quanty enterovirus (5`UTR region)
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1. 20139 Milano Tel 39 0 2 56814413 fax 39 0 2 56814515 www clonit it info clonit it CE mo for in vitro diagnostic use ST RT33 ITA 1 Stampata il 7 Aprile 20152. AW2 Close the cap and centrifuge at full speed 20 000 x g 14 000 rpm for 3 min Place the spin column in a new 1 5 ml collection tube not provided and discard the old collection tube with the filtrate 12 add 50 I of buffer AVE equilibrated to room temperature Close the cap and incubate at room temperature for 1 min Centrifuge at 6000 x g 8000 rpm for 1 min Samples are now ready for amplification or storage at 20 C SOFTWARE SETTING Lifetechnologies 7500 fast Turn the instrument and the computer on and open the control software Click on Advance Setup by default the sofware will shows the page experiment properties Write in the experiment name the file name choose the type of instrument 7500 o 7500fast the type of reaction quantitation standard curve the type of used reagent Taqman Reagents and the reaction time of analysis Standard 2 hours to complete a run Open the page named page setup sheet Define Target and Samples In the window Define Targets set munnasananananianananinaanenenaaneianesnanannananisiananisnineaneninanInasnanenasnanene nnananassanaeganananananeneananineananisnananeneananianananinananqanessn0a saneneneneeneeeneeneneneeneeeeeeneEeeeeneny Enterovirus probe i internal Control IC probe ii Cee AMRA cai Set the samples name in the window Define Samples In the same page plate setup select the sheet Assign Target and Samples On t
3. UTR of the virus in serial dilutions eee e I rt replicate positive nee 10 0 0 793 10 oe 90 O E A E es eni i de iG PAR ae e ne oeee a Le O A i 0008 O E lr lrn 10 0 Analytical sensitivity of quanty enterovirus determined by Probit analysis is 0 70 copies ul 95 confidence interval Cl 0 24cps ul 8 32cps ul Clinical sensitivity It is considered as clinical sensitivity the ability to detect true positive samples in the totality of the samples screened as positive The analysis was made on Enterovirus positive samples and the test was performed following the method recommendations Positive samples were confirmed with an other CE approved method available on the market Obtained results show a Clinical sensitivity of 100 Traceability versus controls material Enterovirus 71 RNA Control Vircell To validate the traceability of the quanty enterovirus versus Enterovirus 71 RNA Control Vircell reference material The used control Enterovirus 71 RNA Control Vircell date revised 05 2012 1 vial with lyophilized RNA of Enterovirus 71 BrCr strain ATCC VR 784 the concentration will be more than 12500 copie ul once reconstituted Founded Average Awaited Pe FI Rte TO CO IC eee eee Oc CONC eam Manual Log 3 64 Log 4 09 siriani QCMD 2015 RNA Programme EQA Panel Challenge 1 quanty enterovirus was checked versus QCMD 2015 RNA Programme EQA Panel Challenge 1 Linearity Proport
4. correspondent in the dropdown menu Samples you can select the type of sample being analyzed Select Standards Enter the concentrations of the controls Select the location where you placed the Negative Control and name it as Negative Control Clicking on the box next to Type correspondent in the dropdown menu Samples you can select the type of sample being analyzed Select Negative Controls Select the location of each sample and enter the name or code of the patient Clicking on the box next to Type correspondent in the dropdown menu Samples you can select the type of sample being analyzed Select UnKnown At the end of the operation click OK in the edit samples and wait until the end of the race for the analysis see Interpretation of Results CFX96 Real Time PCR Turn the instrument and the computer on and start the control software In the principal screen will appear the window Startup wizard select CFX96 and press ok In the next window push create new and set the thermal protocol and the reaction volume 30pl Save the protocol and click the next button The software will open in default the sheet plate Click create new select Fluorophores button to choose fluorophores FAM and VIC Select the locations where they were positioned the controls of known concentration and choose the Sample Type Standards Click Load check boxes to load fluorophores and Typ
5. due volte dovrebbe essere evitati in quanto questo potrebbe influire sulle prestazioni del test reagenti devono essere congelati in aliquote se devono essere utilizzati in modo intermittente PROCEDURA ANALITICA Estrazione Manuale EX16 Estrazione di RNA virale da plasma siero urine o tampone 1 aggiungere 310 1 di buffer AVE alla provetta contenente il Lyophilized carrier RNA Sciogliere il carrier RNA suddividerlo in aliquote e conservarle a 20 C Non congelare scongelare le aliquote di carrier RNA pi di 3 volte 2 controllare che nel buffer AVL non vi sia del precipitato altrimenti incubare a 80 C per scioglierlo Calcolare il volume del mix buffer AVL carrier RNA che serve per i campioni da estrarre n x 0 56 ml y ml y mix 10 l m zel dove n numero di campioni da estrarre y volume di buffer AVL da utilizzare z volume di carrier RNA buffer AVE da aggiungere al buffer AVL Miscelare invertendo la provetta per 10 volte Non vortexare per evitare la formazione di schiuma Buffer AVL carrier RNA deve essere preparato fresco ed stabile per 48 ore a 2 8 C Questa soluzione forma un precipitato se conservato a 2 8 C e deve essere sciolto scaldando la soluzione a 80 C prima dell uso Non scaldare tale soluzione pi di 6 volte e non mantenere la soluzione a 80 C per pi di 5 minuti Frequenti riscaldamenti prolungati possono causare la degradazione del carrier RNA riducendo la resa dell estrazi
6. 1 i 95 2min Estensine a A DG WS seo i COSO 72 C 19 880 Salvare il protocollo termico e cliccare Next Il software aprir automaticamente la pagina Plate Premere create new premere il bottone Fluorophores button per selezionare i fluorofori corretti FAM and VIC Selezionare i pozzetti contenenti i controlli a concentrazione nota e scegliere dal men a tendina Sample Type Standards Cliccare Load check boxes per caricare i fluorofori scelti e scrivere o selezionare il Nome del Target Nella finestra laod concentration impostare le concentrazioni dei 4 calibratori seguendo le istruzioni indicate nel paragrafo Interpretazione dei Risultati Selezionare i pozzetti contenenti il controllo negativo e scegliere dal men a tendina Sample Type NTC Cliccare Load check boxes per caricare i fluorofori scelti e scrivere o selezionare il Nome del Target Selezionare i pozzetti contenenti i campioni in esame e scegliere dal men a tendina Sample Type Unknown Cliccare Load check boxes per caricare i fluorofori scelti e scrivere o selezionare il Nome del Target Salvare la piastra cliccando il pulsante Next e on appena preparata la piastra ed averla correttamente inserita nello strumento premere il pulsante Start Run ALLESTIMENTO DELLE REAZIONI Scongelare una provetta di Enzyme mMix Scongelare una provetta di Enterovirus probes Mix Miscel
7. 3 nT quanty enterovirus 5 UTR region REF RT 33 Detection and quantification of the Enterovirus genome with Real Time PCR INTRODUCTION AND PURPOSE OF USE The quanty enterovirus system is a quantitative test that allows the RNA amplification and quantification by means of Real Time PCR of 5 UTR region of Enterovirus RNA The Procedure allows the detection of the RNA target by means a retro amplification reaction The analysis of the results is made using a Real Time PCR analyzer thermal cycler integrated with a system for fluorescence detection and a dedicated software CONTENT The kit contains reagents enough to perform 48 amplification tests Quantity Description Enzyme mMix RI 3 x 10 pl Reverse Transcriptase e Taq Polymerase enzymes Blue Cap Enterovirus probe Mix R2 3 x 270 pl water dNTPs Tris HCI KCI MgCl2 Green Cap 3x 35 ul cps ul 3x 35 ul synthetic RNA corresponding to 5UTR gene 10 000 l cps ul 3x 35 ul synthetic RNA corresponding to 5 UTR gene 10 000 cps ul R6 3x35 ul synthetic RNA corresponding to 5 UTR gene 100 cps ul R7 1 x 30 ul Negative Control Yellow Cap Instruction for use ST RT33 ENG 1 MATERIALS AND STRUMENTATION REQUIRED BUT NOT SUPPLIED Disposable latex powder free gloves or similar material Bench microcentrifuge 12 000 14 000 rpm Micropipettes and Sterile tips with aerosol filter Vortex Plastic materials microplate and optica adesive cover Heat bl
