o v la conformit di Illumina con specifiche o istruzioni per questo prodotto fornite da o per conto dell acquirente ciascuno dei punti da i a v viene di seguito definito come una Pretesa oggetto di esclusione Indennizzo da parte dell acquirente L acquirente dovr difendere manlevare e tenere indenne Illumina i suoi affiliati i loro collaboratori non affiliati e partner di sviluppo che abbiano contribuito allo sviluppo di questo prodotto nonch i rispettivi funzionari dirigenti rappresentanti e dipendenti da qualsiasi pretesa responsabilit danno multa penale azione legale e perdita di ogni e qualsivoglia tipo comprese a titolo esemplificativo ma non esaustivo azioni per danni a persone o decesso e violazioni di diritti di propriet intellettuale di terzi derivanti relativi o che siano originati da i violazione da parte dell acquirente di uno dei presenti termini e condizioni ii utilizzo di questo prodotto da parte dell acquirente al di fuori dell ambito di utilizzo per scopi di ricerca iii qualsiasi utilizzo di questo prodotto non conforme alle specifiche o alla documentazion
90. ficare un percorso di rete per la cartella di output della corsa La cartella di output della corsa specificata nella schermata Scan Scansione Per maggiori informazioni vedere Schermata Flow Cell Set up Impostazione cella a flusso a pagina 38 Se lo spazio su disco diventa troppo scarso per continuare la corsa necessario che l utente renda disponibile dello spazio Quando diventa disponibile sufficiente spazio su disco la corsa riprende automaticamente Il computer dello strumento HiSeq dispone di una capacit di memorizzazione di 2 7 TB per ciascuna cella a flusso che uno spazio sufficiente per una corsa da 209 cicli di una cella a flusso High Output Output elevato N codice 15023355 Rev K ITA Esecuzione di una corsa dl sequenziamento Output elevato INTO UZIONE ot e E e o do A De E 68 Flusso di lavoro del sequenziamento Output elevato 70 Preparazione dei reagenti SBS 00000 73 Preparazione dei reagenti per l indicizzazione 00 000 79 Inserimento dei parametri della corsa 0000 00000 iiio nono 12n2222n 84 Caricamento e priming dei reagenti 000000000000 aaao aaa aaao a nanana 88 Caricamento di una cella a flusso 000000000000000 oaaao oaaao aaa anaana aaan 98 Monitoraggio di una corsa 000 104 Preparazione dei reagenti per la Lettura 2 iii eee 106 Caricamento reagenti per la Le
91. fici e non vengono trasferite in caso di spostamento del prodotto ad altro impianto dell acquirente a meno che non sia Illumina a predisporre tale spostamento a Garanzia sui materiali di consumo Illumina garantisce che i materiali di consumo diversi da quelli personalizzati saranno conformi alle relative specifiche fino a i 3 mesi dalla data di spedizione da parte di Illumina o ii fino alla data di scadenza o al termine del periodo di validit indicato sul materiale di consumo da Illumina se successivo ma in ogni caso non oltre 12 mesi dalla data di spedizione Per quanto riguarda i materiali di consumo personalizzati vale a dire confezionati in base a specifiche o indicazioni dell acquirente o forniti a Illumina da o per conto dell acquirente Illumina garantisce esclusivamente che i materiali di consumo personalizzati saranno prodotti e testati in conformit con i processi standard di controllo qualit e produzione di Illumina Illumina non garantisce che i materiali consumabili personalizzati funzioneranno come previsto dall acquirente o per gli usi da lui previsti b Garanzia sull hardware Illumina garantisce che l hardware diverso dai componenti aggiornati sar conforme alle relative specifiche per un periodo di 12 mesi dalla data di spedizione da parte di Illumina a meno che non includa l installazione a opera di Illumina in tal caso il periodo di garanzia decorrer dalla data di installazione o dal 30 giorno successivo alla
92. formazioni vedere la Guida per l utente di CASAVA v1 8 n codice 15011196 Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 q P Q y LY je 1 odw 8 ul IsIJeuy p LoIULIoUEed Monitoraggio delle statistiche di durata della corsa Real Time Analysis RTA Analisi in tempo reale genera automaticamente metriche di qualit quando inizia l analisi delle immagini Non tutte le metriche sono disponibili durante i primi cicli poich per generare i dati alcuni processi richiedono cicli multipli Il sommario qui di seguito descrive i punti della corsa in corrispondenza dei quali sono disponibili le metriche Image Analysis Analisi immagini inizia dopo il ciclo 4 Il software deve prima generare una griglia con le posizioni dei cluster Al ciclo 4 il software comincia l analisi delle immagini Iy NOTA Dato che il software comincia l analisi delle immagini durante il ciclo 4 il completamento del ciclo 4 richiede molto pi tempo Il software attende che l analisi sia conclusa prima di procedere con il ciclo successivo Tale comportamento normale Phasing Estimates and Base Calls Determinazione fasi e identificazione basi il software genera le stime di fase e pre fase phasing e prephasing e base call dopo il ciclo 12 Quality Scores Punteggi qualitativi il software genera i punteggi qualitativi dopo il ciclo 25 Il software determina le letture che passano il filtro qualitativo applicando la formula Chastity sulle prime 25 basi Almeno
93. gente sul rack nella posizione numerata associata assicurandosi che l estremit conica del flacone sia posizionata nella tacca alla base del rack Esecuzione di una corsa di sequenziamento Output elevato 8 8 N codice 15023355 Rev K ITA Tabella 3 Posizioni dei reagenti SBS Posizione Reagente Descrizione 1 ICB Incorporation Mix 2 PWI 25 ml Tampone di lavaggio 3 SRE Scan Mix Reagent 4 SBS Tampone 1 SB1 High Salt Buffer 5 SBS Tampone 2 5B2 Incorporation Wash Buffer 6 SBS Tampone 2 SB2 Incorporation Wash Buffer 7 CMR Cleavage Mix Reagent 8 SBS Tampone 3 SB3 Cleavage Buffer 6 Aggiungere 25 ml di PW1 o di acqua da laboratorio al flacone nella posizione 2 NOTA HCS v2 0 e successive include un risciacquo automatico post corsa dopo il completamento della corsa di sequenziamento In preparazione del risciacquo post corsa e importante caricare 25 ml di PW1 o di acqua da laboratorio nella posizione 2 quando si caricano i reagenti SBS all inizio della corsa Il risciacquo post corsa non sostituisce il lavaggio post corsa dello strumento 7 Rimuovere il tappo da ciascun flacone di reagente e sostituirlo con un tappo a imbuto Y ATTENZIONE Dopo aver manipolato il flacone di CMR smaltire i guanti e sostituirli con un nuovo paio 8 Far scorrere il rack reagenti nello scomparto allineando il rack con la guida sulla parte inferiore dello scomparto 9 Abbassarei pescanti nei flaconi di reagente di sequenziamento
94. gini mostra un grafico delle intensit secondo il ciclo mentre la cella a flusso nella chimica e le miniature mentre la cella a flusso sottoposta all imaging Conferma report della prima base Il report della prima base un file htm che fornisce informazioni iniziali su densit cluster qualit della messa a fuoco e intensit della cella a flusso Se durante l impostazione della corsa si selezionato First Base Confirmation Conferma prima base dopo il completamento del ciclo 1 appare automaticamente la finestra di 5 A N codice 15023355 Rev KITA dialogo conferma report della prima base Per maggiori informazioni vedere Schermata Advanced Avanzato a pagina 39 Visualizzatore analisi di sequenziamento SAV Il Visualizzatore analisi di sequenziamento SAV Sequencing Analysis Viewer e un applicazione che permette di visualizzare importanti metriche di sequenziamento generate da Real Time Analysis RTA mediante grafici di dispersione diagrammi e tabelle SAV si apre automaticamente sulla pagina di analisi dopo che iniziata l analisi d immagine Le statistiche vengono aggiornate non appena sono disponibili informazioni nuove sull analisi Selezionare Refresh Aggiorna in qualunque momento durante la corsa per visualizzare metriche aggiornate mentre la corsa procede Si pu visualizzare SAV in remoto installandolo su un altro computer che abbia accesso alla posizione in rete della cartella di output della corsa
95. glioramento e applicazione di flussi di lavoro di lavaggio Timer di lavaggio che richiedono un lavaggio del sistema prima di una corsa di sequenziamento Lavaggio con acqua ogni 24 ore dal completamento dell ultimo lavaggio con acqua Lavaggio di manutenzione ogni 240 ore dal completamento dell ultimo lavaggio di manutenzione Il lavaggio di manutenzione considerato come un lavaggio con acqua in termini di timer e priorit Il software richiede all utente di eseguire i lavaggi post corsa al temine delle corse Quando si arresta una corsa HSC richiede un lavaggio se avverte che l utente non intende riprendere la corsa Complete for Run Completare per corsa L arresto di una corsa permette di riprendere la corsa senza un lavaggio del sistema N codice 15023355 Rev K ITA L avvio di una nuova corsa richiede un lavaggio Nuove opzioni per compressione BCL e il binning raggruppamento dei punteggi qualitativi per ridurre la dimensione dell ingombro dei dati Verifica fluidica pre corsa opzionale Supporto per BaseSpace con BaseSpace necessario un foglio campioni Compressione BCL e binning raggruppamento dei punteggi qualitativi come richiesto per BaseSpace Per scaricare una copia di HCS v2 0 andare alla pagina di supporto HiSeq all indirizzo http www illumina com e fare clic sulla scheda Downloads Download E necessario un login Mylllumina Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 gt T uoIzNpo u Software HiSeq
96. i ma fornisce anche richieste di informazioni da applicare al tipo di campione e al flusso di lavoro di analisi da utilizzarsi L applicazione presenta una funzione per registrare i parametri della piastra campioni ad esempio ID identificatore del campione nome del progetto doppi indici e informazioni del codice a barre Le informazioni relative alla piastra campioni vengono importate usando Experiment Manager Illumina e si possono importare nel foglio campioni i parametri della piastra campioni N codice 15023355 Rev K ITA L applicazione Experiment Manager Illumina pu essere eseguita su qualsiasi piattaforma Windows Per scaricare il software andare alla pagina di supporto Experiment Manager Illumina sul sito web Illumina support illumina com sequencing sequencing_ software experiment_manager downloads ilmn Per maggiori informazioni vedere la Guida per l utente di Experiment Manager Illumina n codice 15031335 IUoIdw EI o1 Bo INS EIIUEIOUEL Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 6 5 Software HiSeq Spazio disponibile sul disco 66 Durante la corsa al completamento dell imaging di ciascuna corsia il software verifica lo spazio disponibile sul disco locale D e E In questo momento non viene controllata la posizione della rete Se lo spazio sul disco scende al di sotto di una soglia di sicurezza il software mette in pausa la corsa e pone la cella a flusso in uno stato sicuro NOTA Illumina consiglia di speci
97. i indicizzazione sono inseriti automaticamente SBS Con HCS v2 0 e successive le versioni di kit compatibili per chimica SBS Indice e Inversione PE sono inserite come impostazione predefinita secondo l ID della cella a flusso inserita dall utente nella schermata Scan Scansione La tabella seguente elenca il nome predefinito del kit come riportato nella schermata Recipe Ricetta per ciascun tipo di cella a flusso Tipo di cella a SBS Indice Cluster e o flusso Inversione PE Cella a Flusso HiSeq Kit TruSeq Multiplex Sequencing Primer Kit TruSeq PE v3 TruSeq Box librerie a singola indicizzazione o Cluster v3 cBot SBS v3 TruSeq Dual Index Sequencing HS Primer Box librerie a doppia indicizzazione NOTA La confezione TruSeq Multiplex Sequencing Primer Box fa parte del kit TruSeq Cluster v3 I reagenti forniti in questi kit possono essere utilizzati con qualsiasi tipo di cella a flusso High Output Output elevato Index Indice Questo il nome del kit Illumina utilizzato per i reagenti di indicizzazione Existing Recipe Ricetta esistente Se si sceglie di usare per la corsa una ricetta personalizzata inserire il percorso e il nome della ricetta Altrimenti lasciare vuota questa casella di controllo Illumina raccomanda di usare la procedura guidata per costruire la propria ricetta in base alle informazioni inserite nella schermata Recipe Ricetta N codice 15023355 Rev K ITA Schermata Sample Sheet Foglio campioni
98. i sulla corsa i parametri della corsa e i file ricetta vengono aggiornati in modo da far corrispondere i cicli totali secondo l ultimo ciclo completato Poi RTA riprende per completare l analisi della corsa fino al punto in cui la corsa era stata arrestata L utente non sar in grado di riprendere la corsa Complete For Read Completare per lettura si arresta RTA Le informazioni sulla corsa i parametri della corsa e i file ricetta vengono aggiornati in modo da regolare e ridurre trim la lunghezza della lettura corrente secondo l ultimo ciclo completato Le letture seguenti non ne sono influenzate Poi RTA riprende per completare l analisi della lettura corrente Si pu riprendere la corsa all inizio della prossima lettura 4 Dopo l arresto della corsa selezionare Return to Start Ritornare all avvio sulla schermata Run Overview Panoramica corsa Si apre la schermata Welcome Benvenuto Ripresa di una corsa arrestata Si pu riprendere una corsa arrestata se la stessa era stata arrestata in sicurezza utilizzando un opzione di arresto normale unitamente a una delle opzioni RTA che permettono di riprendere la corsa 1 Dalla schermata Welcome Benvenuto selezionare Sequence Sequenzia e poi selezionare Resume Run Ripresa corsa Si apre la schermata Resume Ripresa 2 Dall elenco a discesa selezionare la cartella della corsa che si desidera riprendere Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 5 T esJo9 eun Ip OIAABI 0 S9
