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B REGOLAMENTO (CE) N. 152/2009 DELLA COMMISSIONE del 27

1. 5 1 1 1 Porre 5 10 g di campione pesato con l approssimazione di 0 2 mg in un crogiolo di quarzo o di platino cfr nota b essiccare in stufa a 105 C e introdurre il crogiolo nel forno a muffola freddo 4 1 Chiudere il forno cfr nota c e innalzare progressivamente la temperatura fino a raggiungere 450 475 C in 90 minuti circa Mantenere questa tempera tura per 4 16 ore ad esempio tutta una notte in modo da eliminare la materia carboniosa aprire poi il forno e lasciar raffreddare cfr nota d Possono essere utilizzati altri metodi di mineralizzazione purch abbiano dimostrato di dare risultati simili ad esempio la mineralizzazione in pressione a microonde 2 Nel foraggio verde fresco o essiccato possono essere presenti notevoli quantit di silice vegetale che capace di trattenere gli oligoelementi e che va quindi eliminata Ai campioni di tali prodotti va pertanto applicato il procedimento seguente Eseguire le operazioni descritte al punto 5 1 1 1 fino alla filtrazione Lavare per due volte con acqua bollente la carta da filtro contenente il residuo insolubile e porla in un crogiolo di quarzo o di platino 4 3 Calcinare in muffola 4 1 a temperatura inferiore ai 550 C fino a scomparsa completa delle sostanze carboniose Lasciar raffreddare aggiungere qualche goccia d acqua poi 10 15 ml di acido fluoridrico 3 4 quindi evaporare a secco a 150 C circa Se nel residuo rimane ancora della silice sciogli
2. 8 2 Lotti grandi trasportati per nave 8 2 1 Campionamento dinamico di lotti grandi trasportati per nave preferibile effettuare il campionamento di lotti grandi nelle navi quando il prodotto in movimento campionamento dinamico Il campionamento si effettua stiva per stiva intendendo come stiva uno spazio separabile fisicamente Le stive vengono comunque parzialmente svuotate l una dopo l altra cos che l iniziale separazione fisica non sussiste pi dopo il trasferimento nelle strutture di stoccaggio Il cam pionamento pu pertanto essere effettuato in funzione della separazione fisica iniziale o della separazione dopo il trasferimento nelle strutture di stoccaggio Le operazioni di scarico di una nave possono durare diversi giorni Di norma il campionamento deve essere effettuato ad intervalli regolari durante l intera fase di scarico La presenza di un ispettore ufficiale per il campionamento durante l intera operazione di scarico non tut tavia sempre possibile o opportuna Pertanto il campionamento pu riguardare soltanto una parte partita campionata del lotto Il numero di campioni elementari determinato tenendo conto delle dimensioni della partita campionata In caso di campionamento di una parte di un lotto di mangimi della stessa classe o con la medesima descrizione e se tale parte del lotto non risultata conforme ai requisiti UE si presume che i risultati valgano per tutto il mangime di tale l
3. Personale addetto al campionamento i campioni sono prelevati da personale appositamente autorizzato dall autorit competente Il campione sigillato in modo tale da non essere accessibile senza la rottura o l asportazione del sigillo Il marchio del sigillo chia ramente identificabile e ben visibile In alternativa il campione pu essere messo in un recipiente che una volta chiuso non possa essere aperto senza danneggiarsi irreparabilmente e non possa quindi essere riutilizzato Identificazione del campione il campione contrassegnato in modo indelebile e deve essere identificato in maniera tale da essere colle gato inequivocabilmente al verbale di campionamento Da ciascun campione globale sono prelevati almeno due campioni finali almeno uno come controllo verifica dell applicazione della normativa e uno per l operatore del settore dei mangimi difesa in caso di controversia Infine pu essere prelevato un campione finale come riferimento Nel caso che l intero campione globale sia omo geneizzato i campioni finali sono prelevati dal campione globale omogeneizzato a meno che tale procedura non sia in contrasto con le norme vigenti nello Stato membro in materia di diritti degli operatori del settore dei mangimi 4 STRUMENTI 4 1 Gli strumenti utilizzati per il campionamento sono realizzati con mate riali che non possono contaminare i prodotti da campionare Se destinati ad essere riutilizzat
4. sciogliere 1 g di manganese in polvere in 25 ml di acido cloridrico 6 mol l 3 2 e portare a 1 litro con acqua 3 9 1 Soluzione standard di rame 10 ug Mn ml diluire un volume della soluzione standard 3 9 con 9 volumi d acqua poi ridiluire una parte della soluzione cos ottenuta con 9 volumi di acqua 3 10 Soluzione standard di zinco 1 000 ug Zn ml preparata come segue o soluzione equivalente in commercio sciogliere 1 g di zinco in lamine o in fogli in 25 ml di acido cloridrico 6 mol l 3 2 e portare a 1 litro con acqua 3 10 1 Soluzione standard di zinco 10 ug Zn ml diluire un volume della soluzione standard 3 10 con 9 volumi d acqua poi ridiluire una parte della soluzione cos ottenuta con 9 volumi di acqua 3 11 Soluzione di cloruro di lantanio sciogliere 12 g di ossido di lantanio in 150 ml d acqua aggiungere 100 ml di acido cloridrico 6 mol l 3 2 e portare a 1 litro con acqua 4 Apparecchiatura 4 1 Muffola a temperatura regolabile e preferibilmente controllata 4 2 Vetreria resistente in borosilicato si raccomanda di riservarla esclusiva mente alla determinazione degli oligoelementi 4 3 Spettrofotometro di assorbimento atomico conforme ai requisiti del me todo per quanto riguarda la sensibilit e la precisione nell intervallo delle misurazioni richieste 5 Procedimento Sl Campioni contenenti sostanze organiche 5 1 1 Incenerimento e preparazione della soluzione da analizzare
5. 4 2 2 4 3 4 4 4 5 4 6 5 1 Sl 5 2 5 2 1 5 2 2 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 102 Apparecchiatura Agitatore meccanico Apparecchiatura per HPLC a gradiente ternario Colonna per cromatografia liquida 100 mm x 4 6 mm con riempimento in Hypersil ODS da 3 um o equivalente Rivelatore UV a lunghezza d onda variabile o rivelatore a serie di diodi Evaporatore rotante a film Filtro a membrana da 0 45 um Collettore a vuoto Bagno ultrasonico Procedimento Indicazioni generali Alimento bianco Analizzare un alimento di riferimento bianco per accertare l assenza di diclazuril o di altre sostanze che possono interferire Il bianco ha una composizione simile a quella del campione e all analisi il diclazuril o sostanze capaci di interferire non risultano presenti Prova di recupero Effettuare una prova di recupero analizzando il bianco addizionato di una quantit di diclazuril analoga a quella presente nel campione Per ottenere una concentrazione di 1 mg kg aggiungere 0 1 ml della solu zione madre 3 8 1 a 50 g di bianco mescolare accuratamente e lasciar riposare per 10 minuti agitando nuovamente varie volte prima di pro cedere all estrazione 5 2 Se non fosse disponibile un bianco di tipo simile a quello del campione cfr punto 5 1 1 la prova di recupero pu essere eseguita col metodo di addizione della sostanza di riferimento In questo caso un aliquota del campion
6. 8 2 8 3 8 4 8 5 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 51 Introdurre il doppio filtro contenente il residuo secco in un ditale da estrazione 4 2 e coprire con un tampone di cotone sgrassato Porre il ditale in un estrattore 4 1 e operare come indicato al punto 5 1 se condo e terzo capoverso Espressione del risultato Esprimere il risultato della pesata del residuo in percentuale del cam pione Ripetibilit La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione dallo stesso analista non supera lo 0 2 in valore assoluto per contenuti di materie oleose e grasse gregge inferiori al 5 il 4 0 del valore ottenuto pi elevato per contenuti compresi fra 5 e 10 lo 0 4 in valore assoluto per contenuti superiori al 10 Osservazioni Per i prodotti a elevato tenore di sostanze oleose e grasse difficili da macinare o non appropriati per il prelevamento di una piccola quantit omogenea procedere nel modo che segue Pesare con l approssimazione di 1 mg 20 g di campione e mescolarli con 10 g o pi di solfato di sodio anidro 3 2 Procedere all estrazione con etere di petrolio 3 1 come indicato al punto 5 1 Portare l estratto ottenuto al volume di 500 ml con etere di petrolio 3 1 e mescolare Introdurre 50 ml della soluzione in un palloncino asciutto contenente qualche granulo di pietra pomice e tarato Eliminare il solvent
7. Quando la quantit di sostanza sottoposta all analisi superiore a 2 g introdurre innanzitutto 15 ml di acqua distillata nel recipiente 4 e mescolare prima di cominciare la prova Usare lo stesso volume d acqua per la prova comparativa Quando si utilizza un apparecchio di volume diverso da quello di Schei bler Dietrich apportare le conseguenti variazioni alla quantit di so stanza su cui si opera alla quantit di carbonato di calcio nel saggio tipo nonch al calcolo dei risultati APPARECCHIO SCHEIBLER DIETRICH PER LA DETERMINAZIONE DI CO 3 2 3 3 3 4 3 5 3 6 3 6 1 3 6 2 3 7 4 2 4 3 44 4 5 4 6 5 1 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 67 P DETERMINAZIONE DEL FOSFORO TOTALE METODO FOTOMETRICO Finalit e campo d applicazione Il metodo consente la determinazione del contenuto di fosforo totale negli alimenti per gli animali Esso particolarmente indicato per l ana lisi dei prodotti poveri di fosforo In certi casi prodotti ricchi di fosforo pu essere applicato un metodo gravimetrico Principio Il campione viene mineralizzato per via secca per gli alimenti organici o per via umida per i composti minerali e gli alimenti liquidi e tra sferito in soluzione acida La soluzione viene trattata con il reattivo vanado molibdico La densit ottica della soluzione gialla cos formatasi viene misurata allo spettrofotometro a 430 nm Reat
8. debbono essere preessiccati nel modo indicato di seguito Pesare con l approssimazione di 10 mg 50 g di cereali in granella non moliti in un recipiente appropriato ad esempio una piastra di alluminio di 20 x 12 cm con bordo di 0 5 cm Lasciare essiccare in una stufa per 5 7 minuti alla temperatura di 130 C Togliere dalla stufa lasciar raf freddare il prodotto non coperto nel laboratorio per due ore e pesare con l approssimazione di 10 mg Molire subito dopo come indicato al punto 4 1 2 ed effettuare l essiccazione come indicato al punto 4 2 2 Calcolo dei risultati Il contenuto di umidit X espresso in percentuale del campione dato dalle seguenti formule Essiccazione senza preessiccazione m mo X x 100 dove m peso iniziale in grammi della quantit di prodotto sottoposta all analisi m peso in grammi del campione essiccato Essiccazione con preessiccazione 100 e ii 100 x dai ze m mx m dove m peso iniziale in grammi della quantit di prodotto sottoposta all analisi mj peso in grammi della quantit di prodotto sottoposta all analisi dopo la preessiccazione m peso in grammi della quantit di prodotto sottoposta all analisi dopo la macinazione o frantumazione m peso in grammi del campione essiccato 5 3 322 3 3 3 4 3 5 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 24 Ripetibilit La differenza tra i risultati
9. 0 non deve essere utilizzata come bianco 5 1 2 4 Misurazione dell assorbimento atomico Misurare l assorbimento delle soluzioni di taratura e della soluzione da analizzare impiegando una fiamma ossidante aria acetilene alle lun ghezze d onda seguenti Fe 248 3 nm Cu 324 8 nm 5 2 3 2 33 3 4 3 5 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 90 Mn 279 5 nm Zn 213 8 nm Ripetere ogni misurazione quattro volte Alimenti a base di minerali In assenza di materiali organici l incenerimento preliminare superfluo Operare come descritto al punto 5 1 1 1 a partire dal secondo capoverso L evaporazione in presenza di acido fluoridrico pu essere tralasciata Calcolo dei risultati Tramite la curva di taratura calcolare la concentrazione degli oligoele menti nella soluzione in esame ed esprimere il risultato in mg d oligoe lemento per kg di campione ppm Ripetibilit La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione dallo stesso analista non supera 5 mg kg in valore assoluto per i tenori di oligoelementi fino a 50 mg kg il 10 del risultato pi elevato per i tenori superiori a 50 e fino a 100 mg kg 10 mg kg in valore assoluto per i tenori superiori a 100 e fino a 200 mg kg il 5 del risultato pi elevato per i tenori superiori a 200 mg kg Osservazione La presenza di notevoli quantit di fosfati pu
10. Preparazione della soluzione del campione per HPLC Pipettare un aliquota della soluzione di etere di petrolio risultante dalla procedura di cui ai punti 5 3 1 o 5 3 2 in un matraccio a pera da 250 ml 4 2 4 Far evaporare il solvente quasi interamente nell evaporatore ro tante 4 1 a pressione ridotta a una temperatura del bagno non supe riore a 40 C Ripristinare la pressione atmosferica facendovi fluire azoto 39 5 6 5 6 1 5 602 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 74 3 10 e togliere il matraccio dall evaporatore Togliere il solvente rima nente con un flusso di azoto 3 10 e disciogliere immediatamente il residuo in un volume noto 10 100 ml di metanolo 3 3 la concen trazione di vitamina A deve essere dell ordine di 5 UI ml 30 UI ml Determinazione HPLC La vitamina A separata su una colonna C g a fase inversa 4 5 1 e la concentrazione misurata mediante rivelatore UV 325 nm o a fluore scenza eccitazione 325 nm emissione 475 nm 4 5 2 Iniettare un aliquota ad esempio 20 pl della soluzione di metanolo ottenuta conformemente al punto 5 4 ed eluire con la fase mobile 3 9 Calcolare l altezza area media dei picchi di diverse iniezioni della stessa soluzione del campione e le altezze medie aree dei picchi di diverse iniezioni di soluzioni di taratura 5 6 2 Condizioni HPLC Le seguenti condizioni sono proposte a titolo indicativo possibile operare in condizioni dive
11. _ tubo regolabile etere di petrolio strato acquoso saponificazione 3 1 3 2 3 3 3 4 3 5 3 6 IT 3 4 1 3 8 3 8 1 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 86 C DETERMINAZIONE DEGLI OLIGOELEMENTI FERRO RA ME MANGANESE E ZINCO Finalit e campo d applicazione Questo metodo consente di determinare gli oligoelementi ferro rame manganese e zinco contenuti negli alimenti per animali Le soglie di quantificazione dei suddetti elementi sono ferro FE 20 mg kg rame Cu 10 mg kg manganese Mn 20 mg kg zinco Zn 20 mg kg Principio Il campione viene disciolto in acido cloridrico dopo distruzione delle sostanze organiche eventualmente presenti Gli elementi ferro rame manganese e zinco sono determinati dopo opportuna diluizione me diante spettrometria di assorbimento atomico Reattivi Osservazioni preliminari L acqua utilizzata per la preparazione dei reattivi e delle soluzioni per l analisi deve essere esente da cationi da determinare preparata o per doppia distillazione dell acqua in un apparecchio in borosilicato o in quarzo o per doppio passaggio su resine a scambio ionico I reattivi debbono essere di purezza almeno analitica L assenza del l elemento da determinare deve essere controllata mediante una prova in bianco Se necessario i reattivi dovranno essere ulteriormente purificati In luogo delle soluzioni standard appresso elencat
12. confermato da una doppia analisi 4 supera il livello massimo fissato dalla direttiva 2002 32 CE tenendo conto dell incertezza di mi sura Pu tenersi conto dell incertezza di misura in uno dei seguenti modi calcolando l incertezza estesa per mezzo di un fattore di copertura 2 corrispondente ad un livello di fiducia del 95 circa Una partita o sottopartita non conforme se il valore misurato meno U supera il livello massimo stabilendo il limite di decisione CCa come indicato al punto 3 1 2 5 dell allegato I della decisione 2002 657 CE Una partita o sottopartita non conforme se il valore misurato pari o superiore al CCa Le norme di interpretazione di cui sopra si applicano al risultato anali tico ottenuto sul campione utilizzato per il controllo ufficiale Per le analisi effettuate nel quadro di procedure di ricorso o di arbitrato val gono le norme nazionali 22 PCDD F e PCB diossina simili La partita conforme alle specifiche se il risultato di una singola analisi eseguita con un metodo di screening con un tasso di falsi conformi inferiore al 5 indica che il livello non supera i livelli massimi fissati dalla direttiva 2002 32 CE rispettivamente per PCDD PCDF e per la somma di PCDD PCDF e PCB diossina simili eseguita con un metodo di conferma non supera i livelli massimi fissati dalla direttiva 2002 32 CE rispettivamente per PCDD PCDF e per la somma di PCDD PCDF e PCB diossina simili
13. dalla ragione per cui si esegue l analisi Procedimento A Oli e grassi greggi estraibili direttamente Il metodo applicabile alle materie prime per alimenti per animali di origine vegetale fatta eccezione per quelle alle quali si applica il pro cedimento B Procedimento B Oli e grassi greggi totali Il metodo applicabile alle materie prime per alimenti per animali di origine animale e a tutti gli alimenti composti Esso deve essere usato per tutte le materie prime dai quali gli oli e i grassi non possono essere completamente estratti senza idrolisi preliminare ad esempio i glutini i lieviti le proteine di patata e i prodotti che sono stati sottoposti a procedimenti quali l estrusione la fioccatura ed il riscaldamento Interpretazione dei risultati Se il valore ottenuto con il procedimento B pi elevato di quello ottenuto con il procedimento A si considera valore reale il risultato ottenuto con il procedimento B Principio Procedimento A Il campione estratto con etere di petrolio Il solvente eliminato per distillazione e il residuo essiccato e pesato Procedimento B Il campione trattato a caldo con acido cloridrico La miscela raf freddata e filtrata Dopo essere stato lavato ed essiccato il residuo sottoposto all analisi secondo il procedimento A 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 50 3 Reattivi 3 1 Etere di petrolio intervallo di ebollizione 40 60 C L indice
14. nc tra 225 e 300 nm gli spettri del campione e dello standard registrati all apice del picco sul cromatogramma non debbono essere diversi per le parti dello spettro situate fra il 10 e il 100 dell assorbanza relativa Questo criterio rispettato quando sono presenti gli stessi valori massimi e quando in tutti i punti osservati lo scarto tra i due spettri non supera il 15 dell assorbanza dell analita standard c tra 225 e 300 nm gli spettri relativi all estratto del campione regi strati nel tratto ascendente all apice e nel tratto discendente del picco cromatografico non devono differire tra loro per le parti dello spettro situate fra il 10 e il 100 dell assorbanza relativa Questo criterio soddisfatto quando sono presenti gli stessi valori massimi e quando in tutti i punti osservati lo scarto tra gli spettri non supera il 15 dell assorbanza dello spettro all apice del picco 72 73 3 2 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 95 Se uno di questi criteri non soddisfatto la presenza dell analita non confermata Ripetibilit La differenza tra i risultati di due determinazioni parallele effettuate sullo stesso campione non deve superare 0 5 mg kg per contenuti di alofugi none sino a un massimo di 3 mg kg Recupero Per quanto riguarda il campione in bianco addizionato il recupero non inferiore all 80 Risultati di uno studio collaborativo stato organizzato uno studio collaborativo
15. 0 23 mol l Apparecchiatura L unit riscaldante per la mineralizzazione con soluzioni di acido solfo rico e di idrossido di potassio dotata di supporto per crogiolo filtrante 4 2 e di un tubo di uscita con valvola di svuotamento e a vuoto eventualmente con aria compressa Prima dell uso quotidiano preriscal dare per cinque minuti l unit con acqua bollente Crogiolo filtrante in vetro con filtro in vetro sinterizzato dimensione dei pori 40 90 um Prima della messa in uso riscaldare a 500 C per alcuni minuti e raffreddare 8 6 Cilindro da almeno 270 ml con refrigerante a ricadere adatto all ebolli zione Stufa per essiccazione con termostato Forno a muffola con termostato Unit per estrazione consistente in una piastra di supporto per il crogiolo filtrante 4 2 e in un tubo di scarico con valvola di svuotamento e a vuoto Anelli di giunzione per assemblare l unit riscaldante 4 1 il crogiolo 4 2 e il cilindro 4 3 e per collegare l unit di estrazione a freddo 4 6 e il crogiolo Procedimento Pesare con l approssimazione di 1 mg 1 g del campione preparato e introdurlo nel crogiolo 4 2 cfr osservazioni ai punti 8 1 8 2 e 8 3 e aggiungere 1 g di coadiuvante di filtrazione 3 3 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 53 Assemblare l unit riscaldante 4 1 e il crogiolo filtrante 4 2 quindi applicare il cilindro 4 3 al crogiolo Versare 150 ml di acido solforico bollente 3 1
16. Alimenti per animali diversi da quelli menzionati ai punti 4 2 2 e 4 2 3 Tarare con la precisione di 1 mg un recipiente 3 3 provvisto di coperchio Pesare nel recipiente tarato con l approssimazione di 1 mg circa 5 g di prodotto e ripartirli uniformemente Porre il recipiente senza coperchio nella stufa preriscaldata a 103 C Per evitare che la tempe ratura della stufa scenda troppo introdurre il recipiente nel pi breve tempo possibile Lasciare essiccare per quattro ore a partire dal momento in cui la stufa ha nuovamente raggiunto la temperatura di 103 C Ri mettere il coperchio sul recipiente estrarre quest ultimo dalla stufa la sciare raffreddare per 30 45 minuti nell essiccatore 3 6 e pesare con l approssimazione di 1 mg Nel caso di alimenti costituiti essenzialmente da sostanze grasse lasciare essiccare per altri 30 minuti nella stufa a 130 C La differenza tra le due pesate non deve superare lo 0 1 di umidit Cereali farine semole e semolini Tarare con la precisione di 0 5 mg un recipiente 3 3 provvisto di coperchio Pesare nel recipiente tarato con l approssimazione di 1 mg 5 g circa di prodotto macinato e ripartirlo uniformemente Porre il reci piente senza coperchio nella stufa preriscaldata a 130 C Per evitare che la temperatura della stufa scenda troppo introdurre il recipiente nel pi breve tempo possibile Lasciare essiccare per due ore a partire dal momento in cui la stufa ha nuovame
17. DETERMINAZIONE DELLA VITAMINA E Finalit e campo d applicazione Il metodo consente di determinare il contenuto di vitamina E negli alimenti per animali e nelle premiscele Il contenuto di vitamina E espresso in mg di acetato di DL a tocoferolo per kg 1 mg di acetato di DL a tocoferolo corrisponde a 0 91 mg di DL a tocoferolo vitamina E Il limite di quantificazione di 2 mg di vitamina E kg Tale limite ottenibile unicamente mediante rivelatore a fluorescenza Utilizzando un rivelatore UV il limite di quantificazione di 10 mg kg Principio Il campione idrolizzato con una soluzione etanolica di idrossido di potassio e la vitamina E estratta in etere di petrolio Il solvente viene rimosso per evaporazione e il residuo disciolto in metanolo e se necessario diluito alla concentrazione richiesta Il contenuto di vitamina E viene determinato per cromatografia liquida ad alta prestazione a fase inversa RP HPLC utilizzando un rivelatore UV o a fluorescenza Reattivi Etanolo c 96 Etere di petrolio intervallo di ebollizione 40 60 C Metanolo Soluzione di idrossido di potassio c 50 g 100 ml Soluzione di ascorbato di sodio c 10 g 100 ml cfr osservazione al punto 7 7 Solfuro di sodio Na S x H20 x 7 9 Soluzione di solfuro di sodio c 0 5 mol l in glicerolo B 120 g l per x 9 cfr osservazione al punto 7 8 Soluzione di fenolftaleina c 2 g 100 ml in etanolo 3 1 Fase mobile pe
18. HZ 73 3 2 3 3 3 4 3 5 4 2 4 3 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 31 Per bassi tenori di urea aumentare la quantit di campione da sottoporre all analisi fino a quando il filtrato resta limpido ed incolore Quando il prodotto contiene composti azotati semplici ad esempio am minoacidi si effettua la misurazione della densit ottica a 435 nm E DETERMINAZIONE DELLE BASI AZOTATE VOLATILI I PER MICRODIFFUSIONE Finalit e campo d applicazione Il metodo consente di determinare il contenuto di basi azotate volatili espresse in ammoniaca degli alimenti per gli animali Principio Il campione viene estratto con acqua la soluzione viene chiarificata e filtrata Le basi azotate volatili sono spostate per mezzo di una soluzione di carbonato di potassio per microdiffusione raccolte in una soluzione di acido borico e titolate con acido solforico Reattivi Soluzione al 20 p v di acido tricloroacetico Indicatore sciogliere 33 mg di verde di bromocresolo e 65 mg di rosso di metile in 100 ml d etanolo al 95 96 v v Soluzione di acido borico in un pallone tarato da 1 litro sciogliere 10 g d acido borico in 200 ml d etanolo al 95 96 v v e 700 ml d acqua Aggiungere 10 ml di indicatore 3 2 Mescolare e aggiustare se neces sario il colore della soluzione al rosso chiaro mediante aggiunta di una soluzione d idrossido di sodio 1 ml di questa soluzione consente di fissare al mas
19. Riscaldare sul bagno di sabbia o sulla piastra riscaldante 3 3 agitando continuamente con il termometro in modo da far salire la temperatura a 90 C in circa 7 minuti Ridurre l intensit del riscaldamento secondo la frequenza con la quale le bolle risalgono dal fondo del recipiente La temperatura non deve supe rare i 105 C Continuare ad agitare raschiando il fondo del recipiente sino a quando non si formano pi bolle Per assicurare l eliminazione completa dell umidit riscaldare pi volte a 103 2 C raffreddando a 93 C tra i riscaldamenti successivi Lasciare quindi raffreddare nell essiccatore 3 4 sino a temperatura ambiente e pesare Ripetere l operazione fino a quando la perdita di peso tra due pesate consecutive non supera i 2 mg Nota Un aumento del peso del campione dopo i ripetuti riscaldamenti indica un ossidazione del grasso In questo caso calcolare il risul tato basandosi sulla pesata effettuata immediatamente prima che il peso abbia incominciato ad aumentare Calcolo dei risultati Il contenuto di umidit espresso in percentuale del campione dato dalla seguente formula 100 X m m x m 322 3 3 3 4 3 5 3 6 3 7 3 8 3 9 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 25 dove m peso in grammi della quantit di prodotto sottoposta all analisi mj peso in grammi del recipiente con il suo contenuto prima del riscaldamento m peso in gram
20. The Analyst 108 1983 pagg 1252 1256 3 3 3 4 39 3 6 3 1 3 8 3 9 3 9 1 39 2 39 3 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 96 Acetonitrile di qualit HPLC Setacci molecolari Sferette di tipo 3A 8 12 mesh 1 6 2 5 mm alluminosilicato cristallino diametro dei pori 0 3 mm Allumina acida grado di attivit I per cromatografia su colonna Trasferire 100 g di allumina acida in un contenitore adatto e aggiungere 2 0 ml di acqua Tappare e agitare per circa 20 minuti Conservare in un contenitore ben chiuso Soluzione di potassio diidrogeno fosfato c 0 025 mol l Sciogliere 3 40 g di potassio diidrogeno fosfato in acqua qualit HPLC in un matraccio tarato da 1 000 ml portare a volume e agitare Soluzione di fosfato di sodio bibasico c 0 025 mol l Sciogliere 3 55 g di fosfato di sodio bibasico anidro o 4 45 g di dii drato o 8 95 g di dodecaidrato in acqua di qualit HPLC in un matraccio tarato da 1 litro portare a volume e agitare Fase mobile per HPLC Miscelare i seguenti reattivi 650 ml di acetonitrile 3 3 250 ml di acqua di qualit HPLC 50 ml di soluzione di potassio diidrogeno fosfato 3 6 50 ml di soluzione di fosfato di sodio bibasico 3 7 Filtrare la soluzione attraverso un filtro di 0 22 um 4 6 e degassarla ad esempio sottoponendola per 10 minuti a trattamento con ultrasuoni Sostanza di riferimento standard Robenidina pura 1
21. di 0 84 a 246 nm e di 0 80 a 262 nm L estratto deve essere sempre diluito con la fase mobile poich altrimenti il tempo di ritenzione del picco dell amprolium potrebbe spostarsi signi ficativamente per effetto delle variazioni della forza ionica D DETERMINAZIONE DEL CARBADOX Metil 3 2 chinossalinilinmetilene carbazato N N diossido Finalit e campo d applicazione Il metodo consente di determinare il contenuto di carbadox negli ali menti per animali nelle premiscele e nei preparati Il limite di rileva zione di 1 mg kg la soglia di quantificazione di 5 mg kg Principio Il campione viene equilibrato con acqua ed estratto con metanolo ace tonitrile Nel caso degli alimenti per animali un aliquota dell estratto filtrato sottoposta a purificazione su una colonna di allumina Per le premiscele e i preparati un aliquota dell estratto filtrato diluita con acqua metanolo e aceto nitrile fino a ottenere una concentrazione ade guata Il contenuto di carbadox determinato mediante cromatografia liquida ad alta prestazione HPLC in fase inversa usando un rivelatore UV Reattivi Metanolo Acetonitrile di qualit HPLC Acido acetico w 100 Ossido d alluminio neutro grado di attivit I Metanolo acetonitrile 1 1 v v Miscelare 500 ml di metanolo 3 1 con 500 ml di acetonitrile 3 2 Acido acetico c 10 Diluire con acqua 10 ml di acido acetico 3 3 e portare a 100 ml Acetato di sodio A
22. direttiva 1999 27 CE della Commissione del 20 aprile 1999 che fissa i metodi di analisi comunitari per la determinazione dell amprolium del diclazuril e del carbadox negli alimenti per animali che modifica le direttive 71 250 CEE e 73 46 CEE e che revoca la direttiva 74 203 CEE 8 direttiva 1999 76 CE della Commissione del 23 luglio 1999 che fissa i metodi di analisi comunitari per la determinazione del lasalocid sodico negli alimenti per animali direttiva 2000 45 CE della Commissione del 6 luglio 2000 che fissa i metodi di analisi comunitari per la determinazione della vitamina A della vitamina E e del triptofano negli alimenti per animali direttiva 2002 70 CE della Commissione del 26 luglio 2002 GU C GU GU C GU 9 GU C GU GU C GU 19 GU GU che stabilisce i requisiti per la determinazione dei livelli di diossine e PCB diossina simili nei mangimi C GU L 206 del 29 7 1978 pag 43 L 257 del 10 9 1981 pag 38 L 238 del 6 9 1984 pag 34 L 130 del 16 5 1986 pag 53 L 234 del 17 9 1993 pag 17 L 329 del 30 12 1993 pag 54 L 257 del 19 9 1998 pag 14 L 118 del 6 5 1999 pag 36 L 207 del 6 8 1999 pag 13 L 174 del 13 7 2000 pag 32 L 209 del 6 8 2002 pag 15 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 4 vB direttiva 2003 126 CE della Commissione del 23 dicembre 2003 che stabilisce il metodo analitico per la determina
23. sito web dell EURL AP Esempi di Master Mix funzionali sono disponibili sul sito web dell EURL AP 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 144 vm 2 2 5 Amplificazione genica L amplificazione genica effettuata utilizzando i metodi convali dati per ciascuna specie da identificare indicati nelle POS stabilite dall EURL AP e pubblicate sul suo sito web Ogni estratto di DNA analizzato almeno a due diverse diluizioni per valutare l inibi zione Per ogni specie bersaglio sono preparati due controlli di amplifi cazione come descritto dalla norma ISO 24276 per ciascuna piastra o serie di saggi PCR utilizzato un con trollo positivo del DNA bersaglio per ciascuna piastra o serie di saggi PCR utilizzato un con trollo di amplificazione dei soli reagenti controllo no templa te 2 2 6 Interpretazione ed espressione dei risultati Quando comunica i risultati il laboratorio indica almeno il peso delle aliquote sottoposte ad analisi la tecnica di estrazione utiliz zata il numero delle determinazioni eseguite e il limite di rileva zione del metodo I risultati non devono essere interpretati e comunicati se il controllo positivo dell estrazione del DNA e i controlli positivi del DNA bersaglio non forniscono risultati positivi per il bersaglio analizza to mentre il controllo di amplificazione dei soli reagenti negati VO Se i risultati delle due aliquote del campione analizzat
24. working range Particolare attenzione prestata alla qualit del fit della curva nel working range Il valore R come tale di scarsa o nessuna utilit nella stima della bont del fit in regres sione non lineare Un migliore fit ottenuto minimizzando la diffe renza tra i livelli calcolati e osservati nel working range ad esempio minimizzando la somma dei quadrati residui Il livello stimato nell estratto del campione quindi corretto del livello BEQ calcolato per un campione bianco di matrice solvente per tener conto delle impurit provenienti dai solventi e dalle so stanze chimiche utilizzate e del recupero apparente calcolato a par tire dal livello BEQ di idonei campioni di riferimento con pattern di congeneri rappresentativi attorno al livello di interesse Per effettuare una correzione del recupero il recupero apparente deve situarsi entro il range richiesto cfr punto 8 1 4 I campioni di riferimento utiliz zati per la correzione del recupero devono rispondere ai requisiti indicati al punto 8 2 8 1 2 2 Calibrazione con campioni di riferimento In alternativa pu essere utilizzata una curva di calibrazione preparata a partire da almeno 4 campioni di riferimento cfr punto 8 2 4 un bianco matrice pi tre campioni di riferimento a 0 5 x 1 0 x 2 0 x il livello di interesse attorno al livello di interesse il che rende superflua la corre zione del bianco e del recupero In tal caso la risposta al tes
25. 0 2 0 3 0 4 0 e 5 0 ml della soluzione standard intermedia di metilbenzoquato 3 7 2 Portare a volume con la fase mobile 3 3 e miscelare Queste soluzioni presentano rispettivamente concentrazioni di 2 0 4 0 6 0 8 0 e 10 0 ug ml di metilbenzoquato Esse devono essere preparate al momen to poco prima dell uso Apparecchiatura Agitatore da laboratorio Evaporatore rotante a film Colonna di vetro 250 mm x 15 mm dotata di rubinetto e serbatoio della capacit di circa 200 ml Apparecchiatura HPLC a rivelatore UV a lunghezza d onda variabile oppure rivelatore a serie di diodi Colonna per cromatografia liquida 300 mm x 4 mm C g particelle di riempimento 10 um o equivalente Filtri a membrana da 0 22 um Filtri a membrana da 0 45 um Procedimento Indicazioni generali Analizzare un campione di alimento bianco per accertare l assenza del metilbenzoquato o di altre sostanze che possono interferire Procedere a una prova di recupero analizzando un campione in bianco dell alimento addizionato con una quantit di metilbenzoquato simile a quella presente nel campione Per ottenere una concentrazione di 15 mg kg aggiungere 600 pl della soluzione madre standard 3 6 1 a 20 g dell alimento bianco mescolare e attendere 10 minuti prima di procedere all estrazione 5 2 Nota Ai fini del presente metodo l alimento bianco ha una composi zione simile a quella del campione e all analisi il metilbenzoquato non deve risul
26. 1 La porzione di campione pesata deve avere un contenuto di azoto di circa 10 mg Aggiungere con cautela 25 ml di miscela di idrolisi 3 20 e miscelare con il campione Procedere come indicato al punto 5 3 2 3 o 5 3 2 4 Idrolisi sistema aperto Aggiungere 3 biglie di vetro alla miscela preparata conformemente al punto 5 3 2 1 o 5 3 2 2 contenuta nel pallone e far bollire a ricadere per 23 ore a ebollizione continua Al completamento dell idrolisi risciac quare il refrigerante con 5 ml di tampone citrato 3 24 Togliere il pallone e farlo raffreddare in un bagno di ghiaccio Procedere come indicato al punto 5 3 3 Idrolisi sistema chiuso Introdurre il flacone contenente la miscela preparata conformemente al punto 5 3 2 1 o 5 3 2 2 in un forno 4 3 a 110 C Durante la prima ora allo scopo di evitare un accumulo di pressione in conseguenza dello sviluppo di sostanze gassose e di evitare un esplosione porre il tappo a vite sopra al recipiente senza chiuderlo Dopo un ora chiudere il recipiente con il tappo e lasciarlo nel forno 4 3 per 23 ore Al com pletamento dell idrolisi togliere il flacone dal forno aprire con cautela il tappo del flacone e introdurre il flacone in un bagno di acqua e ghiaccio Lasciar raffreddare Secondo la procedura usata per la regolazione del pH 5 3 3 trasferire quantitativamente il contenuto del flacone in un becher da 250 ml o in un pallone a fondo tondo da 250 ml utilizzando tampone citra
27. 15 del risultato pi ele vato 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 77 9 Risultati di uno studio effettuato in cooperazione tra vari laborato ri Alimento pre Concentrato Concentrato Premiscela i i miscelato minerale proteico RR Roe a BE media UI kg 17 02 x 109 1 21 x 106 537 100 151 800 Alimento per suinetti 13 49 18 070 682 s UI kg 0 51 x 106 0 039 x 106 22 080 12 280 r Ul kg 1 43 x 106 0 109 x 106 61824 34 384 L numero di laboratori n numero di valori singoli sr deviazione standard della ripetibilit sg deviazione standard della riproducibilit r ripetibilit R riproducibilit CV coefficiente di variazione della ripetibilit CVRQ coefficiente di variazione della riproducibilit Studio effettuato dal gruppo di lavoro Alimenti per animali del Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs und Forschungsanstalten VDLUFA 1910 3 8 3 614 10 119 20 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 78 Figura 1 Dispositivo di estrazione 4 8 un cilindro di vetro 4 8 1 altezza approssimatiya 48 cm insert di vetro smerigliato 4 8 2 lunghezza approssimativa 45 cm _ tubo regolabile etere di petrolio strato acquoso saponificazione 322 3 3 3 4 3 5 3 6 3 6 1 3 7 3 8 3 9 3 10 1 3 111 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 79 B
28. 2 2 6 Plastiche standard per biologia molecolare microprovette per mi crocentrifuga puntali con filtro per micropipette piastre adatte al termociclatore 2 2 2 2 1 Congelatori per la conservazione dei campioni e dei reagenti 223 Campionamento e preparazione del campione 2 2 3 1 Campionamento Deve essere utilizzato un campione rappresentativo prelevato se condo le prescrizioni dell allegato I 2 2 3 2 Preparazione del campione La preparazione dei campioni di laboratorio fino all estrazione del DNA deve avvenire secondo le prescrizioni dell allegato II Dal campione prelevato e successivamente macinato un sottocam pione di almeno 50 g da analizzare La preparazione del campione deve essere effettuata in un locale diverso da quelli utilizzati per l estrazione del DNA e per le rea zioni di amplificazione genica come descritto dalla norma ISO 24276 Preparare due aliquote del campione in analisi ciascuna di peso non inferiore a 100 mg 2 2 4 Estrazione del DNA L estrazione del DNA effettuata su ogni aliquota da saggio pre parata utilizzando le POS stabilite dall EURL AP e pubblicate sul suo sito web Per ciascuna serie di estrazioni sono preparati due controlli di estrazione come descritto dalla norma ISO 24276 un controllo di estrazione in bianco un controllo di estrazione del DNA positivo L elenco dei primer e delle sonde per ciascuna specie animale bersaglio disponibile sul
29. 3 ore lasciati raffreddare e addizionati di alcune gocce di una soluzione al 20 di nitrato d ammonio o acqua con cautela per evitare la proiezione o l aggregazione delle ceneri Prose guire la calcinazione dopo essiccazione nel forno Ripetere eventual mente l operazione fino a completo incenerimento Per i prodotti che resistono al trattamento di cui al punto 7 1 operare come segue dopo un incenerimento di 3 ore trasferire le ceneri in acqua calda e filtrare su un piccolo filtro senza ceneri Incenerire il filtro e il suo contenuto nello stesso crogiolo Aggiungere il filtrato nel crogiolo raffreddato portare a secco incenerire e pesare Nel caso degli oli e dei grassi pesare esattamente una quantit di prodotto di 25 g in un crogiolo di capacit appropriata Carbonizzare accendendo il prodotto per mezzo di una miccia di carta da filtro senza ceneri Dopo combustione umettare con la quantit minima d acqua Essiccare e incenerire come indicato al punto 5 TL 12 2 2 3 2 3 3 4 2 4 3 5 1 35 2 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 64 N DETERMINAZIONE DELLE CENERI INSOLUBILI IN ACIDO CLORIDRICO Finalit e campo d applicazione Il metodo consente di determinare il contenuto di sostanze minerali insolubili nell acido cloridrico presenti negli alimenti per gli animali Si pu procedere in due modi in funzione della natura del campione Metodo A applicabile alle materie prime di ori
30. 4 00 5 37 sr mg kg 5 29 3 47 3 49 CVr 5 69 7 18 10 70 Contenuto 5 000 16000 80 105 120 50 35 nominale mg kg contenuto dichiarato dal produttore alimento preparato in laboratorio L numero di laboratori n numero di valori singoli sr deviazione standard della ripetibilit sg deviazione standard della riproducibilit CV coefficiente di variazione della ripetibilit CVRQ coefficiente di variazione della riproducibilit Analyst 1995 120 2175 2180 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 111 ALLEGATO V METODI DI ANALISI PER IL CONTROLLO DELLA PRESENZA DI SOSTANZE INDESIDERABILI NEGLI ALIMENTI PER ANIMALI A DETERMINAZIONE DEL GOSSIPOLO LIBERO E TOTALE i Finalit e campo d applicazione Il metodo consente di determinare i livelli di gossipolo libero di gossi polo totale e di sostanze chimicamente affini nei semi nelle farine e nei panelli di cotone nonch negli alimenti composti che contengono tali materie prime Il limite inferiore di determinabilit del metodo di 20 mg kg 2 Principio Il gossipolo viene estratto in presenza di 3 amino 1 propanolo con una miscela di isopropanolo esano nel caso della determinazione del gossi polo libero e con la dimetilformamide nel caso della determinazione del gossipolo totale Il gossipolo trasformato mediante anilina in gossipo lo dianilina la cui densit ottica misu
31. 5 0 10 0 e 20 0 ml della soluzione madre standard 3 11 1 in una serie di matracci tarati da 100 ml Aggiungere 30 ml d acqua portare a volume con metanolo acetonitrile 3 5 e mescolare Avvolgere i matracci in foglio d alluminio Queste soluzioni corrispon dono rispettivamente a 2 0 5 0 10 0 e 20 0 ug ml di carbadox Le soluzioni di taratura devono essere preparate al momento poco prima dell uso Nota per la determinazione del carbadox negli alimenti per animali contenenti meno di 10 mg kg si dovranno preparare soluzioni di taratura a concentrazioni inferiori a 2 0 ug ml Miscela acqua metanolo acetonitrile 3 5 300 700 v v Mescolare 300 ml d acqua con 700 ml della miscela di metanolo aceto nitrile 3 5 Apparecchiatura Agitatore da laboratorio o mescolatore magnetico Carta da filtro in fibra di vetro Whatman GF A o equivalente Colonna in vetro lunghezza 300 400 mm diametro interno 10 mm circa con setto in vetro sinterizzato e valvola di scarico Nota Si pu anche impiegare una colonna di vetro provvista di rubi netto oppure una colonna di vetro a estremit affusolata In questo caso si deve inserire un piccolo tampone di lana di vetro all estre mit inferiore e pressarlo verso il basso con una bacchetta di vetro Apparecchiatura HPLC con sistema di iniezione adeguato per volumi da 20 pl Colonna per cromatografia liquida 300 mm x 4 mm C g particelle di riempimento 10 um o equivalente
32. 50 ml portare a volume con tampone citrato 3 24 e miscelare Conservare a temperatura inferiore a 5 C al massimo per 3 mesi Cfr anche le osservazioni al punto 9 1 Soluzione di taratura degli amminoacidi standard da usarsi con idroliz zati preparati secondo quanto prescritto al punto 5 3 3 1 e destinati al l uso con estratti 5 2 Preparare la soluzione di taratura secondo quanto indicato al punto 3 27 4 ma senza cloruro di sodio Conservare a temperatura inferiore a 5 C al massimo per 3 mesi Apparecchiatura Pallone a fondo arrotondato da 100 o 250 ml provvisto di refrigerante a ricadere Flacone di vetro borosilicatico da 100 ml con tappo a vite e guarnizione di gomma teflon ad esempio Duran Schott utilizzabile in stufa Stufa a ventilazione forzata con regolazione della temperatura avente una precisione superiore a 2 C pH metro a tre cifre decimali Filtro a membrana da 0 22 um Centrifuga Evaporatore rotante sotto vuoto Agitatore meccanico o mescolatore magnetico 4 9 5 1 5 2 5 3 5 3 1 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 37 Analizzatore di amminoacidi o apparecchiatura HPLC provvista di co lonna a scambio ionico dispositivo per ninidrina derivatizzatore post colonna e rivelatore fotometrico La colonna deve essere riempita di resine polistireniche sulfonate in grado di separare gli amminoacidi uno dall altro e da altri prodotti reat tivi alla ninidrina Il
33. 8 3 Determinazione dei valori di cut off stabilito il rapporto tra i risultati bioanalitici in BEQ e i risultati GC HRMS in TEQ ad esempio mediante esperimenti di calibrazione matrix matched con campioni di riferimento spiked a 0 0 5 x 1 x e 2 x il livello massimo con 6 ripetizioni ad ogni livello n 24 I fattori di correzione bianco e recupero possono essere stimati in base a questo rapporto ma sono controllati come indicato al punto 8 2 2 Sono stabiliti valori di cut off per la decisione sulla conformit del campione ai livelli massimi o per il controllo delle soglie d intervento se pertinente con i rispettivi livelli di interesse fissati singolarmente per PCDD PCDF e PCB diossina simili o per la somma di PCDD F e PCB diossina simili Essi sono rappresentati dall endpoint inferiore della di stribuzione dei risultati bioanalitici corretti del bianco e del ricupero corrispondente al limite di decisione GC HRMS in base a un livello di fiducia del 95 implicante un tasso di falsi conformi lt 5 e a un RSDp lt 25 Il limite di decisione GC HRMS il livello massimo tenendo conto dell incertezza di misura Il valore di cut off value in BEQ pu essere calcolato in uno dei modi indicati ai punti 8 3 1 8 3 2 e 8 3 3 cfr figura 1 8 3 1 Uso della banda inferiore dell intervallo di predizione del 95 al limite di decisione GC HRM Valore di cut off BEQpL Syx taf m 2 Vin 1 m x
34. 9 6 I risultati sono espressi nelle stesse unit e con almeno lo stesso numero di cifre significative dei livelli massimi stabiliti dalla direttiva 2002 32 CE 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 134 vm ALLEGATO VI METODI D ANALISI PER LA DETERMINAZIONE DEI COSTITUENTI DI ORIGINE ANIMALE NELL AMBITO DEL CONTROLLO UFFICIALE DEGLI ALIMENTI PER ANIMALI l FINALIT E CAMPO DI APPLICAZIONE La determinazione dei costituenti di origine animale negli alimenti per animali eseguita mediante microscopia ottica o mediante reazione a catena della polimerasi PCR in conformit alle dispo sizioni del presente allegato Questi due metodi permettono di individuare la presenza di costi tuenti di origine animale nelle materie prime per mangimi e nei mangimi composti ma non di calcolarne la quantit Entrambi i metodi presentano un limite di rilevazione inferiore a 0 1 p p Il metodo PCR consente di identificare il gruppo tassonomico dei costituenti di origine animale presenti nelle materie prime per man gimi e nei mangimi composti Questi metodi si applicano per il controllo dell applicazione dei divieti di cui all articolo 7 paragrafo 1 e all allegato IV del rego lamento CE n 999 2001 e all articolo 11 paragrafo 1 del rego lamento CE n 1069 2009 In funzione del tipo di alimento per animali analizzato questi metodi possono essere utilizzati entro un unico protocollo opera tivo singolarmente
35. Ai fini dell applicazione della direttiva 70 373 CEE sono stati adottati e rimangono in vigore conformemente all articolo 61 paragrafo 2 del regolamento CE n 882 2004 i seguenti atti normativi prima direttiva 71 250 CEE della Commissione del 15 giugno 1971 che fissa i metodi d analisi comunitari per controlli ufficiali degli alimenti per gli animali seconda direttiva 71 393 CEE della Commissione del 18 no vembre 1971 che fissa i metodi d analisi comunitari per i controlli ufficiali degli alimenti per gli animali terza direttiva 72 199 CEE della Commissione del 27 aprile 1972 che fissa i metodi di analisi comunitari per i controlli degli alimenti per gli animali quarta direttiva 73 46 CEE della Commissione del 5 dicembre 1972 che fissa i metodi d analisi comunitari per i controlli ufficiali degli alimenti per gli animali 5 prima direttiva 76 371 CEE della Commissione del 1 marzo 1976 che fissa 1 modi comunitari di prelevamento dei cam pioni per il controllo ufficiale degli alimenti per gli anima li 9 settima direttiva 76 372 CEE della Commissione del 1 marzo 1976 che fissa i metodi d analisi comunitari per i controlli ufficiali degli alimenti per gli animali 7 GU L 165 del 30 4 2004 pag 1 rettifica nella GU L 191 del 28 5 2004 pag 1 GU L 155 del 12 7 1971 pag 13 C GU L 279 del 20 12 1971 pag 7 4 GU L 123 del 29 5 1972 pag 6 GU
36. EN ISO IEC 17025 8 Caratteristiche di performance criteri per la somma dei sei PCB indicatori al livello di interesse Esattezza da 30 a 30 Precisione intermedia RSD lt 20 Differenza tra calcolo upperbound e lt 20 lowerbound 9 Reporting dei risultati 9i Se la procedura analitica impiegata lo consente i risultati dell analisi contengono i livelli dei singoli congeneri di PCB e sono espressi come lowerbound upperbound e mediumbound per includere un mas simo di informazione nel reporting dei risultati e permettere cos l inter pretazione dei risultati secondo requisiti specifici 93 l rapporto indica il metodo utilizzato per l estrazione di PCB e lipidi 9 3 I recuperi dei singoli standard interni sono indicati se si situano al di fuori del range menzionato al punto 6 se il livello massimo superato e in altri casi su richiesta 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 133 vmi 9 4 Poich nel decidere della conformit di un campione occorre tener conto dell incertezza di misura deve essere indicato anche questo parametro I risultati analitici sono pertanto espressi come x U dove x il risultato analitico e U l incertezza di misura estesa calcolata per mezzo di un fattore di copertura 2 che d un livello di fiducia del 95 circa 9 5 Se si tiene conto dell incertezza di misura applicando il CCa come descritto al punto 2 1 del capo I questo parametro indicato
37. I sciogliere in acqua 21 9 g di acetato di zinco Zn CH COO 2H 0 e 3 g di acido acetico glaciale Portare a 100 ml con acqua Soluzione di Carrez II sciogliere in acqua 10 6 g di ferrocianuro di potassio K4 Fe CN 3H30 Portare a 100 ml con acqua Reattivo di Luff Schoorl versare agitando sempre lentamente la soluzione di acido citrico 3 4 2 nella soluzione di carbonato di sodio 3 4 3 Aggiungere la soluzione di solfato di rame 3 4 1 e portare al volume di 1 litro con acqua Lasciar riposare una notte e filtrare Controllare la concentrazione del reattivo cos ottenuto Cu 0 05 mol l Na CO 1 mol 1 Il pH della soluzione circa 9 4 Soluzione di solfato di rame sciogliere 25 g di solfato di rame Cu SO 5H30 esente da ferro in 100 ml d acqua Soluzione di acido citrico sciogliere 50 g di acido citrico CoHg07 H30 in 50 ml d acqua Soluzione di carbonato di sodio sciogliere 143 8 g di carbonato di sodio anidro in circa 300 ml d acqua calda Lasciar raffreddare Granuli di pietra pomice bolliti nell acido cloridrico lavati in acqua ed essiccati Soluzione al 30 p v di ioduro di potassio Acido solforico 3 mol l Soluzione di tiosolfato di sodio 0 1 mol l Soluzione d amido aggiungere una miscela di 5 g d amido solubile in 30 ml d acqua a 1 litro d acqua bollente Far bollire per 3 minuti lasciar raffreddare e aggiungere eventualmente come conservante 10 mg di ioduro di mercurio Apparecch
38. Rivelatore UV con regolazione variabile della lunghezza d onda o rive latore a serie di diodi funzionante nell intervallo di 225 400 nm Filtro a membrana da 0 22 um Filtro a membrana da 0 45 um Bagno ultrasonico Sil SL 52 5 2 1 5 2 2 5 2 3 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 161 Procedimento Nota Il carbadox fotosensibile Effettuare tutte le operazioni in luce soffusa oppure usare vetreria scura o avvolta in foglio d alluminio Indicazioni generali Alimento bianco Per poter procedere alla prova di recupero 5 1 2 analizzare un alimento di riferimento bianco per accertare l assenza di carbadox o di altre sostanze che possono interferire Il bianco ha una composizione simile a quella del campione e all analisi il carbadox o sostanze capaci di interferire non devono risultare presenti Prova di recupero Effettuare una prova di recupero analizzando il bianco 5 1 1 addizio nato di una quantit di carbadox simile a quella presente nel campione Per ottenere una concentrazione di 50 mg kg introdurre 5 0 ml della soluzione madre standard 3 11 1 in una beuta da 200 ml Far evaporare la soluzione a 0 5 ml circa in corrente di azoto Aggiungere 10 g dell alimento bianco mescolare per 10 minuti prima di procedere al l estrazione 5 2 Se non fosse disponibile un bianco di tipo simile a quello del campione cfr punto 5 1 1 la prova di recupero pu essere eseguita col metodo di
