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INNO-LiPA HLA-DRB1 Plus

1. 59 Manipulaci n de tiras 59 Instrucciones para la incubaci n manual 59 Instrucciones para el cambio manual del l quido de las cubetas 60 Observaciones y precauciones seh 60 Procedimiento de ensayo manual 60 WIESE as el Nina Sn ne E EE a e 61 Desnaturalizaci n e hibridaci n 61 Lavado astringente 61 Revelado de Cont cesis zd Ree Rx oe Vae Ua CREER RC UA Y 62 Procedimiento de ensayo automatizado Auto LiPA 62 Resultados uxo Sotto oque A A EEN ue ebore a pun X 62 Lectia So dise y iq a RU ERU da edd We Si oe S TA 62 Validaci n 2 55 Syahid manner inrer ei 62 Interpretaci n de los resultados 63 Software de interpretaci n LIRAS 63 Limitaciones del procedimiento 63 Eficacia del ensayo ise ALA OE RT eru REA A 64 Eficacia del ensayo utilizando ADN obtenido con la soluci n de cebador DRB1 en combinaci n con el protocolo Il de PCR 64 Eficacia del ensayo utilizando ADN obtenido con la soluci n de cebador DRB1 en combinaci n con el protocolo de PCR 66 Eficacia del ensayo utilizando ADN obtenido con la soluci n de cebador DRB1 03 11 13 14 en combinaci n con el protocol
2. Reagentes fornecidos Cont m 20 tiras para INNO LiPA HLA DRB1 Plus assinaladas com uma linha preta de marcac o Cont m cido etilenodiaminotetrac tico EDTA e 0 01 de metilisotiazolona MIT 0 1 de cloroacetamida CAA como Solu o alcalina contendo EDTA Deve se fechar o frasco imediatamente ap s uso a exposi o prolongada da solu o ao ar resulta na r pida deteriora o da for a de desnatura o Tamp o salino de fosfato de s dio EDTA SSPE contendo 0 5 sulfato de s dio dodecil SDS A solu o de hibridiza o deve ser pr aquecida at atingir pelo menos os 37 C n o podendo a temperatura exceder os 56 C todos os cristais devem ser dissolvidos antes da Tamp o SSPE contendo 0 1 SDS A solu o de lavagem rigorosa deve ser pr aquecida at atingir pelo menos os 37 C n o podendo a temperatura exceder os 56 C todos os cristais devem ser dissolvidos antes da sua utiliza o Tamp o fosfato contendo NaCl Triton estabilizadores proteicos e 0 01 MIT 0 1 CAA como conservante Streptavidina marcada com fosfatase alcalina em tamp o tris contendo estabilizadores proteicos e 0 0196 MIT 0 09896 CAA como conservante para ser dilu da a 1 100 em diluente conjugado Prepare 2 ml de soluc o conjugada de trabalho para cada cavidade teste 2 ml em excesso a solug o conjugada de trabalho pode ser preparada durante a lavagem rigorosa para o teste manual Para Auto LiPA p
3. 49 Lavaggio stringente 49 Sviluppo del colofe 25 ifc dE aaa ER 50 Procedura automatizzata del test Auto LiPA 50 Risultati aerea erin earn eri Ra roi ti 50 LEMA Jan cs Seta RAR RAEE RATA ARA I 50 KT si i et I OL ORA ER 50 Interpretazione dei risultati 51 Software d interpretazione LIRAS 51 Limiti della procedura 51 Performance del TE vues ie ee e tt a ec H 52 Esecuzione del test usando DNA ottenuto con soluzione primer DRB1 in combinazione con protocollo PCR II 52 Esecuzione del test usando DNA ottenuto con soluzione primer DRB1 in combinazione con protocollo POR I 54 Esecuzione dei test usando DNA ottenuto con soluzione primer DRB1 03 11 13 14 in combinazione con protocollo POR 1 54 Espa ol Uso al que est destinado 55 Principio del ensayo toco tad RR RU IS 55 REAC VOSY A Gat PI e E TENETUR ATO 56 Descripci n preparaci n para el uso y condiciones de almacenamiento recomendadas a ro seh pd hema se IgE M 56 Materiales necesarios pero no suministrados 58 Seguridad y medio ambiente 58 MUSSTAS i A a a a Ca 59 Procedimientos de manipulaci n
4. Les chantillons doivent toujours tre manipul s comme potentiellement infectieux Tout constituant d riv du sang ainsi que tout mat riel biologique doit donc tre consid r comme potentiellement infectieux et devra tre manipul avec les pr cautions d usage Seul le personnel qualifi doit tre autoris r aliser le test Tous les d riv s sanguins et mat riels biologiques doivent tre limin s selon les proc dures de s curit en vigueur Autoclave au moins 15 min 121 C ncin ration des mat riels jetables M langer les d chets liquides avec de l hypochlorite de sodium une concentration finale d environ 196 Laisser en contact une nuit avant l vacuation ATTENTION Les liquides contenant de l acide doivent tre neutralis s avant ajout d hypochlorite de sodium L utilisation d un quipement pour protection du personnel est n cessaire gants et crans lors de la manipulation d agents dangereux ou infectieux Les d chets doivent tre trait s en accord avec les r gles d limination des d chets en vigueur Toutes les r glementations f d rales nationales et locales doivent galement tre observ es Echantillons Le test LiPA utilisant de l ADN amplifi biotinyl comme chantillon il est accompagn d un kit d amplification INNO LiPA DRB1 Amp Plus Proc dures de manipulation Bandelettes Les bandelettes ne sont pas r utilisables Ne pas toucher les bandelette
5. Materiali richiesti ma non forniti Bagnomaria con piatto agitante 80 rpm con coperchio inclinato temperatura programmabile a 56 C 0 5 C Sistema di aspirazione Termometro tarato Agitatore orbitale reciproco o basculante Raccomandazioni Per un agitatore orbitale il diametro del movimento circolare deve essere uguale o superiore a 13 mm la velocit raccomandata per un movimento circolare di 13 mm 160 rpm Per un agitatore reciproco la velocit raccomandata per il movimento avanti e indietro 80 movimenti al minuto Per un agitatore basculante angolo di oscillazione non deve superare i 13 al fine di evitare fuoriuscita di liquido si raccomanda una velocit di 50 rpm Agitatore Vortex o equivalente Cilindri graduati 10 25 50 e 100 ml Acqua distillata o deionizzata Guanti monouso Puntali sterili monouso preferibilmente con filtro Pinzette per maneggiare le striscie Pipette regolabili per dispensare da 1 20 ul da 20 200 ul e da 200 1000 ul Pipetta a ripetizione Eppendorf opzionale Timer 2 ore 1 minuto Sicurezza e ambiente Percortesia fare riferimento alle schede di sicurezza del produttore e alle etichette del prodotto per informazioni sui componenti potenzialmente pericolosi R20 21 R36 R45 R61 S36 37 845 53 Tossico T Nocivo se inalato o messo a contatto con la pelle Irritante per gli occhi Pu provocare cancro
6. Substrate Buffer 1x 180 ml 56953 Tris buffer containing NaCl MgClo and 0 0196 MIT 0 1 CAA as preservative INNOGENETICS9 10 Substrate BCIP NBT 100x 1 x 0 8 ml 56954 5 Bromo 4 chloro 3 indolyl phosphate p toluidine salt BCIP and 4 nitroblue tetrazolium NBT in dimethylformamide DMF to be diluted 1 100 in Substrate buffer before use Prepare 2 ml Substrate working solution for each test trough 2 ml in excess Substrate working solution can be prepared during conjugate incubation for manual testing For Auto LiPA make 10 ml in excess The Substrate working solution is stable for 24 hours at room temperature 20 25 C if stored in the dark Rinse Solution 5x 1x80 ml 56721 Phosphate buffer containing NaCl Triton and 0 05 MIT 0 48 CAA as preservative to be diluted 1 5 1 part 4 parts in distilled or deionized water before use Prepare 8 ml Rinse working solution for each test trough 10 ml in excess For Auto LiPA make 10 ml in excess The Rinse working solution is stable for 2 weeks at 2 8 C Incubation tray 3 Containing 8 troughs each Reading card 1 For identification of positive probes Data reporting sheet 2 For storage of developed strips Materials required but not provided Water bath with shaking platform 80 rpm with inclined lid temperature adjustable to 56 C 0 5 C Aspiration apparatus Calibrated thermometer Orbital reciprocal or rocking platform shaker Re
7. preferably attached to a vacuum aspirator Add 2 ml pre warmed Stringent Wash Solution into each trough and rinse by rocking the tray briefly 10 20 seconds at 20 25 C Aspirate the solution from each trough Repeat this brief washing step once 3 Atlast aspirate solution and incubate each strip in 2 ml pre warmed Stringent Wash Solution in the shaking water bath at 56 C 0 5 C for 10 minutes Close the lid of the water bath Before incubation check the temperature of the water bath using a calibrated thermometer and adjust the temperature if necessary Always close the lid NOTE Dilute the concentrated Rinse Solution 5x and Conjugate 100x during stringent wash See Reagents Color development All subsequent incubations are carried out at 20 25 C on a shaker During the incubations the liquid and test strips should move back and forth in the trough for homogeneous staining 1 Wash each strip twice for 1 minute using 2 ml of the Rinse working solution 2 Add2ml of the Conjugate working solution to each trough and incubate for 30 minutes while agitating the tray on the shaker NOTE Dilute the Substrate BCIP NBT 100x solution about 10 minutes prior to the end of the conjugate incubation See Reagents 3 Wash each strip twice for 1 minute using 2 ml of the Rinse working solution and wash once more using 2 ml Substrate Buffer 4 Add2ml of the diluted Substrate working solution to each trough and incubate for 30 m
8. DRB1 08 DRB1 11 o DRB1 11 DRB1 13 1 caso DRB1 11 DRB1 12 o DRB1 12 DRB1 13 2 casi Per tutti i risultati ambigui il software d interpretazione LIRAS ha consigliato un amplificazione DRB1 03 11 13 14 seguita da ibridazione con la strip INNO LiPA HLA DRB1 Precisione La variazione della ripetibilit intra test inter test e inter persona stata valutata in sede Un campione amplificato in duplicato usando tre diversi variatori ed elaborando due esecuzioni per variatore stato testato usando lo strumento Auto LiPA Questo protocollo stato eseguito in duplicato da due persone diverse Non si sono osservate variazioni significative e si ottenuto un risultato di tipizzazione identico in tutti i casi senza bisogno di modifiche Espa ol Uso al que est destinado INNO LiPA HLA DRB1 Plus es un ensayo de sondas en tira para uso in vitro dise ado para determinar el tipaje molecular de los alelos DRB1 del ant geno leucocitario humano HLA a nivel de grupo de alelos de DRB1 01 a DRB1 16 Principio del ensayo Los ensayos INNO LiPA HLA de tipaje se basan en el principio de hibridaci n reversa Se desnaturaliza qu micamente ADN biotinilado amplificado y se hibridan las hebras separadas con sondas de oligonucle tidos espec ficos inmovilizadas como bandas paralelas en tiras basadas en membranas A continuaci n se realiza un lavado astringente para quitar material amplificado incorrectamente empareja
9. DRB1 14 3 Falle DRB1 04 DRB1 13 oder DRB1 04 DRB1 14 6 F lle DRB1 08 DRB1 11 oder DRB1 11 DRB1 13 1 Fall DRB1 11 DRB1 12 oder DRB1 12 DRB1 13 2 F lle F r alle widerspr chlichen Ergebnisse empfahl die LiRAS Interpretationssoftware eine DRB1 03 11 13 14 Amplifikation gefolgt von einer Hybridisierung mit dem INNO LiPA HLA DRB1 Teststreifen Pr zision Die Wiederholung intra assay und die inter assay und inter person Abweichung wurde hausintern evaluiert Eine Probe zweifach amplifiziert unter Verwendung von drei verschiedenen Cyclern und der Bearbeitung von zwei L ufen pro Cycler wurde mit dem Auto LiPA Instrument getestet Dieses Protokoll wurde durch zwei verschiedene Personen in zweifacher Ausf hrung durchgef hrt Es wurde keine signifikante Abweichung festgestellt und in allen F llen wurde ein identisches Typisierungsergebnis ohne Bedarf einer Bearbeitung erzielt Italiano Uso previsto INNO LiPA HLA DRB1 Plus un test su striscia a sonde allineate LiPA per l uso in vitro progettato per la tipizzazione molecolare degli alleli degli antigeni leucocitari umani HLA DRB1 a livello del gruppo allelico da DRB1 01 a DRB1 16 Principio del test test di tipizzazione INNO LiPA HLA si basano sul principio dell ibridazione inversa Il DNA biotinilato e amplificato viene denaturato chimicamente e i filamenti separati vengono ibridati con sonde oligonucleotidiche specifiche immobilizzate come linee
10. Diese Linie muss immer positiv sein au er bei der Negativkontrolle ihre Intensit t kann jedoch von Probe zu Probe variieren Die Teststreifen aller Negativ Kontrollen d rfen au er der Konjugatkontrolllinie keine sichtbaren Linien aufweisen Die LiPA Kontrollprobe f r INNO TPA HLA DRB1 Plus muss das folgende Muster an positiven Sonden aufweisen Konjugatkontrolle HLA DRB Kontrolle 2 8 23 25 26 30 33 37 Diese Kontrollprobe besteht aus biotinylierten Oligonukleotiden die zu den bereits genannten Hybridisierungssonden komplement r sind Eine positive Hybridisierung bei diesen Sonden zeigt deshalb eine zufriedenstellende Testdurchf hrung an einschlie lich Hybridisierung Stringent Waschl sung Schritt Farbentwicklung und Nachweis Ein anderes Muster kann Testprobleme aufzeigen wie z B falsche Temperatur w hrend der Hybridisierung oder Abweichungen von den vorgeschriebenen Inkubationszeiten oder der Temperatur Die Farbintensit t der Sonden auf einem Streifen kann von Linie zu Linie variieren Interpretation der Ergebnisse LiPA Kontrollprobe auf korrektes Reaktivit tsmuster berpr fen Die Konjugatkontrolllinie auf dem Streifen muss an der Markierungslinie auf der Kunststoffableseschablone ausgerichtet werden Pr fen Sie zuerst ob die Kontrolllinien positiv sind ersten zwei Linien um jeden einzelnen Teststreifen zu validieren siehe Validierung Typisierungsergebnisse basieren auf der Reaktivit t der Sonden im K
11. L ampiezza del movimento generato sia dal bagnomaria in agitazione procedura di ibridazione che dall agitatore procedura di sviluppo di colore critica nel raggiungere la massima sensibilit e una colorazione omogenea La superficie delle strisce deve essere completamente immersa L ampiezza deve essere la pi grande possibile In ogni caso evitare che i liquidi si riversino sul bordo delle vaschette Ci pu portare a cross contaminazioni e risultati non validi L agitazione delle strisce durante l incubazione deve essere eseguita in modo tale che sia il liquido che le strisce di test si muovano avanti e indietro nella vaschetta senza che il liquido arrivi a versarsi oltre il bordo delle vaschette Non coprire il vassoio portavaschette Durante le incubazioni di ibridazione e di lavaggio stringente le vaschette possono essere lasciate scoperte dentro il bagnomaria Coprire le vaschette con copripiastra adesivo pu causare cross contaminazione Indicazioni per il cambio manuale dei liquidi nelle vaschette Il liquido va aspirato dalla vaschetta con una pipetta preferibilmente attaccata a un aspiratore a vuoto Il vassoio va tenuto inclinato per permettere a tutto il liquido di raccogliersi ad un angolo della vaschetta Aggiungere 2 ml della soluzione appropriata a ciascuna vaschetta e seguire il protocollo Una pipetta a ripetizione Eppendorf utile a questo scopo Ripetere questo passaggio tante volte quanto indicato nella proced
12. O INNO LiPA HLA DRB1 Plus um ensaio de sondas em linha LIPA para uso in vitro desenvolvido para a tipagem molecular de alelos DRB1 do antig nio leucocitario humano HLA ao nivel do grupo de alelos DRB1 01 a DRB1 16 Principio do teste Os testes INNO LiPA HLA baseiam se no princ pio da hibridizac o reversa O material com ADN amplificado com biotina quimicamente desnaturado as cadeias separadas s o hibridizadas com sondas de oligonucle tidos espec ficos e imobilizadas como linhas paralelas nas tiras das membranas De seguida executada a etapa de lavagem rigorosa para remover qualquer material amplificado incompat vel Depois da lavagem rigorosa a streptavidina conjugada com fosfatase alcalina adicionada e liga se a quaisquer h bridos com biotina formados anteriormente A incuba o com uma solu o de substrato contendo um cromog nio origina um precipitado p rpura castanho Esta reacg o terminada por uma etapa de lavagem e O padr o de reactividade das sondas registado Assim como o kit INNO LiPA HLA DRB1 Plus h tamb m sua disposic o um kit de amplificac o INNO LiPA HLA DRB1 Amp Plus para a preparac o estandardizada de material biotinilado amplificado O kit de amplifica o tem como base a reac o em cadeia da polimerase PCR polymerase chain reaction Os produtos amplificados s o em seguida hibridizados usando 1 tira de tipagem que cont m 37 sondas ADN espec ficas da sequ nci
13. Pu causare danni al feto Indossare appropriati abiti protettivi e guanti In caso di incidente o malore rivolgersi immediatamente ad un medico mostrando l etichetta se possibile Evitare l esposizione utilizzare le speciali istruzioni per l uso Ristretto ad utilizzatori professionali Contiene dimetilformammide 5 bromo 4 cloro 3 indolilfosfato sale d p toluidina Substrato BCIP NBT 100x R43 S24 37 Irritante Xi Evitare il contatto con la pelle Pu causare sensibilizzazione per contatto con la pelle Indossare appropriati guanti protettivi Contiene 2 Cloroacetammide Soluzione di Risciacquo Tampone Substrato Diluente Coniugato e Controllo LiPA 47 INNO LiPA HLA DRB1 Plus x R36 38 S23 24 26 Irritante Xi Irritante per gli occhi e per la pelle Non inalare i vapori Evitare il contatto con la pelle In caso di contatto con gli occhi sciacquare immediatamente ed abbondantemente con acqua e cercare consulto medico Contiene idrossido di sodio Soluzione di Denaturazione Tutti i componenti del sangue ed i materiali biologici devono sempre essere considerati come potenzialmente infetti e manipolati come tali L esecuzione del test dovrebbe essere permessa solo a personale adeguatamente preparato Tutti i componenti di sangue e i materiali biologici dovrebbero essere smaltiti in accordo a procedure di sicurezza standardizzate Autoclavare per almeno 15 minuti a 121 C ncenerire il materiale monouso Miscelare i
14. es l aide de l instrument Auto LiPA l aide du programme HLA56v3 et l interpr tation a t r alis e l aide d une version d essai clinique du logiciel d interpr tation LiRAST pour LIPA HLA v3 00 Sensibilit du test La sensibilit du test au niveau du groupe d all les a t d finie comme le nombre de r sultats de typage r ussis par rapport au nombre total d chantillons test s La sensibilit du test au cours de cette valuation tait de 100 89 89 95 Cl 95 9 100 Pr cision du diagnostic Le calcul de la pr cision du diagnostic n a t effectu que sur les chantillons pr sentant un r sultat de r f rence unique Deux chantillons ont donc t exclus de ce calcul Un r sultat de typage HLA DRB1 unique a t obtenu pour les 87 chantillons restants La pr cision du diagnostic du test au niveau du groupe d all les a t d finie comme le nombre de r sultats de typage obtenus correctement compar au r sultat de typage unique obtenu l aide de INNO LiPA HLA DRB1 Innogenetics ou d un autre test de typage Olerup SSP GenoVision ou Allset DR Low Resolution Dynal Les r sultats du typage des 87 chantillons correspondant au test de r f rence la pr cision du diagnostic tait donc de 100 87 87 95 CI 95 9 100 R activit des sondes A une ou plusieurs occasions au cours de cette tude certaines sondes ont donn des r actions faibles Un typage concordant au
15. parallele sulla membrana delle strisce di reazione Segue poi un passaggio di lavaggio stringente al fine di rimuovere eventuale materiale amplificato legatosi in maniera non specifica Dopo il lavaggio stringente viene aggiunta streptavidina coniugata con fosfatasi alcalina che si lega ad ogni ibrido biotinilato formatosi in precedenza L incubazione con una soluzione di substrato contenente cromogeno porta alla formazione di un precipitato porpora marrone La reazione viene bloccata da un passaggio di lavaggio e viene registrato il pattern di reattivit delle sonde Insieme al kit INNO LiPA HLA DRB1 Plus disponibile un kit di amplificazione INNO LiPA HLA DRB1 Amp Plus per la preparazione standardizzata di materiale amplificato e biotinilato Questo kit di amplificazione si basa sulla reazione polimerasica a catena PCR prodotti di amplificazione vengono successivamente ibridati usando 1 striscia di tipizzazione sulla quale sono fissate 37 sonde DNA sequenza specifiche e 2 bande di controllo Figura 1 L utilizzo di questo prodotto coperto da licenza di E Hoffmann La Roche Ltd e Roche Molecular Systems Inc INNOGENETICS9 44 INNO LiPA HLA DRB1 Plus passaggi da eseguire Punto 1 Amplificazione dell esone 2 degli alleli HLA DRB1 Punto 2 Ibridazione e lavaggio stringente con 37 sonde immobilizzate su una striscia INNO LiPA HLA DRB1 Plus 56 C Punto 3 Sviluppo del colore Punto 4 Interpretazione del pattern di