99. ibbene un ip suoizndasy Procedure post corsa Esecuzione di un lavaggio con acqua Eseguire un lavaggio con acqua se lo strumento rimasto inattivo per uno o pi giorni prima di avviare una nuova corsa di sequenziamento 4 NOTA HCS non permette di avviare una nuova corsa se lo strumento stato inattivo per pi di 24 ore Prima dell avvio di ogni corsa assicurarsi di aver eseguito la verifica della fluidica raccomandata nel momento in cui il software lo richiede per assicurarsi che la fluidica funzioni correttamente Materiali di consumo forniti da Illumina Acqua da laboratorio Materiali di consumo forniti dall utente Otto flaconi da 250 ml Corning n di catalogo 430776 Dieci provette coniche da 15 ml Corning n di catalogo 430052 Un provetta eppendorf con tappo flip top per ogni cella a flusso Procedura 1 4 122 Dalla schermata Welcome Benvenuto di HCS selezionare Wash Water Lavaggio Acqua Caricare lo strumento con acqua da laboratorio come segue a Riempire otto flaconi da 250 ml con 20 ml di acqua da laboratorio b Sesi stanno lavando posizioni bidirezionali caricare dieci provette da 15 ml con 10 ml da acqua da laboratorio NOTA Prima di un lavaggio con acqua non richiesta la sostituzione delle guarnizioni dei collettori Accertarsi che sia caricata una cella a flusso usata Se necessario caricare una cella a flusso usata Selezionare Next Avanti NOTA Ilumina raccomanda
100. ibrerie a doppia indicizzazione e Esempio di volumi di ICB per le corse a doppia indicizzazione IUCISIASI BIDO OUOII e Istruzioni per la preparazione dei reagenti SBS bidirezionali e di indicizzazione inclusi i primer di sequenziamento richiesti per le librerie a doppia indicizzazione e Enfatizzato l uso della versione corretta di TruSeq Dual Index Sequencing Primer Box in base al tipo di cella a flusso Disponibile solo in inglese 15023355 E Ottobre 2011 Corrette le informazioni seguenti e Durata approssimativa della corsa per corse non indicizzate e Numero di kit richiesti per corse a doppia indicizzazione incluso il numero massimo di cicli eseguiti con un kit da 200 cicli e Istruzioni per la separazione ICB per corse bidirezionali a doppia indicizzazione e Requisiti per un foglio campioni valido e Volumi di HP3 per corse indicizzate Disponibile solo in inglese 15023355 D Ottobre 2011 Aggiornate le descrizioni software a HCS v1 5 Aggiunte le istruzioni per impostare ed eseguire corse a doppia indicizzazione per le librerie Nextera Disponibile solo in inglese Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 IX N codice 15023355 15023355 15023355 Revisione C B Data Giugno 2011 Aprile 2011 Marzo 2011 Descrizione della modifica Aggiunte le istruzioni per caricare 25 ml di acqua da laboratorio alla posizione SBS 2 per il risciacquo automatico post corsa Disponibile solo in ingles
101. icetta esistente solo se si desidera usare una ricetta personalizzata Altrimenti consentire al software di creare la ricetta in base alle informazioni fornite dall utente nelle schermate di impostazione della corsa Schermata Sample Sheet Foglio campioni E NOTA Per visualizzare i risultati di indicizzazione nel Visualizzatore analisi di sequenziamento SAV essenziale che all inizio della corsa l utente carichi un foglio campioni Per riportare correttamente le informazioni di indicizzazione SAV v1 8 richiede un foglio campioni Per maggiori informazioni vedere la Guida per l utente del Visualizzatore analisi di sequenziamento n codice 15020619 Inserire il percorso oppure sfogliare e indicare un foglio campioni valido per la corsa Per le corse indicizzate il foglio campioni richiesto se si desidera che gli indici siano riportati in SAV un foglio campioni richiesto anche se si utilizza BaseSpace Selezionare Next Avanti Schermata Reagents Reagenti 86 1 Scansionare o inserire l ID del kit di reagenti possibile inserire l ID del kit dalla confezione 1 o dalla confezione 2 Per le corse indicizzate scansionare o inserire l ID del kit Indexing Reagent Reagenti di Indicizzazione Per le corse bidirezionali scansionare o inserire l ID del kit di reagenti PE o SR Selezionare il kit di reagenti SBS che si sta utilizzando per la corsa N codice 15023355 Rev K ITA Selezionare 200 Cycles 200 ci
102. icienti fino a 209 cicli di sequenziamento Per corse con un totale di pi di 209 cicli e per massimizzare l utilizzo dei reagenti per altre lunghezze di lettura si possono usare pi kit da 50 cicli La tabella che segue elenca il numero di kit richiesto per corse a doppia indicizzazione Per le corse bidirezionali a doppia indicizzazione nel numero totale di cicli sono calcolati sette cicli di sola chimica Tipo di corsa Cicli della corsa Totale dei cicli Opzione kit 1 Opzione kit 2 Kit SBS Kit SBS 200 cicli 50 cicli Bidirezionale a doppia 101 8 7 8 101 225 4 indicizzazione 93 8 7 8 93 209 1 4 76 8 7 8 76 175 1 3 51 8 7 8 51 125 1 3 36 8 7 8 36 95 1 2 Unidirezionale a doppia 101 8 8 117 1 2 indicizzazione 76 8 8 92 1 2 51 8 8 67 1 2 36 8 8 52 1 1 Riempire il contenitore di SRE e SB3 fino alla sommit Non necessario reintegrare Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 Vi 3 Sgs uabeai lap suolzeJedaJd Per maggiori informazioni vedere Panoramica sequenziamento a doppia indicizzazione a pagina 13 Scongelamento dei reagenti SBS 1 Rimuovere I SRE e il CMR dal luogo di conservazione tra 15 C e 25 C scongelare e capovolgere secondo le istruzioni indicate nella seguente tabella Nome del reagente SRE CMR Kit SBS 200 cicli Scongelare tra 2 C e 8 C per 16 ore o in bagno d acqua a temperatura ambiente per 90 minuti Capovolgere cinque volte per miscelare Lasciare su ghiaccio
103. icizzazione o di librerie TruSeq HT a doppia indicizzazione si pu utilizzare HP6 o HP10 Preparazione Lettura indici Il prodotto Lettura 1 viene rimosso e il primer di sequenziamento per l Indice 1 i7 viene appaiato annealing allo stesso filamento stampo consentendo la Lettura Indice 1 i7 Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 1 1 SUOIZEZZIOIpui ejoBuls e ojuawerzuanbeas eolueJoue y Descrizione generale Nel caso di sequenziamento a doppia indicizzazione si deve obbligatoriamente utilizzare il primer di sequenziamento fornito nella confezione TruSeq Dual Index Sequencing Primer Box HP12 che e utilizzato su cBot al posto di HP8 Nel caso di sequenziamento di librerie TruSeq LT v2 a singola indicizzazione o di librerie TruSeq HT a doppia indicizzazione si pu utilizzare HP8 o HP12 Lettura Indice 1 17 Dopo la preparazione Lettura Indici si esegue la Lettura Indice 1 i7 Nel caso di sequenziamento di librerie a singola indicizzazione la Lettura Indice consiste in sette cicli di sequenziamento Nel caso di sequenziamento di librerie a doppia indicizzazione Nextera o TruSeq HT la Lettura Indice consiste in otto cicli di sequenziamento Risintesi Lettura 2 Il prodotto della Lettura Indice viene rimosso e il filamento stampo originale utilizzato per rigenerare il filamento complementare Poi il filamento stampo originale viene rimosso per consentire l ibridazione del primer di sequenziamento Lettura 2 Nel ca
104. ie Nextera Cella a flusso unidirezionale D O N codice 15023355 Rev K ITA Tipo di corsa Librerie Nextera Cella a flusso bidirezionale Librerie TruSeq HT Cella a flusso unidirezionale Librerie TruSeq HT Cella a flusso bidirezionale Librerie TruSeq LT v2 Cella a flusso unidirezionale o Cella a flusso bidirezionale Librerie TruSeq Small RNA Cella a flusso unidirezionale o Cella a flusso bidirezionale J NOTA Lettura 1 cBot HP10 HP6 o HP10 HP6 o HP10 HP6 o HP10 HP6 o HP10 Indice 1 17 HP12 HP8 o HP12 HP8 o HP12 HP8 o HP12 HP8 o HP12 Indice 2 15 P5 innestato sulla cella a flusso HP9 P5 innestato sulla cella a flusso Lettura 2 HP11 HP7 o HP11 HP7 o HP11 HP7 o HP11 Le librerie TruSeq HT sono librerie a doppia indicizzazione Le librerie TruSeq LT sono librerie a singola indicizzazione e includono librerie preparate con kit TruSeq v2 Compatibilit versione e requisiti Per prestazioni e risultati ottimali della corsa usare sempre versioni compatibili dei materiali di consumo di sequenziamento e del software Tipo di corsa Sequenziamento a doppia indicizzazione Versione del kit di reagenti Kit TruSeq Cluster v3 cBot HS con cella a flusso v3 Kit TruSeq SBS v3 HS TruSeq Dual Index Sequencing Primer Box SR oppure PE Software di controllo HiSeq HCS v1 5 o successiva Software di controllo HiSeq HCS v1 4 o successiva HCS v1 4
105. ifica della fluidica chiede all utente di confermare il flusso corretto prima di inziare la corsa di sequenziamento 5 O N codice 15023355 Rev K ITA Per una verifica della fluidica su una cella a flusso con cluster SB2 deve obbligatoriamente essere selezionato Utilizzare i valori preimpostati di volume velocita di aspirazione e velocit erogazione Se si deve ripetere la verifica della fluidica alternare tra la posizione 5 e la posizione 6 Figura 26 Schermata Fluidics Check Verifica della fluidica per una cella a flusso High Output Output elevato RUN CONFIGURATION PRE RUN SETUP INITIATE RUN Load Seq Flow Cell gt gt CloseDoor gt Sequence Please check the fluidics and press next to continue Solution 5 SB2 Incorporation Butfo Volume 250 E Aspirate Rate 250 a Dispense Rate 2000 a essorscata 60060 6006 Schermata Close Door Chiusura sportello La schermata Close Door Chiusura sportello chiede di chiudere lo sportello dello scomparto delle celle a flusso Il sistema conferma che la pompa a vuoto posizionata correttamente e che lo sportello dello scomparto delle celle a flusso chiuso Quando il sistema pronto le caselle di spunta sono selezionate automaticamente Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 5 ESIOO BSP DIANE IP aJeuayos Software HiSeq Figura 27 Schermata Close Door Chiusura sportello RUN CONFIGURATION PRE RUN SETUP INITIATE RUN Load Seq Flow Cell Fluidics
106. illumina Guida per l utente del sistema HiSeg 1000 A A rr 11 iliiV kkkKkktkbh photo GATAACAGTAACACA AACCTT TTACTTGTTGATCCACTGATTCAAG SI CCGTATCAATTGAGACTAAATATT TACCATTAAGAGCTACCGTCTICTGTIAACCTIAAGATTACTTGATCCACTGATTCAA CCGT CACTGATTCAACGT ACCAA AAA TTM OCACTGAICAACOTACOON AACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGT NOEN AAGAGCTACCGTCTICTGT T KAA AAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGT ACT TARCGA O ei GATAACAGTAACACACTTI FAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACI CGTAACGAACGTATC AACGTACCA ETA CCGTCTTCTG TAGET ARATI ACTTGATCCACTGATTCAA TTGAGACTAAATATTAA CET TETTAA CCTTAAGATTACTTGATCCACT GATTERAGGI ACCGIAAGGAACGTA TC AATTEAGACTAAATALTAAGGITACCATI AAGAGCTTOTGITAACCTTAAGATTI ACTIGATECACTARTTERAGGTACOGTA e occ e n GACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTACAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTA AAGAGCTACCGTGCAACGACGAAAAGAA AACAGTAA GATAACAGIRACACAI CTICTGTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCA TRAGA CTA CCGTCTICTGTTAACCTTAAG AMTACITRAICCACICATTORACG Toi a OO AA AEST ACTONI COAGTOAT Sl ACTTCTGTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGAT TCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAGCTACCGTGCAACGACGAAAAGAATGAI AAAAGAATGATAACAGTAACACACTICTGTTAACCTIAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAAT TGAGACTAAATAT TAACGTACCATTAAGAGCTACC GATAACAGTAACACAC TICTGTTAAC A PAT T R SO eres A TOT CART TARE TOO RTRA TACAR GTT PARCAT AAGATTACTTI O O Se CTAAATATTAACGT ARCATE e Acc CGAAAAGAATGAT G
107. ing per quel ciclo Analysis Graph Grafico dell analisi utilizzare il grafico dell analisi per monitorare i punteggi qualitativi secondo il ciclo Images Graph Grafico delle immagini utilizzare il grafico delle immagini per monitorare le intensit secondo il ciclo Fluidics Graph Grafico della fluidica utilizzare il pulsante a freccia per espandere la sezione della fluidica e monitorare le fasi della chimica nel protocollo to Output elevato Figura 47 Schermata Run Overview Panoramica corsa ll Cycle 1 of 101 Analysis Extracted 0 Called 0 Scored 0 View Data sal ed i sequenziamen gt 020 29 20 al EJ EJ y Cycle Fluidics gt Images B na 10 zz E da P amp 04 02 dad Mon Jan 10 12 PM 1PM Cycle Configuration gt Read Type Single Read Run Read Cycles 101 Output Folder D lllumina Basecalls 110110_Velocity Simulator_0186_AHS12645 Temperature Flowcell 1 HS12645 Cycle 1 Chemistry FirstBase Incorporation Pumping Reagent IC Avanzamento della corsa Fluidica e temperatura Configurazione corsa Analisi Immagini Esecuzione di una corsa d muou gt 7 04 N codice 15023355 Rev KITA NOTA possibile che durante il funzionamento si senta un clic intermittente provenire dal lato destro dello strumento E normale I clic indicano che la pompa di condensazione sta lavorando Report della prima base La finestra di dialog
108. ini da ciascuna striscia combinate in un unica miniatura Una striscia una colonna di tile piastrine e ci sono tre strisce per Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 37 esJO9 SUOIZEINBIJUOO ayjeueyos Software HiSeq corsia per superficie Save All Thumbnails Salva tutte le miniature salva le miniature delle strisce e le miniature delle tile piastrine Save Tile Thumbnails Salva miniature delle tile questa opzione salva solo le miniature delle tile piastrine Le miniature delle tile mostrano solo la tile piuttosto che l intera striscia Schermata Flow Cell Set up Impostazione cella a flusso 38 La schermata Flow Cell Set up Impostazione cella a flusso la schermata di configurazione della corsa nella quale si registrano le informazioni relative alla corsa partendo dall ID della cella a flusso Figura 16 Schermata Flow Cell Set up Impostazione cella a flusso per una cella a flusso High Output Output elevato Please enter Flowcell ID Flow Cell ID Flow Cell Type HiSeq Flow Cell v1 5 Experiment User Name engradmin NOTA fondamentale che quando si imposta la corsa venga scansionato il codice a barre della cella a flusso o venga inserito con precisione l ID della cella a flusso Il software utilizza l ID della cella a flusso per determinare il tipo di cella a flusso e la compatibilit dei componenti Flow Cell ID ID cella a flusso inserire l ID della nuova cella a flusso Si pu in