39. a meno che a seguito di un esame dettagliato non risulti alcuna prova che confermi che anche il resto del lotto non soddisfa i requisiti UE 2 DEFINIZIONI Lotto quantit determinata di mangime che possiede caratteristiche comuni come l origine la variet il tipo di imballaggio l identit dell imballatore lo speditore o l etichettatura e nel caso di un pro cesso produttivo un unit di produzione prodotta in un singolo im pianto applicando parametri di produzione uniformi o pi unit di produzione di questo tipo se prodotte in ordine continuo e imma gazzinate insieme Partita campionata lotto o parte identificata del lotto o del sottolotto Campione sigillato campione sigillato in modo tale da non essere accessibile senza la rottura o l asportazione del sigillo Campione elementare quantit prelevata da un punto della partita campionata Campione globale insieme di campioni elementari prelevati da una stessa partita campionata Campione ridotto parte del campione globale ottenuta mediante ri duzione rappresentativa di quest ultimo Campione finale parte del campione ridotto o del campione globale omogeneizzato Campione di laboratorio campione destinato al laboratorio come ricevuto dal laboratorio che pu essere il campione finale il cam pione ridotto o il campione globale 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 7 vm3 3 DISPOSIZIONI GENERALI
40. aflatossine della segale cornuta di altre micotossine e impurit botaniche nocive nelle materie prime per alimenti per ani mali controllo della contaminazione crociata da un costituente incluso il materiale geneticamente modificato o da una sostanza presumibil mente non distribuita in modo uniforme nelle materie prime per alimenti per animali Nel caso che l autorit di controllo sospetti fortemente che una tale distribuzione non uniforme si presenti anche in caso di contaminazione crociata da un componente o da una sostanza in un alimento per animali composto si possono applicare i requisiti quantitativi indicati nella ta bella che segue Ditaenzioni re de SAID Numero minimo di campioni elementari lt 80 tonnellate Cfr i requisiti quantitativi al punto 5 1 Il numero di campioni elementari da prelevare si moltiplica per 2 5 gt 80 tonnellate 100 5 3 Requisiti quantitativi relativi ai campioni elementari nel caso di lotti molto grandi Nel caso di grandi partite campionate gt 500 tonnellate numero di campioni elementari da prelevare 40 campioni elementari V delle tonnellate per il controllo di sostanze o prodotti ripartiti in modo uni forme nell alimento oppure 100 campioni elementari V delle tonnel late per il controllo di costituenti o sostanze presumibilmente distribuiti in modo non uniforme nelle materie prime per alimenti per animali 6 REQUISITI QUANTITATIVI RIGUARDANTI IL CAMPIONE GLO BAL
41. al di sotto e al di sopra del livello massimo o della soglia di intervento I tassi reali di falsi conformi sono inferiori al 5 Se si dispone di un minimo di 20 risultati confermati per matrice gruppo di matrici dal controllo di qualit dei campioni conformi da questa base di 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 123 vmi dati sono tratte conclusioni sul tasso di falsi conformi I risultati dei campioni analizzati in ring trial o durante incidenti di contaminazione che coprono un range di concentrazione fino a per esempio 2 x il livello massimo LM possono essere inclusi nel minimo di 20 risultati per la valutazione del tasso di falsi conformi I campioni coprono i pattern di congeneri pi frequenti rappresentanti varie fonti Anche se i dosaggi di screening sono diretti principalmente a individuare campioni che superano la soglia d intervento il criterio per la determi nazione dei tassi di falsi conformi il livello massimo tenendo conto dell incertezza di misura del metodo di conferma 6 7 7 I campioni sospetti non conformi dello screening sono sempre verificati con un metodo analitico di conferma GC HRMS Questi campioni possono anche essere utilizzati per valutare il tasso di risultati falsi conformi Per i metodi di screening il tasso di risultati falsi non con formi la frazione dei risultati confermati conformi dall analisi di con ferma GC HRMS quando nello screening precedente il campione stat
42. circa lo stesso volume e a circa la stessa concentrazione di metanolo 10 30 dell idrolizzato finito Questa soluzione deve essere preparata al momento prima dell uso Proteggere dalla luce solare diretta durante la preparazione Acido acetico 1 1 1 tricloro 2 metil 2 propanolo Etanolammina p p p gt 98 Soluzione di 1 g di 1 1 1 tricloro 2 metil 2 propanolo 3 19 in 100 ml di metanolo 3 8 Fase mobile per HPLC 3 00 g di acido acetico 3 18 900 ml di acqua 3 1 50 0 ml di soluzione 3 21 di 1 1 1 tricloro 2 metil 2 propanolo 3 19 in metanolo 3 8 1 g 100 ml regolare il pH a 5 00 utilizzando etanolammina 3 20 portare a 1 000 ml con acqua 3 1 Apparecchiatura Apparecchiatura HPLC con rilevatore spettrofluorimetrico Colonna per cromatografia liquida 125 mm x 4 mm C g particelle di riempimento 3 um o equivalente pH metro Matraccio di polipropilene capacit 125 ml a collo largo e coperchio a vite 4 5 4 6 4 7 4 8 3l 5 2 33 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 45 Filtro a membrana da 0 45 um Autoclave 110 2 C 1 4 0 1 bar Agitatore meccanico o mescolatore magnetico Miscelatore Vortex Procedimento Preparazione dei campioni Il campione viene triturato in modo che possa passare attraverso un vaglio da 0 5 mm I campioni molto umidi devono essere essiccati all aria a una temperatura non superiore a 50 C o liofilizzati pri
43. concentrazioni nominali di queste soluzioni sono 2 0 4 0 8 0 e 20 0 ug ml di DL a tocoferolo e cio 2 20 4 40 8 79 e 22 0 ug ml di acetato di DL a tocoferolo Iniettare pi volte 20 ul di ogni soluzione di taratura e determinare le altezze medie dei picchi aree Sulla base delle altezze medie aree dei picchi tracciare una curva di taratura Standardizzazione UV della soluzione madre di DL a tocoferolo 3 11 1 Diluire 2 0 ml della soluzione madre di DL a tocoferolo 3 11 1 sino a 25 0 ml con etanolo e misurare lo spettro UV di questa soluzione su etanolo 3 1 nello spettrofotometro 4 6 tra 250 nm e 320 nm Il massimo di assorbimento si situa a 292 nm E A 75 8 a 292 nm in etanolo A questa diluizione si dovrebbe ottenere un valore di estinzione di 0 6 Calcolo dei risultati Determinare la concentrazione della soluzione del campione in ug ml calcolata come acetato di a tocoferolo in base all altezza area media dei picchi della vitamina E per riferimento alla curva di taratura 5 6 1 2 o 5 6 2 2 Il contenuto w di vitamina E in mg kg del campione dato dalla seguente formula 500 x c x V2 w Ik Vix m mg kg dove c concentrazione di vitamina E come a tocoferolo nella soluzione del campione 5 4 in ug ml Vj volume della soluzione del campione 5 4 in ml V volume dell aliquota prelevata come indicato al punto 5 4 in ml m peso della quantit di sostanza da analizzare in g Oss
44. contenuto del matraccio collettore con la soluzione volume trica standard di acido cloridrico 3 19 o con la soluzione volumetrica standard di acido solforico 3 6 per mezzo di una buretta e leggere la quantit di soluzione titolata utilizzata Quando applicato il metodo di determinazione colorimetrica del punto finale si raggiunge il punto finale all apparire della prima traccia di colore rosa nel contenuto Valutare il contenuto della buretta con l ap prossimazione di 0 05 ml La visualizzazione del punto finale pu essere facilitata per mezzo di un rivelatore fotometrico E possibile farlo automaticamente per mezzo di un unit di distillazione in corrente di vapore a titolazione automatica Seguire le istruzioni del fabbricante relative al funzionamento dell unit di distillazione o del distillatore titolatore a seconda dei casi Nota Quando utilizzato un sistema di titolazione automatica con soluzione di acido borico all I 3 18 la titolazione inizia non appena avviene la distillazione 5 4 6 1 6 2 6 2 1 6 2 2 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 28 In caso di utilizzo di un unit di distillazione interamente automa tica anche la titolazione automatica dell ammoniaca pu essere eseguita applicando il metodo di determinazione del punto finale per mezzo di un sistema di titolazione potenziometrica del pH In questo caso si ricorre ad un titolatore automatico con pH me tro tarato
45. contenuto in zuccheri riduttori secondo il metodo di Luff Schoorl Il risultato espresso in percentuale di glucosio presente nel campione Determinazione degli zuccheri totali dopo inversione Con una pipetta prelevare 50 ml della soluzione e introdurli in un pallone tarato da 100 ml Aggiungere qualche goccia di soluzione di metilarancio 3 4 poi con molta attenzione e sempre agitando aggiun gere acido cloridrico 3 5 fino a ottenere un viraggio nettamente al rosso Aggiungere 15 ml di acido cloridrico 3 6 immergere il pallone 5 4 7 2 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 56 per 30 minuti in bagnomaria a forte ebollizione e lasciarvelo per 30 minuti Raffreddare rapidamente alla temperatura di circa 20 C e ag giungere 15 ml di soluzione di idrossido di sodio 3 7 Portare al volume di 100 ml con acqua ed omogeneizzare Prelevare un volume non superiore a 25 ml e contenente meno di 60 mg di zuccheri riduttori espressi in glucosio Se necessario portare a 25 ml con acqua distillata e determinare il contenuto in zuccheri riduttori secondo il metodo di Luff Schoorl Esprimere il risultato in percentuale di glucosio o se del caso di saccarosio moltiplicando per il fattore 0 95 Titolazione secondo il metodo di Luff Schoorl Con una pipetta prelevare 25 ml del reattivo di Luff Schoorl 3 8 e introdurlo in un erlenmeyer da 300 ml aggiungere 25 ml esatti della soluzione zuccherina chiarificata Dopo aver aggiu
46. della soluzione madre standard 3 7 1 portare a volume col solvente di estrazione 3 8 e mescolare A temperatura non superiore a 4 C la soluzione si mantiene stabile per un mese Soluzioni di taratura Trasferire 0 5 1 0 e 2 0 ml della soluzione standard intermedia 3 7 2 in una serie di matracci tarati da 50 ml Portare a volume con la fase mobile 3 6 e miscelare Queste soluzioni corrispondono rispettivamente a 0 5 1 0 e 2 0 ug ml di amprolium Esse vanno preparate al momento prima dell uso Solvente di estrazione Miscela metanolo 3 1 acqua 2 1 vtv Apparecchiatura Apparecchiatura HPLC con sistema di iniezione adeguato per volumi da 100 pl Colonna per cromatografia liquida 125 mm x 4 mm a scambio catio nico riempimento Nucleosil 10 SA 5 o 10 um o equivalente Rivelatore UV a lunghezza d onda variabile o rivelatore a serie di diodi Filtro a membrana in PTFE da 0 45 um Filtro a membrana da 0 22 um Bagno ultrasonico Agitatore meccanico o magnetico Procedimento Indicazioni generali Alimento bianco Per poter procedere alla prova di recupero 5 1 2 analizzare un alimento di riferimento bianco per accertare l assenza di amprolium o di altre sostanze che possono interferire L alimento bianco ha una composizione simile a quella del campione e all analisi l amprolium o sostanze capaci di interferire non devono risultare presenti 5 2 521 5 22 5 3 353 1 2009R0152 IT 01 01 20
47. di bromo deve essere inferiore a 1 e il residuo all evaporazione inferiore a 2 mg 100 ml 3 2 Solfato di sodio anidro 3 3 Acido cloridrico c 3 mol l 3 4 Coadiuvante di filtrazione ad esempio farina fossile Hyflo supercel 4 Apparecchiatura 4 1 Estrattore Se l apparecchio munito di un sifone apparecchio di So xhlet la portata del riflusso regolata in modo da ottenere almeno 10 cicli l ora se si tratta di un apparecchio senza sifone il liquido rifluisce in quantit pari a circa 10 ml al minuto 4 2 Ditali da estrazione esenti da sostanze solubili nell etere di petrolio la cui porosit sia compatibile con le esigenze di cui al punto 4 1 4 3 Stufa per essiccazione sia a vuoto a 75 3 C o a pressione atmosferica a 100 3 C di Procedimento 5 1 Procedimento A cfr punto 8 1 Pesare con l approssimazione di 1 mg 5 g del campione introdurli in un ditale da estrazione 4 2 e coprire con un tampone di cotone sgras sato Porre il ditale in un estrattore 4 1 ed estrarre per 6 ore con etere di petrolio 3 1 Raccogliere l estratto in un pallone asciutto e tarato con tenente frammenti di pietra pomice Eliminare il solvente per distillazione Essiccare il residuo introducendo il pallone in una stufa per essiccazione 4 3 lasciandovelo per un ora e mezza Lasciar raffreddare in essiccatore e pesare Essiccare una seconda volta per 30 minuti onde assicurarsi che il peso della sostanza
48. frigo rifero La soluzione va preparata di fresco quotidianamente Soluzioni di taratura In una serie di matracci tarati da 50 ml trasferire 1 0 2 0 5 0 10 0 15 0 e 20 0 ml della soluzione standard intermedia 3 5 2 Portare a volume con la fase mobile 3 4 e miscelare Avvolgere il pallone in foglio di alluminio Queste soluzioni corrispondono rispettivamente a 0 5 1 0 2 5 5 0 7 5 e 10 0 ug ml di olaquindox Queste soluzioni vanno preparate di fresco quotidianamente Apparecchiatura Bagno ultrasonico Agitatore meccanico Apparecchiatura HPLC con rivelatore UV a lunghezza d onda variabile oppure con rivelatore a serie diodi Colonna per cromatografia liquida da 250 mm x 4 mm C g particelle di riempimento 10 um o equivalente Filtri a membrana da 0 45 um Procedimento Nota L olaquindox fotosensibile Effettuare tutte le operazioni in luce soffusa oppure usare vetreria scura Indicazioni generali Analizzare un alimento di riferimento bianco per accertare l assenza di olaquindox o di altre sostanze che possono interferire Effettuare una prova di recupero analizzando il bianco addizionato di una quantit di olaquindox analoga a quella presente nel campione Per ottenere una concentrazione di 50 mg kg trasferire 10 0 ml della 52 5 3 53A 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 152 soluzione madre standard 3 5 1 in una beuta da 250 ml e far evaporare la soluzione a circa 0 5 ml A
49. g ml e portare a 1 000 ml con acqua Resina scambiatrice di cationi Amberlite CG 120 Na 100 200 mesh La resina viene pretrattata prima dell uso Sospendere 100 g di resina con 500 ml di soluzione di acido cloridrico 3 5 e portare ad ebollizione su piastra calda continuando ad agitare Lasciare raffreddare e decantare l acido Filtrare attraverso carta da filtro sotto vuoto Lavare due volte la resina con 500 ml di acqua e poi con 250 ml di metanolo 3 2 Ri sciacquare una seconda volta la resina con 250 ml di metanolo ed essiccarla insufflando aria attraverso il panello del filtro Conservare la resina essiccata in una bottiglia chiusa con tappo Sostanza di riferimento standard metilbenzoquato puro 7 benzilossi 6 butil 3 metossicarbonil 4 chinolone 31 1 3 72 3 13 4 2 4 3 4A 44 1 4 5 4 6 52 5 3 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 147 Soluzione madre standard di metilbenzoquato 500 ug ml Pesare con l approssimazione di 0 1 mg 50 mg di sostanza standard 3 7 scioglierli in soluzione di acido metansolfonico 3 4 in un pallone tarato da 100 ml portare a volume e miscelare Soluzione standard intermedia di metilbenzoquato 50 ug ml Trasferire 5 0 ml della soluzione madre standard di metilbenzoquato 3 7 1 in un pallone tarato da 50 ml portare a volume con metanolo 3 2 e miscelare Soluzioni di taratura In una serie di palloni tarati da 25 ml trasferire 1
50. interno in modo da verificare l assenza di impurit sulla linea di base sotto lo standard interno importante che il tempo di eluizione sia sufficientemente lungo per consentire l eluizione di tutti i prodotti di degradazione altrimenti gli ultimi picchi di eluizione possono interferire con le operazioni cromatografiche successive Nell intervallo operativo il sistema cromatografico d una risposta linea re Tale risposta misurata a una concentrazione costante concentra zione normale dello standard interno e a concentrazioni variabili di triptofano importante che le altezze dei picchi del triptofano e dello standard interno si situino nell intervallo lineare del sistema HPLC fluo rescenza Se il picco o i picchi del triptofano e o dello standard interno sono troppo bassi o troppo alti l analisi viene ripetuta con altre dimen sioni del campione e o un volume finale modificato Idrossido di bario Con il tempo l idrossido di bario si scioglie con maggiore difficolt Ci causa una soluzione torbida per la determinazione HPLC che pu pro durre bassi valori per il triptofano H DETERMINAZIONE DEGLI OLI E GRASSI GREGGI Finalit e campo d applicazione Il metodo consente di determinare il contenuto di oli e grassi greggi negli alimenti per gli animali ma non riguarda l analisi dei semi e frutti oleaginosi L applicazione dei due procedimenti sotto descritti dipende dalla natura e dalla composizione dell alimento nonch
51. l caldo 3 2 poi per due volte con acqua bollente Portare a volume con acqua la concen trazione dell acido cloridrico 0 5 mol l Se il residuo nel filtro nero presenza di carbone rimetterlo nel forno a muffola e incenerire di nuovo a 450 475 C Questo incenerimento che richiede solo alcune ore da 3 a 5 ore completo allorch le ceneri appaiono bianche o quasi Sciogliere di nuovo il residuo con circa 2 ml di acido cloridrico 3 1 evaporare a secco e aggiungere 5 ml di acido cloridrico 6 mol l 3 2 Riscaldare la soluzione e filtrarla nel matraccio tarato e portare a volume con acqua la concentrazione dell acido clori drico 0 5 mol l circa Note a Nella determinazione degli oligoelementi importante vigilare sui rischi di contaminazione in particolare quella da zinco rame e ferro L apparecchiatura impiegata nella preparazione dei campioni deve quindi essere esente da tali metalli Per ridurre i rischi generali di contaminazione lavorare in ambiente esente da polvere con apparecchiature scrupolosamente pulite e ve treria accuratamente lavata La determinazione dello zinco partico larmente sensibile a molti tipi di contaminazione ad esempio quella dovuta alla vetreria ai reattivi alla polvere ecc b Calcolare il peso del campione da incenerire in funzione del conte nuto approssimativo di oligoelementi dell alimento per animali in esame e della sensibilit dello spettrofotometro adoperato Pe
52. lina alla cartina tornasole altrimenti aumentare la quantit di ossido di magnesio 3 2 Procedere conformemente ai punti 5 2 e 5 3 del metodo di analisi per la determinazione del contenuto di proteine gregge parte C del presente allegato Effettuare una prova in bianco applicando lo stesso procedimento in assenza del campione da analizzare Calcolo dei risultati 1 ml di HSO 0 05 mol l corrisponde a 1 7 mg di ammoniaca Esprimere il risultato in percentuale del campione Ripetibilit La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione non supera in valore relativo il 10 di ammo niaca F DETERMINAZIONE DEGLI AMMINOACIDI TRIPTOFANO ESCLUSO Finalit e campo d applicazione Il metodo serve per determinare gli amminoacidi liberi sia di sintesi che naturali e totali legati a peptidi e liberi negli alimenti per animali mediante un analizzatore di amminoacidi Il metodo applicabile ai 2 2 3 0 3 2 3 3 3 4 3 5 3 6 3T 3 8 3 9 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 34 seguenti amminoacidi cist e ina metionina lisina treonina alanina arginina acido aspartico acido glutammico glicina istidina isoleucina leucina fenilalanina prolina serina tirosina e valina Il metodo non distingue gli amminoacidi dai loro sali e non pu distin guere la forma D degli amminoacidi dalla forma L esso non adatto per la determina
53. mediante la PCR mirata a sequenze di DNA specifi che delle specie Il metodo PCR richiede dapprima una fase di estrazione del DNA All estratto di DNA cos ottenuto quindi applicata la fase di amplificazione per individuare la specie animale bersaglio 2 22 Reagenti e attrezzature 2 221 Reagenti 222 11 Reagenti per l estrazione del DNA Utilizzare solo i reagenti approvati dall EURL AP e pubblicati sul suo sito web 2 22 12 Reagenti per l amplificazione genica 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 143 vm 2 2 2 1 2 1 Primer e sonde Utilizzare solo primer e sonde con sequenze oligonucleotidiche validate dall EURL AP 2 2 2 1 2 2 Master Mix Utilizzare solo soluzioni Master Mix che non contengono reagenti che possono portare a risultati falsi a causa della presenza di DNA animale 2 2 2 1 2 3 Reagenti di decontaminazione 2 2 2 1 2 3 1 Soluzione di acido cloridrico 0 1N 2 2 2 1 2 3 2 Candeggina soluzione di ipoclorito di sodio allo 0 15 di cloro attivo 2 2 2 1 2 3 3 Reagenti non corrosivi per la decontaminazione di dispositivi co stosi come le bilance analitiche ad esempio DNA Erase di MP Biomedicals 2 2 2 2 Attrezzature 2 2 22 1 Bilancia analitica con precisione di 0 001 g 2 22 22 Apparecchiatura di macinazione 222 23 Termociclatore per PCR real time 22 224 Microcentrifuga per microprovette 2 2 2 2 5 Set di micropipette per prelievi da 1 ul a 1000 ul 2 2
54. medium bound per includere un massimo di informazione nel reporting dei risultati e permettere cos l interpretazione dei risultati secondo requisiti specifici 9 1 2 Il rapporto comprende anche il metodo utilizzato per l estrazione di PCDD PCDF PCB diossina simili e lipidi 9 1 3 I recuperi dei singoli standard interni sono indicati se si situano al di fuori del range menzionato al punto 7 2 5 se il livello massimo supe rato e in altri casi su richiesta 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 130 vmi 9 1 4 Poich nel decidere della conformit di un campione occorre tener conto dell incertezza di misura deve essere indicato anche questo parametro I risultati analitici sono pertanto espressi come x U dove x il risultato analitico e U l incertezza di misura estesa calcolata per mezzo di un fattore di copertura 2 che d un livello di fiducia del 95 circa Nel caso di una determinazione separata di PCDD PCDF e PCB dios sina simili la somma dell incertezza estesa stimata dei risultati analitici separati di PCDD PCDF e PCB diossina simili utilizzata per la somma di PCDD PCDF e PCB diossina simili 9 1 5 Se si tiene conto dell incertezza di misura applicando il CCa come descritto al punto 2 2 questo parametro indicato 9 1 6 I risultati sono espressi nelle stesse unit e con almeno lo stesso numero di cifre significative dei livelli massimi stabiliti dalla direttiva 2002 32 CE 9
55. metodo di conferma 6 7 3 Durante l analisi di routine la performance del metodo di screening deve essere verificata mediante un controllo della qualit analitica e una va lidazione del metodo on going necessario un programma continuo per il controllo dei risultati conformi 6 7 4 Controllo dell eventuale soppressione della risposta cellulare e della ci totossicit Il 20 degli estratti del campione misurato in screening di routine senza e con aggiunta di 2 3 7 8 TCDD corrispondente al livello di inte resse per verificare se la risposta soppressa da sostanze interferenti presenti nell estratto del campione La concentrazione misurata del cam pione spiked comparata con la somma della concentrazione del l estratto unspiked e della concentrazione dello spiking Se la concen trazione misurata inferiore di pi del 25 alla concentrazione som ma calcolata si ha un indicazione di una potenziale soppressione del segnale e il rispettivo campione deve essere sottoposto ad analisi di conferma GC HRMS I risultati sono monitorati in carte di controllo qualit 6 7 5 Controllo di qualit sui campioni conformi Dal 2 al 10 circa dei campioni conformi secondo la matrice del campione e l esperienza del laboratorio sono confermati mediante GC HRMS 6 7 6 Determinazione dei tassi di falsi conformi a partire dai dati QC determinato il tasso dei risultati falsi conformi dello screening di campioni
56. nel cilindro e crogiolo assemblati e se necessario aggiun gere qualche goccia di agente antischiuma 3 2 Portare il liquido all ebollizione in 5 2 minuti e lasciar bollire viva cemente per esattamente 30 minuti Posizionare la valvola verso il tubo di scarico 4 1 e sotto vuoto filtrare l acido solforico attraverso il crogiolo filtrante e sciacquare il residuo tre volte con 30 ml di acqua bollente ciascuna controllando che il residuo sia filtrato a secco dopo ogni risciacquo Richiudere la valvola di svuotamento e versare 150 ml di soluzione di idrossido di potassio bollente 3 7 nel cilindro e nel crogiolo assemblati e aggiungere qualche goccia di antischiuma 3 2 Portare il liquido all ebollizione entro 5 2 minuti e lasciar bollire vivacemente per esat tamente 30 minuti Filtrare e ripetere la procedura di risciacquo applicata all acido solforico Dopo il risciacquo finale e l essiccazione staccare il crogiolo e il suo contenuto e ricollegarlo all unit di estrazione a freddo 4 6 Applicare il tubo vuoto e risciacquare il residuo nel crogiolo tre volte con porzioni di 25 ml di acetone ciascuna 3 4 assicurandosi che il residuo sia filtrato a secco dopo ogni lavaggio Essiccare il crogiolo nel forno a 130 C fino a cessazione della dimi nuzione di massa Dopo ogni essiccazione lasciar raffreddare nell essic catore e pesare rapidamente Introdurre quindi il crogiolo nel forno a muffola e incenerire fino a peso c
57. nel corso del quale otto laboratori hanno analizzato tre campioni Risultati Per il cam pione A bianco Per il campione B farina Al ricevi mento Per il campione C granu Al ricevi Al ricevi mento mento Dopo due mesi 2 45 0 42 17 75 media mg kg 2 89 Sr mg kg 0 45 0 43 0 40 CVpg 16 18 14 Rec 86 74 88 NR non riscontrata SR deviazione standard della riproducibilit CVR coefficiente di variazione della riproducibilit Rec recupero E DETERMINAZIONE DELLA ROBENIDINA Cloridrato di 1 3 bis 4 clorobenzilidene amino guanidina Finalit e campo d applicazione Il metodo consente di determinare il contenuto di robenidina negli ali menti per animali Il limite di quantificazione di 5 mg kg Principio Il campione estratto con metanolo acidificato L estratto essiccato e una parte aliquota purificata in una colonna di ossido di alluminio La robenidina eluita dalla colonna con metanolo concentrata e portata volume adeguato con la fase mobile Il tenore di robenidina determi nato mediante cromatografia liquida ad alta prestazione HPLC a fase inversa utilizzando un rivelatore UV Reattivi Metanolo Metanolo acidificato Travasare 4 0 ml di acido cloridrico p20 1 18 g ml in un pallone tarato da 500 ml portare a volume con metanolo 3 1 e agitare Questa soluzione preparata al momento poco prima dell uso
58. o in combinazione secondo le procedure ope rative standard POS stabilite dal laboratorio di riferimento del PUE per le proteine animali negli alimenti per animali di seguito EURL AP e pubblicate sul suo sito web 2 METODI 2l Microscopia ottica 2 1 1 Principio I costituenti di origine animale che possono essere presenti nelle materie prime per mangimi e nei mangimi composti sottoposti ad analisi sono individuati sulla base di caratteristiche tipiche e iden tificabili al microscopio come fibre muscolari o altre particelle di carne cartilagini ossa corna peli setole sangue piume gusci d uovo lische e scaglie 2 1 2 Reagenti e attrezzature PARAR Reagenti PAPARE Agente concentratore 2 1 2 1 1 1 Tetracloroetilene densit 1 62 2 1 2 1 2 Reagente colorante 2 1 2 1 2 1 Soluzione di rosso di alizarina diluire 2 5 ml di acido cloridrico 1M in 100 ml di acqua aggiungere 200 mg di rosso di alizarina alla soluzione 2 1 2 1 3 Mezzi di montaggio 2 1 2 1 3 1 Liscivia NaOH a 2 5 in p v o KOH a 2 5 in p v http eurl craw eu 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 135 vm 2 1 2 1 3 2 Glicerolo non diluito viscosit 1 490 cP 2 1 2 1 3 3 Norland Optical Adhesive 65 viscosit 1 200 cP o resina con propriet equivalenti per la preparazione dei vetrini permanenti 2 12 14 Mezzi di montaggio con propriet coloranti 2 1 2 1 4 1 Soluzione di Lugol sciogliere 2 g di iod
59. oleosa o grassa rimanga costante la perdita di peso tra due pesate consecutive deve essere pari o inferiore a 1 mg 5 2 Procedimento B Pesare con l approssimazione di 1 mg 2 5 g del campione cfr punto 8 2 introdurli in un becher da 400 ml o in una beuta da 300 ml e aggiungere 100 ml di acido cloridrico 3 3 e qualche granulo di pietra pomice Ricoprire il becher con un vetro da orologio o applicare sulla beuta un refrigerante a ricadere Portare la miscela a lenta ebollizione su piccola fiamma o su piastra riscaldante e lasciarvela per un ora Evitare che la sostanza aderisca alle pareti del recipiente Raffreddare e aggiungere una quantit sufficiente di un coadiuvante di filtrazione 3 4 per evitare qualsiasi perdita di sostanza grassa durante la filtrazione stessa Filtrare su un doppio filtro di carta bagnato esente da materie grasse Lavare il residuo con acqua fredda fino a reazione neutra del filtrato Verificare che il filtrato non contenga sostanza grasse La presenza di queste nel filtrato indica che prima dell idrolisi deve essere effettuata un estrazione del campione con etere di petrolio secondo il procedimento A Porre il doppio filtro con il residuo su un vetro da orologio ed essiccare per un ora e mezza nella stufa a pressione atmosferica 4 3 a 100 3 C Sostituire i frammenti di pietra con alcune palline di vetro quando si debbano eseguire ulteriori esami qualitativi sulla sostanza oleosa o grassa
60. per un ora Determinare allo spettrofotometro a 440 nm in vaschette di vetro da 1 cm la densit ottica della soluzione della prova in bianco D con frontandola con la soluzione di riferimento C e la densit ottica della soluzione del campione B confrontandola con la soluzione di riferi mento A Sottrarre la densit ottica della soluzione della prova in bianco da quella della soluzione del campione densit ottica corretta Calcolare a partire da questo valore il contenuto in gossipolo libero come indicato al punto 6 Determinazione del gossipolo totale Introdurre la quantit di sostanza da sottoporre all analisi contenente da 1 a 5 mg di gossipolo in un pallone tarato da 50 ml e aggiungere 10 ml di solvente B 3 3 Preparare simultaneamente una prova in bianco introducendo 10 ml di solvente B 3 3 in un altro pallone tarato da 6 1 6 2 6 2 1 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 113 50 ml Riscaldare i due palloni per 30 minuti su un bagno d acqua bollente Raffreddare a temperatura ambiente e portare a volume il con tenuto di ciascun pallone con la miscela di isopropanolo esano 3 1 Mescolare e lasciar depositare per 10 15 minuti quindi filtrare e racco gliere i filtrati in palloni a tappo smerigliato Pipettare 2 ml del filtrato del campione in due palloni tarati da 25 ml e 2 ml del filtrato della prova in bianco in due altri palloni da 25 ml Prendere un pallone di ciascuna serie e comple
61. portare a volume con la miscela isopropanolo esano 3 1 e mescolare Introdurre 2 0 ml di queste soluzioni in due serie di 6 palloni tarati da 25 ml Completare a 25 ml il contenuto dei palloni della prima serie con la miscela isopropanolo esano 3 1 serie di riferimento Aggiungere 2 ml d anilina 3 4 in ciascuno dei palloni della seconda serie Riscaldare per 30 minuti su bagno d acqua bollente Raffreddare a temperatura ambiente portare a volume con la miscela isopropanolo esano 3 1 mescolare e lasciar riposare per un ora serie tipo Determinare la densit ottica di ogni soluzione della serie tipo confron tandola con la soluzione corrispondente della serie di riferimento alle condizioni indicate al punto 5 2 Tracciare la curva di taratura portando in ordinata i valori di densit ottica e in ascissa le quantit corrispondenti di gossipolo in ug 63 Ripetibilit La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione non deve superare il 15 in valore relativo rispetto al valore pi elevato per i contenuti di gossipolo inferiori a 500 ppm 75 ppm in valore assoluto per i contenuti compresi tra 500 e 750 ppm il 10 in valore relativo rispetto al valore pi elevato per i contenuti superiori a 750 ppm YMI se B DETERMINAZIONE DEI LIVELLI DI DIOSSINE PCDD PCDF E PCB CAPO I Metodi di campionamento e interpretazione dei risultati analitici Finali
62. prelevati conformemente alle diposizioni di cui all allegato I La preparazione dei campioni di laboratorio deve assicurare che le quan tit pesate previste dai metodi di analisi siano omogenee e rappresenta tive dei campioni finali DI Precauzioni necessarie Le modalit di preparazione dei campioni sono scelte in funzione dei metodi di analisi impiegati e dei costituenti o delle sostanze da control lare pertanto di fondamentale importanza assicurare che le modalit prescelte siano adeguate al metodo di analisi applicato e ai costituenti o alle sostanze da controllare Effettuare tutte le operazioni in modo da evitare nei limiti del possibile di contaminare il campione o di modificarne le composizione Effettuare le macinazioni le miscelazioni e le setacciature senza ritardi esponendo il meno possibile il campione all aria e alla luce Evitare l impiego di mulini o attrezzature per la macinazione suscettibili di riscaldare eccessivamente il campione Per gli alimenti particolarmente sensibili al calore si raccomanda la macinazione manuale Assicurarsi altres che l apparecchiatura in se stessa non costituisca una fonte di contaminazione Se il campione non pu essere preparato senza causare una variazione sensibile del contenuto di umidit quest ultimo va determinato prima e dopo la preparazione secondo il metodo previsto nell allegato III parte A 3 Procedura 3 1 Procedura generale Il quantitativo
63. punto di ebollizione tra 40 e 60 C 3 20 3 21 3 22 4 2 4 3 44 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 44 Soluzione di idrossido di sodio c 1 mol l sciogliere 40 0 g di NaOH 3 5 in acqua e portare a 1 litro con acqua 3 1 Acido cloridrico c 6 mol l prelevare 492 ml di HCI 3 7 e portare a 1 litro con acqua Acido cloridrico c 1 mol l prelevare 82 ml di HCI 3 7 e portare a 1 litro con acqua Acido cloridrico c 0 1 mol l prelevare 8 2 ml di HC1 3 7 e portare a 1 litro con acqua Acido ortofosforico c 0 5 mol l prelevare 34 ml di acido ortofosforico 3 6 e portare a 1 litro con acqua 3 1 Soluzione concentrata di triptofano 3 2 c 2 50 umol ml in un matraccio tarato da 500 ml sciogliere 0 2553 g di triptofano 3 2 in acido cloridrico 3 13 e portare a volume con acido cloridrico 3 13 Conservare a 18 C al massimo per quattro settimane Soluzione concentrata di standard interno c 2 50 umol ml in un matraccio tarato da 500 ml sciogliere 0 2728 g di a metil tripto fano 3 3 in acido cloridrico 3 13 e portare a volume con acido clori drico 3 13 Conservare a 18 C al massimo per quattro settimane Soluzione madre di taratura di triptofano e di standard interno prelevare 2 00 ml di soluzione concentrata di triptofano 3 15 e 2 00 ml di soluzione concentrata di standard interno a metil triptofano 3 16 Diluire con acqua 3 1 e metanolo 3 8 a
64. quantitativi di cui al presente capitolo al fine di tenere conto delle caratteristiche operative purch dimostri in modo convincente all autorit compe tente l equivalenza della procedura di campionamento per quanto concerne la rappresentativit e previa autorizzazione dell autorit competente In casi eccezionali quando non possibile applicare i requisiti quan titativi del metodo di campionamento prescritto senza danneggiare il lotto in misura inaccettabile per il commercio ad esempio a causa delle tipologie d imballaggio dei mezzi di trasporto delle modalit di immagazzinamento ecc si pu ricorrere a un metodo alternativo a condizione che il campionamento sia il pi rappresentativo possi bile e che il metodo applicato sia chiaramente descritto e debita mente documentato Requisiti quantitativi concernenti i campioni elementari per il con trollo delle sostanze o dei prodotti distribuiti in modo uniforme negli alimenti per animali Alimenti solidi alla rinfusa Numero minimo di campioni elementari Dimensioni della partita campionata lt 2 5 tonnellate gt 2 5 tonnellate y di 20 volte il numero di tonnel late che costituiscono la partita campionata fino a un massimo di 40 campioni elementari Se il risultato un numero decimale si arrotonda al numero intero superiore 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 9 vm3 5 1 2 Alimenti liquidi alla rinfusa Dimensioni della pa
65. solo su cist e ina metionina treonina e lisina una insufficiente separa zione di picchi adiacenti influir sfavorevolmente sulla determinazione Per tutti gli altri amminoacidi la separazione deve essere maggiore di 1 10 Il sistema deve poter separare la lisina da artefatti di lisina e dall or nitina Calcolo dei risultati Determinare le aree del picco del campione e della soluzione standard per ogni singolo amminoacido e calcolare la quantit X in g di am minoacido per kg di campione secondo la seguente formula ge M Bxmx 1000 lele Se si usa uno standard interno moltiplicare per A area del picco dell idrolizzato o dell estratto B area del picco della soluzione standard di taratura C area del picco dello standard interno nell idrolizzato o nell estratto D area del picco dello standard interno soluzione standard di taratura M peso molecolare dell amminoacido determinato c concentrazione dello standard in pmol ml m peso del campione in g corretto al peso originale se essiccato o sgrassato V ml totali di idrolizzato 5 3 4 o ml del volume di diluizione totale calcolati dell estratto 6 1 La cistina e la cisteina sono determinate entrambe sotto forma di acido cisteico negli idrolizzati di campione ossidato ma calcolate come cistina CgH3N304S M 240 30 g mol utilizzando un peso molecolare di 120 15 g mol 0 5 x 240 30 g mol La metionina determinata come metionina sulfone ne
66. standard interni aggiunta ai prodotti prima dell estrazione e del processo di clean up 6 3 Requisiti per i metodi che utilizzano tutti i sei congeneri di PCB indi catori marcati con isotopi a correzione dei risultati in funzione dei recuperi degli standard interni b 1 recuperi degli standard interni marcati con isotopi compresi tra 50 e 120 c recuperi inferiori o superiori per i singoli congeneri con un contributo alla somma dei sei PCB indicatori inferiore al 10 sono accettabili 6 4 Requisiti per i metodi che non utilizzano tutti i sei standard interni marcati con isotopi o utilizzano altri standard interni a controllo del recupero degli standard interni per ogni campione b recuperi degli standard interni compresi tra 60 e 120 c correzione dei risultati in funzione dei recuperi degli standard interni 6 5 I recuperi dei congeneri non marcati sono controllati per mezzo di cam pioni spiked o campioni di controllo qualit con concentrazioni nel range del livello di interesse I recuperi per questi congeneri sono considerati accettabili se sono compresi tra 70 e 120 Ts Prescrizioni per i laboratori Come prescritto dal regolamento CE n 882 2004 i laboratori devono essere accreditati da un organismo riconosciuto operante in conformit alla Guida ISO 58 per garantire che alle loro analisi sia applicata l as sicurazione qualit I laboratori devono essere accreditati in base alla norma
67. standard nelle e tra le serie di test 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 129 vmi La ripetibilit inferiore al 20 la riproducibilit in laboratorio infe riore al 25 in base ai livelli calcolati in BEQ dopo correzione del bianco e del recupero 8 4 2 Nel processo di validazione il test deve permettere di distinguere tra un campione in bianco e un livello al valore di cut off consentendo l iden tificazione dei campioni al di sopra del corrispondente valore di cut off cfr punto 8 1 2 8 4 3 Sono definiti i composti bersaglio le possibili interferenze e i livelli massimi tollerabili di bianco 8 4 4 La deviazione standard percentuale nella risposta o nella concentrazione calcolata a partire dalla risposta possibile solo nel working range di una determinazione triplice di un estratto del campione non pu essere superiore al 15 8 4 5 I risultati non corretti dei campioni di riferimento espressi in BEQ bianco e livello di interesse sono utilizzati per valutare la performance del metodo bioanalitico su un periodo di tempo costante 8 4 6 Le carte di controllo qualit per i bianchi di procedura e ciascun tipo di campione di riferimento sono registrate e controllate per assicurare che la performance analitica sia conforme ai requisiti in particolare per i bianchi di procedura per quanto riguarda la differenza minima richiesta rispetto all estremo inferiore del working range e per i campioni di rif
68. sullo stesso campione nella stessa serie Se dopo la bollitura il filtraggio delle soluzioni acida e basica risulta difficile iniettare aria compressa nel tubo di scarico dell unit riscaldante e continuare a filtrare La temperatura d incenerimento non supera i 500 C in modo da pro lungare la durata dei crogioli filtranti in vetro Vanno evitati possibili effetti da choc termico eccessivo durante i cicli di riscaldamento e di raffreddamento J DETERMINAZIONE DEGLI ZUCCHERI Finalit e campo d applicazione Il metodo consente di determinare il contenuto in zuccheri riduttori ed in zuccheri totali dopo inversione espressi in glucosio e se del caso in saccarosio per conversione mediante fattore 0 95 Il metodo applica bile agli alimenti composti Particolari modalit sono previste per altri alimenti All occorrenza si doser separatamente il lattosio e se ne terr conto nel calcolo dei risultati Principio Gli zuccheri presenti sono sciolti nell etanolo diluito la soluzione chiarificata con reattivi di Carrez I e II Dopo l eliminazione dell etanolo le determinazioni sono effettuate prima e dopo l inversione secondo il metodo di Luff Schoorl Reattivi Soluzione di etanolo al 40 v v densit 0 948 g ml a 20 C neu tralizzato alla fenolftaleina Soluzione di Carrez I sciogliere in acqua 21 9 g di acetato di zinco Zn CH3CO00 2H 0 e 3 g di acido acetico glaciale Portare a 100 ml con acqua Solu
69. tenendo conto dell incertezza di misura Per i dosaggi di screening stabilito un valore di cut off per le decisioni sulla conformit ai livelli di interesse stabiliti rispetivamente per PCDD PCDF o per la somma di PCDD PCDF e PCB diossina simili La partita non conforme alle specifiche se il risultato analitico upper bound ottenuto con un metodo di conferma e confermato da una Upperbound valore calcolato considerando pari al limite di quantificazione il contri buto di ogni congenere non quantificato Lowerbound valore calcolato considerando pari a zero il contributo di ogni congenere non quantificato Mediumbound valore calcolato considerando pari alla met del limite di quantificazione il contributo di ogni congenere non quantificato La doppia analisi necessaria per escludere la possibilit di una contaminazione interna o di una mescolanza accidentale dei campioni La prima analisi tenendo conto dell in certezza di misura utilizzata per verificare la conformit Se l analisi effettuata nell ambito di un incidente di contaminazione la conferma mediante doppia analisi pu essere omessa nel caso in cui la tracciabilit permetta di stabilire il legame tra i campioni selezionati per l analisi e l incidente Upperbound valore calcolato considerando pari al limite di quantificazione il contri buto di ogni congenere non quantificato all equivalente tossico TEQ Lowerbound va
70. trattamento speciale G DETERMINAZIONE DEL TRIPTOFANO Finalit e campo d applicazione Il metodo serve per la determinazione del triptofano totale e libero negli alimenti per animali Esso non distingue la forma D dalla forma L Principio Per la determinazione del triptofano totale il campione idrolizzato in ambiente alcalino con una soluzione satura di idrossido di bario e ri scaldato a 110 C per 20 ore A idrolisi avvenuta viene aggiunto lo standard interno Per la determinazione del triptofano libero il campione estratto in ambiente moderatamente acido in presenza dello standard interno Il triptofano e lo standard interno nell idrolizzato e nell estratto sono determinati per HPLC per mezzo di un rivelatore a fluorescenza Reattivi Usare acqua bidistillata o di qualit equivalente conduttivit lt 10 uS cm Sostanza di riferimento standard triptofano purezza contenuto gt 99 essiccato sotto vuoto su pentossido di fosforo Standard interno a metil triptofano purezza contenuto gt 99 essic cato sotto vuoto su pentossido di fosforo Idrossido di bario ottaidrato prestare attenzione a non esporre eccessi vamente il Ba OH 8 H20 all aria per evitare la formazione di BaCO che potrebbe disturbare la determinazione cfr osservazione al punto 9 3 Idrossido di sodio Acido ortofosforico p p p 85 Acido cloridico p 1 19 g ml Metanolo di qualit HPLC Etere di petrolio
71. una temperatura del bagno non superiore a 40 C Ripristinare la pressione atmosferica facendovi fluire azoto 3 9 e togliere il matraccio dall evaporatore Togliere il solvente rimanente con un flusso di azoto 3 9 e disciogliere il residuo imme diatamente in un volume noto 10 100 ml di metanolo 3 3 la concen trazione di DL a tocoferolo deve essere dell ordine di 5 ug ml a 30 ug ml Determinazione HPLC La vitamina E viene separata su una colonna C g a fase inversa 4 5 1 e la concentrazione misurata mediante rivelatore a fluorescenza eccita zione 295 nm emissione 330 nm 4 5 2 o un rivelatore UV 292 nm 4 5 2 9 16 5 6 1 5 6 1 1 5 6 1 2 5 6 1 3 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 82 Iniettare un aliquota ad esempio 20 ul della soluzione di metanolo ottenuta conformemente al punto 5 4 ed eluire con la fase mobile 3 8 Calcolare le altezze medie aree dei picchi di diverse iniezioni della stessa soluzione del campione e le altezze medie dei picchi aree di diverse iniezioni delle soluzioni di taratura 5 6 2 Condizioni HPLC Le seguenti condizioni vengono proposte a titolo indicativo possibile operare in condizioni diverse purch si ottengano risultati equivalenti Colonna per cromatogra 250 mm Xx 4 mm C g particelle di riem fia liquida 4 5 1 pimento 5 um o 10 um o equivalente Fase mobile 3 8 miscela metanolo 3 3 e acqua ad esem pio 980 20 v v Vel
72. una volta eliminati gli outlier valori aberranti identificati in base al test di Cochran Dixon Sr deviazione standard della ripetibilit Sg deviazione standard della riproducibilit ig ripetibilit R riproducibilit CV coefficiente di variazione della ripetibilit in CVR coefficiente di variazione della riproducibilit in Osservazioni Speciali condizioni cromatografiche consentono una migliore separa zione tra triptofano e a metil triptofano Eluizione isocratica seguita da pulitura della colonna a gradiente Colonna per cromatogra 125 mm Xx 4 mm C g particelle di riempi fia liquida mento 5 um o equivalente Temperatura della colon 32 C na Fase mobile A 0 01 mol l KH POy metanolo 95 5 V V B metanolo Programma del gradiente 0 min 100 A 0 B 15 min 100 A 0 B 17 min 60 A 40 B 19 min 60 A 40 B 21 min 100 A 0 B 33 min 100 A 0 B Velocit di efflusso 1 2 ml min Durata totale dell eluizio circa 33 min ne La cromatografia varier a seconda del tipo di HPLC e di materiale di riempimento utilizzati Il sistema scelto deve permettere una completa separazione dei picchi del triptofano e dello standard interno Inoltre importante che i prodotti di degradazione siano nettamente separati dal 9 3 Lil 123 1 3 22 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 49 triptofano e dallo standard interno Vanno fatti passare idrolizzati senza standard
73. x Qx dove BEQp BEQ corrispondente al limite di decisione GC HRMS ossia al livello massimo compresa l incertezza di misura deviazione standard residua X N m 2 fattore di Student a 5 f gradi di libert un lato m numero totale dei punti di calibrazione indice j n numero di ripetizioni ad ogni livello x concentrazione del campione GC HRMS in TEQ del punto di calibrazione i x media delle concentrazioni in TEQ di tutti i campioni di calibrazione 2 e sie Qua gt xi X parametro somma dei quadrati i indice per il iI punto di calibrazione i 8 3 2 Calcolo a partire dai risultati bioanalitici corretti del bianco e del recu pero di analisi multiple di campioni n gt 6 contaminati al limite di decisione GC HRMS come endpoint inferiore della distribuzione dei dati al corrispondente valore BEQ medio Valore di cut off BEQpr 1 64 x SDR 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 128 vmi dove SDp deviazione standard dei risultati del biodosaggio a BEQpy misurata in condizioni di riproducibilit in laboratorio 8 3 3 Calcolo come valore medio dei risultati bioanalitici in BEQ corretto del bianco e del recupero a partire dall analisi multipla di campioni n 6 contaminati a 2 3 del livello di interesse sulla base dell osservazione che questo livello sar prossimo al valore di cut off determinato come indi cato ai punti 8 3 1 o 8 3 2 Figura 1 Risultati 5 bio
74. 0 minuti quindi toglierla e lasciarla raffreddare a tempera tura ambiente Lasciare riposare per circa un ora finch la sostanza in sospensione si sia depositata filtrare quindi un aliquota con filtro a membrana da 0 45 um 4 2 in un recipiente adeguato Procedere alla determinazione HPLC 5 3 Premiscele In un matraccio tarato pesare con l approssimazione di 0 001 g circa 2 g di premiscela non macinata Aggiungere 100 0 ml di metanolo acidificato 3 8 e scuotere per disperdere Collocare la beuta e il suo contenuto in un bagno ultrasonico 4 1 a circa 40 C per 20 minuti quindi toglierla e lasciarla raffreddare a temperatura ambiente Diluire e portare a volume con metanolo acidificato 3 8 e mescolare accurata mente Lasciare riposare per un ora finch la sostanza in sospensione si sia depositata filtrare quindi un aliquota con filtro a membrana da 0 45 um 4 2 Diluire un volume adeguato di filtrato chiaro con meta nolo acidificato 3 8 ottenendo cos una soluzione di prova finale con tenente circa 4 ug ml di lasalocid sodico Procedere alla determinazione HPLC 5 3 Determinazione HPLC Parametri Le seguenti condizioni vengono proposte a titolo indicativo possibile operare in condizioni diverse purch si ottengano risultati equivalenti Colonna per cromatografia 125 mm x 4 mm colonna a fase inversa liquida 4 3 1 Cig particelle di riempimento 5 um o equivalente Fase mobile 3 9 miscela di soluzione t
75. 00 ml di acqua e 5 ml di soluzione di Carrez I 3 2 agitare per circa 30 secondi e aggiungere 5 ml di soluzione di Carrez II 3 3 Mescolare per mezz ora mediante l agitatore rotativo a capovol gimento Portare a volume con acqua agitare e filtrare Prelevare 5 ml di filtrati limpidi ed incolori introdurli nei tubi da prova con tappo smerigliato aggiungere 5 ml di soluzione di 4 DMAB 3 1 e mescolare Porre i tubi in bagnomaria a 20 C 4 C Dopo 15 minuti misurare la densit ottica della soluzione del campione con lo spettrofotometro a 420 nm rispetto alla soluzione della prova in bianco dei reattivi Curva di taratura Prelevare volumi di 1 2 4 5 e 10 ml della soluzione di urea 3 5 introdurli in matracci tarati da 100 ml e portare a volume con acqua Prelevare 5 ml di ciascuna soluzione aggiungendo ogni volta 5 ml di soluzione di 4 DMAB 3 1 mescolare e misurare la densit ottica come indicato dianzi rispetto ad una soluzione testimone contenente 5 ml di 4 DMAB e 5 ml d acqua esente da urea Tracciare la curva di taratura Calcolo dei risultati Determinare la quantit d urea nella parte di campione sottoposta al l analisi servendosi della curva di taratura Esprimere il risultato in percentuale del campione Osservazioni Per contenuti di urea superiori al 3 ridurre la quantit di campione da sottoporre all analisi a 1 g o diluire la soluzione originale per non avere pi di 50 mg d urea in 500 ml
76. 01 2014 003 001 54 estrazione a freddo 4 6 applicare il vuoto e sciacquare il residuo tre volte con volumi di 30 ml di etere di petrolio ciascuna assicurandosi che il residuo sia secco Collegare il crogiolo e il suo contenuto all unit riscaldante 4 1 e proseguire come indicato al punto 5 Gli alimenti per animali contenenti materie grasse che non possono essere estratte direttamente con etere di petrolio 3 5 vanno sgrassate una prima volta come descritto al punto 8 1 e una seconda volta dopo ebollizione con l acido Dopo l ebollizione con acido e successivi lavag gi collegare il crogiolo e il suo contenuto all unit di estrazione a freddo 4 6 lavare tre volte con 30 ml di acetone e rilavare altre tre volte con 30 ml di etere di petrolio Filtrare sotto vuoto fino a completa essicca zione e continuare l analisi secondo le indicazioni fornite al punto 5 iniziando con il trattamento con idrossido di potassio Se l alimento contiene pi del 5 di carbonati espressi in carbonato di calcio collegare il crogiolo 4 2 con il campione pesato all unit riscal dante 4 1 Lavare il campione tre volte con 30 ml di acido cloridrico 3 6 Dopo ogni aggiunta lasciare riposare il campione per circa un minuto prima di filtrarlo Risciacquare una volta con 30 ml di acqua e proseguire come descritto al punto 5 Se l apparecchio utilizzato composto da pi crogioli collegati alla stessa unit riscaldante non eseguire due prove