8. Do not use beyond the expiration date which appears on the package label Repeat thawing and freezing of reagents more than twice should be avoided as this might affect the performance of the assay The reagents should be frozen in aliquots if they are to be used intermittently ANALYTICAL PROCEDURE Extraction of Enterovirus RNA Manual Extraction EX16 Viral RNA extraction from plasma serum urine or swab 1 add 310 buffer AVE to the tube containing 310 g lyophilized carrier RNA Dissolve the carrier RNA thoroughly divide it into conveniently sized aliquots and store it at 20 C Do not freeze thaw the aliquots of carrier RNA more than 3 times 2 check buffer AVL for precipitate and if necessary incubate at 80 C until the precipitate is dissolved Calculate the volume of buffer AVL carrier RNA mix needed per batch of samples n x 0 56 ml y ml ymlx 10 I ml z where n number of samples to be processed simultaneously y calculated volume of Buffer AVL z volume of carrier RNA Buffer AVE to add to Buffer AVL Gently mix by inverting the tube 10 times To avoid foaming do not vortex Buffer AVL carrier RNA should be prepared fresh and is stable at 2 8 C for up to 48 hours This solution develops a precipitate when stored at 2 8 C that must be redissolved by warming at 80 C before use Do not warm Buffer AVL carrier RNA solution more than 6 times Do not incubate at 80 C for more than 5 minu
9. aia iii iii Cliccare il tasto Dynamic Tube e successivamente Slope correct Controllare il corretto settaggio del threshold nell apposito spazio CT calculation Threshold Anche in questo caso possibile stampare un report dell analisi cliccando sulla finestra Report e selezionando nella sezione Quantification prima il file cycling A green e successivamente il file cycling A yellow CFX96 Real Time PCR System Alla fine della rezione di PCR selezionare lo sheet quantitation Nella parte alta dello schermo selezionare settings dal men e scegliere Baseline Threshold possibile esportare il report cliccando sulla figura block notes posta nella parte superiore dello schermo INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI Grazie alla reazione di Real Time PCR possibile fornire la quantificazione dell RNA di Enterovirus mediante la corretta impostazione dei valori dei controlli positivi che costruiscono la curva di calibrazione Tale impostazione deve considerare tutte le diluizioni ed i passaggi che il campione subisce durante le fasi d estrazione e di amplificazione Il sistema in grado di rilevare da 1 500 000 a circa 10 copie di DNA per reazione I valori dei Ct ottenuti dall amplificazioni dei 4 controlli a titolo noto vengono utilizzati dal software per il calcolo della curva di calibrazione su cui vengono interpolati i campioni incogniti Un corretto funzionamento della miscela d
10. and the target quantification expressed in copies reaction o copies ml depending on the settings of the calibration curve From the window Text Report it s possible to export the results obtained clicking file export on main menu Rotor gene Q At the end of the PCR run open the Analysis window Select the Quantification sheet and click on cycling A green Select from the menu Dynamic Tube and subsequently Slope correct Check the correct setting of the threshold in the space provided CT calculation Threshold Open the Analysis window Select the Quantification sheet and click on cycling A yellow Select from the menu Dynamic Tube and subsequently Slope correct Check the correct setting of the threshold in the space provided CT calculation Threshold Also in this case you can print a report of the analysis by clicking on the Report window and selecting the file in the first Quantification cycling A green and then the file cycling A yellow CFX96 real time PCR system At the end of the PCR select the quantitation sheet On the top of the screen select settings from the menu and choose Baseline Threshold You can export the report pushing the paper block figure on the top of the screen INTERPRETATION OF RESULTS Through the Real Time PCR reaction it is possible to obtain the RNA quantification of Enterovirus RNA by setti
11. are accuratamente mediante vortex 9pl di Enzyme mMix e 260pl di Enterovirus probes Mix la miscela cos prodotta e sufficiente per l esecuzione di 16 reazioni di amplificazione 4 controlli positivi 1 controllo negativo ed 11 campioni Dispensare nella piastra di amplificazione 15pl della miscela appena ricostituita nelle posizioni prescelte e gia predisposte sul software dello strumento Dispensare nella posizione del controllo negativo 15l di soluzione prelevata dalla vial controllo negativo Dispensare nelle posizioni predefinite per ciascun campione 15pl del campione corrispondente Dispensare nelle posizioni predisposte per i controlli positivi 15pl di soluzione 10 copie pl 10 copie pl 10 copie p e 10 copie pl Sigillare accuratamente la piastra mediante l utilizzo di optichal adesive film e verificare che nella miscela non vi siano bolle d aria che possano interferire con l amplificazione Per lo strumento Rotor geneQ 5 6 plex sigillare accuratamente ogni tubo con i tappi appropriati La presenza di bolle d aria non sono influenti la forza centrifuga del rotore ne permetter l automatica eliminazione Trasferire la piastra nello strumento e premere il pulsante Run ANALISI QUANTITATIVA Lifetechnologies 7500 Fast StepOne Plus AI termine della corsa di PCR il software apre automaticamente la finestra Analysis nella sezione Amplification plot posta nel Menu a sinistra Seleziona
12. are consentir di salvare un file excel con tutti i dati relativi all esperimento selezionato Stratagene MX3000P Fare clic sul pulsante Analysis nella barra degli strumenti Il software aprir di default lo sheet Analysis Term Setting Attivare i pulsanti FAM e JOE HEX nella parte inferiore dello schermo e selezionare i campioni in esame Selezionare dalla piastra i pozzetti corrispondenti ai controlli positivi al controllo negativo ed ai campioni in analisi Cliccare lo sheet Results il software aprir di default la pagina Amplification plot Controllare il corretto settaggio del threshold tabella nell apposita finestra Threshold fluorescence Spuntando la casella Standard Curve dal men Area to Analyze possibile visualizzare i dati inerenti alla curva di calibrazione verificandone i parametri descritti nel paragrafo Interpretazione dei Risultati coefficiente di correlazione slope ecc Spuntando la casella Text report dal men Area to Analyze nella parte destra del software possibile verificare i dati ottenuti dagli esperimenti Threshold Cycles Fluorescenze emesse e ovviamente la Quantificazione del target espressa in copie reazione o copie ml in funzione di come stata impostata la curva di calibrazione Dalla finestra Text Report possibile esportare i risultati ottenuti cliccando dal men principale il comando file export Rotor gene Q AI termine
13. aren t air bubbles in the mix to avoid the amplification interferences For the Rotor Gene Q seal each tube with the appropriate cap The air bubbles presence is not influently the rotor centrifugal force will allow automatic deletion Transfer the plate in the instrument and push the button Start Run QUANTITATIVE ANALYSIS Lifetechnologies 7500 Fast StepOne Plus At the end of the PCR run the software automatically opens the Analysis window in the Amplification plot sheet on the menu on the left Select the wells corresponding to the positive control negative control and samples for analysis Select in the Option window inside the Target pop up menu the Enterovirus target Check the correct setting of the threshold Select in the Option window inside the Target pop up menu the IC Control target Check the correct setting of the threshold The analysis of the results is made selecting from the menu in the left the page Analysis From the page Standard Curve maintaining open the sheet view well plate in the right side of the software select the wells containing the points of the curve and verify the parameters described in the paragraph Interpretation of the Results coefficient of correlation slope ecc From the page Amplification Plot verify the amplification plot for every single sample Opening the sheet view well table in the right side of the software it is possible t