109. ione permette a HiSeq di inviare a BaseSpace i dati della corsa e le informazioni relative alla salute del sistema Run Monitoring Only Solo monitoraggio corsa questa opzione invia a BaseSpace solo le informazioni relative alla salute del sistema N codice 15023355 Rev K ITA NOTA Per ogni corsa HiSeq tenter di inviare a BaseSpace almeno le metriche generali relative alla corsa Le metriche sono inviate anonimamente associate con HiSeq dal quale provengono e non ad un utente particolare Le metriche includono i file interoperativi che utilizza il visualizzatore SAV e i file globali quali RunInfo xml e RunParameters xml Non viene inviato nessun file di dati a meno che l utente non abbia indicato questa opzione I permessi per questa funzione sono attivati come predefiniti e Illumina raccomanda di lasciarli attivati Per disattivare i permessi selezionare Menu Tools Options Menu Strumenti Opzioni e quindi deselezionare Send system health information to Illumina to aid technical support Invia informazioni sulla salute del sistema per aiutare il supporto tecnico Illumina possibile visualizzare i termini nella finestra di dialogo Options Opzioni Se i permessi per questa funzione non sono attivati HCS richiede di accettare i Terms and Conditions Termini e condizioni Se i termini e le condizioni non vengono accettate non possibile utilizzare BaseSpace Se non si utilizza BaseSpace tornare alla schermata precede
110. izzare per l intera corsa i primer di sequenziamento della confezione TruSeq Dual Index Sequencing Primer Box ojuauwerizuanbes j 1ad ownsuo Ip enaze Una confezione TruSeq Dual Index Sequencing Primer Box fornisce reagenti sufficienti per il sequenziamento di una cella a flusso Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 q 9 Descrizione generale Nome del kit N di catalogo TruSeq Dual Index Sequencing Primer Box N di catalogo FC 121 1003 Single Read TruSeq Dual Index Sequencing Primer Box N di catalogo PE 121 1003 Paired End Contenuto confezione primer per doppia indicizzazione unidirezionale Nome del reagente Conservazione Descrizione HP10 da 15 C a 25 C Miscela primer sequenziamento Lettura 1 HP12 da 15 C a 25 C Miscela primer sequenziamento Indice 1 i7 HP9 da 15 C a 25 C Miscela primer sequenziamento Indice 2 i5 Contenuto confezione primer per doppia indicizzazione bidirezionale Nome del reagente Conservazione Descrizione HP10 da 15 C a 25 C Miscela primer sequenziamento Lettura 1 HP12 da 15 C a 25 C Miscela primer sequenziamento Indice 1 i7 HP11 da 15 C a 25 C Miscela primer sequenziamento Lettura 2 Primer di sequenziamento secondo il tipo di corsa La seguente tabella elenca i primer di sequenziamento richiesti secondo il tipo di libreria e il tipo di cella a flusso Tipo di corsa Lettura 1 cBot Indice 1 Indice 2 i5 Lettura 2 i7 Librer
111. l intera procedura di impostazione dei parametri della corsa caricamento e priming dei reagenti caricamento della cella a flusso esecuzione delle verifiche della fluidica e avvio della corsa Resume Run Ripresa corsa il software guida l utente lungo l intera procedura di scelta della cartella della corsa esistente e di impostazione dei parametri per la ripresa della corsa Wash Lavaggio selezionare Wash per avviare il lavaggio dello strumento Dal pulsante Wash l utente pu avviare un Water Wash Lavaggio con acqua o un Maintenance Wash Lavaggio di manutenzione Figura 12 Opzioni del comando Wash Lavaggio Water Wash Lavaggio con acqua il lavaggio con acqua fa scorrere acqua nel sistema Si raccomanda un lavaggio con acqua prima dell avvio di una nuova corsa o se il sistema rimasto inattivo per un giorno o pi Per maggiori informazioni vedere Esecuzione di un lavaggio con acqua a pagina 122 Maintenance Wash Lavaggio di manutenzione il lavaggio di manutenzione fa scorrere nel sistema acqua poi NaOH e poi acqua Questo lavaggio raccomandato dopo ogni corsa di sequenziamento Per maggiori informazioni vedere Esecuzione di un lavaggio di manutenzione dello strumento a pagina 118 Check Controllo selezionare Check per aprire la schermata di verifica della fluidica e per confermare il flusso corretto durante l installazione dello strumento o la risoluzione dei problemi della fluidica Per maggiori informazioni vedere
112. la PI per applicazioni specifiche Illumina non garantisce in alcun modo che gli usi specifici previsti dall acquirente non violino i diritti di propriet intellettuale di terzi o la PI per applicazioni specifiche Disposizioni normative Questo prodotto non stato autorizzato o approvato da parte della FDA statunitense o di qualsiasi altro ente normativo nazionale o estero per qualsiasi uso specifico di ricerca commerciale diagnostico o diverso Questo prodotto etichettato Solo per l utilizzo a scopo di ricerca L acquirente deve assicurarsi di disporre delle eventuali autorizzazioni di legge necessarie per gli usi previsti di questo prodotto Utilizzi non autorizzati L acquirente accetta quanto segue a di utilizzare ogni materiale di consumo solo una volta e b di utilizzare esclusivamente materiali di consumo reagenti Illumina in combinazione con l hardware Illumina Le limitazioni di cui ai punti a b non si applicano se la documentazione o le specifiche di questo prodotto indicano altrimenti L acquirente concorda di non intraprendere alcuna delle seguenti attivit e di non autorizzare terzi a farlo i disassemblare eseguire il reverse engineering il reverse compiling o il reverse assembling di questo prodotto ii separare estrarre o isolare componenti di questo prodotto o sottoporre questo prodotto o suoi componenti a qualsiasi analisi non espressamente autorizzata nella documentazione di questo prodotto iii ottenere l ac
113. lizzare l ICB 1 SB1 l SB2 e l 5B3 direttamente dal luogo di conservazione tra 2 C e SUE 7 Registrare sul modulo di monitoraggio del laboratorio il numero del lotto di ciascun reagente Preparazione ICB Preparare l ICB secondo il tipo di corsa e il formato del kit che si sta utilizzando Per corse non indicizzate o a singola indicizzazione che impiegano un kit da 200 cicli vedere Preparazione ICB per Lettura 1 kit da 200 cicli a pagina 76 e Preparazione ICB per Lettura 2 kit da 200 cicli a pagina 110 Per corse non indicizzate o a singola indicizzazione che impiegano un kit da 50 cicli vedere Preparazione ICB per 58 cicli kit da 50 cicli a pagina 76 Per corse a doppia indicizzazione vedere Preparazione ICB per corse a doppia indicizzazione a pagina 77 Per corse non indicizzate o a singola indicizzazione che impiegano il flusso di lavoro alternativo per i reagenti SBS v3 vedere Preparazione ICB per Lettura 1 e Lettura 2 kit da 200 cicli a pagina 78 J NOTA Quando si prepara l ICB capovolgere delicatamente il flacone di ICB per miscelare Per prestazioni ottimali verificare che la temperatura dell ICB rimanga sotto gli 8 C Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 v 5 Sgs jua6es lap suolzeJedaJd Esecuzione di una corsa di sequenziamento Output elevato 16 Preparazione ICB per Lettura 1 kit da 200 cicli Per la preparazione di ICB per una corsa non indicizzata o a singola indicizzazione con un massimo di 2
114. lo per gli occhi a causa dei riflessi dei fasci di luce diretti e diffusi Evitare l esposizione diretta o riflessa alle radiazioni dei laser di Classe 4 su occhi o pelle I laser di Classe 4 possono causare la combustione di materiale infiammabile e provocare bruciature o lesioni serie alla pelle causate dall esposizione diretta Non operare lo strumento se un qualsiasi pannello rimosso Quando lo sportello anteriore dello strumento aperto il raggio laser bloccato tramite interruttori di 8 N codice 15023355 Rev K ITA interblocco di protezione Se lo strumento viene fatto funzionare con un qualsiasi pannello rimosso si rischia l esposizione diretta o riflessa alla luce del laser Figura 4 Avvertenza per il laser di Classe 4 Precauzioni per il laser dello scanner per codice a barre Con il sistema di sequenziamento HiSeq e incluso uno scanner per codice a barre manuale che contiene un laser di Classe 2 Lo scanner per codice a barre un prodotto laser di Classe 2 Non fissare il fascio di luce visibile dello scanner per codice a barre Marchi di conformit e normativi Lo strumento HiSeq etichettato con i seguenti marchi di conformit e normativi Marchio Significato Questa etichetta assicura che il prodotto conforme ai requisiti di tutte le C direttive UE rilevanti Questa etichetta assicura che il prodotto conforme ai requisiti della normativa cinese ROHS Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 9
115. lu indica che lo strumento in esecuzione l arancione indica che lo strumento necessita attenzione e il verde indica che lo strumento pronto a iniziare la corsa successiva A N codice 15023355 Rev KITA Figura 1 Scomparti principali del sistema HiSeq 1000 HiSeq 1000 illumina Modulo ottica Scomparto della cella a flusso Scomparto della fluidica Barra di stato Mmouou gt Scomparto dei reagenti Per impostare una corsa di sequenziamento nel sistema HiSeq necessario accedere allo scomparto dei reagenti e a quello della cella a flusso Scomparto dei reagenti Lo scomparto dei reagenti un ampio vano refrigerato per i reagenti che contiene due rack reagenti uno per i reagenti SBS e uno per i reagenti bidirezionali paired end Le maniglie dei pettini di aspirazione abbassano i pescanti nei flaconi di reagente in ciascun rack Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 5 b3SIH Ip USuoduoJ suorzeImbyuoo Descrizione generale Figura 2 Scomparto dei reagenti A Maniglie B Rack per reagenti bidirezionali o per l indicizzazione C Rack reagenti SBS Rack reagenti SBS il rack reagenti SBS posizionato all estrema destra contengono flaconi conici da 250 ml Il rack reagenti dispone di posizioni numerate che corrispondono ai collegamenti sulla pompa della fluidica Rack reagenti bidirezionali il rack reagenti bidirezionali che si trova a sinistra rispetto al rack SBS contiene provette co
116. ming Dopo il caricamento di una cella a flusso usata confermare che la pompa a vuoto sia posizionata correttamente 4 NOTA Illumina consiglia di usare la cella a flusso proveniente da una corsa precedente per il priming dei reagenti per una corsa successiva o per un lavaggio di manutenzione post corsa Figura 22 Schermata Load Prime Flow Cell Caricamento cella a flusso per il priming per le celle a flusso High Output Output elevato RUN CONFIGURATION PRE RUN SETUP INITIATE RUN Load Reagents gt Load Prime Flow Cell Prime Fluidics Check Prime Please load a non sequencing flow cell and engage the vacuum on the flow i ell holder i Do not close the instrument door until prompted to do so vi Vacuum Engaged x ji dd CANCEL HELP NEXT Schermata Prime Fluidics Check Verifica fluidica per il priming La schermata Prime Fluidics Check Verifica fluidica per il priming chiede all utente di confermare il flusso corretto prima di eseguire il priming dei reagenti Selezionare Pump Pompa per avviare la verifica della fluidica Da questa schermata possibile sospendere o annullare la verifica della fluidica Selezionare Pause Pausa per sospendere temporaneamente la verifica della fluidica Il pulsante Pause Pausa cambia diventando Resume Ripresa Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 47 esJO9 9 1d IUOIZE SOCUWI yewayog Software HiSeq Selezionare Resume Ripresa per continuare Selezionare Stop Ar
117. mparto 7 Abbassarei pescanti nelle provette sul rack reagenti PE come segue a b e d Tirare la maniglia verso di s Abbassare la maniglia mentre la si tira verso di s Ispezionare visivamente i pescanti per assicurarsi che non si pieghino mentre si abbassano nelle provette Rilasciare la maniglia nell alloggiamento nella parte inferiore della scanalatura Si dovrebbe sentire che la maniglia stata posizionata correttamente nell alloggiamento 8 Chiudere lo sportello dello scomparto dei reagenti 9 Selezionare Next Avanti per passare a Priming dei reagenti a pagina 91 Priming dei reagenti Eseguire le fasi seguenti per il priming dei reagenti Pulizia del vano portacella a pagina 92 Caricamento di una cella a flusso usata a pagina 93 Conferma del flusso corretto a pagina 95 Priming dei reagenti a pagina 96 Materiali di consumo forniti dall utente Panno per la pulizia delle lenti Salviette con alcol o etanolo al 70 Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 9 1 uabea rap Bulud a OJUSUUB OLEO Panno da laboratorio a bassissimo rilascio di particelle Cella a flusso usata Pulizia del vano portacella 1 Aprire lo sportello dello scomparto della cella a flusso q ATTENZIONE Non porre liquidi sullo sportello dello scomparto della cella a flusso o sul piano della cella a flusso quando lo sportello aperto Fuoriuscite di liquido in quest area possono danneggiare lo strumento 2 Assicurarsi che la leva