77. 14 003 001 156 Prova di recupero Effettuare una prova di recupero analizzando il bianco addizionato di una quantit di amprolium simile a quella presente nel campione Per ottenere una concentrazione di 100 mg kg trasferire 10 0 ml della so luzione madre standard 3 7 1 in una beuta da 250 ml e far evaporare la soluzione a circa 0 5 ml Aggiungere 50 g del bianco mescolare il tutto e attendere per 10 minuti agitando pi volte prima di procedere al l estrazione 5 2 Se non fosse disponibile un bianco di tipo simile a quello del campione cfr punto 5 1 1 la prova di recupero pu essere eseguita col metodo di addizione della sostanza di riferimento In questo caso un aliquota del campione da analizzare viene addizionata di una quantit nota di am prolium analoga a quella gi presente Quest aliquota viene analizzata insieme a una del campione non addizionato e il recupero pu essere calcolato per differenza Estrazione Premiscele contenuto lt 1 di amprolium e ali menti per animali A seconda del contenuto di amprolium pesare con l approssimazione di 0 01 g da 5 g a 40 g di campione in una beuta da 500 ml a fondo conico e aggiungere 200 ml di solvente di estrazione 3 8 Collocare la beuta nel bagno ultrasonico 4 4 e mantenervela per 15 minuti Togliere la beuta dal bagno agitare per un ora mediante l agitatore o col mesco latore magnetico 4 5 Diluire una parte di estratto con la fase mobile 3 6
78. 2 IT 01 01 2014 003 001 57 La differenza tra il contenuto di zuccheri totali dopo l inversione espressi in glucosio e il contenuto di zuccheri riduttori sempre espressi in glucosio moltiplicata per il fattore 0 95 d il contenuto in percentuale di saccarosio La determinazione del contenuto di zuccheri riduttori a esclusione del lattosio pu avvenire in due modi Per un calcolo approssimativo si moltiplica per 0 675 il contenuto di lattosio stabilito con un metodo d analisi diverso e si detrae il risultato ottenuto dal contenuto di zuccheri riduttori Per un calcolo esatto degli zuccheri riduttori fatta eccezione del lattosio necessario partire dallo stesso campione per le due determinazioni finali Una delle analisi effettuata su una parte della soluzione ottenuta conformemente al procedimento di cui al punto 5 1 l altra su una parte della soluzione ottenuta durante la determinazione del lattosio secondo il metodo previsto a tal fine dopo la fermentazione degli altri tipi di zuccheri e la chiarificazione In entrambi i casi la quantit di zucchero presente determinata se condo il metodo di Luff Schoorl e calcolata in mg di glucosio Uno dei valori detratto dall altro e la differenza espressa in percentuale del campione Esempio Le due quantit prelevate corrispondono per ciascuna analisi a un campione di 250 mg Nel primo caso si consumano 17 ml di una soluzione di tiosolfato di sodi
79. 2 Metodi di screening bioanalitici 9 2 1 Il risultato dello screening espresso come conforme o sospetto non conforme sospetto 9 2 2 Inoltre per PCDD PCDF e o PCB diossina simili pu essere dato un risultato espresso in BEQ e non in TEQ 9 2 3 Se data l incertezza di misura sul livello BEQ calcolato ad esempio come deviazione standard essa basata almeno su una analisi in triplo del campione comprendente estrazione clean up e determinazione della risposta al test 9 2 4 I campioni con una risposta al di sotto del limite di reporting sono espressi come inferiori al limite di reporting 9 2 5 Per ciascun tipo di matrice del campione il rapporto menziona il livello di interesse su cui si basa la valutazione 9 2 6 Il rapporto menziona il tipo di test applicato il principio base del test e il tipo di calibrazione 9 2 7 Il rapporto indica il metodo utilizzato per l estrazione di PCDD PCDF PCB diossina simili e lipidi CAPO II Preparazione dei campioni e prescrizioni per i metodi dI analisi impiegati nel controllo ufficiale dei livelli di PCB non diossina simili PCB 28 52 101 138 153 180 1 Metodi di rilevazione applicabili Gascromatografia con rilevazione a cattura di elettroni GC ECD GC LRMS GC MS MS GC HRMS o metodi equivalenti 2 Identificazione e conferma degli analiti di interesse 2 1 Tempo di ritenzione relativo rispetto agli standard interni o agli standard d
80. 2 1 ossia 2 5 ml Premiscele Il contenuto w di diclazuril nel campione espresso in mg kg dato dalla seguente formula has X hie Ca X 0 02V x p xX hi s x hac m mg kg dove ha altezza area del picco del diclazuril nella soluzione di taratura 3 10 altezza area del picco dello standard interno nella soluzione di taratura 3 10 has altezza area del picco del diclazuril nella soluzione del cam pione 5 2 2 altezza area del picco dello standard interno nella soluzione del campione 5 2 2 Cao concentrazione di diclazuril nella soluzione di taratura in ug ml 3 10 m peso della quantit di sostanza da analizzare in grammi V volume dell estratto del campione conformemente al punto 5 2 2 ossia 25 ml p contenuto nominale di diclazuril nella premiscela in mg kg Convalida dei risultati Identit L identit dell analita pu essere confermata mediante co cromatografia oppure mediante un rivelatore a serie di diodi che permetta di confron tare gli spettri dell estratto del campione 5 2 1 o 5 2 2 e della soluzione di taratura 3 10 Co cromatografia A un estratto del campione 5 2 1 o 5 2 2 viene addizionato un quan titativo adeguato della soluzione di taratura 3 10 Il quantitativo di diclazuril addizionato deve essere analogo a quello di diclazuril rilevato nell estratto del campione Devono aumentare soltanto le altezze del picco del diclazuril e dello standard inter
81. 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 1 Trattandosi di un semplice strumento di documentazione esso non impegna la responsabilit delle istituzioni gt B REGOLAMENTO CE N 152 2009 DELLA COMMISSIONE del 27 gennaio 2009 che fissa i metodi di campionamento e d analisi per i controlli ufficiali degli alimenti per gli animali Testo rilevante ai fini del SEE GU L 54 del 26 2 2009 pag 1 Modificato da Gazzetta ufficiale n pag data gt MI Regolamento UE n 278 2012 della Commissione del 28 marzo 2012 L 91 8 29 3 2012 gt M2 Regolamento UE n 51 2013 della Commissione del 16 gennaio 2013 L 20 33 23 1 2013 gt M3 Regolamento UE n 691 2013 della Commissione del 19 luglio 2013 L 197 1 20 7 2013 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 2 REGOLAMENTO CE N 152 2009 DELLA COMMISSIONE del 27 gennaio 2009 che fissa i metodi di campionamento e d analisi per i controlli ufficiali degli alimenti per gli animali Testo rilevante ai fini del SEE LA COMMISSIONE DELLE COMUNIT EUROPEE visto il trattato che istituisce la Comunit europea visto il regolamento CE n 882 2004 del Parlamento europeo e del Consiglio del 29 aprile 2004 relativo ai controlli ufficiali intesi a verificare la conformit alla normativa in materia di mangimi e di alimenti e alle norme sulla salute e sul benessere degli animali in particolare l articolo 11 paragrafo 4 lettere a b e c considerando quanto segue 1
82. 25 del 23 5 1996 pag 35 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 61 primi tre minuti allo scopo di evitare la formazione di grumi La quantit d acqua del bagnomaria deve essere sufficiente per mantenere l ebolli zione quando vi immerso il pallone Quest ultimo non pu essere tolto dal bagnomaria durante l agitazione Dopo 15 minuti esatti togliere il pallone dal bagnomaria aggiungere 30 ml d acqua fredda e raffreddare immediatamente sino a 20 C Aggiungere 5 ml di soluzione di Carrez I 3 3 ed agitare per circa 30 secondi Aggiungere quindi 5 ml di soluzione di Carrez II 3 4 e agitare nuovamente per circa 30 secondi Portare a volume con acqua mesco lare e filtrare Se il filtrato non perfettamente limpido caso poco frequente ripetere l analisi usando una maggiore quantit di soluzione di Carrez I e II ad esempio 10 ml Misurare quindi il potere rotatorio della soluzione in un tubo da 200 mm con un polarimetro od un saccarimetro 5 3 Determinazione del potere rotatorio P o S delle sostanze solubili in etanolo al 40 Pesare con l approssimazione di 1 mg 5 g del campione introdurli in un pallone tarato da 100 ml e aggiungere circa 80 ml di etanolo 3 5 cfr osservazione 7 2 Lasciar riposare il pallone per un ora a tempera tura ambiente durante questo intervallo agitarlo energicamente sei volte in modo che la sostanza sia ben mescolata con l etanolo Portare quindi a volume con etanolo 3 5 me
83. 3 4 ml di fase mobile 3 8 e travasarlo quanti tativamente in un pallone tarato da 10 ml Lavare il pallone con pi volumi di 1 2 ml di fase mobile e travasare questi liquidi di lavaggio nel pallone tarato Portare a volume con lo stesso solvente e agitare Filtrare un aliquota attraverso un filtro a membrana di 0 45 um 4 7 Conservare questa soluzione per la determinazione HPLC 5 4 Determinazione HPLC Parametri I parametri qui riportati sono di riferimento possibile tuttavia operare in condizioni diverse purch si ottengano risultati equivalenti Colonna per cromatografia liquida 4 4 1 Fase mobile per HPLC 3 8 Velocit di efflusso 1 5 2 ml minuto Lunghezza d onda di rivelazione 317 nm Volume di iniezione 20 50 pl Verificare la stabilit del sistema cromatografico iniettando pi volte la soluzione di taratura 3 9 3 contenente 3 6 ug ml sino ad ottenimento di altezze aree del picco e tempi di ritenzione costanti Curva di taratura Iniettare pi volte ciascuna soluzione di taratura 3 9 3 e misurare le altezze aree dei picchi per ciascuna concentrazione Tracciare una curva di taratura riportando le altezze medie dei picchi o le aree medie delle soluzioni di taratura sulle ordinate e le corrispondenti concentra zioni in ug ml sulle ascisse Soluzione del campione Iniettare pi volte l estratto del campione 5 3 2 utilizzando lo stesso volume usato per le soluzioni di taratura e determinare l altez
84. 3 bis 4 clorobenziliden amino guanidina cloridra to Robenidina soluzione madre standard 300 ug ml Pesare con l approssimazione di 0 1 mg 30 mg di robenidina standard 3 9 Sciogliere con metanolo acidificato 3 2 in un matraccio tarato da 100 ml portare a volume con lo stesso solvente e agitare Avvolgere il matraccio in un foglio di alluminio e conservarlo al buio Soluzione standard intermedia di robenidina 12 ug ml Travasare 10 0 ml della soluzione madre standard 3 9 1 in un matrac cio tarato da 250 ml portare a volume con la fase mobile 3 8 e agitare Avvolgere il matraccio in un foglio di alluminio e conservarlo al buio Soluzioni di taratura In una serie di matracci tarati da 50 ml travasare 5 0 10 0 15 0 20 0 e 25 0 ml della soluzione standard intermedia 3 9 2 Portare a volume con la fase mobile 3 8 e agitare Queste soluzioni corrispondono ri spettivamente a 1 2 2 4 3 6 4 8 e 6 0 ug ml di robenidina Devono essere preparate al momento poco prima dell uso Acqua di qualit HPLC 4 2 4 3 4 4 4 4 1 4 5 4 6 4 7 Ap 52 5 3 5 3 1 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 97 Apparecchiatura Colonna di vetro Colonna realizzata in vetro ambra dotata di rubinetto e serbatoio di circa 150 ml di capacit diametro interno 10 15 mm lunghezza 250 mm Agitatore meccanico o magnetico Evaporatore rotante a film Apparecchiatura per HPLC con rivelator
85. 40 1 1 66 4 1 3 91 9 7 80 2 3 8 2 3 9 3 9 1 3 92 3 93 3 13 1 3 13 2 3 13 3 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 101 Soluzione madre standard di diclazuril 50 ug m 1 Trasferire 5 00 ml della soluzione madre 3 8 1 in un matraccio tarato da 50 ml portare a volume con DMF 3 6 e mescolare Avvolgere il matraccio in un foglio d alluminio o utilizzare un matraccio in vetro scuro e conservare in frigorifero A temperatura non superiore a 4 C la soluzione si mantiene stabile per un mese Standard interno 2 6 dicloro a 4 clorofenil 4 4 5 diidro 3 5 diosso 1 2 4 triazina 2 3H il a metilbenzenebenzene acetonitrile Soluzione madre dello standard interno di diclazu ril 500 ug m 1 In un matraccio tarato da 50 ml pesare con l approssimazione di 0 1 mg 25 mg dello standard interno 3 9 Sciogliere in DMF 3 6 portare a volume con DMF 3 6 e mescolare Avvolgere il matraccio in un foglio d alluminio o utilizzare un matraccio in vetro scuro e conservare in frigorifero A temperatura non superiore a 4 C la soluzione si mantiene stabile per un mese Soluzione dello standard interno di diclazuril 50 ug m I Trasferire 5 00 ml della soluzione madre dello standard interno 3 9 1 in un matraccio tarato da 50 ml portare a volume con DMF 3 6 e me scolare Avvolgere il matraccio in un foglio d alluminio o utilizzare un matraccio in vetro scuro e conservare in frigorifero A temper
86. 5 000 mg kg pu prodursi una degradazione della vitamina E Si racco manda pertanto a titolo di conferma l applicazione di un metodo HPLC che includa la mineralizzazione enzimatica della formulazione della vi tamina E senza la fase della saponificazione alcalina 8 Ripetibilit La differenza fra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione non deve superare il 15 del risultato pi ele vato 9 Risultati di uno studio effettuato in cooperazione tra vari laborato ri sE Alimento pre Concentrato Concentrato Alimento per Premiscela i A i miscelato minerale proteico suinetti L 12 n 48 media mg kg 61 3 sr mg kg 23 r mg kg 6 4 CV 3 8 sr mg kg 7 8 R mg kg 21 8 CVr 12 7 L numero di laboratori n numero di valori singoli sr deviazione standard della ripetibilit sg deviazione standard della riproducibilit r ripetibilit R riproducibilit CV coefficiente di variazione della ripetibilit CVp coefficiente di variazione della riproducibilit Studio effettuato dal gruppo di lavoro Alimenti per animali del Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs und Forschungsanstalten VDLUFA 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 85 Figura 1 Dispositivo di estrazione 4 8 un cilindro di vetro 4 8 1 altezza approssimatiya 48 cm insert di vetro smerigliato 4 8 2 lunghezza approssimativa 45 cm
87. 72 199 CEE Articolo 1 Articolo 2 Articolo 3 Articolo 4 Allegato I parte 1 Allegato I parte 2 Allegato I parte 3 Allegato I parte 4 Allegato I parte 5 Allegato II Direttiva 73 46 CEE Direttiva 73 46 CEE Articolo 1 Articolo 3 Articolo 4 Allegato I parte 1 Allegato I parte 2 Allegato I parte 3 Il presente regolamento Articolo 3 Allegato III parte L Allegato III parte C Allegato V parte A Il presente regolamento Articolo 3 Allegato III parte B Allegato III parte I 10 Ti Direttiva 76 371 CEE Direttiva 76 371 CEE Articolo 1 Articolo 2 Articolo 3 Allegato Direttiva 76 372 CEE 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 167 Il presente regolamento Articolo 1 Allegato I Direttiva 76 372 CEE Articolo 1 Articolo 2 Articolo 3 Allegato Il presente regolamento Direttiva 78 633 CEE Direttiva 78 633 CEE Articolo 1 Articolo 2 Articolo 3 Allegato parte 1 Allegato parte 2 Allegato parte 3 Direttiva 81 715 CEE Direttiva 81 715 CEE Articolo 1 Articolo 2 Articolo 3 Allegato Il presente regolamento Articolo 3 Allegato IV parte C Il presente regolamento Direttiva 84 425 CEE Direttiva 84 425 CEE Articolo 1 Articolo 2 Articolo 3 Allegato Direttiva 86 174 CEE Il presente regolamento Direttiva 86 174 CEE Il presente regolamento Articolo 1 Articolo 2 Articolo 3 Articolo 4
88. 9R0152 IT 01 01 2014 003 001 157 Verificare la stabilit del sistema cromatografico iniettando varie volte la soluzione di taratura 3 7 3 contenente 1 0 ug ml fino a ottenimento di altezze del picco e tempi di ritenzione costanti Curva di taratura Iniettare pi volte ciascuna soluzione di taratura 3 7 3 e determinare le altezze aree medie del picco per ciascuna concentrazione Tracciare una curva di taratura indicando le altezze aree medie del picco delle soluzioni di taratura sulle ordinate e le concentrazioni corrispondenti in ug ml nelle ascisse Soluzione del campione Iniettare pi volte l estratto del campione 5 2 utilizzando lo stesso volume di quello prelevato per le soluzioni di taratura e determinare le altezze aree medie del picco dell amprolium Calcolo dei risultati Determinare la concentrazione della soluzione del campione in ug ml in base all altezza area media dei picchi dell amprolium per riferimento alla curva di taratura 5 3 2 Il contenuto w di amprolium nel campione espresso in mg kg dato dalla seguente formula __Vxexf w mg kg dove V volume del solvente di estrazione 3 8 espresso in ml conforme mente al punto 5 2 ossia 200 ml concentrazione di amprolium nell estratto del campione 5 2 espresso in ug m f fattore di diluizione conformemente al punto 5 2 2 peso della quantit di sostanza da analizzare in grammi le B I Convalida
89. 9R0152 IT 01 01 2014 003 001 165 i o elo a CVr 4 2 3 0 4 3 6 3 5 7 6 5 contenuto nominale 10 0 10 0 10 0 10 0 100 100 g kg numero di laboratori numero di valori singoli deviazione standard della ripetibilit coefficiente di variazione della ripetibilit deviazione standard della riproducibilit coefficiente di variazione della riproducibilit ALLEGATO IX 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 166 TAVOLE DI CONCORDANZA DI CUI ALL ARTICOLO 6 Direttiva 71 250 CEE Direttiva 71 250 CEE Il presente regolamento Articolo 1 primo comma Articolo 1 secondo comma Articolo 2 Articolo 3 Allegato parte 1 Allegato parte 2 Allegato parte 3 Allegato parte 4 Allegato parte 5 Allegato parte 6 Allegato parte 7 Allegato parte 9 Allegato parte 10 Allegato parte 11 Allegato parte 12 Allegato parte 14 Allegato parte 16 Direttiva 71 393 CEE Direttiva 71 393 CEE Articolo 1 Articolo 2 Articolo 3 Allegato parte I Allegato parte II Allegato parte III Allegato parte IV Articolo 3 Articolo 2 Allegato II Allegato III parte O Allegato III parte M Allegato III parte N Allegato III parte Q Allegato III parte K Allegato III parte J Allegato III parte D Il presente regolamento Articolo 3 Allegato III parte A Allegato III parte E Allegato III parte P Allegato III parte H Direttiva 72 199 CEE Direttiva
90. 9R0152 IT 01 01 2014 003 001 52 Se il tenore di sostanza oleosa o grassa superiore al 15 nel proce dimento A si raccomanda di effettuare una estrazione preliminare prima dell idrolisi e nel procedimento B una seconda estrazione Ci pu di pendere in parte dalla natura degli alimenti per animali e da quella della sostanza oleosa o grassa contenuta in tali alimenti I DETERMINAZIONE DELLA CELLULOSA GREZZA Finalit e campo d applicazione Il metodo consente di determinare negli alimenti per animali le materie organiche esenti da grasso insolubili in ambiente acido e in ambiente alcalino convenzionalmente designate con il nome di cellulosa grezza Principio Il campione eventualmente sgrassato trattato successivamente con soluzioni bollenti di acido solforico e di idrossido di potassio di deter minate concentrazioni Il residuo separato per filtrazione su vetro sinterizzato lavato essiccato pesato e incenerito a 475 500 C La perdita di peso conseguente all incenerimento corrisponde alla cellulosa grezza della quantit di prodotto sottoposta all analisi Reattivi Acido solforico c 0 13 mol l Agente antischiuma ad esempio n ottanolo Coadiuvante della filtrazione Celite 545 o equivalente riscaldato a 500 C per quattro ore 8 6 Acetone Etere di petrolio con punto di ebollizione compreso fra 40 C e 60 C Acido cloridrico c 0 5 mol l Soluzione di idrossido di potassio c
91. Allegato Direttiva 93 70 CEE Direttiva 93 70 CEE Articolo 1 Articolo 2 Articolo 3 Allegato Allegato VII Il presente regolamento Articolo 3 Allegato IV parte D 12 13 14 15 16 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 168 Direttiva 93 117 CE Direttiva 93 117 CE Il presente regolamento Articolo 1 Articoli 3 e 5 Articolo 2 Articolo 3 Allegato parte 1 Allegato IV parte E Allegato parte 2 Allegato VIII parte A Direttiva 98 64 CE Direttiva 98 64 CE Il presente regolamento Articolo 1 Articoli 3 e 5 Articolo 2 Articolo 3 Articolo 4 Allegato parte A Allegato III parte F Allegato parte C Allegato VIII parte B Direttiva 1999 27 CE Direttiva 1999 27 CE Il presente regolamento Articolo 1 Articoli 3 e 5 Articolo 2 a Articolo 3 Articolo 4 Articolo 5 Articolo 6 Articolo 7 E Allegato parte A Allegato VIII parte C Allegato parte B Allegato IV parte F Allegato parte C Allegato VIII parte D Direttiva 1999 76 CE Direttiva 1999 76 CE Il presente regolamento Articolo 1 Articolo 3 Articolo 2 Articolo 3 Articolo 4 Allegato Allegato IV parte G Direttiva 2000 45 CE Direttiva 2000 45 CE Il presente regolamento Articolo 1 Articolo 2 Articolo 3 Articolo 4 Allegato parte A Articolo 3 Allegato IV parte A Allegato IV parte B Allegato III parte G Allegato parte B Al
92. C Determinazione del gossipolo libero Porre la quantit di sostanza da sottoporre all analisi in un pallone da 250 ml a collo smerigliato il cui fondo ricoperto di polvere di vetro Aggiungere con una pipetta 50 ml del solvente A 3 2 tappare il pallone e porlo per un ora nel mescolatore rotativo a capovolgimento Filtrare su un filtro asciutto e raccogliere il filtrato in un palloncino a collo smerigliato Nel corso della filtrazione ricoprire l imbuto con un vetro da orologio Introdurre con una pipetta in due palloni tarati da 25 ml A e B parti aliquote identiche di filtrato contenenti da 50 a 100 ug di gossipolo Completare eventualmente a 10 ml con il solvente A 3 2 Portare quindi a volume il contenuto del pallone A con la miscela di isopro panolo esano 3 1 Questa soluzione sar utilizzata come soluzione di riferimento per la misura della soluzione del campione Pipettare 10 ml del solvente A 3 2 in altri due palloni tarati da 25 ml C e D Portare quindi a volume il contenuto del pallone C con la miscela di isopropanolo esano 3 1 Questa soluzione sar utilizzata come soluzione di riferimento per la misura della soluzione della prova in bianco Aggiungere 2 ml d anilina 3 4 nei palloni D e B Riscaldare per 30 minuti su bagno d acqua bollente per far sviluppare la colorazione Raf freddare a temperatura ambiente portare a volume con la miscela di isopropanolo esano 3 1 mescolare e lasciar riposare
93. E richiesto un solo campione globale per partita Dimensione minima del cam pione globale Natura degli alimenti 6 1 Alimenti alla rinfusa 4 kg 6 2 Alimenti in confezioni 4 kg 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 11 vm3 richiesto un solo campione globale per partita Dimensione minima del cam Natura degli alimenti pione globale 6 3 Alimenti liquidi o semiliquidi 4 litri 6 4 Alimenti minerali in formellati o mattonelle di sali minerali di peso unitario superiore a 1 kg 6 4 2 di peso unitario pari o inferiore peso di quattro originari for a l kg mellati o mattonelle 6 5 Foraggi grossolani foraggio 4 kg Se l alimento da sottoporre a campionamento ha un valore elevato si pu prelevare una quantit inferiore di campione globale purch ci sia indicato e documentato nel verbale di campionamento Conformemente alle disposizioni del regolamento UE n 619 2011 della Commissione del 24 giugno 2011 che fissa i metodi di campionamento e di analisi per i controlli ufficiali degli alimenti per animali riguardo alla presenza di materiale geneticamente modificato per il quale sia in corso una procedura di autorizzazione o la cui autorizzazione sia scaduta GU L 166 del 25 6 2011 pag 9 il campione globale per la verifica della presenza di materiale geneticamente modificato deve contenere almeno 35 000 semi grani Ci significa c
94. H PO4 Acido ortofosforico p p p 85 Soluzione di acido ortofosforico c 20 Diluire con acqua 23 5 ml di acido ortofosforico 3 2 e portare a 100 ml 6 metil 2 eptilammina 1 5 dimetilesilammina p p p 99 Metanolo di qualit HPLC Acido cloridrico densit 1 19 g ml Soluzione tampone fosfato c 0 01 mol l In 500 ml di acqua 3 11 sciogliere 1 36 g di KHPO 3 1 aggiungere 3 5 ml di acido ortofosforico 3 2 e 10 0 ml di 6 metil 2 eptilammina 3 4 Portare il pH a 4 0 con soluzione di acido ortofosforico 3 3 e portare a 1 000 ml con acqua 3 11 Metanolo acidificato Travasare 5 0 ml di acido cloridrico 3 6 in un matraccio tarato da 1000 ml portare a volume con metanolo 3 5 e mescolare Questa soluzione deve essere preparata al momento prima dell uso Fase mobile per HPLC soluzione tampone fosfato e metanolo 5 95 V V Mescolare 5 ml di soluzione tampone fosfato 3 7 con 95 ml di meta nolo 3 5 Sostanza standard lasalocid sodico di purezza garantita C34Hs3OgNa sale sodico di un acido monocarbossilico polietere prodotto da Strep tomyces lasaliensis E763 Soluzione madre standard di lasalocid sodico 500 ug ml In un matraccio tarato da 100 ml pesare con l approssimazione di 0 1 mg 50 mg di lasalocid sodico 3 10 sciogliere in metanolo acidi ficato 3 8 portare a volume con lo stesso solvente e mescolare Questa soluzione deve essere preparata al momento poco prima dell us
95. L 83 del 30 3 1973 pag 21 9 GU L 102 del 15 4 1976 pag 1 7 GU L 102 del 15 4 1976 pag 8 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 3 ottava direttiva 78 633 CEE della Commissione del 15 giugno 1978 che fissa i metodi d analisi comunitari per il controllo ufficiale degli alimenti per gli animali nona direttiva 81 715 CEE della Commissione del 31 luglio 1981 che fissa 1 metodi d analisi comunitari per il controllo ufficiale degli alimenti per animali decima direttiva 84 425 CEE della Commissione del 25 luglio 1984 che fissa 1 metodi d analisi comunitari per il controllo ufficiale degli alimenti per animali 3 direttiva 86 174 CEE della Commissione del 9 aprile 1986 che fissa il metodo di calcolo del valore energetico degli alimenti composti destinati al pollame undicesima direttiva 93 70 CEE della Commissione del 28 lu glio 1993 che fissa i metodi d analisi comunitari per il con trollo degli alimenti per animali 5 dodicesima direttiva 93 117 CE della Commissione del 17 di cembre 1993 che fissa i metodi d analisi comunitari per il controllo ufficiale degli alimenti per animali 9 direttiva 98 64 CE della Commissione del 3 settembre 1998 che fissa i metodi di analisi comunitari per la determinazione degli amminoacidi delle materie grasse grezze e dell olaquin dox negli alimenti per animali e che modifica la direttiva 71 393 CEE 7
96. PLICAZIONE I campioni destinati al controllo ufficiale degli alimenti per animali sono prelevati secondo le modalit sottoindicate Tali campioni sono da con siderarsi rappresentativi delle partite campionate Lo scopo del campionamento rappresentativo di prelevare una piccola frazione di un lotto in modo che la determinazione di una caratteristica specifica di tale frazione rappresenti il valore medio della caratteristica del lotto Il campionamento avviene mediante prelievo ripetuto di cam pioni elementari in diversi punti del lotto Tali campioni elementari sono mescolati per formare un campione globale dal quale sono ricavati a loro volta dei campioni finali rappresentativi per divisione rappresenta tiva Se ad un controllo visivo partite del mangime da sottoporre a campio namento mostrano una differenza di qualit dal resto del mangime dello stesso lotto tali partite vengono separate dal resto del mangime e trattate come un sottolotto distinto Qualora non fosse possibile suddividerlo in sottolotti il mangime viene sottoposto a campionamento come lotto unico In tali casi ne fatta menzione nel verbale di campionamento Se un mangime facente parte di un lotto di mangimi della stessa classe o con la medesima descrizione viene sottoposto a campionamento confor memente alle disposizioni del presente regolamento e risulta non soddi sfare i requisiti UE si presume che tutto il mangime di tale lotto non soddisfi i requisiti UE
97. RMINAZIONE DELL UREA Finalit e campo d applicazione Il metodo consente di determinare il contenuto di urea negli alimenti per animali 3 2 3 3 3 4 3 59 4 2 4 3 DD 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 30 Principio Il campione messo in sospensione nell acqua in presenza di un chia rificante La sospensione filtrata Il contenuto di urea del filtrato determinato dopo aggiunta di 4 dimetilamminobenzaldeide 4 DMAB misurando la densit ottica alla lunghezza d onda di 420 nm Reattivi Soluzione di 4 dimetilamminobenzaldeide sciogliere 1 6 g di 4 DMAB in 100 ml di etanolo al 96 e aggiungere 10 ml di acido cloridrico P20 1 19 g ml Questo reattivo si conserva soltanto per due settimane Soluzione di Carrez I sciogliere in acqua 21 9 g di acetato di zinco Zn CH3C00 2H 0 e 3 g di acido acetico glaciale Portare a 100 ml con acqua Soluzione di Carrez II sciogliere nell acqua 10 6 g di ferrocianuro di potassio K4 Fe CN 3H350 Portare a 100 ml con acqua Carbone attivo non assorbente urea eseguire un controllo Urea soluzione allo 0 1 p v Apparecchiatura Agitatore rotativo a capovolgimento circa 35 40 giri per minuto Provette 160 x 16 mm a tappo smerigliato Spettrofotometro Procedimento Analisi del campione Pesare con l approssimazione di 1 mg 2 g del campione ed introdurli con 1 g di carbone attivo 3 4 in un matraccio tarato da 500 ml Aggiungere 4
98. Sciacquare un quantitativo adatto di amberlite 3 2 con acqua fino a eliminazione completa di tutti gli ioni cloruro eliminazione che viene verificata eseguendo una prova al nitrato di argento 3 20 sulla fase acquosa che stata messa da parte Sciacquare quindi la resina con 50 ml di metanolo 3 8 eliminare il metanolo e conservare la resina in metanolo fresco Soluzione di nitrato di argento circa 0 1 mol l Sciogliere 0 17 g di nitrato di argento 3 9 in 10 ml di acqua Fase mobile per HPLC Mescolare 500 ml di acetonitrile 3 1 300 ml di soluzione tampone di acetato ammonico 3 18 e 1 200 ml di acqua 3 14 Regolare il pH a 4 3 con acido acetico 3 5 Filtrare la soluzione attraverso un filtro di 0 22 um 4 8 e degassarla ad esempio sottoponendola per 10 minuti a trattamento con ultrasuoni Questa soluzione stabile per un mese se conservata al buio in un contenitore chiuso 4 2 4 3 4 4 4 4 1 4 5 4 6 4 7 4 8 5 1 5 2 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 92 Apparecchiatura Bagno ultrasonico Evaporatore rotante Centrifuga Apparecchiatura HPLC a rivelatore UV a lunghezza d onda variabile oppure rivelatore a serie di diodi Colonna per cromatografia liquida 300 mm x 4 mm Cjg con riempi mento 10 um o colonna equivalente Colonna di vetro 300 mm x 10 mm con filtro in vetro sinterizzato e di rubinetto di arresto Filtri in fibra di vetro diametro 150 mm F
99. TEF per le diossine i furani e i PCB diossina simili TEF dell OMS per la valutazione dei rischi per l uomo basati sulle conclusioni della riunione di esperti del programma internazionale sulla sicurezza delle sostanze chimiche dell Organizzazione mondiale della sanit OMS svoltasi a Ginevra nel giugno 2005 Martin van den Berg et al The 2005 World Health Organization Re evaluation of Human and Mammalian Toxic Equivalency Factors for Dioxins and Dioxin like Com pounds Toxicological Sciences 93 2 223 241 2006 Congenere Valore TEF Congenere Valore TEF Dibenzo p diossine PCB diossina simili PCDD e dibenzo p PCB non orto PCB furani PCDF mono orto 1 2 3 7 8 PeCDD 1 PCB non orto 1 2 3 4 7 8 HxCDD o1 PCB77 0 0001 1 2 3 6 7 8 HxCDD 0 0003 1 2 3 7 8 9 HxCDD 0 1 1 2 3 4 6 7 8 HpCDD 0 03 orm 2 3 7 8 TCDF 0 00003 1 2 3 7 8 PeCDF 0 00003 2 3 4 7 8 PeCDF 0 00003 1 2 3 4 7 8 HxCDF 0 00003 1 2 3 6 7 8 HxCDF 0 00003 1 2 3 7 8 9 HxCDF o1 PCB 157 0 00003 2 3 4 6 7 8 HxCDF 0 1 0 00003 1 2 3 4 6 7 8 HpCDF 0 01 PCB 189 0 00003 1 2 3 4 7 8 9 HpCDF OCDF 0 01 0 0003 Abbreviazioni T tetra Pe penta Hx esa Hp epta O octa CDD clorodi benzodiossina CDF clorodibenzofurano CB clorobifenile C GU L 221 del 17 8 2002 pag 8 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 116 vmi La partita non conforme alle specifiche se il risultato analitico upper bound
100. Tabella dei valori per 25 ml di reattivo di Luff Schoorl ml di Na S O 0 1 mol l 2 minuti di riscaldamento 10 minuti di ebollizione Glucosio fruttosio zuc Na S2 03 cheri invertiti Lattosio Maltosio Na S2 03 0 1 mol l Cia Hz Ol C2 Hz Oji 0 1 mol l 2 4 2 4 3 6 37 3 9 3 9 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8 9 9 10 10 11 11 12 12 13 13 14 14 15 15 16 16 17 17 18 18 19 19 20 20 21 21 22 22 23 23 3 2 3 3 3 4 3 5 3 2 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 60 L DETERMINAZIONE DELL AMIDO METODO POLARIMETRICO Finalit e campo d applicazione Il metodo consente di determinare il contenuto in amido e in prodotti di degradazione dell amido ad alto peso molecolare negli alimenti per ani mali al fine di controllarne la conformit al valore energetico dichiarato disposizioni di cui all allegato VII e alla direttiva 96 25 CE del Consi glio Principio Il metodo prevede una duplice determinazione Nella prima il campione trattato con acido cloridrico diluito Dopo chiarificazione e filtrazione si misura per polarimetria il potere rotatorio della soluzione Nella seconda il campione viene estratto con etanolo al 40 Dopo acidificazione del filtrato con acido cloridrico chiarificazione e filtrazio ne si misura il potere rotatorio come nella prima determinazione La differenza tra le due misure moltiplicata per un fattore noto d il contenuto in amido del campione R
101. a della non conformit del resto del lotto ai requisiti UE 8 3 Campionamento di lotti grandi immagazzinati in depositi Il campionamento si effettua sulla parte accessibile del lotto Il numero di campioni elementari determinato tenendo conto delle dimensioni della partita campionata In caso di campionamento di una parte di un lotto di mangimi della stessa classe o con la medesima descrizione e se tale parte del lotto non risultata conforme ai requisiti UE si presume che i risultati valgano per tutto il mangime di tale lotto a meno che a seguito di un esame dettagliato non risulti prova alcuna della non con formit del resto del lotto ai requisiti UE 8 4 Campionamento di strutture di stoccaggio sili 8 4 1 Campionamento di sili facilmente accessibili dall alto Il campionamento si effettua sulla parte accessibile del lotto Il numero di campioni elementari determinato tenendo conto delle dimensioni della partita campionata In caso di campionamento di una parte di un lotto di mangimi della stessa classe o con la medesima descrizione e se tale parte del lotto non risultata conforme ai requisiti UE si presume che i risultati valgano per tutto il mangime di tale lotto a meno che a seguito di un esame dettagliato non risulti prova alcuna della non con formit del resto del lotto ai requisiti UE 8 4 2 Campionamento di sili non accessibili dall alto chiusi 8 4 2 1 Sili non accessibili dall alto chiusi di di
102. addizione della sostanza di riferimento In questo caso un aliquota del campione da analizzare viene addizionata di una quantit nota di carba dox analoga a quella gi presente Quest aliquota viene analizzata in sieme a una del campione non addizionato e il recupero pu essere calcolato per differenza Estrazione Alimenti per animali Pesare con l approssimazione di 0 01 g 10 g del campione e trasferirli in una beuta da 200 ml Aggiungere 15 0 ml di acqua mescolare ed equilibrare per 5 minuti Aggiungere 35 0 ml di metanolo acetonitrile 3 5 tappare e agitare per 30 minuti sull agitatore o col mescolatore magnetico 4 1 Filtrare la soluzione attraverso carta da filtro in fibra di vetro 4 2 Conservare questa soluzione per la fase di purificazione 5 3 Premiscele 0 1 2 0 Pesare con l approssimazione di 0 001 g 1 g del campione non maci nato e trasferirlo in una beuta da 200 ml Aggiungere 15 0 ml di acqua mescolare ed equilibrare per 5 minuti Aggiungere 35 0 ml di metanolo acetonitrile 3 5 tappare ed agitare per 30 minuti sull agitatore o col mescolatore magnetico 4 1 Filtrare la soluzione attraverso carta da filtro in fibra di vetro 4 2 Pipettare un aliquota del filtrato in un matraccio tarato da 50 ml Ag giungere 15 0 ml d acqua portare a volume con metanolo acetonitrile 3 5 e mescolare La concentrazione di carbadox nella soluzione finale di circa 10 g ml Filtrare un aliquota attraverso un filtr
103. ali Dopo aver selezionato il numero prescritto di formellati o mattonelle da campionare secondo quanto indicato nel capitolo 5 prelevare una parte da ciascun formellato o da ciascuna mattonella Se si ha il sospetto che un formellato o una mattonella non sia omogeneo a pu essere prelevato come campione l intero formellato o l intera mattonella Per i formellati o le mattonelle di peso unitario non superiore a 1 kg il campione elementare costituito dal contenuto di un formellato o di una mattonella 9 3 Formazione dei campioni globali Riunire i campioni elementari per costituire un unico campione globale 94 Formazione dei campioni finali Il materiale del campione globale va mescolato con cura Introdurre ciascun campione in un contenitore recipiente idoneo Prendere tutte le precauzioni del caso per evitare qualsiasi modifica alla composizione del campione o qualsiasi contaminazione o alte razione fortuita durante il trasporto o lo stoccaggio In caso di controllo di costituenti o sostanze distribuiti in modo uniforme nell alimento il campione globale pu essere ridotto in modo rappresentativo a non meno di 2 0 kg o 2 0 litri campione ridotto 2 possibilmente facendo uso di un divisore meccanico o automatico Per la verifica della presenza di residui di antiparassitari nei legumi nei cereali in grani e nella frutta a guscio il campione ridotto deve essere di almeno 3 kg Se la natura dell alimento no
104. ampioni di riferimento 8 2 1 I campioni di riferimento rappresentano la matrice campione i pattern di congeneri e i range di concentrazione per PCDD PCDF e PCB diossina simili attorno al livello di interesse 8 2 2 Un bianco matrice e se questo non possibile un bianco di procedura e un campione di riferimento al livello di interesse sono inclusi in ciascuna serie di test Questi campioni sono estratti e testati nello stesso momento in condizioni identiche Il campione di riferimento presenta una risposta notevolmente pi elevata del campione in bianco in modo da garantire l idoneit del test Questi campioni possono essere utilizzati per le cor rezioni del bianco e del recupero 9 Gli attuali requisiti si basano sui TEF pubblicati in M Van den Berg et al Toxicol Sci 93 2 223 241 2006 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 127 vmi 8 2 3 I campioni di riferimento scelti per effettuare una correzione del recupero sono rappresentativi dei campioni del test il che significa che i pattern di congeneri non possono portare a una sottostima dei livelli 8 2 4 Campioni di riferimento supplementari per esempio a 0 5 x e 2 x il livello di interesse possono essere inclusi per dimostrare la performance adeguata del test nel range di interesse per il controllo del livello di interesse Combinati questi campioni possono essere utilizzati per cal colare i livelli BEQ nei campioni del test cfr punto 8 1 2 2
105. ampone fosfato 3 7 e metanolo 3 5 5 95 V V Velocit di efflusso 1 2 ml min Lunghezze d onda di rivela zione eccitazione 310 nm emissione 419 nm Volume da iniezione 20 pl Verificare la stabilit del sistema cromatografico iniettando pi volte la soluzione di taratura 3 10 3 contenente 4 0 ug ml fino a ottenimento di altezze aree del picco e tempi di ritenzione costanti Curva di taratura Iniettare pi volte ciascuna soluzione di taratura 3 10 3 e determinare le altezze aree medie dei picchi per ciascuna concentrazione Tracciare la curva di taratura riportando in ordinata le altezze aree medie dei picchi e in ascissa le corrispondenti concentrazioni espresse in ug ml Soluzione del campione Iniettare pi volte gli estratti dei campioni di cui ai punti 5 2 1 o 5 2 2 utilizzando lo stesso volume di quello prelevato per le soluzioni di taratura e determinare le altezze aree medie dei picchi del lasalocid sodico Calcolo dei risultati Determinare la concentrazione della soluzione del campione in ug ml in base all altezza area media dei picchi del lasalocid sodico ottenuta per iniezione 5 3 3 per riferimento alla curva di taratura 6 1 6 2 72 7 3 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 109 Alimenti per animali Il contenuto w di lasalocid sodico nel campione espresso in mg kg dato dalla seguente formula cx V w l mg kg m dove c concentrazione d
106. analitici a BEQ Limite di decisione r Linea di regressione con intervallo di predizione Valore cut off del 95 BEQLivello di azione Livello di Livello Limite di Risultati HRGC HRMS azione max decisione TEQ Calcolo dei valori di cut off in base a un livello di fiducia del 95 implicante un tasso di falsi conformi lt 5 e un RSDgp lt 25 1 a partire dalla banda inferiore dell intervallo di predizione del 95 al limite di decisione HRGC HRMS 2 a partire dall analisi multipla di campioni n gt 6 contaminati al limite di decisione HRGC HRMS come endpoint inferiore della distribuzione dei dati rappresentata nella figura da una curva a campana al corrispondente valore BEQ medio 8 3 4 Restrizioni dei valori di cut off I valori di cut off espressi in BEQ calcolati a partire dalla RSDg ottenuta durante la validazione utilizzando un numero limitato di campioni con differenti matrici pattern di congeneri possono essere superiori ai livelli di interesse espressi in TEQ in quanto la precisione maggiore di quella raggiungibile in routine quando deve essere controllato uno spettro sco nosciuto di possibili pattern di congeneri In tali casi i valori di cut off sono calcolati a partire da una RSDg 25 o sono preferiti i due terzi del livello di interesse 8 4 Caratteristiche di performance 8 4 1 Sono eseguiti test di ripetibilit dei metodi bioanalitici per ottenere informazioni sulla deviazione
107. ando sono presenti gli stessi valori massimi e quando in tutti i punti osservati lo scarto fra gli spettri non supera il 15 dell assorbanza dello spettro all apice del picco Se uno di questi criteri non soddisfatto la presenza dell analita non confermata Ripetibilit La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione non deve superare il 30 rispetto al valore pi elevato per i contenuti di diclazuril compresi fra 0 5 e 2 5 mg kg 0 75 mg kg per i contenuti di diclazuril compresi fra 2 5 e 5 mg kg il 15 del valore pi elevato per i contenuti di diclazuril superiori a 5 mg kg Recupero Per un campione addizionato bianco il recupero non inferiore al 1 80 Risultati di uno studio collaborativo stato organizzato uno studio collaborativo nel corso del quale undici laboratori hanno analizzato cinque campioni costituiti da due premiscele una mescolata con una matrice organica O 100 e l altra con una matrice inorganica A 100 Il contenuto teorico era di 100 mg di diclazuril kg I tre alimenti misti per volatili da cortile sono stati preparati da tre diversi produttori NL L1 Z1 K1 Il contenuto teorico era di 1 mg di dicla zuril kg Ai laboratori stato chiesto di analizzare ciascun campione uno sola volta o in duplicato Per ulteriori informazioni consultare il Journal of AOAC International Volume 77 n 6 1994 pagg 1359 1361 I
108. anga al di sotto di 40 C Portare il pH a 2 20 a temperatura ambiente utilizzando la soluzione di idrossido di sodio di cui al punto 3 17 e infine una soluzione di idrossido di sodio conforme al punto 3 18 Procedere conformemente al punto 5 3 4 Soluzione del campione per cromatografia Trasferire quantitativamente l idrolizzato portato a pH 2 20 5 3 3 1 o 5 3 3 2 con tampone citrato 3 24 in un matraccio tarato da 200 ml e portare a volume con tampone 3 24 Se non stato ancora utilizzato uno standard interno aggiungerne 2 00 ml 3 27 3 e portare a volume con tampone citrato 3 24 Misce lare accuratamente Procedere alla fase della cromatografia 5 4 Se le soluzioni del campione non vengono cromatografate nello stesso giorno conservarle a temperatura inferiore a 5 C Cromatografia Prima della cromatografia portare l estratto 5 2 o l idrolizzato 5 3 4 a temperature ambiente Agitare la miscela e filtrarne una quantit appro priata attraverso un filtro a membrana da 0 22 um 4 5 La soluzione limpida risultante viene sottoposta a cromatografia a scambio ionico utilizzando un analizzatore di amminoacidi 4 9 L iniezione pu venire eseguita manualmente o automaticamente im portante iniettare sempre la stessa quantit 0 5 di soluzione nella colonna per l analisi degli standard e dei campioni salvo quando si usa uno standard interno inoltre i rapporti sodio amminoacidi nello standard e nelle s
109. aratura Iniettare pi volte ciascuna soluzione di taratura 3 7 3 e misurare le altezze aree del picco per ciascuna concentrazione Tracciare una curva di taratura riportando in ordinate l altezza media o l area media dei picchi delle soluzioni di taratura e in ascisse le corrispondenti concentrazioni in ug ml Soluzione del campione Iniettare pi volte l estratto del campione 5 5 utilizzando lo stesso volume usato per le soluzioni di taratura e determinare l altezza area media dei picchi del metilbenzoquato Calcolo dei risultati Determinare la concentrazione della soluzione del campione in g ml in base all altezza area media dei picchi del metilbenzoquato per riferi mento alla curva di taratura 5 6 2 Il contenuto di metilbenzoquato w mg kg del campione dato dalla formula seguente c x 40 wW m dove c concentrazione del metilbenzoquato nella soluzione del campione in g ml m peso della quantit di sostanza da analizzare in grammi Convalida dei risultati Identit L identit dell analita pu essere confermata mediante co cromatografia oppure mediante un rivelatore a serie di diodi che permetta di confron tare gli spettri dell estratto del campione e della soluzione di taratura 3 7 3 contenente 10 ug ml Co cromatografia Un estratto del campione viene rinforzato mediante un quantitativo adeguato della soluzione standard intermedia 3 7 2 Il quantitativo di metilbenzoquato addizi
110. arente del biodosaggio calcolato a partire da idonei cam pioni di riferimento con pattern di congeneri rappresentativi attorno al livello di interesse 6 4 Validazione nel range del livello di interesse e misure generali di con trollo della qualit 6 4 1 I laboratori dimostrano la performance di un metodo nel range del livello di interesse ad esempio 0 5 x 1 x e 2 x il livello di interesse con un coefficiente di variazione accettabile per le analisi ripetute durante la procedura di validazione e durante le analisi di routine 6 4 2 Controlli regolari in bianco ed esperimenti spiking o analisi di campioni di controllo di preferenza se disponibile materiale di riferimento certi ficato sono effettuati come misure interne di controllo della qualit Per i controlli in bianco gli esperimenti spiking o le analisi dei campioni di controllo sono registrate e verificate carte di controllo qualit per assi curare che la performance analitica sia conforme ai requisiti 6 5 Limite di quantificazione 6 5 1 Per un metodo di screening bioanalitico non indispensabile fissare il limite di quantificazione ma il metodo deve dimostrare di poter diffe renziare tra il valore bianco e il valore cut off Quando fornito un livello BEQ fissato un livello di reporting per trattare i campioni che presentano una risposta al di sotto di tale livello Il livello di repor ting dimostrato diverso dai campioni bianchi almeno di un fattore
111. ato di volume adeguato e diluire con acqua sino al volume necessario per la cromatografia ad esempio 100 ml L aggiunta di metanolo non provoca precipitazione 5 4 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 46 Filtrare alcuni ml della soluzione con un filtro a membrana da 0 45 um 4 5 prima dell iniezione nella colonna HPLC Procedere alla fase della cromatografia secondo quanto indicato al punto 5 4 Proteggere la soluzione madre e gli idrolizzati dalla luce solare diretta Se non possibile analizzare gli idrolizzati il giorno stesso questi de vono essere conservati a 5 C al massimo per 3 giorni Determinazione HPLC Le seguenti condizioni di eluizione isocratica sono proposte a titolo indicativo possibile operare in condizioni diverse purch si ottengano risultati equivalenti cfr anche osservazioni 9 1 e 9 2 Colonna per cromatografia 125 mm x 4 mm C g particelle di riem liquida 4 2 pimento 3 um o equivalente Temperatura della colonna temperatura ambiente Fase mobile 3 22 3 00 g di acido acetico 3 18 900 ml di acqua 3 1 50 0 ml di soluzione 3 21 di 1 1 1 trichloro 2 metil 2 propanolo 3 19 in metanolo 3 8 1 g 100 ml re golare il pH a 5 00 per mezzo di etanolammina 3 20 portare a 1 000 ml con acqua 3 1 Velocit di efflusso 1 ml min Durata totale dell eluizione circa 34 min Lunghezza d onda di rivela eccitazione 280 nm emissione 356 nm zione Volume di iniezion
112. atura 5 4 2 Alimenti per animali Il contenuto w mg kg di carbadox nel campione dato dalla seguente formula cx Vi k w mo meke dove c concentrazione di carbadox nell estratto del campione 5 2 espresso in ug ml V volume dell estratto espresso in ml ossia 50 ml m peso della quantit di sostanza da analizzare in grammi Premiscele e preparati Il contenuto w mg kg di carbadox nel campione dato dalla seguente formula cx V xf ___ mg kg dove c concentrazione di carbadox nell estratto del campione 5 2 2 o 5 2 3 espresso in pg ml V2 volume dell estratto espresso in ml ossia 50 ml per le premiscele 150 ml per i preparati f fattore di diluizione conformemente ai punti 5 2 2 premiscele e 5 2 3 preparati m peso della quantit di sostanza da analizzare in grammi Convalida dei risultati Identit L identit dell analita pu essere confermata mediante co cromatografia oppure mediante un rivelatore a serie di diodi che permetta di confron tare gli spettri dell estratto del campione e della soluzione di taratura 3 11 2 contenente 10 0 ug ml Co cromatografia Un estratto del campione viene rinforzato mediante aggiunta di un quantitativo adeguato della soluzione di taratura 3 11 2 Il quantitativo di carbadox aggiunto deve essere simile a quello stimato rilevato nel l estratto del campione Deve aumentare soltanto l altezza del picco del carbadox tenuto
113. atura non superiore a 4 C la soluzione si mantiene stabile per un mese Soluzione dello standard interno per le premiscele p 1000 mg ml p contenuto nominale di diclazuril nella premiscela in mg kg In un matraccio tarato da 100 ml pesare con l approssimazione di 0 1 mg p l10 mg dello standard interno sciogliere in DMF 3 6 in bagno ultrasonico 4 6 portare a volume con DMF e mescolare Av volgere il matraccio in un foglio d alluminio o utilizzare un matraccio in vetro scuro e conservare in frigorifero A temperatura non superiore a 4 C la soluzione si mantiene stabile per un mese Soluzione di taratura 2 ug ml In un matraccio tarato da 50 ml pipettare 2 00 ml di soluzione standard di diclazuril 3 8 2 e 2 00 ml di soluzione dello standard interno 3 9 2 Aggiungere 16 ml di DMF 3 6 portare a volume con acqua e mesco lare Questa soluzione deve essere preparata al momento prima dell uso Cartuccia Cjg per estrazione in fase solida ad esempio Bond Elut misura 1 cm peso sorbente 100 mg Solvente di estrazione metanolo acidificato Pipettare 5 0 ml di acido cloridrico 3 7 in 1 000 ml di metanolo 3 5 e mescolare Fase mobile per HPLC Eluente A soluzione di acetato di ammonio solfidrato di tetrabuti lammonio Sciogliere 5 g di acetato d ammonio 3 2 e 3 4 g di TBHS 3 3 in 1 000 ml d acqua 3 1 e mescolare Eluente B acetonitrile 3 4 Eluente C metanolo 3 5 4 2 4 2 1
114. base di vetro smerigliato Matracci tarati con tappi di vetro smerigliato a collo piccolo da 10 25 100 e 500 ml Imbuti separatori conici da 1 000 ml con tappi di vetro smerigliato Matracci a pera da 250 ml con base di vetro smerigliato Refrigerante Allihn lunghezza tubo di raffreddamento 300 mm con giunzione di vetro smerigliato con adattatore per tubo di alimentazione gas Carta filtro pieghettata per separazione di fase diametro 185 mm ad esempio Schleicher amp Schuell 597 HY 1 2 Apparecchiatura HPLC con dispositivo di iniezione Colonna per cromatografia liquida 250 mm x 4 mm C g particelle di riempimento 5 o 10 um o equivalente Rivelatore UV o a fluorescenza con regolazione lunghezza d onda va riabile Spettrofotometro con celle al quarzo da 10 mm Bagnomaria con agitatore magnetico Il dispositivo di estrazione cfr figura 1 costituito da un cilindro di vetro della capacit di 1 litro con collo e tappo di vetro smerigliato un insert di vetro smerigliato con braccio laterale e tubo regolabile che attraversa la parte centrale Tale tubo ha l estremit inferiore a U e un beccuccio all estremit opposta in modo che lo strato liquido superiore nel cilindro possa essere trasferito in un imbuto separatore Procedimento Nota La vitamina E sensibile alla luce ultravioletta e all ossidazione Tutte le operazioni sono effettuate in assenza di luce utilizzando vetreria di vetro ambra o vetreria prot