14. ction By correctly setting the standards concentration as a function of the extraction system you can get the quantization of the sample directly in copies ml Manual Extr EX05 Clonit Alternative extract RTS 1 35 700 000 copie ml 1 500 000 copie reaz RTS 2 3 570 000 copie ml 150 000 copie reaz RTS 3 357 000 copie ml 15 000 copie reaz RTS 4 35 700 copie ml 1 500 copie reaz When alternative systems are used sample concentration expressed in copies ml will be obtained using the formula 1000 Ev x e xC reaz copie ml where Ve extracted sample Volume expressed in ul Ev eluted sample Volume during extraction stage expressed in ul Ea extracted sample volume used for amplification expressed in ul Creaz copies provided by the instrument As with any diagnostic device the results obtained with this product must be interpreted taking in consideration all the clinical data and the other laboratory tests done on the patient As with any diagnostic device with this product there is a residual risk of obtaining invalid false positives or false negatives results The use of positive and negative controls in each amplification session allow to verify the correct functioning of the amplification mix and the absence of any contamination Ct undetermined In the amplification reaction of each sample the Ct values for the internal control specific probe are used to validate the analysis sessi
15. della corsa di PCR aprire la finestra Analisys Selezionare lo sheet Quantification e fare doppio clic spuntando la voce cycling A green Cliccare il tasto Dynamic Tube e successivamente Slope correct la sessione d analisi a partire dal processo di retrotrascrizione sino alla fase di detection Assicurarsi che la fluorescenza emessa dall amplificazione del controllo interno non presenti un Ct gt 28 o undetermined Se un campione presenta Ct Enterovirus RNA undetermined e Ct del controllo interno gt 28 significa che si sono verificati problemi nella fase di estrazione o nella fase di retro amplificazione e quindi il campione potrebbe essere un falso negativo Ripetere il campione Possono essere considerati validi i campioni che presentano un Ct gt 28 per quanto riguarda il controllo interno ed una concentrazione di Enterovirus RNA elevata In questo caso la natura competitiva della reazione di PCR pu nascondere o sfavorire l amplificazione del controllo interno Concentrazione 1 500 000 copie E I N 5 15 8 1 4 13 L inaccuratezza media risulta essere del 8 N i Conc Media i Inaccuratezza Singh S Chow VT Phoon MC Chan KP Poh CL 2002 Direct Detection of Enterovirus 71 EV71 in Clinical Specimens From a Hand Foot aqnd Mouth Disease Outbreak in Singapore by Reverse Transcription PCR with Universal Enterovirus and EV71 Specific Primers J Clin Mic
16. determinare veri positivi sulla totalit di campioni positivi screenati L analisi stata effettuata su campioni positivi per Enterovirus ed il test stato eseguito seguendo le indicazioni riportate nella metodica campioni positivi sono stati confermati con un altro sistema marcato CE presente in commercio risultati ottenuti mostrano una sensibilit diagnostica del 100 Tracciabilit verso altri materiale di controllo Enterovirus 71 RNA Control Vircell Il kit quanty Enterovirus stato utilizzato per la quantificazione del controllo positivo Enterovirus 71 RNA Control rev 05 2012 fornito dalla societ VIRCELL e contenente RNA liofilizzato dell Enterovirus 71 CrCr strain ATCC VR 784 Al presente standard stata assegnata una concentrazione 12500 copie ul una volta ricostituito 187 500 cps react j Media Trovata Atteso ESITAZIONE iii OD CONO ine OD CONO Manuale Log 3 64 Log 4 09 QCMD 2015 RNA Programme EQA Panel Challenge 1 Il kit quanty enterovirus stato valutato utilizzando il pannello QCMD 2015 RNA Programme EQA Panel Challenge 1 Linearit Proporzionalit La linearit del sistema stata valutata analizzando RNA sintetico PGEM ENT RNA quantificato mediante analisi spettrofotometrica contenenti la regione di interesse del virus 5 UTR in diluizioni scalari 1 10 da 1 500 000 copie reazione a 15 copie reazione di RNA nei 15ul di estratto aggiunto alla reazione di retro amplif
17. e quantitative PCR Multiple Standard Turn the lamp on 20 minutes before doing a new experiment For turning the lamp on click on the icon of the lamp in the tool bar or select Lamp On from the menu Instruments Verify the right setting of the gain of the fluorescent reporters in the menu of settings choose Instrument and then Filter set gain setting Click on button setup in the tool bar and choose Plate Setup Sign the wells corresponding to calibrators Define the calibrator s positions in right menu setting i i Collect i Reference i Replicate e type i Fluorescent Data Dye i Symbol i Standard FAM HEX ROX ROX None Clicking on every single well the window well information will appear choose the name of the calibrator In the window Select Quantity set the concentrations of the 4 calibrators following the instructions indicated in the paragraph Interpretation of the results Sign the wells correspondent to Negative control Define the NTC positions in right menu setting E Well type Fluorescent Data Dye Symbol ANTE ee i PRAMHIENROX ROX Moo___ Clicking on every single well the window well information will appear set NTC as the name Sign the wells correspondent to the Samples Define the samples positions in right menu setting __ellype Fluorescent Data _ Dye Symbol i UnKnown FAM HEX ROX ROX None Clicki
18. e la lampada almeno 20 minuti prima di eseguire un nuovo esperimento Per accendere la lampada cliccare sull icona lampada dalla barra degli strumenti o selezionare Lamp On dal men Strumenti Verificare la corretta impostazione dei guadagni dei reporter fluorescenti nel men di impostazione scegliere Instrument e quindi Filter set gain setting Cliccare sul pulsante setup nella barra degli strumenti e scegliere lo sheet Plate Setup Contrassegnare i pozzetti corrispondenti ai calibratori Definire le posizioni del calibratore nel men di destra impostando Collect Reference Replicate T Well type i Fiuorescent Data Dye i Symbol Standard FAM HEX ROX ROX None Cliccando su ogni singolo pozzetto apparira la finestra di dialogo well information in cui sara possibile impostare il nome del calibratore Nella finestra Select Quantity impostare le concentrazioni dei 4 calibratori seguendo le istruzioni indicate nel paragrafo Analisi dei Risultati Contrassegnare i pozzetti corrispondenti ai controlli negativi Definire le posizioni del calibratore nel menu di destra impostando i _vellype Fluorescent Data Dye Symbol ENTO eccessi AM HEX ROX E ROX ie None og Cliccando su ogni singolo pozzetto apparira la finestra di dialogo well information in cui sara possibile impostare NTC come nome Contrassegnare i pozzetti corrispondenti ai campioni clinici Definire le pos
19. e or select Target Name In the box laod concentration set the concentrations of the 4 calibrators following the instructions indicated in the paragraph Analysis of the results Select the location where you placed the Negative Control Choose the Sample Type NTC Click Load check boxes to load fluorophores and Type or select Target Name Select the location of each sample and enter the name or code of the patient Choose the Sample Type Unknown Click Load check boxes to load fluorophores and Type or select Target Name Save the plate clicking the next button and start the experiment PREPARATION OF THE REACTIONS Defrost a tube of Enzyme mMix Defrost a tube of Enterovirus probes Mix Mix carefully by vortex 9p of Enzyme mMix and 260pl of Enterovirus probes Mix the mix as produced is enough to prepare 16 reactions of amplification 4 positive controls 1 negative control and 11 samples Distribute in the amplification plate 15pl of just reconstituted mix in chosen positions as already set on the instrument software Distribute in the negative control position 15 pl of solution taken by the negative control vial Distribute in chosen position for each sample 15 pl of corresponding sample Distribute in chosen positions for the positive controls 15pl of 10 copies ul 10 copies pl 10 copies pl and 10 copies pl Seal up accurately the plate using an optichal adesive film and verify that there
20. ents used for amplification reactions from those used for other reactions as well as from post amplification products use tips with filters to prevent cross contamination between samples use disposable gloves and change them frequently carefully open test tubes to prevent aerosol formation close every test tube before opening another one The proper functioning of the amplification mix depends on the correct collection correct transportation correct storage and correct preparation of a biological sample As with any diagnostic device the results obtained with this product must be interpreted taking in consideration all the clinical data and other laboratory tests done on the patient A negative result obtained with this product suggests that the RNA of Enterovirus was not detected in RNA extracted from the sample but it may also contain Enterovirus RNA at a lower titre than the detection limit for the product detection limit for the product see paragraph on Performance Characteristics in this case the result would be a false negative As with any diagnostic device with this product there is a residual risk of obtaining invalid false positives or false negatives results STORAGE AND STABILITY Store the product quanty enterovirus at 20 C The quanty enterovirus kit is shipped on dry ice The kit components should be frozen An intact and well stored product has a stability of 6 months from the date of production