16. se recomienda empezar con a y Seguir con b si se producen ambig edades relacionadas con los alelos DRB1 03 11 13 14 y otros alelos DRB1 As lo recomendar el software de interpretaci n LIRAS INNOGENETICS9 56 a la amplificaci n del ex n 2 de los alelos HLA DRB1 03 11 13 14 con la soluci n del cebador HLA DRB1 antes de analizar con la tira de INNO LiPA HLA DRB1 Plus b la amplificaci n espec fica del grupo del ex n 2 de los alelos HLA DRB1 03 11 13 14 con la soluci n del cebador HLA DRB1 03 11 13 14 antes de analizar con la tira de INNO LiPA HLA DRB1 Plus La soluci n del cebador HLA DRB1 03 11 13 14 suministrada amplifica el ex n 2 de los alelos HLA DRB1 03 11 13 14 No se amplificar el ex n 2 de otros alelos DRB1 a excepci n del alelo DRB1 0820 INNO LiPA HLA DRB1 Plus se ha dise ado para proporcionar la mejor resoluci n posible con el formato de ensayo de hibridaci n reversa a nivel de grupo de alelos se indica mediante los dos primeros d gitos despu s del asterisco en el nombre del alelo seg n la nomenclatura est ndar de HLA por ejemplo HLA DRB1 01 Adem s de la interpretaci n del grupo de alelos el software proporcionar todas las combinaciones posibles de alelos No obstante no debe considerarse esta informaci n como decisiva sino como datos adicionales Reactivos Descripci n preparaci n para el uso y condiciones de almacenamiento recomendadas Silos reactivos se almacena
17. thermom tre calibr et ajuster si n cessaire Toujours fermer le couvercle NOTE Diluer la Solution de Ringage concentr e 5x et le Conjugu 100x pendant l tape de Lavage Stringent Voir R actifs R v lation Toutes les incubations suivantes sont effectu es 20 25 C sur un agitateur Durant les incubations veiller ce que les bandelettes et la solution effectuent un mouvement de va et vient dans les compartiments pour homog n iser la coloration 1 Laver chaque bandelette deux fois pendant 1 minute l aide de 2 ml de Solution de travail de Ringage 2 Ajouter 2 ml de la Solution de travail de Conjugu dans chaque compartiment et incuber 30 minutes sous agitation NOTE Diluer la Solution de Substrat BCIP NBT 100x 10 minutes environ avant la fin de l incubation Voir R actifs 3 Laver deux fois chaque bandelette pendant 1 minute l aide de 2 ml de Solution de travail de Ringage puis une nouvelle fois avec 2 ml de Tampon Substrat 4 Ajouter 2 ml de la Solution de travail de Substrat dilu e dans chaque compartiment et incuber 30 minutes sous agitation ATTENTION Porter des gants et des lunettes de protection 5 Stopper la r v lation en lavant les bandelettes deux fois dans 2 ml d eau distill e Sous agitation pendant au moins 3 minutes 6 A l aide de pinces en plastique retirer les bandelettes des compartiments et les d poser sur du papier absorbant Laisser s cher compl tement les band
18. 0304 x 1309 las doce muestras La alternativa DRB1 1309 a DRB1 15 en presencia del alelo DRB1 03 es un alelo raro de origen hisp nico El alelo DRB1 0304 relacionado es tambi n extrafio y fue detectado por primera vez en tres caucasianos no relacionados Este alelo tiene una secuencia con similitudes a DRB1 0301 el cual fue dado como primera alternativa Reproducibilidad Tipajes realizados utilizando distintos lotes del equipo INNO LiPA HLA DRB1 y las mismas muestras cl nicas de DNA obtenidas durante el estudio dieron en cada caso resultados reproducibles en la reactividad de las sondas Precisi n Durante la evaluaci n externa el equipo INNO LiPA HLA DRB1 mostr una concordancia completa con los m todos de referencia Resumen del n mero de muestras 243 N mero total de reacciones de amplificaci n intentadas ning n fallo 211 N mero total de resultados no ambiguos a nivel de tipaje de grupo de alelos 32 ambig edades 203 243 N mero de muestras comparadas con el INNO LiPA DRB key utilizado para medir la concordancia 40 243 N mero de muestras analizadas por PCR SSP tambi n usado para medir la concordancia INNOGENETICS9 66 Eficacia del ensayo utilizando ADN obtenido con la soluci n de cebador DRB1 en combinaci n con el protocolo de PCR A B Bw4 C DRB1 DRB1 03 11 13 14 Con el fin de evaluar la equivalencia entre los protocolos de PCR y Il se probaron internamente 42 muestras utilizando ambos m
19. 44 22 Consignes de s curit 22 Echantillons orto grate ie S EST wenn EE aa 23 Proc dures de manipulation 23 Bandelelf s io ec un oq easet mismo ir eA MNT EFE ie 23 Directives pour incubation manuelle 23 Directives pour changement des solutions 24 Remarques et pr cautions 24 Procedure manuelle usare e rra ERE DAMAGE S 25 EH pat bli A da Generate es 25 D naturation et hybridation 25 Lavage stringent us ip panda db a UI 25 ROVIGO oo I SU ad Medo Gc ooa die ftu esr ea pss aom M esto i 26 INNOGENETICS is a Registered Trademark of Innogenetics N V 3 INNO LiPA HLA DRB1 Plus Proc dure automatis e Auto LiPA 26 R sultats sans 202 RA Senden do ue RES ERA 26 Boi M CIN EA EE SOA Ne i 26 Valdalon EE 26 Interpr tation 2 2 2 0 Se are PST DA ORE RA 27 Logiciel d interpr tation LRAG 27 Limites d test attente lb POLARE ee RSA 27 Performances Sa 2 424 de aa oh Er ee xd ages 28 Performances l aide d ADN obtenu l aide de la Solution Amorce DRB1 associ e au protocole PCR II 28 Performances l aide d ADN obtenu l aide de la Solution Amorce DRB1 associ e au protocole POR I 29 Performances l aide d ADN obtenu l aide de l
20. 89 89 95 CI 95 9 100 Precisi n de diagn stico nicamente se llevaron a cabo c lculos de precisi n de diagn stico en las pruebas en las que se produjo un nico resultado de referencia Como consecuencia dos de las muestras quedaron excluidas de este c lculo En las 87 muestras restantes se obtuvo un nico resultado de identificaci n del tipo HLA DRB1 La precisi n de diagn stico del ensayo en el nivel de grupo de alelos se calcul como el n mero de resultados correctos de identificaci n del tipo en comparaci n con el resultado nico de identificaci n del tipo obtenido con INNO LiPA HLA DRB1 Innogenetics o un ensayo alternativo de identificaci n del tipo Olerup SSP GenoVision o Allset DR Low Resolution Dynal Los resultados de identificaci n del tipo de todas las muestras 87 concordaron con el ensayo de referencia por lo que la precisi n de diagn stico fue del 100 87 87 95 CI 95 9 100 Reactividades de las sondas En una o varias ocasiones durante este estudio algunas de las sondas produjeron reacciones d biles La concordancia de identificaci n del tipo en el nivel de grupo de alelos se obtuvo cuando se utiliz el software de interpretaci n LIRAS 67 INNO LiPA HLA DRB1 Plus Resoluci n tabla de tipos v5 8 021112 La soluci n de cebador DRB1 utilizada en combinaci n con la tira de INNO LiPA HLA DRB1 se ha dise ado para identificar el tipo de los alelos HLA DRB1 en e
21. Allelen und der DRB1 11 Allelgruppe wurden Sequenz hnlichkeiten dokumentiert Sowohl die DRB1 13 Allele die zu Nicht Eindeutigkeit f hren als auch die des DRB1 0415 Allele treten selten auf Ein Antigen war in 9 66 13 696 der Proben mit entweder DRB1 13 oder DRB1 14 nicht eindeutig f r DRB1 13 14 Diese Allele die zu Nicht Eindeutigkeit f hren werden von der LiPA Expert Software wie folgt angegeben DRB1 0103 x 1417 1430 3 Proben DRB1 0402 0414c13H x 1421 5 Proben und DRB1 0402 0414 x 1417 1430 1 Probe In Gegenwart von DRB1 04 werden erst seit kurzem bekannte selten auftretende Allele von DRB1 14 1417 1421 und 1430 als Alternative zur Allelgruppe DRB1 13 angegeben Die spezifischen Alternativen DRB1 14 1417 und 1430 s oben zu den DRB1 13 Allelen in Gegenwart von DRB1 01 werden beide als selten angesehen Ein Antigen war in 12 97 12 496 der Proben mit entweder DRB1 13 oder DRB1 15 nicht eindeutig f r DRB1 13 15 Diese Allele die zu Nicht Eindeutigkeit f hren werden von der LiPA Expert Software wie folgt angegeben DRB1 0304 x 1309 alle 12 Proben DRB1 1309 als Alternative zu DRB1 15 in Gegenwart von DRB1 03 ist ein seltenes Allel hispanischer Herkunft Das Allel DRB1 0304 mit dem es zusammen gefunden wurde tritt ebenfalls selten auf und wurde zuerst bei drei nicht untereinander verwandten Kaukasiern gefunden Es weist Sequenz hnlichkeiten mit DRB1 0301 auf das als die erste Alternative angeg
22. Directions for manual changing liquid in the troughs The liquid is aspirated from the trough with a pipette preferably attached to a vacuum aspirator The tray is held at an angle to allow all liquid to flow to one end of the trough Add 2 ml of the appropriate solution to each trough and follow the protocol A dispensing Multipette Eppendorf is useful for this purpose Repeat this step as many times as indicated in the test procedure NOTE Do not allow the strips to dry between two steps Make sure not to damage the surface of the strips when aspirating Aspirate the liquid at the top of the strip above the marker line Make sure all liquid is aspirated Make sure the whole strip is thoroughly washed by complete submersion in the solution Adapt the speed of the shaker when necessary Remarks and precautions For professional use only In order to avoid DNA contamination a maximum physical separation between the pre and post amplification steps is recommended separate rooms separate pipettes and other lab material separate lab coats and gloves and their stock are minimum precautions for a good laboratory practice Avoid any return from the post amplification room to the pre amplification room The use of autoclaved disposable lab material is recommended Do not reuse disposable lab material 13 INNO LiPA HLA DRB1 Plus Use a new sterile pipette tip for each aliquoted specimen Do not use the reagents be
23. Lavaggio Stringente Per Auto LiPA preparare 10 ml in eccesso La soluzione di lavoro del Coniugato stabile per 24 ore a temperatura ambiente da 20 25 C se conservata al buio Tampone Tris contenente NaCl MgCl e 0 01 MIT 0 1 CAA come conservante 5 Bromo 4 cloro 3 indolilfosfato sale di p toluidina BCIP e 4 nitroblu di tetrazolio NBT in dimetilformammide DMF da diluire 1 100 in tampone Substrato prima dell uso Per il test manuale preparare 2 ml di soluzione di lavoro Substrato per ciascuna vaschetta 2 ml in eccesso la soluzione di lavoro Substrato pu essere preparata durante l incubazione del Coniugato Per Auto LiPA preparare 10 ml in eccesso La soluzione di lavoro Substrato stabile per 24 ore a temperatura ambiente da 20 25 C se conservata al buio Tampone Fosfato contenente NaCl Triton e 0 05 MIT 0 48 CAA come conservante da diluire 1 5 1 parte 4 parti in acqua distillata o deionizzata prima dell uso Per il test manuale preparare 8 ml di soluzione di lavoro di Risciacquo per ciascuna vaschetta 10 ml in eccesso Per Auto LiPA preparare 10 ml in eccesso La soluzione di lavoro di INNOGENETICS9 46 Risciacquo stabile per 2 settimane a temperatura compresa tra 2 8 C Vassoi Incubazione 3 Contenente 8 vaschette ciascuna Carta di lettura 1 Per l identificazione delle sonde positive Foglio di report dei dati 2 Per la conservazione di strisce sviluppate
24. MIT 0 1 chloroacetamide CAA as preservative Denaturation Solution 1x1ml 56718 Alkaline solution containing EDTA The vial should be closed immediately after use prolonged exposure of this solution to air leads to a rapid deterioration of the denaturing strength Hybridization Solution 1x80 ml 56719 Saline sodium phosphate EDTA SSPE buffer containing 0 5 sodium dodecyl sulphate SDS The Hybridization Solution should be pre warmed to a temperature of at least 37 C and must not exceed 56 C all crystals should be dissolved before use Stringent Wash Solution 1x 200 ml 56720 SSPE buffer containing 0 196 SDS The Stringent Wash Solution should be pre warmed to a temperature of at least 37 C and must not exceed 56 C all crystals should be dissolved before use Conjugate Diluent 1x80 ml 56951 Phosphate buffer containing NaCl Triton protein stabilizers and 0 0196 MIT 0 196 CAA as preservative Conjugate 100x 1x0 8 ml 56952 Streptavidin labeled with alkaline phosphatase in Tris buffer containing protein stabilizers and 0 0196 MIT 0 09896 CAA as preservative to be diluted 1 100 in Conjugate Diluent before use Prepare 2 ml Conjugate working solution for each test trough 2 ml in excess Conjugate working solution can be prepared during stringent wash for manual testing For Auto LiPA make 10 ml in excess The Conjugate working solution is stable for 24 hours at room temperature 20 25 C if stored in the dark
25. Schutzhandschuhe tragen Enth lt 2 Chloracetamid Sp ll sung Substratpuffer Konjugatverd nner und LiPA Kontrolle x R36 38 S23 24 26 Reizend Xi Reizt Augen und Haut Dampf nicht einatmen Hautkontakt vermeiden Bei Ber hrung mit den Augen sofort mit viel Wasser absp len und Arzt konsultieren Enth lt Natriumhydroxid Denaturierungsl sung A Alle Proben sollten als potentiell infekti s angesehen und dementsprechend behandelt werden Daher sollten alle Blutbestandteile und biologischen Materialien als potentiell infekti s angesehen und dementsprechend behandelt werden Der Test darf nur 35 INNO LiPA HLA DRB1 Plus von hinreichend ausgebildetem medizinischem Personal durchgef hrt werden Alle Blutbestandteile und das biologische Material m ssen in bereinstimmung mit den entsprechenden Sicherheitsbestimmungen entsorgt werden Mindestens 15 Minuten bei 121 C autoklavieren Einmalmaterial verbrennen Fl ssigen Abfall mit Natriumhypochlorit zu einer Endkonzentration von 1 Natriumchlorit mischen Vor der Entsorgung ber Nacht wirken lassen VORSICHT S urehaltigen Fl ssigabfall vor Zugabe von Natriumhypochlorit neutralisieren Beider Arbeit mit potentiell gef hrlichen oder infekti sen Materialien geeignete Schutzhandschuhe und Schutzbrille Gesichtsschutz tragen Abf lle m ssen entsprechend den Abfallbeseitigungsvorschriften der jeweiligen Einrichtung entsorgt werden Dar ber hinaus m ssen a
26. analizado en el LiPA Resoluci n Tabla de tipaje utilizada K 1067 v 5 x 1998 02 20 Las tiras INNO LiPA HLA DRB1 con 37 sondas inmovilizadas permiten un tipaje DRB1 a nivel de grupo de alelos Est calculado que la resoluci n te rica a amplio nivel es del 89 396 Durante el estudio la resoluci n global alcanzada a nivel de grupo de alelos fue del 86 8 211 243 Fueron descritos un total de 32 resultados ambiguos Estos surgieron de cuatro combinaciones de sondas y se registraron con las siguientes combinaciones de alelos DRB1 03 x 11 13 8 muestras DRB1 04 x 11 13 3 muestra DRB1 01 x 13 14 3 muestras DRB1 03 x 13 15 12 muestras 65 INNO LiPA HLA DRB1 Plus Un ant geno fue ambiguo para DRB1 11 13 en 11 83 13 3 de las muestras en las que cualquiera de los dos alelos estaba presente Estas ambig edades fueron identificadas con el software LiPA Expert como DRB1 0308 x 1324 dos muestras DRB1 0415 x 1322 1323 tres muestras y DRB1 0308 x 1305 1307 1311 1314c75L 1314c75V seis muestras En presencia de DRB1 03 donde DRB1 13 es dado como grupo de alelos alternativo a DRB1 11 el alelo espec fico DRB1 03 es en cada caso DRB1 0308 Se ha descrito que este alelo tiene una secuencia muy similar al alelo DRB1 03011 excepto en el cod n 58 donde la secuencia es similar a la de los alelos del grupo DRB1 11 Adem s tanto el alelo DRB1 0308 como los alelos espec ficos DRB1 13 DRB1 1305 DRB1 1307 DR
27. banda de color morado o marr n claro al final del procedimiento de ensayo llustraci n 1 ver p gina 15 Ubicaci n de la banda de marca de color negro la banda de control de conjugado control de conjugado la banda de control de HLA DRB1 Plus control de conjugado y las 37 bandas de sonda de ADN espec ficas de la secuencia en la tira de INNO LIPA HLA DRB1 Plus Validaci n Incluya un control negativo y el control LIPA para INNO LiPA HLA DRB1 Plus cada vez que realice un ensayo Al igual que en cualquier nuevo ensayo se debe considerar la posibilidad de incluir controles positivos y negativos adicionales hasta que se alcance un elevado grado de confianza en la capacidad de realizar correctamente el procedimiento de ensayo Se recomienda el uso del ADN de referencia para validar las condiciones de ensayo establecidas La banda superior en la tira de INNO LiPA HLA DRB1 Plus es la banda de marca banda de color negro Esta banda permite orientar correctamente la tira 63 INNO LiPA HLA DRB1 Plus La siguiente banda controla la adici n de soluci n de conjugado y de soluci n de sustrato reactivas durante el procedimiento de detecci n Esta banda debe estar alineada con la banda de control de conjugado de la tarjeta de lectura de pl stico Debe ser siempre positiva y tener aproximadamente la misma intensidad en cada tira de un mismo ensayo La siguiente banda es la banda de control positivo de HLA DRB control HLA DRB
28. dem INNO LiPA HLA DRB1 Plus Streifen INNOGENETICS9 32 b JU un red Amplifikation von Exon 2 der HLA DRB1 03 11 13 14 Allele mit HLA DRB1 03 11 13 14 Primerl sung vor der Analyse mit dem INNO LiPA HLA ORB Plus Streifen Die mitgelieferte HLA DRB1 03 11 13 14 Primerl sung amplifiziert Exon 2 der HLA DRB1 03 11 13 14 Allele Exon 2 anderer DRB1 Allele wird nicht amplifiziert eine Ausnahme bildet das Allel DRB1 0820 Der INNO LiPA HLA DRB1 Plus wurde f r eine bestm gliche Aufl sung auf Allelgruppen Niveau unter Verwendung der reversen Hybridisierung d h gem Standard HLA Nomenklatur die ersten zwei Stellen nach dem Stern einer Allelbezeichnung z B DRB1 01 Zus tzlich zur Allelgruppeninterpretation nennt die Software alle m glichen Allelkombinationen Diese Informationen sollten jedoch als Zusatzinformation und nicht als ausschlaggebend ber cksichtigt werden Reagenzien Beschreibung Vorbereitung und empfohlene Lagerung und Haltbarkeit Werden die Reagenzien ge ffnet oder unge ffnet bei 2 8 C und in den Originalfl schchen gehalten bzw gelagert bleiben sie bis zum Verfallsdatum des Kits stabil Reagenzien nicht einfrieren Verwenden Sie den Kit nicht nach berschreitung des Verfallsdatums Der Kit muss getrennt von allen Quellen kontaminierender DNA insbesondere von Amplifikationsprodukten gelagert werden Alle Reagenzien sollten ca 60 Minuten vor dem Gebrauch auf Raumtemperatur 20 25 C gebrach
29. des conditions de test La ligne sup rieure de la bandelette INNO LiPA HLA DRB1 Plus est la ligne rep re noire Elle permet d orienter correctement la bandelette La bande suivante est le contr le d addition des solutions de Conjugu et de Substrat pendant la proc dure de d tection Cette bande doit tre align e avec la bande contr le Conjugu de la carte de lecture en plastique Elle doit toujours tre positive et d intensit plus ou moins similaire sur chaque bandelette d un m me test La bande suivante est le contr le positif HLA DRB HLA DRB control de la carte de lecture qui indique si la quantit de mat riel HLA DRB1 amplifi qui a t ajout e pour l hybridation est ad quate ou non Cette bande doit toujours tre positive sauf pour le contr le n gatif mais son intensit peut varier d un chantillon l autre Le r sultat du test de chaque contr le n gatif ne doit pr senter aucun signal apparent pour aucune des bandes de la bandelette l exception de la bande contr le Conjugu Le contr le LiPA pour INNO LiPA HLA DRB1 Plus doit pr senter le profil de sondes positives suivant contr le Conjugu contr le HLA DRB 2 8 23 25 26 30 33 37 Ce contr le est compos d oligonucl otides biotinyl s compl mentaires des sondes d hybridation mentionn es Une hybridation positive sur ces sondes d montre donc une performance satisfaisante du test comprenant hybridation lavage stringent r v lation
30. em combina o com PCR protocolo ll Desempenho do teste usando ADN obtido com a solu o de iniciador DRB1 em combina o com o PCR protocolo Desempenho do teste usando ADN obtido com a solu o de iniciador DRB1 03 11 13 14 em combina o com o PCR protocolo INNOGENETICS SYMBOLS USED Manufactured by mal But du test Hersteller Prodotto da Fabricado por In vitro diagnostic medical device Produit pour diagnostic in vitro Hilfsmittel f r die medizinische in vitro Diagnostik Dispositivo medico diagnostico in vitro Producto sanitario para diagn stico in vitro Dispositivo m dico para diagn stico n vitro Lot number Num ro de lot Chargennummer Numero di lotto N mero de lote Lote n mero Catalog number R f rence catalogue Katalognummer Codice N mero del cat logo Use by Mat riel n cessaire non fourni Verwendbar bis Utilizzare entro Para ser usado hasta Usado por Consult instructions for use WD Consignes de s curit F r Anwendung siehe Gebrauchsanleitung Consultare le istruzioni per l uso Consulte las instrucciones de uso Consultar instru es de utiliza o sc Temperature limits 1 Limites de temp rature Temperaturbereich Limiti di temperatura L mites de temperatura Limites de Temperatura Contains sufficient for lt X gt tests V7 Conditionnement suffisant pour lt X gt tests Inhalt ausreichend f r lt X