115. campione che produce una risposta strumentale a due diversi ioni da monitorare con un rapporto S R segnale rumore di 3 1 per il segnale meno intenso e il rispetto dei criteri di identificazione descritti ad esempio nella norma prEN 16215 Alimenti per animali Determinazione di diossine e PCB diossina simili mediante GC HRMS e di PCB indicatori mediante GC HRMS e o nel metodo EPA 1613 revi sione B I metodi di screening bioanalitici non danno risultati al livello del con genere ma solo un indicazione del livello di TEQ espresso in equi valenti bioanalitici BEQ in considerazione del fatto che non tutti i composti presenti in un estratto di campione che produce una risposta nel test possono soddisfare i requisiti del principio di TEQ I metodi di screening e di conferma possono essere applicati per il controllo di una determinata matrice solo se sono sufficientemente sen sibili per rilevare i livelli in modo attendibile al livello di interesse soglia d intervento o livello massimo Prescrizioni di garanzia della qualit Devono essere adottate misure per evitare contaminazioni accidentali durante ogni fase del campionamento e dell analisi I campioni devono essere conservati e trasportati in contenitori di vetro alluminio polipropilene o polietilene che ne permettano la conserva zione senza influenzare i livelli di PCDD PCDF e di PCB diossina simili Le tracce di polvere di carta devono essere rimosse dal conten
116. cines Laboratori di riferimento UE per i residui di medicinali veterinari e contaminanti negli alimenti di origine animale di Foug res Berlino e Bilthoven 20 1 2010 http ec europa eu food food chemicalsafety residues lab_analysis_en htm vmi 2 3 4 2 4 3 4 4 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 119 b test fisico chimico ad esempio gascromatografia spettrometria di massa spettrometria di massa GC MS MS o gascromatografia spet trometria di massa a bassa risoluzione GC LRMS per il quale le caratteristiche misurate della precisione del metodo non soddisfano i requisiti per i test quantitativi I metodi quantitativi soddisfano gli stessi requisiti di accuratezza range dinamico e precisione dei test di conferma Se richiesta la quantifica zione questi metodi sono convalidati come metodi di conferma Background Per il calcolo delle concentrazioni di equivalenti tossici TEQ le con centrazioni delle singole sostanze in un dato campione sono moltiplicate per i rispettivi fattori di tossicit equivalente TEF stabiliti dall Orga nizzazione mondiale della sanit ed elencati nell appendice del presente allegato quindi sommate per ottenere la concentrazione totale di compo sti diossina simili espressa in TEQ Ai fini della presente parte B dell allegato V il limite di quantificazione specifico accettato di un singolo congenere la concentrazione di un analita nell estratto di un
117. conformemente al punto 5 6 3 2 2 6 di tert butil 4 metilfenolo BHT cfr osservazioni al punto 7 5 Apparecchiatura Evaporatore rotante sotto vuoto Vetreria in vetro ambra Matracci a fondo piatto o beute da 500 ml con base di vetro smerigliato Matracci tarati con tappi di vetro smerigliato a collo piccolo da 10 25 100 e 500 ml Imbuti separatori conici da 1000 ml con tappi di vetro smerigliato Matracci a pera da 250 ml con base di vetro smerigliato Refrigerante Allihn lunghezza tubo di raffreddamento 300 mm con giunzione di vetro smerigliato e con adattatore per tubo di alimentazione gas Carta filtro pieghettata per separazione di fase diametro 185 mm ad esempio Schleicher amp Schuell 597 HY 1 2 Apparecchiatura HPLC con dispositivo di iniezione Colonna per cromatografia liquida 250 mm x 4 mm C g particelle di riempimento 5 o 10 um o equivalente criterio di prestazione un unico picco per tutti gli isomeri di retinolo in condizioni HPLC Rivelatore UV o a fluorescenza con regolazione lunghezza d onda va riabile Spettrofotometro con celle al quarzo da 10 mm Bagnomaria con agitatore magnetico Il dispositivo di estrazione cfr figura 1 costituito da un cilindro di vetro della capacit di 1 litro con collo e tappo di vetro smerigliato un insert di vetro smerigliato con braccio laterale e tubo regolabile che attraversa la parte centrale Questo tubo ha l estremit inferiore a U e un beccucci
118. conto sia del quantitativo di carbadox aggiunto che della diluizione dell estratto L ampiezza del picco a met della sua altezza massima deve corrispon dere con uno scostamento massimo del 10 dall ampiezza originale Rivelazione a serie di diodi I risultati sono valutati in base ai seguenti criteri a la lunghezza d onda dell assorbimento massimo degli spettri del cam pione e dello standard registrata al vertice del picco sul cromato gramma deve essere la stessa entro un margine determinato dal po tere di risoluzione del sistema di rivelazione Per la rivelazione a serie di diodi tale margine in genere di circa 2 nm 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 164 b fra 225 e 400 nm gli spettri del campione e dello standard registrati all apice del picco cromatografico non devono differire tra loro per le parti dello spettro situate fra il 10 e il 100 dell assorbanza relativa Questo criterio soddisfatto quando sono presenti gli stessi valori massimi e quando in tutti i punti osservati lo scarto tra gli spettri non supera il 15 dell assorbanza dell analita standard c fra 225 e 400 nm gli spettri relativi all estratto del campione regi strati nel tratto ascendente all apice e nel tratto discendente del picco cromatografico non devono differire tra loro per quelle parti dello spettro situate tra il 10 e il 100 dell assorbanza relativa Questo criterio soddisfatto quando sono presenti gli stessi valo
119. costituito per pi del 5 da particelle gt 0 50 mm setacciare a 0 25 mm e procedere all esame delle due frazioni risultanti 2 1 3 3 6 Preparazione del campione tal quale preparare un aliquota di al meno 5 g di sottocampione macinato Se questo materiale co stituito per pi del 5 da particelle gt 0 50 mm setacciare a 0 25 mm e procedere all esame delle due frazioni risultanti 2 1 3 4 Preparazione di campioni costituiti da grassi o oli Per la preparazione di campioni costituiti da grassi o oli seguire il seguente protocollo se il grasso si presenta in forma solida scaldarlo in un forno fino a liquefarlo utilizzando una pipetta trasferire con una 40 ml di grasso o olio dal fondo del campione in un tubo di centrifugazione centrifugare per 10 minuti a 4 000 giri minuto se il grasso si presenta in forma solida dopo la centrifugazione riscaldarlo in un forno fino a liquefarlo ripetere la centrifugazione per 5 minuti a 4000 giri minuto trasferire con un cucchiaino o una spatola met delle impurit decantate su vetrini per microscopico per l esame si racco manda il glicerolo come mezzo di montaggio utilizzare le impurit restanti per preparare il sedimento come indicato al punto 2 1 3 3 2 135 Uso di reagenti coloranti Per facilitare la corretta identificazione dei costituenti di origine animale l operatore pu utilizzare reagenti di colorazione durante la
120. cqua di qualit HPLC Soluzione tampone di acetato c 0 01 mol 1 pH 6 0 Sciogliere 0 82 g di acetato di sodio 3 7 in 700 ml d acqua 3 8 e regolare il pH a 6 0 con acido acetico 3 6 Trasferire in un matraccio tarato da 1000 ml portare a volume con acqua 3 8 e mescolare Fase mobile per HPLC Mescolare 825 ml di soluzione tampone di acetato 3 9 con 175 ml di acetonitrile 3 2 Filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0 22 um 4 5 e degassarla ad esempio sottoponendola per 10 minuti a trattamento con ultrasuoni 3 111 3 112 4 2 4 3 44 4 4 1 4 4 2 4 5 4 6 4 7 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 160 Sostanza di riferimento standard Carbadox allo stato puro Metil 3 2 chinossalinilinmetilene carbazato N N diossido E 850 Soluzione madre standard di carbadox 100 ug ml cfr nota 5 Procedimento In un matraccio tarato da 250 ml pesare con l approssimazione di 0 1 mg 25 mg di carbadox standard Sciogliere la sostanza in metano lo acetonitrile 3 5 sottoponendola a trattamento con ultrasuoni 4 7 Dopo il trattamento con ultrasuoni raffreddare a temperatura ambiente portare a volume con metanolo acetonitrile 3 5 e mescolare Avvolgere il matraccio in un foglio d alluminio o usare vetreria scura e conservare in frigorifero A temperatura non superiore a 4 C la soluzione si man tiene stabile per un mese Soluzioni di taratura Trasferire 2 0
121. da saggiare prelevato dal campione finale Il metodo del cono e della quartatura sconsigliato in quanto pu dar luogo a quan titativi da saggiare con un elevato errore di ripartizione 3 1 1 Alimenti che possono essere macinati direttamente Mescolare il campione finale setacciato e raccoglierlo in un reci piente appropriato pulito e asciutto provvisto di chiusura ermetica Mescolare di nuovo al fine di garantire che l omogeneizzazione sia completa immediatamente prima di prelevare la quantit da analiz zare quantitativo da saggiare 3 1 2 Alimenti che possono essere macinati dopo essic cazione Salvo diversa indicazione specifica nei metodi di analisi essiccare il campione finale in modo da portarne il contenuto di umidit ad un livello compreso tra 1 8 e il 12 applicando il procedimento di pre essiccazione indicato al punto 4 3 del metodo di dosaggio dell umi dit menzionato nell allegato III parte A Procedere quindi come indicato al punto 3 1 1 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 18 vm3 3 1 3 Alimenti liquidi o semiliquidi Raccogliere il campione finale in un recipiente appropriato pulito ed asciutto provvisto di chiusura ermetica Mescolare bene al fine di garantire che l omogeneizzazione sia completa immediatamente prima di prelevare la quantit da analizzare quantitativo da saggia re 3 1 4 Altri alimenti Se il campione finale non pu essere preparato
122. dard c H 504 0 05 mol l Indicatore rosso di metile sciogliere 300 mg di rosso di metile in 100 ml di etanolo o 95 96 v v Soluzione d idrossido di sodio possibile usare quello di purezza tec nica 40 g 100 ml m v 40 Idrossido di sodio soluzione standard volumetrica c NaOH 0 25 mol l Idrossido di sodio soluzione volumetrica standard c Na OH 0 10 mol l Pietra pomice in granulati lavata con acido cloridrico e calcinata Acetanilide p f 114 C contenuto N 10 36 Saccarosio esente da azoto Acido borico H3B0O Soluzione d indicatore rosso di metile sciogliere 100 mg di rosso di metile in 100 ml di etanolo o metanolo 5 2 5 2 1 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 26 Soluzione di verde di bromocresolo sciogliere 100 mg di verde di bromocresolo in 100 ml di etanolo o metanolo Soluzione di acido borico da 10 g l a 40 g l a seconda dell apparec chiatura utilizzata Quando applicato il metodo di determinazione colorimetrica del punto finale vanno aggiunti alle soluzioni di acido borico gli indicatori rosso di metile e bromocresolo Nella preparazione di 1 litro di soluzione di acido borico prima di portare a volume aggiungere 7 ml di soluzione d indicatore rosso metile 3 16 e 10 ml di soluzione di verde di bromo cresolo 3 17 A seconda dell acqua utilizzata il pH della soluzione di acido borico pu variare da una partita all altra Per otten
123. dare la procedura d analisi Deve essere aggiunto almeno un congenere per ciascuno dei gruppi omologhi da tetra a octaclorati di PCDD PCDF e almeno un congenere per ciascuno dei gruppi omologhi di PCB diossina simile in alternativa almeno un congenere per ciascuna funzione di registrazione di ioni selezionati tramite spettrometria di massa utilizzata per il monitoraggio di PCDD PCDF e PCB diossina simili Nel caso dei metodi di conferma sono utilizzati tutti i 17 stan dard interni di PCDD PCDF 2 3 7 8 sostituiti marcati con 5C e tutti i 12 standard interni di PCB diossina simile marcati con 3C 7 2 2 Sono inoltre determinati i fattori di risposta relativa per i congeneri ai quali non aggiunto alcun analogo marcato con 5C utilizzando appro priate soluzioni di calibrazione 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 124 vmi 7 2 3 Per gli alimenti per animali di origine vegetale e per gli alimenti per animali di origine animale con tenore di grassi inferiore al 10 lag giunta di standard interni prima dell estrazione obbligatoria Per gli alimenti per animali di origine animale con tenore di grassi superiore al 10 gli standard interni possono essere aggiunti prima o dopo l estrazione dei grassi effettuata un appropriata validazione dell effi cienza dell estrazione a seconda della fase in cui sono introdotti gli standard interni e del modo in cui i risultati sono espressi sulla base del prodotto o dei gras
124. dei risultati Identit L identit dell analita pu essere confermata mediante co cromatografia oppure mediante un rivelatore a serie di diodi che permetta di confron tare gli spettri dell estratto del campione 5 2 e della soluzione di tara tura 3 7 3 contenente 2 0 ug ml Co cromatografia Un estratto del campione 5 2 viene rinforzato mediante aggiunta di un quantitativo adeguato della soluzione di taratura 3 7 3 Il quantita tivo di amprolium aggiunto deve essere simile a quello di amprolium rilevato nell estratto del campione Deve aumentare soltanto l altezza del picco dell amprolium tenuto conto sia del quantitativo aggiunto che della diluizione dell estratto L ampiezza del picco a met della sua altezza deve corrispondere con uno sco stamento massimo del 10 all ampiezza originale del picco dell am prolium nell estratto del campione non addizionato Rivelazione a serie di diodi I risultati sono valutati in base ai seguenti criteri a la lunghezza d onda dell assorbimento massimo degli spettri del cam pione e dello standard registrata al vertice del picco sul cromato gramma deve essere la stessa entro un margine determinato dal po tere di risoluzione del sistema di rivelazione Per la rivelazione a serie di diodi tale margine in genere di circa 2 nm 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 158 b fra 210 e 320 nm gli spettri del campione e dello standard registrati al vertice del picc
125. derabili ai sensi della direttiva 2002 32 CE un prodotto destinato all alimentazione animale conside rato non conforme al livello massimo fissato quando il risultato d analisi relativo a un alimento con tenore di umidit del 12 giudicato superiore al livello massimo tenuto conto dell incertezza di misura estesa e della correzione per il recupero Al fine di valutare la confor mit si utilizza la concentrazione risultante dall analisi corretta per il fattore di recupero e dopo aver dedotto l incertezza di misura estesa Tale procedura applicabile unicamente nei casi in cui il metodo d ana lisi consenta la stima dell incertezza di misura e la correzione per il fattore di recupero non possibile ad esempio in caso di analisi microscopica Il risultato dell analisi riportato come segue quando il metodo d ana lisi consente di valutare l incertezza di misura e il tasso di recupero a corretto per il recupero indicando il tasso di recupero La correzione non necessaria nel caso in cui il tasso di recupero sia compreso tra 90 e 110 b nella forma x U dove x il risultato dell analisi e U l incer tezza di misura estesa calcolata per mezzo di un fattore di copertura 2 che d un livello di affidabilit del 95 circa Tuttavia qualora il risultato dell analisi risulti molto inferiore gt 50 al valore della specifica oggetto di controllo e a condizione che si rispe
126. di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione non supera lo 0 2 di umidit valore assoluto Osservazione Qualora sia necessario procedere alla macinazione e questa comporti una variazione nel contenuto di umidit del prodotto i risultati dell analisi dei componenti dell alimento devono essere corretti in funzione del con tenuto di umidit del campione iniziale B DETERMINAZIONE DELL UMIDITA NEI GRASSI E NEGLI OLI ANIMALI E VEGETALI Finalit e campo d applicazione Il metodo consente di determinare il contenuto di umidit acqua ed altre materie volatili dei grassi e degli oli animali e vegetali Principio Il campione viene sottoposto ad essiccazione a 103 C fino a cessazione della diminuzione di massa la perdita di peso tra due pesate consecutive deve essere inferiore o pari a 1 mg La perdita di peso determinata per pesata Apparecchiatura Recipiente a fondo piano di materiale resistente alla corrosione diame tro da 8 a 9 cm altezza di 3 cm circa Termometro con bulbo rinforzato e camera di espansione all estremit superiore tarato da circa 80 C ad almeno 110 C lunghezza di 10 cm circa Bagno di sabbia o piastra elettrica riscaldante Essiccatore contenente un efficace disidratante Bilancia per analisi Procedimento Pesare con l approssimazione di 1 mg 20 g circa del campione omo geneizzato nel recipiente 3 1 essiccato e tarato contenente il termome tro 3 2
127. di iniezione 20 ul Lunghezza d onda di 280 nm rivelazione Verificare la stabilit del sistema cromatografico iniettando pi volte la soluzione di taratura 3 10 contenente 2 ug ml fino a ottenimento di altezze aree del picco e tempi di ritenzione costanti Soluzione di taratura Iniettare pi volte 20 ul della soluzione di taratura 3 10 e determinare l altezza area media dei picchi del diclazuril e dello standard interno Soluzione del campione Iniettare pi volte 20 ul della soluzione del campione 5 2 1 o 5 2 2 e determinare l altezza area media dei picchi del diclazuril e dello stan dard interno Calcolo dei risultati Alimenti per animali Il contenuto w di diclazuril nel campione espresso in mg kg dato dalla seguente formula ha s XxX hic x Cdc X 10 V his x ha c mg kg 6 2 TA TEZ 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 104 has altezza area del picco del diclazuril nella soluzione del cam pione 5 2 1 his altezza area del picco dello standard interno nella soluzione del campione 5 2 1 ha altezza area del picco del diclazuril nella soluzione di taratura 3 10 hic altezza area del picco dello standard interno nella soluzione di taratura 3 10 Ca concentrazione di diclazuril nella soluzione di taratura in ug ml 3 10 m peso della quantit di sostanza da analizzare in grammi V volume dell estratto del campione conformemente al punto 5
128. di soluzione dello standard interno 3 9 3 e 200 ml di solvente di estrazione 3 12 poi tappare la beuta Agitare per una notte sull agitatore 4 1 Lasciare depositare per 10 minuti Trasferire un aliquota da 10 000 p ml p con tenuto nominale di diclazuril nella premiscela espresso in mg kg del 5 3 Sil 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 103 surnatante in un matraccio a fondo arrotondato di dimensioni adatte Evaporare nell evaporatore rotante 4 3 sotto pressione ridotta e a 60 C fino a quando il composto comincia a seccare Sciogliere il residuo con 10 0 ml DMF 3 6 aggiungere 15 0 ml d acqua 3 1 e mescolare Procedere alla determinazione HPLC 5 3 Determinazione HPLC Parametri Le seguenti condizioni vengono proposte a titolo indicativo possibile operare in condizioni diverse purch si ottengano risultati equivalenti Colonna per cromato 100 mm x 4 6 mm grafia liquida 4 2 1 con riempimento in Hypersil ODS da 3 um o equivalente Fase mobile Eluente A 3 13 1 soluzione acquosa di acetato di ammonio e di solfidrato di tetrabu tilammonio Eluente B 3 13 2 acetonitrile Eluente C 3 13 3 metanolo Metodo di eluzione gradiente lineare condizioni iniziali A B C 60 20 20 V V V dopo 10 minuti eluizione a gradiente per 30 minuti fino a A B C 45 20 35 V V V Risciacquare con B per 10 minuti Velocit di efflusso 1 5 2 ml min Volume
129. di soluzione di idrossido di potassio 3 4 attraverso il refrigerante 4 3 e lasciar rifluire per altri 25 minuti sempre agitando sotto una debole corrente di azoto Risciac quare il refrigerante con circa 20 ml di acqua e lasciare raffreddare il contenuto del matraccio a temperatura ambiente Estrazione Trasferire quantitativamente per decantazione la soluzione di saponifica zione risciacquando con un volume totale di 250 ml di acqua in un imbuto separatore da 1000 ml 4 2 3 o nel dispositivo di estrazione 4 8 Risciacquare successivamente il matraccio di saponificazione con 25 ml di etanolo 3 1 e 100 ml di etere di petrolio 3 2 e trasferire il liquido di lavaggio nell imbuto separatore o nel dispositivo di estrazione Il rapporto di acqua ed etanolo nelle soluzioni combinate deve essere di circa 2 1 Agitare energicamente per 2 minuti e lasciare riposare per 2 minuti Estrazione con imbuto separatore 4 2 3 Quando gli strati sono separati cfr osservazione al punto 7 3 trasferire lo strato di etere di petrolio in un altro separatore 4 2 3 Ripetere questa estrazione due volte con 100 ml di etere di petrolio 3 2 poi ancora due volte con 50 ml di etere di petrolio 3 2 Lavare due volte gli estratti combinati nell imbuto separatore rimestando delicatamente per evitare la formazione di emulsioni con volumi di 100 ml di acqua e quindi agitando ripetutamente con altri volumi di 100 ml di acqua finch l acqua risulti incol
130. di tiosolfato di sodio 0 1 mol l Esprimere il risultato in percentuale del campione Procedimenti speciali Per gli alimenti molto ricchi di melasso e altri alimenti poco omogenei pesare 20 g e introdurli con 500 ml d acqua in un pallone tarato da 1 litro Far girare nell apparecchio rotativo per un ora Chiarificare con i reattivi di Carrez I 3 2 e Carrez II 3 3 come descritto al punto 5 1 utilizzando tuttavia una quantit quattro volte pi elevata di ciascun reattivo Portare a volume con etanolo all 80 v v Omogeneizzare e filtrare Eliminare l etanolo come descritto al punto 5 1 In assenza di amido destrinizzato portare a volume con acqua distillata Per i melassi e le materie prime per alimenti ricchi in zuccheri e pra ticamente esenti da amido carrube fettucce essiccate di barbabietole ecc pesare 5 g introdurli in un pallone tarato da 250 ml aggiungere 200 ml di acqua distillata e far girare nell apparecchio rotativo per un ora o pi se necessario Chiarificare con i reattivi di Carrez I 3 2 e Carrez II 3 3 come descritto al punto 5 1 Portare a volume con acqua omogeneizzare e filtrare Per la determinazione degli zuccheri totali procedere come descritto al punto 5 3 Osservazioni consigliabile aggiungere circa 1 ml di 3 metilbutan l olo 3 14 senza tener conto del volume prima dell ebollizione con il reattivo di Luff Schoorl onde evitare la formazione di schiuma 8 2 8 3 2009R015
131. do cloridrico 3 2 sino a cessazione dell effervescenza Aggiungere altri 10 ml di acido cloridrico 3 2 Porre il becher su un bagno di sabbia e evaporare a secco per insolubilizzare la silice Riprendere il residuo con 10 ml di acido nitrico 3 3 e far bollire per 5 minuti sul bagno di sabbia o sulla piastra riscaldante senza arrivare a secco Travasare il liquido in un pallone tarato da 500 ml lavando il becher a pi riprese con acqua calda Lasciar raffreddare portare a volume con acqua mescolare e filtrare Sviluppo della colorazione e misura della densit ottica Diluire una parte del filtrato ottenuto conformemente a quanto indicato al punto 5 1 1 o 5 1 2 in modo da ottenere una concentrazione di fosforo in quantit non superiore a 40 ug ml Introdurre in un tubo da saggio 4 6 10 ml di questa soluzione ed aggiungervi 10 ml del reattivo va nado molibdico 3 6 Mescolare e lasciar riposare almeno 10 minuti alla temperatura di 20 C Misurare la densit ottica allo spettrofotometro a 430 nm per comparazione con una soluzione ottenuta per aggiunta di 10 ml di reattivo vanado molibdico 3 6 a 10 ml di acqua Curva di taratura Preparare a partire dalla soluzione tipo 3 7 soluzioni contenenti ri spettivamente 5 10 20 30 e 40 ug di fosforo per ml Prelevare 10 ml da ciascuna soluzione e aggiungervi 10 ml di reattivo vanado molibdico Mescolare e lasciar riposare almeno 10 minuti alla temperatura di 20 C Misurarne la den
132. e possibile impiegare soluzioni standard commerciali purch fornite di garanzia e controllate prima dell uso Acido cloridrico d 1 19 g ml Acido cloridrico 6 mol l Acido cloridrico 0 5 mol l Acido fluoridrico al 38 40 v v con un contenuto di ferro Fe inferiore a 1 mg l e un residuo d evaporazione espresso in solfati inferiore a 10 mg l Acido solforico d 1 84 g ml Perossido di idrogeno a 100 volumi circa di ossigeno 30 in peso Soluzione standard di ferro 1 000 ug Fe ml preparata come segue o soluzione equivalente in commercio sciogliere 1 g di fil di ferro in 200 ml di acido cloridrico 6 mol l 3 2 aggiungere 16 ml di perossido d idrogeno 3 6 e portare a 1 litro con acqua Soluzione standard di ferro 100 ug Fe ml diluire un volume della soluzione standard 3 7 con 9 volumi d acqua Soluzione standard di rame 1000 ug Cu ml preparata come segue o soluzione equivalente in commercio sciogliere 1 g di rame in polvere in 25 ml di acido cloridrico 6 mol l 3 2 aggiungere 5 ml di perossido d idrogeno 3 6 e portare a 1 litro con acqua Soluzione standard di rame 10 ug Cu ml diluire un volume della soluzione standard 3 8 con 9 volumi d acqua poi ridiluire una parte della soluzione cos ottenuta con 9 volumi di acqua 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 87 3 9 Soluzione standard di manganese 1000 ug Mn ml preparata come segue o soluzione equivalente in commercio
133. e 20 pl Calcolo dei risultati Calcolare la quantit di triptofano X espressa in g per 100 g di campione secondo la seguente formula AxBxVixcex Va xM C x Dx V3 x 10000 x m A area del picco dello standard interno soluzione madre di tara tura 3 17 B area del picco del triptofano estratto 5 2 o idrolizzato 5 3 Vj volume in ml 2 ml di soluzione concentrata di triptofano 3 15 aggiunta alla soluzione di taratura 3 17 c concentrazione in umol ml 2 50 di soluzione concentrata di triptofano 3 15 aggiunta alla soluzione di taratura 3 17 V volume in ml della soluzione concentrata di standard interno 3 16 aggiunta all estrazione 5 2 5 00 ml o all idrolizzato 5 3 2 00 ml C area del picco dello standard interno dell estratto 5 2 o del l idrolizzato 5 3 D area del picco del triptofano soluzione madre di taratura 3 17 V3 volume in ml 2 00 ml della soluzione concentrata dello standard interno 3 16 aggiunto alla soluzione madre di taratura 3 17 m peso del campione in g corretto al peso iniziale se essiccato e o sgrassato M peso molecolare del triptofano 204 23 g mol Ripetibilit La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione non deve superare il 10 del valore ottenuto pi elevato 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 47 Risultati di uno studio collaborativo stato organizzato un
134. e 2 5 ug ml fino a ottenimento di altezze del picco e tempi di ritenzione costanti Curva di taratura Iniettare pi volte ciascuna soluzione di taratura 3 5 3 e determinare le altezze le aree medie dei picchi per ciascuna concentrazione Tracciare una curva di taratura indicando le altezze aree medie dei picchi delle soluzioni di taratura sulle ordinate e le concentrazioni corrispondenti in ug ml nelle ascisse Soluzione del campione Iniettare pi volte l estratto del campione 5 2 utilizzando lo stesso volume usato per le soluzioni di taratura e determinare l altezza area media dei picchi dell olaquindox Calcolo dei risultati Determinare la concentrazione della soluzione del campione in ug ml in base all altezza area media dei picchi dell olaquindox per riferimento alla curva di taratura 5 3 2 Il tenore w di olaquindox espresso in mg kg del campione dato dalla seguente formula c x 1000 w m 1 2 13 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 153 dove c concentrazione di olaquindox nell estratto del campione 5 2 espressa in ug ml m peso della sostanza da analizzare in g 5 2 Convalida dei risultati Identit L identit dell analita pu essere confermata mediante co cromatografia oppure mediante un rivelatore a serie di diodi che permetta di confron tare gli spettri dell estratto del campione 5 2 e della soluzione di tara tura 3 7 3 contenente 5 0 ug ml Co cromatog
135. e a 100 ml con acqua Rame ug Cu ml 1 0 ml di soluzione standard di la 10 voro 3 7 1 1 ml 10 ug Cu ml HCI 3 2 8 ug Mn ml 1 0 ml di soluzione standard di la 10 voro 3 7 1 1 ml 10 ug Mn ml HCI 3 2 7 10 ml di soluzione di cloruro di lantanio 3 11 portare a 100 ml con acqua Zinco ug Zn ml 0 8 ml di soluzione standard di la 8 voro 3 7 1 1 ml 10 ug Zn ml HCI 3 2 7 10 ml di soluzione di cloruro di lantanio 3 11 portare a 100 ml con acqua 5 1 2 2 Preparazione della soluzione da sottoporre ad analisi Per la determinazione del rame la soluzione preparata secondo quanto indicato al punto 5 1 1 pu in linea generale essere utilizzata direttamen te Se necessario portare la sua concentrazione nell intervallo delle concentrazioni delle soluzioni di taratura una sua aliquota pu essere pipettata in un pallone tarato da 100 ml e portata a volume con acido cloridrico 0 5 mol l 3 3 Per la determinazione del ferro del manganese e dello zinco pipettare un aliquota della soluzione preparata secondo quanto indicato al punto 5 1 1 in un pallone tarato da 100 ml aggiungere 10 ml di soluzione di cloruro di lantanio 3 11 e portare a volume con acido cloridrico 0 5 mol l 3 3 cfr anche punto 8 Osservazione 5 1 2 3 Prova in bianco Effettuare una prova in bianco comprendente tutte le operazioni pre scritte nel procedimento escludendo la presenza del campione La solu zione di taratura
136. e a ultravioletti a lunghezza d onda variabile oppure con rivelatore a serie di diodi funzionante nell intervallo di 250 400 nm Colonna per cromatografia liquida 300 mm x 4 mm C g particelle di riempimento 10 um o equivalente Carta da filtro in fibra di vetro Whatman GF A o equivalente Filtri a membrana da 0 22 um Filtri a membrana da 0 45 um Procedimento Nota La robenidina sensibile alla luce Si usa vetreria ambrata in tutte le operazioni Indicazioni generali Analizzare un alimento di riferimento bianco per accertare l assenza di robenidina o di altre sostanze che possono interferire Procedere a una prova di recupero analizzando un campione dell ali mento bianco 5 1 1 addizionato di una quantit di robenidina simile a quella presente nel campione Per ottenere una concentrazione di 60 mg kg trasferire 3 0 ml della soluzione madre standard 3 9 1 in una beuta da 250 ml Far evaporare la soluzione fino a circa 0 5 ml in corrente d azoto Aggiungere 15 g dell alimento bianco mescolare per 10 minuti prima di procedere all estrazione 5 2 Nota Ai fini del presente metodo l alimento bianco ha una composi zione simile a quella del campione e all analisi la robenidina non deve risultare presente Estrazione Pesare con l approssimazione di 0 01 g 15 g circa del campione pre parato trasferirli in una beuta da 250 ml aggiungere 100 0 ml di me tanolo acidificato 3 2 tappare e agitare per un
137. e da analizzare viene addizionata di una quantit nota di dicla zuril analoga a quella gi presente Quest aliquota viene analizzata in sieme a una del campione non addizionato e il recupero pu essere calcolato per differenza Estrazione Alimenti per animali Pesare con l approssimazione di 0 01 g 50 g circa del campione Tra sferire in una beuta da 500 ml aggiungere 1 00 ml di soluzione dello standard interno 3 9 2 e 200 ml di solvente di estrazione 3 12 poi tappare la beuta Mantenere sotto agitazione la miscela per una notte nell agitatore 4 1 Lasciare depositare per 10 minuti Trasferire una parte aliquota da 20 ml del surnatante in un contenitore adatto in vetro e diluire con 20 ml d acqua Trasferire questa soluzione in una cartuccia di estrazione 3 11 e filtrare sotto vuoto 4 5 Lavare la cartuccia con 25 ml di una miscela di solvente di estrazione 3 12 e d acqua 65 35 V V Eliminare le frazioni raccolte ed eluire i composti con 25 ml di una miscela di solvente di estrazione 3 12 e d acqua 80 20 V V Evaporare questa frazione a 60 C nell evaporatore rotante 4 3 fino a quando comincia a seccare Sciogliere il residuo con 1 0 ml di DMF 3 6 aggiungere 1 5 ml d acqua 3 1 e mescolare Filtrare con filtro a membrana 4 4 Procedere alla determinazione HPLC 5 3 Premiscele Pesare con l approssimazione di 0 001 g 1 g circa del campione Tra sferire in una beuta da 500 ml aggiungere 1 00 ml
138. e di pesce raccomandata una pulitura finale dei setacci con acetone e aria compressa 2 133 Preparazione dei campioni diversi da grassi o oli RERA Essiccazione del campione i campioni con tenore di umidit gt 14 devono essere essiccati prima del trattamento 2133 2 Presetacciatura del campione si raccomanda di presetacciare a 1 mm i mangimi pellettati e le granaglie e poi di preparare e analizzare le due frazioni risultanti come campioni distinti 2 1 3 3 3 Sottocampionamento e macinatura prelevare dal campione e ma cinare un sottocampione di almeno 50 g da analizzare 2 1 3 3 4 Estrazione e preparazione del sedimento trasferire una porzione di 10 g precisione 0 01 g del sottocampione macinato nell imbuto separatore o nel decantatore a fondo conico e aggiungere 50 ml di tetracloroetilene L aliquota trasferita nell imbuto limitata a 3 g nel caso delle farine di pesce o di altri prodotti di origine esclusi vamente animale di ingredienti minerali o di premiscele che ge nerano pi del 10 di sedimento Agitare vigorosamente la mi scela per almeno 30 secondi e versare con cautela almeno altri 50 ml di tetracloroetilene sulla superficie interna dell imbuto per rimuovere le particelle aderenti ad esso Lasciare riposare la mi scela cos ottenuta per almeno 5 minuti prima di separare il sedi mento aprendo il rubinetto Se utilizzato un decantatore a fondo conico agitare vigorosa mente la misc
139. e frazioni grossolane Ogni vetrino esaminato interamente a vari ingrandimenti Il numero minimo di vetrini da osservare in ogni fase del proto collo di osservazione deve essere rigorosamente rispettato a meno che sia impossibile pur utilizzando tutto il materiale della frazione raggiungere il numero di vetrini stabilito Per ogni determinazione sono osservati non pi di sei vetrini Per facilitare l identificazione della natura e dell origine delle par ticelle l operatore pu utilizzare ausili quali sistemi di aiuto alle decisioni gallerie di immagini e campioni di riferimento vm 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 139 Diagramma 1 Protocollo di osservazione per l individuazione di particelle animali nei mangimi composti e nelle materie prime per mangimi diverse dalle farine di pesce s 95 delle particelle lt 0 50 mm NO 3 vetrini da sedimento 1 vetrino da flottato o materia prima 35 particelle anima _S della stessa natura individuate NO 1 vetrino da sedimento s gt 5 particelle animal della stessa natura individuate 1 vetrino da sedimento flottato o materia prima particelle animali individuate NO campione dichiarato secondo il punto 2 1 5 3 per gli ANIMALI TERRESTRI dopo la frantumazione del campione campione dichiarato secondo il punto 2 1 5 3 per i PESCI gt 5 lt 5 Numero di part
140. e in parallelo sullo stesso campione non deve superare il 10 del risultato pi elevato per contenuti di robenidina superiori a 15 mg kg Recupero Per il campione in bianco addizionato il recupero non inferiore al l 85 Risultati di uno studio collaborativo La Comunit europea ha organizzato uno studio collaborativo nel corso del quale dodici laboratori hanno analizzato quattro campioni di alimenti per volatili da cortile e per conigli in forma di farina o di granulare Ogni campione stato analizzato due volte I risultati dello studio figu rano nella seguente tabella 3 2 3 3 3 4 3 5 3 6 IT 3 8 3 8 1 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 100 Conigli Farina Granulare Farina media mg kg sr mg kg Cv Sr mg kg CVr Recupero sr deviazione standard della ripetibilit CV coefficiente di variazione della ripetibilit Sg deviazione standard della riproducibilit CVR coefficiente di variazione della riproducibilit F DETERMINAZIONE DEL DICLAZURIL 4 clorofenil 2 6 dicloro 4 2 3 4 5 tetraidro 3 5 diosso 1 2 4 triazina 2 il fenil acetonitrile Finalit e campo d applicazione Il metodo consente di determinare il contenuto di diclazuril negli ali menti per animali e nelle premiscele Il limite di rilevazione di 0 1 mg kg il limite di quantificazione di 0 5 mg kg Principio Dopo aggiunta di uno standard interno
141. e l acido bollendo si condensa sulle pareti del pallone Evitare che le pareti si surriscaldino e che particelle organiche vi aderiscano Quando la soluzione diventa limpida e di colore verde pallido prolun gare l ebollizione ancora per due ore Lasciare quindi raffreddare Distillazione Aggiungere con precauzione un quantitativo d acqua sufficiente a scio gliere completamente i solfati Lasciar raffreddare Aggiungere quindi se necessario qualche granulo di zinco 3 3 Procedere secondo il punto 5 2 1 0 5 2 2 Distillazione in acido solforico Introdurre nel matraccio collettore dell apparecchio di distillazione 25 ml misurati esattamente di acido solforico 3 5 o 3 7 a seconda del presunto contenuto di azoto e qualche goccia di indicatore al rosso di metile 3 8 S2 2 53 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 27 Collegare il pallone di mineralizzazione al refrigerante dell apparecchio di distillazione e immergere l estremit di quest ultimo per almeno 1 cm nel liquido del matraccio collettore cfr osservazione al punto 8 3 Versare lentamente nel pallone 100 ml di soluzione di idrossido di sodio 3 9 senza provocare una perdita di ammoniaca cfr osservazione al punto 8 1 Scaldare il pallone fino a distillazione completa dell ammo niaca Distillazione in acido borico Quando la titolazione del contenuto di ammoniaca del distillato rea lizzata manualmente si applica il metodo indicato di seguito Q
142. e madre standard di amminoacidi 3 16 1 c 2 5 pmol ml di ciascuno in acido cloridrico Reperibile in commercio Soluzione madre standard di acido cisteico e metionina sulfone c 1 25 umol ml Sciogliere 0 2115 g di acido cisteico 3 16 2 e 0 2265 g di metionina sulfone 3 16 3 in tampone citrato 3 24 in un matraccio tarato da 1 litro e portare a volume con tampone citrato Conservare a temperatura inferiore a 5 C al massimo per 12 mesi Questa soluzione non viene utilizzata se la soluzione madre standard 3 27 1 contiene acido cisteico e metionina sulfone Soluzione madre standard ad esempio norleucina c 20 umol ml Sciogliere 0 6560 g di norleucina 3 13 in tampone citrato 3 24 in un matraccio tarato e portare a 250 ml con tampone citrato Conservare a temperatura inferiore a 5 C al massimo per 6 mesi Soluzione di taratura degli amminoacidi standard da usarsi con idroliz zati c 5 nmol 50 ul di acido cisteico e metionina sulfone e c 10 nmol S0 pl di altri amminoacidi Sciogliere 2 2 g di cloruro di sodio 3 10 in un becher da 100 ml con 30 ml di tampone citrato 3 24 Aggiungere 4 00 ml di soluzione madre standard di amminoacidi 3 27 1 4 00 ml di soluzione madre standard di acido cisteico e metio nina sulfone 3 27 2 e se del caso 0 50 ml di soluzione madre standard dello standard interno 3 27 3 Portare il pH a 2 20 con idrossido di sodio 3 18 Trasferire quantitativamente in un matraccio tarato da
143. e per distillazione essiccare e proseguire come indicato al punto 5 1 ultimo capoverso Eliminare il solvente dal residuo d estrazione che si trova nel ditale macinare il residuo alla finezza di 1 mm porlo nuovamente nel ditale non aggiungere solfato di sodio e proseguire come indicato al punto 5 1 secondo e terzo capoverso Il contenuto di materie oleose e grasse gregge espresso in percentuale del campione dato dalla seguente formula 10m my x 5 dove mj peso in grammi del residuo della prima estrazione parte ali quota dell estratto m peso in grammi del residuo della seconda estrazione La quantit di sostanza sottoposta all analisi nel caso di prodotti poveri di materie oleose e grasse pu essere portata a 5 g Gli alimenti per animali da compagnia contenenti un elevato tenore d acqua possono rendere necessaria l aggiunta di solfato di sodio anidro prima dell idrolisi e dell estrazione secondo il procedimento B Nel procedimento descritto al punto 5 2 potrebbe rivelarsi pi efficace usare acqua calda invece che fredda per lavare il residuo dopo la filtrazione Per alcuni alimenti per animali il tempo di essiccazione 1 h 30 deve essere prolungato tuttavia evitato un tempo di essiccazione eccessivo che potrebbe dare scarsi risultati possibile usare altres un forno a microonde 8 6 322 3 3 3 4 35 3 6 IT 4 2 4 3 4 4 4 5 4 6 4 7 200
144. e simile a quella del campione e all analisi il lasalocid sodico o sostanze capaci di interferire non risultano presenti Prova di recupero Effettuare una prova di recupero analizzando il bianco addizionato di una quantit di lasalocid sodico analoga a quella presente nel campione Per ottenere una concentrazione di 100 mg kg trasferire 10 0 ml della soluzione madre di riserva 3 10 1 in una beuta da 250 ml e far eva porare la soluzione a circa 0 5 ml Aggiungere 50 g del bianco mesco lare il tutto e attendere per 10 minuti agitando pi volte prima di procedere all estrazione 5 2 Se non fosse disponibile un bianco di tipo simile a quello del campione cfr punto 5 1 1 la prova di recupero pu essere eseguita col metodo di addizione della sostanza di riferimento In questo caso un aliquota del campione da analizzare viene addizionata di una quantit nota di lasa locid sodico analoga a quella gi presente Quest aliquota viene analiz zata insieme a una del campione non addizionato e il recupero pu essere calcolato per differenza Estrazione Alimenti per animali In una beuta da 250 ml con tappo pesare con l approssimazione di 0 01 g da 5 a 10 g del campione Aggiungere con pipetta 100 0 ml di metanolo acidificato 3 8 Chiudere senza stringere e scuotere per disperdere Collocare la beuta in un bagno ultrasonico 4 1 a circa 522 STEP 5 3 1 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 108 40 C per 2
145. eattivi Acido cloridrico soluzione al 25 p p densit 1 126 g ml Acido cloridrico soluzione all 1 13 p v La concentrazione deve essere verificata per titolazione mediante una soluzione di idrossido di sodio 0 1 mol l in presenza di rosso di metile allo 0 1 p v in etanolo al 94 v v Per la neutralizzazione di 10 ml sono necessari 30 94 ml di NaOH 0 1 mol l Soluzione di Carrez I sciogliere in acqua 21 9 g di acetato di zinco Zn CH3C00 2H 0 e 3 g di acido acetico glaciale Portare a 100 ml con acqua Soluzione di Carrez II sciogliere nell acqua 10 6 g di ferrocianuro di potassio K4Fe CN g 3H30 Portare a 100 ml con acqua Etanolo soluzione al 40 v v densit 0 948 g ml a 20 C Apparecchiatura Erlenmeyer da 250 ml a cono normalizzato con collo smerigliato con refrigerante a ricadere Polarimetro o saccarimetro Procedimento Preparazione del campione Macinare il campione in modo che passi tutto attraverso un setaccio a maglie rotonde di 0 5 mm di diametro Determinazione del potere rotatorio totale P o S cfr osservazione 7 1 Pesare con l approssimazione di 1 mg 2 5 g del campione macinato e introdurli in un pallone tarato da 100 ml Aggiungere 25 ml di acido cloridrico 3 2 agitare per ottenere una buona ripartizione della sostanza e aggiungere altri 25 ml di acido cloridrico 3 2 Immergere il pallone in bagnomaria bollente agitando energicamente e regolarmente per i GU L 1
146. ela per 60 minuti con un agitatore o meccanico o miscelatore magnetico 4 8 Lasciar depositare il sedimento e pipettare 10 0 ml della soluzione surnatante in un becher da 100 ml Aggiungere 5 0 ml di soluzione di acido solfosalicilico 3 22 sempre agitando e continuare ad agitare con agitatore magnetico per 5 minuti Filtrare o centrifugare il surnatante per rimuovere eventuali precipitati Introdurre 10 0 ml della soluzione risultante in un becher da 100 ml e portare il pH a 2 20 con una soluzione di idrossido di sodio 3 18 trasferire in un matraccio tarato di volume appropriato utilizzando tam pone citrato 3 24 e portare a volume con la soluzione tampone 3 24 Se si usa uno standard interno aggiungere 1 00 ml di standard interno 3 27 3 ogni 100 ml di soluzione finale e portare a volume con la soluzione tampone 3 24 Procedere alla fase della cromatografia secondo quanto indicato al punto 5 4 Se gli estratti non vengono cromatografati lo stesso giorno conservarli a temperatura inferiore a 5 C Determinazione degli amminoacidi totali Ossidazione Pesare con l approssimazione di 0 2 mg da 0 1 a 1 g del campione preparato 5 1 in un pallone a fondo arrotondato da 100 ml 4 1 per l idrolisi in sistema aperto 5 3 2 3 o 5 3 2 pie PA 5 3 2 2 332 3 5 3 2 4 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 38 un pallone a fondo arrotondato da 250 ml 4 1 se richiesta una bassa concentraz
147. ela per almeno 15 secondi e lavare accuratamente la superficie interna del decantatore con almeno 10 ml di tetraclo roetilene pulito per rimuovere le particelle aderenti alle pareti Lasciare riposare la miscela per 3 minuti quindi agitare nuova mente per 15 secondi e lavare accuratamente la superficie interna del decantatore con almeno 10 ml di tetracloroetilene pulito per rimuovere le particelle aderenti alle pareti Lasciare riposare la miscela cos ottenuta per almeno 5 minuti quindi rimuovere ed eliminare la frazione liquida travasandola accuratamente facendo attenzione a non perdere nulla del sedimento 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 137 vm Lasciar seccare il sedimento e poi procedere alla sua pesatura precisione 0 001 g Se il sedimento costituito per pi del 5 da particelle gt 0 50 mm setacciare a 0 25 mm e procedere all esame delle due frazioni risultanti 21 33 39 Estrazione e preparazione del flottato dopo il recupero del sedi mento con il metodo sopra descritto devono rimanere nell imbuto separatore due fasi una fase liquida costituita dal tetracloroetilene e una fase solida costituita dal materiale flottante Recuperare la fase solida flottato facendo defluire completamente dall imbuto il tetracloroetilene aprendo il rubinetto Rovesciando l imbuto sepa ratore trasferire il flotatto in una grande piastra Petri e farlo essic care ad aria in una cappa aspirante Se il flottato
148. ella TCDD i valori agli estremi inferiore e superiore della curva presenteranno una forte variazione coefficiente di variazione CV elevato Il working range costituito dalla zona in cui il CV inferiore al 15 L estremo inferiore del working range limite di reporting deve inoltre essere fissato al di sopra dei bianchi di pro cedura almeno di un fattore tre L estremo superiore del working range di norma rappresentato dal valore EC 70 della concen trazione effettiva massima ma pi basso se il CV superiore al 15 in questo range Il working range stabilito durante la vali dazione I valori di cut off 8 3 devono situarsi entro il working range Le soluzioni standard e gli estratti dei campioni sono testati almeno in doppio Nel caso di uso di doppi una soluzione standard o un estratto di controllo testati in 4 6 pozzetti distribuiti sulla piastra producono una risposta o una concentrazione possibile solo nel working range in base a un CV lt 15 8 1 2 Calibrazione 8 1 2 1 Calibrazione con curva standard I livelli nei campioni sono stimati comparando la risposta al test a una curva di calibrazione della TCDD o del PCB 126 o di una miscela standard PCDD PCDF PCB diossina simili per calcolare il livello BEQ nell estratto e poi nel campione Le curve di calibrazione contengono da 8 a 12 concentrazioni al meno in doppio con concentrazioni sufficienti nella parte inferiore della curva
149. elle di sali minerali Almeno un formellato o una mattonella da campionare per partita di 25 unit per un massimo di quattro formellati o mattonelle Per i formellati o le mattonelle di peso unitario non superiore a 1 kg il campione elementare costituito dal contenuto di un formellato o di una mattonella 5 1 5 Foraggi grossolani foraggio Numero minimo di campioni elementa ri Dimensioni della partita campionata lt 5 tonnellate y di 5 volte il numero di tonnellate che costituiscono la partita campio nata fino a un massimo di 40 campioni elementari gt 5 tonnellate Si riconosce che in determinate situazioni ad esempio nel caso degli insilati non possibile prelevare i necessari campioni elementari senza provocare danni inaccettabili al lotto In tali situazioni pu essere applicato un metodo di campionamento alternativo Prima dell entrata in vigore del presente rego lamento sar approntata una guida per il campionamento di questo tipo di lotti Se il risultato un numero decimale si arrotonda al numero intero superiore 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 10 vm3 52 Requisiti quantitativi concernenti i campioni elementari per il con trollo di costituenti o sostanze presumibilmente distribuiti negli ali menti per animali in maniera non uniforme Questi requisiti quantitativi concernenti i campioni elementari si appli cano nei casi seguenti controllo delle
150. ere una prova in bianco positiva spesso necessario un trattamento con una piccola quantit di alcali Nota L aggiunta di circa 3 4 ml di NaOH 3 11 a 1 litro di soluzione di acido borico a 10 g l d in genere buoni risultati Conservare la soluzione a temperatura ambiente e proteggerla dalla luce e da sorgenti di fami di ammoniaca Acido cloridrico soluzione volumetrica standard c HC1 0 10 mol l Nota Si possono utilizzare altre concentrazioni di soluzioni volumetri che 3 5 3 6 3 7 3 10 3 11 e 3 19 a condizione di apportare le necessarie correzioni nei calcoli Le concentrazioni sono espresse sempre in cifre a quattro decimali Apparecchiatura Apparecchi per mineralizzazione distillazione e titolazione secondo il metodo di Kjeldahl Procedimento Mineralizzazione Pesare con l approssimazione di 1 mg 1 g del campione e introdurlo nel pallone dell apparecchio di mineralizzazione Aggiungere 15 g di solfato di potassio 3 1 una quantit appropriata di catalizzatore 3 2 da 0 3 g a 0 4 g di ossido rameico oppure da 0 9 g a 1 2 g di solfato di rame II pentaidrato 25 ml di acido solforico 3 4 e se necessario frammenti di pietra pomice 3 12 Mescolare Riscaldare il pallone prima moderatamente agitando di tanto in tanto se necessario fino a carbonizzazione della massa e a scomparsa della schiuma quindi scaldare pi intensamente sino a ebollizione regolare del liquido Il riscaldamento adeguato s
151. erimento per quanto riguarda la riproducibilit in laboratorio I bianchi di procedura sono controllati in modo da evitare risultati falsi conformi quando sono sottratti 8 4 7 I risultati delle analisi GC HRMS dei campioni sospetti e del 2 10 dei campioni conformi minimo di 20 campioni per matrice sono raccolti e utilizzati per valutare la performance del metodo di screening e il rap porto tra BEQ e TEQ Questa base di dati pu essere utilizzata per la ri valutazione dei valori di cut off applicabili ai campioni di routine per le matrici validate 8 4 8 La buona performance del metodo pu essere dimostrata anche con la partecipazione a ring trial Anche i risultati dei campioni analizzati in ring trial che coprano un range di concentrazione fino a per esempio due volte il limite massimo possono essere inclusi nella valutazione del tasso di falsi conformi se il laboratorio in grado di dimostrare la sua buona performance I campioni coprono i pattern di congeneri pi fre quenti rappresentanti varie fonti 8 4 9 Durante gli incidenti i valori di cut off possono essere ri valutati te nendo conto della matrice e dei pattern di congeneri specifici del singolo incidente 9 Reporting dei risultati 9 1 Metodi di conferma 9 1 1 Se la procedura analitica impiegata lo consente i risultati dell analisi contengono i livelli dei singoli congeneri di PCDD PCDF e PCB dios sina simili e sono espressi come lowerbound upperbound e