21. esasessesesessesasessesesessesssesseseseseeseseesesaseseeseseseesesessesssessesssessesssessesesessesesessessseseeseseseesaseseessesenan EDMA code 1504400200 CND W0105040502 The quanty enterovirus kit is CE marked diagnostic kit according to the European in vitro diagnostic directive 98 79 CE ull CLONIT S r l Headquarter Via Varese 20 20121 Milano Production Site Via B Quaranta 57 20139 Milano Tel 39 0 2 56814413 fax 39 0 2 56814515 www clonit it info clonit it Eros for in vitro diagnostic use ST RT33 ENG 1 Printed 7 April 2015 3 nT quanty enterovirus 5 UTR region REF RT 33 Rilevazione e quantificazione del genoma di Enterovirus mediante Real Time PCR INTRODUZIONE E DESTINAZIONE D USO Il prodotto quanty Enterovirus un saggio quantitativo che consente la rilevazione e la quantificazione mediante metodica Real Time PCR della regione 5 UTR di Enterovirus RNA La procedura prevede il rilevamento dell RNA target di interesse mediante una reazione di retro amplificazione in micropiastra L analisi dei risultati viene effettuata tramite uno strumento di Real Time PCR composto da un thermal cycler provvisto di un sistema di rilevamento della fluorescenza COMPOSIZIONE Quantit Descrizione Enzyme mMix R1 3x 10 ul Reverse Transcriptase e Taq Polymerase enzymes Tappo Blu Enterovirus probe Mix Upstream primer downstream primer Target probe FAM Internal Control IC p
22. gliere una zona della piastra dove verr posizionato il controllo negativo selezionare nello spazio Assign target to selected wells il task Negative N per il target Enterovirus Scegliere una zona della piastra dove verranno posizionati i campioni selezionare i pozzetti della piastra ed impostare entrambi i target Enterovirus e IC Associare ad ogni pozzetto un campione in analisi mediante la finestra Assign samples to selected wells Selezionare per ciascun campione nell apposito spazio Assign targets to selected wells il task UnKnown U per il target Enterovirus Impostare come passive reference utilizzato come normalizzatore della fluorescenza rilevata il ROX Aprire la pagina Run Method sheet Graphic View ed impostare il ciclo termico corretto eicli i denaturazione p annealing Estensione i 50 C QO MIN ese ssermessmeemmeesi RA a i Nella finestra Reaction volume plate per well impostare il volume di 30 pl Non appena preparata la piastra e dopo averla correttamente inserita nello strumento premere il pulsante Start Run Stratagene MX3000P Accendere lo strumento ed attendere che le due lampade verdi abbiano luce fissa accendere il computer ed avviare il software di controllo Nella schermata principale del software apparir la finestra di dialogo New Experiment Options selezionare Experiment type quantitative PCR Multiple Standard Accender
23. he screen you will see the microplate draft Select an area of the plate where the controls will be placed select wells of the plate and set both targets Enterovirus and IC Select Assign target to selected wells in the blank the task Standard S for Enterovirus target and set the controls concentration Choose an area in the plate where negative control will be placed select Assign target to selected wells in the blank the task Negative N for the Enterovirus target Select an area of the plate where samples will be placed select the wells and set both targets Enterovirus and IC Link every well to a sample through the window Assign samples to selected wells For each sample select in the blank Assign targets to selected wells the task UnKnown U for the Enterovirus target Set ROX as passive reference using it as normalizer of detecting fluorescence Open Run Method sheet Graphic View and set the right thermal cycling annealing i extension eeu In the window Reaction volume plate per well set a volume of 30 ul After preparing the plate and correctly inserting it in the instrument press the button Start Run STRATAGENE MX3000P Turn the instrument on and wait until both green lamps have fixed light turn on the computer and start the control software In the main screen will appear the window New Experiment Options select Experiment typ
24. i amplificazione pu essere verificato analizzando i seguenti parametri i PAFAMETtO ii Riferimento RTS conc 10 copie ul FAM _ Lil Cts 22 nn i Coefficiente di correlazione E 0 990 lt lt ll eni i SIOPE iii i E L SIOPE 3 2 i Efficienza di POR cummin Efficienza lt 100 Se i risultato della reazione di amplificazione del RTS alla concentrazione di 10 copie produce un Ct gt 22 o undetermined la sessione non pu essere considerata valida e deve essere ripetuta Verificare se i valori del coefficiente di correlazione r della slope e quindi dell efficienza di reazione rientrino nei limiti indicati in tabella o che non si discostino molto da essi in quanto rappresentano il range ideale per una reazione di PCR ottimale In funzione del sistema di estrazione si pu ottenere direttamente la quantificazione del target in copie ml impostando le seguenti concentrazioni per gli standard Estr Manuale EX05 Clonit Estraz Alternativa RTS 1 35 700 000 copie ml 1 500 000 copie reaz RTS 2 3 570 000 copie ml 150 000 copie reaz RTS 3 357 000 copie ml 15 000 copie reaz RTS 4 35 700 copie ml 1 500 copie reaz In questo caso la concentrazione del campione espressa in copie ml potra essere ricavata utilizzando la formula seguente 1000 Er Ve Ea xC reaz copie ml dove Ve Volume del campione estratto espresso in ul Ev Volume in cui il campione viene eluito durante la fase di es
25. icazione La valutazione stata effettuata analizzando 10 curve di calibrazione che hanno mostrato tutte i seguenti parametri Ct lt 22 media Ct 18 29 i FAM sti direi siii 0 990 lt r lt 1 Riproducibilit e Ripetibilit La Riproducibilit e la Ripetibilita del sistema sono state valutate analizzando 3 diluizioni di RNA sintetico contenente la regione di interesse 5 UTR di Enterovirus e quantificata mediante analisi spettrofotometrica ed 1 controllo negativo RNA negativo Vengono eseguiti 5 replicati per ogni sessione per 3 sessioni differenti eseguite da operatori differenti su 3 lotti diversi La specificit diagnostica risulta essere al 100 per i campioni di DNA estratto da plasma Specificit Analitica La specificit del test garantita dall utilizzo di primers specifici per la determinazione di Enterovirus L esame di allineamento delle regioni scelte per l ibridazione dei primers specifici per Enterovirus con le sequenze disponibili in banca dati della regione 5 UTR ha dimostrato la loro conservazione l assenza di mutazioni significative e la completa specificit per il target analizzato Cross Reattivit L esame di allineamento delle regioni scelte per l ibridazione dei primers specifici per Enterovirus con le sequenze disponibili in banca dati della regione 5 UTR ha dimostrato la loro conservazione l assenza di mutazioni significative e la completa specificit per il target analiz
26. icity It is considered as diagnostic specificity the ability of the method to detect trues negative samples The diagnostic specificity of the system was evaluated analyzing human samples tested and confirmed as Enterovirus negative with an other CE marked method available on the market Diagnostic specificity is 100 for material extracted from plasma Analytical Specificity Test s specificity was guaranteed by the use of specific primers for Enterovirus The alignment of the choose regions for specific primers hybridization for Enterovirus with available sequences of the 5 UTR region present in database demonstrated their conservation the absence of significative mutations and the complete specificity for the analysed target Cross Reactivity To check the cross reactivity of the assay samples tested as positive for other mviruses were analysed following the method instructions INTERFERENCES Verify that in the RNA extracted from the sample there is no contamination from mucoproteins and haemoglobin to exclude possible inhibition of PCR reaction The interference due to contaminants can be detected through a spectrophotometric analysis verifying the ratio between the absorbance readings at 260 nm maximum absorbtion of Nucleic Acids and 280 nm maximum absorbtion of Proteins A pure RNA should have a ratio of approximately 2 QUALITY CONTROL It is recommended to include in each analytical run as quality contro