31. et d tection Un profil diff rent peut mettre en vidences des probl mes tels qu une temp rature incorrecte pendant I hybridation ou le non respect des dur es ou des temp ratures d incubation recommand es L intensit de couleur des sondes d une bandelette peut varier d une bande l autre Interpr tation V rifier que le Contr le LiPA pr sente le profil de r activit attendu La bande contr le Conjugu de la bandelette doit tre align e avec la bande Contr le conjugu de la carte de lecture en plastique Contr ler que les bandes contr les les deux premi res bandes sont positives afin de valider chaque bandelette voir Validation Les r sultats du typage sont bas s sur la r activit des sondes du kit Une liste des caract ristiques des sondes est disponible sur demande Identifier tous les num ros de sondes positives sur la bandelette INNO LiPA HLA DRB1 Plus et d duire le type DRB1 l aide de la table de typage INNO LiPA HLA DRB1 Plus ou d une version du logiciel d interpr tation LIPA LIRAS Le logiciel propose souvent plus de r sultats que ce que ne mentionne le paragraphe But du test il fournit une interpr tation au niveau du groupe d all les ainsi que toutes les combinaisons d all les possibles Cette information toutefois doit tre consid r e comme un plus et non comme d cisive Logiciel d interpr tation LiRAS Le logiciel LIRASTM est destin faciliter l interpr tation
32. frequency In the presence of DRB1 04 either of two rare alleles of DRB1 13 1322 1323 is given as the alternative to DRB1 11 allele group typing and the only DRB1 04 allele they were reported with is DRB1 0415 There is documented sequence similarities between the specific DRB1 13 alleles involved and the DRB1 11 allelegroup The frequencies of the DRB1 13 alleles causing ambiguity and of the DRB1 0415 allele are also expected to be low One antigen was ambiguous for DRB1 13 14 in 9 66 13 696 samples where either DRB1 13 or DRB1 14 was present These ambiguity causing alleles were reported by the LiPA Expert software as follows DRB1 0103 x 1417 1430 three samples DRB1 0402 0414c13H x 1421 five samples and DRB1 0402 0414 x 1417 1430 one sample In the presence of DRB1 04 rare and recently described alleles of DRB1 14 1417 1421 and 1430 are given as the alternative to DRB1 13 allele group typing The specific DRB1 14 alternatives 1417 and 1430 see above to the DRB1 13 alleles in the presence of DRB1 01 are both expected to occur rarely One antigen was ambiguous for DRB1 13 15 in 12 97 12 4 samples where either DRB1 13 or DRB1 15 was present These ambiguity causing alleles were reported by the LiPA Expert software as DRB1 0304 x 1309 all twelve samples The DRB1 1309 alternative to DRB1 15 in the presence of DRB1 03 is a rare allele of Hispanic origin The DRB1 0304 allele it is reported with is als
33. numero di risultati di tipizzazione ottenuti correttamente in confronto al risultato di tipizzazione unico ottenuto con INNO LiPA HLA DRB1 Innogenetics o con un test di tipizzazione alternativo Olerup SSP GenoVision oppure Allset DR Low Resolution Dynal risultati di tipizzazione di tutti gli 87 campioni sono risultati concordi al test di riferimento producendo una precisione diagnostica del 100 87 87 95 CI 95 9 100 Reattivit delle sonde In pi di un occasione nel corso di questo studio alcune sonde hanno dato reazioni deboli Una tipizzazione coerente a livello di gruppo di allele stato raggiunto quando si utilizzato il software d interpretazione LIRAS Risoluzione tabella di tipizzazione v5 8 021112 La soluzione primer DRB1 usata in combinazione con la strip INNO LiPA HLA DRB1 inteso per la tipizzazione di allele HLA DRB1 a livello del gruppo di allele La soluzione DRB1 03 11 13 14 usata in combinazione con la strip INNO LiPA HLA DRB viene usata per risolvere le ambiguit pi frequenti cio le ambiguit che coinvolgono DRB1 03 11 13 e o 14 allele Tutte le ambiguit a livello del gruppo di allele osservate dopo aver i test con la soluzione primer DRB1 sono state ridotte a un risultato di tipizzazione non ambiguo utilizzando la 55 INNO LiPA HLA DRB1 Plus soluzione primer DRB1 03 11 13 14 DRB1 01 DRB1 13 o DRB1 01 DRB1 14 3 casi DRB1 04 DRB1 13 o DRB1 04 DRB1 14 6 casi
34. parts en eau distill e ou d sionis e avant utilisation Pr parer 8 ml de Solution de travail de Ringage par compartiment 10 ml suppl mentaires Pour l Auto LiPA pr parer 10 ml suppl mentaires La Solution de travail de Ringage est stable 2 semaines 2 8 C INNOGENETICS9 22 Plaque d incubation 3 Contenant 8 compartiments chacun Carte de lecture 1 Pour l identification des sondes positives Feuille de r sultats 2 Pour la conservation des bandelettes d velopp es Mat riel n cessaire non fourni Bain marie avec plate forme agitante 80 tr min avec couvercle inclin temp rature r glable 56 C 0 5 C Syst me d aspiration Thermom tre calibre Agitateur plan orbital lin aire ou oscillant Recommandations Pour un agitateur orbital le diam tre du mouvement circulaire doit tre gal ou sup rieur 13 mm la vitesse recommand e pour un mouvement circulaire de 13 mm est de 160 tr min Pour un agitateur lin aire la vitesse recommand e pour le mouvement de va et vient est de 80 mouvements par minute Pour un agitateur oscillant l angle d agitation ne doit pas d passer 13 pour viter tout d bordement la vitesse recommand e est de 50 tr min Vortex ou quivalent Eprouvette gradu e 10 25 50 et 100 ml A Eau distill e ou d sionis e A Gants jetables C nes pour pipettes st riles jetables de pr f rence filtre coton P
35. reattivit delle sonde Punto 5 Se necessario il software d interpretazione LIRAS consiglia un ulteriore passaggio di amplificazione e ibridazione Se si usa il kit INNO LiPA HLA DRB1 Plus e si verificano ambiguit che coinvolgono gli alleli DRB1 03 11 13 o 14 con altri alleli DRB1 si consiglia di iniziare dal punto a e procedere fino al punto b Questo passaggio verr consigliato dal software d interpretazione LIRASTM a Effettuare l amplificazione dell esone 2 dell allele HLA DRB1 03 11 13 14 con la soluzione di primer HLA DRB1 prima dell analisi con la striscia INNO LiPA HLA DRB1 Plus b Effettuare l amplificazione gruppo specifica dell esone 2 degli alleli HLA DRB1 03 11 13 14 con la soluzione di primer HLA DRB1 03 11 13 14 prima dell analisi con la striscia INNO LiPA HLA DRB1 Plus La soluzione di primer HLA DRB1 03 11 13 14 in dotazione amplifica l esone 2 degli alleli HLA DRB1 03 11 13 14 L esone 2 degli altri alleli DRB1 non sar amplificato ad eccezione dell allele DRB1 0820 L INNO LiPA HLA DRB1 Plus utilizzando il principio di ibridazione inversa stato progettato per dare la migliore risoluzione possibile a livello di gruppo allelico s intendono in questo senso le prime due cifre dopo l asterisco nel nome di un allele secondo la nomenclatura standard HLA ad es HLA DRB1 01 Oltre ad interpretare il gruppo allelico il software dar tutte le possibili combinazioni a livello di allele Queste informazion
36. rie de ADN Apenas 0 05 ug de ADN extra do A260 nm A280 nm gt 1 5 podem ser usados no acompanhamento do ensaio de amplificac o produzindo ADN mais que suficiente para detec o no LiPA Resolug o Tabela de tipagem utilizada K 1067 v 5 x 1998 02 20 As tiras INNO LiPA HLA DRB1 com 37 sondas de ADN imobilizadas em linhas paralelas permitem uma tipagem DRB1 a nivel de grupo de alelos A resolu o te rica a amplo n vel DRB1 01 a DRB1 16 calculada como de 89 3 Durante o estudo a resoluc o global alcangada a n vel de grupo de alelos foi de 86 8 211 243 Foi descrito um total de 32 resultados ambiguos Estes surgiram de sete combina es de sondas e foram registados com as seguintes combina es de alelos DRB1 03 x 11 13 8 amostras DRB1 04 x 11 13 3 amostras DRB1 01 x 13 14 3 amostras DRB1 04 x 13 14 6 amostras e DRB1 03 x 13 15 12 amostras Um antig nio foi amb guo para DRB1 11 13 em 11 83 13 3 das amostras nas quais quer DRB1 11 ou DRB1 13 estavam presentes Estas ambiguidades foram identificadas com o software LiPA Expert como DRB1 0308 x 1324 duas amostras DRB1 0415 x 1322 1323 tr s amostras e DRB1 0308 x 1305 1307 1311 1314c75L 1314c75V seis amostras Na presen a de DRB1 03 em que DRB1 13 dado como grupo de alelos alternativo a DRB1 11 o alelo espec fico DRB1 03 em cada caso DRB1 0308 Descreveu se que este alelo tem uma sequ ncia muito semelhante ao a
37. schlie en Die LiPA Kontrolle sollte in jeden Testlauf integriert werden 37 INNO LiPA HLA DRB1 Plus Proben 1 DRB1 Amplifikationsprodukt 10 ul verwenden F r die Vorbereitung der Probe siehe INNO LiPA HLA DRB1 Amp Plus Hinweise zur Verwendung 2 LiPA Kontrollprobe f r INNO LiPA HLA DRB1 Plus 10 pl verwenden Amplifikation ist nicht erforderlich 3 DNA freie Amplifikationskontrollproben Negativkontrolle 10 ul verwenden Denaturierung und Hybridisierung 1 Sch ttelwasserbad auf 56 C 0 5 C erw rmen Temperatur mit einem kalibrierten Thermometer berpr fen und Temperatur anpassen wenn erforderlich Die vorgeschriebenen Temperaturen nicht berschreiten Die Hybridisierungsl sung und die Stringent Waschl sung in einem Wasserbad auf mindestens 37 C vorw rmen aber 56 C nicht berschreiten Vor Gebrauch mischen Alle Kristalle m ssen vollst ndig aufgel st sein 2 Mit Hilfe einer Pinzette die erforderliche Anzahl von INNO LiPA DRB1 Plus Teststreifen aus dem R hrchen entnehmen ein Streifen pro Testprobe Nehmen Sie zus tzlich einen Streifen f r die LiPA Kontrollprobe beim INNO LiPA HLA DRB1 Plus und f r die DNA freie Amplifikationskontrollprobe Schreiben Sie mit Bleistift eine Identifizierungsnummer oberhalb der schwarzen Markierungslinie auf dem Streifen 3 Nehmen Sie die erforderliche Anzahl an Testwannen eine Wanne pro Testprobe und legen Sie diese in den Halter 4 F llen Sie mit einer Pip
38. strip on which 37 sequence specific DNA probes and 2 control probes are fixed fig 1 The use of this product is covered by a license of F Hoffmann La Roche Ltd and Roche Molecular Systems Inc INNO LiPA HLA DRB1 Plus steps involved step 1 Amplification of exon 2 of the HLA DRB1 alleles step 2 Hybridization and stringent wash with 37 probes immobilized on one INNO LiPA HLA DRB1 Plus strip 56 C step 3 Color development step 4 Interpretation of the probe reactivity pattern step 5 If required the LiRAS interpretation software advises for a further amplification and hybridization step Using the INNO LiPA HLA DRB1 Plus kit it is advised to start with a and proceed to b if ambiguities involving DRB1 03 11 13 or 14 alleles with other DRB1 alleles occur This will be advised by the LIRAS interpretation software a the amplification of exon 2 of the HLA DRB1 03 11 13 14 alleles with the HLA DRB1 primer solution prior to analysis with the INNO LiPA HLA DRB1 Plus strip b group specific amplification of exon 2 of the HLA DRB1 03 11 13 14 alleles with HLA DRB1 03 11 13 14 primer solution prior to analysis with the INNO LiPA HLA DRB1 Plus strip The primer solution HLA DRB1 03 11 13 14 provided amplifies exon 2 of the HLA DRB1 03 11 13 14 alleles Exon 2 of other DRB1 alleles will not be amplified an exception is the allele DRB1 0820 The INNO LiPA HLA DRB1 Plus is designed to give the best possible resolution u
39. til para este fin Repita este paso tantas veces como se indique en el procedimiento de ensayo NOTA No deje que las tiras se sequen entre los dos pasos Evite dafiar la superficie de las tiras al aspirar Aspire el l quido en la parte superior de la tira por encima de la banda de marca Aseg rese de que se aspira todo el l quido Aseg rese de lavar toda la tira meticulosamente sumergi ndola por completo en la soluci n Sies necesario ajuste la velocidad del agitador Observaciones y precauciones Para uso profesional exclusivamente Para evitar la contaminaci n de ADN se recomienda una separaci n f sica m xima entre los pasos previos y posteriores a la amplificaci n las precauciones m nimas para una buena pr ctica de laboratorio son usar habitaciones pipetas y dem s material de laboratorio independientes distintos guantes y batas y distintos lugares de almacenamiento tambi n Evite el retorno de la habitaci n de operaciones posteriores a la amplificaci n a la habitaci n de operaciones previas a la amplificaci n Se recomienda el uso de material de laboratorio desechable esterilizado en autoclave No reutilice el material de laboratorio desechable Utilice una nueva punta de pipeta esterilizada para cada muestra dividida en alicuotas No utilice reactivos caducados No mezcle reactivos de kits distintos a menos que los componentes tengan n meros de lote id nticos Evite la contaminaci n m
40. todos Los productos de PCR de ambos protocolos produjeron resultados de identificaci n de tipo id nticos para todas las muestras Eficacia del ensayo utilizando ADN obtenido con la soluci n de cebador DRB1 03 11 13 14 en combinaci n con el protocolo I de PCR A B Bw4 C DRB1 DRB1 03 11 13 14 La eficacia de la soluci n de cebador DRB1 03 11 13 14 de INNO LiPA HLA DRB1 Plus se evalu internamente y en dos laboratorios belgas de identificaci n de tipos de tejido Se analizaron un total de 89 muestras an nimas 50 muestras externamente y 39 internamente Previamente se hab a identificado el tipo de todas las muestras con INNO LiPA HLA DRB1 14 de las muestras produjeron resultados ambiguos seis ambig edades distintas y 75 de ellas resultados no ambiguos Se identific nuevamente el tipo de todas las muestras ambiguas hasta obtener un nico resultado con uno o varios ensayos de identificaci n del tipo basados en ADN Todas las hibridaciones se llevaron a cabo con el instrumento Auto LiPA utilizando el programa HLA56v3 y la interpretaci n se realiz con una versi n de prueba cl nica del software de interpretaci n LIRAS para LiPA HLA v3 00 Sensibilidad de la prueba La sensibilidad de la prueba del ensayo en el nivel de grupo de alelos se calcul como el n mero de resultados correctos de identificaci n del tipo sobre el n mero total de muestras probadas La sensibilidad del ensayo en esta evaluaci n fue del 100
41. 0x circa 10 minuti prima della fine dell incubazione del Coniugato Vedi Reagenti 3 Lavare ciascuna striscia due volte per 1 minuto usando 2 ml della soluzione di lavoro di Risciacquo e lavare una volta ancora usando 2 ml di Tampone Substrato 4 Aggiungere 2 ml di soluzione di lavoro Substrato a ciascuna vaschetta e incubare per 30 minuti sull agitatore ATTENZIONe Indossare guanti e occhiali protettivi 5 Fermare lo sviluppo del colore lavando le strisce due volte in 2 ml di acqua distillata agitando il portavaschette sull agitatore per almeno 3 minuti 6 Usando le pinzette rimuovere le strisce dalle vaschette e posizionarle su carta assorbente Lasciare asciugare completamente le strisce prima di leggere i risultati Conservare le strisce asciugate e sviluppate al buio Procedura automatizzata del test Auto LiPA La procedura del test LiPA idonea ad essere automatizzata L Auto LiPA amp progettato infatti per gestire completamente l ibridazione il lavaggio stringente e sviluppo del colore L Auto LiPA un sistema di walk away con riscaldamento e raffreddamento automatici e con aspirazione e pipettaggio automatici Per maggiori informazioni e protocolli specifici dell Auto LiPA si prega di contattare i propri distributori locali Risultati Lettura Una linea considerata positiva quando appare una netta banda viola marrone al termine della procedura del test Figura 1 vedere pagina 15 Posizione della linea di id
42. 1421 et 1430 rares et nouvellement d crits sont donn s comme alternative au typage de groupe d all les DRB1 13 Les alternatives sp cifiques DRB1 14 1417 et 1430 voir ci dessus aux all les DRB1 13 en pr sence de DRB1 01 sont pour les deux attendues comme v nement rare Un antig ne tait ambigu pour DRB1 13 15 dans 12 97 chantillons 12 496 o pouvaient tre pr sent DRB1 13 ou DRB1 15 Ces all les responsables d ambiguit taient rapport s par le logiciel LiPA Expert comme suit DRB1 0304 x 1309 les 12 chantillons L alternative DRB1 1309 au DRB1 15 en pr sence de DRB1 03 est une all le rare d origine hispanique L all le DRB1 0304 qui t report avec est galement rare ayant t report la premi re fois dans trois causasiens non apparent s Cet all le a des similarit de s quence avec DRB1 0301 qui tait donn comme premi re alternative Reproductibilit Des typages r p t s par diff rents lots de INNO LiPA HLA DRB1 utilisant l ADN issu des chantillons cliniques de l tude ont montr des r activit s de sondes reproductibles dans tous les cas Pr cision INNO LiPA HLA DRB1 a montr durant toute l valuation externe une concordance absolue avec les r sultats obtenus avec les m thodes de r f rence R capitulatif des nombres d chantillons 243 ombre total des amplifications effectu es aucun chec observ 211 ombre total de r sultats sans ambiguit au niveau groupe d
43. 1x 80 ml Coniugato 100x 1x0 8 ml Tampone Substrato 1 x 180 ml Substrato BCIP NBT 100x 1 x 0 8 ml Soluzione di Risciacquo 5x 1 x 80 ml 56718 56719 56720 56951 56952 56953 56954 56721 Flacone con soluzione alcalina contenente EDTA Il flacone deve essere chiuso immediatamente dopo l uso una esposizione prolungata di questa soluzione all aria porta ad un rapido deterioramento della forza denaturante Flacone con soluzione salina tampone sodio fosfato EDTA SSPE contenente 0 5 sodio dodecil solfato SDS La soluzione di ibridazione deve essere pre riscaldata a una temperatura di almeno 37 C e non deve comunque superare i 56 C tutti i cristalli devono essere disciolti prima dell uso Flacone con tampone SSPE contente 0 1 di SDS La soluzione di lavaggio stringente deve essere pre riscaldata a una temperatura di almeno 37 C e non deve superare i 56 C tutti i cristalli devono essere disciolti prima dell uso Tampone fosfato contenente NaCl Triton proteine stabilizzatrici e 0 01 MIT 0 1 CAA come conservante Streptavidina legata a fosfatasi alcalina in tampone Tris contenente proteine stabilizzatrici e 0 01 MIT 0 098 CAA come conservante da diluire 1 100 prima dell uso nel Diluente Coniugato Per il test manuale preparare 2 ml di soluzione di lavoro di Coniugato per ciascuna vaschetta del test 2 ml in eccesso la soluzione di lavoro del Coniugato pu essere preparata durante il
44. 2 des all les HLA DRB1 03 11 13 14 L exon 2 des autres all les DRB1 ne sera pas amplifi exception faite pour l all le DRB1 0820 Le test INNO LiPA HLA DRB1 Plus est concu pour fournir la meilleure r solution possible par la technique d hybridation inverse au niveau groupe d all les c est dire les deux premiers chiffres apr s l ast risque dans le nom de l all le selon la nomenclature HLA standard par ex HLA DRB1 01 En plus de l interpr tation des groupes d all les le logiciel fournira toutes les combinaisons d all les possibles Cette information toutefois doit tre consid r e comme un plus et non comme un facteur d cisif R actifs Description pr paration et conditions de conservation Tous les r actifs ouverts ou ferm s sont stables jusqu la date de p remption du kit s ils sont conserv s entre 2 8 C dans leurs flacons d origine Ne pas congeler les r actifs Ne pas utiliser les r actifs apr s la date de validit Le kit doit tre conserv l cart de toute source de DNA contaminant en particulier des produits amplifi s Tous les r actifs doivent tre ramen s la temp rature ambiante 20 25 C 60 minutes environ avant l utilisation et replac s au r frig rateur imm diatement apr s l utilisation Une alt ration de l apparence physique des composants du kit peut indiquer une instabilit ou une d t rioration Pour minimiser le risque de voir les bandelettes s enr
45. 596 La soluci n de hibridaci n debe precalentarse a una temperatura de al menos 37 C y no debe superar los 56 C todos los cristales deben disolverse antes de usarse 57 INNO LiPA HLA DRB1 Plus Soluci n de lavado 1x 200 ml astringente Diluyente de conjugado 1x 80 ml Conjugado 100x 1x0 8 ml Tamp n sustrato 1x 180 ml Sustrato BCIP NBT 100x 1 x 0 8 ml Soluci n de lavado 5x 1 x 80 ml Bandeja de incubaci n 3 Tarjeta de lectura 1 Hoja de registro de datos 2 56720 56951 56952 56953 56954 56721 Tamp n SSPE con SDS al 0 1 La soluci n de lavado astringente debe precalentarse a una temperatura de al menos 37 C y no debe superar los 56 C todos los cristales deben disolverse antes de usarse Tampon fosfato con NaCl Triton estabilizadores de prote nas y MIT al 0 01 CAA al 0 196 como conservante Estreptavidina etiquetada con fosfatasa alcalina en tamp n Tris con estabilizadores de prote nas y MIT al 0 0196 CAA al 0 09896 como conservante que debe diluirse en una proporci n 1 100 en diluyente de conjugado antes de usarse Prepare 2 ml de soluci n de Conjugado de trabajo para cada cubeta de ensayo 2 ml en exceso la soluci n de Conjugado de trabajo debe prepararse durante el lavado astringente para ensayo manual Para Auto LiPA prepare 10 ml en exceso La soluci n de Conjugado de trabajo se mantiene estable durante 24 horas a temperatura ambiente 20 25 C si se al