118. ndo un kit parziale inserire il numero di cicli per il quale si prevede che i reagenti durino Il software esegue un conteggio alla rovescia sul numero di cicli inserito Quando il numero di cicli comincia a essere basso il software chiede all utente di caricare reagenti freschi Per maggiori informazioni vedere Sostituzione dei reagenti durante una corsa a pagina 60 NOTA Se si sta avviando una nuova corsa utilizzando meno di un kit completo di reagenti fare in modo di essere poi presenti nelmomento in cui i reagenti saranno necessari Prime SBS Reagents Priming reagenti SBS selezionare questa casella di controllo per il priming dei reagenti prima di avviare la corsa Eseguire sempre il priming dei reagenti prima di caricare una cella a flusso nuova N codice 15023355 Rev K ITA Schermata Review Revisione La schermata Review Revisione elenca le informazioni inserite dall utente per la corsa Se e necessario modificare degli inserimenti selezionare Back Indietro esJO9 SUOIZEINBIJUOO ajeueyos Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 A 5 Schermate impostazioni pre corsa Dopo l inserimento delle informazioni richieste nelle schermate di configurazione della corsa si aprono le schermate delle impostazioni pre corsa Le schermate delle impostazioni pre corsa includono Load Reagents Load Prime Flow Cell Prime Fluidics Check e Prime Caricamento reagenti Caricamento cella a flusso per il priming Verifica della fluidica p
119. ne di una corsa di sequenziamento Output elevato Los Rimuovere la mano dalla cella a flusso prima di posizionare l interruttore della pompa a 1 vuoto Questo previene una possibile perdita di allineamento nel tempo 3 Spostare lentamente la leva della cella a flusso in posizione 1 per attivare la pompa a vuoto e assicurare la cella a flusso in posizione Quando la leva della cella a flusso verde la pompa a vuoto posizionata correttamente Figura 45 Leva della cella a flusso in posizione 1 4 Attendere circa cinque secondi quindi spostare lentamente la leva della cella a flusso nella posizione 2 Quando la leva della cella a flusso verde fisso i collettori sono in posizione e la cella pronta per l uso Figura 46 Leva della cella a flusso in posizione 2 q O D N codice 15023355 Rev K ITA 5 Assicurarsi che la casella di spunta Vacuum Engaged Pompa a vuoto attiva sia selezionata sulla schermata di caricamento della cella a flusso di sequenziamento Conferma del flusso corretto Dopo aver caricato la cella a flusso verificare il flusso corretto utilizzando la schermata di verifica della fluidica La verifica del flusso corretto conferma che la cella a flusso e le guarnizioni sono installate correttamente e che il collettore posizionato correttamente 1 2 Selezionare la soluzione 5 5B2 dall elenco a tendina Inserire i valori predefiniti seguenti Volume Volume 250 Aspirate Rate Velocit di aspir
120. ng 62 risultati dell analisi 133 RunInfo xml 62 134 S SAV 55 105 131 schermata Flow Cell Set up Impostazione cella a flusso 38 schermata Reagents Reagenti 43 schermata Recipe Ricetta 84 schermata Review Revisione 45 schermata Run Overview Panoramica corsa 53 104 schermata Sample Sheet Foglio campioni 43 schermata Scan Scansione 84 schermata Storage Archiviazione 35 scomparto dei reagenti 4 5 117 scomparto della cella a flusso 4 6 91 scomparto fluidica 4 sequenziamento a indicizzazione reagenti caricamento 90 sequenziamento bidirezionale reagenti caricamento 111 singola indicizzazione panoramica 11 software Analisi in tempo reale RTA 26 compatibilit delle versioni 21 durata della corsa 71 Experiment Manager 64 info su versione 28 inizializzazione 23 inizializzazione manuale 28 mostrare file di registro 28 risoluzione dei problemi 141 RTA analisi in tempo reale 128 Software di controllo HiSeq 26 66 visualizzare a schermo intero 28 Visualizzatore analisi di sequenziamento SAV 26 Software di controllo HiSeq 26 Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 Software di controllo HiSeq HCS 66 spazio su disco verifica 66 spegnimento strumento 125 status xml 62 striscia 35 suono con clic 104 suono con clic 104 T tappi a imbuto 19 trasferimento dati 128 V verifica fluidica 142 Visualizzatore analisi di sequenziamento SAV 26 55 105 131 147 Ipul Indice 148
121. ni ottimali dello strumento eseguire un lavaggio di manutenzione dello strumento in base alla programmazione seguente Ogni 10 giorni Dopo ogni corsa di sequenziamento Cambiare la guarnizione al momento del lavaggio di manutenzione Il lavaggio di manutenzione composto da tre fasi di lavaggio First water wash Primo lavaggio con acqua lava il sistema con acqua da laboratorio NaOH wash Lavaggio con NaOH lava il sistema con NaOH Final water wash Lavaggio finale con acqua lava il sistema con acqua da laboratorio per rimuovere lo NaOH Posizioni Tempo di esecuzione approssimativo per fase Otto posizioni SBS 20 minuti Otto posizioni SBS e dieci posizioni 60 minuti cluster Materiali di consumo forniti dall utente Salviette imbevute di etanolo 24 flaconi 250 ml Coming n di catalogo 430776 otto flaconi per fase di lavaggio 30 provette 15 ml Corning n di catalogo 430052 dieci provette per fase di lavaggio Acqua da laboratorio 1 N NaOH 3 provette eppendorf per cella a flusso per le fasi di lavaggio della stazione di caricamento campioni Primo lavaggio con acqua 1 Dalla schermata Welcome Benvenuto di HCS selezionare Wash Maintenance Lavaggio Manutenzione q q 8 N codice 15023355 Rev K ITA 2 Selezionare Yes S per lavare le posizioni dei reagenti PE Altrimenti selezionare No No Selezionare Next Avanti per procedere 3 Caricare lo strumento con acqua da laboratorio come segue a Riempire otto fl
122. niche da 15 ml contenenti i reagenti bidirezionali e i reagenti per l indicizzazione Vano refrigerato per i reagenti progettato per mantenere i reagenti a una temperatura di 4 C Questo vano refrigerato non pensato per il raffreddamento dei reagenti Pertanto i reagenti devono essere raffreddati prima di essere caricati sullo strumento Scomparto della cella a flusso Lo scomparto della cella a flusso contiene il piano portacelle la stazione termica la pompa a vuoto e le connessioni della fluidica alla cella a flusso La cella a flusso posizionata sul piano portacelle che si sposta dentro e fuori il modulo ottica La cella a flusso posizionata nel vano portacella con le porte di ingresso e di 6 N codice 15023355 Rev K ITA uscita rivolte verso il basso ed e tenuta in posizione da una pompa a vuoto La pompa a vuoto e controllata da una leva illuminata davanti al vano portacella La leva della cella a flusso diventa verde quando la pompa a vuoto e posizionata correttamente Figura 3 Piano portacelle A Cella a flusso B Leva della cella a flusso Fusibili Solo i tecnici di assistenza FSE Illumina sono qualificati per la sostituzione dei fusibili interni Il modulo di ingresso alimentazione include due fusibili di ingresso sulle linee di ingresso ad alta tensione Questi fusibili sono della dimensione 5 mm x 20 mm e sono del tipo 10 A 250 V c a slow blow Cavi di alimentazione HiSeq dotato di un connettore
123. non ha la necessit di ricorrere a questa funzione Il software sospende la corsa automaticamente prima delle Lettura 2 Output elevato per consentire il caricamento dei reagenti Software HiSeq 1 Dalla schermata Run Overview Panoramica corsa selezionare Pause Pausa Si apre il menu Pause Pausa Figura 34 Opzioni Pausa Normal Pause Change Reagents 2 Selezionare Normal Pause Pausa normale 3 Selezionare Yes S per confermare il comando pausa Il software conclude il comando corrente per la chimica o per l imaging e pone la cella a flusso in uno stato sicuro 4 Selezionare Resume Ripresa quando si pronti a riprendere la corsa Sostituzione dei reagenti durante una corsa Se si iniziata una corsa con un volume di reagenti solo parziale utilizzare la funzione Change Reagents Cambia reagenti per mettere in pausa la corsa e riempire i reagenti Per caricare reagente fresco prima della Lettura 2 non necessario mettere in pausa la corsa a quel punto il software mette automaticamente in pausa la corsa 1 Dalla schermata Run Overview Panoramica corsa selezionare Pause Pausa Si apre il menu Pause Pausa 2 Selezionare Change Reagents Cambia reagenti 3 Selezionare Yes S per confermare il comando pausa Il software conclude il comando corrente per la chimica o per l imaging e pone la cella a flusso in uno stato sicuro 4 Sulla schermata Reagent Reagente inserire i seguenti parametri del r
124. nte e assicurarsi che l opzione BaseSpace sia deselezionata In caso contrario il pulsante Next Avanti non sar attivato Save to an output folder Salva su una cartella di output inserire il percorso della cartella della corsa che la destinazione di tutti i file di output Illumina raccomanda di specificare un percorso di rete per la cartella della corsa Per maggiori informazioni vedere Cartelle delle corse a pagina 62 Zip BCL files Comprimere file BCL permette di ridurre l ingombro di spazio su disco necessario per la corsa Se si utilizza BaseSpace i file vengono compressi come opzione predefinita Bin OScores Bin Raggruppamento dei punteggi qualitativi permette di ridurre l ingombro di spazio su disco necessario per la corsa Questo grazie al raggruppamento dei punteggi qualitativi su un pi ampio intervallo di valori Per i dettagli tecnici su come la risoluzione dei dati dei punteggi qualitativi possono essere ridotti senza sacrificare l accuratezza del punteggio o l analisi standard e l identificazione di varianti consultare il white paper disponibile sul sito Web www Illumina com intitolato Reducing Whole Genome Data Storage Footprint Riduzione dell ingombro dei dati di archiviazione genomici Save Auxiliary Files Salva file ausiliari questa opzione permette di definire quali file di imaging saranno salvati Save All Thumbnails Salva tutte le miniature le immagini delle miniature sono una combinazione di otto immag
125. nuto PSJO9 9 J0 IUOIZE Al completamento del priming si aprono automaticamente le schermate di avvio della corsa Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 4 Q Software HiSeq Schermate di avvio della corsa Dopo che l utente ha caricato i reagenti e ne ha eseguito il priming il software apre le schermate di avvio della corsa Le schermate includono Load Sequencing Flow Cell Fluidics Check e Close Door Caricamento cella a flusso Verifica della fluidica e Chiusura sportello Schermata Load Sequencing Flow Cell Caricamento cella a flusso di sequenziamento La schermata Load Sequencing Flow Cell Caricamento cella a flusso di sequenziamento illustra le fasi per il caricamento della cella a flusso con cluster e per posizionare correttamente la pompa a vuoto Quando la pompa a vuoto posizionata correttamente il sistema seleziona automaticamente la casella di spunta Vacuum Engaged Pompa a vuoto attiva Figura 25 Schermata Load Seq Flow Cell Caricamento cella a flusso di sequenziamento per la cella a flusso High Output Output elevato RUN CONFIGURATION PRE RUN SETUP INITIATE RUN Please load the sequencing flow cell simulator and engage the vacuum on i e flow cell holder i Do not close the instrument door until prompted to do so Press Next to perform a fluidics check YA Vacuum Engaged 44 x dd BACK CANCEL HELP NEXT Schermata Fluidics Check Verifica della fluidica La schermata Fluidics Check Ver
126. o di conferma del report della prima base si apre automaticamente al completamento del primo ciclo se durante l impostazione della corsa sulla schermata Scan Scansione si era selezionato Confirm First Base Conferma prima base Il ciclo si metter in pausa a questa fase Se la casella di spunta non era stata contrassegnata la corsa continua dopo l inclusione della prima base senza chiedere di esaminare il report Per maggiori informazioni vedere Schermata Advanced Avanzato a pagina 39 1 Esaminare il report della prima base dalla finestra di dialogo First Base Report Confirmation Conferma report prima base oppure aprendo First_Base_Report htm dal livello base della cartella della corsa 2 Sei risultati sono soddisfacenti selezionare Continue Continua per continuare la corsa In caso contrario interrompere la corsa Visualizzatore analisi di sequenziamento SAV Si pu monitorare la corsa utilizzando il Visualizzatore analisi di sequenziamento SAV Sequencing Analysis Viewer che si avvia automaticamente dopo l inizio dell analisi delle immagini Per maggiori informazioni vedere Visualizzatore analisi di sequenziamento SAV a pagina 131 Per una descrizione dettagliata delle metriche disponibili e delle istruzioni d installazione vedere la Guida per l utente del Visualizzatore analisi di sequenziamento n codice 15020619 Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 q O 5 esoo eun Ip OIBBeIOHUOlN Esecuzione di una cors
127. o momento 3 Collocare la cella a flusso sul supporto con le porte di ingresso e uscita rivolte verso il basso e il codice a barre a destra La freccia sul bordo sinistro della cella a flusso indica la direzione del flusso e deve puntare verso lo strumento 4 Far scorrere delicatamente la cella a flusso verso i perni guida superiore e destro fino a quando non si blocca NOTA Rimuovere la mano dalla cella a flusso prima di posizionare l interruttore della pompa a vuoto Questo previene ogni possibile perdita di allineamento nel tempo Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 Q 3 1 jusbes lap BuluLid a ozuswesep Esecuzione di una corsa di sequenziamento Output elevato 94 Figura 37 Cella a flusso posizionata sui perni guida superiore e destro A Perno guida superiore B Perni guida destri Spostare lentamente la leva della cella a flusso in posizione 1 per attivare la pompa a vuoto e assicurare la cella a flusso in posizione Quando la leva della cella a flusso verde la pompa a vuoto posizionata correttamente Figura 38 Leva della cella a flusso in posizione 1 N codice 15023355 Rev K ITA 6 Attendere circa cinque secondi quindi spostare lentamente la leva della cella a flusso nella posizione 2 tutto a destra Quando la leva della cella a flusso verde fisso i collettori sono in posizione e la cella pronta per l uso Figura 39 Leva della cella a flusso in posizione 2 7 Assicurarsi che la cas