27. ionality The system linearity was valued analyzing syntetic RNA pGEM ENT RNA quantified by spectrophotometric analysis containing the regions of interest 5 UTR of the virus in serial dilutions 1 10 from 1 500 000 copie reactions to 15 copies reaction of RNA in 15ul of extracted material added in the retro amplification reaction The evaluation was performed analyzing 10 calibration curves that showed these parameters aeea i FAM Correlation Coefficient e Reproducibility and Repeatability The reproducibility and repeatability of the system were valued analyizing 3 dilutions of synthetic RNA containing the 5 UTR region of interest for Enterovirus and quantified by spectrophotometric analysis plus a negative control negative RNA For each session 5 replicates were made in 3 different sessions performed by different technicians using 3 different lots of product Ct lt 22 medium Ct 18 29 medium r 0 996 gt PIITITTTTITITI CITI II TITTI i COPIES A iii ED E Qui arnnnnazanianananinnanananesnanannanane nnnnannanananienanananenesnananeanaeaananananagianiriaririnsisansenisanasisinonsis puanaanananannananannananannananasna sane peneeeeeeeeeeeeeeeeeeeseeeeeeeeeeeeeeeeeeeesem Hypothetical value 1 500 000 co pies LALA i 1 500 000 copies 15 000 copies 19 000 copies 150 copies 150 copies The average Inaccuracy percentage of Enterovirus method is 8 Diagnostic Specif
28. izioni del calibratore nel menu di destra impostando pr Riga Resia i _elltyee Fluorescent Data Dye Symbol i UnKnown FAM HEX ROX ROX None Cliccando su ogni singolo pozzetto apparira la finestra di dialogo well information in cui sara possibile impostare il nome o il codice del campione clinico Selezionare i pozzetti in analisi e Impostare accanto al nome dei fluorofori il nome del target in analisi Menna RNA ENTErOVIFUS sun Internal Control i Nella barra degli strumenti scegliere lo sheet Thermal Profile Setup impostare il ciclo termico corretto e la lettura della fluorescenza in fas di annealing extension 1 50 C 20 min Non appena preparata la piastra e dopo averla correttamente inserita nello strumento premere il pulsante Run selezionare lo sheet Thermal profile status e controllare la correttezza del profilo termico Selezionare la casella Turn Lamp Off alla fine dell esecuzione nella finestra di dialogo Premere il pulsante start il software vi chieder di indicare il nome con cui salvare il file e avvier l analisi Rotor Gene Q Nuovi esperimenti possono essere impostati utilizzando la procedura guidata di avvio rapido o la procedura guidata avanzata che appare quando il software viene avviato Selezionare la procedura guidata Advanced Come primo passo selezionare il modello Two Step Reaction con un doppio clic nella finestra New Run Nella fines
29. l of every extraction amplification and detection step an already tested negative and positive sample or a reference material with known concentration In accordance with the Clonit srl ISO EN 13485 Certified quality Management System each lot of quanty Enterovirus is tested against predetermined specification to ensure consistent product quality BIBLIOGRAPHY Dubot P r s A Tan CY de Chesse R Sibounheuang B Vongsouvath M Phommasone K Bessaud M Gazin C Thirion L Phetsouvanh R Newton PN de Lamballerie X SYBR green real time PCR for the detection of all enterovirus A71 genogroups References PLoS One 2014 Mar 20 9 3 e89963 Osterback R Tevaluoto T Ylinen T Peltola V Susi P Hyypia T Waris M Simultaneous detection and differentiation of human rhino and enteroviruses in clinical specimens by real time PCR with locked nucleic Acid probes References J Clin Microbiol 2013 Dec 51 12 3960 7 doi 10 1128 JCM 01646 13 Epub 2013 Sep 18 Qian Chena Zheng Hua Qihua Zhanga Minghui Yu Development and evaluation of a real time method of simultaneous ampli cation and testing of enterovirus 71 incorporating a RNA internal control system References Journal of Virological Methods 196 2014 139 144 Bustin SA 2000 Absolute quantification of mRNA using real time reverse transcription polymerase chain reaction assays J Mol Endocrinol 25 2 169 193 Bustin SA 2000 Quantification of mRNA using real time reverse t
30. ng on every single well the window well information will appear set the name or the code of the sample It s possible indeed set near the name of fluorescent reporter the name of analyzed targets hrrrnnnnnannnnnnnnnnnannnnnnannnnanan aaua V PPPPPPPPPPTT a cssscesesesessesvseseesesvereses DecuceenecuceeceseeeeneaueeenesueeenesuneeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeOeeeeesSeeeeeeSeeeeeSeeeeeeeuPaeeeeeeeeeeeeeeseeeeeeseeeeeeeeeeeeseeeeeeseseeeeseseeeeseeeseeseeeeeeseseseeseseesusesaesusessssusesssssl In the tool bar choose the sheet Thermal Profile Setup set the correct thermal cycle and reading the fluorescence in the annealing step a eaeeeeeeeneeeeeeneeeeeeeensgenseseneneeeeesnseeeeenseeeeenseeeeeseeeeeneeeeeeungreercrceeeeocceeeeeeceeeeeeeeeeeeeeeeesOeSeeeeOeSeeeeOeSe0es0pSe000000000000000000000000 0000000 0000000 000000000000 00 080058 nanan cycles na PPPPETTTTTTITTTTTITTTTTTTTTTTTTAT ees a sssssssfrinininisinininin veered extension CLLLLELLELLELCLLL il er CI i AD sO Og a BOE After preparing the plate and inserting it in the instrument press the button Run selecting the sheet Thermal profile status and check the correctness of thermal profile Select the box Turn Lamp Off at the end of execution Push the button Start the software will ask you to indicate the name of saved file The analysis will start ROTOR GENE Q The experiments can be set using the Quick Start Wizard or the Advanced Wizard which appea
31. ng the values of the positive controls of the calibration curve To calculate these values all the dilutions steps that the sample has undergone during the extraction and amplification stages must be considered The system can detect from 1 500 000 to about 15 copies of DNA per reaction The Ct values obtained from the amplification of 4 controls of known titre are used by the software for the calculation of the calibration curve from which the unknown samples are interpolated A proper functioning of the amplification mix can be verified analyzing these parameters aunnnanazananeasaneneananeaananeaeaneeaneananeaenzaneaeasaseaeasaneneasaneaanaeeaanaeeaeananeaeasaneQeazanessasasessasanessesasessasanessasasessasasessasasessasasessisasessasaeessasaceesasaceasasaneasisit Parameters a ronno 2000 ier dina teres Reference i RTS CONC 10 copie tl FAM CES i Correlation Coefficients 0 990 lt r lt 1 Tanananazazaananan anioni nio na ninna na siii ii iii eeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeueeseeeeeeeeeeeeeeeeseeeeeeeeeeeeeseeeeeeseseeeeseeeeeeseseeeeeeee If the RTS amplification reaction at a concentration of 10 copies produces a Ct gt 22 or undetermined the session can t be considered valid and must be repeated Verify that the correlation coefficient value r the slope or the reaction efficiency fit to the limited indicated in the above table or do not deviate much from them which represent the ideal range for a proper PCR rea
32. ni dove sono stati posizionati i controlli a concentrazione nota e nominarli come Enterovirus Standard Cliccando sulla casellina Type corrispondente nel menu a tendina Samples possibile selezionare il tipo di campione che si sta analizzando Selezionare Standards Inserire le concentrazioni dei controlli Selezionare la posizione dove stato posizionato il controllo Negativo e nominarla come Negative Control Cliccando sulla casellina Type corrispondente nel menu a tendina Samples possibile selezionare il tipo di campione che si sta analizzando Selezionare Negative Controls Selezionare la posizione di ogni singolo campione ed inserire il nome o il codice del paziente Cliccando sulla casellina Type corrispondente nel menu a tendina Samples possibile selezionare il tipo di campione che si sta analizzando Selezionare UnKnown Al termine delle operazione cliccare OK nella finestra edit samples e attendere il termine della corsa per l analisi vedi Interpretazione dei risultati CFX 96 Real Time PCR Accendere lo strumento accendere il computer ed avviare il software di controllo Nella schermata principale del software apparir Startup wizard selezionare CFX96 e cliccare il bottone ok Nella schermata successiva premere create new ed impostare il protocollo termico ed volumi di reazione 30 ul i denaturazione annealing i