46. B1 1311 DRB1 1314 y DRB1 1324 con los cuales fue ambiguamente relacionado tambi n tienen una frecuencia esperada baja En presencia del alelo DRB1 04 cualquiera de los dos alelos raros DRB1 13 1322 1323 se da como alternativa al grupo de alelos DRB1 11 y el nico alelo DRB1 04 con el que fueron relacionados fue DRB1 0415 Hay secuencias documentadas de la similitud entre los alelos espec ficos DRB1 13 implicados y el grupo de alelos DRB1 11 La frecuencia de alelos DRB1 13 causantes de ambig edades y la frecuencia del alelo DRB1 0415 tambi n se espera que sean bajas Un ant geno fue ambiguo para DRB1 13 14 en 9 66 4 4 de las muestras donde uno de los dos alelos DRB1 13 o DRB1 14 estaba presente Esta ambig edad fue identificada por el software LiPA Expert como DRB1 0103 x 1417 1430 tres muestras DRB1 0402 0414c13H x 1421 cinco muestras y DRB1 0402 0414 x 1417 1430 una muestra En presencia del alelo DRB1 04 los alelos DRB1 14 1417 1421 y 1430 raros y recientemente descritos se dan como alternativa al tipaje de grupo de alelos DRB1 13 Las alternativas espec ficas del alelo DRB1 14 1417 y 1430 ver abajo al grupo de alelos DRB1 13 en presencia del alelo DRB1 01 tambi n se espera que sean bajas Un ant geno fue ambiguo para DRB1 13 15 en 12 97 12 496 de las muestras donde uno de los dos alelos DRB1 13 o DRB1 15 estaba presente Esta ambig edad fue identificada por el software LiPA Expert como DRB1
47. CI 95 9 100 Precis o diagn stica O c lculo da precis o diagn stica foi apenas executado para as amostras para as quais existia um resultado de refer ncia Consequentemente duas amostras foram exclu das deste c lculo Para as 87 amostras restantes obteve se um resultado de tipagem HLA DRB1 nico 79 INNO LiPA HLA DRB1 Plus A precis o diagn stica do teste ao n vel do grupo de alelos foi calculada atrav s do n mero de resultados de tipagem correctos em compara o com o resultado de tipagem nico do INNO LiPA HLA DRB 1 Innogenetics ou com um ensaio de tipagem alternativo Olerup SSP GenoVision ou Allset DR Low Resolution Dynal Os resultados de tipagem de todas as 80 amostras foram concordantes com o ensaio de refer ncia o que resulta numa precis o diagn stica de 100 87 87 95 CI 95 9 100 Reactividades de sonda Em uma ou mais ocasi es deste estudo algumas sondas apresentaram reacc es fracas Ao utilizar o software de interpreta o LIRASTM obteve se uma tipagem concordante ao n vel do grupo de alelos Resolug o tabela de tipagem v5 8 021112 A soluc o de iniciador Primer Solution utilizada em combinag o com a INNO LiPA HLA DRB1 strip foi desenvolvida para tipagem dos alelos HLA DRB1 ao nivel do grupo de alelos A solu o de iniciador DRB1 03 11 13 14 utilizada em combina o com a INNO LiPA HLA DRB1 strip foi desenvolvida para resolver as ambiguidades mais frequentes ou sej
48. DRB1 Plus Kit steht ein Amplifikations Kit INNO LiPA HLA DRB1 Amp Plus zur Verf gung mit dem die standardisierte Vorbereitung von biotinyliertem Amplifikationsmaterial m glich ist Der Amplifikations Kit basiert auf der Polymerasekettenreaktion PCR polymerase chain reaction Die Amplifikationsprodukte werden anschlie end mit 37 sequenzspezifischen DNA Sonden und 2 Kontrolllinien eines Typisierungsstreifens hybridisiert Abbildung 1 Die Verwendung dieses Produktes ist durch eine Lizenz von F Hoffmann La Roche Ltd und Roche Molecular Systems Inc gedeckt INNO LiPA HLA DRB1 Plus Die einzelnen Schritte Schritt 1 Amplifikation von Exon 2 der HLA DRB1 Allele Schritt 2 Hybridisierung und Waschschritt mit Stringent Waschl sung mit 37 Sonden die auf einem INNO LiPA HLA DRB1 Plus Streifen 56 C aufgetragen wurden Schritt 3 Farbentwicklung Schritt 4 Auswertung des Sondenreaktionsmusters Schritt 5 Falls erforderlich r t die LIRAS Interpretation Software zu einem weiteren Amplifikations und Hybridisierungsschritt Bei der Verwendung des INNO LiPA HLA DRB1 Plus Kits wird empfohlen mit Punkt a zu beginnen und dann mit Punkt b fortzufahren falls Mehrdeutigkeiten im Hinblick auf DRB1 03 11 13 oder 14 Allele mit anderen DRB1 Allelen auftreten Dies wird von der LIRAS Interpretation Software empfohlen a die Amplifikation von Exon 2 der HLA DRB1 03 11 13 14 Allele mit der HLA DRB1 Primerl sung vor der Analyse mit
49. Innogenetics 2004 INNO LiPA HLA DRB1 Plus Manufactured by INNOGENETICS N V Technologiepark 6 9052 Ghent Belgium 32 9 329 13 29 Distributed by INNOGENETICS GmbH Lembecker Stra e 19 46359 Heiden Westfalen Germany 92 49 2867 99 07 0 INNOGENETICS S r l Via del Mare 36 00040 Pomezia Roma Italy D 39 06 911 80 375 INNOGENETICS N V Technologiepark 6 9052 Ghent Belgium D 32 9 329 13 29 t INNOGENETICS Ce 0459 INNOGENETICS s a r l 8 Rue du Mar chal de Lattre de Tassigny 59800 Lille France D 33 1 49 93 26 18 INNOGENETICS Diagnostica y Terapeutica IDT S A Calle Bot nica 146 08908 Hospitalet de Llobregat Barcelona Spain 34 93 600 8000 25847 v1 BIOTECHNOLOGY FOR HEALTHCARE 2004 10 12 INNOGENETICS 2 TABLE OF CONTENTS Symbols USO a u en ee a ei ea RIT 6 English drca SEs cowed Midd Ee gd Bee Are bett e E he 8 Testipfinciple vite DID dao Cen UY Dre ru eur ee 8 egene set g ere senc nat EE SERA sendibe Games 9 Description preparation for use and recommended storage conditions 9 Materials required but not provided 10 Safety and environment 10 SPECIMENS 42 Lace a iii RIVA VR ELS EOD AURA RUN mU T SING 11 Manipulations procedures 11 Strip handling RER 11 Directions for manual incubation 12 Dir
50. LiRAS software is designed to assist with the interpretation of the LiPA results Please contact your local distributor to obtain the latest updated version Limitations of the procedure Use of this product should be limited to personnel trained in the techniques of hybridization Only good laboratory practice and careful performance of the procedures specified will allow specific hybridization and correct typing of target DNA The INNO LiPA HLA DRB1 Plus is designed to give resolution at the allele group level of HLA DRB1 this means the first two digits after the asterisk in an allele name when following standard HLA nomenclature e g HLA DRB1 01 However combinations of certain alleles could lead to a non unique probe combination and thus to an ambiguous answer of two or more possible allelic combinations Knowledge of the allele frequencies in the population under study will indicate the most probable DRB1 type In case a higher resolution typing is required use the INNO LiPA HLA DRB decoder kit New alleles might have polymorphisms outside the probe regions this should be taken into consideration when interpreting results The sequence at the primer binding site is not known for all alleles The risk of mismatch at the primer sites is considered to be very low as primer failure has never been observed and more than 80 alleles spanning all groups have been tested However the possibility of allelic drop out should be con
51. NNO LiPA HLA DRB1 Plus se ha disefiado para proporcionar la resoluci n a nivel de grupo de alelos de HLA DRB1 se indica mediante los dos primeros d gitos despu s del asterisco en el nombre del alelo seg n la nomenclatura est ndar de HLA por ejemplo HLA DRB1 01 No obstante las combinaciones de determinados INNOGENETICS9 64 alelos pueden dar como resultado combinaciones de sondas no nicas y por lo tanto una respuesta ambigua de dos o m s combinaciones posibles de alelos El conocimiento de las frecuencias de alelos de la poblaci n estudiada indicar el tipo de DRB1 m s probable Si es necesaria una determinaci n de tipo de mayor resoluci n utilice el kit INNO LiPA HLA DRB Decoder Alinterpretar los resultados debe tenerse en cuenta la posibilidad de polimorfismos de los nuevos alelos fuera de las regiones de sonda No se conoce la secuencia del sitio de uni n del cebador para todos los alelos Se considera que el riesgo de emparejamiento incorrecto del cebador es muy bajo ya que nunca se ha observado un fallo del cebador en este sentido y se han realizado ensayos con m s de 80 alelos de todos los grupos Sin embargo debe tenerse en cuenta la posibilidad de que se produzca fallo al lico fallo en la amplificaci n de alg n alelo en caso de obtener un resultado homocig tico Eficacia del ensayo Eficacia del ensayo utilizando ADN obtenido con la soluci n de cebador DRB1 en combinaci n con el protocolo Il de PC
52. R DRB1 DRB1 3 4 5 86G 86V DQB1 El equipo INNO LiPA HLA DRB1 ha sido evaluado en tres centros europeos de tipaje de tejidos y en dos de Norte Am rica con muestras de rutina En el estudio se ensayaron un total de 243 muestras con el equipo INNOLIPA HLA DRB1 Los resultados se compararon con t cnicas de tipaje cl sicas y establecidas basadas en ensayos de DNA INNO LiPA DRB key decoder SSP y o serolog a No hubo problemas de amplificaci n con el equipo INNO LiPAHLA DRB1 durante el estudio Reactividad de las sondas Durante el estudio se registraron 74 reacciones de falsos positivos utilizando el equipo INNO LiPA DRB1 No se observaron reacciones de falsos negativos Consultar las instrucciones de uso para informaci n espec fica sobre la reactividad de las sondas Esta disponible un listado de sondas y de especificidades de los primers Todas las sondas est n disefiadas para hibridar espec ficamente con su secuencia complementaria a nivel de un error mismatch si no est especificado de otra manera en la lista Est tambi n disponible un control de calidad de la reactividad de las distintas sondas para prop sitos de acreditaci n Rango de aplicaci n El limite inferior del rango de aplicaci n se determin utilizando diluciones seriadas de DNA 0 05 mg de DNA A260 nm A280 nm gt 1 5 fueron suficientes para realizar la reacci n de amplificaci n produciendo una cantidad de producto amplificado suficiente para ser
53. RB1 11 e il solo allele DRB1 04 con cui essi sono stati riportati il DRB1 0415 C una similarit di sequenza documentata tra gli alleli specifici DRB1 13 coinvolti e il gruppo allelico DRB1 11 Le frequenze attese degli alleli DRB1 13 che causano ambiguit e dell allele DRB1 0415 sono anch esse basse Un antigene risultato ambiguo per DRB1 13 14 in 9 66 13 696 campioni quando era presente o DRB1 13 o DRB1 14 Questi alleli responsabili di ambiguit sono stati riportati dal software LiPA Expert come DRB1 0103 x 1417 1430 tre campioni DRB1 0402 0414c13H x 1421 cinque campioni and DRB1 0402 0414 x 1417 1430 un campione In presenza di DRB1 04 gli alleli rari e recentemente descritti di DRB1 14 AMN 1421 and 1430 vengono dati come alternativi al gruppo allelico DRB1 13 Le specifiche alternative DRB1 14 1417 e 1430 vedi sopra agli alleli DRB1 13 in presenza di DRB1 01 sono entrambe attese raramente Un antigene risultato ambiguo per DRB1 13 15 in 12 97 12 4 campioni quando era presente o DRB1 13 o DRB1 15 Questi alleli responsabili di ambiguit sono stati riportati dal software LiPA Expert come DRB1 0304 x 1309 tutti i dodici campioni L allele DRB1 1309 in alternativa a DRB1 15 in presenza di DRB1 03 un allele raro di origine Ispanica L allele DRB1 0304 riportato con esso anche raro essendo stato rilevato all inizio in tre Caucasici non imparentati Questo allele ha similarit di sequen
54. a o das tiras As tiras foram desenvolvidas para serem utilizados uma s vez N o pegue as tiras com as m os utilize pin as limpas Utilize um lapis para identificar as tiras do teste N o utilize canetas etc Escreva o ID acima da linha de marca o das tiras Durante as v rias etapas de incuba o as tiras de teste devem permanecer na mesma cavidade As tiras n o utilizadas ou processadas devem ser mantidas ao abrigo de luz forte e do calor Para interpretar cobrir ou armazenar as tiras processadas aguarde at que estas estejam completamente secas Tiras processadas e secas devem de prefer ncia ser armazenadas no escuro a uma temperatura de 20 25 C N o reutilize as cavidades INNOGENETICS9 72 Instrug es para a incubac o manual A incuba o a 56 C 0 5 C durante a hibridiza o e a lavagem rigorosa s o as etapas mais importantes para evitar falsos positivos temperatura demasiado baixa ou falsos negativos sinais muito fracos temperatura demasiado elevada O uso de um banho de gua com agitac o e com tampa inclinada assegura um melhor controlo das varia es de temperatura E necess rio realizar um controlo rigoroso da temperatura com um term metro calibrado Durante a incubac o deve sempre fechar a tampa do banho de gua a fim de evitar sinais positivos falsos N o utilize um agitador de ar quente para efectuar a hibridizac o e a lavagem rigorosa Para a hibridiza
55. a o deste produto deve ficar reservado ao pessoal qualificado em t cnicas de hibridizac o Apenas a adop o de uma boa pr tica de laborat rio e a realiza o meticulosa dos procedimentos espec ficos permitem a hibridizac o espec fica e a determinac o do tipo correcto do ADN alvo O INNO LiPA HLA DRB1 Plus foi desenvolvido para apresentar resultados ao n vel do grupo de alelos HLA DRB1 isto significa que os primeiros dois d gitos depois do asterisco no nome do alelo correspondem nomenclatura HLA estandardizada por exemplo HLA DRB 01 No entanto combinag es de determinados alelos podem resultar numa combina o de sonda n o nica e portanto apresentar um resultado amb guo para duas ou mais poss veis combinac es al licas O conhecimento de todas as frequ ncias de alelos na populac o que objecto de estudo indicar o tipo mais prov vel de DRB1 Se necessitar de uma tipagem de resoluc o mais elevada utilize o kit descodificador INNO LiPA HLA DRB Alelos novos podem ter polimorfismos fora das regi es de sonda o que se deve ter em conta ao efectuar a interpretac o dos resultados Asequ ncia no local ligador do iniciador n o conhecida para todos os alelos O risco da n o ligac o no locais do iniciador considerado muito baixo j que a falha de iniciador nunca foi observada e terem sido testado mais de 80 alelos abrangendo todos os grupos No entanto a possibilidade de uma falha al lica de
56. a Solution Amorce DRB1 03 11 13 14 associ e au protocole POR I 30 Deutsch Verwendungszweck 2 22 94 NEEN EE DE bd deny EN Funktionsweise des Tests 31 Reagenzien A che hte eae e irs 32 Beschreibung Vorbereitung und empfohlene Lagerung und Haltbarkeit 32 Zus tzliche ben tigte Materialien die nicht im Lieferumfang enthalten sind 24 Sicherheits und Umwelthinweise 34 Herstellung der Proben 35 Handhabung Aan fs ohne el E bab ave bee SUUM 35 Handhabung der Teststreifen 35 Hinweise zur manuellen Inkubation 35 Anleitung f r das manuelle Auswechseln der Fl ssigkeit in den Wannen 36 Hinweise und Vorsichtsma nahmen 36 Manuelles Testverfahren 2 5 2 0 065 esas s e lh n 36 Proben c ebe a yy bee Sui ee esque Raum MEN 37 Denaturierung und Hybridisierung 37 Stringent Waschl sung Schritt 37 Farbentwicklung xv sipario ae as dede SG T 38 Automatisches Testverfahren Auto LiPA 38 Ergebnisse 2 3 2002 Sn eed a E Ei IMs Ee tM rm eh ee ees a 38 e EE 38 Validierung 2 202 mme impete e e A SS Sa aa 38 Interpretation der Ergebnisse 39 Interpretationssoftwar
57. a ambiguidades envolvendo os alelos DRB1 03 11 13 e ou 14 Todas a ambiguidades observadas ao n vel do grupo de alelos ap s o teste com a soluc o de iniciador DRB1 foram reduzidas para um resultado de tipagem n o ambigua usando a soluc o de iniciador DRB1 03 11 13 14 DRB1 01 DRB1 13 ou DRB1 01 DRB1 14 3 casos DRB1 04 DRB1 13 ou DRB1 04 DRB1 14 6 casos DRB1 08 DRB1 11 ou DRB1 11 DRB1 13 1 caso DRB1 11 DRB1 12 ou DRB1 12 DRB1 13 2 casos O software de interpreta o LIRAS aconselhou para todos os resultados ambiguos a amplifica o DRB1 03 11 13 14 seguida por hibridiza o com INNO LiPA HLA DRB1 strip Precis o A repetibilidade intra ensaio a variac o inter ensaio e interpessoal foram avaliadas internamente Uma amostra amplificada em duplicado usando tr s termocicladores diferentes e processada em duas s ries por cada termociclador foi testada com o instrumento Auto LiPA Este protocolo foi executado em duplicado por duas pessoas diferentes N o foi observada varia o significativa e em todos os casos se obteve um resultado de tipagem id ntico n o sendo necessario fazer alterac es
58. a e 2 sondas de controlo fig 1 INNOGENETICS9 68 A utiliza o deste produto est protegida por patente da F Hoffmann La Roche Ltd e Roche Molecular Systems Inc INNO LiPA HLA DRB1 Plus as etapas envolvidas 1 etapa Amplifica o do ex o 2 dos alelos HLA DRB1 2 etapa Hibridizac o e lavagem rigorosa com 37 sondas imobilizadas numa tira INNO LiPA HLA DRB1 Plus 56 C 3 etapa Revela o da cor 4 etapa Interpreta o do padr o de reactividade da sonda 5 etapa Se necess rio o software de interpreta o LIRAS sugere uma etapa adicional de amplifica o e de hibridiza o Se ao utilizar o kit INNO LIPA HLA DRB1 Plus ocorrerem ambiguidades envolvendo alelos DRB1 03 11 13 ou 14 com outros alelos DRB1 aconselhamos que comece por a e que prossiga com b Isto ser lhe aconselhado pelo software de interpreta o LIRAS a a amplifica o do ex o 2 dos alelos HLA DRB1 03 11 13 14 com solu o de iniciadores HLA DRB1 anterior analise com a tira do INNO LiPA HLA DRB1 Plus b a amplifica o espec fica de grupo do ex o 2 dos alelos HLA DRB1 03 11 13 14 com solu o de iniciadores HLA DRB1 03 11 13 14 anterior analise com a tira do INNO LiPA HLA DRB1 Plus A solu o de iniciadores HLA DRB1 03 11 13 14 fornecida amplifica o ex o 2 dos alelos HLA DRB1 03 11 13 14 O ex o 2 ou outros alelos DRB1 n o ser o amplificados excep o do alelo DRB1 0820 O INNO LiPA HLA DRB1 Plus foi d
59. all les 32 ambiguit s 203 243 ombre d chantillons compar s avec INNO LiPA DRB key utilis pour mesure de concordance 40 243 ombre d chantillons test s par PCR SSP galement pour mesure de concordance Performances l aide d ADN obtenu l aide de la Solution Amorce DRB1 associ e au protocole PCR I A B Bw4 C DRB1 DRB1 03 11 13 14 Pour valuer l quivalence entre les protocoles PCR et II quarante deux chantillons ont t test s en interne avec les deux m thodes Les produits PCR des deux protocoles ont donn des r sultats de typage identiques pour tous les chantillons INNOGENETICS9 30 Performances l aide d ADN obtenu l aide de la Solution Amorce DRB1 03 11 13 14 associ e au protocole PCR I A B Bw4 C DRB1 DRB1 03 11 13 14 Les performances de la Solution Amorce DRB1 03 11 13 14 du test INNO LiPA HLA DRB1 Plus ont t valu es en interne et dans deux laboratoires belges de typage tissulaire Un total de 89 chantillons anonymes ont t analys s 50 chantillons en externe 39 en interne Tous les chantillons avaient t pr alablement typ s l aide de INNO LiPA HLA DRB1 Les chantillons incluaient 14 chantillons ambigus six ambiguit s diff rentes et 75 chantillons non ambigus Tous les chantillons ambigus ont t nouveau typ s jusqu obtention d un r sultat unique l aide de tests de typage bas s sur l ADN Toutes les hybridations ont t effectu
60. almente submergidas na soluc o NOTA Use luvas descart veis e pincas 8 Coloque o suporte no banho agitador com agua a 56 C 0 5 C 80 rpm veja as Instruc es para a incubac o manual feche a tampa e incube durante 30 minutos NOTA Evite salpicar a cavidade com gua do banho Ajuste o n vel da gua entre 1 3 e 1 2 da altura da cavidade Para evitar que o suporte escorregue imobilize o entre dois pesos Lavagem rigorosa 1 Ap s a hibridiza o retire o suporte do banho com agua 2 Incline o suporte a um ngulo ligeiro e aspire o liquido da cavidade com uma pipeta de prefer ncia ligada a um aspirador de v cuo Adicione 2 ml de Solu o de lavagem rigorosa pr aquecida a cada cavidade e lave oscilando o suporte durante 10 20 segundos a uma temperatura de 20 25 C Aspire a solu o de todas as cavidades Repita esta etapa de lavagem mais uma vez 3 Por ltimo aspire a solu o e incube cada tira em 2 ml de solu o de lavagem rigorosa pr aquecida num banho de gua de agita o a uma temperatura de 56 C 0 5 C durante 10 minutos Feche a tampa do banho de gua Antes da incuba o me a a temperatura do banho de gua com um term metro calibrado e se necess rio aque a ou arrefe a a gua Feche sempre a tampa Nora Dilua a solu o concentrada de lavagem 5x e o conjugado 100x ao realizar a lavagem rigorosa Veja Reagentes Revela o da cor Todas as incuba es seguintes devem