128. o successiva HCS v1 5 o successiva Per maggiori informazioni sulla compatibilit delle versioni visitare il sito Web Illumina all indirizzo www illumina com VersionCompatibility Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 21 o uaweizuanbaes j 1ad ownsuo Ip enaze Descrizione generale Materiali di consumo forniti dall utente 22 Materiali di consumo Materiale di consumo 1N NaOH Salviettine imbevute di alcol isopropilico al 70 oppure etanolo al 70 Provette per centrifuga 250 ml Provette coniche 15 ml Guanti monouso privi di polvere Panno da laboratorio a bassissimo rilascio di particelle Carta pulente per lenti 10x15 cm ca Acqua da laboratorio 18 M Ohm Fornitore Fornitore generico VWR n di catalogo 15648 981 Fornitore generico Corning n di catalogo 430776 Corning n di catalogo 430052 Fornitore generico VWR n di catalogo 21905 026 VWR n di catalogo 52846 001 Millipore Scopo Lavaggio di manutenzione dello strumento Pulizia della cella a flusso e del piano della cella a flusso Lavaggio di manutenzione e lavaggio con acqua dello strumento Raccolta e misura del volume degli scarti Uso generale Pulizia del vano portacella Pulizia della cella a flusso Rack reagenti SBS posizione 2 Lavaggio con acqua N codice 15023355 Rev K ITA Avvio del sistema HiSeq Per avviare il sistema HiSeq e il computer dello strumento attenersi alla procedura de
129. ontrollati o di propriet di Illumina che riguardano questo prodotto e il suo utilizzo solo in relazione ad ambito i o applicazione i specifiche La PI per applicazioni specifiche esclude ogni propriet intellettuale controllata o di propriet di Illumina relativa a elementi o caratteristiche di questo prodotto o del suo utilizzo che siano comuni a tutte le possibili applicazioni e a tutti i possibili ambiti di utilizzo di questo prodotto di seguito la PI base La PI per applicazioni specifiche e la PI base sono sottoinsiemi separati e non coincidenti nemmeno in parte di tutti i diritti di propriet intellettuale posseduti o controllati da Illumina A titolo esemplificativo ma non esaustivo i diritti di propriet intellettuale di Illumina per metodi diagnostici specifici per metodi forensi specifici o per biomarcatori del DNA sequenze o combinazioni di biomarcatori o sequenze specifiche sono esempi di PI per applicazioni specifiche Materiali di consumo indica i reagenti e i materiali di consumo a marchio Illumina destinati a essere utilizzati insieme e in combinazione con l hardware Documentazione indica il manuale per l utente Illumina per questo prodotto inclusi senza limitazioni foglietti illustrativi e altra documentazione di accompagnamento per questo prodotto o a cui il prodotto fa riferimento o nella confezione del prodotto in vigore alla data di spedizione del prodotto da Illumina La documentazione include questo documento
130. ovetta di EDP 50 con miscela ICB LFN per assicurarsi che tutto l EDP sia trasferito 5 Tappare il flacone e capovolgere delicatamente diverse volte per miscelare N codice 15023355 Rev K ITA 6 Mettere da parte su ghiaccio fino a quando non si e pronti a caricare i reagenti sullo strumento Preparazione ICB per corse a doppia indicizzazione Illumina consiglia la seguente procedura per calcolare il volume di ICB richiesto per una corsa a doppia indicizzazione Per maggiori informazioni sul numero di Kit SBS necessari per una corsa a doppia indicizzazione secondo la lunghezza della corsa vedere Kit SBS per sequenziamento a doppia indicizzazione a pagina 73 1 All inizio della corsa aliquotare ICB LFN e EDP utilizzando i seguenti volumi per ogni dieci cicli di sequenziamento da eseguire Non miscelare ICB LEN e EDP Reagente Volume per dieci cicli Conservazione ICB 4 57 ml da 2 Ca8 C LEN 0 6 ml da 15 C a 25 C EDP 0 11 ml da 15 C a 25 C Ad esempio una corsa da 101 cicli bidirezionali a doppia indicizzazione ha un totale di 225 cicli 124 cicli 101 8 7 8 per la Lettura 1 e per le Letture Indici 101 cicli per la Lettura 2 Lettura 1 e Letture Indici 124 cicli Lettura 2 101 cicli 124 cicli 10 cicli 12 4 101 cicli 10 cicli 10 e ICB 12 4 x 4 57 ml 56 9 ml e ICB 10 x 4 57 ml 45 7 ml e LFN 12 4 x 0 6 ml 7 44 ml e LFN 10 x 0 6 ml 6 ml e EDP 12 4 x 0 11 ml 1 36 ml e EDP 10 x 0 11
131. pegnimento dello strumento 0 000000000 aaa 00000 aaao a aaao a aoaaa aaau 125 3 pe dl PAS tia i lt n si A mel n nn gt e Arreme errore A o 5 A A nt si lt Sraasracas e Por a id Fia parer Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 1 7 5 y oJoydeo Procedure post corsa Introduzione 116 Le procedure post corsa includono la rimozione e la pesatura dei reagenti e il lavaggio dello strumento I lavaggi eseguiti regolarmente assicurano la continuit della resa prestazionale dello strumento per i seguenti motivi Eliminano gli eventuali residui di reagenti e campione dai tubi della fluidica e dai pescanti Impediscono l accumulo e la cristallizzazione dei sali nei tubi della fluidica e nei pescanti Impediscono la contaminazione crociata con corse precedenti NOTA Un lavaggio con acqua viene sempre eseguito al termine di ogni corsa per lavare il sistema e per controllare la fluidica HCS non permette di avviare una nuova corsa se non stato eseguito un lavaggio con acqua o un lavaggio di manutenzione richiesto entro le ultime 24 ore Ogni 10 giorni HCS richiede di eseguire un lavaggio di manutenzione indipendentemente dall ultimo lavaggio di manutenzione eseguito N codice 15023355 Rev K ITA Rimozione e pesatura dei reagenti 1 Aprire lo sportello dello scomparto dei reagenti 2 Sollevare i pescanti per il rack reagenti e il rack cluster che si sta caricando effettuando i seguenti movim
132. pioni LIMS LIMS Server Server LIMS il nome del server per l interazione con i file LIMS supportati da Illumina LIMS Username Nome utente LIMS il nome utente LIMS che HiSeq utilizzer per l autenticazione dei file LIMS Illumina LIMS Password Password LIMS la password LIMS che HiSeq utilizzer per l autenticazione dei file LIMS Illumina Send instrument health information to Illumina to aid technical support Invia informazioni sulla salute del sistema per aiutare il supporto tecnico Illumina permette allo strumento di inviare informazioni a BaseSpace per ogni corsa Tutte le informazioni saranno confidenziali Illumina raccomanda di tenere attiva questa funzione e non condivider mai queste informazioni I dati dei campioni della corsa saranno inviati solo se nella schermata Storage Archiviazione stato indicato che si desidera inviare tali dati Per maggiori informazioni vedere Schermata Storage Archiviazione a pagina 35 Opzioni della schermata di avvio 30 La schermata Welcome Benvenuto presenta le opzioni seguenti Sequence Sequenzia Wash Lavaggio Check Controllo Sequence Sequenzia selezionare Sequence per iniziare le fasi di impostazione di una corsa di sequenziamento Dal pulsante Sequence l utente pu avviare una nuova corsa O riprendere una corsa esistente N codice 15023355 Rev KITA Figura 11 Opzioni del comando Sequence Sequenzia New Run Nuova corsa il software guida l utente lungo
133. porre su ghiaccio Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 8 3 SUOIZEZZIOIpul 12d u beL lap suolzeredald Inserimento dei parametri della corsa L interfaccia del software HCS guida l utente attraverso le fasi di impostazione della corsa Dalla schermata Welcome Benvenuto del software CS selezionare Sequence New Run Sequenzia Nuova corsa Si apre la schermata Scan Scansione Schermata Flow Cell Set up Impostazione cella a flusso NOTA fondamentale che quando si imposta la corsa venga scansionato il codice a barre della cella a flusso o venga inserito con precisione l ID della cella a flusso Il software utilizza l ID della cella a flusso per determinare il tipo di cella a flusso e la compatibilit dei reagenti 1 Eseguire la scansione del codice a barre della cella a flusso o inserire l ID numero del codice a barre della cella a flusso che deve essere sequenziata 2 Confermare il tipo della cella a flusso che selezionato automaticamente secondo l ID della cella Inserire il nome dell esperimento e il nome utente 4 Selezionare la corsia contenente il controllo se applicabile Altrimenti selezionare None Nessuna 5 Selezionare Next Avanti Esecuzione di una corsa di sequenziamento Output elevato 8 4 N codice 15023355 Rev K ITA Schermata Recipe Ricetta 1 Selezionare una delle seguenti opzioni di indicizzazione No Index Nessun indice esegue una corsa non indicizzata unidire
134. re i tubi degli scarti nel flacone degli scarti Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 1 D 3 enboe uos olbb6ene un ip uoiznoesg Procedure post corsa Porre lo strumento nello stato inattivo idling 124 Se lo strumento non sar utilizzato nei dieci giorni successivi prepararlo per l inattivit Se lo strumento non sar usato per pi di dieci giorni vedere Spegnimento dello strumento a pagina 125 1 Eseguire un lavaggio di manutenzione completo per lavare completamente lo strumento Per maggiori informazioni vedere Esecuzione di un lavaggio di manutenzione dello strumento a pagina 118 2 Lasciare la cella a flusso sul piano della cella a flusso con la leva della cella in posizione 2 Questo lascia i collettori nella posizione sollevata 3 Caricare 10 ml di acqua da laboratorio in ciascuna posizione dei reagenti nei rack reagenti quindi abbassare i pescanti nell acqua 4 Lasciare lo strumento acceso 5 Quando l utente pronto per utilizzare lo strumento per un altra corsa eseguire un lavaggio con acqua Per maggiori informazioni vedere Esecuzione di un lavaggio con acqua a pagina 122 N codice 15023355 Rev K ITA Spegnimento dello strumento Spegnere lo strumento solo se rimarr inattivo per pi di dieci giorni Se lo strumento sar utilizzato entro i dieci giorni successivi vedere Porre lo strumento nello stato inattivo idling a pagina 124 Se lo strumento viene spento non necessario spegnere il
135. resto per annullare la verifica della fluidica Figura 23 Schermata Prime Fluidics Check Verifica fluidica per il priming RUN CONFIGURATION PRE RUN SETUP INITIATE RUN Load Reagents gt Load Prime Flow Cell Prime Please check the fluidics and press next to continue Solution 5 SB2 incorpora Volume 250 Aspirate Rate 250 E Dispense Rate 2000 di de 1 5 9000 Schermata Prime Priming Dalla schermata Prime Priming l utente pu monitorare la fase di priming in corso Selezionare Start Prime Avvia priming per iniziare o selezionare Skip Prime Salta priming se si gi eseguito il priming dei reagenti A 8 N codice 15023355 Rev K ITA Figura 24 Schermata Prime Priming RUN CONFIGURATION PRE RUN SETUP INITIATE RUN Load Reagents gt Load Prime Flow Cell Prime Fluidics Check Please select Start Prime to begin priming or Skip Prime to skip priming JSOdUWI 9 Je LIS YIS LI o ro LI o ro Q ro x b gt BACK CANCEL HELP Start Prime Da questa schermata possibile sospendere o annullare il priming Selezionare Pause Pausa per sospendere temporaneamente il priming Il pulsante Pause Pausa cambia diventando Resume Ripresa Selezionare Resume Ripresa per continuare Selezionare Stop Arresto per arrestare il priming Selezionare Cancel Annulla per annullare abort l impostazione della corsa e ritornare alla schermata Welcome Benve
136. rimer Seq Indice i5 P5 Grafted Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 1 3 I UIBJOUB y izuonbas e pul eiddop e ojusule Suo0IZBeZZIOl Descrizione generale 14 Lettura 1 La Lettura 1 segue il protocollo standard di sequenziamento Lettura 1 utilizzando reagenti forniti nel kit TruSeq SBS Il primer di sequenziamento Lettura 1 viene appaiato annealing al filamento stampo durante il processo di generazione dei cluster su cBot Nel caso di sequenziamento di librerie Nextera a doppia indicizzazione si deve obbligatoriamente utilizzare l appropriato primer di sequenziamento fornito nella confezione TruSeq Dual Index Sequencing Primer Box HP10 che e utilizzato su cBot al posto di HP6 Per maggiori informazioni vedere la Guida per l utente di cBot n codice 15006165_ITA Nel caso di sequenziamento di librerie TruSeq HT a doppia indicizzazione si pu utilizzare HP6 oppure HP10 Preparazione Lettura indici Il prodotto Lettura 1 viene rimosso e il primer di sequenziamento per l Indice 1 17 viene appaiato annealing allo stesso filamento stampo consentendo la Lettura Indice 1 17 Nel caso di sequenziamento di librerie Nextera a doppia indicizzazione si deve obbligatoriamente utilizzare il primer di sequenziamento fornito nella confezione TruSeq Dual Index Sequencing Primer Box HP12 che utilizzato su cBot al posto di HP8 Nel caso di sequenziamento di librerie TruSeq HT a doppia indicizzazione si pu utiliz
137. rio preparare RMR RMR utilizzato durante la Lettura Indice 2 i5 di una corsa bidirezionale a doppia indicizzazione e non utilizzato di nuovo durante la risintesi Lettura 2 Nelle corse bidirezionali non indicizzate o a singola indicizzazione RMR richiesto e utilizzato durante la fase di inversione bidirezionale Kit TruSeq PE Cluster PE Reagents Box Kit TruSeq PE Cluster PE Reagents Box Kit TruSeq PE Cluster PE Reagents Box Kit TruSeq PE Cluster PE Reagents Box Kit TruSeq PE Cluster PE Reagents Box Kit TruSeq PE Cluster PE Reagents Box TruSeq Dual Index Sequencing Primer Box Kit TruSeq PE Cluster PE Reagents Box Kit TruSeq PE Cluster PE Reagents Box AVVERTENZA Questo set di reagenti contiene formammide una ammide alifatica che una probabile tossina riproduttiva L inalazione l ingestione il contatto con la pelle o con gli occhi possono causare lesioni personali Lo smaltimento dei contenitori e dei contenuti non utilizzati avviene secondo gli standard di sicurezza in vigore nel proprio paese Per maggiori informazioni vedere le MSDS per questo kit all indirizzo www illumina com Scongelamento dei reagenti 1 Rimuovere i reagenti dal luogo di conservazione a una temperatura tra 15 C e 25 C Verificare che si stia utilizzando il primer di sequenziamento appropriato per il tipo di libreria e il tipo di corsa 2 Scongelare i reagenti in un becher riempito con acqua deionizzata a temperatura