33. o be used intermittently At all times follow Good Laboratory Practice GLP guidelines Wear protective clothing such as laboratory coats and disposable gloves while assaying samples Avoid any contact between hands and eyes or nose during specimens collection and testing Handle and dispose all used materials into appropriate bio hazard waste containers It should be discarded according to local law Keep separated the extraction and the reagents preparation Upstream primer downstream primer Target probe FAM Internal Control IC probe VIC Nuclease free synthetic RNA corresponding to 5 UTR gene 100 000 Never pipette solutions by mouth Avoid the air bubbles during the master mix dispensing Eliminate them before starting amplification Wash hands carefully after handling samples and reagents Do not mix reagents from different lots It is not infectious and hazardous for the health see Material Safety data Sheet MSDS Do not eat drink or smoke in the area where specimens and kit reagents are handled Read carefully the instructions notice before using this test Do not use beyond the expiration date which appears on the package label Do not use a test from a damaged protective wrapper LIMIT OF THE METHOD The extreme sensitivity of gene amplification may cause false positives due to cross contamination between samples and controls Therefore you should physically separate all the products and reag
34. o verify the data obtained from experiments Threshold Cycles emitted fluorescence and the target quantification expressed in copies reaction or copies ml depending on the settings of the calibration curve Clicking from the menu file and selecting the box export the window export properties will open Indicate the file name select the position to save it Browse and click on button Start export In this way the software will permit to save a excel file with all the data corresponding to selected experiment Stratagene MX3000P Click on button Analysis in the toolbar The software will open in default the sheet Analysis Term Setting Activate the buttons FAM and HEX in the lower part of the screen and select testing samples Click on sheet results the software will open in default the page Amplification plot Check the correct setting of the threshold in the specific window Threshold fluorescence in the menu on the right of the screen Selecting the box Standard Curve from menu Area to Analyze it s possible to visualize the data related to the calibration curve and verify the parameters described in paragraph Interpretation of Results coefficient of correlation slope ecc Selecting the box Text report from menu Area to Analyze in the right side of the screen it s possible to verify the data obtained from the experiments Threshold Cycles emitted Fluorescences
35. ock only for extraction Reagents The quanty enterovirus kit was developed and validated to be used with the following extraction method Manual Extraction EX16 Viral RNA extraction from plasma serum urine or swab The kit allows the manual RNA extraction from Human samples The kit contains reagents enough to perform the DNA extraction for 50 samples Clonit srl Real Time PCR The quanty enterovirus kit was developed and validated to be used with the following real time PCR instruments e 7500 Fast Lifetechnologies e Stratagene MX3000P Agilent Technologies e Rotor Gene Q 5 6 plex QIAGEN e CFX96 Real Time PCR System BioRad Please ensure that the instruments have been installed calibrated checked and maintained according to the manufacturer s instruction and raccommendations SAMPLES AND STORAGE The quanty enterovirus system must be used with extracted RNA from the following biological samples Serum and Urine Collected material must be shipped and stored at 2 8 C Store the samples at 20 C if not used within 3 days PRECAUTIONS USE This kit is for in vitro diagnostic IVD for professional use only and not for in vivo use After reconstitution the amplification master mix must be used in one time 16 reactions Repeat thawing and freezing of reagents more than twice should be avoided as this might affect the performance of the assay The reagents should be frozen in aliquots if they are t
36. on from extraction process until detection step In the amplification reaction of each sample the Ct values for the internal control specific probe are used to validate the analysis session from reversetranscription process until detection step Be sure that emitted fluorescence from internal control amplification has not a Ct gt 28 or undetermined If a sample shows an undetermined Enterovirus RNA and an internal control Ct gt 28 this means that there have been problems in the extraction stage or in the retro amplification stage therefore the sample could be a false negative Repeat the sample It can be considered valid the samples with a Ct gt 28 for the internal control and a high concentration of Enterovirus RNA In this case the competitive nature of PCR reaction can hide or disadvantage the internal control amplification i Detector FAMI Detector ViC Hex i PCR RUM SEP ns Ct gt 28 or undetermined Not Valid repeat oe Ct lt 28 same Valid ww Negative i Emmet Ct ii Ct lt 28 edn iii OSHIVE a 201 Valid i HighPositive PERFORMANCES Analytical sensitivity It is considered as analytical sensitivity the highest dilution title to which a positive sample can be diluted without the system losing the ability to detect with a positivity rate of e 95 The analytical sensitivity of the system was assessed by analyzing synthetic RNA quantified by spectrophotometric analysis containing the regions of interest 5
37. one dell RNA virale e causando falsi negativi dopo RT PCR soprattutto per campioni con basso titolo virale 3 pipettare 560 di buffer AVL carrier a RNA in una provetta da 1 5 ml 4 aggiungere 140 di plasma siero urine o liquido di trasporto del tampone al buffer AVL Vortexare per 15 secondi 5 incubare a temperatura ambiente per 10 minuti e centrifugare brevemente per togliere eventuali gocce dal tappo della provetta 6 aggiungere 560 ul di etanolo 95 vortexare per 15 secondi e ricentrifugare brevemente 7 predisporre le colonnine inserite nei tubi di raccolta in un numero pari a quello dei campioni trattati 8 aggiungere 630 1 della miscela ottenuta al punto 6 all interno delle colonnine e centrifugare a 6 000 g per 1 minuto Porre le colonnine in un tubo di raccolta pulito ed eliminare quello contenente il filtrato 9 ripetere il punto 8 aggiungendo alle colonnine la restante parte della miscela Scartare il filtrato e porre la colonnina nel medesimo tubo di raccolta 10 aggiungere 500 ul di buffer AW1 in ogni colonnina e centrifugare a 6 000 g per 1 minuto Porre le colonnine in un tubo di raccolta pulito ed eliminare quello contenente il filtrato 11 aggiungere 500 ul di buffer AW2 in ogni colonnina e centrifugare a 14 000 g per 3 minuti Porre le colonnine in una provetta da 1 5 ml ed eliminare quella contenente il filtrato 12 aggiungere 50 ul di buffer AVE in ogni colonnina incubare a temperatura ambiente pe
38. pende dalla corretta raccolta dal corretto trasporto dal corretto stoccaggio nonch da una corretta preparazione del campione biologico prelevato I risultati ottenuti utilizzando il prodotto devono essere interpretati considerando tutti i dati clinici e laboratoristici legati al paziente L esito di un risultato negativo ottenuto con questo prodotto suggerisce che non stata rilevata la presenza dell RNA di Enterovirus nel RNA estratto dal campione Questo non esclude che il campione possa contenere RNA di Enterovirus ma con titolo inferiore al limite di rivelazione del prodotto limite di rilevamento per il prodotto vedere paragrafo Caratteristiche prestazionali in questo caso il risultato sarebbe un falso negativo Come per qualunque altro dispositivo diagnostico esiste un rischio residuo di ottenere risultati non validi che non pu essere eliminato o ridotto ulteriormente CONSERVAZIONE E STABILITA Conservare il prodotto quanty enterovirus a 20 C quanty enterovirus viene spedito in ghiaccio secco componenti del kit dovrebbero arrivare congelati Se uno o pi componenti non sono congelati al ricevimento o se i tubi sono stati compromessi durante il trasporto contattare Clonit srl per l assistenza Il prodotto integro e correttamente conservato ha una stabilit di 6 mesi dalla data di produzione Non utilizzare oltre la data di scadenza riportata sulla scatola Il congelamento e scongelamento dei reagenti pi di