61. avaschette 4 Pipettare 10 ul di soluzione di denaturazione nell angolo superiore di ciascuna vaschetta NOTA Chiudere il flacone immediatamente dopo l uso 5 Aggiungere 10 pl di campione vedi Istruzioni per l uso di INNO LiPA HLA DRB1 Amp Plus e miscelare attentamente pipettando su e gi Usare sempre puntali sterili Lasciare a denaturare per 5 minuti a 20 25 C 6 Agitare la Soluzione di Ibridazione pre riscaldata e aggiungerne delicatamente 2 ml al prodotto amplificato denaturato in ciascuna vaschetta Miscelare agitando delicatamente Fare attenzione a non contaminare le vaschette vicine durante il pipettamento 7 Porre immediatamente le strisce nelle vaschette con il lato contrassegnato dalla linea identificativa nera rivolta verso l alto Le strisce devono essere completamente immerse nella soluzione NOTA ndossare guanti monouso e usare le pinzette 8 Porre il vassoio portavaschette nel bagnomaria in agitazione a una temperatura di 56 C 0 5 C 80 rpm vedere le indicazioni per l incubazione manuale chiudere il coperchio e incubare per 30 minuti NOTA Evitare che l acqua del bagnomaria schizzi dal bagnomaria nella vaschetta Regolare il livello dell acqua tra 1 3 e 1 2 dell altezza della vaschetta Per prevenire lo scivolamento del portavaschette immobilizzarlo tra due oggetti pesanti Lavaggio stringente 1 Dopo l ibridazione rimuovere il vassoio portavaschette dal bagnomaria 2 Tenere il vassoio
62. avidades pode causar a contaminac o cruzada Instrug es para mudar manualmente o l quido nas cavidades O l quido deve ser aspirado da cavidade com uma pipeta de prefer ncia ligada a aspirador de v cuo O suporte inclinado de modo a permitir que o l quido se desloque para um lado da cavidade Adicione 2 ml da soluc o apropriada e siga o protocolo A pipeta dispensadora multi canal Eppendorf til para esta aplicac o Repita esta etapa tantas vezes quantas as indicadas no procedimento de teste NOTA N o deixe que as tiras sequem entre as duas etapas Certifique se de que n o danificou a superficie das tiras durante a aspirac o Aspire o liquido pela parte superior da tira acima da linha de marcac o Certifique se de que aspirou todo o l quido Certifique se de que a tira foi cuidadosamente lavada por submers o completa na solug o de lavagem Adaptar a velocidade do agitador quando necess rio 73 INNO LiPA HLA DRB1 Plus Observa es e precau es Exclusivamente para uso profissional Afim de evitar a contamina o de ADN recomendada a m xima separa o f sica entre etapas de pr e p s amplifica o locais diferentes pipetas e outro material de laborat rio diferentes batas e luvas de laborat rio diferentes armazenagem separada s o precau es m nimas para uma boa pr tica de laborat rio Evite transferir qualquer elemento do local de p s amplifica o para o
63. bbildung 1 siehe Seite 15 Position der Markierungslinie Schwarz der Konjugatkontrolllinie conj Control der HLA DRB1 Plus Kontrolllinie HLA DRB Control und der 37 sequenzspezifischen DNA Sonden auf dem INNO LiPA HLA DRB1 Plus Streifen Validierung Bei jedem Test eine Negativkontrolle und eine LiPA Kontrolle f r INNO LiPA HLA DRB1 Plus hinzuf gen Wie bei jedem neuen Testverfahren ist das Hinzuf gen einer zus tzlichen Positiv und Negativkontrolle ratsam bis eine hohe Zuverl ssigkeit bei der Durchf hrung des Testverfahrens gew hrleistet ist Es wird geraten Referenz DNA zu verwenden um sicherzustellen dass angemessene Testbedingungen eingehalten wurden 39 INNO LiPA HLA DRB1 Plus Die oberste Linie auf den INNO LiPA HLA DRB1 Plus Teststreifen ist die Markierungslinie schwarze Linie Diese Linie erm glicht die korrekte Ausrichtung des Teststreifens An Hand der n chsten Linie wird die Zugabe von reaktivem Konjugat und von Substratgebrauchsl sung w hrend des Nachweisverfahrens kontrolliert Diese Linie muss an der Konjugatkontrolllinie auf der Kunststoffableseschablone ausgerichtet werden Diese Linie muss immer positiv sein und sollte auf allen Teststreifen eines Testlaufs dieselbe Intensit t aufweisen Die nachfolgende Linie ist die HLA DRB Positivkontrolllinie HLA DRB Kontrolle auf der Ableseschablone die anzeigt ob eine ausreichende Menge an HLA DRB1 Amplifikat f r die Hybridisierung zugef gt wurde
64. ca que o Auto LiPA foi desenvolvido para controlar totalmente as etapas da hibridizac o da lavagem rigorosa e da revelac o da cor O Auto LiPA caracteriza se por ser um instrumento independente com aquecimento refrigerac o aspirac o e pipetac o automatizados Para mais informag es sobre protocolos espec ficos do Auto LIPA contacte o seu distribuidor local Resultados Leitura Uma linha considerada positiva quando no final do teste aparecer uma faixa de cor p rpura castanho claro Figura 1 ver p gina 15 Lugar da linha de marcac o preto da linha de controlo do conjugado Controlo conj da linha de controlo HLA DRB1 controlo HLA DRB e das 37 sondas de ADN espec ficas da sequ ncia nas tiras INNO LiPA HLA DRB1 Plus strip Validac o nclua um controlo negativo e um controlo LIPA para o INNO LiPA HLA DRB1 Plus cada vez que realize um teste Tal como sucede com qualquer outro novo procedimento de teste at se ter alcangado um grau de confianga mais elevado quanto execuc o correcta do procedimento do teste deve ser considerada a inclus o de controlos positivos e negativos adicionais Recomenda se a utilizac o de ADN de refer ncia para validar as condi es adequadas estabelecidas A linha superior da tira de INNO LiPA HLA DRB1 Plus a linha de marca o linha preta Esta linha permite orientar correctamente a tira A linha seguinte controla a adi o do conjugado reactivo e da solu o de substra
65. ci n Term metro calibrado Agitador de plataforma orbital de movimiento reciproco o de balanceo Recomendaciones Para un agitador orbital el di metro del movimiento circular debe ser igual o superior a 13 mm a velocidad recomendada para un movimiento circular de 13 mm es de 160 rpm Para un agitador de movimiento rec proco la velocidad recomendada para el movimiento de ida y vuelta es de 80 movimientos por minuto Para un agitador de plataforma de balanceo el ngulo de agitaci n no debe superar los 13 para evitar que el l quido se derrame la velocidad recomendada es de 50 rpm V rtex o equivalente Probetas graduadas 10 25 50 y 100 ml Agua destilada o desionizada Guantes desechables Puntas de pipeta esterilizadas desechables preferiblemente con filtro de algod n Pinzas para la manipulaci n de las tiras Pipetas ajustables que permitan pipetear 1 20 ul 20 200 ul y 200 1000 yl Multtipipeta de distribuci n Eppendorf opcional Cron metro 2 horas 1 minuto Seguridad y medio ambiente Consulte la hoja de datos sobre seguridad del fabricante y el etiquetado del producto para obtener informaci n acerca de componentes potencialmente peligrosos PI R20 21 R36 R45 R61 S36 37 S45 53 Producto t xico T Dafiino si se inhala o entra en contacto con la piel Irrita los ojos Puede provocar c ncer Puede dafiar los fetos Utilice indumentaria y guantes de pro
66. ciutte devono essere conservate preferibilmente al buio a una temperatura compresa tra 20 25 C Non riutilizzare le vaschette Indicazioni per l incubazione manuale L incubazione a 56 C 0 5 C durante l ibridazione e il lavaggio stringente il passaggio pi critico per evitare falsi positivi temperatura troppo bassa o segnali falsi negativi molto deboli temperatura troppo alta Un bagnomaria in agitazione con coperchio inclinato permette un buon controllo delle variazioni di temperatura E necessario un controllo rigoroso della temperatura con un termometro calibrato Chiudere sempre il coperchio del bagnomaria durante le incubazioni per evitare segnali positivi falsi Non usare agitatori ad aria calda per l ibridazione e il lavaggio stringente Per l ibridazione e il lavaggio stringente le vaschette devono essere posizionate sul piatto di agitazione del bagnomaria Regolare il livello dell acqua tra 1 3 e 1 2 INNOGENETICS9 48 dell altezza della vaschetta Assicurarsi che le vaschette non galleggino nell acqua L acqua deve essere a contatto diretto con le vaschette passaggi d incubazione per lo sviluppo del colore devono essere compresi tra 20 25 C Se la temperatura inferiore a 20 C si potrebbero ottenere risultati pi deboli Se la temperatura superiore a 25 C si possono ottenere elevate colorazioni e o segnali falsi positivi Incubare sempre esattamente per il tempo indicato nel protocollo
67. commendations For an orbital shaker the diameter of the circular motion should be equal or superior to 13 mm recommended speed for a 13 mm circular motion is 160 rpm For a reciprocal shaker recommended speed for the to and from motion is 80 movements per minute For a rocking platform shaker the shaking angle should not exceed 13 to avoid spilling of liquid recommended speed is 50 rpm Vortex mixer or equivalent Graduated cylinders 10 25 50 and 100 ml Distilled or deionized water Disposable gloves Disposable sterile pipette tips preferably cotton plugged Forceps for strip handling Adjustable pipettes to deliver 1 20 ul 20 200 ul and 200 1000 pl Dispensing Multipipette Eppendorf optional Timer 2 hours 1 minute Safety and environment Please refer to the manufacturer s safety data sheet and product labeling for information on potentially hazardous components 11 INNO LiPA HLA DRB1 Plus E R20 21 R36 R45 R61 S36 37 S45 53 Toxic T Harmful by inhalation and in contact with skin Irritating to eyes May cause cancer May cause harm to the unborn child Wear suitable protective clothing and gloves In case of accident or if you feel unwell seek medical advice immediately show the label where possible Avoid exposure obtain special instructions for use Restricted to professional users Contains Dimethylformamide 5 Bromo 4 chloro 3 indolyl phosphate p Toluidine
68. d K 1067 v 5 x 1998 02 20 The INNO LiPA HLA DRB1 strips with 37 DNA probes immobilized as parallel lines allow DRB1 allele group typing The theoretical resolution at broad level DRB1 01 to 17 INNO LiPA HLA DRB1 Plus DRB1 16 is calculated as 89 3 During the study the overall allele group resolution achieved was 86 8 211 243 A total of 32 ambiguous results were described These arose from seven probe combinations and were reported with the following allele combinations DRB1 03 x 11 13 8 samples DRB1 04 x 11 13 3 samples DRB1 01 x 13 14 3 samples DRB1 04 x 13 14 6 samples and DRB1 03 x 13 15 12 samples One antigen was ambiguous for DRB1 11 13 in 11 83 13 396 samples where either DRB1 11 or DRB1 13 was present These ambiguity causing alleles were reported by the LiPA Expert software as follows DRB1 0308 x 1324 two samples DRB1 0415 x 1322 1323 three samples and DRB1 0308 x 1305 1307 1311 1314c75L 1314c75V six samples In the presence of DRB1 03 where DRB1 13 is given as the alternative allele group to DRB1 11 the specific DRB1 03 allele is in each case DRB1 0308 This allele has been described as having a very similar sequence to DRB1 03011 except at codon 58 where the similarity is with the DRB1 11 allele group In addition both the DRB1 0308 and the specific DRB1 13 alleles DRB1 1305 1307 1311 1314 and 1324 with which it was ambiguously reported also have an expected low
69. d accr ditation est disponible sur demande Intervalle d application La limite la plus basse de l intervalle d application a t d termin e l aide d une s rie d ADN titr s 0 05 ug d ADN extrait A260 nm A280 nm gt 1 5 amplifi avec le test d amplification fourni est plus qu il n en faut pour obtenir une d tection par LiPA R solution Table de typage K 1067 v 5 x 1998 02 20 Les bandelettes INNO LiPA HLA DRB1 avec 37 sondes DNA immobilis es en bandes parall les permettent un typage DRB1 au niveau groupe d all les La r solution th orique au niveau g n rique DRB1 01 DRB1 16 est de 89 3 Au cours de l tude la r solution globale au niveau groupe d all les a t de 86 896 211 243 32 r sultats ambigus ont t obtenus provenant de 7 combinaisons de Sondes et ont t rapport s avec les combinaisons d all les suivantes DRB1 03 x 11 13 8 chantillons DRB1 04 x 11 13 3 chantillons DRB1 01 x 13 14 3 chantillons DRB1 04 x 13 14 6 chantillons et DRB1 03 x 13 15 12 chantillons Un antig ne tait ambigu pour DRB1 11 13 dans 11 83 chantillons 13 396 oU soit DRB1 11 soit DRB1 13 taient pr sents Ces all les responsables de l ambiguit ont t rapport s par le logiciel LiPA Expert comme suit DRB1 0308 x 1324 2 chantillons DRB1 0415 x 1322 1323 3 chantillons et DRB1 0308 x 1305 1307 1311 1314c75L 1314c75V 6 chantillons 29 INNO LiPA HLA DRB1 Plu
70. das se sequen completamente antes de interpretarlas cubrirlas y almacenarlas Las tiras reveladas secas deben almacenarse preferiblemente en un lugar oscuro a una temperatura entre 20 25 C No reutilice las cubetas Instrucciones para la incubaci n manual La incubaci n a 56 C 0 5 C durante la hibridaci n y el lavado astringente es el paso m s importante para evitar falsos positivos temperatura demasiado baja o falsos negativos se ales muy d biles temperatura demasiado elevada Un ba o de agua de agitaci n con una cubierta inclinada ofrece un buen control sobre las variaciones de temperatura Es necesario realizar un control estricto de la temperatura con un term metro calibrado Cierre siempre la cubierta del ba o de agua durante las incubaciones para evitar se ales de falso positivo No utilice un agitador de aire caliente para la hibridaci n y el lavado astringente Para la hibridaci n y el lavado astringente las cubetas deben colocarse en la plataforma de agitaci n del ba o de agua Ajuste el nivel de agua entre 1 3 y 1 2 de la altura de la cubeta Aseg rese de que las cubetas no flotan en el agua El agua debe estar en contacto directo con las cubetas Los pasos de incubaci n para el revelado de colores deben realizarse a una temperatura entre 20 25 C Si la temperatura fuera inferior a 20 C se obtendr an resultados menos intensos Si la temperatura fuera superior a 25 C se obtendr a una sefial de fond
71. de la tarjeta de lectura que indica si se a adi una cantidad adecuada de material amplificado de HLA DRB1 para la hibridaci n Esta banda debe ser siempre positiva excepto para el control negativo pero su intensidad puede variar de una muestra a otra El resultado del ensayo de cada control negativo no debe ofrecer ninguna sefial aparente para ninguna de las bandas de la tira excepto para la banda de control de conjugado La muestra de control LiPA para INNO LiPA HLA DRB1 Plus debe producir el siguiente patr n de sondas positivas control de conjugado control HLA DRB 2 8 23 25 26 30 33 37 Esta muestra de control se compone de oligonucle tidos biotinilados complementarios de las sondas de hibridaci n mencionadas La hibridaci n positiva sobre estas sondas demuestra as un rendimiento satisfactorio del ensayo que incluye la hibridaci n el lavado astringente el revelado de color y la detecci n Un patr n diferente puede indicar problemas de rendimiento del ensayo tales como una temperatura incorrecta durante la hibridaci n o desviaciones respecto a los valores de tiempo o temperatura prescritos para la incubaci n Las intensidades del color de las sondas de una tira pueden diferir de una banda a otra Interpretaci n de los resultados Compruebe que el patr n de reactividad de la muestra de control LiPA es correcto La banda de control de conjugado de la tira debe estar alineada con la banda de control de conjugado de
72. de soluc o de lavagem de trabalho para cada cavidade teste 10 ml em excesso Para Auto LiPA prepare mais 10 ml Armazenada a uma temperatura de 2 8 C a solu o lavagem de trabalho permanece est vel por 2 semanas Suporte de teste 3 Contendo 8 cavidades cada um Cart o de leitura 1 Para a identificag o de sondas positivas Folha de relat rio de dados 2 Para guardar tiras processadas Material necess rio n o fornecido Banho de gua com plataforma agitadora 80 rpm com tampa inclinada temperatura ajust vel at aos 56 C 0 5 C Aparelho aspirador Term metro calibrado Plataforma agitadora orbital reciproca ou oscilador Recomenda es Para um agitador orbital o di metro do movimento circular deve ser igual ou superior a 13 mm a velocidade recomendada para um movimento circular de 13 mm de 160 rpm Para um agitador rec proco a velocidade recomendada para o movimento de ida e volta de 80 movimentos por minuto Para a plataforma agitadora de oscilac o o movimento de agita o n o deve exceder dos 13 para evitar o derramamento de liquido a velocidade recomendada de 50 rpm Agitador de vortex ou equivalente Provetas graduados 10 25 50 e 100 ml Agua destilada ou desionizada Luvas descart veis Pontas de pipetas est reis descart veis de prefer ncia com filtro de algod o Pin as para manipula o das tiras Pipetas ajust veis capaz
73. des r sultats LIPA Contactez votre distributeur pour obtenir sa derni re version Limites du test L utilisation de ce produit doit tre restreinte au personnel ayant recu une formation aux techniques d hybridation Seules de bonnes pratiques de laboratoire et le strict respect des proc dures sp cifi es permettront une hybridation sp cifique et un typage correct de l ADN cible Le test INNO LiPA HLA DRB1 Plus est concu pour fournir une r solution au niveau du groupe d all les de HLA DRB1 c est dire les deux premiers chiffres apr s l ast risque dans le nom de l all le selon la nomenclature HLA standard par ex HLA DRB1 01 Toutefois la combinaison de certains all les pourrait produire une combinaison de sondes non unique et donc une r ponse ambigu de deux ou plusieurs combinaisons all liques possibles La connaissance des fr quences all liques dans la population tudi e indiquera INNOGENETICS9 28 le type DRB1 le plus probable Si un typage de r solution sup rieure tait n cessaire utiliser le kit INNO LiPA HLA DRB decoder convient de tenir compte lors de l interpr tation des r sultats que de nouveaux all les peuvent avoir des polymorphismes situ s en dehors des r gions des sondes La s quence au site de fixation des amorces n est pas connue pour tous les all les Le risque de m sappariement au site de fixation des amorces est consid r comme tr s faible tant donn qu aucun chec d am
74. dio la risoluzione complessiva a livello di gruppo allelico raggiunta stata del 86 8 211 243 Sono stati descritti un totale di 32 risultati ambigui Questi derivano da sette combinazioni di sonde e sono stati riportati con le seguenti combinazioni alleliche DRB1 03 x 11 13 8 campioni DRB1 04 x 11 13 3 campioni DRB1 01 x 13 14 3 campioni DRB1 04 x 13 14 6 campioni e DRB1 03 x 13 15 12 campioni Un antigene risultato ambiguo per DRB1 11 13 in 11 83 13 396 campioni in cui era presente o DRB1 11 o DRB1 13 Questi alleli responsabili di ambiguit sono stati riportati 53 INNO LiPA HLA DRB1 Plus dal software LiPA Expert come DRB1 0308 x 1324 due campioni DRB1 0415 x 1322 1323 tre campioni and DRB1 0308 x 1305 1307 1311 1314c75L 1314c75V sei campioni In presenza di DRB1 03 quando DRB1 13 viene dato come gruppo allelico alternativo a DRB1 11 lo specifico allele DRB1 03 in ogni caso DRB1 0308 Questo allele stato descritto avere una sequenza molto simile alla sequenza di DRB1 03011 ad eccezione del codone 58 dove la similitudine con il gruppo allelico DRB1 11 Inoltre sia l allele DRB1 0308 che gli alleli specifici DRB1 13 DRB1 1305 1307 1311 1314 and 1324 con cui stato riportato in maniera ambigua hanno una frequenza attesa bassa In presenza di DRB1 04 uno dei due rari alleli di DRB1 13 1322 1323 viene dato come possibile allele alternativo al gruppo allelico D
75. do Tras el lavado astringente se a ade conjugado de estreptavidina con fosfatasa alcalina y se une a alg n h brido biotinilado formado previamente La incubaci n con una soluci n de sustrato que contiene un crom geno produce un precipitado de un color morado o marr n Se detiene la reacci n mediante un lavado y se registra el patr n de reactividad de las sondas Con el kit INNO LiPA HLA DRB1 Plus est disponible un kit de amplificaci n INNO LiPA HLA DRB1 Amp Plus para la preparaci n estandarizada de material amplificado biotinilado Este kit de amplificaci n se basa en la reacci n en cadena de polimerasa PCR polymerase chain reaction Los productos de amplificaci n se hibridan sucesivamente con 1 tira de determinaci n de tipo en la que se fijan 37 sondas de ADN espec ficas de la secuencia y 2 sondas de control Ilustraci n 1 El uso de este producto est cubierto por una licencia de F Hoffmann La Roche Ltd y Roche Molecular Systems Inc Pasos de INNO LiPA HLA DRB1 Plus Paso 1 Amplificaci n del ex n 2 de los alelos HLA DRB1 Paso 2 Hibridaci n y lavado astringente con 37 sondas inmovilizadas en una tira de INNO LiPA HLA DRB1 a 56 C Paso 3 Revelado de color Paso 4 Interpretaci n del patr n de reactividad de las sondas Paso 5 Si es necesario el software de interpretaci n LIRAS recomienda completar un paso m s de amplificaci n e hibridaci n Cuando se utiliza el kit INNO LiPA HLA DRB1 Plus