138. ritta nell unit D e la cartella temporanea della corsa per la cella a flusso B scritta nell unit E Contenuto delle cartelle della corsa File cartelle principali First_Base_Report htm TALog txt Foglio campioni opzionale Sottocartella Livello base RunInfo xml runParameters xml Config 62 Descrizione File con metriche di base per il primo ciclo File di registro per eventi di analisi immagini Se si prevede di utilizzare CASAVA copiare il foglio campioni nel livello base della cartella della corsa Per maggiori informazioni vedere la Guida per l utente di CASAVA n codice 15011196 Identifica informazioni ad alto livello della corsa Fornisce i parametri d impostazione per la corsa Contiene una copia dei parametri software di configurazione utilizzati per la corsa N codice 15023355 Rev K ITA Sottocartella File cartelle principali Data Status htm Cartella Intensities Intensit CopyLog txt Log txt Data Cartella BaseCalls Intensities config xml Dati Intensit RTAConfiguration xml Logs Ricetta_ lt data gt _ lt ora gt log Recipe xml Thumbnail_ Immagini in miniatura Images file jpg Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 Descrizione Contiene metriche specifiche della corsa e di analisi generate durante la corsa Contiene i risultati delle analisi delle immagini Questa cartella salvata nella cartella in rete secondo il percorso lt Run Folder gt Data e all
139. scritta qui di seguito NOTA Tenere presente le seguenti prassi migliori quando si esegue l accensione e lo spegnimento del computer e durante il funzionamento del computer Non avviare il computer quando lo strumento acceso Lasciare lo strumento spento per almeno un minuto prima di accenderlo nuovamente Non spegnere mai lo strumento quando il software dello strumento in esecuzione Collegare il cavo USB dello strumento USB del monitor e USB della tastiera nella parte posteriore del server collegare lo scanner per codice a barre e il mouse nella parte anteriore del server Non usare la gestione porte per eliminare le porte Avviare il computer di controllo dello strumento Accedere al sistema operativo usando il nome utente predefinito e la password predefinita Attendere che il caricamento giunga a termine Nome utente sbsuser Password sbs123 Se i valori predefiniti non funzionano consultare il personale IT per individuare il nome utente e la password Portare l interruttore principale in posizione ON Se si sta di fronte allo strumento l interruttore si trova sul lato sinistro Attendere l inizializzazione dell unit dello strumento denominata DoNotEject Non espellere Alla conclusione dell inizializzazione dell unit si apre una finestra Chiudere la finestra NOTA Non espellere mai l unit di tipo flash denominata DoNotEject posta all interno del telaio dello strumento ed evitare di modificare i file
140. serire l ID della cella a flusso utilizzando lo scanner per codice a barre la tastiera oppure la tastiera di tipo touch screen Utilizzare lo scanner per codice a barre per assicurare l accuratezza altrimenti inserire con cura l ID della cella a flusso Flow Cell Type Tipo di cella a flusso il tipo appropriato di cella a flusso selezionato automaticamente secondo l ID della cella a flusso Il software utilizza queste informazioni per confermare la compatibilit della cella a flusso con il software dello strumento e con i componenti della corsa Per maggiori informazioni vedere Schermata Recipe Ricetta a pagina 40 N codice 15023355 Rev KITA Experiment Esperimento inserire un nome a scelta per l esperimento Il nome appare in alto in ciascuna schermata dell interfaccia per aiutare a individuare la corsa di sequenziamento in corso User Name Nome utente inserire il nome della persona che sta impostando la corsa Schermata Advanced Avanzato La schermata Advanced Avanzato include le impostazioni per la conferma della prima base e per indicare le corsie per l allineamento Figura 17 Schermata Advanced Avanzato per una cella a flusso High Output Output elevato Please check the remaining parameters and select Next to continue O Confirm First Base Control Lane None Align to PhiX Y Y Y Y Y dI Y dI O Keep Intensity Files Confirm First Base Conferma prima base selezionare la casella di controllo per
141. so di sequenziamento di librerie Nextera a doppia indicizzazione si deve obbligatoriamente utilizzare il primer di sequenziamento fornito nella confezione TruSeq Dual Index Sequencing Primer Box HP11 che utilizzato su cBot al posto di HP7 Nel caso di sequenziamento di librerie TruSeq LT v2 a singola indicizzazione o di librerie TruSeq HT a doppia indicizzazione si pu utilizzare HP7 o HP11 Lettura 2 La Lettura 2 segue il protocollo standard di sequenziamento bidirezionale utilizzando reagenti forniti nel kit TruSeq SBS N codice 15023355 Rev K ITA Panoramica sequenziamento a doppia indicizzazione for NOTA A L esecuzione di corse di sequenziamento a doppia indicizzazione richiede il Software di controllo HiSeq HiSeq Control Software HCS v1 5 o successiva Il sequenziamento a doppia indicizzazione include due Letture Indici dopo la Lettura 1 Figura 6 Sequenziamento unidirezionale a doppia indicizzazione Lettura 1 Lettura Indice 1 i7 Lettura Indice 2 15 Primer Seq mu Indice ib Indice i5 Indice i5 i HP9 Primer Lettura 1 HP6 o HP10 Indice i7 Y HP8 o HP12 Indice i7 Indice i7 Primer Seq Figura 7 Sequenziamento bidirezionale a doppia indicizzazione Lettura 1 Lettura Indice 1 i7 Lettura Indice 2 15 Lettura 2 Indice 5 Primer Primer Lettura 1 Lettura 2 HP6 o HP10 HP7 o HP11 Primer Seq m s 17 Pra nara 1 Indice i5 Indice i7 Indice i7 icli di y m pi A P
142. sono corrette selezionare Next Avanti Se necessario modificare degli inserimenti selezionare Back Indietro Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 37 es109 eJjep 11jauesed lap ojuauasu Caricamento e priming dei reagenti La fase successiva consiste nel caricamento dei reagenti di sequenziamento L interfaccia del software guida l utente attraverso il processo Caricamento dei reagenti SBS Assicurarsi che i reagenti SBS siano scongelati completamente e pronti per il caricamento sullo strumento Materiali di consumo forniti da Illumina Otto tappi a imbuto forniti nel kit TruSeq Cluster Materiali di consumo forniti dall utente Un flacone da 250 ml Corning n di catalogo 430776 Procedura 1 Registrare il peso di ciascun reagente sul modulo di monitoraggio del laboratorio NOTA La pesatura dei reagenti prima e dopo la corsa di sequenziamento conferma l erogazione appropriata del reagente 2 Aprire lo sportello dello scomparto dei reagenti 3 Sollevare i pescanti per il rack reagenti di sequenziamento effettuando i seguenti movimenti a Tirare la maniglia verso di s b Spingere la maniglia verso l alto mentre la si tira verso di s c Rilasciare la maniglia nell alloggiamento nella parte superiore della scanalatura Si dovrebbe sentire che la maniglia stata posizionata correttamente nell alloggiamento 4 Far scorrere il rack reagenti fuori dallo scomparto reagenti 5 Collocare ogni flacone di rea
143. ssibile riprendere la corsa S La corsa riprende all inizio della prossima lettura S La corsa riprende al prossimo ciclo Non possibile riprendere la corsa S La corsa riprende all inizio della prossima lettura No 1 Dalla schermata Run Overview Panoramica corsa selezionare Stop Arresto Si apre il menu Stop Arresto Figura 29 Arresto della corsa Immediate Stop Normal Stop End of Lane Chemistry Normal Stop End of Cycle 2 Selezionare una delle seguenti opzioni di arresto N codice 15023355 Rev K ITA Normal Stop End of Lane Chemistry Arresto normale fine corsia chimica arresta la corsa solo dopo il completamento del comando corrente per la chimica o per l imaging e poi pone la cella a flusso in uno stato sicuro Normal Stop End of Cycle Arresto normale fine del ciclo arresta la corsa dopo il completamento del ciclo corrente e poi pone la cella a flusso in uno stato sicuro Immediate Stop Arresto immediato arresta la corsa senza completare l operazione corrente e non pone la cella a flusso in uno stato sicuro Non possibile riprendere una corsa arrestata usando il comando Immediate Stop Arresto immediato 3 Selezionare una delle seguenti opzioni RTA Keep As Is Mantenere come si trova la corsa arrestata senza alcun cambiamento su RTA Si pu riprendere la corsa da dove la si era lasciata Complete For Run Completare per corsa si arresta RTA Le informazion
144. stampo originale utilizzato per rigenerare il filamento complementare Poi il filamento stampo originale viene rimosso per consentire l ibridazione del primer di sequenziamento Lettura 2 Nel caso di sequenziamento di librerie Nextera a doppia indicizzazione si deve obbligatoriamente utilizzare il primer di sequenziamento fornito nella confezione TruSeq Dual Index Sequencing Primer Box HP11 che utilizzato su cBot al posto di HP7 Nel caso di sequenziamento di librerie TruSeq HT a doppia indicizzazione si pu utilizzare HP7 oppure HP11 Lettura 2 La Lettura 2 segue il protocollo standard di sequenziamento bidirezionale utilizzando reagenti forniti nel kit TruSeq SBS Librerie a doppia indicizzazione Le librerie a doppia indicizzazione vengono preparate con adattatori contenenti due indici Indice 1 i7 un indice a otto basi adiacente al filamento P7 Indice 2 i5 un indice a otto basi adiacente al filamento P5 Durante la preparazione del campione fino a 12 sequenze Indice 1 univoche sono disposte a matrice secondo le colonne di una piastra a 96 pozzetti e fino a otto sequenze Indice 2 univoche sono disposte a matrice secondo le righe creando fino a 96 adattatori univocamente a doppio indice Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 q 5 SUOIZEZZIOIpul eiddop e ojuawelzuaenbas eolueJoue y Descrizione generale Librerie a doppia indicizzazione supportate Sul sistema HiSeq e supportato il sequenziamento a doppia indiciz
145. sto prodotto ma escludendo espressamente qualsiasi uso che a richiederebbe diritti o una licenza da parte di Illumina per PI per applicazioni specifiche b costituisca riutilizzo di un materiale di consumo utilizzato in precedenza c costituisca disassemblaggio reverse engineering reverse compiling o reverse assembling di questo prodotto d costituisca separazione estrazione o isolamento dei componenti di questo prodotto o altra analisi non autorizzata del medesimo e determini l accesso o individui le modalit di funzionamento di questo prodotto f costituisca utilizzo di reagenti materiali di consumo non forniti da Illumina con l hardware del medesimo non applicabile se le specifiche o la documentazione indicano altrimenti o g costituisce cessione a terzi o sublicenza del software o di qualsiasi software di terzi Il software che venga fornito separatamente installato o incorporato in un prodotto viene concesso in licenza all acquirente e non venduto A eccezione di quanto espressamente indicato nella presente sezione nessun diritto o licenza sui diritti di propriet intellettuale di Illumina viene concessa espressamente implicitamente o in base al principio di inopponibilit esclusiva responsabilit dell acquirente assicurarsi di disporre di tutti i diritti di propriet intellettuale necessari per gli usi che intende fare di questo prodotto compresi a titolo esemplificativo ma non esaustivo diritti da terzi o diritti sul
146. ta sulla parte superiore del banco probabile che venga applicata troppa pressione e che la cella a flusso si rompa Illumina raccomanda di pulire la cella a flusso tenendone i bordi con le dita 6 Proteggere la cella a flusso dalla polvere fino a quando la si carica sullo strumento q OO N codice 15023355 Rev K ITA Caricamento della cella a flusso NOTA 4 Non sostituire le guarnizioni dei collettori in questo momento Durante il caricamento della cella a flusso con cluster lasciare in sede le guarnizioni che erano state installate prima del lavaggio di manutenzione dello strumento Le guarnizioni dei collettori verranno sostituite al completamento della corsa di sequenziamento prima del lavaggio di manutenzione dello strumento uire pi di i sequenzi u i Non eseguire di una corsa di sequenziamento sullo stesso set di guarnizioni dei collettori 1 Collocare la cella a flusso sul supporto con le porte di ingresso e uscita rivolte verso il basso e il codice a barre a destra La freccia sul bordo sinistro della cella a flusso indica le direzione del flusso e deve puntare verso lo strumento 2 Far scorrere delicatamente la cella a flusso verso i perni guida superiore e destro fino a quando non si blocca Figura 44 Cella a flusso posizionata sui perni guida superiore e destro A Perno guida superiore B Perni guida destri i NOTA Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 7 01 ossn e e j9o eun IP oJuaue91es Esecuzio