39. r 1 minuto e centrifugare a 6 000 g per 1 minuto nell eluato presente RNA Il campione cos preparato pu essere utilizzato subito oppure conservato a 20 C IMPOSTAZIONI DEL SOFTWARE Lifetechnologies 7500 fast Accendere lo strumento il computer ed avviare il software di controllo Dalla schermata principale del software cliccare sul bottone Advanced Setup di default il software vi mostra la pagina experiment properties Digitare nella finestra experiment name il nome con il quale verr salvato l esperimento Scegliere il tipo di strumento che si utilizza ABI7500 o ABI7500fast scegliere il tipo di esperimento quantitation standard curve il tipo di reagenti utilizzati Taqman reagents ed il tempo di reazione Standard 2 hours to complete a run Aprire la pagina page setup sheet Define Target and Samples Nella finestra Define Targets impostare Nella finestra Define Samples impostare il nome dei campioni in analisi Sempre nella pagina plate setup selezionare lo sheet Assign Target and Samples comparir nella vostra schermata la piastra schematizzata Scegliere una zona della piastra dove verranno posizionati i controlli selezionare i pozzetti della piastra ed impostare entrambi i target Enterovirus e IC Selezionare nello spazio Assign target to selected wells il task Standard S per il target BK ed impostare le concentrazioni dei controlli Sce
40. ranscription PCR RT PCR trends and problems J Mol Endocrinol 29 1 23 39 Freeman WM1 Walker SJ Vrana KE 1999 Quantitative RT PCR pitfalls and potential Biotechniques 1999 26 1 112 22 124 5 Larionov A Krause A Miller W 2005 A standard curve based method for relative real time PCR data processing BMC Bioinformatics 6 62 Singh S Chow VT Phoon MC Chan KP Poh CL 2002 Direct Detection of Enterovirus 71 EV71 in Clinical Specimens From a Hand Foot aqnd Mouth Disease Outbreak in Singapore by Reverse Transcription PCR with Universal Enterovirus and EV71 Specific Primers J Clin Microbiol 40 8 2823 7 TECHNICAL ASSISTANCE For any question and support please contact out Technical support e mail info clonit it phone 39 02 56814413 Qedeaeaneneaeaneneneaneueneansueaeansueneansueseausueeanqeseeeeeseeeseeseeeeeseseeseeseeeeeeseeeseeseeeseeseseseeeeesesseeseseeeeeeseeeeeeeeeeesesseeeeeseeseseeseeeseseeseseeseeeeeseeeseeseeeseesseeeeesen Tanananananasnananasnanansonananesnananasasnanasnananasnafineasananeanananeanananeanananessanasessasasesnananessanesessasasessanasessasassasanaseasaninasnananessasanessasasesnananasnanasasnasanasnananannanano Ronnnnnananannanananaanananaanananannanannanananaananannafoneonananonananaonanansanananasnananasnananasnananaanasanasnasanasnananasnanasasnananasnananasnananasnananisnananasnaninasnananasnananaana nananana nq Sansannasassanasasssnasassnnasassnasassanasassanasasaanafcneseesesese
41. re dalla piastra i pozzetti corrispondenti ai controlli positivi al controllo negativo ed ai campioni in analisi Selezionare nella finestra Option il Menu a tendina Target e impostare BK Controllare il corretto settaggio del threshold Selezionare nella finestra Option il Menu a tendina Target e impostare IC Control Controllare il corretto settaggio del threshold L analisi dei risultati si gestisce selezionando nel men a sinistra la pagina Analysis Dalla sottopagina Standard Curve mantenendo aperta nella parte destra del software lo sheet view well plate selezionare i pozzetti contenenti i punti della curva e verificare i parametri descritti nel paragrafo Interpretazione dei Risultati coefficiente di correlazione slope ecc Dalla sottopagina Amplification Plot verificare le curve di amplificazione di ogni singolo campione Aprendo lo sheet view well table nella parte destra del software possibile verificare i dati ottenuti dagli esperimenti Threshold Cycles Fluorescenze emesse e ovviamente la Quantificazione del target espressa in copie reazione o copie ml in funzione di come stata impostata la curva di calibrazione Cliccando dal men file e selezionando il comando export si aprir la finestra export properties Indicare il nome del file selezionare la posizione in cui salvarlo Browse e cliccare il pulsante Start export In questo modo il softw
42. robe VIC Nuclease free water dNTPs Tris HCl KCI MgCl2 Tappo Verde R2 3 x 270 ul RE titolo noto 10 copie ul RNA sintetico corrispondente alla regione 5 UTR a 3x 35 ul ripe titolo noto 10 copie ul RNA sintetico corrispondente alla regione 5 UTR a 3x 35 ul CR titolo noto 10 copie ul RNA sintetico corrispondente alla regione 5 UTR a ne ia titolo noto 10 copie ul R7 1x30 ul Controllo negativo Tappo giallo Istruzioni per l uso ST RT33 ITA 1 MATERIALE E STRUMENTAZIONE NECESSARIA MA NON FORNITA Guanti senza polvere monouso in lattice o simili Microcentrifuga da banco 12 000 14 000 rpm Micropipette e puntali sterili con filtro incorporato per la prevenzione di aerosol Vortex Materiale plastico monouso sterile Micropiastra e pellicole ottiche adesive Reagenti Il kit quanty enterovirus stato sviluppato e validato per essere utilizzato con i seguenti metodi di estrazione Estrazione Manuale EX16 Estrazione di RNA virale da plasma siero urine o tampone Il Sistema consente l estrazione di RNA dai campioni in esame Il kit contiene reagenti utili per 50 estrazioni Clonit srl Real Time PCR Il kit quanty enterovirus stato sviluppato e validato per essere utilizzato con i seguenti stumenti di real time PCR e 7500 Fast Lifetechnologies e Stratagene MX3000P Agilent Technologies e Rotor Gene Q 5 6 plex QIAGEN e CFX96 Real Time PCR System BioRad Assicura
43. robiol 40 8 2823 7 ASSISTENZA TECNICA Per ogni domanda o per assistenza contattare il nostro servizio tecnico e mail info clonit it telefono 39 02 56814413 Dispositivo n vitro diagnostico Consultare le istruzioni per l uso Intervallo di temperatura Utilizzare entro aaaa mm 2unananza azeazananessa anessanenessanaeessasanessism nananana asaneazasaneaeasaneaeanaeeanenaseazasaseseasaeenzanpneseseeasenessasesesesseseesaseseeeaseeeeeaseneseaguesee0sesesessseesessesesessesesesesesene set Controllare il corretto settaggio del threshold nell apposito spazio CT detector FAM i Detector VIC HEX Saggio i CAMPIONE Specificit Diagnostica l l Liu 1 calculation Threshold erunaaismaned Ct gt 280 Da ripate Ai fini della presente valutazione viene considerata specificit diagnostica iaia undetermined ill li la i la capacit del metodo di determinare campioni veri negativi La Lotto xxxx Aprire nuovamente la finestra Analisys Selezionare lo sheet i Ot undetermined i Ct lt 28 iu ADO ia Negativo specificit diagnostica del sistema stata valutata analizzando campioni Quantification e fare doppio clic spuntando la voce cycling AGG i a ae Ot 28 mire irene OSHIVO i genomici umani testati e confermati negativi con un altro sistema yellow i Ctbasso ica an d Valido i Forte Positivo PIESERI IR COMME Codice prodotto Fassssasazaonasani siano ninna nananana ninna ini ii i
44. rs when the software is started Select the wizard Advanced As a first step select the model Two Step Reaction with a double click in the New Run In the next window select the type of rotor installed on the instrument from the list that appears Check the Locking Ring Attached check the checkbox and then click Next Enter the name of the operator and the reaction volume of 30 ul and then click Next In the next window click on edit profile Set the following thermal cycle Select the annealing extension from the thermal profile and click on Acquiring A to cycling In the next window select yellow from the available channels and add it to acquiring channel along with the green channel and click OK In the next window click on OK and then click Next Click on Edit Gain button and set the following values for each channel To begin the course click on the button Start Run You can save the model before you begin your run by clicking on Save Template After clicking on the button Start Run window appears Save As The stroke can be saved in the desired position by the user Once the run started the window Edit Samples allows you to set the name of samples and controls in the positions in which they were loaded on the instrument Select the locations where they were positioned the controls of known concentration and designate them as Enterovirus Standard Clicking on the box next to Type
45. rsi che gli strumenti siano stati correttamente installati calibrati e controllati con la manutenzione tecnica appropriata in accordo con le istruzione del produttore CAMPIONI E CONSERVAZIONE Il prodotto quanty enterovirus progettato per essere utilizzato con RNA estratto dai seguenti campioni biologici Siero e Urine campioni raccolti devono essere trasportati e conservati a 2 8 C ed utilizzati entro 3 giorni dalla data del prelievo Conservare il campione a 20 C se utilizzato dopo 8 giorni PRECAUZIONI D USO Il kit per un uso diagnostico in vitro IVD per uso professionale e non per uso in vivo Una volta ricostituita la miscela di amplificazione deve essere utilizzata in un unica sessione 16 reazioni Il congelamento e scongelamento dei reagenti pi di due volte dovrebbe essere evitati in quanto questo potrebbe influire sulle prestazioni del test reagenti devono essere congelati in aliquote se devono essere utilizzati in modo intermittente Gli utilizzatori devono seguire le norme Good Laboratory Practice GLP Indossare abiti protettivi come camice di laboratorio e guanti monouso durante la manipolazione di campioni Evitare il contatto con tra le mani e occhi o naso durante la raccolta ed uso dei campioni La raccolta di tutti i materiali utilizzati deve essere fatto in appositi contenitori e lo smaltimento svolto in accordo con le leggi locali Disporre aree separate per l estrazione e l alle