76. e LIRASTM 39 Grenzen der Meade ec quam ruas cops ae oa commen anite fig i ee 39 Leistungsf higkeit des Tests 40 Testleistung unter Verwendung von DNA die mit DRB1 Primer L sung in Kombination mit dem PCR Protokoll Il ausgel st wurde 40 Testleistung unter Verwendung von DNA die mit DRB1 Primer L sung in Kombination mit dem PCR Protokoll ausgel st wurde 42 Testleistung unter Verwendung von DNA die mit DRB1 03 11 13 14 Primer L sung in Kombination mit dem PCR Protokoll ausgel st wurde 42 Italiano USO previstos 74 cotone LIA lo e I 43 Principio detesta colita den tu er Area ia 43 Reagenti si 2 24 etu etes tentes i en 44 Descrizione preparazione per l uso e condizioni di conservazione raccomandate cortar pas Eres Ces 44 Materiali richiesti ma non forniti 46 Sicurezza e ambiente 2 Voce teg enia OMA aan Cu 46 CAMPILLO en LORO HERE 47 Procedure di manipolazione 47 INNOGENETICS9 4 Trattamento delle strisce 47 Indicazioni per l incubazione manuale 47 Indicazioni per il cambio manuale dei liquidi nelle vaschette 48 Note e precauzioni iio see Eer er ea E Tu pi 48 Procedura manuale del test ENEE 48 Campioni attenta roti deg e eds der eo s e NE a d 49 Denaturazione e ibridazione
77. e Substrato Tamp n sustrato Tamp o de substrato Rinse Solution 5x Solution de Rin age 5x 5x konzentrierte Sp ll sung Soluzione di Risciacquo 5x Soluci n de lavado 5x Solu o de lavagem 5x INNOGENETICS 8 English Intended use The INNO LiPA HLA DRB1 Plus is a line probe assay for in vitro use designed for the molecular typing of human leukocyte antigen HLA DRB1 alleles at the allele group level DRB1 01 to DRB1 16 Test principle The INNO LiPA HLA typing tests are based on the reverse hybridization principle Amplified biotinylated DNA material is chemically denatured and the separated strands are hybridized with specific oligonucleotide probes immobilized as parallel lines on membrane based strips This is followed by a stringent wash step to remove any mismatched amplified material After the stringent wash streptavidin conjugated with alkaline phosphatase is added and bound to any biotinylated hybrid previously formed Incubation with a substrate solution containing a chromogen results in a purple brown precipitate The reaction is stopped by a wash step and the reactivity pattern of the probes is recorded With the INNO LiPA HLA DRB1 Plus kit an amplification kit INNO LiPA HLA DRB1 Amp Plus is available for standardized preparation of biotinylated amplified material This amplification kit is based on the polymerase chain reaction PCR Amplification products are subsequently hybridized using 1 typing
78. e se poder avaliar a equival ncia entre dos protocolos PCR e Il foram testadas internamente quarenta e duas amostras usando ambos os m todos Os produtos PCR de ambos os protocolos apresentaram para todas as amostras resultados de tipagem id nticos Desempenho do teste usando ADN obtido com a soluc o de iniciador DRB1 03 11 13 14 em combinac o com o PCR protocolo A B Bw4 C DRB1 DRB1 03 11 13 14 O desempenho da soluc o de iniciador DRB1 03 11 13 14 do INNO LiPA HLA DRB1 Plus foi avaliado internamente e em dois laborat rios de tipagem de tecido belgas Foi analisado um total de 89 amostras an nimas 50 amostras externamente 39 amostras internamente Todas as amostras foram previamente tipadas com INNO LiPA HLA DRB1 As amostras inclu am 14 amostras amb guas seis ambiguidades diferentes e 75 amostras n o ambiguas Al m disso todas as amostras amb guas foram tipadas para um resultado nico com um ou mais ensaios de tipagem alternativos baseados em ADN Todas as hibridizag es foram executadas usando o instrumento de Auto LiPA usando o programa HLA56v3 e a interpretac o foi executada usando uma vers o experimental cl nica do LIRAS para o software de interpreta o LIPA HLA v3 00 Sensibilidade do teste A sensibilidade do teste ao n vel do grupo de alelos foi calculada atrav s do n mero de tipagens bem sucedido sobre o n mero total de amostras testadas A sensibilidade nesta avaliac o foi de 100 89 89 95
79. e typing assay Olerup SSP GenoVision or Allset DR Low Resolution Dynal The typing results of all 87 samples were concordant with the reference assay resulting in a diagnostic accuracy of 100 87 87 95 CI 95 9 100 Francais But du test INNO LiPA HLA B DRB1 Plus est un test sur bandelette usage in vitro pour le typage mol culaire au niveau du groupe d all les des all les HLA DRB1 Human Leucocyte Antigen au niveau du groupe d all les DRB1 01 DRB1 16 Principe du test Les tests de typage INNO LiPA HLA sont bas s sur le principe de l hybridation inverse L ADN biotinyl amplifi est d natur chimiquement et les chaines s par es sont hybrid es l aide de sondes oligonucl otidiques immobilis es en bandes parall les sur bandelettes L hybridation est suivie d un lavage stringent afin d liminer tout mat riel amplifi non appari Apr s le lavage stringent est ajout e de la streptavidine marqu e une phosphatase alcaline qui se fixe aux hybrides biotinyl s pr c demment form s L incubation avec une solution de substrat contenant un chromog ne entraine la formation d un pr cipit violet brun La r action est stopp e par lavage et le profil de r activit des sondes est tabli Le kit INNO LiPA HLA DRB1 Plus est fourni avec un kit d amplification INNO LiPA HLA DRB1 Amp Plus pour la pr paration standardis e de mat riel amplifi biotinyl Ce kit d amplification est bas
80. eben wurde Reproduzierbarkeit Wiederholte Typisierungstestserien mit verschiedenen Chargen des INNO LiPA HLA DRB1 Tests mit DNA von w hrend der Studie entnommenen klinischen Proben ergaben in jedem Fall reproduzierbare Reaktivit ten der Sonden Richtigkeit Bei der externen Evaluierung zeigte der INNO LiPA HLA DRB1 Test vollst ndige bereinstimmung mit den Referenzmethoden Zusammenfassung der Probenzahlen 243 Gesamtzahl der Amplifikationen keine Fehlergebnisse 211 Gesamtzahl eindeutiger Ergebnisse auf dem Niveau derAllelgruppen 32 Nicht eindeutige Ergebnisse 203 243 Probenzahl im Vergleich mit INNO LiPA DRB Key zur Messung der Konkordanz 40 243 Zahl der mit PCR SSP gemessenen Proben ebenfalls zur Bestimmung der Konkordanz herangezogen INNOGENETICS9 42 Testleistung unter Verwendung von DNA die mit DRB1 Primer L sung in Kombination mit dem PCR Protokoll ausgel st wurde A B Bw4 C DRB1 DRB1 03 11 13 14 Um de Aquivalenz zwischen den PCR Protokollen und Il bewerten zu k nnen wurden 44 Proben hausintern unter Verwendung beider Methoden getestet Die PCR Produkte beider Protokolle ergaben dieselben Typisierungsergebnisse f r alle Proben Testleistung unter Verwendung von DNA die mit DRB1 03 11 13 14 Primer L sung in Kombination mit dem PCR Protokoll I ausgel st wurde A B Bw4 C DRB1 DRB1 03 11 13 14 Die Leistung der DRB1 03 11 13 14 Primer L sung des INNO LiPA HLA DRB1 Plus wurde hausintern so
81. ections for manual changing liquid in the troughs 12 Remarks and precautions eh 12 Manual test procedure m lt Siames niet Eton mente etd ce e Pe e 13 ue EEN 13 Denaturation and hybridization 13 Stringent Wash vocal ee wee eee Giu Ee 14 Color development rar sans pasta Rig DA 14 Automated test procedure Auto LiPA 14 Results Un elle lisina LESENE VERI 14 R ading icaro ea iaia RAT 14 Malidatlol i calende x aie ORAE CREAR ra siae 15 Interpretation of results 15 Interpretation software LIRASTM 16 Limitations of the procedure 16 Test performance rita tonal e RE TA ad cee 16 Test performance using DNA obtained with DRB1 Primer Solution in combination with PCR protocol Il 16 Test performance using DNA obtained with DRB1 Primer Solution in combination with PCR protocol 18 Test performance using DNA obtained with DRB1 03 11 13 14 Primer Solution in combination with PCR protocol 18 Frangais But dute ou pee ee wees Di QI E NU EN YE 19 Principe du test cya esie er driver unen a ee RR 19 c gc T cr 20 Description pr paration et conditions de conservation 20 Mat riel n cessaire non fourni 4 4
82. elettes avant de lire les r sultats Conservez les bandelettes d velopp es et s ches l obscurit Proc dure automatis e Auto LiPA La proc dure de test LiPA peut tre tr s facilement automatis e C est ainsi que l Auto LiPA est congu pour prendre int gralement en charge les tapes d hybridation de lavage stringent et de r v lation L Auto LiPA est un syst me ne n cessitant aucune surveillance et pourvu de fonctions de chauffage et refroidissement aspiration et pipetage automatiques Pour plus d informations et les protocoles sp cifiques de l Auto LiPA prendre contact avec un distributeur local R sultats Lecture Une bande est consid r e positive lorsqu une coloration violet brun apparait clairement la fin de la proc dure de test Figure 1 voir page 15 Emplacement de la ligne de rep re noire de la bande contr le Conjugu conj Control de la bande contr le HLA DRB1 Plus HLB DRB Control et des 37 sondes ADN sp cifiques sur la bandelette INNO LiPA HLA DRB1 Plus Validation Inclure un contr le n gatif et le contr le LIPA pour INNO LiPA HLA DRB1 Plus lors de chaque test Comme dans toute proc dure de test il est indiqu de pr voir des contr les positifs et n gatifs suppl mentaires jusqu acquisition d une pr cision 27 INNO LiPA HLA DRB1 Plus satisfaisante dans l ex cution de la proc dure de test Il est conseill d utiliser un ADN de r f rence pour valider la qualit
83. entificazione nera della banda di controllo del coniugato conj Control della banda di controllo HLA DRB1 Plus HLA DRB Control e le 37 sonde DNA sequenza specifiche sulla striscia INNO LiPA HLA DRB1 Plus Validazione Includere un controllo negativo e il Controllo LIPA per INNO LiPA HLA DRB1 Plus ogni volta che si esegue un test Come per ogni nuova procedura di test l aggiunta di controlli aggiuntivi positivi e negativi deve essere presa in esame fino a raggiungere un alto grado di confidenza nella corretta esecuzione del test 51 INNO LiPA HLA DRB1 Plus Si suggerisce di usare DNA di riferimento per assicurarsi che siano state raggiunte le condizioni idonee per l esecuzione del test La linea superiore sulla striscia INNO LiPA HLA DRB1 Plus la linea di identificazione linea nera Questa linea permette un corretto orientamento della striscia La linea successiva controlla l aggiunta delle soluzioni di lavoro del Coniugato e del Substrato durante la procedura di rilevazione Questa linea deve essere sempre allineata con la linea di controllo del Coniugato della carta di lettura Questa linea deve essere sempre positiva e dovrebbe avere approssimativamente la stessa intensit nelle strisce della stessa seduta La linea successiva la linea di controllo positivo HLA DRB controllo HLA DRB sulla carta di lettura che indica se si aggiunta per l ibridazione il quantitativo appropriato di materiale amplificato HLA DRB1 Ques
84. es de dispensar 1 20 ul 20 200 yl e 200 1000 ul Pipetas dispensadoras multi canal Eppendorf opcional Cron metro 2 horas 1 minuto Seguranca e ambiente Consulte as safety data sheet do fabricante e a rotulagem do produto para obter informac o sobre componentes potencialmente perigosos R20 21 R36 R45 R61 S36 37 S45 53 T xico T Perigoso por inalac o e em contacto com a pele Pode provocar irritag o nos olhos Pode provocar o cancro Durante uma gravidez pode causar perigo para o beb Usar roupas e luvas adequadas e de protecc o Em caso de acidente ou se se sentir mal procurar conselho m dico imediatamente mostrar o r tulo sempre que poss vel Evitar exposic o obter instruc es especiais de utilizac o Limitado a utilizadores profissionais Contem dimetilformamida sal de 5 bromo 4 cloro 3 indolil fosfato p toluidina Substrato BCIP NBT 100x 71 INNO LiPA HLA DRB1 Plus x R43 S24 37 Provoca irritac o Xi Evite o contacto com a pele Pode causar sensibilizac o em contacto com a pele Utilize luvas de protecc o adequadas Cont m 2 cloroacetamida Soluc o de lavagem tamp o substrato diluente conjugado e controlo LiPA x R36 38 S23 24 26 Provoca irritag o Xi provoca irritag o dos olhos e pele N o respire o vapor Evite o contacto com a pele Em caso de contacto com os olhos lave imediatamente com muita gua e procure auxilio m dico Cont m hidr xido de s dio S
85. esenvolvido para dar a melhor resolu o poss vel usando o formato de ensaio da hibridiza o invertida ao n vel do grupo de alelos isto significa que os primeiros dois d gitos depois do asterisco no nome do alelo correspondem nomenclatura HLA estandardizada por exemplo HLA DRB1 01 Al m da interpreta o do grupo de alelos o software dar todas as combina es poss veis de alelos No entanto esta informa o deve ser considerada como informa o adicional e n o como sendo informa o decisiva Reagentes Descri o prepara o para utiliza o e condi es de conserva o recomendadas Os reagentes abertos ou fechados permanecem est veis at data limite de validade do kit se os mantiver a uma temperatura de 2 8 C e estiverem guardados nos frascos originais N o congele os reagentes N o utilize os reagentes para al m da data de validade N o se deve guardar o kit junto de qualquer fonte de contamina o de ADN em especial de produtos amplificados Atemperatura de todos reagentes deve ser elevada temperatura ambiente 20 25 C aproximadamente 60 minutos antes da utiliza o e recolocados imediatamente no frigor fico ap s o uso Altera es na apar ncia f sica dos reagentes do kit podem indicar instabilidade ou deteriora o E recomend vel guardar o tubo horizontalmente para minimizar a possibilidade das tiras se encaracolarem antes do uso 69 INNO LiPA HLA DRB1 Plus
86. eser Studie mit dem INNO LiPA HLA DRB1 Test traten keine Amplifikationsfehler auf Reaktivit t der Sonden Insgesamt traten bei dem INNO LiPA HLA DRB1 Test 74 falsch positive Banden auf Falsch negative Banden wurden nicht gefunden F r weitere Informationen ber die Reaktivit t der Sonden ziehen Sie bitte die entsprechenden Richtlinien zu Rate Eine vollst ndige Liste aller Sonden und Primerspezifit ten liegt vor Alle Sonden wurden so hergestellt dass sie soweit in der Liste nicht anders angegeben bis auf eine Fehlpaarung spezifisch mit den komplement ren Sequenzen hybridisieren Auf Anfrage k nnen wir Ihnen einen Bericht ber die Qualit tskontrolle der Reaktivit ten zur Verf gung stellen Anwendungsbereiche Das untere Limit des Anwendungsbereiches wurde mit Hilfe einer DNATitrationsserie ermittelt Die minimale DNA Menge die im zugeh rigen Amplifikationstest eingesetzt werden kann um f r die Detektion im LiPA Test ausreichende DNA Mengen zu amplifizieren liegt bei 0 05 ug extrahierter DNA A260 nm A280 nm gt 1 5 Aufl sung Verwendete Typisierungstabelle K 1067 v 5 x 1998 02 20 Es ist m glich mit den INNO LiPA HLA DRB1 Streifen auf denen 37 DNA Sonden als parallele Banden immobilisiert sind eine DRB1 Allelgruppen Typisierung durchzuf hren Die theoretische Aufl sung ber die gesamte Breite DRB1 01 bis DRB1 16 wird als 89 396 berechnet Die bei der Studie erzielte Aufl sung betrug bei der Gesamt Allelgr
87. ette 10 ul Denaturierungsl sung in die obere Ecke jeder Wanne HINWEIS Schlie en Sie das Fl schchen unmittelbar nach Gebrauch 5 10 pl Probe hinzuf gen siehe Anleitung f r die Verwendung des INNO LiPA HLA DRB1 Amp Plus und vorsichtig durch Auf und Abpipettieren mischen Immer sterile Pipettenspitzen verwenden Denaturieren Sie die DNA f r 5 Minuten bei 20 25 C 6 Sch tteln Sie die vorgew rmte Hybridisierungsl sung und geben Sie vorsichtig 2 ml hiervon zu dem denaturierten Amplifikationsprodukt in jede Wanne Durch sanftes Sch tteln mischen Achten Sie darauf w hrend des Pipettierens keine benachbarten Wannen zu kontaminieren 7 Legen Sie den Teststreifen umgehend mit der markierten Seite nach oben in die Wanne Die Teststreifen m ssen vollst ndig in die L sung eingetaucht sein HINWEIS Einweghandschuhe tragen und Pinzette verwenden 8 Wannen in Sch ttelwasserbad mit einer Temperatur von 56 C 0 5 C 80 U min siehe Anleitung f r die manuelle Inkubation schlie en Sie den Deckel und inkubieren Sie f r 30 Minuten HINWEIS Achten Sie darauf dass kein Wasser vom Wasserbad in die Wanne spritzt Den Wasserstand auf 1 3 bis 1 2 der H he der Wanne einstellen Um ein Verrutschen der Wannen zu vermeiden den Wannenbeh lter zwischen zwei schweren Gewichten fixieren Stringent Waschl sung Schritt 1 Nach der Hybridisierung die Wannen aus dem Wasserbad nehmen 2 Die Wanne leicht geneigt halten und die F
88. fier la temp rature l aide d un thermom tre calibr et ajuster si n cessaire Ne pas d passer les temp ratures indiqu es Pr chauffer les Solutions d Hybridation et de Lavage Stringent dans un bain marie une temp rature de 37 C minimum ne pas d passer 56 C M langer avant utilisation Tous les cristaux doivent tre dissous 2 Alaide de pinces en plastique retirer le nombre requis de bandelettes INNO LiPA HLA DRB1 Plus du tube une bandelette par chantillon Inclure une bandelette pour le contr le LiPA pour INNO LiPA HLA DRB1 Plus et pour le contr le blanc amplifi A l aide d un crayon inscrire un num ro d identification au dessus de la ligne rep re noire de la bandelette 3 Placer le nombre requis de compartiments un par chantillon dans le support 4 Al aide d une pipette d poser 10 ul de Solution de D naturation dans le coin sup rieur de chaque compartiment NOTE Refermer le flacon imm diatement apr s usage 5 Ajouter 10 pl d chantillon voir le mode d emploi du test INNO LiPA HLA DRB1 Amp Plus et homog n iser soigneusement par flux et reflux Toujours utiliser des embouts de pipette st riles Laisser d naturer pendant 5 minutes 20 25 C 6 Agiter la Solution d Hybridation pr chauff e et en ajouter d licatement 2 ml au produit amplifi d natur dans chaque compartiment Homog n iser en agitant doucement Attention ne pas contaminer les compartiments voisins pendant le pipeta
89. ge 7 Placer imm diatement la bandelette dans le compartiment le c t marqu de la membrane vers le haut Les bandelettes doivent tre compl tement immerg es dans la solution NOTE Porter des gants jetables et utiliser des pinces en plastique 8 Placer le support dans le bain marie agitant 56 C 0 5 C 80 tr min voir Directives pour incubation manuelle fermer le couvercle et incuber 30 minutes NOTE Eviter de projeter de l eau du bain marie dans les compartiments R gler le niveau d eau entre le tiers et la moiti de la hauteur du compartiment Pour emp cher le support de glisser l immobiliser entre deux poids Lavage stringent 1 Apr s l tape d hybridation retirer le support du bain marie 2 Incliner l g rement le support et aspirer le liquide de chaque compartiment l aide d une pipette de pr f rence branch e sur une pompe vide Ajouter 2 ml de Solution de Lavage Stringent pr chauff e dans chaque compartiment et INNOGENETICS9 26 rincer en agitant le support pendant 10 20 secondes 20 25 C Aspirer la solution de chaque compartiment R p ter une fois cette br ve tape de lavage 3 Pour terminer aspirer la solution et incuber chaque bandelette dans 2 ml de solution de Lavage Stringent pr chauff e dans le bain marie agitateur 56 C 0 5 C pendant 10 minutes Fermer le couvercle du bain marie Avant l incubation v rifier la temp rature du bain marie l aide d un
90. gt Tests Contenuto sufficiente per lt X gt test Contenido suficiente para lt X gt ensayos Cont m material suficiente para lt X gt testes ET Strips Bandelettes Teststreifen Strisce Tiras 7 INNO LiPA HLA DRB1 Plus CONTROL LiPA DENAT SOLN HYBRIDIZ SOLN STRIN WASH SOLN CONJ 100x CON DIL SUBS BCIP NBT 100x SUBS BUF RINSE SOLN 5x LiPA Control Contr le LiPA LiPA Kontrolle Controllo LiPA Control LiPA Controlo LiPA Denaturation Solution Solution de D naturation Denaturierungsl sung Soluzione di Denaturazione Soluci n de desnaturalizaci n Soluc o de desnaturac o Hybridization Solution Solution d Hybridation Hybridisierungsl sung Soluzione di Ibridazione Soluci n de hibridaci n Solu o de hibridiza o Stringent Wash Solution Solution de Lavage Stringent Stringent Waschl sung Soluzione di Lavaggio Stringente Soluci n de lavado astringente Solu o para lavagem rigorosa Conjugate 100x Conjugu 100x 100x konzentriertes Konjugat Coniugato 100x Conjugado 100x Conjugate Diluent Diluant Conjugu Konjugatverd nner Diluente del Coniugato Diluyente de conjugado Diluente de conjugado Substrate BCIP NBT 100x Substrat BCIP NBT 100x 100x konzentriertes BCIP NBT Substrat Substrato BCIP NBT 100x Substrate Buffer Tampon Substrat Substratpuffer Tampon