147. te Velocit di aspirazione e Dispense Rate Velocit di erogazione 5 Wash Lavaggio lo strumento esegue un lavaggio 3 A N codice 15023355 Rev KITA Load Solvent Caricamento solvente viene richiesto di caricare NaOH in tutte le posizioni per il lavaggio Solvent Wash Lavaggio con solvente lo strumento esegue un lavaggio con solvente Load Wash Reagents Caricamento reagenti di lavaggio viene richiesto di caricare i reagenti di lavaggio Wash Lavaggio lo strumento esegue un lavaggio Lavaggio di manutenzione Se richiesto HCS richiede di eseguire un lavaggio di manutenzione prima di una corsa In tutti i casi un lavaggio di manutenzione raccomandato dopo una corsa 1 Load Wash Reagents Caricamento reagenti di lavaggio viene richiesto di caricare i reagenti di lavaggio Load Wash Flow Cell Caricamento cella a flusso per il lavaggio viene richiesto di caricare una cella a flusso non per il sequenziamento e di inserire l ID della cella a flusso per il lavaggio Fluidics Check Verifica fluidica viene richiesto di selezionare una soluzione Utilizzare i valori predefiniti per Volume Volume Aspiration Rate Velocit di aspirazione e Dispense Rate Velocit di erogazione Wash Lavaggio lo strumento esegue un lavaggio Load Solvent Caricamento solvente viene richiesto di caricare NaOH in tutte le posizioni per il lavaggio Solvent Wash Lavaggio con solvente lo strumento esegue un
148. ti di HiSeq 00000000000000 aa inaano 4 Panoramica sequenziamento a singola indicizzazione 11 Panoramica sequenziamento a doppia indicizzazione 13 Materiali di consumo per il sequenziamento 17 Materiali di consumo fomiti dall utente 0 0 0 22 Avvio del sistema HiSeq nn nr nn LPD nn 202r 22221 23 SET ar ATAR A EEA SI A f e ER ln Sena e ne SE n RS MA Enpa rcoreato ps o ns qee ni Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 q L oJoydey Descrizione generale Introduzione Il sistema HiSeq Illumina unisce una progettazione innovativa e la consolidata tecnologia SBS definendo nuovi standard di output semplicit ed efficacia in termini di costi HiSeq presenta le seguenti caratteristiche Imaging a doppia superficie HiSeq utilizza un sistema a epifluorescenza a quattro videocamere con tecnologia di scansione all avanguardia per consentire l imaging a doppia superficie Ampio vano refrigerato per i reagenti lo scomparto dei reagenti un ampio vano refrigerato che contiene reagenti sufficienti per l intera corsa di sequenziamento Fluidica integrata per corse bidirezionali la fluidica integrata bidirezionale fornisce i reagenti dallo scomparto dei reagenti alla cella a flusso per la risintesi Lettura 2 e per il sequenziamento indicizzato Opzioni dei controlli dell interfaccia l
149. ti differenti per i primer di sequenziamento Librerie Nextera le librerie Nextera richiedono primer di sequenziamento addizionali forniti nella confezione TruSeq Dual Index Sequencing Primer Box Tali primer sono utilizzati nel corso del processo di sequenziamento inclusi la Lettura 1 applicati durante la generazione dei cluster qualsiasi Lettura Indice e la Lettura 2 Le corse di sequenziamento su celle a flusso unidirezionali richiedono i primer di sequenziamento forniti nel kit unidirezionale Le corse di sequenziamento su celle a flusso bidirezionali richiedono i primer di sequenziamento forniti nel kit bidirezionale anche se si prevede di eseguire corse unidirezionali su una cella a flusso bidirezionale Librerie TruSeq HT nel caso di sequenziamento su una cella a flusso bidirezionale nel corso del processo di sequenziamento le librerie TruSeq HT possono utilizzare i primer di sequenziamento forniti nel kit TruSeq Cluster Tuttavia nel caso di esecuzione di una corsa a doppia indicizzazione su una cella a flusso unidirezionale le librerie TruSeq HT richiedono il primer di sequenziamento Lettura Indice 2 HP9 della confezione Dual Index Sequencing Primer Box Single Read NOTA I primer di sequenziamento forniti nella confezione TruSeq Dual Index Sequencing Primer Box sono compatibili con tutte le librerie TruSeq e Nextera Se la cella a flusso dell utente contiene una combinazione di librerie TruSeq e Nextera in corsie differenti util
150. tilizzabili per la risoluzione di eventuali problemi della corsa Le immagini in miniatura non sono adatte per l analisi d immagine Figura 51 Immagine in miniatura thumbnail o DO VU ajeas odw ul Isijeuy lep indino Ip Neg Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 1 37 7 3 3 N codice 15023355 Rev KITA Risoluzione dei problemi Introduzione nes 140 Possibili problemi d impostazione della corsa 00 0 141 Esecuzione di una verifica della fluidica 00 000 142 Ripetizione dell ibridazione primer Lettura 2 1000212221 143 Se BaseSpace non disponibile 00000000 0000 144 gat AE cd a GA an ae pr er a AA sese poro sr pal Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 7 3 9 9 oJoydey Risoluzione dei problemi Introduzione Questa sezione descrive le possibili soluzioni da parte dell utente nel caso di problemi durante una corsa di sequenziamento e come eseguire una verifica della fluidica dalla schermata Welcome Benvenuto q 4 O N codice 15023355 Rev KITA Possibili problemi d impostazione della corsa Problema Il software non ha eseguito l inizializzazione La leva della cella a flusso arancione Erogazione fluido scadente Possibile causa Il software non stato in grado di inizializzare i dispositivi hardware interni La cella a flusso non collocata correttamente Si persa
151. to o parte di esso divenga o possa diventare secondo l opinione di Illumina oggetto di azione per violazione di diritti di terzi sar facolt di Illumina a sua discrezione A di procurare all acquirente il diritto di continuare a utilizzare questo prodotto B di modificare o sostituire questo prodotto con un sostituto sostanzialmente equivalente che non configuri violazione o C di richiedere la restituzione di questo prodotto e porre fine ai diritti alla licenza e a ogni altra autorizzazione fornita all acquirente in relazione a esso nonch a rimborsare all acquirente il valore come indicato nei documenti ufficiali dell acquirente del prodotto restituito tenendo conto dell ammortamento maturato al momento della restituzione considerando che nessun rimborso verr effettuato per i materiali di consumo usati o scaduti La presente sezione esaurisce la responsabilit di Illumina per qualsiasi violazione di diritti di propriet intellettuale di terzi Esclusioni agli obblighi di indennizzo di Illumina Illumina ha l obbligo di difendere indennizzare e tenere indenne l acquirente da qualsiasi pretesa violazione di diritti di terzi da parte di Illumina nella misura in cui essa derivi da i l utilizzo di questo prodotto in qualsiasi modo o per qualsiasi scopo non compreso nell ambito dell utilizzo per scopi di ricerca ii l utilizzo di questo prodotto in modo non conforme alle sue caratteristiche tecniche alla documentazione ai diritti espr
152. ttura 2 0 111 PAT az per ISA Dr y g E HUA h 3 ARE IDATA M gt QA INT N gt Ll NE z gt n e i ee pa A ne E TORNATA ia great e i E TAI Fig a ns A a o keo Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 67 e ojoydeo Esecuzione di una corsa di sequenziamento Output elevato Introduzione Per eseguire una corsa di sequenziamento Output elevato sul sistema HiSeq prima si preparano i reagenti per la corsa e poi la si imposta utilizzando l interfaccia HCS Le fasi di impostazione della corsa includono inserimento dei parametri della corsa caricamento e priming dei reagenti caricamento della cella a flusso High Output Output elevato ed esecuzione di una verifica della fluidica I reagenti per la Lettura 1 e le Letture Indici vengono caricati durante l impostazione della corsa prima di avviarla I reagenti per la risintesi Lettura 2 vengono caricati dopo la conclusione della Lettura 1 e delle Letture Indici Illumina consiglia di preparare e caricare ICB fresco per la Lettura 2 Per maggiori informazioni vedere Preparazione ICB a pagina 75 Tipi di corse Output elevato Sul sistema HiSeq si possono eseguire sei tipi di corse Output elevato Tipo di corsa Cicli Cicli di lettura Cicli di lettura Cicli Cicli Lettura 1 Indice 1 17 Indice 2 i5 Lettura 2 totali Unidirezionale lt 101 lt 101 non indicizzata Unidirezionale lt 101 VAI lt 108 singola indicizzazione 8
153. ua una corsa a doppia indicizzazione su una cella a flusso unidirezionale NOTA x I primer di sequenziamento forniti nella confezione TruSeq Dual Index Sequencing Primer Box sono compatibili con le librerie non indicizzate e con le librerie a singola indicizzazione Se la cella a flusso in uso contiene una combinazione di librerie non indicizzate a singola indicizzazione e a doppia indicizzazione utilizzare i primer di sequenziamento della confezione TruSeq Dual Index Sequencing Primer Box Per maggiori informazioni vedere Primer di sequenziamento secondo il tipo di corsa a pagina 20 Tipo di libreria e tipo di cella a flusso Indice 1 i7 Indice 2 15 Librerie Nextera HP12 HP9 Cella a flusso unidirezionale Librerie Nextera HP12 RMR Cella a flusso bidirezionale Librerie TruSeq HT HP8 o HP12 HP9 Cella a flusso unidirezionale Librerie TruSeq HT HP8 o HP12 RMR Cella a flusso bidirezionale Librerie TruSeq LT v2 HP8 o HP12 Cella a flusso unidirezionale o cella a flusso bidirezionale Librerie TruSeq Small RNA HP8 o HP12 Cella a flusso unidirezionale o cella a flusso bidirezionale Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 F Q SUOIZEZZIOIpul 19d 1 u be e lap uoizesed ld Esecuzione di una corsa di sequenziamento Output elevato La preparazione dei reagenti di indicizzazione richiede meno di 30 minuti Tabella 2 Reagenti per indicizzazione Reagenti Nome del kit HP3 Kit TruSeq PE Cluster Indexing Reagents Box
154. ualizzare i risultati di indicizzazione nel Visualizzatore analisi di sequenziamento SAV e essenziale che all inizio della corsa l utente carichi un foglio campioni Per riportare le informazioni di indicizzazione SAV v1 8 richiede un foglio campioni Vedere la Guida per l utente del Visualizzatore analisi di sequenziamento n codice 15020619 Si pu creare il foglio campioni in una serie di applicazioni software come ad esempio Excel o Notepad oppure utilizzare Experiment Manager Illumina Per la creazione del foglio campioni l utente si atterr alle seguenti linee guida Tutte le sequenze indice sono specificate nel campo Index Indice Se si stanno eseguendo letture a doppia indicizzazione gli indici multipli devono essere obbligatoriamente separati da un trattino ACCAGTAA GGACATGA Se un campione non contiene una sequenza indice lasciare vuoto il campo Index Per la validit del foglio campioni ciascun ciclo in una Lettura Indici per ciascuna corsia deve avere come minimo una base nel canale rosso A C e una base nel canale verde G T per assicurare un elaborazione immagini appropriata Un foglio campioni non valido impedir l analisi secondaria appropriata Experiment Manager Illumina 64 Experiment Manager Illumina un applicazione basata su una procedura guidata che indica all utente le operazioni da eseguire per creare il foglio campioni Utilizzando Experiment Manager Illumina non solo si riducono gli errori di sintass
155. umina tenter di passare eventuali garanzie di tale tipo all acquirente Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 VI Cronologia revisioni N codice Revisione Data 15023355_ITA K Maggio 2013 15023355 J Gennaio 2013 15023355 H Novembre 2012 15023355 G Luglio 2012 Descrizione della modifica Sostituiti i reagenti seguenti e RMR per RMX Correzione errori rimosse le informazioni relative al sistema 1500 nelle sezioni Esecuzione di una corsa di sequenziamento Disponibile solo in inglese Rivisto per supportare HCS 2 0 Disponibile solo in inglese Elencati i requisiti dei primer per le librerie TruSeq HT e per le librerie Nextera Aggiunto un elenco di librerie a doppia indicizzazione supportate Aggiornate le impostazioni della corsa per le librerie a doppia indicizzazione per specificare TruSeq Dual Index Sequencing Primer Box indipendentemente dai primer di sequenziamento usati per la corsa Disponibile solo in inglese N codice 15023355 Rev K ITA N codice Revisione Data Descrizione della modifica 15023355 F Aprile 2012 Modificato il flusso di lavoro per l impostazione della corsa le guarnizioni dei collettori devono essere sostituite prima di eseguire un lavaggio di manutenzione dello strumento invece che prima di caricare la cella a flusso con cluster Aggiunte le informazioni seguenti e Panoramiche delle corse di sequenziamento a singola indicizzazione e a doppia indicizzazione e Descrizione delle l
156. ure Indici il software chiede all operatore di caricare i reagenti bidirezionali per la risintesi Lettura 2 e ICB da una preparazione fresca per la Lettura 2 Caricamento dei reagenti bidirezionali 1 Registrare il peso di ciascun reagente sul modulo di monitoraggio del laboratorio 2 Sollevarei pescanti per il rack reagenti PE effettuando i seguenti movimenti a Tirare la maniglia verso di s b Spingere la maniglia verso l alto mentre la si tira verso di s c Rilasciare la maniglia nell alloggiamento nella parte superiore della scanalatura Si dovrebbe sentire che la maniglia stata posizionata correttamente nell alloggiamento 3 Far scorrere il rack reagenti fuori dallo scomparto dei reagenti usando la maniglia del rack 4 Posizionare ciascuna provetta dei reagenti sul rack nelle posizioni numerate associate secondo il tipo di corsa che si sta eseguendo Tabella 8 Posizioni dei reagenti bidirezionali Posizione 10 11 12 13 14 15 16 18 19 Reagente RMR LMX2 BMX AMX2 APM2 AT2 HP7 o HP11 HP3 HT2 Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 Descrizione Resynthesis Mix Linearization Mix 2 Blocking Mix Amplification Mix 2 AMX2 Premix 100 Formammide Primer sequenziamento Lettura 2 Soluzione di denaturazione Tampone di lavaggio 117 z enya e 13d nuabeal oJuauwe9LIeo Esecuzione di una corsa di sequenziamento Output elevato NOTA Per le corse bidirezionali a doppia indicizza