152. erla in pochi ml di acido fluori drico 3 4 ed evaporare a secco Aggiungere 5 gocce di acido solforico 3 5 e riscaldare fino a scomparsa dei fumi bianchi Addizionare 5 ml di acido cloridrico 6 mol l 3 2 e 30 ml circa d acqua riscaldare filtrare la soluzione in un matraccio tarato da 250 ml e portare a volume con acqua la concentrazione dell acido cloridrico di 0 5 mol l circa Procedere quindi nella determinazione a partire dal punto 5 1 3 S 1 1 2 9 12 5 1 2 1 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 88 Umettare le ceneri con acqua e trasferirle in un becher da 250 ml Lavare bene il crogiolo con complessivi 5 ml circa di acido cloridrico 3 1 e travasare lentamente e accuratamente quest ultimo nel becher si pu avere una reazione violenta per formazione di CO2 Aggiungere goccia a goccia dell acido cloridrico 3 1 agitando finch l efferve scenza sia terminata Evaporare a secco agitando ogni tanto con un bacchetta di vetro Aggiungere al residuo 15 ml di acido cloridrico 6 mol l 3 2 e succes sivamente circa 120 ml d acqua Rimescolare con la bacchetta di vetro che va lasciata nel becher e coprire quest ultimo con un vetro di oro logio Portare il liquido a leggera ebollizione e mantenerla finch non si vedono pi dissolversi le ceneri Filtrare su carta filtro senza ceneri e raccogliere il filtrato in un matraccio tarato da 250 ml Lavare il becher e il filtro prima con 5 ml di acido cloridrico 6 mol
153. ervazioni Per i campioni con debole concentrazione di vitamina E pu essere utile combinare gli estratti di etere di petrolio delle due saponificazioni quan tit pesata 25 g con una soluzione del campione per la determinazione HPLC Il peso del campione prelevato per l analisi non contiene pi di 2 g di sostanze grasse Se non ha luogo la separazione di fase aggiungere circa 10 ml di etanolo 3 1 affinch l emulsione si rompa 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 84 7 4 Dopo la misurazione spettrofotometrica dell acetato di DL a tocoferolo o della soluzione di DL a tocoferolo secondo il punto 5 6 1 3 o rispetti vamente 5 6 2 3 aggiungere circa 10 mg di BHT 3 12 alla soluzione 3 10 1 o 3 10 2 e conservare questa soluzione in frigorifero tempo massimo di conservazione 4 settimane T3 In sostituzione del BHT si pu utilizzare idrochinone 7 6 Utilizzando una colonna a fase normale possibile separare i tocoferoli a P y e TT La soluzione di ascorbato di sodio pu essere sostituita da circa 150 mg di acido ascorbico 7 8 La soluzione di solfuro di sodio pu essere sostituita da circa 50 mg di EDTA 7 9 L acetato di vitamina E viene idrolizzato molto velocemente in condi zioni alcaline ed pertanto molto sensibile all ossidazione in particolare in presenza di oligoelementi quali il ferro e il rame Nel caso della determinazione della vitamina E nelle premiscele a livelli superiori a
154. essere di tipo manuale semiautomatico o automa tico Se l apparecchio richiede un travasamento tra mineralizzazione e distillazione il travasamento deve essere effettuato senza perdite Se il pallone dell apparecchio di distillazione non provvisto di un imbuto separatore aggiungere la soluzione d idrossido di sodio immediatamente prima di collegare il pallone al refrigerante lasciando colare lentamente il liquido lungo le pareti Se il prodotto mineralizzato si solidifica ricominciare la determinazione usando un quantitativo di acido solforico 3 4 superiore a quello indi cato sopra Per i prodotti poveri di sostanze azotate il volume di acido solforico 3 7 da introdurre nel matraccio collettore pu essere ridotto se neces sario a 10 o 15 ml e portato a 25 ml con acqua Per analisi ordinarie possono essere applicati metodi alternativi per de terminare le proteine gregge ma il metodo di Kjeldahl descritto in questa parte C costituisce il metodo di riferimento L equivalenza tra i risultati ottenuti con il metodo alternativo ad esempio il metodo Du mas e quelli del metodo di riferimento va dimostrata per ciascuna matrice singolarmente Dato che i risultati ottenuti con un metodo di verso anche dopo verifica dell equivalenza possono deviare leggermente da quelli ottenuti con il metodo di riferimento necessario indicare nella relazione di analisi il metodo utilizzato per la determinazione delle proteine gregge D DETE
155. etta con foglio di alluminio e di ossigeno eliminato con un getto di azoto Durante l estra zione l aria al di sopra del liquido sostituita con azoto evitare una pressione eccessiva alzando ogni tanto il tappo Preparazione del campione Frantumare il campione affinch passi attraverso un vaglio da 1 mm evitando la produzione di calore La frantumazione deve essere effettuata immediatamente prima della pesatura e della saponificazione altrimenti si possono verificare perdite di vitamina E Saponificazione A seconda del contenuto di vitamina E pesare con l approssimazione di 0 01 g da 2 g a 25 g di campione in un matraccio da 500 ml a fondo piatto o conico 4 2 1 Aggiungere successivamente sempre rimestando 130 ml di etanolo 3 1 circa 100 mg di BHT 3 13 2 ml di soluzione di ascorbato di sodio 3 5 e 2 ml di soluzione di solfuro di sodio 3 6 Adattare un refrigerante 4 3 al matraccio e immergere quest ultimo in un bagno d acqua con agitatore magnetico 4 7 Portare a ebollizione e lasciare rifluire per 5 minuti Aggiungere 25 ml di soluzione di idrossido di potassio 3 4 attraverso il refrigerante 4 3 e lasciare rifluire per altri 25 minuti sempre agitando sotto una debole corrente di azoto Risciac quare il refrigerante con circa 20 ml di acqua e lasciare raffreddare il contenuto del matraccio a temperatura ambiente 5 3 5 4 IN 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 81 Estrazione Tras
156. ferire quantitativamente per decantazione la soluzione di saponifica zione risciacquando con un volume totale di 250 ml di acqua in un imbuto separatore da 1 000 ml 4 2 3 o nel dispositivo di estrazione 4 8 Risciacquare successivamente il matraccio di saponificazione con 25 ml di etanolo 3 1 e 100 ml di etere di petrolio 3 2 e trasferire il liquido di lavaggio nell imbuto separatore o nel dispositivo di estrazione Il rapporto di acqua ed etanolo nelle soluzioni combinate deve essere di circa 2 1 Agitare energicamente per 2 minuti e lasciare riposare per 2 minuti Estrazione con imbuto separatore 4 2 3 Quando gli strati sono separati cfr osservazione al punto 7 3 trasferire lo strato di etere di petrolio in un altro separatore 4 2 3 Ripetere questa estrazione due volte con 100 ml di etere di petrolio 3 2 poi ancora due volte con 50 ml di etere di petrolio 3 2 Lavare due volte gli estratti combinati nell imbuto separatore rimestando delicatamente per evitare la formazione di emulsioni con volumi di 100 ml di acqua e quindi agitando ripetutamente con altri volumi di 100 ml di acqua finch l acqua risulti incolore con l aggiunta di solu zione di fenolftaleina 3 7 in genere sono sufficienti quattro successivi lavaggi Filtrare l estratto lavato attraverso un filtro asciutto per separa zione di fase 4 4 per rimuovere eventuale acqua residua e trasferire in un matraccio tarato da 500 ml 4 2 2 Risciacquare l imbuto se
157. flusso del tampone e del reattivo di ninidrina garantito da pompe il cui grado di stabilit di portata 0 5 nell in tervallo tra l analisi della soluzione di taratura e l analisi del campione Con alcuni analizzatori di amminoacidi si possono utilizzare metodi di idrolisi in cui l idrolizzato presenta una concentrazione di sodio di c 0 8 mol l e contiene tutto l acido formico residuo dalla fase di ossidazione Altri apparecchi non consentono una separazione soddisfa cente di certi amminoacidi se l idrolizzato contiene troppo acido formico e o presenta elevate concentrazioni di ioni sodio In questo caso il vo lume dell acido ridotto a circa ml mediante evaporazione dopo l idrolisi e prima della regolazione del pH L evaporazione eseguita sotto vuoto a temperatura non superiore a 40 C Procedimento Preparazione del campione Il campione viene triturato in modo che possa passare attraverso un vaglio da 0 5 mm I campioni molto umidi devono essere essiccati all aria ad una temperatura non superiore a 50 C o liofilizzati prima di essere triturati I campioni ad alto tenore di grassi sono estratti con etere di petrolio 3 12 prima di essere triturati Determinazione degli amminoacidi liberi negli alimenti per animali e nelle premiscele Pesare con l approssimazione di 0 2 mg una quantit appropriata 1 5 g del campione preparato 5 1 in una beuta e aggiungere 100 0 ml di miscela di estrazione 3 2 1 Agitare la misc
158. ggiungere 50 g del bianco mescolare il tutto e attendere 10 minuti agitando pi volte prima di procedere al l estrazione 5 2 Nota Ai fini del presente metodo il bianco ha una composizione simile a quella del campione e all analisi l olaquindox non deve risultare presente Estrazione Pesare con l approssimazione di 0 01 g 50 g circa del campione Tra sferire in una beuta da 1 000 ml aggiungere 100 ml di metanolo 3 1 e immergere per 5 minuti la beuta in un bagno ultrasonico 4 1 Aggiun gere 410 ml di acqua e lasciare nel bagno ultrasonico per altri 15 minuti Togliere la beuta dal bagno agitare per 30 minuti mediante l agitatore 4 2 e filtrare attraverso un filtro a pieghe Trasferire 10 0 ml del filtrato in un matraccio tarato da 20 ml portare a volume con acqua e agitare Filtrare un aliquota attraverso un filtro a membrana 4 4 cfr osserva zione al punto 9 Procedere alla determinazione HPLC 5 3 Determinazione HPLC Parametri Le seguenti condizioni vengono proposte a titolo indicativo possibile operare in condizioni diverse purch si ottengano risultati equivalenti Colonna analitica 4 3 1 Fase mobile 3 4 miscela acqua 3 3 metanolo 3 2 900 100 v v Velocit di efflusso 1 5 2 ml min Lunghezza d onda di rivelazio 380 nm ne Volume di iniezione 20 pl 100 ul Verificare la stabilit del sistema cromatografico iniettando pi volte la soluzione di taratura 3 5 3 contenent
159. gine organica per alimenti per animali ed alla maggior parte degli alimenti composti Metodo B applicabile ai composti e alle miscele minerali oltre che agli alimenti composti il cui contenuto di sostanze insolubili in acido clori drico determinato secondo il metodo A superiore all l1 Principio Metodo A il campione incenerito e le ceneri sono trattate all ebolli zione con acido cloridrico e il residuo insolubile filtrato e pesato Metodo B il campione trattato con acido cloridrico La soluzione filtrata il residuo incenerito e le ceneri ottenute vengono trattate come nel metodo A Reattivi Acido cloridrico 3 mol l Acido tricloroacetico soluzione al 20 p v Acido tricloroacetico soluzione all 1 p v Apparecchiatura Piastra riscaldante Forno elettrico a muffola dotato di termostato Crogioli da incenerimento in quarzo porcellana o platino rettangolari 60 x 40 x 25 mm o circolari diametro di 60 75 mm altezza da 20 a 40 mm Procedimento Metodo A Incenerire la sostanza da analizzare secondo il procedimento previsto per la determinazione delle ceneri grezze Possono essere utilizzate anche le ceneri ottenute in tale determinazione Trasferire le ceneri in un becher da 250 400 ml con 75 ml d acido cloridrico 3 1 Portare lentamente a ebollizione e lasciare bollire adagio per 15 minuti Filtrare la soluzione calda su filtro di carta senza ceneri e lavare il residuo con acqua ca
160. gli idrolizzati del campione ossidato ma calcolata come metionina utilizzando il peso molecolare della metionina 149 21 g mol 6 1 Tel 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 41 La metionina libera aggiunta viene determinata dopo estrazione sotto forma di metionina per il calcolo si usa lo stesso valore M Il volume della diluizione totale degli estratti F per la determinazione degli amminoacidi liberi 5 2 calcolato come segue F 100 ml x 10 ml 5 ml T V 10 ml 10 V volume dell estratto finale Valutazione del metodo Il metodo stato testato nel 1990 nel corso di un confronto internazio nale tra laboratori sulla base di quattro diversi alimenti per animali alimento composto per suini alimento composto per polli da ingrasso concentrato proteico premiscela Le medie e le deviazioni standard ottenute dopo l eliminazione dei risultati anomali figurano nelle seguenti tabelle Medie in g kg Amminoacido Materiale di riferi mento Treonina Cist e ina Metionina Lisina Alimento com 9 55 posto per suini n 13 Alimento com 13 93 posto per polli n 16 da ingrasso Concentrato pro 47 74 teico n 15 Premiscela 98 03 n 16 n numero di laboratori partecipanti Ripetibilit La ripetibilit espressa come deviazione standard entro il laboratorio del confronto tra laboratori presentata nelle seguenti tabelle Deviazione standard entro il laboratorio S in g
161. he per il mais il campione globale deve essere pari ad almeno 10 5 kg e per la soia a 7 kg Per altri semi e grani come orzo miglio avena riso segale frumento e colza il campione globale di 4 kg corrisponde a pi di 35 000 semi Nel caso degli alimenti confezionati possibile che le dimensioni delle singole unit non consentano di prelevare 4 kg per il campione globale Qualora si tratti di foraggio grossolano o foraggio a basso peso specifico ad esempio fieno o paglia il campione globale deve essere di almeno 1 kg ra REQUISITI QUANTITATIVI RIGUARDANTI I CAMPIONI FINALI Campioni finali E richiesta l analisi di almeno un campione finale L entit del campione finale destinato all analisi deve essere non inferiore ai seguenti quanti tativi Alimenti solidi 500 g Alimenti liquidi o semiliquidi 500 ml Conformemente alle disposizioni del regolamento UE n 619 2011 il cam pione finale per la verifica della presenza di materiale geneticamente modi ficato deve contenere almeno 10 000 semi grani Ci significa che per il mais il campione finale deve essere pari ad almeno 3 000 g e per la soia a 2 000 g Per altri semi e grani come orzo miglio avena riso segale frumento e colza il campione finale di 500 g corrisponde a pi di 10 000 Se le dimensioni del campione globale sono considerevolmente inferiori a 4 kg o litri cfr note al punto 6 si pu prelevare anche una qua
162. i I risultati sono valutati in base ai seguenti criteri a la lunghezza d onda di assorbimento massimo degli spettri del cam pione e dello standard registrata all apice del picco sul cromatogram ma deve essere la stessa entro un margine determinato dal potere di risoluzione del sistema di rivelazione Per la rivelazione a serie di diodi tale margine in generale di 2 nm circa b n tra 225 e 300 nm gli spettri del campione e dello standard registrati all apice del picco sul cromatogramma non devono essere diversi per le parti dello spettro situate fra il 10 e il 100 dell assorbanza relativa Questo criterio soddisfatto quando sono presenti gli stessi valori massimi e quando in tutti i punti osservati lo scarto tra gli spettri non supera il 15 dell assorbanza dell analita standard c tra 250 e 400 nm gli spettri relativi all estratto del campione regi strati nel tratto ascendente all apice e nel tratto discendente del picco cromatografico non devono differire tra loro per le parti dello spettro situate fra il 10 e il 100 dell assorbanza relativa Questo criterio soddisfatto quando sono presenti gli stessi valori massimi e quando in tutti i punti osservati lo scarto tra gli spettri non supera il 15 dell assorbanza dello spettro all apice del picco Se uno di questi criteri non soddisfatto la presenza dell analita non confermata Ripetibilit La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuat
163. i tore La conservazione e il trasporto devono avvenire in modo da preservare l integrit del campione di alimento per animali Se del caso macinare finemente e mescolare accuratamente ogni cam pione di laboratorio utilizzando un metodo che garantisca una completa omogeneizzazione ad esempio macinazione che consenta il passaggio attraverso un setaccio a maglie di 1 mm prima della macinazione i campioni devono essere asciugati qualora il tenore di umidit sia troppo elevato I metodi bioanalitici non sono specifici ai congeneri inclusi nel sistema TEF Nel l estratto del campione possono essere presenti altri composti strutturalmente affini Ahr attivi che contribuiscono alla risposta globale Pertanto i risultati bioanalitici non sono una stima ma piuttosto un indicazione del livello di TEQ nel campione 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 120 vmi 4 5 I reagenti la vetreria e le apparecchiature sono sottoposti a controlli per evitare che inflenzino i risultati espressi in TEQ o BEQ 4 6 E effettuata un analisi in bianco eseguendo l intera procedura analitica senza il campione 4 7 Per i metodi bioanalitici occorre verificare che la vetreria e i solventi utilizzati nell analisi siano esenti da composti che interferiscono con la rilevazione dei composti bersaglio nel working range La vetreria deve essere risciacquata con solventi o riscaldata a temperature che consen tano di eliminare dalla su
164. i tuendo i 50 ml di acido cloridrico 3 1 con 50 ml di acido tricloroace tico al 20 3 2 lavando il filtro mediante una soluzione calda di acido tricloroacetico all 1 3 3 O DETERMINAZIONE DEI CARBONATI Finalit e campo d applicazione Il metodo consente la determinazione dei carbonati convenzionalmente espressi in carbonato di calcio nella maggior parte degli alimenti per animali Tuttavia in alcuni casi ad esempio con il carbonato di ferro bisogna impiegare un metodo particolare Principio I carbonati sono decomposti in acido cloridrico l anidride carbonica liberata raccolta in un tubo tarato e il suo volume comparato a quello sprigionato nelle medesime condizioni da una quantit nota di carbo nato di calcio Reattivi Acido cloridrico densit 1 10 g ml Carbonato di calcio Acido solforico 0 05 mol litro circa colorato con rosso di metile Apparecchiatura Apparecchio di Scheibler Dietrich cfr schema o apparecchio equiva lente Procedimento Secondo il contenuto di carbonati del campione pesare una quantit di prodotto come indicato di seguito 0 5 g peri prodotti contenenti da 50 a 100 di carbonati espressi in carbonato di calcio 1 g per i prodotti contenenti da 40 a 50 di carbonati espressi in carbonato di calcio da 2 a 3 gin tutti gli altri casi Introdurre la quantit di sostanza da analizzare nello speciale recipiente 4 dell apparecchio provvisto di
165. i lasalocid sodico nella soluzione del campione 5 2 1 in ug ml Vj volume dell estratto del campione espresso in ml conformemente al punto 5 2 1 ossia 100 ml m peso della quantit di sostanza da analizzare in grammi Premiscele Il contenuto w di lasalocid sodico nel campione espresso in mg kg dato dalla seguente formula cx V2 xf __ mg kg dove c concentrazione di lasalocid sodico nella soluzione del campione 5 2 2 in ug ml V volume dell estratto del campione espresso in ml conformemente al punto 5 2 2 ossia 250 ml f fattore di diluizione conformemente al punto 5 2 2 m peso della quantit di sostanza da analizzare in grammi Convalida dei risultati Identit I metodi basati sulla spettrofluorimetria sono meno soggetti a interfe renza di quelli in cui si fa ricorso alla rivelazione UV L identit del l analita pu essere confermata mediante co cromatografia Co cromatografia Un estratto del campione 5 2 1 o 5 2 2 viene rinforzato mediante aggiunta di un quantitativo adeguato della soluzione di taratura 3 10 3 Il quantitativo di lasalocid sodico aggiunto deve essere analogo a quello di lasalocid sodico rilevato nell estratto del campione Deve aumentare soltanto l altezza del picco del lasalocid sodico tenuto conto della quan tit di lasalocid aggiunto e della diluizione dell estratto L ampiezza del picco a met altezza deve corrispondere con uno scartamento mas
166. i punti 5 1 e 5 2 riguardanti il numero di campioni elementari sono applicabili a partite di dimensioni mas sime di 500 tonnellate l una e campionabili in modo rappresentativo La procedura di campionamento descritta ugualmente valida per i quantitativi superiori alla dimensione massima della partita campio nata se non si tiene conto del numero massimo di campioni elemen tari indicato nelle tabelle che seguono in tal caso il numero di campioni elementari determinato dalla formula contenente la radice quadrata che figura nella parte corrispondente della procedura cfr punto 5 3 e la dimensione minima del campione globale aumentata in proporzione Ci non impedisce di suddividere un lotto grande in sottolotti pi piccoli e di sottoporre a campionamento ciascun sotto lotto seguendo la procedura descritta ai punti 5 1 e 5 2 La grandezza della partita da campionare deve essere tale da con sentire il prelievo di campioni in ogni sua parte Nel caso dei lotti o sottolotti molto grandi gt 500 tonnellate e dei lotti trasportati o immagazzinati in un modo che non rende possibile effettuare campionamenti seguendo la procedura di cui ai punti 5 1 e 5 2 del presente capitolo si adotta la procedura di campionamento indicata al punto 5 3 Qualora sia tenuto per legge a rispettare il presente regolamento nell ambito di un sistema di monitoraggio obbligatorio l operatore del settore dei mangimi pu discostarsi dai requisiti
167. i riferimento deviazione accettabile di 0 25 22 Separazione gascromatografica dei sei PCB indicatori PCB 28 PCB 52 PCB 101 PCB 138 PCB 153 e PCB 180 dalle sostanze interferenti specie PCB coeluenti in particolare se i livelli dei campioni si situano entro i limiti legali e la non conformit deve essere confermata 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 131 vmi I congeneri che spesso coeluiscono sono per esempio PCB 28 31 PCB 52 69 e PCB 138 163 164 Per la GC MS devono essere considerate anche le possibili interferenze di frammenti di congeneri pi altamente clorurati 2 3 Requisiti per le tecniche GC MS Monitoraggio di almeno a due ioni specifici per HRMS b due ioni specifici di m z gt 200 o tre ioni specifici di m z gt 100 per LRMS c 1 precursore e 2 ioni prodotti per MS MS Tolleranze massime ammesse per i rapporti di abbondanza per i fram menti di massa selezionati Deviazione relativa del rapporto di abbondanza dei frammenti di massa selezionati rispetto all abbondanza teorica o standard di calibrazione per lo ione bersaglio lo ione monitorato pi abbondante e gli ioni qualifi catori Intensit relativa degli ioni qualificatori rispetto allo ione bersaglio GC EI MS deviazione relativa GC CI MS GC MS deviazione relativa gt 50 10 20 da gt 20 a 50 15 25 da gt 10 a 20 20 30 lt 10 50 50 E
168. i umidit Apparecchiatura Mulino da laboratorio costruito in materiale non assorbente l umidit facile a pulirsi che permetta una macinazione rapida e uniforme senza provocare un sensibile riscaldamento eviti al massimo il contatto con l aria in ambiente esterno e risponda ai requisiti di cui ai punti 4 1 1 e 4 1 2 ad esempio micromacinatori a martelli o a raffreddamento ad acqua mulini a coni smontabili macinatori a movimento lento o a dischi dentati Bilancia analitica precisione 1 mg Recipienti asciutti di vetro o di metallo inossidabile provvisti di coper chi a chiusura ermetica superficie utile che permetta di ottenere una ripartizione della quantit di prodotto su cui si opera dell ordine di 0 3 g em Stufa isotermica 2 C a riscaldamento elettrico adeguatamente ventilata capace di assicurare una regolazione rapida della temperatu ra Stufa a vuoto a riscaldamento elettrico regolabile munita di pompa a olio e di un dispositivo per l introduzione di aria calda disidratata o di un agente disidratante ad esempio ossido di calcio Essiccatore a piastra in metallo o in porcellana spessa perforata con tenente un efficace disidratante Procedimento Nota Le operazioni descritte in questo capitolo debbono essere effet tuate immediatamente dopo l apertura degli imballaggi contenenti i campioni Le analisi vanno eseguite almeno due volte Per l essiccazione dei cereali nonch delle farine se
169. i una microburetta 4 3 Effettuare una prova in bianco applicando lo stesso procedimento in assenza del campione da analizzare 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 32 Calcolo dei risultati 1 ml di H SOy 0 01 mol l corrisponde a 0 34 mg di ammoniaca Esprimere il risultato in percentuale del campione Ripetibilit La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione non supera il 10 in valore relativo per i contenuti di ammoniaca inferiori a 1 0 lo 0 1 in valore assoluto per i contenuti di ammoniaca uguali o superiori all 1 0 Osservazione Se il contenuto di ammoniaca del campione superiore allo 0 6 diluire il filtrato iniziale CONWAY CELL Scale 1 1 E D d o n ka Dn 2 s 5 z 2 8 s 5 ka D D v v a amp Ra S N N dv d n N y t gt LI i I 1 1 1 I La li 1 fi 8 I n i Ni L bi id E 3 n oF Il 2 i t teic wu GI 2 S D o w 2 T O S o Q te D E o e v Schema della cella 141 00 89 345 dd 0 45 0 25 685 4 DI 32 3 3 3 4 3 5 3 6 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 33 II PER DISTILLAZIONE Finalit e campo d applicazione Il metodo consente di determinare il contenuto di basi azotate volatili espresse in ammoniaca delle farine di pesce non contenenti praticamen te urea Il met
170. i varie volte gli strumenti sono di agevole pulizia per evitare una contaminazione crociata 4 2 Strumenti raccomandati per il prelievo di campioni di alimenti solidi per animali 4 2 1 Campionamento manuale 4 2 1 1 Pala a fondo piatto e a bordi laterali verticali 4 2 1 2 Sonda a lungo setto o a partizioni Le dimensioni della sonda sono adeguate alle caratteristiche della partita campionata profondit del re cipiente misure del sacco ecc e alla dimensione delle particelle costi tuenti l alimento Se la sonda presenta diverse aperture per fare s che il campione sia prelevato in diversi punti lungo la sonda le aperture sono separate da compartimenti o scalate in sequenza 4 2 2 Campionamento meccanico Per il prelievo di campioni di alimenti in flusso possono essere utilizzati strumenti meccanici appropriati vale a dire che consentano di sottoporre a campionamento almeno l intera sezione del flusso Il campionamento dei mangimi in movimento a elevata velocit di flusso pu essere effettuato facendo uso di campionatori automatici 4 2 3 Divisori Se possibile e opportuno per preparare campioni ridotti rappresentativi possono essere utilizzati strumenti che servono a dividere i campioni in parti approssimativamente uguali vm3 5 5 1 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 8 REQUISITI QUANTITATIVI PER QUANTO RIGUARDA IL NU MERO DI CAMPIONI ELEMENTARI I requisiti quantitativi di cui a
171. ia 0 3431 x sostanze grasse gregge 0 1669 x amido 0 1301 x zuccheri totali espressi in saccarosio 2 Tolleranze applicabili ai valori dichiarati Se a seguito dei controlli ufficiali si constata una differenza in pi o in meno fra il risultato del controllo del valore energetico dell alimento e il valore energetico dichiarato applicata una tolleranza minima di 0 4 MJ kg di EM 3 Espressione dei risultati Previa applicazione della formula suindicata il risultato ottenuto approssi mato al primo decimale 4 Modalit di prelievo dei campioni e metodi di analisi Il prelievo del campione dell alimento composto e la determinazione dei tenori dei componenti analitici impiegati nel metodo di calcolo devono essere effettuati rispettivamente secondo i modi di campionamento e i metodi di analisi comunitari per il controllo ufficiale degli alimenti per animali Vanno applicati per la determinazione delle sostanze grasse gregge la procedura B del metodo per la determinazione delle sostanze grasse gregge di cui all al legato III parte H per la determinazione dell amido il metodo polarimetrico di cui all alle gato III parte L 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 146 ALLEGATO VII METODI DI ANALISI PER IL CONTROLLO DELLA PRESENZA ILLECITA NEGLI ALIMENTI PER ANIMALI DI ADDITIVI NON PI AUTORIZZATI Osservazioni importanti Possono essere applicati metodi di analisi pi se
172. iatura Bagnomaria con termostato regolato a 38 40 C Procedimento Pesare con l approssimazione di 1 mg 1 g del campione e introdurlo in un pallone tarato da 100 ml Aggiungere 25 30 ml d acqua Porre il pallone per 30 minuti in un bagnomaria bollente e lasciarlo poi raffred dare a circa 35 C Aggiungere 5 ml di sospensione di lievito 3 1 e mescolare Lasciar riposare il pallone per 2 ore in un bagnomaria a una temperatura di 38 40 C Raffreddare quindi sino a circa 20 C Aggiungere 2 5 ml di soluzione di Carrez I 3 2 e agitare per 30 secondi aggiungere poi 2 5 ml di soluzione di Carrez II 3 3 e agitare nuovamente per 30 secondi Portare a 100 ml con acqua mescolare e 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 59 filtrare Prelevare con la pipetta un quantitativo di filtrato non eccedente i 25 ml e contenente preferibilmente da 40 a 80 mg di lattosio porlo quindi in un erlenmeyer da 300 ml Se necessario portare a 25 ml con acqua Procedere nello stesso modo a una prova in bianco con 5 ml di sospen sione di lievito 3 1 Determinare il contenuto di lattosio secondo il metodo Luff Schoorl come segue aggiungere 25 ml esatti del reattivo di Luff Schoorl 3 4 e due granuli di pietra pomice 3 5 Riscaldare agitando a mano su una fiamma libera di media altezza e portare il liquido all ebollizione in circa 2 minuti Trasferire immediatamente l er lenmeyer su una tela metallica provvista di uno schermo d amianto m
173. icelle di pesci PESCI natura delle particelle animali ANIMALI TERRESTRI Numero di particelle di animali terresti campione dichiarato ripetizione dell analisi secondo il punto 2 1 4 3 ripetizione dell analisi secondo il punto 2 1 4 3 Setacciatura a maglie di 0 25 mm 3 vetrini da sedimento lt 0 25 mm 1 vetrino da flottato o materia prima lt 0 25 mi gt 5 particelle animali della stessa natura individuate NO 1 vetrino da sedimento gt 0 25 mm 5 particelle animali della stessa natura individuate 1 vetrino da flottato o materia prima gt 0 25mm particelle animali individuate NO secondo il punto 2 1 5 1 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 140 vm Diagramma 2 Protocollo di osservazione per l individuazione di particelle animali nelle farine di pesce 95 delle particelle lt 0 50 mm dopo la frantumazione del campione Setacciatura a maglie di 0 25 mm 3 vetrini 3 vetrini da da sedimento sedimento lt 0 25 mm 5 particelle di animal gt 5 particelle di terrestri individuate animali terrestri individuate campione dichiarato secondo il punto 2 1 5 3 per gli ANIMALI TERRESTRI 2 vetrini da sedimento gt 0 25 mm 2 vetrini da sedimento 3 5 particelle di animal Numero di particelle di animali gt 5 particelle di terrestri individuate terrestri animali terrestri individ
174. il campione viene estratto con metanolo acidificato Nel caso degli alimenti per animali una parte aliquota dell estratto viene purificata su una cartuccia Cjg per estrazione in fase solida Il diclazuril viene eluito dalla cartuccia con una miscela di metanolo acidificato e acqua Dopo evaporazione il residuo disciolto in una miscela DMF acqua Nelle premiscele l estratto viene evaporato e il residuo disciolto in una miscela DMF acqua Il contenuto di diclazuril determinato per cromatografia liquida ad alta prestazione HPLC a gradiente ternario e in fase inversa utilizzando un rivelatore UV Reattivi Acqua di qualit HPLC Acetato di ammonio Solfidrato di tetrabutilammonio TBHS Acetonitrile di qualit HPLC Metanolo di qualit HPLC N N dimetilformammide DMF Acido cloridrico pg 1 19 g ml Sostanza di riferimento standard diclazuril II 24 4 clorofenil 2 6 dicloro 4 2 3 4 5 tetraidro 3 5 diosso 1 2 4 triazina 2 il fenil aceto nitri le di purezza garantita E771 Soluzione madre standard di diclazuril 500 ug m 1 In un matraccio tarato da 50 ml pesare con l approssimazione di 0 1 mg 25 mg di diclazuril standard 3 8 Sciogliere in DMF 3 6 portare a volume con DMF 3 6 e mescolare Avvolgere il matraccio in un foglio d alluminio o impiegare un matraccio in vetro scuro e conservare in frigorifero A temperatura non superiore a 4 C la soluzione si mantiene stabile per un mese Granulare
175. il controllo della presenza di sostanze indesiderabili negli alimenti per animali e nell allegato VI Metodi di analisi per la determinazione dei costituenti di origine ani male nell ambito del controllo ufficiale degli alimenti per animali Articolo 4 Il valore energetico degli alimenti composti destinati al pollame cal colato conformemente al metodo descritto nell allegato VII Articolo 5 I metodi di analisi per il controllo della presenza illecita di additivi il cui uso non pi autorizzato negli alimenti per animali di cui all alle gato VIII sono applicati a fini di conferma Articolo 6 Le direttive 71 250 CEE 71 393 CEE 72 199 CEE 73 46 CEE 76 371 CEE 76 372 CEE 78 633 CEE 81 715 CEE 84 425 CEE 86 174 CEE 93 70 CEE 93 117 CE 98 64 CE 1999 27 CE 1999 76 CE 2000 45 CE 2002 70 CE e 2003 126 CE sono abrogate I riferimenti alle direttive abrogate s intendono fatti al presente regola mento e vanno letti secondo le tavole di concordanza che figurano nell allegato IX Articolo 7 Il presente regolamento entra in vigore il ventesimo giorno successivo alla pubblicazione nella Gazzetta ufficiale dell Unione europea Esso si applica a decorrere dal 26 agosto 2009 Il presente regolamento obbligatorio in tutti i suoi elementi e diretta mente applicabile in ciascuno degli Stati membri 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 6 vm3 ALLEGATO I METODI DI CAMPIONAMENTO l FINALIT E CAMPO DI AP
176. iltri a membrana da 0 45 um Filtri a membrana da 0 22 um Procedimento Nota L alofuginone in quanto base libera instabile in soluzioni alca line e di acetato di etile Non resta in acetato di etile per oltre 30 minuti Indicazioni generali Analizzare un alimento di riferimento bianco per accertare l assenza di alofuginone o di altre sostanze che possono interferire Eseguire una prova di recupero analizzando il bianco addizionato di una quantit di alofuginone analoga a quella presente nel campione Per ottenere una concentrazione di 3 mg kg aggiungere 300 pl della solu zione madre standard 3 6 1 a 10 g del bianco mescolare e attendere 10 minuti prima di procedere all estrazione 5 2 Nota Ai fini del presente metodo il bianco ha una composizione simile a quella del campione e all analisi l alofuginone non risulta pre sente Estrazione Pesare con l approssimazione di 0 1 g 10 g del campione preparato in una provetta da centrifuga da 200 ml aggiungere 0 5 g di ascorbato sodico 3 10 0 5 g di EDTA 3 13 e 20 ml di acqua e agitare Im mergere la provetta in bagnomaria 80 C per 5 minuti Dopo aver fatto raffreddare a temperatura ambiente aggiungere 20 ml di soluzione di carbonato di sodio 3 15 e agitare Aggiungere immediatamente 100 ml di acetato di etile 3 4 e agitare vigorosamente a mano per 15 secondi Introdurre quindi la provetta nel bagno ultrasonico 4 1 per 3 minuti e allentare il tappo Ce
177. in maniera appropriata entro una gamma di valori com presa tra pH 4 e pH 7 conformemente ai normali metodi di taratura del pH in laboratorio Il punto finale in pH della titolazione raggiunto a pH 4 6 che corrisponde al punto di inflessione o di flesso della curva di titolazione Prova in bianco Per confermare che i reattivi sono esenti da azoto effettuare una prova in bianco mineralizzazione distillazione e titolazione sostituendo il campione con 1 g di saccarosio 3 14 Calcolo dei risultati I calcoli sono effettuati conformemente ai punti 6 1 o 6 2 Calcolo per la titolazione conformemente al punto 5 3 1 Calcolare il tenore di proteine gregge espresso in percentuale di peso con la formula seguente Vo Vi x c x 0 014 x 100 x 6 25 m Vo volume ml di NaOH 3 10 o 3 11 usato nella prova in bianco V volume ml di NaOH 3 10 o 3 11 usato nella titolazione del campione concentrazione mol l dell idrossido di sodio 3 10 o 3 11 m peso g del campione e Calcolo per la titolazione conformemente al punto 5 3 2 Titolazione con acido cloridrico Calcolare il tenore di proteine gregge espresso in percentuale di peso con la formula seguente Vi Vo x cx 1 4 x 6 25 m dove m peso g della quantit di sostanza sottoposta all analisi c concentrazione mol l della soluzione volumetrica standard di acido cloridrico 3 19 Vo volume ml di acido cloridrico usa
178. interferire nella determi nazione del ferro del manganese e dello zinco Questa interferenza deve essere corretta aggiungendo soluzione di cloruro di lantanio 3 11 Tut tavia se nel campione il rapporto di peso Ca Mg P risulta gt 2 non necessario aggiungere soluzione di cloruro di lantanio 3 11 alla solu zione da analizzare e alle soluzioni di taratura D DETERMINAZIONE DELL ALOFUGINONE DL trans 7 bromo 6 cloro 3 3 3 idrossi 2 piperidil acetonil chinazolin 4 3H one bromidrato Finalit e campo d applicazione Il metodo consente di determinare il contenuto di alofuginone negli alimenti per animali Il limite di quantificazione di 1 mg kg Principio Dopo essere stato trattato con acqua calda l alofuginone estratto come base libera in acetato di etile e successivamente ripartito come cloridrato in soluzione acquosa acida L estratto purificato mediante cromatogra fia a scambio ionico Il tenore di alofuginone determinato mediante cromatografia liquida ad alta prestazione HPLC a fase inversa usando un rivelatore UV Reattivi Acetonitrile di qualit HPLC Resina amberlite XAD 2 Acetato di ammonio Acetato di etile Acido acetico glaciale 3 6 3 6 1 3 6 2 SIA 3 8 3 20 3 21 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 91 Alofuginone standard DL trans 7 bromo 6 cloro 3 3 3 idrossi 2 pipe ridil acetonil chinazolin 4 3H one bromidrato E 764 Soluzione madre di a
179. ioanalitici in generale Un metodo di screening in via di principio classifica un campione come conforme o sospetto non conforme Per questo il livello di BEQ calco lato comparato al valore di cut off cfr 8 3 I campioni al di sotto del valore di cut off sono dichiarati conformi i campioni uguali o superiori al valore di cut off sono dichiarati sospetti non conformi e devono essere analizzati con un metodo di conferma In pratica un livello di BEQ corrispondente a 2 3 del livello massimo pu servire come il valore di cut off pi idoneo a garantire un tasso di falsi conformi inferiore al 5 e un tasso accettabile di risultati falsi non conformi Con livelli massimi distinti per PCDD F e per la somma di PCDD F e PCB diossina simili il controllo della conformit dei campioni senza frazionamento richiede appropriati valori di cut off dei biodosaggi per i PCDD F Per il con trollo dei campioni che superano le soglie di intervento una percentuale appropriata del rispettivo livello di interesse pu fungere da valore di cut off Inoltre nel caso di alcuni metodi bioanalitici un livello indicativo espresso in BEQ pu essere dato per i campioni compresi nel working range e che superano il limite di reporting cfr 8 1 1 e 8 1 6 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 125 vmi 8 1 Valutazione della risposta al test 8 1 1 Prescrizioni generali Nel calcolo delle concentrazioni a partire da una curva di calibra zione d
180. ione Diversi metodi determinano una procedura di purificazione specifica In linea di massima possibile applicare procedure di purificazione diverse da quella indicata nel metodo a condizione che abbiano dimostrato di produrre risultati per la matrice analizzata equivalenti a quelli prodotti dalla procedura indicata nel metodo 3 Numero di determinazioni Qualora si analizzino sostanze indesiderabili se il risultato della prima determinazione risulta significativamente inferiore gt 50 al valore della specifica oggetto di controllo non necessario procedere a ulte riori determinazioni a condizione che si applichino le procedure appro priate in materia di qualit In altri casi necessaria una seconda analisi seconda determinazione per escludere la possibilit di una contamina zione crociata interna o di uno scambio accidentale dei campioni La media delle due determinazioni che tiene conto dell incertezza di misu ra utilizzata per verificare la conformit Se nel controllare il contenuto dichiarato di una sostanza o di un dato ingrediente il risultato della prima determinazione conferma il contenuto dichiarato ossia lo scarto tra il risultato dell analisi e il contenuto dichiarato rientra in un margine di variazione accettabile non neces sario ripetere la determinazione purch siano rispettate le opportune procedure di qualit In altri casi necessaria una seconda analisi se conda determina
181. ione di sodio o un flacone da 100 ml dotato di tappo a vite 4 2 per l idrolisi in sistema chiuso 5 3 2 4 La porzione di campione pesata deve avere un contenuto d azoto di circa 10 mg e un contenuto di umidit non superiore a 100 mg Introdurre il pallone o il flacone in un bagno di acqua e ghiaccio e raffreddare a 0 C aggiungere 5 ml di miscela di ossidazione 3 23 e miscelare con una spatola di vetro con un estremit ricurva Sigillare il pallone o flacone contenente la spatola con una pellicola impermeabile all aria introdurre il bagno di acqua e ghiaccio contenente il contenitore sigillato in un frigorifero a 0 C e lasciarvelo per 16 ore Dopo 16 ore togliere dal frigorifero e decomporre l eccesso di reagente di ossidazione mediante l aggiunta di 0 84 g di bisolfito di sodio 3 4 Procedere come indicato al punto 5 3 2 1 Idrolisi Idrolisi dei campioni ossidati Aggiungere al campione ossidato preparato conformemente al punto 5 3 1 25 ml di miscela di idrolisi 3 20 avendo cura di risciacquare eventuali residui di campione che aderiscono alle pareti del recipiente e alla spatola Procedere come indicato al punto 5 3 2 3 o 5 3 2 4 a seconda del me todo di idrolisi utilizzato Idrolisi dei campioni non ossidati Pesare in un pallone a fondo arrotondato da 100 ml o 250 ml 4 1 o in un flacone da 100 ml con tappo a vite 4 2 con l approssimazione di 0 2 mg una quantit da 0 1 a 1 g del campione preparato 5
182. ione si rompa Con olio di fegato di merluzzo ed altri grassi puri il tempo di saponi ficazione portato a 45 60 minuti In sostituzione del BHT si pu utilizzare idrochinone Utilizzando una colonna a fase normale possibile separare gli isomeri del retinolo In questo caso tuttavia a fini di calcolo vanno sommate le altezze aree dei picchi degli isomeri tutto trans e cis In sostituzione della soluzione di ascorbato di sodio si possono utilizzare circa 150 mg di acido ascorbico La soluzione di solfuro di sodio pu essere sostituita da circa 50 mg di EDTA In caso di analisi della vitamina A negli alimenti d allattamento va prestata particolare attenzione alla saponificazione 5 2 a causa della quantit di grasso presente nel campione potrebbe rivelarsi necessario aumentare la soluzione di idrossido di potassio 3 4 all estrazione 5 3 a causa della presenza di emulsioni potrebbe essere necessario adeguare il rapporto 2 1 acqua etanolo Per verificare se il metodo di analisi applicato consente di ottenere risultati affidabili relativi a questa matrice specifica alimenti d allatta mento effettuata una prova di recupero su un campione supplemen tare Se il tasso di recupero inferiore all 80 il risultato dell analisi va corretto per il fattore di recupero Ripetibilit La differenza fra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione non deve superare il
183. ione tipo A di gossipolo 3 5 Completare i volumi a 10 ml con il solvente A 3 2 Completare ogni serie con un pallone tarato da 25 ml contenente sol tanto 10 ml del solvente A 3 2 prova in bianco Portare a 25 ml il volume dei palloni della prima serie compreso quello per la prova in bianco con la miscela isopropanolo esano 3 1 serie di riferimento 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 114 Aggiungere 2 ml d anilina 3 4 in ciascuno dei palloni della seconda serie compreso quello per la prova in bianco Riscaldare per 30 minuti su bagno d acqua bollente per far sviluppare la colorazione Raffreddare a temperatura ambiente portare a volume con la miscela isopropanolo esano 3 1 mescolare e lasciar riposare per un ora serie tipo Determinare la densit ottica di ogni soluzione della serie tipo confron tandola con la soluzione corrispondente della serie di riferimento alle condizioni indicate al punto 5 2 Tracciare la curva di taratura portando in ordinata i valori di densit ottica e in ascissa le quantit corrispondenti di gossipolo in ug 6 2 2 Gossipolo totale Predisporre 6 palloni tarati da 50 ml Porre nel primo 10 ml del solvente B 3 3 e negli altri rispettivamente 2 0 4 0 6 0 8 0 e 10 0 ml della soluzione tipo B di gossipolo 3 6 Completare il contenuto di ogni pallone a 10 ml con il solvente B 3 3 Riscaldare per 30 minuti su bagno d acqua bollente Raffreddare a temperatura ambiente
184. ione viene estratto con una miscela acqua metanolo Il tenore di olaquindox determinato mediante cromatografia liquida ad alta presta zione HPLC a fase inversa utilizzando un rivelatore UV 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 150 Granulare 2 8 70 0 50 5 70 1 00 11 50 89 00 32 3 3 3 4 39 4 2 4 3 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 151 Reattivi Metanolo Metanolo di qualit HPLC Acqua di qualit HPLC Fase mobile per HPLC Miscela acqua 3 3 metanolo 3 2 900 100 v v Sostanza di riferimento standard olaquindox puro 2 N 2 idrossie til carbamoil 3 metilchinossalina N N4 biossido E 851 Soluzione madre standard di olaquindox 250 ug ml Pesare con l approssimazione di 0 1 mg 50 mg di olaquindox 3 5 in un matraccio tarato da 200 ml ed aggiungere circa 190 ml di acqua Immergere quindi il matraccio per 20 minuti in un bagno ultrasonico 4 1 Dopo il trattamento ultrasonico raffreddare la soluzione a tempe ratura ambiente portare a volume con acqua e mescolare Avvolgere il matraccio in un foglio di alluminio e conservare in frigorifero La solu zione va preparata di fresco ogni mese Soluzione standard intermedia di olaquindox 25 ug ml Travasare 10 0 ml di soluzione madre standard 3 5 1 in un matraccio tarato da 100 ml portare a volume con la fase mobile 3 4 ed agitare Avvolgere il matraccio in un foglio di alluminio e conservare in
185. irca 5 g e introdurlo con un grammo di carbone attivo in un matraccio tarato da 500 ml Aggiungere 400 ml di acqua a circa 20 C e 5 ml di soluzione di Carrez I 3 7 agitare per 30 secondi e aggiungere 5 ml di soluzione di Carrez II 3 8 Miscelare per 30 minuti nell agitatore rota tivo portare a volume mescolare e filtrare 5 2 72 7 3 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 70 Alimenti cotti panelli e farina di lino prodotti ricchi di farina di lino e altri prodotti ricchi di mucillaggini o di sostanze colloidali ad esempio amido destrinizzato Preparare la soluzione come indicato al punto 5 1 2 ma senza filtrare Dopo decantazione se necessario centrifugare prelevare 100 ml del liquido surnatante e introdurli in un pallone tarato da 200 ml Mescolare con acetone 3 6 e portare a volume con tale solvente miscelare e filtrare Titolazione Porre in un erlenmeyer con la pipetta da 25 a 100 ml del filtrato a seconda del contenuto presunto di cloro ottenuto secondo quanto indi cato ai punti 5 1 1 5 1 2 o 5 1 3 L aliquota non deve contenere pi di 150 mg di cloro C1 Diluire se necessario con acqua fino a ottenere una soluzione di 50 ml aggiungere 5 ml di acido nitrico 3 4 20 ml di soluzione satura di bis solfato di ammonio e ferro 3 3 e 2 gocce di soluzione di tiocianato di ammonio 3 1 proveniente dalla buretta riem pita a questo scopo fino al tratto zero Far gocciolare in seguito da una bu
186. isultati falsi non conformi o che possono diminuire la risposta causando risultati falsi conformi 6 3 Alta accuratezza esattezza e precisione recupero apparente del biodo saggio 6 3 1 Per i metodi GC MS la determinazione fornisce una stima valida della concentrazione vera in un campione necessaria un alta accuratezza per evitare che il risultato dell analisi di un campione sia respinto a causa della scarsa affidabilit del livello di TEQ determinato L accuratezza espressa come esattezza differenza tra il valore medio misurato per un analita in un materiale certificato e il suo valore certificato espressa in percentuale di tale valore e precisione deviazione standard relativa RSDp calcolata in base a risultati ottenuti in condizioni di riproducibi lit 6 3 2 Per i metodi bioanalitici determinato il recupero apparente del biodo saggio Il recupero apparente del biodosaggio il livello di BEQ calco lato a partire dalla curva di calibrazione della TCDD o del PCB 126 corretto del bianco e poi diviso per il livello TEQ determinato mediante GC HRMS Mira a correggere fattori quali la perdita di PCDD PCDF e composti diossina simili durante le fasi di estrazione e clean up compo sti coestratti che aumentano o diminuiscono la risposta effetti agonistici e antagonistici la qualit del fit della curva o le differenze tra i valori TEF fattore di equivalenza tossica e REP potenzialit relativa Il recupero app
187. ituarsi tra 325 nm e 327 nm Calcolo del contenuto di vitamina A UI di vitamina A ml E326 x 19 0 El per l acetato di vitamina A 1 530 a 326 nm in 2 propanolo cm Soluzione madre di palmitato di vitamina A Pipettare 2 0 ml della soluzione madre di palmitato di vitamina A 3 12 1 in un matraccio tarato da 50 ml 4 2 2 e portare a volume con 2 propanolo 3 8 La concentrazione nominale di questa soluzione di 56 UI di vitamina A ml Pipettare 3 0 ml di questa soluzione di palmitato di vitamina A diluita in un matraccio tarato da 25 ml e portare a volume con 2 propanolo 3 8 La concentrazione nominale di questa soluzione di 6 72 UI di vitamina A ml Misurare lo spettro UV di questa soluzione su 2 propanolo 3 8 nello spettrofotometro 4 6 tra 300 nm e 400 nm Il massimo di estinzione deve situarsi tra 325 nm e 327 nm Calcolo del contenuto di vitamina A UI di vitamina A ml E326 19 0 per il palmitato di vitamina A 957 a 326 nm in 2 propanolo 1 cm Soluzione standard di lavoro di vitamina A Pipettare 3 0 ml della soluzione standard di lavoro di vitamina A non diluita preparata secondo quanto indicato al punto 5 6 1 in un matrac cio tarato da 50 ml 4 2 2 e portare a volume con 2 propanolo 3 8 Pipettare 5 0 ml di questa soluzione in un matraccio tarato da 25 ml e portare a volume con 2 propanolo 3 8 La concentrazione nominale di questa soluzione di 6 72 UI di vitamina A ml Misurare lo
188. kg f Amminoacido Materiale di riferi mento Alimento com 0 13 0 10 0 11 0 26 posto per suini n 15 n 17 n 17 n 13 Alimento com 0 28 posto per polli n 16 da ingrasso Concentrato pro 0 99 teico n 15 Premiscela 2 06 n 16 n numero di laboratori partecipanti 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 42 Coefficiente di variabilit per la deviazione standard entro il laboratorio S Amminoacido Materiale di riferi mento Treonina Cist e ina Metionina Lisina Alimento com 2 8 posto per suini n 13 Alimento com 2 1 posto per polli n 16 da ingrasso Concentrato pro 2 4 teico n 15 Premiscela 2 1 n 16 n numero di laboratori partecipanti 1 2 Riproducibilit I risultati relativi alla deviazione standard tra laboratori ottenuti dal confronto tra laboratori figurano nelle seguenti tabelle Deviazione standard tra laboratori S in g kg R Lisi Amminoacido Materiale di riferi Treonina Cist e ina Metionina Lisina Alimento com 0 28 0 30 0 23 0 30 posto per suini n 15 n 17 n 17 n 13 Alimento com 0 75 posto per polli n 16 da ingrasso Concentrato pro 1 24 teico n 15 Premiscela 6 62 n 16 n numero di laboratori partecipanti Coefficiente di variabilit per la deviazione standard tra labo ratori S Amminoacido Materiale di riferi mento Treonina Cist e ina Metionina Lisina Alimento com 4 1 7 0 3 2 posto per suini n 13 Ali
189. l o too o D D 6 3 72 7 3 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 62 S potere rotatorio totale in gradi saccarimetrici S potere rotatorio in gradi saccarimetrici delle sostanze solubili nell etanolo al 40 v v N peso in g del saccarosio in 100 ml di acqua che d un potere rotatorio di 100 gradi saccarimetrici misurati con un tubo di 200 mm 16 29 g per i saccarimetri francesi 26 00 g per i saccarimetri tedeschi 20 00 g per i saccarimetri misti ON potere rotatorio specifico dell amido puro cfr 6 1 Ripetibilit La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione non deve superare lo 0 4 in valore assoluto per i contenuti di amido inferiori al 40 e l 1 in valore relativo per i contenuti di amido uguali o superiori al 40 Osservazioni Se il campione contiene pi del 6 di carbonati espressi in carbonato di calcio prima di determinare il potere rotatorio totale essi vanno di strutti per trattamento con l esatta quantit necessaria di acido solforico diluito Nel caso di prodotti ad alto contenuto di lattosio quali il siero di latte in polvere o il latte scremato in polvere dopo aver aggiunto 80 ml di etanolo 3 5 procedere come segue Applicare un refrigerante a ricadere sulla beuta e immergerla per 30 minuti in bagnomaria a 50 C Lasciare poi raffreddare e continuare l analisi come indicato al punto 5 3 Quando la determi