91. i devono per essere considerate come un extra e non decisive Reagenti Descrizione preparazione per l uso e condizioni di conservazione raccomandate Chiusi e conservati a 2 8 C tutti i reagenti del test incluse le strisce sono stabili fino alla data di scadenza del kit Non congelare i reagenti Non usare i reagenti oltre la data di scadenza Il kit deve essere conservato isolato da qualsiasi sorgente di DNA contaminante specialmente dai prodotti di DNA amplificati Tutti i reagenti devono essere portati a temperatura ambiente 20 25 C approssimativamente 60 minuti prima dell uso e devono essere riposti in frigorifero immediatamente dopo l uso Alterazioni nell aspetto fisico dei componenti del kit possono indicare instabilit o deterioramento Alfine di minimizzare la possibilit che le strisce si pieghino prima dell uso si raccomanda di conservare il tubo in senso orizzontale Reagenti in dotazione Componente Quantit Rif Descrizione Strisce 1x20 58191 Tubo di plastica contenente 20 strisce per INNO LiPA HLA DRB1 Plus identificate con una linea di colore nero Controllo LiPA 1 x 0 05 ml 58192 Contenente acido etilendiamminotetracetico EDTA e 0 01 di metilisotiazolone MIT 0 196 cloroacetammide CAA come conservante 45 INNO LiPA HLA DRB1 Plus Soluzione di 1x1ml denaturazione Soluzione di ibridazione 1x 80 ml Soluzione di Lavaggio 1x 200 ml Stringente Diluente del Coniugato
92. ication number above the black marker line on the strip 3 Take the required number of test troughs one trough per test sample and place them into the tray 4 Pipette 10 pl Denaturation Solution into the upper corner of each trough NOTE Close the vial immediately after use 5 Add 10 pl sample see Instructions for use of INNO LiPA HLA DRB1 Amp Plus and carefully mix by pipetting up and down Always use sterile pipette tips Allow denaturation to proceed for 5 minutes at 20 25 C 6 Shake the prewarmed Hybridization Solution and gently add 2 ml to the denatured amplified product into each trough Mix by gentle shaking Take care not to contaminate neighbouring troughs during pipetting 7 Immediately place the strip with the marked side of the membrane up into the trough The strips should be completely submerged in the solution NOTE Wear disposable gloves and use forceps 8 Place the tray into the 56 C 0 5 C shaking water bath 80 rpm see Directions for manual incubation close the lid and incubate for 30 minutes NOTE Avoid splashing water from the water bath into the trough Adjust the water level between 1 3 and 1 2 of the height of the trough To prevent the tray from sliding immobilize the tray between two heavy weights INNOGENETICS9 14 Stringent wash 1 After hybridization remove the tray from the water bath 2 Hold the tray at a low angle and aspirate the liquid from the trough with a pipette
93. icrobiana de los reactivos Procedimiento de ensayo manual NOTA En los distintos pasos de incubaci n las tiras de ensayo deben permanecer siempre en la misma cubeta 61 INNO LiPA HLA DRB1 Plus Antes de la incubaci n mida la temperatura del ba o de agua con un term metro calibrado y aj stela si es necesario antes de colocar la bandeja Cierre siempre la cubierta En cada ensayo debe incluirse el control LiPA Muestras 1 Producto DRB1 amplificado use 10 pl Para la preparaci n de la muestra consulte las instrucciones de uso de INNO LiPA HLA DRB1 Amp Plus 2 Muestra de control LIPA para INNO LiPA HLA DRB1 Plus use 10 pl la amplificaci n no es necesaria 3 Muestra de control blanco amplificada control negativo use 10 pl Desnaturalizaci n e hibridaci n 1 Caliente un bafio de agua de agitaci n a 56 C 0 5 C Mida la temperatura con un term metro calibrado y aj stela si es necesario No se deben superar las temperaturas indicadas Precaliente la soluci n de hibridaci n y la soluci n de lavado astringente en un bafio de agua a una temperatura de al menos 37 C y que no supere los 56 C M zclelas antes de usarlas Todos los cristales deben disolverse 2 Utilice las pinzas para retirar el n mero requerido de tiras de INNO LiPA HLA DRB1 Plus del tubo una tira por cada muestra de ensayo Incluya una tira para la muestra de control LiPA de INNO LiPA HLA DRB1 Plus y para la muestra de control blanco ampl
94. idizac o e a Soluc o de lavagem rigorosa no banho de gua at atingir uma temperatura m nima de 37 C e n o superior aos 56 C Agite as antes de usar Todos os cristais devem estar dissolvidos 2 Utilize uma pinga para retirar do tubo o n mero de tiras INNO LiPA HLA DRB1 Plus necess rio uma tira por cada teste de amostra Inclua a tira para a amostra de controlo LiPA do INNO LiPA HLA DRB1 Plus e para a amostra amplificada de controlo em branco Com um l pis escreva um n mero de identifica o acima da linha preta de marca o da tira 3 Coloque num suporte o n mero de cavidades de teste requerido uma cavidade por cada teste de amostra 4 Com uma pipeta adicione 10 ul de Solu o de desnatura o nos cantos superiores das cavidades Nora Feche o frasco imediatamente depois de uso 5 Adicione 10 ul de cada amostra veja as instru es de utiliza o de INNO LiPA HLA DRB1 Amp Plus e misture cuidadosamente pipetando para cima e para baixo Utilize sempre pontas de pipetas est reis Permita a desnatura o durante 5 minutos a uma temperatura de 20 25 C INNOGENETICS9 74 6 Agite a soluc o de hibridizac o pr aquecida e adicione cuidadosamente 2 ml ao produto amplificado desnaturado em cada cavidade Misture agitando suavemente Ao pipetar tenha cuidado em nao contaminar as cavidades vizinhas 7 Coloque a tira de teste com o lado assinalado da membrana virado para cima na cavidade As tiras devem estar tot
95. ificada Escriba con l piz un n mero de identificaci n por encima de la banda de marca negra de la tira 3 Coloque en la bandeja el n mero requerido de cubetas de ensayo una cubeta por cada muestra de ensayo 4 Pipetee 10 pl de soluci n de desnaturalizaci n en la esquina superior de cada cubeta NOTA Cierre el vial inmediatamente despu s de usarlo 5 A ada una muestra de 10 ul consulte las instrucciones de uso de INNO LiPA HLA DRB1 Amp Plus y m zclela cuidadosamente pipeteando arriba y abajo Utilice siempre puntas de pipeta esterilizadas Permita que contin e la desnaturalizaci n durante 5 minutos a una temperatura de 20 25 C 6 Agite la soluci n de hibridaci n precalentada y afiada cuidadosamente 2 ml al producto amplificado desnaturalizado en cada cubeta M zclelos agitando suavemente Evite contaminar las cubetas vecinas al pipetear 7 Coloque inmediatamente la tira en la cubeta con el lado marcado de la membrana hacia arriba Las tiras deben quedar completamente sumergidas en la soluci n NOTA Use guantes desechables y pinzas 8 Coloque la bandeja en el ba o de agua de agitaci n a una temperatura de 56 C x 0 5 C 80 rpm consulte las Instrucciones para la incubaci n manual cierre la cubierta e incube durante 30 minutos NOTA Evite salpicar la cubeta con agua del bafio de agitaci n Ajuste el nivel de agua entre 1 3 y 1 2 de la altura de la cubeta Para evitar que la bandeja se deslice inmovi
96. ince pour la manipulation des bandelettes Pipettes ajustables 1 20 ul 20 200 ul et 200 1000 ul Multipipette type Eppendorf en option Minuteur 2 heures 1 minute Consignes de s curit Ser f rer la fiche s curit du fabricant et l tiquetage pour toute information sur les produits potentiellement dangereux E R20 21 R36 R45 R61 836 37 845 53 Toxique T Nocif par inhalation et contact avec la peau Irritant pour les yeux Canc rig ne T ratog ne Porter des gants et des v tements de protection En cas d accident et de malaise consulter imm diatement un m decin montrer l tiquette si possible Eviter toute exposition Se procurer les instructions sp ciales d utilisation Limit un usage par des professionnels Contient du dim thylformamide 5 bromo 4 chloro 3 indolylphosphate sel de p toluidine Substrat BCIP NBT 100x R43 S24 37 Irritant Xi Eviter le contact avec la peau Peut causer des irritations par contact avec la peau Porter des gants de protection Contient 2 chloroac tamide Solution de Ringage Tampon Substrat Diluant Conjugu et Contr le LiPA x R36 38 S23 24 26 Irritant Xi Irritant pour les yeux et la peau Ne pas inhaler Eviter tout contact avec la peau En cas de contact avec les yeux rincer imm diatement grande eau et consulter de suite un m decin Contient de l hydroxyde de sodium Solution de D naturation 23 INNO LiPA HLA DRB1 Plus
97. ingent les compartiments doivent tre plac s sur la plate forme agitante du bain marie R gler le niveau d eau entre le tiers et la moiti de la hauteur du compartiment Veiller ce que les compartiments ne flottent pas sur l eau L eau doit tre en contact direct avec les compartiments INNOGENETICS9 24 Les tapes d incubation pour la r v lation doivent se r aliser entre 20 25 C Si la temp rature est inf rieure 20 C les r sultats obtenus peuvent tre plus faibles Une temp rature sup rieure 25 C risque de provoquer une coloration de fond trop importante et ou des signaux faussement positifs Respecter exactement les dur es d incubation indiqu es dans le protocole L amplitude du mouvement g n r soit par le bain marie agitant proc dure d hybridation soit par l agitateur proc dure de r v lation est un param tre critique pour optimiser la sensibilit et homog n iser la coloration Les bandelettes doivent tre compl tement immerg es L amplitude doit tre aussi grande que possible tout en vitant tout d bordement Un d bordement du liquide peut tre cause de contamination crois e et de r sultats non valides Pendant l incubation des bandelettes l agitation doit s effectuer de mani re que le liquide et les bandelettes effectuent un va et vient dans le compartiment sans d bordement du liquide Ne pas couvrir le support Pendant les incubations en phase d hybridation et de lavage stringe
98. inutes while agitating the tray on the shaker CAUTION Wear gloves and protective goggles 5 Stop the color development by washing the strips twice in 2 ml distilled water while agitating the tray on the shaker for at least 3 minutes 6 Using forceps remove the strips from the troughs and place them on absorbent paper Let the strips dry completely before reading the results Store the developed and dried strips in the dark Automated test procedure Auto LiPA The LiPA test procedure is extremely well suited for automation Therefore the Auto LiPA was designed to fully handle hybridization stringent wash and color development steps The Auto LiPA is featured as a walk away system with automated heating and cooling and with automated aspiration and pipetting For more information and specific protocols on the Auto LiPA please contact your local distributor Results Reading A line is considered positive when a clear purple brown band appears at the end of the test procedure INNO LiPA HLA DRB1 Plus Marker line Conj control HLA DRB control cam rametnonoortrreceeee ANNAN OO Figure 1 Location of the marker line black the conjugate control line conj control the HLA DRB1 Plus control line HLA DRB Control and the 37 sequence specific DNA probes on the INNO LiPA HLA DRB1 Plus strip Validation Include one negative control and the LiPA Control for INNO LiPA HLA DRB1 Plus each time a test is performed As with an
99. it Eine Liste der Sondenspezifikationen ist erh ltlich Alle Sondennummern identifizieren die auf den INNO LiPA HLA DRB1 Plus Teststreifen positiv sind und den DRB1 Typ mittels der INNO LiPA HLA DRB1 Plus Typisierungstabelle oder einer Version der LiPA Interpretation Software ermitteln LIRAS Die Software liefert h ufig mehr Ergebnisse als die beabsichtigte Verwendung vermuten l sst es wird sowohl eine Auswertung der Allelgruppe als auch aller m glichen Allelkombinationen gegeben Diese Informationen sollten jedoch als Zusatzinformation und nicht als ausschlaggebend ber cksichtigt werden Interpretationssoftware LiRAS Die LIRAS Software hilft bei der Auswertung der LiPA Ergebnisse Bitte kontaktieren Sie Ihren lokalen Vertreter f r die aktuellste Version Grenzen der Methode Der Einsatz dieses Produktes sollte nur von Personal durchgef hrt werden das mit den Techniken der Hybridisierung vertraut ist Nur gute Laborpraxis und eine vorsichtige Durchf hrung der beschriebenen Verfahren gestattet eine spezifische Hybridisierung und eine korrekte Typisierung der Ziel DNA Der INNO LiPA HLA DRB1 Plus wurde f r eine bestm gliche Aufl sung auf Allelgruppen Niveau f r HLA DRB1 entworfen d h gem Standard HLA Nomenklatur die ersten zwei Stellen nach dem Stern einer Allelbezeichnung z B HLA DRB1 01 Eine Kombination bestimmter Allele k nnte jedoch zu einer nicht einzigartigen Sondenkombination und damit zu ei
100. l cela entre dos pesas pesadas Lavado astringente 1 Tras la hibridaci n retire la bandeja del ba o de agua 2 Sostenga la bandeja formando un ngulo pequefio y aspire el liquido de la cubeta con una pipeta preferiblemente conectada a un aspirador de vac o Afiada 2 ml de soluci n de lavado precalentada a cada cubeta y lave la bandeja balance ndola durante 10 a 20 segundos a una temperatura de 20 25 C Aspire la soluci n de cada cubeta Repita una vez este breve paso de lavado 3 Por ltimo aspire la soluci n e incube cada tira en 2 ml de soluci n de lavado astringente precalentada en el bafio de agua de agitaci n a 56 C 0 5 C durante 10 minutos Cierre la cubierta del bafio de agua INNOGENETICS9 62 Antes de la incubaci n mida la temperatura del ba o de agua con un term metro calibrado y aj stela si es necesario Cierre siempre la cubierta NOTA Diluya la soluci n de Lavado concentrada 5x y Conjugado 100x al realizar el lavado astringente Vea Reactivos Revelado de color Todas las incubaciones sucesivas deben realizarse a 20 25 C en un agitador Durante las incubaciones el l quido y las tiras de ensayo deben moverse de ac para all en la cubeta para obtener una coloraci n uniforme 1 Lave dos veces cada tira durante 1 minuto con 2 ml de la soluci n de lavado de trabajo 2 A ada 2 ml de la soluci n de Conjugado de trabajo a cada cubeta e incube durante 30 minutos a la vez que agi
101. l nivel de grupo de alelos La soluci n de cebador DRB1 03 11 13 14 utilizada en combinaci n con la tira de INNO LiPA HLA DRB1 se ha disefiado para resolver las ambig edades m s frecuentes las referentes a los alelos DRB1 03 11 13 y o 14 Todas las ambig edades observadas en el nivel de grupo de alelos tras realizar pruebas con la soluci n de cebador DRB1 se redujeron a un resultado no ambiguo de identificaci n del tipo con la soluci n de cebador DRB1 03 11 13 14 DRB1 01 DRB1 13 o DRB1 01 DRB1 14 3 casos DRB1 04 DRB1 13 o DRB1 04 DRB1 14 6 casos DRB1 08 DRB1 11 o DRB1 11 DRB1 13 1 caso DRB1 11 DRB1 12 o DRB1 12 DRB1 13 2 casos Para resolver todos los resultados ambiguos el software de interpretaci n LIRAS sugiri utilizar la amplificaci n DRB1 03 11 13 14 seguida de una hibridaci n con la tira de INNO LiPA HLA DRB1 Precisi n Se evalu internamente la variaci n tras comparar un mismo ensayo repetitividad varios ensayos y ensayos realizados por varias personas Una de las muestras que se hab a amplificado por duplicado se prob con el instrumento Auto LiPA utilizando tres termocicladores distintos y procesando dos pruebas en cada termociclador Dos personas distintas realizaron este mismo protocolo por duplicado No se observ ninguna variaci n significativa y se obtuvo en todos los casos un resultado de identificaci n del tipo id ntico sin necesidad de edici n Portugu s Utilizagao
102. l ssigkeit mittels einer Pipette vorzugsweise an eine Vakuumpumpe angeschlossen aus den Wannen absaugen 2 ml vorgew rmte Waschl sung in jede Wanne geben und durch kurzes Sch tteln der Schale bei 20 25 C aussp len 10 20 Sekunden L sung aus jeder Wanne absaugen Diesen kurzen Waschvorgang einmal wiederholen 3 Abschlie end die L sung absaugen und jeden Teststreifen in 2 ml vorgew rmter Stringent Waschl sung im Sch ttelwasserbad bei 56 C 0 5 C f r 10 Minuten inkubieren Die Klappe des Wasserbads schlieBen INNOGENETICS9 38 Vor der Inkubation die Temperatur des Wasserbads mit einem kalibriertem Thermometer berpr fen und die Temperatur anpassen wenn erforderlich Deckel des Wasserbads immer schlie en HINWEIS W hrend des Waschvorgangs mit Stringent Waschl sung die konzentrierte Sp ll sung 1 5 und das Konjugat 1 100 verd nnen Siehe Reagenzien Farbentwicklung Alle nachfolgenden Inkubationen werden bei 20 25 C auf einem Sch ttler durchgef hrt W hrend der Inkubationen sollten die Fl ssigkeit und die Teststreifen in der Wanne hin und her bewegt werden um eine homogene F rbung zu erzielen 1 Jeden Teststreifen zweimal f r 1 Minute mit 2 ml Sp larbeitsl sung waschen 2 2ml der Konjugatsarbeitsl sung in jede Wanne geben und f r 30 Minuten inkubieren wobei die Schale auf dem Sch ttler bewegt wird HINWEIS Die Substrat BCIP NBT 100x L sung ca 10 Minuten vor dem Ende der Konjugatink
103. l st haben 33 INNO LiPA HLA DRB1 Plus Konjugatverd nner 1x80 ml 100x konzentriertes 1x0 8 ml Konjugat Substratpuffer 1x 180 ml 100x konzentriertes 1x0 8 ml BCIP NBT Substrat 5x konzentrierte Sp ll sung 1 x 80 ml Halter f r Inkubations 3 wannen Ableseschablone 1 Datenblatt 2 56951 56952 56953 56954 56721 Phosphatpuffer mit NaCl Triton Proteinstabilisatoren und 0 0196 MIT 0 1 CAA als Konservierungsmittel Mit alkalischer Phosphatase markiertes Streptavidin in Tris Puffer mit Proteinstabilisatoren und 0 01 MIT 0 098 CAA als Konservierungsmittel muss vor dem Gebrauch im Verh ltnis 1 100 mit Konjugatverd nner verd nnt werden Bereiten Sie 2 ml Konjugatarbeitsl sung f r jede Testwanne vor 2 ml berschuss Konjugatarbeitsl sung kann w hrend des Waschvorgangs mit Stringent Waschl sung vorbereitet werden f r das manuelle Testen F r den Auto LiPA stellen Sie bitte 10 ml berschuss her Die Konjugatsarbeitsl sung bleibt bei Raumtemperatur 20 25 C f r 24 Stunden stabil wenn sie im Dunkeln gelagert wird Tris Puffer mit NaCl MgCl und 0 01 MIT 0 196 CAA als Konservierungsmittel 5 Bromo 4 Chloro 3 Indolylphosphat p Toluidinsalz BCIP und 4 Nitroblau Tetrazolium NBT in Dimethylformamid DMF Vor Gebrauch 1 100 mit Substratpuffer verd nnen Bereiten Sie 2 ml Substratgebrauchsl sung f r jede Testwanne vor 2 ml berschuss Substratgebrauchsl sung kan
104. l incubazione verificare la temperatura del bagnomaria usando un termometro tarato e regolare la temperatura se necessario prima di posizionare il portavaschetta nel bagnomaria Chiudere sempre il coperchio Il Controllo LiPA dovrebbe essere sempre incluso in ciascuna seduta Campioni 1 Prodotti amplificati DRB1 usare 10 pl Per la preparazione del campione vedi le istruzioni per l uso INNO LiPA HLA DRB1 Amp Plus 2 Controllo LiPA per INNO LiPA HLA DRB1 Plus usare 10 ul l amplificazione non richiesta 3 Controllo bianco amplificato controllo negativo usare 10 ul Denaturazione e ibridazione 1 Riscaldare un bagnomaria con agitazione a 56 C 0 5 C Controllare la temperatura usando un termometro tarato e regolare la temperatura se necessario Non superare le temperature indicate Preriscaldare la Soluzione d Ibridazione e la Soluzione di Lavaggio Stringente in un bagnomaria ad almeno 37 C e non superare i 56 C Miscelare prima dell uso Tutti i cristalli devono essere sciolti 2 Usando un paio di pinzette rimuovere il numero richiesto di strisce INNO LiPA HLA DRB1 Plus dal tubo una striscia per campione di test Includere una striscia per il Controllo LiPA di INNO LiPA HLA DRB1 Plus e una striscia per il controllo bianco Apporre a matita un numero identificativo sopra la linea di identificazione della striscia 3 Prelevare il numero richiesto di vaschette una per ciascuna striscia e alloggiarle nel vassoio port