157. utente del sistema HiSeq 1000 1 3 3 VU ejeas odw ul Isijeuy ljep indino Ip Neg Analisi in tempo reale RTA 134 File principale file _pos txt config xml CopyLog txt ErrorLog txt RunInfo xml SampleSheet csv Sottocartella AnalysisFolder Data Intensities AnalysisFolder Data Intensities AnalysisFolder Data Intensities Basecalls1 AnalysisFolder Data AnalysisFolder Data AnalysisFolder AnalysisFolder AnalysisFolder Data Intensities Basecalls1 Descrizione Riporta le coordinate dei cluster C un file _pos txt per ciascuna tile Questi file devono essere utilizzati nel software di analisi OLB se si desidera eseguire la identificazione delle basi BUSTARD Contiene meta informazioni sulla corsa sull analisi delle immagini e sulla identificazione delle basi Tutti gli eventi copia effettuati durante l analisi sono memorizzati nel file CopyLog Qualsiasi errore durante l analisi memorizzato nel file ErrorLog Se non ci sono errori non viene generato alcun file ErrorLog txt Identifica i limiti delle letture comprese le letture indici il Flowcell ID ID della cella a flusso se disponibile e la tabella qualit selezionata per la corsa Contiene informazioni sul campione incluse le informazioni di indicizzazione RTA copia il file Sample Sheet dalla cartella base della corsa alla cartella Basecalls N codice 15023355 Rev K ITA Numerazione delle tile Il nom
158. vere 2 Usando una salvietta imbevuta di alcol o un tessuto che non lasci fibre imbevuto di etanolo o isopropanolo pulire la superficie del supporto della cella a flusso fino a quando non completamente pulita Al ATTENZIONE y Non far sgocciolare l alcol nei fori della pompa a vuoto o intorno ai collettori Se necessario utilizzare un panno da laboratorio a bassissimo rilascio di particelle per asciugare il piano Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 9 9 ossn e e j99 eun IP oJuaue91es Esecuzione di una corsa di sequenziamento Output elevato Figura 43 Ispezione dei fori della pompa a vuoto 3 Ispezionare visivamente il supporto della cella a flusso per assicurarsi che sia privo di fibre e che i fori della pompa a vuoto siano privi di ostruzioni Pulizia della cella a flusso 1 Sciacquare la cella a flusso con acqua da laboratorio e asciugarla con un panno pulente per lenti 2 Piegare una salvietta imbevuta di alcol fino approssimativamente alle dimensioni della cella a flusso 3 Tenere i bordi della cella a flusso con cluster con due dita Assicurarsi che le porte di ingresso e di uscita siano rivolte verso l alto 4 Pulire ogni lato della cella a flusso con un unico movimento Ripetere ripiegando il panno a ogni passaggio fino a quando la cella a flusso non completamente pulita Asciugare la cella a flusso con un panno pulente per lenti 5 Y ATTENZIONE Se si pulisce la cella a flusso quando adagia
159. zamento a da un immagine della cella a flusso La barra d avanzamento nella parte alta dello schermo mostra il numero di cicli completati mentre l immagine della cella a flusso illustra quali corsie sono state sottoposte a imaging in quel ciclo Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 5 3 d M IM AQ UN y gewys esS109 BIIWUEIJOUE Software HiSeq Un grigio chiaro indica che la corsia e stata sottoposta a imaging un grigio scuro indica che la corsia non e stata sottoposta a imaging Le linee ondeggianti attraverso la cella a flusso indicano che si stanno pompando reagenti lungo la cella a flusso I cambiamenti di colori dello sfondo indicano cambiamenti di temperatura durante la corsa Il blu corrisponde a temperature pi fredde mentre i colori arancione e rosso indicano temperature pi calde a A Immagine di una cella a flusso High Output Output elevato fluidica in avanzamento B Immagine di una cella a flusso High Output Output elevato imaging in avanzamento Configuration Configurazione elenca il tipo di lettura la cartella di output e i parametri corsa per la corsa in avanzamento Per espandere la visualizzazione selezionare il pulsante con la freccia Analysis Analisi mostra un grafico delle intensit secondo il ciclo Fluidics Fluidica mostra i valori correnti di temperatura fase del protocollo e reagente Per espandere la visualizzazione selezionare il pulsante con la freccia Images Imma
160. zare HP8 oppure HP12 Lettura Indice 1 17 Dopo la preparazione Lettura Indici si esegue la Lettura Indice 1 i7 Nel caso di sequenziamento di librerie a doppia indicizzazione Nextera o TruSeq HT la Lettura Indice consiste in otto cicli di sequenziamento Lettura Indice 2 15 Il processo per la Lettura Indice 2 i5 differente per corse eseguite su celle a flusso unidirezionali single read rispetto a corse eseguite su celle a flusso bidirezionali paired end Celle a flusso unidirezionali il prodotto della Lettura Indice 1 i7 viene rimosso e la Miscela primer di sequenziamento Indice 2 i5 Index 2 i5 Sequencing Primer Mix HP9 appaiata annealing allo stesso filamento stampo HP9 fornito nella confezione TruSeq Dual Index Sequencing Primer Box ed necessario per le corse a N codice 15023355 Rev K ITA doppia indicizzazione su celle a flusso unidirezionali indipendentemente dal tipo di libreria Nextera o TruSeq HT La corsa procede per otto cicli di sequenziamento Celle a flusso bidirezionali il prodotto della Lettura Indice 1 i7 viene rimosso La Miscela di risintesi RMR deprotegge il primer P5 innestato sulla superficie della cella a flusso e il templato si appaia annealing al primer P5 innestato La corsa procede con altri sette cicli di sola chimica ossia senza imaging seguiti da otto cicli di sequenziamento Risintesi Lettura 2 Il prodotto della Lettura Indice viene rimosso e il filamento
161. zazione delle librerie preparate con i seguenti kit Illumina Kit TruSeq HT Sample Prep Kit Nextera DNA Sample Prep Kit Nextera XT Sample Prep Kit Nextera Custom e Exome Enrichment Sample Prep q 6 N codice 15023355 Rev K ITA Materiali di consumo per il sequenziamento Per il sequenziamento sul sistema HiSeq sono necessari materiali di consumo forniti da Illumina I kit necessari dipendono dal tipo di corsa che si esegue e dal tipo di librerie che si stanno sequenziando E Tipo di libreria Materiali di consumo Tipo di corsa sii compatibili Tutte le corse Qualsiasi tipo di Kit TruSeq SBS libreria Corsa di sequenziamento indicizzata Qualsiasi tipo di Kit TruSeq Cluster SR o PE libreria Corsa di sequenziamento Qualsiasi tipo di Kit TruSeq Cluster PE bidirezionale libreria Tutti i tipi di corsa Librerie Nextera TruSeq Dual Index Sequencing Primer Box Corsa unidirezionale a doppia Librerie TruSeq HT TruSeq Dual Index indicizzazione Sequencing Primer Box Cella a flusso unidirezionale Per maggiori informazioni vedere Primer di sequenziamento secondo il tipo di corsa a pagina 20 Reagenti SBS Il kit TruSeq SBS fornisce i reagenti di sequenziamento Tutte le corse di sequenziamento richiedono un kit TruSeq SBS da 200 cicli oppure uno o pi kit TruSeq SBS da 50 cicli a seconda del numero totale di cicli della corsa Un kit da 200 cicli fornisce reagenti sufficienti per un massimo di 209 cicli Un kit da 50 cicli fornisce reag
162. zia 100 risoluzione dei problemi 141 cicli in una lettura 41 compatibilit delle versioni materiali di consumo 21 software 21 Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 Ipul componenti modulo ottica 4 scomparto dei reagenti 4 5 117 scomparto della cella a flusso 4 6 91 scomparto fluidica 4 config xml 62 134 D documentazione 149 doppia indicizzazione impostazioni sulla schermata Recipe Ricetta 85 panoramica 13 su cella a flusso bidirezionale 85 durata della corsa 71 F file bcl 133 136 file cif 133 file clocs 133 file control 136 file filter 133 136 file locs 133 file pos txt 134 file stats 133 136 fluidica risoluzione dei problemi 141 flusso 99 flusso di lavoro durata della corsa 71 foglio campioni caricamento 43 editor 64 nella cartella corsa 62 panoramica 64 schermata Sample Sheet Foglio campioni 43 145 Indice 146 G guarnizioni dei collettori 19 118 ibridazione Lettura 2 143 icona errori e avvertenze 32 icona avviso stato 32 icone avviso stato 32 immagini immagini in miniatura 35 salvataggio campioni immagini 35 inclusione prima base conferma 39 54 105 posizione report 39 62 indicatori di attivit 32 indicizzazione reagenti 79 inizializzazione del software 28 L lavaggi ii dei collettori 118 avaggio con acqua 30 116 122 lavaggio di manutenzione 30 116 118 materiali di consumo 118 122 raccomandazioni 116 volumi erogati 118 122 lavaggio con acqua
163. zionale oppure bidirezionale Single Index Singolo indice esegue una corsa unidirezionale oppure bidirezionale con una Lettura Indici Lettura Indice 1 17 Dual Index Doppio indice esegue una corsa unidirezionale oppure bidirezionale con due Letture Indici Lettura Indice 1 17 e Lettura Indice 2 15 Custom Personalizzata esegue una corsa unidirezionale oppure bidirezionale con un numero di cicli personalizzato per le Letture Indici 2 Selezionare un formato di cella a flusso Single Read Unidirezionale oppure Paired End Bidirezionale Questa opzione appare in modalit Output elevato solo se stato selezionato Dual Index Doppio indice oppure Custom Personalizzata 3 Inserire il numero di cicli che l utente desidera sequenziare per la Lettura 1 e per la Lettura 2 se applicabile Se l utente ha selezionato l opzione di indicizzazione Custom Personalizzata inserire il numero di cicli che l utente desidera per sequenziare le Letture Indici NOTA possibile eseguire una corsa unidirezionale a doppia indicizzazione utilizzando una cella a flusso bidirezionale contenente librerie bidirezionali A tale fine impostare una dual indexed paired end run corsa bidirezionale a doppia indicizzazione e inserire zero come numero di cicli nella Lettura 2 Questo arrester la corsa dopo la Lettura Indice 2 i5 4 Confermare le selezioni per la chimica della corsa a b SBS questa impostazione determinata dall ID
164. zionali con adattamenti di ricetta La selezione in CS cella a flusso bidirezionale o unidirezionale determina il tipo di ricetta Utilizzare sempre la confezione appropriata di primer di sequenziamento a doppia indicizzazione secondo il tipo di cella a flusso impiegata NOTA Le corse bidirezionali a doppia indicizzazione devono obbligatoriamente essere eseguite su celle a flusso bidirezionali Cycles Cicli Cycles Cicli inserire il numero di cicli che si intende sequenziare per ciascuna lettura incluse la Lettura 1 le Letture Indici e la Lettura 2 NOTA Aggiungere sempre un ciclo al totale dei cicli di Lettura 1 o Lettura 2 Ad esempio per eseguire 100 cicli per la Lettura 1 inserire 101 Per eseguire 50 cicli per la Lettura 1 inserire 51 Il numero di cicli eseguito in una lettura uno in pi rispetto al numero di cicli analizzati L ultimo ciclo necessario per i calcoli di fase e pre fase phasing and prephasing Per le corse bidirezionali inserire lo stesso numero di cicli per Lettura 2 come inserito per Lettura 1 oppure se stata selezionata l opzione di indicizzazione Guida per l utente del sistema HiSeq 1000 41 esJO9 SUOIZEINBIJUOO ajeueyos Software HiSeq 42 Custom Personalizzata inserire il numero di cicli per ogni Lettura Indice la lunghezza della Lettura non deve essere identica NOTA Selezionando Single Index Singolo indice o Dual Index Doppio indice i valori di numero di cicli d
165. zione non e necessario caricare RMR RMR e utilizzato durante la Lettura Indice 2 i5 e non utilizzato di nuovo durante la risintesi Lettura 2 Rimuovere i tappi da ogni provetta di reagente Far scorrere il rack reagenti nello scomparto allineando il rack con la guida sulla parte inferiore dello scomparto Abbassare i pescanti nei flaconi di reagenti bidirezionali come segue a Tirare la maniglia verso di s b Abbassare la maniglia mentre la si tira verso di s c Ispezionare visivamente i pescanti per assicurarsi che non si pieghino mentre si abbassano nelle provette d Rilasciare la maniglia nell alloggiamento nella parte inferiore della scanalatura Si dovrebbe sentire che la maniglia stata posizionata correttamente nell alloggiamento Caricamento ICB per la Lettura 2 112 1 2 Registrare il peso del reagente sul modulo di monitoraggio del laboratorio Sollevare i pescanti per il rack reagenti di sequenziamento effettuando i seguenti movimenti a Tirare la maniglia verso di s b Spingere la maniglia verso l alto mentre la si tira verso di s c Rilasciare la maniglia nell alloggiamento nella parte superiore della scanalatura Si dovrebbe sentire che la maniglia stata posizionata correttamente nell alloggiamento Far scorrere il rack reagenti fuori dallo scomparto reagenti Rimuovere il flacone esistente del reagente ICB dalla posizione 1 del rack reagenti e rimuovere il tappo a imbuto dal flacone
166. zzo di un controllo PhiX per corse di sequenziamento HiSeq disponibile nella pagina di supporto HiSeq sul sito Web Illumina all indirizzo http www illumina com Keep Intensity Files Mantieni i file intensit selezionare la casella di controllo per salvare i file delle intensit dei cluster cif per successiva ri analisi risoluzione dei problemi o analisi personalizzate Il salvataggio dei file delle intensit non necessario per le analisi integrate sullo strumento L attivazione di questa opzione aumenta significativamente la dimensione della cartella di output dei dati Come impostazione predefinita questa opzione non selezionata Schermata Recipe Ricetta A partire dalle informazioni che l utente inserisce nella schermata Recipe Ricetta il software crea una ricetta specifica per la corsa La ricetta copiata automaticamente nella cartella della corsa e salvata nelle sottocartella Recipe Ricetta La ricetta salvata include solo il numero di cicli per ogni lettura o indice non salva le opzioni per corsia di controllo allineamento PhiX immagini o file cif Figura 18 Schermata Recipe Ricetta per una cella a flusso High Output Output elevato con doppia indicizzazione selezionata Please check the remaining parameters and select Next to continue Index Type Flowcell Format O NoIndex O Dual Index O Single Read O Single Index O Custom O Paired End Read 1 Index 1 i7 Index 2 15 Read 2 Cycles 4 8 8 1 SBS

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