190. l 25 al 60 per i PCDD PCDF dal 50 al 130 i range valgono per la curva di calibrazione della TCDD Poich il contributo dei PCB diossina simili alla somma di PCDD PCDF e PCB diossina simili pu variare secondo le matrici e i campioni i recuperi apparenti del biodosaggio per la somma di PCDD PCDF e PCB diossina simili riflettono questi range e sono compresi tra il 30 e il 130 Ogni modifica sostanziale dei valori TEF per PCDD PCDF e PCB diossina simili nella legislazione dell Unione ri chiede la revisione di questi range 8 1 5 Controllo dei recuperi per il clean up La perdita di composti durante il clean up verificata durante la vali dazione Un campione bianco addizionato con una miscela dei diversi congeneri sottoposto a clean up almeno n 3 e il recupero e la variabilit sono verificati mediante analisi GC HRMS Il recupero compreso tra 60 e 120 in particolare per i congeneri che contribui scono per pi del 10 al livello TEQ in diverse miscele 8 1 6 Limite di reporting Per i livelli BEQ un limite di reporting determinato a partire dai corrispondenti campioni matrice implicanti pattern di congeneri tipici ma non dalla curva di calibrazione degli standard data la scarsa preci sione nel range inferiore della curva Occorre tenere conto degli effetti dell estrazione e del clean up Il limite di reporting fissato al di sopra dei bianchi di procedura almeno di un fattore tre 8 2 Uso di c
191. lda sino a scomparsa della reazione acida Essiccare il filtro contenente il residuo e incenerire in un crogiolo tarato a temperatura non inferiore a 550 C e non superiore a 700 C Raf freddare in un essiccatore e pesare Metodo B Pesare con l approssimazione di 1 mg 5 g di campione e introdurli in un becher da 250 a 400 ml Aggiungere successivamente 25 ml d acqua e 25 ml d acido cloridrico 3 1 agitare sino a cessazione dell efferve scenza Aggiungere altri 50 ml d acido cloridrico 3 1 Attendere la fine di nuova effervescenza e porre il becher in un bagno di acqua bollente e tenervelo per la durata di 30 minuti o pi se necessario al fine di 3 L 3 2 3 3 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 65 idrolizzare completamente l amido eventualmente presente Filtrare a caldo su un filtro senza ceneri e lavare il filtro mediante 50 ml di acqua calda cfr osservazione 7 Porre il filtro contenente il residuo in un crogiolo da incenerimento essiccare e incenerire a temperatura non in feriore a 550 C e non superiore a 700 C Trasferire infine le ceneri in un becher della capacit di 250 400 ml mediante 75 ml di acido clori drico 3 1 e continuare come descritto al punto 5 1 secondo capoverso Calcolo dei risultati Calcolare il peso del residuo deducendone la tara Esprimere il risultato in percentuale del campione Osservazione Se la filtrazione si rivela difficile ricominciare la determinazione sost
192. legato parte C 17 18 Direttiva 2002 70 CE Direttiva 2002 70 CE Articolo 1 Articolo 2 Articolo 3 Articolo 4 Articolo 5 Allegato I Allegato II Direttiva 2003 126 CE Direttiva 2003 126 CE Articolo 1 Articolo 2 Articolo 3 Articolo 4 Articolo 5 Articolo 6 Allegato 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 169 Il presente regolamento Articolo 1 Articoli 2 e 3 Allegato I e allegato V parte B 1 Allegato II e allegato V parte B II Il presente regolamento Articolo 3 Allegato VI
193. lettrico a muffola dotato di termostato Crogioli da incenerimento in quarzo porcellana o platino rettangolari 60 x 40 x 25 mm o circolari diametro di 60 75 mm altezza da 20 a 40 mm Procedimento Pesare con l approssimazione di 1 mg 5 g circa o 2 5 g per i prodotti aventi tendenza a rigonfiare del campione in un crogiolo per inceneri mento preventivamente riscaldato a 550 C raffreddato e tarato Porre il crogiolo sopra la piastra riscaldante e scaldare progressivamente fino a carbonizzazione della sostanza Incenerire conformemente ai punti 5 1 o 5 2 Introdurre quindi il crogiolo nel forno a muffola regolato a 550 C Mantenere a tale temperatura fino a ottenere ceneri di colore bianco grigio chiaro o rossastro apparentemente esenti da particelle carboniose Porre il crogiolo in un essiccatore lasciare raffreddare e pesare imme diatamente Introdurre il crogiolo nel forno a muffola regolato a 550 C Incenerire per 3 ore Porre il crogiolo in un essiccatore lasciare raffreddare e pesare immediatamente Incenerire nuovamente per 30 minuti onde as sicurarsi che il peso delle ceneri rimanga costante la perdita di peso tra due pesate consecutive deve essere pari o inferiore a 1 mg Calcolo dei risultati Calcolare il peso del residuo deducendone la tara Esprimere il risultato in percentuale del campione Osservazioni I prodotti di difficile incenerimento vanno sottoposti a un primo ince nerimento di almeno
194. livelli di PCDD F e di PCB diossina simili superiori ai livelli massimi o alle soglie d intervento eventual mente ricorrendo a un metodo di screening che permetta un alto throughput di campioni a costi commisurati all efficacia in modo 9 La doppia analisi necessaria per escludere la possibilit di una contaminazione interna C _ o di una mescolanza accidentale dei campioni La prima analisi tenendo conto dell in certezza di misura utilizzata per verificare la conformit Se l analisi effettuata nell ambito di un incidente di contaminazione la conferma mediante doppia analisi pu essere omessa nel caso in cui la tracciabilit permetta di stabilire il legame tra i campioni selezionati per l analisi e l incidente Le precisazioni e le prescrizioni relative alla doppia analisi per il controllo delle soglie di intervento sono identiche a quelle indicate alla nota per i livelli massimi vmi 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 118 da accrescere la possibilit di scoprire nuovi incidenti con alta espo sizione e rischi per la salute dei consumatori I metodi di screening possono comprendere metodi bioanalitici e metodi GC MS La loro applicazione ha lo scopo di evitare i risultati falsi conformi La concentrazione di PCDD F e la somma di PCDD F e PCB diossi na simili nei campioni con livelli significativi deve essere determi nata confermata mediante un metodo di conferma b la determinazi
195. lizzato Pesare con l approssimazione di 0 2 mg da 0 1 a 1 g del campione preparato 5 1 nel matraccio di polipropilene 4 4 La porzione di campione pesata ha un contenuto di azoto di circa 10 mg Aggiungere 8 4 g di idrossido di bario ottaidrato 3 4 e 10 ml di acqua Miscelare con un miscelatore Vortex 4 8 o con agitatore magnetico 4 7 La sciare il magnete rivestito di teflon nella miscela Sciacquare le pareti del recipiente con 4 ml di acqua Porre il coperchio a vite e chiudere il matraccio senza stringere Trasferire in una autoclave 4 6 con acqua bollente e vapore per 30 60 minuti Chiudere l autoclave e metterla in funzione a 110 2 C per 20 ore Prima di aprire l autoclave ridurre la temperatura poco al di sotto di 100 C Per evitare la cristallizzazione del Ba OH 8H30 aggiungere alla miscela calda 30 ml di acqua a temperatura ambiente Scuotere o agitare non violentemente Aggiungere 2 00 ml di soluzione concentrata di standard interno a metil triptofano 3 16 Lasciare raffreddare i recipienti in un bagno di acqua e ghiaccio per 15 minuti Aggiungere quindi 5 ml di acido orto fosforico 3 14 Tenere il reci piente nel bagno di refrigerazione e neutralizzare con HCI 3 11 sempre agitando regolare quindi il pH a 3 0 utilizzando HCI 3 12 Aggiungere una quantit sufficiente di metanolo per ottenere una concentrazione compresa tra 10 e 30 di metanolo nel volume finale Trasferire in un matraccio tar
196. lofuginone 100 ug ml In un matraccio tarato da 500 ml pesare con l approssimazione di 0 1 mg 50 mg di alofuginone 3 6 sciogliere in una soluzione tampone di acetato ammonico 3 18 portare a volume con la soluzione tampone e mescolare Questa soluzione stabile per tre settimane a 5 C se conservata al buio Soluzioni di taratura In una serie di palloni graduati da 100 ml trasferire 1 0 2 0 3 0 4 0 e 6 0 ml della soluzione madre standard 3 6 1 Portare a volume con la fase mobile 3 21 e agitare Queste soluzioni hanno concentrazioni rispettivamente di 1 0 2 0 3 0 4 0 e 6 0 ug ml di alofuginone Devono essere preparate al momento poco prima dell uso Acido cloridico P2 circa 1 16 g ml Metanolo Nitrato di argento Ascorbato di sodio Carbonato di sodio Cloruro di sodio EDTA acido etilendiamminotetracetico sale bisodico Acqua di qualit HPLC Soluzione di carbonato di sodio c 10 g 100 ml Soluzione di carbonato di sodio saturata con cloruro di sodio c 5 g 100 ml Sciogliere 50 g di carbonato di sodio 3 11 in acqua portare a 1 litro e aggiungere cloruro di sodio 3 12 fino a saturazione Acido cloridrico circa 0 1 mol l Diluire 10 ml di HCI 3 7 con acqua e portare a 1 litro Soluzione tampone di acetato di ammonio circa 0 25 mol l Sciogliere 19 3 g di acetato di ammonio 3 3 e 30 ml di acido acetico 3 5 in acqua 3 14 e portare a 1 litro Preparazione della resina amberlite XAD 2
197. lore calcolato considerando pari a zero il contributo di ogni congenere non quantificato al TEQ Mediumbound valore calcolato considerando pari alla met del limite di quantificazione il contributo di ogni congenere non quantificato al TEQ t lt d lt vmi 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 117 doppia analisi supera il livello massimo fissato dalla direttiva 2002 32 CE tenendo conto dell incertezza di misura 6 Pu tenersi conto dell incertezza di misura in uno dei seguenti modi calcolando l incertezza estesa per mezzo di un fattore di copertura 2 corrispondente ad un livello di fiducia del 95 circa Una partita o sottopartita non conforme se il valore misurato meno U supera il livello massimo Nel caso di una determinazione separata di PCDD PCDF e PCB diossina simili la somma dell incertezza estesa stimata dei risultati analitici separati di PCDD PCDF e PCB diossina simili deve essere utilizzata per la somma di PCDD PCDF e PCB diossina simili stabilendo il limite di decisione CCa come indicato al punto 3 1 2 5 dell allegato I della decisione 2002 657 CE Una partita o sottopartita non conforme se il valore misurato pari o superiore al CCa Le norme di interpretazione di cui sopra si applicano al risultato anali tico ottenuto sul campione utilizzato per il controllo ufficiale Per le analisi effettuate nel quadro di procedure di ricorso o di arbitrato val gono le n
198. ma di essere triturati I campioni ad alto tenore di grassi sono estratti con etere di petrolio 3 9 prima di essere triturati Determinazione del triptofano libero estratto In una beuta pesare con l approssimazione di 1 mg una quantit ade guata 1 5 g del campione preparato 5 1 aggiungere 100 0 ml di acido cloridrico 3 13 e 5 00 ml di soluzione concentrata di standard interno 3 16 Agitare o miscelare per 60 minuti con un agitatore meccanico o magnetico 4 7 Lasciare che si depositi il sedimento e pipettare 10 0 ml della soluzione surnatante in un becher Aggiungere 5 ml di acido orto fosforico 3 14 Portare il pH al valore 3 utilizzando idrossido di sodio 3 10 Aggiungere sufficiente metanolo 3 8 per ottenere una concen trazione compresa tra il 10 e il 30 di metanolo nel volume finale Trasferire in un matraccio tarato di volume adeguato e diluire con acqua sino al volume necessario per la cromatografia approssimativamente lo stesso volume della soluzione madre di taratura 3 17 Filtrare alcuni ml della soluzione con un filtro a membrana da 0 45 um 4 5 prima dell iniezione nella colonna HPLC Procedere alla fase della cromatografia secondo quanto indicato al punto 5 4 Proteggere la soluzione madre e gli estratti dalla luce solare diretta Se non possibile analizzare gli estratti nello stesso giorno questi devono essere conservati a 5 C al massimo per 3 giorni Determinazione del triptofano totale idro
199. mensioni gt 100 tonnellate Il mangime immagazzinato in siffatti sili non campionabile in modo statico Pertanto qualora si debba campionare il mangime che si trova all interno del silo e non vi sia possibilit di spostare la partita occorre accordarsi con l operatore affinch questi informi l ispettore su quando sar svuotato il silo di modo che il campionamento possa essere ese guito con il mangime in movimento 8 4 2 2 Sili non accessibili dall alto chiusi di dimensioni lt 100 tonnellate La procedura di campionamento prevede che si inserisca in un recipiente un quantitativo compreso fra 50 e 100 kg e che si prelevi da esso il campione Le dimensioni del campione globale corrispondono alla tota lit del lotto e il numero dei campioni elementari alla quantit tratta dal silo e immessa nel recipiente per il campionamento In caso di campio namento di una parte di un lotto di mangimi della stessa classe o con la medesima descrizione e se tale parte del lotto non risultata conforme ai requisiti UE si presume che i risultati valgano per tutto il mangime di tale lotto a meno che a seguito di un esame dettagliato non risulti prova alcuna della non conformit del resto del lotto ai requisiti UE 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 14 YM3 8 5 Campionamento di alimenti alla rinfusa in grandi contenitori chiusi Spesso tali lotti sono campionabili solo dopo essere stati scaricati In certi casi non
200. mento com 5 4 posto per polli n 16 Concentrato pro 3 0 teico n 15 Premiscela 6 7 n 16 n numero di laboratori partecipanti 92 9 3 3 2 3 3 3 4 3 5 3 6 3 7 3 8 3 9 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 43 Utilizzo di materiali di riferimento La corretta applicazione del metodo pu essere verificata ripetendo le misurazioni dei materiali di riferimento certificati se disponibili Si rac comanda di effettuare la taratura con una soluzione di taratura certificata di amminoacidi Osservazioni A causa delle differenze tra gli analizzatori di amminoacidi le concen trazioni finali delle soluzioni di taratura degli amminoacidi standard cfr punti 3 27 4 e 3 27 5 e dell idrolizzato cfr punto 5 3 4 sono conside rate valori indicativi Per tutti gli amminoacidi va verificato il range della risposta lineare dell apparecchiatura La soluzione standard diluita con tampone citrato per ottenere aree dei picchi al centro del range Se si fa uso di apparecchi per cromatografia liquida ad alta prestazione per analizzare gli idrolizzati le condizioni sperimentali devono essere ottimizzate conformemente alle raccomandazioni del fabbricante L applicazione del metodo agli alimenti per animali contenenti cloruro in misura superiore all l concentrato alimenti a base di minerali ali menti integrativi potrebbe comportare una sottostima della metionina va previsto pertanto un
201. mercurio Acido solforico 3 mol l Soluzione al 30 p v di ioduro di potassio Granuli di pietra pomice bolliti nell acido cloridrico lavati in acqua ed essiccati 3 metilbutano 1 olo Apparecchiatura Agitatore rotativo a capovolgimento circa 35 40 giri al minuto Procedimento Estrazione del campione Introdurre 2 5 g di sostanza pesata con l approssimazione di 1 mg in un pallone tarato da 250 ml Aggiungere 200 ml di etanolo 3 1 e far girare il pallone per un ora nell apparecchio rotativo Aggiungere 5 ml di so luzione di Carrez I 3 2 e agitare per circa 30 secondi Aggiungere quindi 5 ml di soluzione di Carrez II 3 3 e agitare nuovamente per un minuto Portare a volume con etanolo 3 1 omogeneizzare e filtrare Prelevare 200 ml del filtrato ed evaporare circa la met del volume allo scopo di eliminare la maggior parte di etanolo Trasferire quantitativa mente il residuo d evaporazione mediante acqua calda in un pallone tarato da 200 ml raffreddare portare a volume con acqua omogeneiz zare e filtrare se necessario Questa soluzione sar utilizzata per la determinazione degli zuccheri riduttori e dopo inversione per la deter minazione degli zuccheri totali Determinazione degli zuccheri riduttori Con una pipetta prelevare un volume di soluzione non superiore a 25 ml e contenente meno di 60 mg di zuccheri riduttori espressi in glucosio Se necessario portare a 25 ml con acqua distillata e determinare il
202. mi del recipiente con il suo contenuto dopo il riscaldamento I risultati inferiori allo 0 05 debbono recare la dicitura meno di 0 05 Ripetibilit La differenza tra i risultati di due determinazioni parallele effettuate sullo stesso campione non deve oltrepassare lo 0 05 in valore asso luto C DETERMINAZIONE DEL CONTENUTO DI PROTEINE GREGGE Finalit e campo d applicazione Il metodo consente di determinare il contenuto in proteine gregge degli alimenti per animali a partire dal contenuto di azoto dosato secondo il metodo di Kjeldahl Principio Il campione viene mineralizzato in acido solforico in presenza di un catalizzatore La soluzione acida alcalinizzata con una soluzione d idrossido di sodio L ammoniaca viene isolata per distillazione e rac colta in una quantit determinata di acido solforico il cui eccesso titolato con una soluzione standard d idrossido di sodio In alternativa l ammoniaca liberatasi viene distillata in un eccesso di soluzione di acido borico e successivamente titolata con una soluzione di acido cloridrico o acido solforico Reattivi Solfato di potassio Catalizzatore ossido rameico II CuO o solfato di rame II pentaidrato CuSO 5H O Zinco in granuli Acido solforico p20 1 84 g ml Acido solforico soluzione volumetrica standard c H 504 0 25 mol l Acido solforico soluzione volumetrica c H S04 0 10 mol l Acido solforico soluzione volumetrica stan
203. microscopio a partire dal sedimento e a scelta dell operatore dal flottato o dalla frazione di campione tal quale Se nel corso della preparazione del campione stata effet tuata una setacciatura preparare le due frazioni risultanti fine e grossolana Le porzioni di materiale da analizzare distribuite sui vetrini devono essere rappresentative dell intera frazione Preparare un numero di vetrini sufficiente perch possa essere realizzato un protocollo d esame completo come previsto al punto 2 1 4 2 Montare i vetrini per microscopio con il mezzo di montaggio adeguato secondo le procedure operative standard POS stabilite dall EURL AP e pubblicate sul suo sito web Dopo la distribuzione della frazione in esame sul vetrino portaoggetti deve essere posi zionato il vetrino coprioggetti 2 1 4 2 Protocolli di osservazione per l individuazione di particelle animali in mangimi composti e materie prime per mangimi I vetrini per microscopio preparati sono osservati seguendo i pro tocolli di osservazione indicati nel diagramma 1 mangimi compo sti e materie prime per mangimi diverse dalle farine di pesce e nel diagramma 2 farine di pesce pure Le osservazioni microscopiche sono effettuate utilizzando il micro scopio composto sul sedimento e a scelta dell operatore sul flot tato o sulla frazione di campione tal quale Lo stereomicroscopio pu essere utilizzato in aggiunta al microscopio composto per l osservazione dell
204. mole e semolini la stufa deve avere una capacit calorifica tale che preventivamente regolata alla temperatura di 131 C possa raggiungere nuovamente tale temperatura in meno di 45 minuti dopo avervi introdotto il numero massimo di campioni da essiccare simultaneamente La stufa deve avere una ventilazione tale che essiccando per due ore tutti i campioni di frumento tenero che essa pu contenere i risultati presentino una differenza inferiore allo 0 15 rispetto ai risultati ottenuti con quattro ore di essiccazione 4 1 4 1 1 4 2 4 2 1 4 2 2 4 2 3 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 22 Preparazione Alimenti per animali diversi da quelli menzionati ai punti 4 1 2 e 4 1 3 Prelevare almeno 50 g di campione Se necessario macinare o dividere in particelle di grandezza appropriata in modo da evitare ogni variazione del contenuto di umidit cfr punto 6 Cereali e semole Prelevare almeno 50 g di campione Macinare in particelle di cui almeno la met passi per un setaccio a maglie di 0 5 mm e non lasci pi del 10 di residuo su un setaccio a maglie rotonde di 1 mm di diametro Alimenti liquidi o pastosi alimenti costituiti es senzialmente da sostanze grasse Prelevare almeno 25 g di campione pesati con l approssimazione di 10 mg e aggiungere una quantit appropriata di sabbia anidra pesare con l approssimazione di 10 mg e mescolare sino a ottenere un prodotto omogeneo Essiccazione
205. n consente di utilizzare un divisore o se non si dispone di un divisore si pu ridurre il campione con il metodo della suddivisione in quarti Formare quindi dai campioni ridotti campioni finali per controllo difesa in caso di controversia e riferimento di entit approssimati vamente uguale e rispondenti alle prescrizioni quantitative di cui al capitolo 7 Se si controllano costituenti incluso il materiale geneti camente modificato o sostanze presumibilmente distribuiti in modo non uniforme nelle materie prime per alimenti per animali il cam pione globale sar interamente omogeneizzato e successivamente diviso in campioni finali oppure ridotto a non meno di 2 kg o 2 litri 3 servendosi di un divisore meccanico o automatico Solo se la natura dell alimento non consente di utilizzare un divisore si pu ridurre il campione qualora necessario con il metodo della suddivisione in quarti Per la verifica della presenza di materiale geneticamente modifi cato nel quadro del regolamento UE n 619 2011 il campione ridotto deve contenere almeno 35 000 semi grani per permettere di ottenere campioni finali di almeno 10 000 semi grani ai fini di verifica dell applicazione della normativa per la difesa in caso di controversia e come riferimento cfr nota al capitolo 6 e nota al capitolo 7 Eventuali grumi vanno schiacciati se necessario togliendoli dalla massa per poi reinte grarveli Ad eccezione del f
206. n un matraccio a fondo arrotondato da 500 ml Ripetere l estrazione della fase acquosa con altri due volumi di 70 ml di diclorometano e aggiungere questi estratti al primo nel matraccio In evaporatore rotante evaporare a secchezza 4 2 l estratto di dicloro metano a 40 C a pressione ridotta Sciogliere il residuo contenuto nel pallone con circa 5 ml di metanolo 3 2 e trasferire quantitativamente questa soluzione in un matraccio tarato da 10 ml Risciacquare il pallone con altri due volumi di 1 2 ml di metanolo e trasferire anche questi nel matraccio tarato Portare a volume con il metanolo e miscelare Un ali quota viene filtrata attraverso un filtro a membrana 4 6 Conservare questa soluzione per la determinazione mediante HPLC 5 6 Determinazione HPLC Parametri I parametri seguenti sono proposti a titolo indicativo possibile operare in condizioni diverse purch si ottengano risultati equivalenti Colonna per cromatografia liquida 4 4 1 Fase mobile per HPLC miscela metanolo acqua 3 3 Velocit di effllusso 1 1 5 ml minuto Lunghezza d onda di rivelazione 265 nm Volume d iniezione 20 50 pl 5 6 2 5 6 3 TAI T2 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 149 Verificare la stabilit del sistema cromatografico iniettando pi volte la soluzione di taratura 3 7 3 contenente 4 ug ml fino a ottenimento di altezze o aree del picco e tempi di ritenzione costanti Curva di t
207. nazione del contenuto di amido viene effettuata col metodo polarimetrico le materie prime elencate di seguito se presenti negli alimenti per animali in quantit significative possono dar luogo a interferenze capaci di condurre a risultati inesatti prodotti della barbabietola da zucchero come polpa di barbabietola da zucchero melasse di barbabietola da zucchero polpa di bar babietola da zucchero melassata borlanda di barbabietola da zuc chero zucchero di barbabietola pastazzo di agrumi semi di lino panello di lino farina di estrazione di lino semi di colza panello di colza farina di estrazione di colza cortec cia di colza semi di girasole farina di estrazione di girasole farina di estrazione di girasole parzialmente decorticato panello di copra farina di estrazione di copra polpa di patate lievito disidratato prodotti ricchi di inulina ad esempio fettucce e farina di topinam bur ciccioli M DETERMINAZIONE DELLE CENERI GREZZE Finalit e campo d applicazione Il metodo consente di determinare il tenore di ceneri grezze negli ali menti per gli animali 4 2 4 3 5 1 DZ 12 73 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 63 Principio Il campione incenerito alla temperatura di 550 C il residuo viene pesato Reattivi Nitrato d ammonio soluzione al 20 p v Apparecchiatura Piastra riscaldante Forno e
208. ne dato dalla formula seguente cx 10 w m dove c concentrazione di alofuginone nella soluzione del campione in ug ml m peso della quantit di sostanza da analizzare in grammi Convalida dei risultati Identit L identit dell analita pu essere confermata mediante co cromatografia oppure usando un rivelatore a serie di diodi in cui vengono confrontati gli spettri dell estratto di campione e della soluzione di taratura 3 6 2 contenente 6 0 ug ml Co cromatografia Un estratto di campione viene rinforzato mediante aggiunta di un quantitativo adeguato della soluzione di taratura 3 6 2 Il quantitativo di alofuginone addizionato deve essere analogo a quello stimato di alo fuginone rilevato nell estratto di campione Deve aumentare soltanto l altezza del picco dell alofuginone tenuto conto sia della quantit addizionata che della diluizione dell estratto L ampiezza del picco a met della sua altezza massima deve corrispon dere con uno scostamento massimo del 10 all ampiezza originale Rivelazione a serie di diodi I risultati sono valutati in base ai seguenti criteri a la lunghezza d onda di assorbimento massimo degli spettri del cam pione e dello standard registrata all apice del picco sul cromatogram ma deve essere la stessa entro un margine determinato dal potere di risoluzione del sistema di rivelazione Per la rivelazione a serie di diodi tale margine in genere di circa 2 nm b
209. ne per la determinazione mediante HPLC 5 4 Determinazione HPLC Parametri I parametri qui riportati sono di riferimento E possibile operare in condizioni diverse purch si ottengano risultati equivalenti Colonna per cromatografia liquida 4 4 1 Fase mobile per HPLC 3 21 Velocit di efflusso 1 5 2 ml min Lunghezza d onda di rivelazione 243 nm Volume iniettato 40 100 pl Verificare la stabilit del sistema cromatografico iniettando pi volte la soluzione di taratura 3 6 2 contenente 3 0 ug ml fino a ottenimento di altezze aree del picco e tempi di ritenzione costanti Curva di taratura Iniettare pi volte ciascuna soluzione di taratura 3 6 2 e misurare le altezze aree dei picchi per ciascuna concentrazione Tracciare la curva di taratura riportando in ordinate le altezze medie o le aree medie dei picchi delle soluzioni di taratura e in ascisse le corrispondenti concen trazioni in ug ml 5 4 3 7 1 1 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 94 Soluzione del campione Iniettare pi volte l estratto di campione 5 3 2 utilizzando lo stesso volume usato per le soluzioni di taratura e determinare l altezza area media dei picchi dell alofuginone Calcolo dei risultati Determinare la concentrazione della soluzione del campione in ug ml in base all altezza area media dei picchi dell alofuginone per riferimento alla curva di taratura 5 4 2 Il contenuto di alofuginone w mg kg del campio
210. ngere un piccolo tampone di lana di vetro alla sommit del letto della resina Lasciar colare il metanolo dalla colonna e lavare la resina con 100 ml d acqua fermando il flusso quando il liquido raggiunge la sommit del letto della resina Attendere che la colonna si stabilizzi per 10 minuti prima di utilizzarla Evitare comunque che la colonna si essicchi Purificazione del campione Trasferire quantitativamente l estratto 5 2 sulla sommit della colonna di amberlite preparata 5 3 1 ed eluire scartando l eluato La velocit di eluizione non deve superare 20 ml min Risciacquare il pallone con 20 ml di acido cloridrico 3 17 e usare quest ultimo liquido per lavare la colonna di resina Eliminare eventuali residui di soluzione acida insuf flando aria Eliminare i liquidi di lavaggio Aggiungere 100 ml di me tanolo 3 8 alla colonna e lasciar eluire per 5 10 minuti raccogliendo l eluato in un pallone da 250 ml Attendere che il metanolo residuo si stabilizzi per 10 minuti con la resina e continuare l eluizione con un flusso non superiore a 20 ml min raccogliendo l eluato nello stesso pallone Evaporare il metanolo sull evaporatore rotante 4 2 la tempe ratura del bagnomaria non deve superare i 40 C Trasferire quantitati vamente il residuo in un pallone tarato da 10 ml applicando la fase mobile 3 21 Portare a volume con la fase mobile e agitare Filtrare una parte attraverso un filtro a membrana 4 7 Riservare questa solu zio
211. no tenuto conto dei quantitativi aggiunti e della diluizione dell estratto L ampiezza del picco a met altezza deve corrispondere con uno scostamento massimo del 10 all ampiezza originale del picco del diclazuril o dello standard interno del campione non addizionato Rivelazione a serie di diodi I risultati sono valutati in base ai seguenti criteri a la lunghezza d onda dell assorbimento massimo degli spettri del cam pione e dello standard registrata al vertice del picco sul cromato gramma deve essere la stessa entro un margine determinato dal po tere di risoluzione del sistema di rivelazione Per la rivelazione a serie di diodi essa in genere di 2 nm circa 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 105 b fra 210 e 320 nm gli spettri del campione e dello standard registrati al vertice del picco sul cromatogramma non devono essere diversi per le parti dello spettro situate fra il 10 e il 100 dell assorbanza relativa Questo criterio soddisfatto quando sono presenti gli stessi massimi e quando in tutti i punti osservati lo scarto fra gli spettri non supera il 15 dell assorbanza dello standard dell analita c n fra 230 e 320 nm gli spettri della curva ascendente dell apice e della curva discendente del picco prodotta dall estratto del campione non devono essere diversi gli uni dagli altri per le parti dello spettro situate fra il 10 e il 100 dell assorbanza relativa Questo criterio soddisfatto qu
212. nsibili di quelli citati nel presente allegato per individuare la presenza illecita di additivi il cui uso negli alimenti per animali non pi autorizzato I metodi di analisi citati nel presente allegato sono utilizzati a fini di conferma 3 2 3 3 3 4 3 5 3 6 3 7 A DETERMINAZIONE DEL METILBENZOQUATO 7 benzilossi 6 butil 3 metossicarbonil 4 chinolone Finalit e campo d applicazione Il metodo consente di determinare il contenuto di metilbenzoquato negli alimenti per animali Il limite di quantificazione di 1 mg kg Principio Il metilbenzoquato viene estratto dal campione con una soluzione meta nolica di acido metansolfonico L estratto purificato con diclorometano mediante cromatografia a scambio ionico e poi nuovamente con diclo rometano Il tenore del metilbenzoquato determinato mediante croma tografia liquida ad alta prestazione HPLC in fase inversa utilizzando un rivelatore UV Reattivi Diclorometano Metanolo di qualit HPLC Fase mobile per HPLC miscela di metanolo 3 2 e acqua di qualit HPLC 75 25 v v Filtrare la soluzione attraverso un filtro di 0 22 um 4 5 e degassarla ad esempio sottoponendola per 10 minuti a trattamento con ultrasuoni Soluzione di acido metansolfonico c 2 Diluire 20 0 ml di acido metansolfonico e portarlo a 1000 ml con metanolo 3 2 Soluzione di acido cloridrico c 10 Prelevare 100 ml d acido cloridrico p20 1 18
213. nte raggiunto la temperatura di 130 C Rimettere il coperchio sul recipiente estrarre quest ultimo dalla stufa lasciare raffreddare per 30 45 minuti nell essiccatore 3 6 e pesare con l approssimazione di 1 mg Alimenti composti contenenti pi del 4 di saccarosio o lattosio materie prime per mangimi quali carrube prodotti a base di cereali idrolizzati germi di malto fettucce di barbabietola solubili di pesce e zuccheri alimenti composti contenenti pi del 25 di sali minerali con acqua di cristallizzazione Tarare con la precisione di 0 5 mg un recipiente 3 3 provvisto di coperchio Pesare nel recipiente tarato con l approssimazione di 1 mg circa 5 g di prodotto e ripartirli uniformemente Porre il recipiente privo del coperchio nella stufa a vuoto 3 5 preriscaldata a una temperatura di 80 85 C Per evitare che la temperatura della stufa scenda troppo introdurre il recipiente nel pi breve tempo possibile Portare la pressione a 100 Torr e lasciare essiccare a questa pressione per quattro ore in corrente d aria secca e calda o mediante un disidra tante 300 g circa per 20 campioni In quest ultimo caso interrompere la connessione con la pompa a vuoto quando raggiunta la pressione prescritta Misurare la durata dell essiccazione a partire dal momento 4 3 4 3 1 5 1 5 2 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 23 in cui la stufa ha nuovamente raggiunto la temperatura di 80 85 C Ripor
214. ntit inferiore di campione finale purch ci sia indicato e documentato nel verbale di campionamento Nel caso del campionamento di legumi cereali in grani e frutta a guscio per determinare i residui di antiparassitari il campione finale deve essere di almeno 1 kg conformemente alle disposizioni della direttiva 2002 63 CE della Commissione GU L 187 del 16 7 2002 pag 30 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 12 YM 8 METODO DI CAMPIONAMENTO PER LOTTI MOLTO GRANDI IMMAGAZZINATI O TRASPORTATI CON MODALIT CHE NON PERMETTONO IL PRELIEVO DI CAMPIONI DA TUTTO IL LOTTO 8 1 Principi generali Se le modalit di trasporto o di immagazzinamento di un lotto non consentono il prelievo di campioni elementari dall intero lotto prefe ribile effettuare il campionamento quando il lotto in movimento Nel caso dei grandi depositi per immagazzinare alimenti per animali gli operatori vanno incoraggiati ad installare nel deposito attrezzature che consentano di effettuare il campionamento automatico su tutto il lotto immagazzinato In caso di applicazione delle procedure di campionamento previste dal presente capitolo 8 l operatore del settore dei mangimi o un suo rap presentante viene informato sulla procedura di campionamento Se con testa la procedura l operatore o il suo rappresentante deve consentire all autorit competente di effettuare prelievi per il campionamento in tutto il lotto a proprie spese
215. nto due granuli di pietra pomice 3 13 riscaldare agitando a mano su fiamma libera di altezza media e portare il liquido a ebollizione in circa 2 minuti Col locare immediatamente l erlenmeyer su una tela metallica provvista di uno schermo d amianto munito di un foro del diametro di circa 6 cm sulla quale stata preventivamente accesa una fiamma Questa regolata in modo tale che venga riscaldato soltanto il fondo dell erlenmeyer Adattare sull erlenmeyer un refrigerante a riflusso A decorrere da questo momento far bollire per 10 minuti esatti Raffreddare immediatamente in acqua fredda e dopo circa 5 minuti titolare nel seguente modo Aggiungere 10 ml di soluzione di ioduro di potassio 3 12 e subito dopo con molta attenzione a causa del rischio di formazione di abbon dante schiuma 25 ml di acido solforico 3 11 Titolare quindi con la soluzione di tiosolfato di sodio 3 9 sino all apparire di una colorazione giallo opaco aggiungere l indicatore all amido 3 10 e terminare la tito lazione Effettuare la stessa titolazione su di una miscela esattamente misurata di 25 ml di reattivo di Luff Schoorl 3 8 e 25 ml d acqua dopo aver aggiunto 10 ml di soluzione di ioduro di potassio 3 12 e 25 ml di acido solforico 3 11 senza portare a ebollizione Calcolo dei risultati Stabilire a mezzo della tabella la quantit in mg di glucosio corri spondente alla differenza tra i risultati delle due titolazioni espresse in mg
216. ntrifugare per 2 minuti e decantare la fase di acetato etilico attraverso un filtro in fibra di vetro 4 6 in un imbuto separatore da 500 ml Ripetere l estrazione del campione con un secondo volume di 100 ml di acetato di etile Lavare gli estratti combinati per un minuto con 50 ml di soluzione di carbonato di sodio saturata con cloruro di sodio 3 16 ed eliminare lo strato acquoso Estrarre lo strato organico per un minuto con 50 ml di acido cloridrico 3 17 Raccogliere lo strato acido inferiore in un imbuto separatore da 250 ml Riestrarre lo strato organico per 1 5 minuti con altri 50 ml di acido cloridrico e aggiungere al primo estratto Lavare gli estratti acidi combinati agitando per 10 secondi con 10 ml di acetato di etile 3 4 5 3 5 3 1 5 4 5 4 1 5 4 2 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 93 Trasferire quantitativamente lo strato acquoso in un pallone a fondo arrotondato da 250 ml ed eliminare la fase organica Far evaporare dalla soluzione acida tutto l acetato di etile restante mediante un evaporatore rotante 4 2 La temperatura del bagnomaria non deve superare i 40 C Con un vuoto di circa 25 mbar tutto l acetato di etile residuo sar rimosso entro 5 minuti a 38 C Purificazione Preparazione della colonna di amberlite Per ciascun estratto di campione viene preparata una colonna XAD 2 Mediante metanolo 3 8 trasferire in una colonna di vetro 4 5 10 g di amberlite preparata 3 19 Aggiu
217. o 3 10 2 3 10 3 4 2 4 3 5 2 SZ 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 107 Soluzione standard intermedia di lasalocid sodico 50 ug ml In un matraccio tarato da 100 ml pipettare 10 0 ml di soluzione madre standard 3 10 1 portare a volume con metanolo acidificato 3 8 e mescolare Questa soluzione deve essere preparata al momento prima dell uso Soluzioni di taratura In una serie di matracci tarati da 50 ml trasferire 1 0 ml 2 0 ml 4 0 ml 5 0 ml e 10 0 ml di soluzione madre intermedia 3 10 2 Portare a volume con metanolo acidificato 3 8 e mescolare Queste soluzioni corrispondono rispettivamente a 1 0 2 0 4 0 5 0 e 10 0 g di lasalocid sodico per ml e vanno preparate al momento prima dell uso Acqua di qualit HPLC Apparecchiatura Bagno ultrasonico o bagnomaria con agitatore con sistema di termo regolazione Filtri a membrana 0 45 um Apparecchiatura HPLC con sistema di iniezione adeguato per volumi da 20 pl Colonna per cromatografia liquida 125 mm x 4 mm Cjg particelle di riempimento 5 um o equivalente Spettrofluorimetro con regolazione a lunghezza d onda variabile eccita zione e emissione Procedimento Indicazioni generali Alimento bianco Per eseguire la prova di recupero 5 1 2 analizzare un alimento di riferimento bianco per accertare l assenza di lasalocid sodico o di altre sostanze che possono interferire Il campione bianco ha una composi zion
218. o c 1 6 mol 1 In un matraccio tarato da 1 000 ml sciogliere 224 74 g di perclorato sodico monoidrato in acqua 3 3 portare a volume con acqua 3 3 e mescolare Campione 4 11 44 95 4 6 36 8 42 6 7 8 8 100 95 4 3 6 3 7 SIL 37 2 3 7 3 3 8 4 2 4 3 44 4 5 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 155 Fase mobile per HPLC cfr osservazione 9 1 Miscela di acetonitrile 3 2 soluzione di fosfato monosodico 3 4 e soluzione di perclorato sodico 3 5 450 450 100 v v v Prima del l impiego filtrare attraverso filtro a membrana da 0 22 um 4 3 e de gassare la soluzione ad esempio nel bagno ultrasonico 4 4 per almeno 15 minuti Sostanza di riferimento standard cloridrato di cloruro di 1 4 ammino 2 propilpirimidin5 il metil 2 metil piridinio amprolium E 750 di pu rezza garantita cfr punto 9 2 Soluzione madre standard di amprolium 500 ug ml In un matraccio tarato da 100 ml pesare con l approssimazione di 0 1 mg 50 mg di amprolium 3 7 sciogliere in 80 ml di metanolo 3 1 e immergere per 10 minuti il matraccio in bagno ultrasonico 4 4 Dopo il trattamento a ultrasuoni raffreddare la soluzione a temperatura ambien te portare a volume con acqua e mescolare A temperatura non superiore a 4 C la soluzione si mantiene stabile per un mese Soluzione standard intermedia di amprolium 50 ug ml In un matraccio tarato da 50 ml pipettare 5 0 ml
219. o dichiarato sospetto non conforme La valutazione della vantaggiosit del metodo di screening si basa sul confronto dei campioni falsi non con formi con il numero totale di campioni controllati Tale tasso deve essere sufficientemente basso da rendere vantaggioso l uso di uno strumento di screening 6 7 8 Almeno in condizioni di validazione i metodi bioanalitici forniscono una valida indicazione del livello di TEQ calcolato ed espresso in BEQ Anche per i metodi bioanalitici applicati in condizioni di ripetibilit la RSD intralaboratorio di norma inferiore alla riproducibilit RSDp T Prescrizioni specifiche per i metodi gc ms da rispettare a fini di screening o di conferma Taly Prescrizioni generali La differenza tra il livello upperbound e il livello lowerbound non deve essere superiore al 20 per gli alimenti per animali con una contami nazione di circa 1 ng OMS TEQ kg di prodotto con tenore di umidit del 12 in base alla somma di PCDD F e PCB diossina simili Per livelli di contaminazione inferiori ad esempio 0 5 ng OMS TEQ kg di prodot to la differenza tra il livello upperbound e il livello lowerbound pu essere compresa tra il 25 e il 40 72 Controllo dei recuperi 7 2 1 All inizio del metodo d analisi ad esempio prima dell estrazione devono essere aggiunti standard interni di PCDD PCDF 2 3 7 8 clorosostituiti e marcati con 3C e standard interni di PCB diossina simile marcati con 13C per convali
220. o a membrana da 0 45 um 4 6 Procedere alla determinazione HPLC 5 4 Preparati gt 2 Pesare con l approssimazione di 0 001 g 0 2 g del campione non ma cinato e trasferirli in una beuta da 250 ml Aggiungere 45 0 ml d acqua 5 3 5 3 1 5 4 5 4 1 5 4 2 5 4 3 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 162 mescolare ed equilibrare per 5 minuti Aggiungere 105 0 ml di metano lo acetonitrile 3 5 coprire e omogeneizzare Sottoporre il campione a ultrasuoni 4 7 per 15 minuti poi scuotere o agitare per 15 minuti 4 1 Filtrare la soluzione attraverso carta da filtro in fibra di vetro 4 2 Diluire un aliquota del filtrato con la miscela acqua metanolo acetonitrile 3 12 fino ad ottenere una concentrazione finale di carbadox dell ordine di 10 15 ug ml per un preparato al 10 il fattore di diluizione 10 Filtrare un aliquota attraverso un filtro da 0 45 um 4 6 Procedere alla determinazione HPLC 5 4 Purificazione Preparazione della colonna di ossido di alluminio Pesare 4 g di ossido di alluminio 3 4 e trasferire nella colonna di vetro 4 3 Purificazione del campione Far passare 15 ml dell estratto filtrato 5 2 1 per la colonna di ossido di alluminio ed eliminare i primi 2 ml di eluato Raccogliere i successivi 5 ml e filtrare un aliquota attraverso un filtro da 0 45 um 4 6 Procedere alla determinazione HPLC 5 4 Determinazione HPLC Parametri Le seguenti condizioni
221. o all estremit opposta in modo che lo strato liquido superiore nel cilindro possa essere trasferito in un imbuto separatore Procedimento Nota La vitamina A sensibile alla luce ultravioletta e all ossidazione Tutte le operazioni sono effettuate in assenza di luce utilizzando vetreria di vetro ambra o vetreria protetta con foglio di alluminio e di ossigeno eliminato con un getto di azoto Durante l estra zione l aria al di sopra del liquido sostituita con azoto evitare una pressione eccessiva alzando ogni tanto il tappo Preparazione del campione Frantumare il campione affinch passi attraverso un vaglio da 1 mm evitando la produzione di calore La frantumazione deve essere effettuata immediatamente prima della pesatura e della saponificazione altrimenti si possono verificare perdite di vitamina A 3 2 5 3 5 4 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 73 Saponificazione A seconda del contenuto di vitamina A pesare con l approssimazione di 1 mg da 2 a 25 g di campione in un matraccio da 500 ml a fondo piatto o conico 4 2 1 Aggiungere rimestando ogni volta 130 ml di etanolo 3 1 circa 100 mg di BHT 3 13 2 ml di soluzione di ascorbato di sodio 3 5 e 2 ml di soluzione di solfuro di sodio 3 6 Adattare un refrigerante 4 3 al matraccio e immergere quest ultimo in un bagno d acqua con agitatore magnetico 4 7 Portare a ebollizione e lasciar rifluire per 5 minuti Aggiungere quindi 25 ml
222. o conico a condizione che il laboratorio abbia dimostrato che i livelli di rile vamento sono equivalenti a quello ottenuto utilizzando l imbuto separatore conico di vetro Imbuto separatore y 250 ml diametro 4mm 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 136 vm 2 1 2 2 5 Stereomicroscopio con gamma di ingrandimenti finali almeno da 6 5 x a 40 x 2 1 2 2 6 Microscopio composto in campo chiaro a luce trasmessa con gamma di ingrandimenti finali almeno da 100 x a 400 x Possono inoltre essere utilizzati la luce polarizzata e il contrasto interferen ziale differenziale 2122 7 Vetreria da laboratorio standard 2 1 2 2 8 Attrezzatura per la preparazione dei vetrini vetrini per microscopio classici vetrini concavi vetrini coprioggetti 20 x 20 mm pinzet te spatole 2 13 Campionamento e preparazione del campione 2 1 31 Campionamento utilizzato un campione rappresentativo prelevato secondo le prescrizioni dell allegato I 2 1 3 2 Precauzioni Per evitare rischi di contaminazione crociata in laboratorio tutte le attrezzature riutilizzabili devono essere accuratamente pulite prima dell uso Prima di essere pulito l imbuto separatore deve essere smontato I pezzi che compongono l imbuto separatore e le vetrerie devono essere prima lavati a mano e poi in lavastoviglie I setacci devono essere puliti usando una spazzola a setole sintetiche rigide Dopo la setacciatura di materie grasse come le farin
223. o di 0 1 mol l corrispondenti a 44 2 mg di glucosio nel secondo 11 ml corrispondenti a 27 6 mg di glucosio La differenza di 16 6 mg di glucosio Il contenuto in zuccheri riduttori eccettuato il lattosio calcolato in glucosio pertanto di 4 x 16 6 6 64 10 ci Tabella dei valori per 25 ml di reattivo di Luff Schoorl ml di Na S O 0 1 mol l 2 minuti di riscaldamento 10 minuti di ebollizione Glucosio fruttosio zuc Na S2 03 cheri invertiti Lattosio Maltosio 0 1 mol l Cia Ho Oni Cia Hz Oni 0 DIS UDAUIUN 2 4 2 4 3 6 37 3 9 3 9 Na S2 03 0 1 mol l ml 0 DAUDSDUIDBDPUINT 322 3 3 3 4 3 4 1 3 4 2 3 4 3 3 5 3 6 3 7 3 8 3 9 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 58 K DETERMINAZIONE DEL LATTOSIO Finalit e campo d applicazione Il metodo consente di determinare il contenuto di lattosio negli alimenti per animali che ne contengono pi dello 0 5 Principio Gli zuccheri sono disciolti nell acqua La soluzione sottoposta a fer mentazione col lievito Saccharomyces cerevisiae che lascia intatto il lattosio Dopo chiarificazione e filtrazione il contenuto in lattosio del filtrato determinato con il metodo di Luff Schoorl Reattivi Sospensione di Saccharomyces cerevisiae porre in sospensione 25 g di lievito fresco in 100 ml di acqua La sospensione si conserva in frigo rifero al massimo per una settimana Soluzione di Carrez
224. o non sono coerenti ripetuto almeno lo step dell amplificazione genica Se il laboratorio sospetta che gli estratti di DNA possano essere la causa dell incoerenza sono effettuate una nuova estrazione del DNA e una successiva amplificazione genica prima di interpretare i risul tati L espressione finale dei risultati si basa sull integrazione e sull in terpretazione dei risultati delle due aliquote analizzate secondo le POS stabilite dall EURL AP e pubblicate sul suo sito web 2 2 6 1 Risultato negativo Un risultato negativo espresso come segue Nel campione esaminato non stato individuato DNA di X X la specie animale o il gruppo di specie animali bersaglio 2 2 6 2 Risultato positivo Un risultato positivo espresso come segue Nel campione esaminato stato individuato DNA di X X la specie animale o il gruppo di specie animali bersaglio 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 145 ALLEGATO VII METODO DI CALCOLO DEL VALORE ENERGETICO DEGLI ALIMENTI DESTINATI AL POLLAME 1 Metodo di calcolo ed espressione del valore energetico Il valore energetico degli alimenti composti destinati ai volatili da cortile calcolato secondo la formula che segue in base alle percentuali di alcuni componenti analitici degli alimenti il valore espresso in megajoule MJ di energia metabolizzabile ME corretta in azoto per chilogrammo di alimento composto MJ kg di ME 0 1551 x proteina gregg
225. o spettro situate fra il 10 e il 100 dell assorbanza relativa Questo criterio soddisfatto quando sono presenti gli stessi valori massimi e quando in tutti i punti osservati lo scarto fra gli spettri non supera il 15 dell assorbanza dello spettro al vertice del picco Se uno di questi criteri non soddisfatto la presenza dell analita non confermata Ripetibilit La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione non deve superare il 10 del valore ottenuto pi elevato per contenuti di metilbenzoquato compresi tra 4 e 20 mg kg Recupero Per il campione bianco addizionato il recupero non inferiore al 90 Risultati di uno studio collaborativo Cinque campioni sono stati analizzati da 10 laboratori Ogni campione stato analizzato due volte media mg kg 8 90 sr mg kg 0 60 CV 6 70 sr mg kg 0 90 CVr 10 10 Recupero 92 00 NR non riscontrata sr deviazione standard della ripetibilit CV coefficiente di variazione della ripetibilit sg deviazione standard della riproducibilit CVR coefficiente di variazione della riproducibilit B DETERMINAZIONE DELL OLAQUINDOX 2 N 2 idrossietil carbamoil 3 metilchinoxalin N N biossido Finalit e campo d applicazione Il metodo consente di determinare il contenuto di olaquindox negli alimenti per animali Il limite di quantificazione di 5 mg kg Principio Il camp
226. o studio collaborativo a livello comunitario quarta intercomparazione nel corso del quale dodici laboratori hanno analiz zato tre campioni al fine di convalidare il metodo di idrolisi Ogni campione stato analizzato cinque volte I risultati sono stati i seguenti Campione 2 Cambiata Alimento per suini Campione 3 p _ _ con aggiunta di L Alimento concen Alimento per suini ae triptofano trato per suini L 12 12 n 55 50 Media g kg 3 40 4 22 sr g kg 0 05 0 08 r g kg 0 14 0 22 CV 1 6 1 9 Sr g kg 0 20 0 09 R g kg 0 56 0 25 CVr 6 0 2 2 L numero di laboratori che hanno trasmesso risultati n numero di risultati individuali considerati una volta eliminati gli outlier valori aberranti identificati in base al test di Cochran Dixon sr deviazione standard della ripetibilit Sg deviazione standard della riproducibilit r ripetibilit R riproducibilit CV coefficiente di variazione della ripetibilit in CVRQ coefficiente di variazione della riproducibilit in stato organizzato un altro studio collaborativo a livello comunitario terza intercomparazione in cui tredici laboratori hanno analizzato due campioni al fine di convalidare il metodo di estrazione del triptofano libero Ogni campione stato analizzato cinque volte I risultati sono stati i seguenti Campione 5 Campione 4 Miscela di frumento e Miscela di frumento e soia campione 4 con soia aggiunta di
227. o sul cromatogramma non devono essere diversi per le parti dello spettro situate fra il 10 e il 100 dell assorbanza relativa Questo criterio soddisfatto quando sono presenti gli stessi valori massimi e quando in tutti i punti osservati lo scarto fra gli spettri non supera il 15 dell assorbanza dell analita standard c fra 210 e 320 nm gli spettri relativi all estratto del campione regi strati nel tratto ascendente all apice e nel tratto discendente del picco cromatografico non devono differire tra loro per le parti dello spettro situate fra il 10 e il 100 dell assorbanza relativa Questo criterio soddisfatto quando sono presenti gli stessi valori massimi e quando in tutti i punti osservati lo scarto fra gli spettri non supera il 15 dell assorbanza dello spettro al vertice del picco Se uno di questi criteri non soddisfatto la presenza dell analita non confermata Ripetibilit La differenza fra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione non deve superare il 15 del valore pi elevato per i contenuti di amprolium compresi fra 25 mg kg e 500 mg kg 75 mg kg per i contenuti di amprolium compresi fra 500 mg kg e 1000 mg kg il 7 5 del valore pi elevato per i contenuti di amprolium supe riori a 1 000 mg kg Recupero Per un campione addizionato bianco il recupero non inferiore al 90 Risultati di uno studio collaborativo E stato organizzat
228. o uno studio in cooperazione tra vari laboratori nel corso del quale sono stati analizzati tre alimenti per pollame campioni 1 3 un alimento minerale campione 4 e una premiscela campione 5 I risultati dello studio figurano nella seguente tabella pr L Campione 2 Campione 3 Campione 4 Campione 5 L 14 15 n 56 60 media mg kg 5 129 25 140 sr mg kg 178 550 CVr 3 46 2 20 sr mg kg 266 760 CVr 5 19 3 00 contenuto nominale mg 5 000 25 000 kg L numero di laboratori n numero di valori singoli Sr deviazione standard della ripetibilit CV coefficiente di variazione della ripetibilit sg deviazione standard della riproducibilit CVR coefficiente di variazione della riproducibilit 92 9 3 3 2 3 3 3 4 3 5 3 6 3 7 3 8 3 9 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 159 Osservazioni Se il campione contiene tiamina il relativo picco compare nel cromato gramma poco prima di quello dell amprolium Secondo questo metodo l amprolium e la tiamina debbono essere separati Se l amprolium e la tiamina non vengono separati dalla colonna 4 1 1 impiegata con questo metodo sostituire con metanolo fino al 50 della porzione di acetoni trile della fase mobile 3 6 Secondo la farmacopea britannica lo spettro di una soluzione di ampro lium c 0 02 mol l in acido cloridrico c 0 1 mol l presenta valori massimi a 246 nm e 262 nm L assorbanza