46. stimento delle reazioni Non pipettare a bocca alcuna soluzione RNA sintetico corrispondente alla regione 5 UTR a Evitare la formazione di aria nel depositare la miscela all interno delle provette Eliminare ogni bolla prima di procedere con l amplificazione Lavare bene le mani dopo aver maneggiato i campioni ed i reagenti Non scambiare reagenti provenienti da lotti diversi Non infettivo o pericoloso per la salute vedi schede di sicurezza Non mangiare bere o fumare dove i campioni ed i kit vengono utilizzati Leggere attentamente le istruzioni d uso prima di utilizzare il test Non utilizzare oltre la data di scadenza riportata sulla scatola Non utilizzare il kit se l involucro danneggiato LIMITI DEL METODO ED AVVERTENZE L elevata sensibilit della metodica di amplificazione genica rende possibile l insorgenza di falsi positivi dovuti a contaminazioni crociate fra campioni e controlli E pertanto necessario attenersi alle seguenti indicazioni separare fisicamente tutti i materiali e reagenti dedicati alla reazione di amplificazione da quelli utilizzati per altre metodiche e dai prodotti gi amplificati utilizzare puntali con filtro per evitare contaminazioni crociate fra campioni cambiare frequentemente i guanti e aprire le provette con cautela per prevenire la formazione di aerosol chiudere ogni provetta prima di aprirne un altra L ottimale funzionamento della miscela di amplificazione di
47. tes Frequent warming and extended incubation will cause degradation of carrier RNA leading to reduced recovery of viral RNA and eventually false negative RT PCR results This is particularly the case with low titer samples 3 pipet 560 of prepared buffer AVL carrier RNA into a 1 5 ml microcentrifuge tube 4 add 140 plasma serum urine or swab liquid carrier to the buffer AVL carrier RNA in the microcentrifuge tube Mix by pulse vortexing for 15 s incubate at room temperature 15 25 C for 10 min briefly centrifuge the tube to remove drops from the inside of the lid On Sveles denaturation va add 560 of ethanol 95 to the sample and mix by pulse vortexing for 15 s After mixing briefly centrifuge the tube to remove drops from inside the lid 8 carefully apply 630 1 of the solution from step 7 to the spin column in a 2 ml collection tube without wetting the rim Close the cap and centrifuge at 6000 x g 8000 rpm for 1 min Place the QlAamp Mini column into a clean 2 ml collection tube and discard the tube containing the filtrate 9 carefully open the spin column and repeat step 8 10 carefully open the spin column and add 500 of buffer AW1 Close the cap and centrifuge at 6000 x g 8000 rpm for 1 min Place the spin column in a clean 2 ml collection tube provided and discard the tube containing the filtrate 11 carefully open the spin column and add 500 of buffer
48. to T Ylinen T Peltola V Susi P Hyypia T Waris M Simultaneous detection and differentiation of human rhino and enteroviruses in clinical specimens by real time PCR with locked nucleic Acid probes References J Clin Microbiol 2013 Dec 51 12 3960 7 doi 10 1128 JCM 01646 13 Epub 2013 Sep 18 Qian Chena Zheng Hua Qihua Zhanga Minghui Yu Development and evaluation of a real time method of simultaneous ampli cation and testing of enterovirus 71 incorporating a RNA internal control system References Journal of Virological Methods 196 2014 139 144 Bustin SA 2000 Absolute quantification of mRNA using real time reverse transcription polymerase chain reaction assays J Mol Endocrinol 25 2 169 193 Bustin SA 2000 Quantification of mRNA using real time reverse transcription PCR RT PCR trends and problems J Mol Endocrinol 29 1 23 39 Freeman WM1 Walker SJ Vrana KE 1999 Quantitative RT PCR pitfalls and potential Biotechniques 1999 26 1 112 22 124 5 Larionov A Krause A Miller W 2005 A standard curve based method for relative real time PCR data processing BMC Bioinformatics 6 62 Fabbricante Contenuto sufficiente per n saggi EDMA code 1504400200 CND W0105040502 Il kit quanty enterovirus un kit diagnostico marcato CE in accordo con le direttive diagnostiche Europee 98 79 CE al CLONIT S r l Headquarter Via Varese 20 20121 Milano Production Site Via B Quaranta 57
49. tra successiva selezionare il tipo di rotore montato sullo strumento dalla lista che appare Controllare il Locking Ring Attached spuntare la casella di controllo e quindi fare clic su Avanti Inserire il nome dell operatore e il volume di reazione di 30 ul e fare clic su Avanti Nella finestra successiva fare clic su edit profile Impostare ciclo termico seguente i Cicli denaturazione annealing Estensione __ coli 50 C 20 min di ee i ae 95 C 2 min E cdi into nd 015 SOC 08 C 45sec i O 19 SC i Selezionare la fase di annealing extension dal profilo termico e fare clic su Acquiring to cycling A Nella finestra successiva selezionare il giallo da available channel e aggiungerlo a acquiring channel insieme al canale verde e fare clic su ok Cliccare sul pulsante Edit Gain ed impostare i seguenti valori per i due canali interessati Nella finestra successiva fare clic su ok e poi su Avanti Per avviare la corsa fare clic sul pulsante Start Run E anche possibile salvare il modello prima di iniziare la corsa facendo clic su Save Template Dopo aver fatto clic sul pulsante Start Run viene visualizzata la finestra Save As La corsa pu essere salvata nella posizione desiderata dall utente Una volta che la corsa iniziata la finestra Edit Samples permette di impostare il nome di campioni e controlli nelle posizioni in cui sono stati caricati sullo strumento Selezionare le posizio
50. trazione espresso in ul Ea Volume di campione estratto utilizzato per l amplificazione espresso in ul Creaz copie fornite dallo strumento I risultati ottenuti con questo saggio devono essere interpretati considerando tutti i dati clinici e gli altri esami di laboratorio relativi al paziente L utilizzo del controllo positivo e negativo all interno di ogni sessione di amplificazione consente di verificare il corretto funzionamento della miscela e l assenza di possibili contaminazioni Nelle reazioni di amplificazione di ciascun campione i valori di Ct della sonda specifica per il controllo interno vengono utilizzati per convalidare CARATTERISTICHE FUNZIONALI Sensibilit analitica Ai fini della presente valutazione viene considerata sensibilit analitica la maggiore diluizione titolo a cui un campione positivo pu essere diluito senza che il sistema perda la capacit di rilevarlo come positivo con un rate 95 La sensibilit analitica del sistema stata valutata analizzando RNA sintetico quantificato mediante analisi spettrofotometrica contenente la regione di interesse del virus 5 UTR in diluizioni scalari La sensibilit analitica per il test quanty Enterovirus determinata mediante l analisi Probit risulta essere di 0 70 copies ul 95 confidence interval Cl 0 24cps ul 8 32cps ul Sensibilit clinica Ai fini della presente valutazione viene considerata sensibilit clinica la capacit di
51. zato E stata inoltre effettuata un analisi su campioni positivi per altri virus ed il test stato eseguito seguendo le indicazioni riportate nella metodica Campioni positivi INTERFERENZE Verificare che nell RNA estratto dal campione di partenza non vi siano presenti mucoproteine ed emoglobina in modo da escludere eventuali inibizioni nella reazione di PCR L interferenza dovuta a contaminanti pu essere evidenziata mediante l analisi spettrofotometrica e rapporto dei dati ottenuti a 260 nm Assorbimento massimo Acidi Nucleici e 280 nm Assorbimento massimo Proteine Un RNA puro dovrebbe avere un rapporto di circa 2 CONTROLLO QUALITA Si consiglia inoltre di inserire come controllo di qualit interno di ciascuna sessione di estrazione amplificazione e rilevamento un campione negativo ed un campione positivo gi testati in precedenza o materiale di riferimento a titolo noto In conformit con il sistema di gestione della qualit certificato ISO EN 13485 di Clonit srl ogni lotto di quanty Enterovirus stato testato contro specifiche predeterminate al fine di garantire una qualit costante del prodotto BIBLIOGRAFIA Dubot P r s A Tan CY de Chesse R Sibounheuang B Vongsouvath M Phommasone K Bessaud M Gazin C Thirion L Phetsouvanh R Newton PN de Lamballerie X SYBR green real time PCR for the detection of all enterovirus A71 genogroups References PLoS One 2014 Mar 20 9 3 e89963 Osterback R Tevaluo
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