229. ocit di efflusso 1 2 ml min Rivelatore 4 5 2 rivelatore a fluorescenza eccitazione 295 nm emissione 330 nm o rivelatore UV 292 nm Taratura acetato di DL a tocoferolo o DL a tocoferolo Standard di acetato di DL a tocoferolo Preparazione della soluzione standard di lavoro Pipettare 25 ml della soluzione madre di acetato di DL a tocoferolo 3 10 1 in un matraccio a fondo piatto o in una beuta da 500 ml 4 2 1 e idrolizzare come indicato al punto 5 2 Successivamente estrarre con etere di petrolio 3 2 secondo quanto indicato al punto 5 3 e portare a 500 ml con etere di petrolio Far evaporare 25 ml di questo estratto nell evaporatore cfr punto 5 4 sin quasi all essiccazione togliere il solvente residuo con una corrente di azoto 3 9 e ridisciogliere il resi duo in 25 0 ml di metanolo 3 3 La concentrazione nominale di questa soluzione di 45 5 ug di DL a tocoferolo ml equivalente a 50 ug di acetato di DL a tocoferolo ml La soluzione standard di lavoro deve essere preparata al momento poco prima dell uso Preparazione delle soluzioni di taratura e della curva di taratura In una serie di matracci tarati da 20 ml trasferire 1 0 2 0 4 0 e 10 0 ml della soluzione standard di lavoro portare a volume con metanolo 3 3 e miscelare Le concentrazioni nominali di queste soluzioni sono 2 5 5 0 10 0 e 25 0 ug ml di acetato di DL a tocoferolo e cio 2 28 4 55 9 10 e 22 8 ug ml di DL a tocoferolo Iniettare pi vol
230. odo applicabile unicamente a contenuti di ammoniaca inferiori a 0 25 Principio Il campione viene estratto con acqua la soluzione chiarificata e filtrata Le basi azotate volatili sono portate spostate all ebollizione per aggiunta di ossido di magnesio e raccolte in una quantit determinata d acido solforico il cui eccesso viene titolato di ritorno con una soluzione d idrossido di sodio Reattivi Soluzione al 20 p v di acido tricloroacetico Ossido di magnesio Emulsione antischiuma ad esempio silicone Acido solforico 0 05 mol l Soluzione di idrossido di sodio 0 1 mol l Soluzione allo 0 3 v v di rosso di metile in etanolo al 95 96 v v Apparecchiatura Agitatore rotativo a capovolgimento circa 35 40 giri al minuto Apparecchio per distillazione del tipo Kjeldahl Procedimento Pesare con l approssimazione di 1 mg 10 g di sostanza e introdurli in un pallone tarato da 200 ml con 100 ml d acqua Mescolare o agitare il pallone nell agitatore rotativo per 30 minuti Aggiungere 50 ml della soluzione d acido tricloroacetico 3 1 portare a volume con acqua agi tare vigorosamente e filtrare su un filtro a pieghe Prelevare una quantit di filtrato limpido in funzione del presunto con tenuto di basi azotate volatili 100 ml sono generalmente sufficienti Diluire a 200 ml e aggiungere 2 g di ossido di magnesio 3 2 e qualche goccia di emulsione antischiuma 3 3 La soluzione deve risultare alca
231. oluzioni del campione devono essere il pi possibile simili 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 40 La frequenza delle iniezioni della soluzione di taratura dipende dalla stabilit del reattivo ninidrina e del sistema analitico La soluzione stan dard o del campione diluita con tampone citrato 3 24 in misura tale che l area del picco della soluzione standard sia compresa Fra il 30 e il 200 dell area del picco dell amminoacido nel campione La cromatografia degli amminoacidi varier leggermente secondo il tipo di analizzatore impiegato e la resina usata Il sistema scelto deve essere in grado di separare gli amminoacidi uno dall altro e dalle sostanze reattive alla ninidrina Nel corso dell operazione il sistema cromatogra fico deve dare una risposta lineare alle variazioni delle quantit di am minoacidi introdotti in colonna Durante la fase di cromatografia quando si analizza una soluzione equimolare degli amminoacidi sottoposti a determinazione si applicano i rapporti di altezza valle picco citati pi avanti La soluzione equimolare deve contenere almeno il 30 del carico massimo di ciascun ammi noacido che pu essere determinato con precisione tramite il sistema di analisi degli amminoacidi 4 9 Per la separazione treonina serina il rapporto di altezza valle picco del pi basso dei due amminoacidi che si sovrappongono sul cromato gramma non deve superare 2 10 se la determinazione viene effettuata
232. onato deve essere analogo a quello stimato di metilbenzoquato rilevato nell estratto del campione Deve aumentare soltanto l altezza del picco del metilbenzoquato tenuto conto sia della quantit di metilbenzoquato aggiunta che della diluizione dell estratto L ampiezza del picco a met della sua altezza massima deve corrispondere con uno scostamento massimo del 10 all am piezza originale Rivelazione a serie di diodi I risultati sono valutati in base ai seguenti criteri a la lunghezza d onda di assorbimento massimo degli spettri del cam pione e dello standard registrata all apice del picco sul cromatogram ma deve essere la stessa entro un margine determinato dal potere di risoluzione del sistema di rivelazione Per la rivelazione a serie di diodi tale margine in genere di circa 2 nm 72 T3 b fra 225 e 300 nm gli spettri del campione e dello standard registrati all apice del picco sul cromatogramma non devono differire tra loro per le parti dello spettro situate fra il 10 e il 100 dell assorbanza relativa Questo criterio soddisfatto quando sono presenti gli stessi valori massimi e quando in tutti i punti osservati lo scarto tra i due spettri non supera il 15 dell assorbanza dell analita standard c tra 220 e 350 nm gli spettri relativi all estratto del campione regi strati nel tratto ascendente all apice e nel tratto discendente del picco cromatografico non devono differire tra loro per le parti dell
233. one dei livelli di PCDD F e di PCB diossina simili nei campioni di alimenti per animali nel range dei livelli di background bassi Ci importante per seguire le tendenze nel tempo valutare l esposizione della popolazione e creare una base di dati per l even tuale ri valutazione dei livelli di azione e dei livelli massimi Questo obiettivo raggiunto mediante metodi di conferma che permettono di identificare e quantificare in modo inequivoco i PCDD F e i PCB diossina simili al livello di interesse Questi metodi possono essere utilizzati per la conferma dei risultati ottenuti con i metodi di scree ning e per la determinazione dei livelli di background bassi nel monitoraggio degli alimenti per animali sono importanti anche per stabilire pattern di congeneri per identificare la fonte di una possibile contaminazione Attualmente questi metodi utilizzano la gascromato grafia ad alta risoluzione spettrometria di massa ad alta risoluzione HRGC HRMS 2 Classificazione dei metodi per grado di quantificazione 8 Zi I metodi qualitativi danno una risposta s no sulla presenza di analiti di interesse senza dare un indicazione quantificata della concentrazione dell analita presunto Questi metodi possono dare risultati semiquantita tivi ma sono utilizzati esclusivamente per indicare in termini di decisione s no livelli superiori o inferiori a determinati range ad esempio il limite di rilevabilit il limite di quantificazione o i val
234. one di 5 0 g della resina a scambio cationico trattata 3 6 con 50 ml di acido cloridrico 3 5 versare nella colonna di vetro e far decantare Scaricare l eccesso di acido fino a poco sopra la superficie della resina e lavare la colonna con acqua fino a quando l effluente neutro al tornasole Trasferire 50 ml di metanolo 3 2 nella colonna e drenare fino alla superficie della resina Cromatografia su colonna Mediante una pipetta trasferire accuratamente l estratto ottenuto come descritto al punto 5 3 nella colonna Risciacquare il pallone con due volumi di 5 10 ml di metanolo 3 2 e trasferire questi liquidi di lavag gio nella colonna Scaricare l estratto fino alla superficie della resina e lavare la colonna con 50 ml di metanolo facendo attenzione che lai defluiscano ad una velocit pari o inferiore a 5 ml al minuto Eliminare tutto il filtrato Eluire il metilbenzoquato dalla colonna utilizzando 150 ml di soluzione di acico metansolfonico 3 4 e raccogliere l eluato della colonna in una beuta da 250 ml Separazione liquido liquido Trasferire l eluato ottenuto come descritto al punto 5 4 2 in un imbuto separatore da 1 litro Risciacquare la beuta con 5 10 ml di metanolo 3 2 e aggiungere il liquido di risciacquo al contenuto dell imbuto se paratore Aggiungere 300 ml di soluzione di acido cloridrico 3 5 e 130 ml di diclorometano 3 1 Agitare per 1 minuto e lasciar separare le fasi Versare lo strato inferiore diclorometano i
235. ono state individuate particelle animali di una data natura nel campione esaminato al microscopio ottico non sono state individuate particelle derivate da animali terrestri nel campione esaminato al microscopio ottico non sono state individuate particelle derivate da pesci 2 01 52 Se sono state individuate una media tra 1 e 5 particelle animali di una data natura nel campione esaminato al microscopio ottico sono state indi viduate in media per determinazione non pi di 5 particelle derivate da animali terrestri Le particelle sono state identificate come ossa cartilagine fibre muscolari peli corna Dato il basso numero di particelle inferiore al limite di rileva zione del metodo microscopico non pu essere escluso il ri schio di un falso risultato positivo 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 142 vm Oppure secondo il caso nel campione esaminato al microscopio ottico sono state indi viduate in media per determinazione non pi di 5 particelle derivate da pesci Le particelle sono state identificate come lisca scaglia cartilagine muscolo otolite branchia Dato il basso numero di particelle inferiore al limite di rileva zione del metodo microscopico non pu essere escluso il ri schio di un falso risultato positivo Se il campione stato sottoposto a presetacciamento il rapporto del laboratorio indica in quale frazione frazione setacciata fra zione pellet
236. ora con l agitatore 4 2 Filtrare la soluzione attraverso un filtro in fibra di vetro 4 5 e racco gliere tutto il filtrato in una beuta da 150 ml Aggiungere 7 5 g di setacci molecolari 3 4 tappare e agitare per cinque minuti Filtrare immedia tamente attraverso un filtro in fibra di vetro Conservare questa soluzione per la fase di purificazione 5 3 Purificazione Preparazione della colonna di ossido di alluminio Introdurre un piccolo tampone di lana di vetro all estremit inferiore della colonna 4 1 e comprimerlo con un asticella di vetro Pesare e trasferire nella colonna 11 0 g di allumina preparata 3 5 Nel corso di questa operazione far s che l esposizione all atmosfera sia ridotta al minimo Battere delicatamente l estremit inferiore della colonna per lasciar depositare l allumina 5 4 5 4 1 5 4 2 5 4 3 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 98 Purificazione del campione Trasferire nella colonna con una pipetta 5 0 ml dell estratto del campione preparato secondo quanto indicato al punto 5 2 Posizionare la punta della pipetta contro la parete della colonna e lasciando che l allumina assorba la soluzione Eluire la robenidina con 100 ml di metanolo 3 1 alla velocit di 2 3 ml minuto e raccogliere l eluato in un pallone a fondo arrotondato da 250 ml Evaporare a secco la soluzione di metanolo a pressione ridotta e a 40 C mediante evaporatore rotante 4 3 Ridi sciogliere il residuo in
237. oraggio grossolano o del foraggio a basso peso specifico 3 Ad eccezione del foraggio grossolano o del foraggio a basso peso specifico 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 16 vm3 0 5 Imballaggio dei campioni Sigillare ed etichettare i recipienti o le confezioni in modo che non possano essere aperti senza violare il sigillo L etichetta completa deve essere incorporata nel sigillo 9 6 Invio dei campioni al laboratorio Il campione deve essere inviato senza indugio al laboratorio di analisi designato Con esso vanno inviate anche le informazioni necessarie all analista 10 VERBALI DEL CAMPIONAMENTO Per ogni campione va redatto un verbale che permetta di identificare in modo univoco la partita campionata e le sue dimensioni Il verbale deve anche recare nota di ogni eventuale scostamento rispetto alla procedura di campionamento prevista dal presente regolamento Oltre che al laboratorio di controllo ufficiale il verbale va messo a disposizione dell operatore del settore dei mangimi e o del laboratorio designato dall operatore del settore dei mangimi 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 17 vm3 ALLEGATO II DISPOSIZIONI GENERALI RELATIVE AI METODI DI ANALISI DE GLI ALIMENTI PER ANIMALI A PREPARAZIONE DEI CAMPIONI PER LE ANALISI 1 Finalit Le modalit qui di seguito descritte riguardano la preparazione per l analisi dei campioni trasmessi ai laboratori di controllo dopo essere stati
238. ore con l aggiunta di solu zione di fenolftaleina 3 7 in genere sono sufficienti quattro successivi lavaggi Filtrare l estratto lavato attraverso un filtro asciutto per separa zione di fase 4 4 per rimuovere eventuale acqua residua e trasferire in un matraccio tarato da 500 ml 4 2 2 Risciacquare l imbuto separatore ed il filtro con 50 ml di etere di petrolio 3 2 portare a volume con etere di petrolio 3 2 e mescolare bene Estrazione con apparecchiatura per estrazione 4 8 Quando gli strati si sono separati cfr osservazione al punto 7 3 sosti tuire il tappo del cilindro di vetro 4 8 1 con l insert di vetro smerigliato 4 8 2 e disporre l estremit inferiore a U del tubo regolabile in modo che risulti appena al di sopra del livello dell interfaccia Esercitando una pressione con getto d azoto nel braccio laterale trasferire lo strato supe riore di etere di petrolio in un imbuto separatore da 1000 ml 4 2 3 Aggiungere 100 ml di etere di petrolio 3 2 nel cilindro di vetro tappare e scuotere bene Lasciare che gli strati si separino e trasferire lo strato superiore nell imbuto separatore come prima Ripetere la procedura di estrazione con altri 100 ml di etere di petrolio 3 2 e altre due volte con frazioni di 50 ml di etere di petrolio 3 2 aggiungere gli strati di etere di petrolio nell imbuto separatore Lavare gli estratti di etere di petrolio combinati come descritto al punto 5 3 1 e procedere come ivi indicato
239. ori di cut off Per il controllo dei livelli massimi e delle soglie d intervento per i PCDD PCDF e i PCB diossina simili negli alimenti per animali possono essere utilizzati metodi di screening che sono basati sul confronto del risultato analitico con un valore di cut off e danno una decisione s no indicativa del possibile superamento del livello di interesse 2 2 I metodi semiquantitativi danno un indicazione approssimativa della con centrazione dell analita presunto quando il risultato numerico non ri sponde ai requisiti dei metodi quantitativi Possono essere utilizzati per fornire informazioni sul range di concentrazione dell analita e permettere all analista di decidere sul range di calibrazione per il test di conferma da eseguire successivamente e per scopi di controllo della qualit Ad esem pio i seguenti metodi sono considerati semiquantitativi a metodi basati su principi biologici come i dosaggi cellulari i dosaggi di recettori e gli immunodosaggi metodi bioanalitici che sono in grado di rilevare gli analiti d interesse includono una curva di cali brazione danno una decisione s no indicante il possibile supera mento del livello di interesse e permettono di esprimere il risultato in equivalenti bioanalitici BEQ che sono un indicazione del valore TEQ nel campione 8 Adattato ai PCDD F e ai composti diossina simili da Guidelines for the validation of screening methods for residues of veterinary medi
240. orme nazionali Risultati eccedenti le soglie d intervento di cui all Allegato II della Direttiva 2002 32 CE Le soglie di intervento fungono da strumento per la selezione dei cam pioni nei casi in cui necessario identificare una fonte di contamina zione e prendere provvedimenti per la sua riduzione o eliminazione I metodi di screening permettono di stabilire appropriati valori di cut off per la selezione di tali campioni Le azioni necessarie per identificare una fonte e ridurre o eliminare la contaminazione sono intraprese solo se il superamento delle soglie di intervento confermato da una doppia analisi eseguita con un metodo di conferma e tenendo conto dell incer tezza di misura 7 CAPO II Preparazione dei campioni e prescrizioni per i metodi di analisi impiegati nel controllo ufficiale dei livelli di diossine PCDD PCDF e di PCB diossina simili negli alimenti per animali Campo d applicazione Le prescrizioni di cui al presente allegato si applicano alle analisi dei prodotti destinati all alimentazione degli animali effettuate ai fini del controllo ufficiale dei livelli di policlorodibenzo p diossine PCDD e policlorodibenzofurani PCDF 2 3 7 8 sostituiti e di policlorobifenili diossina simili PCB diossina simili e per finalit di legge Il monitoraggio della presenza di PCDD F e di PCB diossina simili negli alimenti per animali pu essere effettuato per due diversi scopi a la selezione di campioni con
241. ostante la perdita di peso tra due pesate consecutive deve essere pari o inferiore a 2 mg ad una tempe rature compresa tra 450 e 500 C per almeno 30 minuti Dopo ciascun riscaldamento lasciar raffreddare in un primo momento nel forno poi nell essiccatore e pesare Procedere ad una prova in bianco in assenza del campione La perdita di peso conseguente all incenerimento non deve essere superiore a 4 mg Calcolo dei risultati Il contenuto di cellulosa grezza in percentuale del campione dato dalla seguente formula mo m x 100 X m dove m peso del campione in grammi m perdita di peso conseguente all incenerimento nel corso della determinazione in grammi mj perdita di peso conseguente all incenerimento durante la prova in bianco in grammi Ripetibilit La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione non deve superare lo 0 6 in valore assoluto per i contenuti di cellulosa grezza inferiori al 10 il 6 rispetto al valore pi elevato per i contenuti di cellulosa grezza uguali o superiori al 10 Osservazioni Gli alimenti per animali che contengono pi del 10 di sostanze grasse gregge debbono essere sgrassati prima dell analisi con etere di petrolio 3 5 Collegare il crogiolo filtrante 4 2 e il suo contenuto all unit di 8 2 8 3 8 4 8 5 8 6 3 2 3 3 3 4 3 5 3 6 2009R0152 IT 01
242. otto campione di 50 g Tuttavia se dopo la prima e la seconda deter minazione la somma delle particelle animali di una data natura individuate nelle due determinazioni superiore a 15 la determi nazione aggiuntiva non necessaria e il risultato dell analisi espresso direttamente utilizzando la frase indicata al punto 2 1 5 3 Se dopo la terza determinazione la somma delle particelle animali di una data natura individuate nelle tre determinazioni superiore a 15 il risultato dell analisi espresso utilizzando la frase indicata al punto 2 1 5 3 in caso contrario il risultato dell analisi espresso utilizzando la frase indicata al punto 2 1 5 2 Se a seguito di una prima determinazione effettuata secondo i protocolli di osservazione figuranti secondo il caso nel diagramma 1 o nel diagramma 2 sono individuate pi di 5 particelle animali di una data natura animale terrestre o pesce il risultato dell ana lisi espresso utilizzando la frase indicata al punto 2 1 5 3 2 1 5 Espressione dei risultati Quando comunica i risultati il laboratorio indica il tipo di mate riale su cui stata effettuata l analisi sedimento flottato o frazione di campione tal quale e il numero di determinazioni effettuate Il rapporto del laboratorio contiene almeno informazioni sulla pre senza di costituenti derivati da animali terrestri e da pesci Le diverse situazioni sono riportate nei modi sottoindicati 21 51 Se non s
243. otto a meno che a seguito di un esame dettagliato non risulti prova alcuna della non conformit del resto del lotto ai requisiti UE La presenza di un ispettore necessaria anche quando il campione ufficiale prelevato automaticamente Tuttavia nel caso in cui il cam pionamento sia effettuato in modo automatico con parametri prefissati non modificabili nel corso dello stesso e i campioni elementari siano posti in un recipiente sigillato cos da prevenire possibili frodi la pre senza di un ispettore richiesta solo all inizio del campionamento ogni volta che il recipiente dei campioni deve essere cambiato e alla fine del campionamento 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 13 YM3 8 2 2 Campionamento statico di lotti trasportati per nave Se il campionamento eseguito in modo statico si applica la stessa procedura prevista per le strutture di stoccaggio sili accessibili dall alto cfr punto 8 4 1 Il campionamento si effettua sulla parte accessibile dall alto del lotto della stiva Il numero di campioni elementari determinato tenendo conto delle dimensioni della partita campionata In caso di campiona mento di una parte di un lotto di mangimi della stessa classe o con la medesima descrizione e se tale parte del lotto non risultata conforme ai requisiti UE si presume che i risultati valgano per tutto il mangime di tale lotto a meno che a seguito di un esame dettagliato non risulti prova alcun
244. paratore e il filtro con 50 ml di etere di petrolio 3 2 portare a volume con etere di petrolio 3 2 e mescolare bene Estrazione con apparecchiatura per estrazione 4 8 Quando gli strati si sono separati cfr osservazione al punto 7 3 sosti tuire il tappo del cilindro di vetro 4 8 1 con l insert di vetro smerigliato 4 8 2 e disporre la terminazione inferiore a U del tubo adattabile in modo che risulti appena al di sopra del livello dell interfaccia Eserci tando una pressione con getto d azoto nel braccio laterale trasferire lo strato superiore di etere di petrolio in un imbuto separatore da 1 000 ml 4 2 3 Aggiungere 100 ml di etere di petrolio 3 2 nel cilindro di vetro tappare e scuotere bene Lasciare che gli strati si separino e trasferire lo strato superiore nell imbuto separatore come prima Ripetere la procedura di estrazione con altri 100 ml di etere di petrolio 3 2 poi ancora due volte con 50 ml di etere di petrolio 3 2 aggiungere gli strati di etere di petrolio nell imbuto separatore Lavare gli estratti di etere di petrolio combinati come descritto al punto 5 3 1 e procedere come ivi indicato Preparazione della soluzione del campione per HPLC Pipettare un aliquota della soluzione di etere di petrolio risultante dalla procedura di cui ai punti 5 3 1 o 5 3 2 in un matraccio a pera da 250 ml 4 2 4 Far evaporare il solvente sin quasi all essiccazione nell evapora tore rotante 4 1 a pressione ridotta ad
245. perficie le tracce di PCDD PCDF composti diossina simili e composti interferenti 4 8 La quantit del campione utilizzato per l estrazione deve permettere la conformit ai requisiti in relazione a un working range sufficientemente basso comprendente le concentrazioni di interesse 4 9 Le procedure specifiche di preparazione dei campioni utilizzate per i prodotti considerati sono conformi a linee guida internazionalmente ac cettate 5 Prescrizioni per i laboratori S1 Come prescritto dal regolamento CE n 882 2004 i laboratori sono accreditati da un organismo riconosciuto operante in conformit alla Guida ISO 58 per garantire che applichino alle loro analisi le procedure di assicurazione qualit I laboratori devono essere accreditati in base alla norma EN ISO IEC 17025 52 La competenza del laboratorio dimostrata dalla partecipazione regolare ed efficace a studi condotti in collaborazione con altri laboratori per la determinazione di PCDD PCDF e di PCB diossina simili nelle matrici di alimenti per animali e nei range di concentrazioni corrispondenti 5 3 I laboratori che applicano metodi di screening per il controllo di routine dei campioni instaurano una stretta cooperazione con i laboratori che applicano il metodo di conferma per il controllo della qualit e per la conferma del risultato analitico dei campioni sospetti 6 Prescrizioni di base per la procedura di analisi per le diossine PCDD PCDDF e i PCB diossina
246. pettri relativi all estratto del campione regi strati nel tratto ascendente all apice e nel tratto discendente del picco cromatografico non devono differire tra loro per le parti dello spettro situate fra il 10 e il 100 dell assorbanza relativa Questo criterio soddisfatto quando sono presenti gli stessi valori massimi e quando in tutti i punti osservati lo scarto tra gli spettri non supera il 15 dell assorbanza dello spettro al vertice del picco Se uno di questi criteri non soddisfatto la presenza dell analita non confermata Ripetibilit La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione non deve superare il 15 del risultato pi elevato per contenuti di olaquindox compresi tra 10 e 200 mg kg Recupero Per il campione bianco addizionato il recupero non inferiore al 90 322 3 3 3 4 3 5 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 154 Risultati di uno studio collaborativo stato organizzato uno studio comunitario in cooperazione tra vari laboratori nel corso del quale tredici laboratori hanno analizzato quattro campioni di alimenti per suinetti ivi compreso un alimento bianco I risultati dello studio figurano nella tabella seguente L 13 n 40 media mg kg S mg kg Sr mg kg _ CV CVr Contenuto nominale mg kg recupero L numero di laboratori n numero di valori singoli S devia
247. pione preparare una soluzione come indicato al punto 5 1 1 o 5 1 2 Procedura abituale Pesare con l approssimazione di 1 mg 1 g o pi del campione Intro durre la quantit da analizzare in un matraccio di Kjeldahl aggiungere 20 ml di acido solforico 3 5 agitare per imbibire d acido tutta la sostanza e per evitare che essa aderisca alle pareti del pallone riscaldarla e farla bollire per 10 minuti Lasciar raffreddare leggermente aggiungere I2 5 3 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 68 2 ml di acido nitrico 3 4 riscaldare lentamente lasciare ancora raf freddare leggermente aggiungere dell altro acido nitrico 3 4 e portare il tutto nuovamente a ebollizione Ripetere le operazioni fino a ottenere una soluzione incolore Far raffreddare aggiungere un po d acqua tra vasare il liquido in un pallone tarato da 500 ml lavando il pallone con acqua calda Lasciar raffreddare portare a volume con acqua mescolare e filtrare Campioni contenenti sostanze organiche ed esenti da diidrogenofosfati di calcio e magnesio Pesare con l approssimazione di 1 mg 2 5 g circa di campione e in trodurli in un crogiolo da incenerimento Miscelare il campione da ana lizzare sino ad amalgamarlo con 1 g di carbonato di calcio 3 1 Ince nerire nel forno a 550 C fino a ottenere ceneri bianche o grigie una piccola quantit di carbone non disturba Trasferire le ceneri in un becher da 250 ml Aggiungere 20 ml d acqua e aci
248. possibile scaricare presso il punto di importazione o di controllo per cui il campionamento va eseguito al momento dello sca rico dei contenitori 9 ISTRUZIONI RELATIVE AI PRELIEVI ALLA FORMAZIONE E ALL IMBALLAGGIO DEI CAMPIONI 9 1 Aspetti generali Prelevare e formare i campioni senza inutili ritardi prendendo le pre cauzioni necessarie per evitare qualsiasi alterazione o contaminazione del prodotto Le superfici i recipienti e gli strumenti impiegati devono essere puliti e asciutti 92 Campioni elementari I campioni elementari vanno prelevati a caso dall insieme della partita da campionare e devono risultare d entit approssimativamente uguale Il campione elementare pari ad almeno 100 grammi o a 25 grammi in caso di foraggio grossolano o foraggio a basso peso specifico Qualora siano da prelevare meno di 40 campioni elementari conforme mente alle norme procedurali per il campionamento fissate al punto 8 le dimensioni di tali campioni sono determinate in funzione delle dimen sioni prescritte per il campione globale da ottenere cfr punto 6 In caso di campionamento di piccoli lotti di mangime confezionato da cui in base ai requisiti quantitativi sia da prelevare un numero limitato di campioni elementari il campione elementare dato dal contenuto di un unit originaria di peso non superiore a 1 kg o di volume non superiore a un litro Per i campionamenti di mangime confezionato composto da piccole uni
249. preparazione dei campioni seguendo le linee guida emesse dal PEURL AP e pubblicate sul suo sito web Il sedimento pu essere sottoposto a colorazione utilizzando una soluzione di rosso di alizarina applicando il seguente protocollo trasferire il sedimento secco in una provetta di vetro e risciac quare due volte con circa 5 ml di etanolo utilizzare ogni volta un agitatore vortex per 30 secondi lasciare decantare il sol vente per circa 1 min 30 s ed eliminarlo sbiancare il sedimento aggiungendo almeno 1 ml di soluzione di ipoclorito di sodio Lasciare reagire per 10 minuti Riempire d acqua la provetta lasciare decantare il sedimento per 2 3 minuti ed eliminare con cautela l acqua e le particelle in so spensione 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 138 vm risciacquare altre due volte il sedimento con circa 10 ml di acqua utilizzare un agitatore vortex per 30 secondi lasciare decantare ed eliminare l acqua ogni volta aggiungere da 2 a 10 gocce di soluzione di rosso di alizarina e agitare su vortex la miscela Lasciare reagire per 30 secondi e risciacquare due volte il sedimento colorato con circa 5 ml di etanolo e poi una volta con acetone utilizzare ogni volta un agitatore vortex per 30 secondi lasciare decantare il solvente per circa un minuto ed eliminarlo essiccare il sedimento colorato 2 1 4 Esame microscopico 2 1 4 1 Preparazione dei vetrini Preparare i vetrini per
250. r HPLC miscela di metanolo 3 3 e acqua ad esempio 980 20 v v Il rapporto esatto sar determinato dalle caratteristiche della colonna utilizzata Azoto senza ossigeno Acetato di DL a tocoferolo purissimo di attivit certificata Soluzione madre di acetato di DL a tocoferolo in un matraccio tarato da 100 ml pesare con l approssimazione di 0 1 mg 100 mg di acetato di DL a tocoferolo 3 10 Sciogliere in etanolo 3 1 e portare a volume con lo stesso solvente 1 ml di questa soluzione contiene 1 mg di acetato di DL a tocoferolo per il controllo UV cfr punto 5 6 1 3 per la sta bilizzazione cfr osservazioni al punto 7 4 DL a tocoferolo purissimo di attivit certificata Soluzione madre di acetato di DL a tocoferolo in un matraccio tarato da 100 ml pesare con l approssimazione di 0 1 mg 100 mg di DL a tocoferolo 3 11 Sciogliere in etanolo 3 1 e portare a volume con lo stesso solvente 1 ml di questa soluzione contiene 1 mg di DL a tocoferolo per il controllo UV cfr punto 5 6 2 3 per la stabilizzazione cfr osservazioni al punto 7 4 2 6 di tert butil 4 metilfenolo BHT cfr osservazione al punto 7 5 Apparecchiatura Evaporatore rotante a film 4 2 4 2 1 4 2 2 4 2 3 4 2 4 4 3 4 4 4 5 4 6 4 7 4 8 4 8 1 4 8 2 5 1 5 2 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 80 Vetreria in vetro ambra Matracci a fondo piatto o beute da 500 ml con
251. r taluni alimenti per animali a basso tenore di oligoelementi pu essere ne cessario partire da un campione del peso di 10 20 g e limitare a soli 100 ml il volume della soluzione finale c L incenerimento deve essere effettuato in forno chiuso senza insuf flazione d aria o di ossigeno d La temperatura indicata dal pirometro non deve superare i 475 C Determinazione spettrofotometrica Preparazione delle soluzioni di taratura Per ciascun oligoelemento da dosare preparare una serie di soluzioni di taratura a partire dalle soluzioni standard di lavoro di cui ai punti 3 7 1 3 8 1 3 9 1 e 3 10 1 in modo che la concentrazione dell acido cloridrico in ciascuna di esse sia all incirca 0 5 mol l e nel caso del ferro del manganese e dello zinco la concentrazione del cloruro di lantanio corri sponda allo 0 1 di La p v Le concentrazioni prescelte per gli oligoelementi devono trovarsi nell in tervallo di sensibilit dello spettrofotometro utilizzato Le tabelle di se guito riportano a titolo di esempio alcuni tipi di composizione delle soluzioni di taratura nondimeno a seconda del tipo e della sensibilit dello spettrofotometro impiegato potrebbe essere necessario scegliere altre concentrazioni 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 89 Ferro ug Fe ml 5 ml di soluzione standard di la 5 voro 3 7 1 1 ml 100 ug Fe ml HCI 3 2 7 10 ml di soluzione di cloruro di lantanio 3 11 portar
252. rafia Un estratto del campione 5 2 viene rinforzato mediante aggiunta di un quantitativo adeguato della soluzione di taratura 3 5 3 Il quantita tivo di olaquindox aggiunto deve essere simile a quello di olaquindox rilevato nell estratto del campione Deve aumentare soltanto l altezza del picco dell olaquindox tenuto conto sia della quantit aggiunta che della diluizione dell estratto L ampiezza del picco a met della sua altezza deve corrispondere con uno sco stamento massimo del 10 all ampiezza originale del picco dell ola quindox nell estratto del campione non addizionato Rivelazione a serie di diodi I risultati sono valutati in base ai seguenti criteri a la lunghezza d onda di assorbimento massimo degli spettri del cam pione e dello standard registrata all apice del picco sul cromatogram ma deve essere la stessa entro un margine determinato dal potere di risoluzione del sistema di rivelazione Per la rivelazione a serie di diodi tale margine in genere di circa 2 nm b fra 220 e 400 nm gli spettri del campione e dello standard registrati all apice del picco sul cromatogramma non devono essere diversi per le parti dello spettro situate fra il 10 e il 100 dell assorbanza relativa Questo criterio soddisfatto quando sono presenti gli stessi valori massimi e quando in tutti i punti osservati lo scarto tra i due spettri non supera il 15 dell assorbanza dell analita standard c fra 220 e 400 nm gli s
253. rata a 440 nm 3 Reattivi 3 1 Miscela di isopropanolo esano mescolare 60 parti in volume di isopro panolo con 40 parti in volume di esano normale 3 2 Solvente A porre in un pallone tarato da 1 litro 500 ml circa della miscela isopropanolo esano 3 1 2 ml di 3 amino 1 propanolo 8 ml di acido acetico glaciale e 50 ml d acqua Portare a volume con miscela di isopropanolo esano 3 1 Questo reattivo stabile per una settimana 3 3 Solvente B pipettare in un pallone tarato da 100 ml 2 ml di 3 amino 1 propanolo e 10 ml di acido acetico glaciale Raffreddare a temperatura ambiente e portare a volume con N N dimetilformamide Questo reattivo stabile per una settimana 3 4 Anilina se la densit ottica della prova in bianco supera il valore 0 022 l anilina deve essere distillata su polvere di zinco eliminando la prima e l ultima frazione pari al 10 del distillato Posta in bottiglia chiusa di vetro bruno ed in frigorifero questo reattivo si conserva per parecchi mesi 35 Soluzione tipo A di gossipolo porre in un pallone tarato da 250 ml 27 9 mg d acetato di gossipolo Sciogliere e portare a volume con il solvente A 3 2 Pipettare 5 0 ml di questa soluzione in un matraccio tarato da 250 ml e portare a volume con il solvente A La concentra zione di gossipolo in questa soluzione 0 02 mg ml Lasciar riposare per un ora a temperatura ambiente prima dell uso 3 6 Soluzione tipo B di gossipolo porre in un pallone tara
254. retta la soluzione di nitrato d argento 3 2 fino ad averne un eccesso di 5 ml Aggiungere 5 ml di etere dietilico 3 5 e agitare energicamente per far coagulare il precipitato Titolare l eccesso di nitrato d argento con la soluzione di tiocianato di ammonio 3 1 fino a quando il viraggio al rosso bruno persiste per 1 minuto Calcolo dei risultati La quantit di cloro X espressa in cloruro di sodio data dalla formula seguente 5 845 x Vi V2 m X dove Vj ml di soluzione di nitrato d argento 0 1 mol l aggiunti V ml di soluzione di tiocianato di ammonio 0 1 mol l utilizzati per la titolazione m peso del campione Qualora la prova in bianco indichi un consumo di soluzione di nitrato d argento di 0 1 mol l detrarre questo valore dal volume Vj V3 Osservazioni La titolazione pu essere realizzata anche con il metodo potenziometri co Per i prodotti molto ricchi in sostanze grasse procedere a uno sgrassag gio preliminare con etere dietilico o etere di petrolio Per le farine di pesce la titolazione pu essere effettuata secondo il metodo di Mohr 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 71 ALLEGATO IV METODI DI ANALISI PER IL CONTROLLO DEL CONTENUTO DI ADDITIVI AUTORIZZATI NEGLI ALIMENTI PER ANIMALI 322 3 3 3 4 3 5 3 6 3 6 1 3 1 3 8 3 9 3 111 A DETERMINAZIONE DELLA VITAMINA A Finalit e campo d applicazione Il metodo consente di de
255. ri massimi e quando in tutti i punti osservati lo scarto tra gli spettri non supera il 15 dell assorbanza dello spettro all apice del picco Se uno di questi criteri non soddisfatto la presenza dell analita non confermata Ripetibilit Per contenuti di 10 mg kg e superiori la differenza fra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione non deve superare il 15 rispetto al risultato pi elevato Recupero Per un campione addizionato bianco il recupero non inferiore al 90 Risultati di uno studio collaborativo stato organizzato uno studio in cooperazione tra vari laboratori nel corso del quale otto laboratori hanno analizzato sei alimenti per animali quattro premiscele e tre preparati Ogni campione stato analizzato due volte Per maggiori informazioni consultare Journal of the AOAC Vo lume 71 1998 pag 484 490 I risultati ad esclusione di quelli fuori campo sono mostrati di seguito Tabella 1 Risultati dello studio collaborativo sugli alimenti per animali Campione Campione Campione Campione Campione Campione 1 2 3 4 5 6 L 8 15 media mg kg 49 7 S mg kg 2 12 CV 4 3 Sr mg kg 2 44 CVr 4 9 contenuto nominale mg 50 0 50 0 50 0 50 0 50 0 50 0 kg Tabella 2 Risultati dello studio collaborativo sulle premiscele e sui preparati Premiscele Preparati media g kg S g kg DI CV 7 4 Sr g kg 7 7 200
256. ri per analisi p a Per l analisi degli ele menti in traccia la purezza dei reattivi deve essere controllata con una prova in bianco A seconda del risultato ottenuto pu rendersi necessaria una purificazione supplementare dei reattivi 2 Per le operazioni di dissoluzione diluizione risciacquo o lavaggio men zionate nei metodi di analisi senza indicazioni riguardo alla natura del solvente o del diluente deve essere utilizzata acqua Di norma l acqua deve essere demineralizzata o distillata In casi particolari indicati nei metodi di analisi deve essere sottoposta a procedimenti specifici di purificazione 3 Tenuto conto dell abituale equipaggiamento dei laboratori di controllo l apparecchiatura descritta nei metodi di analisi si limita agli strumenti e agli apparecchi speciali o rispondenti a prescrizioni d uso specifiche Detto materiale deve essere pulito soprattutto per le determinazioni di quantit minime di sostanze 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 19 vm3 C APPLICAZIONE DEI METODI DI ANALISI ED ESPRESSIONE DEI RISULTATI l Procedura di estrazione Diversi metodi determinano una procedura di estrazione specifica In linea di massima possibile applicare procedure di estrazione diverse da quella indicata nel metodo a condizione che abbiano dimostrato un efficienza di estrazione per la matrice analizzata equivalente a quella della procedura indicata nel metodo 2 Procedura di purificaz
257. risultati dello studio figurano nella seguente tabella Campione 1 Campione 2 Campione 3 Campione 4 Campione 5 A 100 O 100 LI ZI KI L 11 6 n 19 12 Media 1 15 0 89 S mg kg 0 02 0 03 CV 1 92 3 34 Sr mg kg 0 11 0 12 CVRr 9 67 13 65 contenuto nominale mg 1 1 kg L numero di laboratori n numero di valori singoli S deviazione standard della ripetibilit CV coefficiente di variazione della ripetibilit 32 33 3 4 39 3 6 3 7 3 8 3 9 3 10 1 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 106 Sp deviazione standard della riproducibilit CVp coefficiente di variazione della riproducibilit Osservazioni Deve essere dimostrato preliminarmente che il diclazuril d una risposta lineare per l insieme delle concentrazioni misurate G DETERMINAZIONE DEL LASALOCID SODICO Sale sodico di un acido monocarbossilico polietere prodotto da Streptomyces lasaliensis Finalit e campo d applicazione Il metodo consente di determinare il contenuto di lasalocid sodico negli alimenti per animali e nelle premiscele Il limite di rilevazione di 5 mg kg il limite di quantificazione di 10 mg kg Principio Il lasalocid sodico viene estratto dal campione in metanolo acidificato e viene determinato per cromatografia in fase liquida ad alta prestazione HPLC a fase inversa utilizzando un rivelatore spettrofluorimetrico Reattivi Potassio diidrogeno fosfato K
258. rse purch si ottengano risultati equivalenti Colonna per cromatogra 250 mm x 4 mm C g particelle di riempi fia liquida 4 5 1 mento 5 o 10 um o equivalente Fase mobile 3 9 miscela di metanolo 3 3 e acqua ad esem pio 980 20 v v Velocit di efflusso 1 2 ml min Rivelatore 4 5 2 rivelatore UV 325 nm o rivelatore a fluore scenza eccitazione 325 nm emissione 475 nm Taratura Preparazione delle soluzioni madre di lavoro Pipettare 20 ml della soluzione madre di acetato di vitamina A 3 11 1 o 20 ml della soluzione madre di palmitato di vitamina A 3 12 1 in un matraccio a fondo piatto o in una beuta da 500 ml 4 2 1 e idrolizzare come indicato al punto 5 2 ma senza aggiunta di BHT Successivamen te estrarre con etere di petrolio 3 2 secondo le indicazioni di cui al punto 5 3 e portare a 500 ml con etere di petrolio 3 2 Fare evaporare 100 ml di questo estratto nell evaporatore rotante cfr punto 5 4 sin quasi all essiccazione togliere il solvente residuo con una corrente di azoto 3 10 e ridisciogliere il residuo in 10 0 ml di metanolo 3 3 La concentrazione nominale di questa soluzione 560 UI di vitamina A ml Il contenuto esatto deve essere determinato conformemente al punto 5 6 3 3 La soluzione madre di lavoro deve essere preparata al momento poco prima dell uso Pipettare 2 0 ml di questa soluzione madre di lavoro in un matraccio tarato da 20 ml portare a volume con metanolo 3 3 e me
259. rtita campionata Numero minimo di campioni elementari lt 2 5 tonnellate o lt 2 500 litri 4 gt 2 5 tonnellate o gt 2 500 litri 7 Nel caso in cui non sia possibile rendere omogeneo il liquido il numero di campioni elementari deve essere aumentato 5 1 3 Alimenti in confezioni Gli alimenti solidi e liquidi possono essere confezionati in sacchetti sacchi barattoli fusti ecc ai quali si fa riferimento nella tabella come unit Le unit grandi 500 kg o litri si campionano in base alle disposizioni prescritte per gli alimenti alla rinfusa cfr punti 5 1 1 e 5 1 2 Numero minimo di unit da cui deve Dimensioni della partita campionata essere prelevato almeno un campione elementare Da 1 a 20 unit 1 unit Da 21 a 150 unit 3 unit Da 151 a 400 unit 5 unit della V del numero di unit che costituiscono la partita campiona ta fino a un massimo di 40 unit gt 400 unit Qualora l apertura di un unit possa alterare i risultati dell analisi per esem pio nel caso degli alimenti umidi deperibili il campione elementare co stituito dall unit non aperta Per le unit di contenuto non superiore a 1 kg o a un litro il campione elementare costituto dal contenuto di un unit originaria Se il risultato un numero decimale si arrotonda al numero intero superiore 5 1 4 Alimenti minerali formellati o matton
260. scolare La concentrazione nominale di questa soluzione madre di lavoro diluita 56 UI di vitamina A ml Preparazione delle soluzioni di taratura e della curva di taratura In una serie di matracci tarati da 20 ml trasferire 1 0 ml 2 0 ml 5 0 ml e 10 0 ml di soluzione madre di lavoro diluita portare a volume con metanolo 3 3 e mescolare Le concentrazioni nominali di queste solu zioni sono 2 8 5 6 14 0 e 28 0 UI di vitamina A ml Iniettare pi volte 20 ul di ogni soluzione di taratura e determinare le altezze medie dei picchi aree Sulla base delle altezze medie aree dei picchi tracciare una curva di taratura tenendo presente i risultati del controllo UV 5 6 3 3 3 63 SABAR 5 6 3 2 5 16 33 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 75 Standardizzazione UV delle soluzioni madre Soluzione madre di acetato di vitamina A Pipettare 2 0 ml della soluzione madre di acetato di vitamina A 3 11 1 in un matraccio tarato da 50 ml 4 2 2 e portare a volume con 2 propanolo 3 8 La concentrazione nominale di questa soluzione di 56 UI di vitamina A ml Pipettare 3 0 ml di questa soluzione di acetato di vitamina A diluita in un matraccio tarato da 25 ml e portare a volume con 2 propanolo 3 8 La concentrazione nominale di questa soluzione di 6 72 UI di vitamina A ml Misurare lo spettro UV di questa soluzione su 2 propanolo 3 8 nello spettrofotometro 4 6 tra 300 nm e 400 nm Il massimo di estinzione deve s
261. scolare e filtrare Pipettare 50 ml del filtrato corrispondenti a 2 5 g del campione in una beuta da 250 ml aggiungere 2 1 ml di acido cloridrico 3 1 e agitare energicamente Applicare un refrigerante a ricadere sulla beuta e immer gerla in bagnomaria bollente Dopo 15 minuti esatti ritirare la beuta dal bagno travasarne il contenuto in un pallone tarato da 100 ml sciac quando con un po di acqua fredda e raffreddare sino a 20 C Chiarificare quindi con le soluzioni di Carrez I 3 3 e II 3 4 portare a volume con acqua mescolare filtrare e misurare il potere rotatorio come indicato al punto 5 2 secondo e terzo capoverso 6 Calcolo dei risultati Il contenuto di amido in calcolato come segue 6 1 Misurazioni effettuate con il polarimetro o 2 000 P P Contenuto di amido ZA o p P potere rotatorio totale in gradi d arco P potere rotatorio in gradi d arco delle sostanze solubili nell eta nolo al 40 v v ORN potere rotatorio specifico dell amido puro I valori numerici D comunemente accettati per tale fattore sono i seguenti 185 9 amido di riso 185 7 fecola di patate 184 6 amido di mais 182 7 amido di frumento 181 5 amido d orzo 181 3 amido d avena 184 0 altri tipi di amido e miscele di amido negli alimenti composti 6 2 Misurazioni effettuate con il saccarimetro 2000 2N x 0 665 S S 26 6Nx S S Contenuto di amido 300 X EAN x 0 663 X a
262. secondo uno dei procedimenti di cui sopra applicare qualsiasi altro procedimento di preparazione che consenta di ottenere quantitativi da saggiare omo genei e rappresentativi dei campioni finali 3 2 Procedura specifica in caso di esame mediante ispezione visiva o al microscopio o nei casi in cui sia omogeneizzato l intero campione glo bale In caso di esame mediante ispezione visiva senza uso del micro scopio si adopera l intero campione di laboratorio In caso di esame al microscopio il laboratorio pu ridurre il cam pione globale o ridurre ulteriormente il campione ridotto I campioni finali per la difesa in caso di controversia e di riferimento si prele vano seguendo una procedura equivalente a quella seguita per il campione finale ai fini di verifica dell applicazione della normativa Qualora l intero campione globale sia omogeneizzato i campioni finali si prelevano dal campione globale omogeneizzato 4 Conservazione e immagazzinamento dei campioni Conservare i campioni a una temperatura tale da non alterare la loro composizione Nel caso dei campioni destinati all analisi di vitamine o di sostanze particolarmente sensibili alla luce conservarli in modo tale che non vengano alterati dalla luce B DISPOSIZIONI CONCERNENTI I REATTIVI E L APPAREC CHIATURA DA UTILIZZARE NEI METODI DI ANALISI 1 Tutti i reattivi in mancanza di altre indicazioni specificate nel metodo di analisi devono essere pu
263. si 7 2 4 Prima dell analisi GC MS sono aggiunti 1 o 2 standard di recupero surrogato 7 2 5 necessario il controllo del recupero Per i metodi di conferma i recu peri dei singoli standard interni sono compresi tra il 60 e il 120 Recuperi inferiori o superiori per singoli congeneri in particolare per alcune dibenzo p diossine e alcuni dibenzofurani epta e octaclorati sono accettabili purch il loro contributo al valore TEQ non superi il 10 del valore totale TEQ in base alla somma di PCDD PCDF e PCB diossina simili Per i metodi di screening GC MS i recuperi sono com presi tra il 30 e il 140 7 3 Rimozione delle sostanze interferenti La separazione dei PCDD PCDF dai composti clorurati interferenti quali i PCB non diossina simili e gli eteri clorurati di difenile effettuata mediante appropriate tecniche cromatografiche di prefe renza con una colonna di florisil d allumina e o di carbone La separazione gascromatografica degli isomeri lt 25 da picco a picco tra 1 2 3 4 7 8 HxCDF e 1 2 3 6 7 8 HxCDF 7 4 Calibrazione con curva standard Il range della curva di calibrazione copre il corrispondente range dei livelli di interesse 8 Prescrizioni specifiche per i metodi bioanalitici I metodi bioanalitici sono metodi basati su principi biologici come i dosaggi cellulari i dosaggi di recettori e gli immunodosaggi Le pre scrizioni figuranti in questo punto 8 si riferiscono ai metodi b
264. simili 6 1 Working range e limiti di quantificazione bassi Per i PCDD PCDF le quantit rilevabili devono situarsi nel range supe riore del femtogrammo 10 5 g data l estrema tossicit di alcuni di questi composti Per la maggior parte dei congeneri dei PCB gi sufficiente il limite di quantificazione dell ordine del nanogrammo 107 g Per la misura dei congeneri pi tossici dei PCB diossina simili in particolare i congeneri non orto sostituiti il limite inferiore del working range deve raggiungere i livelli bassi del picogrammo 107 g Per tutti gli altri congeneri dei PCB sufficiente un limite di quantificazione dell ordine del nanogrammo 107 g 6 2 Alta selettivit specificit 6 2 1 Occorre distinguere tra PCDD PCDF e PCB diossina simili e una mol titudine di altri composti coestratti che possono generare un interferenza presenti anche in concentrazioni superiori di vari ordini di grandezza a quelle degli analiti di interesse Per i metodi GC MS necessaria una differenziazione tra i vari congeneri in particolare tra quelli tossici ad esempio i diciassette PCDD PCDF 2 3 7 8 sostituiti e i dodici PCB diossina simili e gli altri congeneri 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 121 vmi 6 2 2 I metodi bioanalitici permettono di rilevare i composti bersaglio come somma di PCDD PCDF e o PCB diossina simili Il clean up del cam pione ha lo scopo di eliminare i composti che causano r
265. simo del 10 all ampiezza originale prodotta dall estratto del campione non addizionato Ripetibilit La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione non deve superare il 15 del valore pi elevato per i contenuti di lasalocid sodico compresi fra 30 e 100 mg kg 15 mg kg per contenuti di lasalocid sodico compresi fra 100 e 200 mg kg il 7 5 del valore pi elevato per i contenuti di lasalocid sodico superiori a 200 mg kg Recupero Per il campione addizionato bianco di alimento il recupero non inferiore all 80 Per i campioni addizionati di premiscela il recupero non inferiore al 90 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 110 8 Risultati di uno studio collaborativo stato organizzato uno studio collaborativo nel corso del quale dodici laboratori hanno analizzato due 2 premiscele campioni 1 e 2 e cinque alimenti per animali campioni 3 7 Ciascun campione stato analizzato due volte I risultati figurano nella tabella seguente c Cam Cam Cam Cam Cam na Campione 2 pione 3 pione 4 pione 5 pione 6 pione 7 pione 1 Premiscela G lar Bricio Mangi Mancime Manci Premiscela remiscela Granulare ricio angime angime angime m PET tacchini per tac lame per per tac per polli per polli per pora chini polli chini A B L 12 12 12 23 23 23 media mg 92 9 48 3 32 6 kg sr mg kg 2 27 1 93 1 75 CVr 2 44
266. simo 300 ug di ammoniaca Soluzione satura di carbonato di potassio sciogliere 100 g di carbonato di potassio in 100 ml d acqua portata all ebollizione Lasciar raffreddare e filtrare Acido solforico 0 01 mol l Apparecchiatura Agitatore rotativo a capovolgimento circa 35 40 giri al minuto Celle di Conway cfr figura in vetro o in materia plastica Microburette graduate a 1 100 ml Procedimento Pesare con l approssimazione di 1 mg 10 g di sostanza e porli in un pallone tarato da 200 ml con 100 ml d acqua Mescolare o agitare il pallone nell agitatore rotativo per 30 minuti Aggiungere 50 ml della soluzione d acido tricloroacetico 3 1 portare a volume con acqua agi tare vigorosamente e filtrare su un filtro a pieghe Prelevare con una pipetta 1 ml della soluzione di acido borico 3 3 nell incavo centrale della cella Conway e nella corona della cella 1 ml del filtrato ottenuto dal campione Coprire parzialmente con il coperchio ingrassato Lasciar scolare rapidamente nella corona periferica 1 ml della soluzione satura di carbonato di potassio 3 4 e chiudere ermeticamente il coperchio Agitare con precauzione la cella facendola rotare su un piano orizzontale in modo da assicurare la miscelazione dei due reattivi Mantenere l apparecchio per almeno quattro ore alla tempe ratura ambiente o per un ora a 40 C Titolare le basi volatili nella soluzione d acido borico con la soluzione di acido solforico 3 5 per mezzo d
267. sino ad ottenere un tenore di amprolium di 0 5 2 ug ml e mescolare cfr osservazione 9 3 Filtrare 5 10 ml di questa soluzione diluita at traverso un filtro a membrana 4 2 Procedere alla determinazione HPLC 5 3 Premiscele contenuto gt 1 di amprolium A seconda del contenuto di amprolium pesare con l approssimazione di 0 001 g da 1 a 4 g di premiscela in una beuta da 500 ml e aggiungere 200 ml di solvente di estrazione 3 8 Collocare la beuta nel bagno ultrasonico 4 4 e mantenervela per 15 minuti Togliere la beuta dal bagno agitare per un ora mediante l agitatore o col mescolatore magne tico 4 5 Diluire una parte di estratto con la fase mobile 3 6 sino ad ottenere un contenuto di amprolium di 0 5 2 ug ml e mescolare Filtrare 5 10 ml di questa soluzione diluita attraverso un filtro a membrana 4 2 Procedere alla determinazione HPLC 5 3 Determinazione HPLC Parametri Le seguenti condizioni vengono proposte a titolo indicativo possibile operare in condizioni diverse purch si ottengano risultati equivalenti Colonna per cromatografia 125 mm x 4 mm a scambio cationico liquida 4 1 1 riempimento Nucleosil 10 SA 5 o 10 um o equivalente Fase mobile 3 6 miscela di acetonitrile 3 2 soluzione di fosfato monosodico 3 4 e soluzione di perclorato sodico 3 5 450 450 100 v v y Velocit di efflusso 0 7 1 ml min Lunghezza d onda di rive 264 nm lazione Volume d iniezione 100 pl 200
268. sit ottica come indicato al punto 5 2 Tracciare la curva di taratura portando in ordinata i valori di densit ottica ed in ascissa le quantit corrispondenti di fosforo Per concentrazioni comprese tra 0 e 40 ug ml la curva sar lineare Calcolo dei risultati Determinare la quantit di fosforo nella sostanza sottoposta all analisi riferendosi alla curva di taratura Esprimere il risultato in percentuale del campione Ripetibilit La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione non supera il 3 rispetto al valore pi elevato per contenuti di fosforo infe riori al 5 lo 0 15 in valore assoluto per i contenuti in fosforo uguali o superiori al 5 3 2 3 3 3 4 3 5 3 6 3 7 3 8 3 9 5 1 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 69 Q DETERMINAZIONE DEL CLORO DEI CLORURI Finalit e campo d applicazione Il metodo consente di determinare il cloro dei cloruri solubili in acqua convenzionalmente espresso in cloruro di sodio Esso applicabile a tutti gli alimenti per gli animali Principio I cloruri sono disciolti in acqua Se il prodotto contiene sostanze organi che si procede ad una chiarificazione La soluzione leggermente aci dificata con acido nitrico e i cloruri sono precipitati sotto forma di cloruro d argento a mezzo di una soluzione di nitrato d argento L ec cesso di nitrato d argento titolato median
269. sono costituiti da o sono prodotti a partire da organismi geneticamente modificati OGM gli additivi per mangimi come definiti dal regolamento CE n 1831 2003 del Parla mento europeo e del Consiglio le sostanze indesiderabili quali defi nite dalla direttiva 2002 32 CE del Parlamento europeo e del Consi glio 3 effettuato conformemente ai metodi di cui all allegato I Il metodo di campionamento di cui all allegato I applicabile per il controllo dei mangimi per quanto concerne la determinazione dei residui di antiparassitari quali definiti dal regolamento CE n 396 2005 del Parlamento europeo e del Consiglio 4 e il controllo della conformit al regolamento UE n 619 2011 vB Articolo 2 La preparazione dei campioni per l analisi e l espressione dei risultati sono conformi ai metodi indicati nell allegato II 39 del 24 12 2003 pag 78 68 del 18 10 2003 pag 29 40 del 30 5 2002 pag 10 0 del 16 3 2005 pag 1 Et SNET NU 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 5 Articolo 3 Le analisi per i controlli ufficiali degli alimenti per animali sono effet tuate secondo i metodi indicati nell allegato III Metodi di analisi per il controllo della composizione delle materie prime per alimenti per ani mali e degli alimenti composti nell allegato IV Metodi di analisi per il controllo del contenuto di additivi autorizzati negli alimenti per anima li nell allegato V Metodi di analisi per
270. sono proposte a titolo indicativo possibile operare in condizioni diverse purch si ottengano risultati equivalenti Colonna per cromatografia 300 mm x 4 mm C g particelle di riem liquida 4 4 1 pimento 10 um o equivalente Fase mobile 3 10 Miscela di soluzione tampone di acetato 3 9 e acetonitrile 3 2 825 175 v v Velocit di efflusso 1 5 2 ml min Lunghezza d onda di rive 365 nm lazione Volume di iniezione 20 pl Verificare la stabilit del sistema cromatografico iniettando pi volte la soluzione di taratura 3 11 2 contenente 5 0 ug ml fino a ottenimento di altezze del picco e tempi di ritenzione costanti Curva di taratura Iniettare pi volte ciascuna soluzione di taratura 3 11 2 e determinare le altezze aree del picco per ciascuna concentrazione Tracciare una curva di taratura riportando in ordinata le altezze aree medie del picco della soluzione di taratura e in ascissa le corrispondenti concentrazioni espresse in ug ml Soluzione del campione Iniettare pi volte l estratto del campione 5 3 2 per gli alimenti 5 2 2 per le premiscele e 5 2 3 per i preparati e determinare l altezza area media dei picchi del carbadox 6 1 6 2 Talli 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 163 Calcolo dei risultati Determinare la concentrazione della soluzione del campione in ug ml in base all altezza area media dei picchi del carbadox per riferimento alla curva di tar
271. spettro UV di questa soluzione su 2 propanolo 3 8 nello spettrofotometro 4 6 tra 300 nm e 400 nm Il massimo di estinzione deve situarsi tra 325 nm e 327 nm Calcolo del contenuto di vitamina A UI di vitamina A ml B335 x 18 3 El per l alcole di vitamina A 1821 a 325 nm in 2 propanolo cm Calcolo dei risultati Determinare la concentrazione della soluzione del campione in UI ml in base all altezza area media dei picchi della vitamina A per riferimento alla curva di taratura 5 6 2 72 73 7 4 TI 7 6 7 7 7 8 7 9 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 76 Il contenuto w di vitamina A in UI kg del campione dato dalla seguente formula 500 x c x Va x 1 000 Vixm UI kg dove le Il concentrazione di vitamina A nella soluzione del campione 5 4 in UI ml V volume della soluzione del campione 5 4 in ml V volume dell aliquota prelevata come indicato al punto 5 4 in ml m peso della quantit di sostanza da analizzare in grammi Osservazioni Per i campioni con scarsa concentrazione di vitamina A pu essere utile combinare gli estratti di etere di petrolio delle due saponificazioni quan tit pesata 25 g con una soluzione del campione per la determinazione HPLC Il campione prelevato per l analisi non contiene pi di 2 g di sostanze grasse Se non ha luogo la separazione di fase aggiungere circa 10 ml di etanolo 3 1 affinch l emuls
272. ssendo disponibile un numero sufficiente di frammenti di massa con intensit relativa gt 10 non raccomandato l uso di ioni qualificatori con intensit relativa inferiore al 10 rispetto allo ione bersaglio 2 4 Requisiti per le tecniche GC ECD Conferma dei risultati che oltrepassano la tolleranza con due colonne GC con fasi stazionarie di diversa polarit 3 Dimostrazione della performance del metodo La performance del metodo validata nel range del livello di interesse da 0 5 a 2 volte il livello di interesse con un coefficiente di variazione accettabile per le analisi ripetute cfr requisiti per la precisione interme dia al punto 8 4 Limite di quantificazione I valori del bianco non sono superiori al 30 del livello di contami nazione corrispondente al livello massimo di Controllo di qualit Controlli in bianco regolari analisi di campioni spiked campioni di controllo di qualit partecipazione a studi interlaboratorio su matrici rilevanti 1 altamente raccomandato un contributo inferiore del livello del bianco reagente al livello di un contaminante in un campione E compito del laboratorio controllare la variazione dei livelli del bianco in particolare se sono sottratti 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 132 YMI 6 Controllo dei recuperi 6 1 Sono utilizzati idonei standard interni con propriet fisico chimiche com parabili agli analiti di interesse 6 2 Aggiunta di
273. t ad esempio lt 250 g le dimensioni del campione elementare dipendono dalle dimensioni dell unit 9 2 1 Alimenti alla rinfusa Eventualmente si pu procedere al campionamento al momento della messa in movimento della partita da campionare carico o scarico 9 2 2 Alimenti in confezioni Dopo aver selezionato il numero prescritto di unit da campionare se condo quanto indicato nel capitolo 5 prelevare con una sonda o con una pala una parte del contenuto di ciascuna di tali unit All occorrenza svuotare separatamente le unit 9 2 3 Alimenti liquidi o semiliquidi omogenei o omogeneizzabili Dopo aver selezionato il numero prescritto di unit da campionare se condo quanto indicato nel capitolo 5 prelevare una parte del contenuto di ciascuna unit se necessario dopo omogeneizzazione I campioni elementari possono eventualmente essere prelevati al mo mento del travaso del prodotto 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 15 vm3 9 2 4 Alimenti liquidi o semiliquidi non omogeneizzabili Dopo aver selezionato il numero prescritto di unit da campionare se condo quanto indicato nel capitolo 5 prelevare i campioni a diversi livelli I campioni possono essere prelevati anche al momento del travaso del prodotto dopo eliminazione delle prime frazioni In entrambi i casi il volume totale dei prelievi non deve essere inferiore a 10 litri 9 2 5 Alimenti minerali formellati o mattonelle di sali miner
274. t e campo d applicazione I campioni destinati al controllo ufficiale dei livelli di policlorodibenzo p diossine PCDD policlorodibenzofurani PCDF policlorobifenili vmi 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 115 PCB diossina simili e PCB non diossina simili negli alimenti per animali sono prelevati secondo le disposizioni dell allegato I Si appli cano le prescrizioni quantitative relative al controllo delle sostanze o dei prodotti ripartiti in modo uniforme negli alimenti per animali di cui al punto 5 A dell allegato I I campioni globali cos ottenuti sono conside rati rappresentativi delle partite o sottopartite da cui sono prelevati Il rispetto dei livelli massimi fissati nella direttiva 2002 32 CE accertato in base ai livelli determinati nei campioni di laboratorio Ai fini di questa parte dell allegato V si applicano le definizioni figu ranti nell allegato I della decisione 2002 657 CE della Commissione del 14 agosto 2002 che attua la direttiva 96 23 CE del Consiglio relativa al rendimento dei metodi analitici e all interpretazione dei risultati 2 Conformit della partita o sottopartita alle specifiche PCB non diossina simili La partita conforme alle specifiche se il risultato analitico non supera il livello massimo di PCB non diossina simili 2002 32 CE tenendo conto dell incertezza di misura fissato dalla direttiva Tabella dei fattori di equivalenza tossica
275. t corri spondente a 2 3 del livello massimo cfr punto 8 3 pu essere calcolata direttamente a partire da questi campioni e utilizzata come valore di cut off Per il controllo dei campioni che superano le soglie d intervento il valore di cut off pu essere costituito da una percentuale appropriata di queste soglie d intervento vmi 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 126 8 1 3 Determinazione separata di PCDD PCDF e PCB diossina simili Gli estratti possono essere suddivisi in frazioni contenenti PCDD PCDF e PCB diossina simili il che permette un indicazione separata dei livelli TEQ in BEQ di PCDD PCDF e PCB diossina simili Per valutare i risultati per la frazione contenente PCB diossina simili da utilizzarsi di preferenza una curva di calibrazione standard del PCB 126 8 1 4 Recuperi apparenti del biodosaggio Il recupero apparente del biodosaggio calcolato a partire da idonei campioni di riferimento con pattern di congeneri rappresentativi attorno al livello di interesse ed espresso in percentuale del livello BEQ rispetto al livello TEQ A seconda del tipo di dosaggio e di TEF utilizzati le differenze tra fattori TEF e REP per i PCB diossina simili possono causare per i PCB diossina simili recuperi apparenti bassi rispetto ai PCDD PCDF Pertanto se eseguita una determinazione separata di PCDD PCDF e PCB diossina simili i recuperi apparenti del biodosaggio sono per i PCB diossina simili da
276. tare i rispettivi contenuti a 25 ml con la miscela di isopropanolo esano 3 1 Queste soluzioni saranno utilizzate come soluzione di riferimento Aggiungere 2 ml d anilina 3 4 negli altri due palloni Riscaldare per 30 minuti su bagno d acqua bollente per far sviluppare la colorazione Raf freddare a temperatura ambiente portare a 25 ml con miscela di iso propanolo esano 3 1 mescolare e lasciar riposare per un ora Determinare la densit ottica come indicato al punto 5 2 per il gossipolo libero Calcolare a partire da questo valore il contenuto in gossipolo totale come indicato al punto 6 Calcolo dei risultati Il calcolo dei risultati pu essere fatto sia in base alla densit ottica specifica 6 1 sia per riferimento a una curva di taratura 6 2 In base alla densit ottica specifica Nelle condizioni descritte le densit ottiche specifiche sono le seguenti 1 Gossipolo libero E 625 lem 1 Gossipolo totale E 600 lem Il contenuto di gossipolo libero o totale nel campione dato dalla formula seguente E x 1250 1 1cm gossipolo xpxa dove E densit ottica corretta determinata come indicato al punto 5 2 p quantit in g di sostanza analizzata a parte aliquota del filtrato espressa in ml In base a una curva di taratura Gossipolo libero Predisporre 2 serie di 5 palloni tarati da 25 ml In ogni serie pipettare rispettivamente 2 0 4 0 6 0 8 0 e 10 0 ml della soluz
277. tare poi con precauzione la stufa alla pressione atmosferica Aprire la stufa coprire immediatamente il recipiente con il coperchio estrarlo dalla stufa lasciarlo raffreddare per 30 45 minuti nell essiccatore 3 6 e pesare con l approssimazione di 1 mg Essiccare per altri 30 minuti nella stufa a vuoto alla temperatura di 80 85 C e pesare di nuovo La differenza tra le due pesate non deve superare lo 0 1 di umidit Preessiccazione Alimenti per animali diversi da quelli menzionati al punto 4 3 2 Gli alimenti solidi il cui contenuto di umidit elevato e rende difficile la macinazione devono essere preessiccati nel modo indicato di seguito Pesare con l approssimazione di 10 mg 50 g di prodotto non macinato un grossolano spezzettamento pu essere effettuato se necessario nel caso di alimenti compressi o agglomerati in un recipiente appropriato ad esempio una piastra di alluminio di 20 x 12 cm con bordo di 0 5 cm Lasciar essiccare in una stufa alla temperatura di 60 70 C sino a che il contenuto di umidit sia portato a un valore compreso tra 1 8 e il 12 Togliere dalla stufa lasciar raffreddare il prodotto non coperto nel laboratorio per un ora e pesare con l approssimazione di 10 mg Macinare subito dopo come indicato al punto 4 1 1 ed effettuare l essiccazione come indicato ai punti 4 2 1 o 4 2 3 secondo la natura dell alimento Cereali I cereali in granella aventi una percentuale di umidit superiore al 17
278. tare presente Estrazione Pesare con l approssimazione di 0 01 g circa 20 g del campione pre parato e trasferirli in una beuta da 250 ml Aggiungere 100 0 ml di soluzione di acido metansolfonico 3 4 e agitare in agitatore meccanico 4 1 per 30 minuti Filtrare la soluzione attraverso carta da filtro e conservare il filtrato per la fase di separazione liquido liquido 5 3 Separazione liquido liquido In un imbuto separatore da 500 ml contenente 100 ml di soluzione di acido cloridrico 3 5 trasferire 25 0 ml del filtrato ottenuto come de scritto al punto 5 2 Introdurre nell imbuto 100 ml di diclorometano 3 1 e agitare per 1 minuto Lasciare separare gli strati e versare lo 5 4 5 4 1 5 4 2 S 5 6 5 6 1 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 148 strato inferiore diclorometano in un pallone da 500 ml Ripetere l estra zione della fase acquosa con altri due volumi di 40 ml di diclorometano e riunirli con il primo estratto nel pallone a fondo arrotondato Evaporare a secchezza nell evaporatore rotante 4 2 l estratto di diclorometano a 40 C a pressione ridotta Sciogliere il residuo in 20 25 ml di metanolo 3 2 tappare il pallone e conservare tutto l estratto per la cromatografia a scambio ionico 5 4 Cromatografia a scambio ionico Preparazione della colonna a scambio cationico Inserire un tappo di lana di vetro nell estremit inferiore di una colonna di vetro 4 3 Preparare una sospensi
279. tata o granuli sono state individuate le particelle ani mali in quanto l individuazione di particelle animali soltanto nella frazione setacciata pu essere il segno di una contaminazione am bientale 215 3 Se sono state individuate una media di pi di 5 particelle animali di una data natura nel campione esaminato al microscopio ottico sono state indi viduate in media per determinazione pi di 5 particelle derivate da animali terrestri Le particelle sono state identificate come ossa cartilagine fibre muscolari peli corna Oppure secondo il caso nel campione esaminato al microscopio ottico sono state indi viduate in media per determinazione pi di 5 particelle derivate da pesci Le particelle sono state identificate come lisca scaglia cartilagine muscolo otolite branchia Se il campione stato sottoposto a presetacciamento il rapporto del laboratorio indica in quale frazione frazione setacciata fra zione pellettata o granuli sono state individuate le particelle ani mali in quanto l individuazione di particelle animali soltanto nella frazione setacciata pu essere il segno di una contaminazione am bientale 2 2 Reazione a catena della polimerasi PCR 2 2 1 Principio I frammenti di acido desossiribonucleico DNA di origine animale che possono essere presenti nelle materie prime per mangimi e nei mangimi composti sono individuati con una tecnica di amplifica zione genica
280. te 20 ul di ogni soluzione di taratura e determinare le altezze medie aree dei picchi Sulla base delle altezze medie aree dei picchi tracciare una curva di taratura Standardizzazione UV della soluzione madre di acetato di DL a tocoferolo 3 10 1 Diluire 5 0 ml della soluzione madre di acetato di DL a tocoferolo 3 10 1 sino a 25 0 ml con etanolo e misurare lo spettro UV di questa soluzione su etanolo 3 1 nello spettrofotometro 4 6 tra 250 e 320 nm Il massimo di assorbimento si situa a 284 nm E 43 6 a 284 nm in etanolo 1 cm A questa diluizione si deve ottenere un valore di estinzione compreso tra 0 84 e 0 88 5 6 2 5 6 2 1 5 6 2 2 5 6 2 3 TZ Midi 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 83 Standard di DL a tocoferolo Preparazione della soluzione standard di lavoro Trasferire con pipetta 2 ml della soluzione madre di DL a tocoferolo 3 11 1 in un matraccio tarato da 50 ml sciogliere in metanolo 3 3 e portare a volume con metanolo La concentrazione nominale di questa soluzione di 40 ug di DL a tocoferolo ml equivalente a 44 0 ug di acetato di DL a tocoferolo ml La soluzione standard di lavoro deve essere preparata al momento poco prima dell uso Preparazione delle soluzioni di taratura e della curva di taratura In una serie di matracci tarati da 20 ml trasferire 1 0 2 0 4 0 e 10 0 ml della soluzione standard di lavoro portare a volume con metanolo 3 3 e miscelare Le
281. te una soluzione di tiocianato di ammonio secondo il metodo Volhard Reattivi Soluzione di tiocianato di ammonio 0 1 mol l Soluzione di nitrato d argento 0 1 mol l Soluzione satura di bis solfato di ammonio e ferro NH4 Fe SO4 Acido nitrico densit 1 38 g ml Etere dietilico Acetone Soluzione di Carrez I sciogliere in acqua 21 9 g di acetato di zinco Zn CH3C00 2H 0 e 3 g di acido acetico glaciale Portare a 100 ml con acqua Soluzione di Carrez II sciogliere in acqua 10 6 g di ferrocianuro di potassio K4Fe CN g 3H 0 Portare a 100 ml con acqua Carbone attivo esente da cloruri e non assorbente cloro Apparecchiatura Agitatore rotativo a capovolgimento circa 35 40 giri al minuto Procedimento Preparazione della soluzione Secondo la natura del campione preparare una soluzione come indicato ai punti 5 1 1 5 1 2 o 5 1 3 Effettuare in parallelo una prova in bianco senza il campione da ana lizzare Campioni esenti da sostanze organiche Pesare con l approssimazione di 1 mg un campione di peso non supe riore a 10 g e contenente al massimo 3 g di cloro sotto forma di cloruri Introdurlo in un matraccio tarato da 500 ml con 400 ml di acqua a 20 C circa Agitare per 30 minuti con l agitatore rotativo portare a volume mescolare e filtrare Campioni contenenti materie organiche a ecce zione dei prodotti indicati al punto 5 1 3 Pesare con l approssimazione di 1 mg un quantitativo di campione di c
282. terminare il contenuto di vitamina A retinolo negli alimenti per animali e nelle premiscele La vitamina A comprende l alcole retinilico tutto trans e i suoi isomeri cis che vengono determinati con tale metodo Il contenuto di vitamina A espresso in unit interna zionali UI per kg Una UI corrisponde all attivit di 0 300 ug di alcole di vitamina A tutto trans oppure 0 344 ug di acetato di vitamina A tutto trans oppure 0 550 ug di palmitato di vitamina A tutto trans Il limite di quantificazione di 2 000 UI di vitamina A kg Principio Il campione viene idrolizzato con una soluzione etanolica di idrossido di potassio e la vitamina A viene estratta in etere di petrolio Il solvente rimosso per evaporazione e il residuo sciolto in metanolo e se neces sario diluito alla concentrazione richiesta Il contenuto di vitamina A determinato per cromatografia liquida ad alta prestazione a fase inversa RP HPLC utilizzando un rivelatore UV o a fluorescenza I parametri cromatografici sono scelti in modo che non vi sia separazione tra l alcole di vitamina A tutto trans e i suoi isomeri cis Reattivi Etanolo c 96 Etere di petrolio intervallo di ebollizione 40 60 C Metanolo Soluzione di idrossido di potassio c 50 g 100 ml Soluzione di ascorbato di sodio c 10 g 100 ml cfr osservazione al punto 7 7 Solfuro di sodio Na S x H30 x 7 9 Soluzione di solfuro di sodio c 0 5 mol l in glicerolo B 120 g l per
283. tivi Carbonato di calcio Acido cloridico P2 1 10 g ml 6 mol l circa Acido nitrico pay 1 045 g ml Acido nitrico po 1 38 1 42 g ml Acido solforico pz 1 84 g ml Reattivo vanado molibdico mescolare in un pallone tarato da 1 litro 200 ml di soluzione di eptamolibdato d ammonio 3 6 1 con 200 ml di soluzione di monovanadato d ammonio 3 6 2 e 134 ml di acido nitrico 3 4 Portare a volume con acqua Soluzione di eptamolibdato d ammonio sciogliere in acqua calda 100 g di eptamolibdato d ammonio NH4 6Mo0 0 4 4H30 Aggiungere 10 ml di ammoniaca densit 0 91 g ml e portare a 1 litro con acqua Soluzione di monovanadato di ammonio sciogliere 2 35 g di monova nadato di ammonio NH4VO in 400 ml di acqua calda Aggiungere lentamente sempre agitando 20 ml di acido nitrico diluito 7 ml di HNO 3 4 13 ml di H 0 e portare a 1 litro con acqua Soluzione tipo contenente 1 mg di fosforo per ml sciogliere in acqua 4 387 g di potassio diidrogeno fosfato KH POy Portare a 1 litro con acqua Apparecchiatura Crogioli da incenerimento di quarzo porcellana o platino Forno elettrico a muffola munito di termostato regolato a 550 C Matraccio di Kjeldahl da 250 ml Palloni tarati e pipette di precisione Spettrofotometro Tubi da saggio a tappo smerigliato diametro circa 16 mm a smeriglia tura normalizzata 14 5 mm capacit 25 30 ml Procedimento Preparazione della soluzione Secondo la natura del cam
284. to 3 24 Procedere come indicato al punto 5 3 3 9 33 33 32 5 4 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 39 Regolazione del pH Procedere conformemente al punto 5 3 3 1 o 5 3 3 2 alla regolazione del pH in funzione della tolleranza al sodio dell analizzatore di ammi noacidi 4 9 Per sistemi cromatografici 4 9 che richiedono una bassa concentrazione di sodio Quando si impiegano analizzatori di amminoacidi che richiedono una bassa concentrazione di sodio quando il volume dell acido deve essere ridotto consigliabile utilizzare una soluzione madre standard interna 3 27 3 In questo caso aggiungere 2 00 ml della soluzione standard interna 3 27 3 all idrolizzato prima dell evaporazione Aggiungere 2 gocce di l ottanolo 3 15 all idrolizzato ottenuto confor memente alla procedura di cui al punto 5 3 2 3 o 5 3 2 4 Utilizzando un evaporatore rotante 4 7 ridurre il volume a 5 10 ml sotto vuoto a 40 C Se il volume viene ridotto accidentalmente a meno di 5 ml scartare l idrolizzato e ricominciare l analisi Portare il pH a 2 20 con soluzione di idrossido di sodio 3 18 e pro cedere conformemente al punto 5 3 4 Per tutti gli altri analizzatori di amminoacidi 4 9 Neutralizzare parzialmente gli idrolizzati ottenuti conformemente al punto 5 3 2 3 o 5 3 2 4 aggiungendovi con cautela sempre agitando 17 ml di soluzione di idrossido di sodio 3 17 facendo attenzione che la temperatura rim
285. to da 50 ml 27 9 mg d acetato di gossipolo sciogliere e portare a volume con il solvente B 3 3 La concentrazione di gossipolo in questa soluzione di 0 5 mg ml Le soluzioni tipo A e B di gossipolo restano stabili per 24 ore se sono conservate al buio 4 Apparecchiatura 4 1 Agitatore rotativo a capovolgimento circa 35 giri al minuto 5 2 5 3 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 112 Spettrofotometro Procedimento Quantit di sostanza da sottoporre all analisi La quantit di sostanza da sottoporre all analisi proporzionale al pre sunto contenuto di gossipolo nel campione preferibile operare su una piccola quantit di sostanza e su una parte aliquota del filtrato relativa mente importante in modo da ottenere una quantit di gossipolo suffi ciente per effettuare una misura spettofotometrica precisa Per la deter minazione del gossipolo libero nei semi nelle farine e nei panelli di cotone la quantit di sostanza da sottoporre all analisi non supera 1 g per gli alimenti composti potr arrivare sino a 5 g Una parte aliquota di 10 ml di filtrato sufficiente nella maggioranza dei casi essa conterr da 50 a 100 ug di gossipolo Per la determinazione del gossipolo totale la quantit di sostanza da sottoporre ad analisi varier da 0 5 a 5 g in modo che una parte aliquota di 2 ml di filtrato contenga da 40 a 200 ug di gossipolo Effettuare l analisi a una temperatura ambiente di circa 20
286. to nella prova in bianco V volume ml di acido cloridrico usato per la quantit di sostanza sottoposta all analisi Titolazione con acido solforico Calcolare il tenore di proteine gregge espresso in percentuale di peso con la formula seguente Vi Vo x c x 2 8 x 6 25 m 72 8 2 8 3 8 4 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 29 dove m peso g della quantit di sostanza sottoposta all analisi c concentrazione mol l della soluzione volumetrica standard di acido solforico 3 6 Vo volume ml di acido solforico usato per la prova in bianco V volume ml di acido solforico 3 6 usato per la quantit di so stanza sottoposta all analisi Verifica del metodo Ripetibilit La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione non deve superare lo 0 2 in valore assoluto per i contenuti di proteine gregge infe riori al 20 l 1 0 rispetto al valore pi elevato per i contenuti di proteine gregge compresi fra il 20 e il 40 lo 0 4 in valore assoluto per i contenuti di proteine gregge supe riori al 40 Precisione Eseguire l analisi mineralizzazione distillazione e titolazione su 1 5 2 0 g di acetanilide 3 13 in presenza di 1 g di saccarosio 3 14 1 g di acetanilide consuma 14 80 ml di acido solforico 3 5 Il recupero deve essere almeno del 99 Osservazioni L apparecchiatura pu
287. tre con una risposta al di sotto del working range quindi calcolato a partire da campioni contenenti i composti bersaglio attorno al livello minimo richiesto e non da un rapporto S R o un dosaggio bianco 6 5 2 Il limite di quantificazione per un metodo di conferma dell ordine di circa un quinto del livello di interesse 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 122 vmi 6 6 Criteri analitici Affinch i metodi di conferma o di screening diano risultati affidabili devono essere soddisfatti i seguenti criteri rispettivamente per il valore TEQ e il valore BEQ determinati come TEQ totale somma di PCDD PCDF e PCB diossina simili o separatamente per PCDD PCDF e PCB diossina simili Screening con metodi bioanalitici o fisico chi Metodi di conferma mici Percentuale di falsi con lt 5 formi Esattezza da 20 a 20 Ripetibilit RSD lt 20 Riproducibilit in labo lt 25 lt 15 ratorio RSDR rispetto ai livelli massimi 6 7 Prescrizioni specifiche per i metodi di screening 6 7 1 Per lo screening possono essere utilizzati metodi GC MS e metodi bioa nalitici Per i metodi GC MS valgono le prescrizioni indicate al punto 7 Per i metodi bioanalitici cellulari valgono le prescrizioni specifiche in dicate al punto 8 6 7 2 I laboratori che applicano metodi di screening per il controllo di routine dei campioni instaurano una stretta cooperazione con i laboratori che applicano il
288. triptofano 0 457g kg L 12 12 n 55 60 Media g kg 0 391 0 931 s g kg 0 005 0 012 r g kg 0 014 0 034 CV 1 34 1 34 Sr g kg 0 018 0 048 R g kg 0 050 0 134 CVr 4 71 5 11 L numero di laboratori che hanno trasmesso risultati n numero di risultati individuali considerati una volta eliminati gli outlier valori aberranti identificati in base al test di Cochran Dixon sr deviazione standard della ripetibilit Sg deviazione standard della riproducibilit r ripetibilit R riproducibilit CV coefficiente di variazione della ripetibilit in coefficiente di variazione della riproducibilit in Q lt w 92 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 48 stato effettuato un altro studio di intercomparazione comunitario in cui sono stati analizzati quattro campioni da 7 laboratori ai fini della certi ficazione del triptofano per idrolisi Ogni campione stato analizzato cinque volte I risultati sono stati i seguenti Campione 2 Campione 1 Campione 4 Farina di pe Alimento p Campione 3 Latte scre sce a basso composto per k Farina di soia mato in pol P P tenore di P suini i CRM 119 vere grassi CRM 117 CRM 118 CRM 120 L 7 n 30 Media g kg 5 236 sr g kg 0 040 r g kg 0 112 CVr 0 76 Sr g kg 0 221 R g kg 0 619 CVr 4 22 L numero di laboratori che hanno trasmesso risultati n numero di risultati individuali considerati
289. trodurre 8 2 ml di HCl 3 7 in circa 900 ml d acqua e miscelare aggiungere 20 ml di tiodiglicolo 3 9 e portare a 1 litro con acqua non miscelare direttamente le sostanze di cui ai punti 3 7 e 3 9 Acido 5 solfosalicilico p 6 sciogliere 60 g di acido 5 solfosalicilico 3 6 in acqua e portare a 1 litro con acqua Miscela di ossidazione acido performico fenolo miscelare 0 5 ml di perossido di idrogeno 3 1 con 4 5 ml di soluzione di acido formico e fenolo 3 19 in un piccolo becher Tenere in incu bazione a 20 30 C per un ora per ottenere acido performico lasciare raffreddare su un bagno di acqua gelata 15 min prima di aggiungere il campione Attenzione evitare il contatto con la pelle e indossare indumenti di protezione Tampone citrato c Nat 0 2 mol l pH 2 20 sciogliere 19 61 g di citrato di sodio 3 8 5 ml di tiodiglicole 3 9 1 g di fenolo 3 3 e 16 50 ml di HCI 3 7 in cira 800 ml d acqua Portare il pH a 2 20 Portare a 1 litro con acqua Tamponi di eluizione preparati conformemente alle prescrizioni relative all analizzatore 4 9 Reattivo alla ninidrina preparato conformemente alle prescrizioni relative all analizzatore 4 9 Soluzioni standard di amminoacidi Conservare queste soluzioni a tem peratura inferiore a 5 C 3 24 11 3 32 3353 3 27 4 3 27 5 4 2 4 3 44 4 5 4 6 4 7 4 8 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 36 Soluzion
290. ttino le procedure appropriate in materia di qualit e l analisi serva unicamente a verificare la conformit alle norme giuridiche pertinenti il risultato dell analisi pu essere presentato senza correzioni per il recu pero e in questo caso il tasso di recupero e l incertezza della misura possono essere omessi 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 21 ALLEGATO III METODI DI ANALISI PER IL CONTROLLO DELLA COMPOSIZIONE DELLE MATERIE PRIME PER ALIMENTI PER ANIMALI E DEGLI 322 3 3 3 4 3 5 3 6 ALIMENTI COMPOSTI A DETERMINAZIONE DELL UMIDIT Finalit e campo d applicazione Il metodo consente di determinare il contenuto di umidit degli alimenti per animali Nel caso degli alimenti contenenti sostanze volatili ad esempio acidi organici va osservato che oltre al contenuto di umidit si rileva anche un importante presenza di materie volatili Il metodo non riguarda l analisi dei prodotti lattieri in quanto materie prime per alimenti per animali delle sostanze minerali e miscele essen zialmente composte di sostanze minerali l analisi dei grassi e oli vege tali n quella dei semi e frutti oleaginosi Principio Il campione sottoposto a essiccazione in condizioni ben definite va rianti in funzione della natura dell alimento La perdita di peso deter minata per pesata necessario procedere a una preessiccazione quando si tratta di alimenti solidi aventi un elevato contenuto d
291. uS Perossido d idrogeno p p p 30 Acido formico p p p 98 100 Fenolo Metabisolfito di sodio Idrossido di sodio Acido 5 solfosalicilico diidrato Acido cloridrico densit circa 1 18 g ml Citrato trisodico diidrato 2 2 Tiodietanolo tiodiglicole Cloruro di sodio Ninidrina Etere di petrolio intervallo di ebollizione 40 60 C Norleucina o altro composto adatto ad essere utilizzato come standard interno 3 16 1 3 16 2 3 16 3 3 20 3 21 3 22 329 3 24 3 25 3 26 3 27 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 35 Azoto gassoso lt 10 ppm di ossigeno 1 Ottanolo Amminoacidi Sostanze di riferimento elencate al punto 1 Composti puri non conte nenti acqua di cristallizzazione Essiccare sotto vuoto su P 05 o H504 per una settimana prima dell uso Acido cisteico Metionina sulfone Soluzione di idrossido di sodio c 7 5 mol l sciogliere 300 g di NaOH 3 5 in acqua e portare a 1 litro Soluzione di idrossido di sodio c 1 mol l sciogliere 40 g di NaOH 3 5 in acqua e portare a 1 litro Soluzione di acido formico fenolo miscelare 889 g di acido formico 3 2 con 111 g d acqua e aggiungere 4 73 g di fenolo 3 3 Miscela di idrolisi c HC1 6 mol l contenente 1 g di fenolo aggiungere 1 g di fenolo 3 3 a 492 ml di HCI 3 7 e portare a 1 litro con acqua Miscela di estrazione c HCI 0 1 mol l contenente 2 di tiodiglicole in
292. uando l unit di distillazione interamente automatizzata anche per quanto riguarda la titolazione del tenore di ammoniaca del distillato seguire le istruzioni d uso di tale unit fornite dal fabbricante Collocare un matraccio collettore contenente 25 30 ml della soluzione di acido borico 3 18 alla bocca d uscita del refrigerante in modo che il tubo di evacuazione si trovi al di sotto della superficie dell eccesso di soluzione di acido borico Regolare l unit di distillazione per ottenere 50 ml di soluzione di idrossido di sodio 3 9 Far funzionare l unit di distillazione conformemente alle istruzioni fornite dal fabbricante ed eliminare l ammoniaca liberatasi per distillazione aggiungendo la solu zione di idrossido di sodio Raccogliere il distillato nella soluzione di acido borico La quantit di distillato tempo di distillazione in corrente di vapore dipende dal tenore di azoto nel campione Seguire le indica zioni fornite dal fabbricante Nota In un unit di distillazione semiautomatica l aggiunta di eccesso di idrossido di sodio e la distillazione in corrente di vapore avven gono automaticamente Titolazione Procedere conformemente al punto 5 3 1 o 5 3 2 Acido solforico Titolare l eccesso di acido solforico nel matraccio collettore per mezzo di una soluzione d idrossido di sodio 3 10 o 3 11 secondo la concentra zione dell acido solforico usato sino a raggiungere il punto finale Acido borico Titolare il
293. uate 1 vetrino da flottato Lia sn 1 vetrino da flottato o materia prima ripetizione dell analisi o materia prima lt 0 25 mm secondo il punto 2 1 4 3 particelle di animali particelle di animali terrestri individuate terrestri individuate campione dichiarato secondo il punto 2 1 5 1 per gli ANIMALI TERRESTRI 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 141 vm 2 1 4 3 Numero di determinazioni Se a seguito di una prima determinazione effettuata secondo il protocollo di osservazione figurante nel diagramma 1 o nel dia gramma 2 secondo il caso non sono individuate particelle animali di una data natura animale terrestre o pesce non necessaria una determinazione aggiuntiva e il risultato dell analisi espresso uti lizzando la frase indicata al punto 2 1 5 1 Se a seguito di una prima determinazione effettuata secondo i protocolli di osservazione figuranti secondo il caso nel diagramma 1 o nel diagramma 2 il numero totale delle particelle animale di una data natura animale terrestre o pesce individuate compreso tra 1 e 5 effettuata una seconda determinazione a partire da un nuovo sottocampione di 50 g Se a seguito di questa seconda determinazione il numero delle particelle animali della data natura individuate compreso tra 0 e 5 il risultato dell analisi espresso utilizzando la frase indicata al punto 2 1 5 2 in caso contrario effettuata una terza determinazione a partire da un nuovo s
294. un piccolo tubo in materiale infrangi bile contenente 10 ml di acido cloridrico 3 1 e collegare il recipiente all apparecchio Girare il rubinetto a tre vie 5 in modo che il tubo 1 comunichi con l esterno Per mezzo del tubo mobile 2 che riempito di acido solforico colorato 3 3 ed collegato al tubo tarato 1 portare il livello del liquido alla gradazione zero Girare il rubinetto 5 in modo da far comunicare i tubi 1 e 3 e verificare se il livello a zero Versare lentamente l acido cloridrico 3 1 sulla sostanza inclinando il recipiente 4 Pareggiare la pressione abbassando il tubo 2 Agitare il recipiente 4 fino a cessazione completa dell emissione di anidride car bonica Ristabilire la pressione riportando il liquido allo stesso livello nei tubi 1 e 2 Eseguire la lettura dopo qualche minuto quando il volume gassoso divenuto costante Effettuare nelle stesse condizioni una prova comparativa su 0 5 g di carbonato di calcio 3 2 72 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 66 Calcolo dei risultati Il contenuto di carbonati espressi in carbonato di calcio dato dalla seguente formula V x 100 Ga Vi x 2m dove X p p di carbonati presenti nel campione espressi come carbonati di calcio V ml di CO liberati dalla quantit di sostanza sottoposta all analisi Vj ml di CO liberati da 0 5 g di CaCO m peso in g della sostanza sottoposta ad analisi Osservazioni
295. unito di un foro del diametro di circa 6 cm sulla quale stata pre ventivamente accesa una fiamma Questa regolata in modo tale che venga riscaldato soltanto il fondo dell erlenmeyer Adattare sull erlenme yer un refrigerante a riflusso A decorrere da questo momento far bollire per 10 minuti esatti Raffreddare immediatamente in acqua fredda e dopo circa 5 minuti titolare nel seguente modo aggiungere 10 ml di soluzione di ioduro di potassio 3 6 e subito dopo con molta attenzione a causa del rischio di formazione di abbondante schiuma 25 ml di acido solforico 3 7 Titolare quindi con la soluzione di tiosolfato di sodio 3 8 sino all apparire di una colorazione giallo opaco aggiungere l indicatore all amido 3 10 e terminare la titolazione Effettuare la stessa titolazione su di una miscela esattamente misurata di 25 ml di reattivo di Luff Schoorl 3 4 e 25 ml d acqua dopo aver aggiunto 10 ml di soluzione di ioduro di potassio 3 6 e 25 ml di acido solforico 3 7 senza portare a ebollizione Calcolo dei risultati Stabilire a mezzo della tabella allegata la quantit di lattosio in mg corrispondente alla differenza tra i risultati delle due titolazioni espressi in ml di tiosolfato di sodio 0 1 mol l Esprimere il risultato in percentuale del lattosio anidro del campione Osservazione Per i prodotti contenenti pi del 40 di zuccheri fermentescibili uti lizzare pi di 5 ml di sospensione di lievito 3 1
296. uro di potassio in 100 ml di acqua e aggiungere 1 g di iodio agitando ripetutamente 2 1 2 1 4 2 Reagente cistina 2 g di acetato di piombo 10 g di NaOH 100 ml di acqua 2 1 2 1 4 3 Reagente di Fehling preparato prima dell uso da parti eguali 1 1 di due soluzioni madre A e B Soluzione A sciogliere 6 9 g di solfato di rame II pentaidrato in 100 ml di acqua Soluzione B sciogliere 34 6 g di tartrato di potassio e di sodio tetraidrato e 12 g di NaOH in 100 ml di acqua 2 1 2 1 4 4 Tetrametilbenzidina perossido di idrogeno sciogliere 1 g di 3 3 5 5 tetrametilbenzidina TMB in 100 ml di acido acetico glaciale e 150 ml di acqua Prima dell uso mescolare 4 parti di questa so luzione di TMB con 1 parte di perossido di idrogeno al 3 212 15 Agenti di risciacquo 2 1 2 1 5 1 Etanolo gt 96 per analisi 2 1 2 1 5 2 Acetone per analisi 2 1 2 1 6 Reagente sbiancante 2 1 2 1 6 1 Soluzione di ipoclorito di sodio in commercio 9 14 di cloro attivo 2 1 2 2 Attrezzature 2 1 22 1 Bilancia analitica con precisione di 0 001 g 2 12 22 Apparecchiatura per macinazione mulino o mortaio 2 1 2 2 3 Setacci a maglie quadrate di 0 25 mm e 1 mm di larghezza 2 12 24 Imbuto separatore conico di vetro con capacit di 250 ml munito di rubinetto in teflon o vetro smerigliato alla base del cono Il diame tro dell apertura del rubinetto deve essere di almeno 4 mm In alternativa pu essere utilizzato un decantatore a fond
297. x 9 cfr osservazione al punto 7 8 Soluzione di fenolftaleina c 2 g 100 ml in etanolo 3 1 2 propanolo Fase mobile per HPLC miscela di metanolo 3 3 e acqua ad esempio 980 20 v v Il rapporto esatto sar determinato dalle caratteristiche della colonna utilizzata Azoto senza ossigeno Acetato di vitamina A tutto trans purissimo di attivit certificata ad esempio 2 80 x 106 UI g Soluzione madre di acetato di vitamina A tutto trans in un matraccio tarato da 100 ml pesare con l approssimazione di 0 1 mg 50 mg di acetato di vitamina A 3 11 Sciogliere in 2 propanolo 3 8 e portare a volume con lo stesso solvente La concentrazione nominale di questa soluzione 1 400 UI di vitamina A ml Il contenuto esatto deve essere determinato conformemente al punto 5 6 3 1 Palmitato di vitamina A tutto trans purissimo di attivit certificata ad esempio 1 80 x 105UI g 3 12 1 4 2 4 2 1 4 2 2 4 2 3 4 2 4 4 3 4 4 4 5 4 5 1 4 6 4 7 4 8 4 8 1 4 8 2 5 1 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 72 Soluzione madre di palmitato di vitamina A tutto trans in un matraccio tarato da 100 ml pesare con l approssimazione di 0 1 mg 80 mg di palmitato di vitamina A 3 12 Sciogliere in 2 propanolo 3 8 e portare a volume con lo stesso solvente La concentrazione nominale di questa soluzione 1400 UI di vitamina A ml Il contenuto esatto deve essere determinato
298. za area media dei picchi della robenidina Calcolo dei risultati Determinare la concentrazione della soluzione del campione in ug ml in base all altezza area media dei picchi della robenidina per riferimento alla curva di taratura 5 4 2 Il contenuto di robenidina w mg kg del campione dato dalla se guente formula cx 200 w m dove c concentrazione di robenidina nella soluzione del campione in ug ml m peso della quantit di sostanza da analizzare in grammi TL2 12 73 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 99 Convalida dei risultati Identit L identit dell analita pu essere confermata mediante co cromatografia oppure mediante un rivelatore a serie di diodi che permetta di confron tare gli spettri dell estratto del campione e della soluzione di taratura 3 9 3 contenente 6 ug ml Co cromatografia Un estratto del campione viene rinforzato mediante aggiunta di un quantitativo adeguato della soluzione di taratura 3 9 3 Il quantitativo di robenidina addizionato deve essere analogo a quello stimato di robeni dina rilevato nell estratto del campione Deve aumentare soltanto l altezza del picco della robenidina tenuto conto sia della quantit di robenidina addizionata che della diluizione dell estratto L ampiezza del picco a met della sua altezza massima deve corrispondere con uno scostamento massimo del 10 all am piezza originale Rivelazione a serie di diod
299. zione dei costituenti di origine animale nell ambito del controllo ufficiale degli alimenti per animali 2 Dal momento che la direttiva 70 373 CEE stata sostituita dal regolamento CE n 882 2004 opportuno sostituire i provvedi menti attuativi di tale direttiva con un regolamento unico Al contempo vanno adeguate le metodiche tenendo conto degli svi luppi delle conoscenze in campo scientifico e tecnologico I me todi non pi validi per i fini previsti vanno soppressi E previsto l aggiornamento a tempo debito delle disposizioni relative al cam pionamento al fine di tener conto degli ultimi sviluppi nel campo della produzione dell immagazzinamento del trasporto e della commercializzazione degli alimenti per animali ma opportuno per il momento mantenere le disposizioni vigenti in materia 3 Occorre di conseguenza abrogare le direttive 71 250 CEE 71 393 CEE 72 199 CEE 73 46 CEE 76 371 CEE 76 372 CEE 78 633 CEE 81 715 CEE 84 425 CEE 86 174 CEE 93 70 CEE 93 117 CE 98 64 CE 1999 27 CE 1999 76 CE 2000 45 CE 2002 70 CE e 2003 126 CE 4 Le misure di cui al presente regolamento sono conformi al parere del comitato permanente per la catena alimentare e la salute degli animali HA ADOTTATO IL PRESENTE REGOLAMENTO vm3 Articolo 1 Il campionamento per il controllo ufficiale degli alimenti per animali in particolare per quanto concerne la determinazione dei costituenti com presi i materiali che contengono o
300. zione per escludere la possibilit di una contaminazione crociata interna o di uno scambio accidentale dei campioni La media delle due determinazioni che tiene conto dell incertezza di misura utilizzata per verificare la conformit In alcuni casi il margine di variazione accettabile definito da norme quali il regolamento CE n 767 2009 del Parlamento europeo e del Consiglio del 13 luglio 2009 sull immissione sul mercato e sull uso dei mangimi che modifica il regolamento CE n 1831 2003 del Par lamento europeo e del Consiglio e che abroga le direttive 79 373 CEE del Consiglio 80 511 CEE della Commissione 82 471 CEE del Consi glio 83 228 CEE del Consiglio 93 74 CEE del Consiglio 93 113 CE del Consiglio e 96 25 CE del Consiglio e la decisione 2004 217 CE della Commissione 4 Comunicazione del metodo di analisi applicato Il rapporto di prova deve indicare il metodo di analisi applicato 5 Comunicazione dei risultati dell analisi Il risultato deve essere espresso secondo le indicazioni fornite nel me todo di analisi con un numero appropriato di cifre significative e ove necessario corretto in funzione del contenuto di umidit del campione finale prima della sua preparazione GU L 229 dell 1 9 2009 pag 1 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 20 vm3 6 Incertezza di misura e tasso di recupero in caso di analisi di sostanze indesiderabili Per quanto riguarda le sostanze indesi
301. zione del triptofano n degli analoghi idrossilati degli am minoacidi Principio Amminoacidi liberi Gli amminoacidi liberi sono estratti con acido cloridrico diluito Le macromolecole azotate coestratte vengono fatte precipitare con acido solfosalicilico e vengono rimosse per filtrazione La soluzione filtrata viene portata a pH 2 20 Gli amminoacidi sono separati mediante cro matografia a scambio ionico e determinati per reazione con la ninidrina e con rivelazione fotometrica a 570 nm Amminoacidi totali La scelta della procedura dipende dagli amminoacidi oggetto dell analisi Cist e ina e metionina devono essere ossidate ad acido cisteico e al metionina sulfone prima dell idrolisi La tirosina deve essere determinata in idrolizzati di campioni non ossidati Tutti gli altri amminoacidi elen cati al punto 1 possono essere determinati sia nel campione ossidato sia in quello non ossidato L ossidazione viene eseguita a 0 C con una miscela di acido performico e di fenolo L eccesso del reagente di ossidazione viene decomposto con metabisolfito di sodio Il campione ossidato o non ossidato idrolizzato con acido cloridrico 3 20 per 23 ore L idrolizzato regolato a pH 2 20 Gli amminoacidi sono separati mediante cromatografia a scambio ionico e determinati per reazione con la ninidrina e con rivelazione fotometrica a 570 nm 440 nm per la prolina Reattivi Usare acqua bidistillata o di qualit equivalente conduttivit lt 10
302. zione di Carrez II sciogliere nell acqua 10 6 g di ferrocianuro di potassio K4Fe CN 3H30 Portare a 100 ml con acqua Soluzione allo 0 1 p v di metilarancio Acido cloridrico 4 mol l Acido cloridrico 0 1 mol l 31 3 8 3 8 1 3 8 2 3 8 3 3 9 5 1 5 2 5 3 2009R0152 IT 01 01 2014 003 001 55 Soluzione di idrossido di sodio 0 1 mol l Reattivo di Luff Schoorl aggiungere agitando prudentemente la soluzione d acido citrico 3 8 2 alla soluzione di carbonato di sodio 3 8 3 Aggiungere quindi la solu zione di solfato di rame 3 8 1 e portare al volume di 1 litro con acqua Lasciar riposare una notte e filtrare Controllare la concentrazione del reattivo cos ottenuto Cu 0 05 mol l Na CO 1 mol l cfr punto 5 4 ultimo capoverso Il pH della solu zione circa 9 4 Soluzione di solfato di rame sciogliere 25 g di solfato di rame Cu SO 5H30 esente da ferro in 100 ml d acqua Soluzione di acido citrico sciogliere 50 g di acido citrico CoHgO7 H30 in 50 ml d acqua Soluzione di carbonato di sodio sciogliere 143 8 g di carbonato di sodio anidro in circa 300 ml d acqua calda Lasciar raffreddare Soluzione di tiosolfato di sodio 0 1 mol l Soluzione d amido aggiungere una miscela di 5 g di amido solubile in 30 ml d acqua a 1 litro d acqua bollente Far bollire per 3 minuti lasciar raffreddare aggiungere eventualmente come conservante 10 mg di io duro di
303. zione standard della ripetibilit Sg deviazione standard della riproducibilit CV coefficiente di variazione della ripetibilit CVR coefficiente di variazione della riproducibilit Osservazione Anche se il metodo non stato convalidato per alimenti contenenti quantit superiori a 100 mg kg di olaquindox possibile ottenere risul tati soddisfacenti pesando una quantit di campione pi piccola e o diluendo l estratto 5 2 fino a ottenere una concentrazione entro il campo della curva di taratura C DETERMINAZIONE DELL AMPROLIUM Cloridrato di cloruro di 1 4 ammino 2 propil 5 pirimidinil metil 2 picolinio Finalit e campo d applicazione Il metodo consente di determinare il contenuto di amprolium negli ali menti per animali e nelle premiscele Il limite di rilevazione di 1 mg kg la soglia di quantificazione di 5 mg kg Principio Il campione estratto con una miscela metanolo acqua Dopo diluizione con la fase mobile e filtrazione per membrana il contenuto di ampro lium determinato per cromatografia in fase liquida ad alta prestazione HPLC a scambio cationico utilizzando un rivelatore UV Reattivi Metanolo Acetonitrile di qualit HPLC Acqua di qualit HPLC Soluzione di fosfato monosodico c 0 1 mol l In un matraccio tarato da 1 000 ml sciogliere 13 80 g di fosfato mono sodico monoidrato in acqua 3 3 portare a volume con acqua 3 3 e mescolare Soluzione di perclorato sodic

B REGOLAMENTO (CE) N. 152/2009 DELLA COMMISSIONE del 27

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