105. l liquido di scarto con ipoclorito di sodio in modo che la concentrazione finale sia 1 di ipoclorito di sodio Lasciare riposare tutta la notte prima di smaltirlo ATTENZIONe Neutralizzare il liquido di scarto che contiene acido prima di aggiungere ipoclorito di sodio necessario l uso di equipaggiamento di protezione indossare guanti e occhiali di sicurezza quando si manipolano agenti pericolosi o infettivi Gli scarti devono essere trattati secondo le linee guida delle istituzioni in materia Rispettare inoltre i regolamenti sull ambiente statali e locali Campioni Poich il test LiPA utilizza come campione DNA biotinilato e amplificato disponibile un kit di amplificazione INNO LiPA DRB1 Amp Plus come strumento di accompagnamento Procedure di manipolazione Trattamento delle strisce Le strisce possono essere utilizzate solo una volta Non toccare le strisce a mani nude usare pinzette pulite Usare una matita per l identificazione delle strisce del test Non usare penne a sfera ecc Scrivere il numero identificativo sopra la linea nera di identificazione della striscia Durante i vari passaggi d incubazione le strisce devono rimanere sempre nella stessa vaschetta Le strisce non usate e quelle gi sviluppate devono essere mantenute lontano da fonti di luce intensa e di calore Lasciare asciugare completamente le strisce prima dell interpretazione copertura e conservazione Le strisce sviluppate e as
106. la tarjeta de lectura de pl stico Compruebe si las dos primeras bandas de control son positivas para poder validar cada tira individual consulte el apartado Validaci n Los resultados de determinaci n de tipo se basan en la reactividad de las sondas del kit Hay una lista de especificidades de las sondas disponible bajo petici n Identifique todos los n meros de sonda positivos en la tira de INNO LiPA HLA DRB1 Plus y utilice la tabla de tipos de INNO LiPA HLA DRB1 Plus o una versi n del software de interpretaci n de LiPA LIRAS para deducir el tipo de DRB1 El software suele proporcionar m s resultados de los que sugiere el uso al que est destinado el ensayo interpretaci n del grupo de alelos adem s de todas las combinaciones posibles de alelos No obstante no debe considerarse esta informaci n como decisiva sino como datos adicionales Software de interpretaci n LiRAS El software LIRAS se ha dise ado como ayuda para la interpretaci n de los resultados de LiPA P ngase en contacto con el distribuidor local para obtener la versi n actualizada m s reciente Limitaciones del procedimiento Este producto s lo debe ser utilizado por personal que haya recibido formaci n en las t cnicas de hibridaci n S lo una buena pr ctica de laboratorio y la realizaci n meticulosa de los procedimientos especificados permitir n una hibridaci n espec fica y el tipaje correcto de la muestra que se est analizando I
107. laboratories A total of 89 anonymous samples was analyzed 50 samples externally 39 in house All samples had previously been typed with INNO LiPA HLA DRB1 The samples included 14 ambiguous six different ambiguities and 75 unambiguous samples All ambiguous samples were further typed to a unique result with one or more alternative DNA based typing assays All hybridizations were performed using the Auto LiPA instrument using program HLA56v3 and the interpretation was done with a clinical trial version of the LIRAS for LiPA HLA v3 00 interpretation software Test sensitivity Test sensitivity of the assay at allele group level was calculated as the number of successful typing results over the total number of samples tested Test sensitivity in this evaluation was 100 89 89 95 CI 95 9 100 Probe reactivity On one or more occasions during this study some probes gave weak reactions Concordant typing at allele group level was achieved when the LiRAS interpretation software was used Resolution typing table v5 8 021112 The DRB1 Primer Solution used in combination with the INNO LiPA HLA DRB1 strip is designed for typing HLA DRB1 alleles at allele group level The DRB1 03 11 13 14 Primer Solution used in combination with the INNO LiPA HLA DRB1 strip is designed to resolve the most frequent ambiguities i e ambiguities involving DRB1 03 11 13 and or 14 alleles All ambiguities at allele group level obser
108. lelo DRB1 03011 excepto no c d o 58 onde a sequ ncia semelhante dos alelos do grupo DRB1 11 Al m disso tanto o alelo DRB1 0308 como os alelos espec ficos DRB1 13 DRB1 1305 1307 1311 1314 e 1324 com os quais foi ambiguamente relacionado tamb m t m uma frequ ncia esperada baixa Em presenga do alelo DRB1 04 qualquer dos dois alelos raros DRB1 13 1322 1323 dado como alternativa ao grupo de alelos DRB1 11 e o nico alelo DRB1 04 com que foram relacionados foi DRB1 0415 H sequ ncias documentadas da semelhanga entre os alelos espec ficos DRB1 13 envolvidos e o grupo de alelos DRB1 11 A frequ ncia dos alelos DRB1 13 causadores de ambiguidades e a frequ ncia do alelo DRB1 0415 tamb m se espera que sejam baixas Um antig nio foi amb guo para DRB1 13 14 em 9 66 13 696 das amostras onde estavam presentes quer o alelo DRB1 13 como o DRB1 14 Esta ambiguidade foi identificada pelo software LiPA Expert como DRB1 0103 x 1417 1430 tr s amostras DRB1 0402 0414c13H x 1421 cinco amostras e DRB1 0402 0414 x 1417 1430 uma amostra Em presenga do alelo DRB1 04 Os alelos DRB1 14 1417 1421 e 1430 raros e recentemente descritos s o dados como alternativa tipagem do grupo de alelos DRB1 13 As alternativas espec ficas do alelo DRB1 14 1417 e 1430 ver a seguir ao grupo de alelos DRB1 13 em presenga do alelo DRB1 01 tamb m se espera que acontecam raramente INNOGENETICS9 78 Um a
109. leotides complementary to the mentioned hybridization probes Positive hybridization on these probes thus demonstrates satisfactory performance of the assay including hybridization stringent washing color development and detection A different pattern may indicate assay performance problems such as incorrect temperature during hybridization or deviations from the prescribed incubation times or temperatures Color intensities of probes on a strip may differ from one line to the other Interpretation of results Check for the correct reactivity pattern of the LiPA Control sample The conjugate control line on the strip should be lined up with the conjugate control line on the plastic reading card Check the positivity of the control lines first two lines in order to validate each individual strip see Validation Typing results are based on the reactivity of the probes in the kit A list of probe specificities is available on request Identify all probe numbers that are positive on the INNO LiPA HLA DRB1 Plus strip and deduce the DRB1 type by using the INNO LiPA HLA DRB1 Plus typing table or a version of the LiPA interpretation software LIRAS The software often gives more results than the intended use suggests interpretation at allele INNOGENETICS9 16 group is given as well as all possible allele combinations This information however should be considered as extra not as decisive Interpretation software LiRAS The
110. ler die Neigungswinkel darf 13 nicht berschreiten um ein berlaufen der Fl ssigkeit zu vermeiden empfohlene Sch ttelgeschwindigkeit 50 U min Vortex Mixer oder gleichwertiges Instrument Messzylinder 10 25 50 und 100 ml Destilliertes oder deionisiertes Wasser Einweghandschuhe Sterile Einwegpipettenspitzen vorzugsweise mit Wattestopfen Pinzette zum Entnehmen der Streifen Einstellbare Pipetten f r die Volumina 1 20 ul 20 200 ul und 200 1000 ul Dispensier Multipipette Eppendorf optional Laborwecker 2 Stunden 1 Minute Sicherheits und Umwelthinweise Bitte beachten Sie die Sicherheitsdatenbl tter des Herstellers und die Produktkennzeichnung bez glich potenziell gef hrlicher Substanzen amp R20 21 R36 R45 R61 S36 37 S45 53 Giftig T Gesundheitssch dlich beim Einatmen und bei der Ber hrung mit der Haut Reizt die Augen Kann Krebs erzeugen Kann das Kind im Mutterleib sch digen Bei der Arbeit geeignete Schutzhandschuhe und Schutzkleidung tragen Bei Unfall oder Unwohlsein sofort Arzt hinzuziehen wenn m glich dieses Etikett vorzeigen Exposition vermeiden vor Gebrauch besondere Anweisungen einholen Verwendung nur durch ausgebildetes Personal Enth lt Dimethylformamid 5 Bromo 4 Chloro 3 Indolylphosphat p Toluidinsalz 100x konzentriertes BCIP NBT Substrat R43 S24 37 Reizend Xi Hautkontakt vermeiden Kann bei Hautkontakt Sensibilisierung verursachen Geeignete
111. lle specificit delle sonde e disponibile su richiesta Identificare i numeri di tutte le sonde che sono positive sulle strisce INNO LiPA HLA DRB1 Plus e risalire al tipo di DRB1 usando la tabella di tipizzazione INNO LIPA HLA DRB1 Plus o una versione del software d interpretazione LIPA LIRAS Il software spesso fornisce pi risultati rispetto all uso previsto del prodotto viene fornita l interpretazione a livello di gruppo allelico come pure tutte le possibili combinazioni alleliche Poich il kit non stato progettato per tipizzare in maniera specifica questi alleli a livello allelico queste informazioni devono essere considerate come aggiuntive e non come decisive Software d interpretazione LiRAS Il software LIRAS stato progettato per assistere nell interpretazione dei risultati LiPA Si prega di contattare il proprio fornitore locale per avere l ultima versione aggiornata Limiti della procedura L utilizzo di questo prodotto deve limitarsi al personale esperto nelle tecniche di ibridazione Solo le buone pratiche di laboratorio e l attenta esecuzione delle procedure specificate permetteranno una ibridazione specifica e un corretta tipizzazione del DNA target L INNO LiPA HLA DRB1 Plus stato progettato per permettere una risoluzione a livello di gruppo allelico con questo si intendono nella nomenclatura HLA standard le prime due cifre dopo l asterisco nel nome dell allele ad es HLA DRB1 01 Comunque combina
112. lle staatlichen und rtlichen Umweltbestimmungen eingehalten werden Herstellung der Proben Da der LiPA Test biotinyliertes amplifiziertes DNA Material als Probe verwendet steht erg nzend ein Amplifikations Kit zur Verf gung der INNO LiPA DRB1 Amp Plus Handhabung Handhabung der Teststreifen Die Teststreifen k nnen nur einmal verwendet werden Die Teststreifen nicht mit bloBen H nden ber hren immer Pinzetten verwenden Bitte einen Bleistift f r die Identifizierung der Teststreifen verwenden Keine Kugelschreiber etc verwenden Schreiben Sie die ID oberhalb der Markierungslinie auf die Streifen W hrend der verschiedenen Inkubationsschritte m ssen die Teststreifen immer in derselben Wanne verbleiben Unbenutzte und entwickelte Teststreifen d rfen nicht direktem Sonnenlicht oder Hitze ausgesetzt werden Lassen Sie die entwickelten Streifen vor der Auswertung Abdeckung und Lagerung vollst ndig trocknen Entwickelte Teststreifen sollten vorzugsweise im Dunklen bei 20 25 C gelagert werden Wannen nicht mehrmals benutzen Hinweise zur manuellen Inkubation Die Inkubation bei 56 C 0 5 C w hrend der Hybridisierung und des Waschvorgangs mit Stringent Waschl sung stellt den entscheidenden Schritt dar um falsch positive Banden Temperatur zu niedrig oder falsche negative sehr schwache Banden Temperatur zu hoch zu vermeiden Ein Sch ttelwasserbad mit geneigtem Deckel gestattet eine gute Kontr
113. local de pr amplificac o Autilizac o de material de laborat rio autoclavado descart vel recomendada N amp oreutilize material de laborat rio descart vel Utilize uma ponta de pipeta nova por cada amostra aliquotada N o utilize os reagentes para al m da data de validade N o misturar reagentes de kits diferentes a n o ser que os componentes tenham n meros de lote id nticos Evite a contaminac o microbiana dos reagentes Procedimento para teste manual NOTA Durante as diferentes etapas de incuba o as tiras de teste devem permanecer na mesma cavidade Antes da incubac o meca a temperatura do banho de agua com um term metro calibrado e se necess rio ajuste a temperatura antes de colocar o suporte no banho de gua Feche sempre a tampa O controlo LiPA deve ser inclu do em cada s rie de teste Amostras 1 Produto DRB1 amplificado utilize 10 ul Para a preparac o da amostra veja as instru es de utiliza o para INNO LiPA HLA DRB1 Amp Plus 2 Amostra de controlo LiPA para INNO LiPA HLA DRB1 Plus utilize 10 ul n o requer amplificac o 3 Amostra amplificada de controlo em branco controlo negativo utilize 10 pl Desnaturac o e hibridizac o 1 Aque a um banho de agua com agita o aos 56 C 0 5 C Controle a temperatura com um term metro calibrado e se necess rio ajuste a temperatura N o ultrapasse as temperaturas indicadas Pr aqueca a Soluc o de hibr
114. macena en un lugar oscuro Tampon Tris con NaCl MgCl y MIT al 0 01 CAA al 0 196 como conservante Sal p toluidina de 5 bromo 4 cloro 3 indolil fosfato BCIP y 4 nitroazul de tetrazolio NBT en dimetilformamida DMF que debe diluirse en una proporci n 1 100 en tamp n sustrato antes de usarse Prepare 2 ml de soluci n de sustrato de trabajo para cada cubeta de ensayo 2 ml en exceso la soluci n de sustrato de trabajo puede prepararse durante la incubaci n del conjugado para ensayo manual Para Auto LiPA prepare 10 ml en exceso La soluci n de Conjugado de trabajo se mantiene estable durante 24 horas a temperatura ambiente 20 25 C si se almacena en un lugar oscuro Tamp n fosfato con NaCl Triton y MIT al 0 05 CAA al 0 48 como conservante que debe diluirse en una proporci n 1 5 1 parte 4 partes en agua destilada o desionizada antes de usarse Prepare 8 ml de soluci n de lavado de trabajo para cada cubeta de ensayo 10 ml en exceso Para Auto LiPA prepare 10 ml en exceso La soluci n de lavado de trabajo se mantiene estable durante 2 semanas a una temperatura entre 2 8 C Cada una contiene 8 cubetas Para la identificaci n de sondas positivas Para almacenar las tiras reveladas INNOGENETICS9 58 Materiales necesarios pero no suministrados Bafio de agua con plataforma de agitaci n 80 rpm con cubierta inclinada temperatura ajustable a 56 C 0 5 C Aparato de aspira
115. minutos como m nimo a 121 C ncinere el material desechable Mezcle los residuos l quidos con hipoclorito s dico lej a hasta obtener una concentraci n final de un 1 de hipoclorito s dico D jelos reposar durante toda la noche antes de eliminarlos PRECAUCI N neutralice los residuos l quidos que contengan cido antes de a adir el hipoclorito s dico Es imprescindible el uso de equipo protector personal como guantes y gafas de seguridad para manipular agentes peligrosos o infecciosos Deseche los residuos de acuerdo con las normas de gesti n de residuos de su instituci n Asimismo debe cumplir con todas las normas medioambientales nacionales auton micas y locales Muestras Como el ensayo LiPA utiliza como muestra ADN biotinilado amplificado est disponible un kit de amplificaci n INNO LiPA DRB1 Amp Plus como herramienta asociada Procedimientos de manipulaci n Manipulaci n de tiras Las tiras est n dise adas para usarse una sola vez No toque las tiras con las manos desnudas utilice pinzas limpias Utilice un l piz para identificar las tiras de ensayo No utilice un bol grafo u otro utensilio Escriba el identificador por encima de la banda de marcador de las tiras En los distintos pasos de incubaci n las tiras de ensayo deben permanecer siempre en la misma cubeta Mantenga las tiras reveladas y las que no se utilicen alejadas de fuentes de luz y calor intensos Espere a que las tiras revela
116. n en los viales originales a una temperatura entre 2 8 C abiertos o sin abrir se mantendr n estables hasta la fecha de caducidad del kit No los congele No utilice reactivos caducados El kit debe almacenarse aislado de fuentes de ADN contaminante especialmente de productos amplificados Todos los reactivos deben ponerse a temperatura ambiente 20 25 C durante unos 60 minutos antes de usarse y devolverse al refrigerador inmediatamente despu s de su uso Cualquier alteraci n en la apariencia f sica de los componentes del kit puede ser signo de inestabilidad o deterioro Para minimizar la posibilidad de que las tiras se retuerzan antes de usarse es recomendable almacenar el tubo horizontalmente Reactivos suministrados Componente Cantidad Ref Descripci n Tiras 1x20 58191 Contiene 20 tiras para INNO LiPA HLA DRB1 Plus marcadas con una banda de marca de color negro Control LiPA 1x 0 05 ml 58192 Contiene cido etilendiaminotetraac tico EDTA y metilisotiazolona MIT al 0 01 cloracetamida CAA al 0 1 como conservante Soluci n de 1x1ml 56718 Soluci n alcalina con EDTA El vial debe desnaturalizaci n cerrarse inmediatamente despu s de usarse una exposici n prolongada de esta soluci n al aire provocar un r pido deterioro de la intensidad de la desnaturalizaci n Soluci n de hibridaci n 1 x 80 ml 56719 Tamp n EDTA SSPE de fosfato s dico salino con dodecil sulfato s dico SDS al 0
117. n w hrend der Konjugatinkubation vorbereitet werden f r das manuelle Testen F r den Auto LiPA stellen Sie bitte 10 ml berschuss her Die Substratgebrauchsl sung bleibt bei Raumtemperatur 20 25 C f r 24 Stunden stabil wenn sie im Dunkeln gelagert wird Phosphatpuffer mit NaCl Triton und 0 05 MIT 0 48 CAA als Konservierungsmittel vor Gebrauch mit destilliertem oder deionisiertem Wasser 1 5 1 Teil 4 Teile verd nnen 8 ml Sp ll sung f r jede Testwanne vorbereiten 10 ml berschuss F r den Auto LiPA stellen Sie bitte 10 ml berschuss her Die Sp larbeitsl sung bleibt bei einer Temperatur von 2 8 C f r 2 Wochen stabil Enth lt jeweils 8 Wannen F r die Identifizierung positiver Sonden F r die Aufbewahrung entwickelter Teststreifen INNOGENETICS9 34 Zus tzliche ben tigte Materialien die nicht im Lieferumfang enthalten sind Wasserbad mit Sch ttelvorrichtung 80 U min mit geneigtem Deckel Temperatur einstellbar auf 56 C 0 5 C Absaugvorrichtung Kalibriertes Thermometer Orbitalschwenker Horizontal oder Wippsch ttler Empfehlungen F r den Orbitalsch ttler schwingungsdurchmesser mindestens 13 mm oder h her empfohlene Geschwindigkeit 160 U min bei einem Schwingungsdurchmesser von 13 mm Empfehlungen f r einen R ttelsch ttler empfohlene Geschwindigkeit f r die R ttelbewegung ist 80 Bewegungen pro Minute Empfehlungen f r den Horizontalsch tt
118. ner mehrdeutigen Antwort INNOGENETICS9 40 f r zwei oder mehr m gliche Allelkombinationen f hren Kenntnisse der Allelh ufigkeit in der untersuchten Population wird den wahrscheinlichsten DRB1 Typ anzeigen F r den Fall dass eine h here Aufl sungstypisierung erforderlich ist bitte den INNO LiPA HLA DRB Decoder Kit verwenden Neue Allele k nnten Polymorphismen au erhalb der Sondenbereiche haben dies sollte bei der Auswertung der Ergebnisse ber cksichtigt werden Die Sequenz der Primer bindenden Stelle ist nicht f r alle Allele bekannt Das Risiko einer unspezifischen Bindung an der Primerbindungsstelle wird als sehr gering eingesch tzt da ein Versagen der Primer noch nie beobachtet wurde und 80 Allele aller Gruppen getestet wurden Es sollte jedoch die M glichkeit eines Allel Dropouts f r den Fall eines homozygoten Ergebnisses ber cksichtigt werden Leistungsf higkeit des Tests Testleistung unter Verwendung von DNA die mit DRB1 Primer L sung in Kombination mit dem PCR Protokoll Il ausgel st wurde DRB1 DRB1 3 4 5 86G 86V DQB1 INNO LiPA HLA DRB1 wurde in drei Gewebetypisierungslabors in Europa und in zwei Labors in Nordamerika mit Routineproben f r die Typisierung evaluiert Leistungsf higkeit Insgesamt wurden 243 Proben mit INNO LiPA HLA DRB1 untersucht Die Ergebnisse wurden mit klassischen Typisierungstechniken DNATests INNO LiPA DRB key Decoder SSP und oder serologischen Tests verglichen Bei di
119. niveau du groupe d all les a t obtenu lorsque le logiciel d interpr tation LIRAS a t utilis R solution tableau de typage v5 8 021112 La Solution Amorce DRB1 utilis e en combinaison avec les bandelettes INNO LiPA HLA DRB1 est destin e au typage des all les HLA DRB1 au niveau du groupe d all les La Solution Amorce DRB1 03 11 13 14 utilis e en combinaison avec les bandelettes INNO LiPA HLA DRB1 est destin e r soudre les ambiguit s les plus fr quentes c est dire les ambiguit s impliquant les all les DRB1 03 11 13 et ou 14 Toutes les ambiguit s au niveau du groupe d all les observ es apr s le test l aide de la Solution Amorce DRB1 ont t r duites un r sultat de typage non ambigu l aide de la Solution Amorce DRB1 03 11 13 14 DRB1 01 DRB1 13 or DRB1 01 DRB1 14 3 cas DRB1 04 DRB1 13 or DRB1 04 DRB1 14 6 cas DRB1 08 DRB1 11 or DRB1 11 DRB1 13 1 cas DRB1 11 DRB1 12 or DRB1 12 DRB1 13 2 cas Pour tous les r sultats ambigus le logiciel d interpr tation LIRAS a conseill de proc der une amplification DRB1 03 11 13 14 suivie d une hybridation l aide de la bandelette INNO LiPA HLA DRB1 31 INNO LiPA HLA DRB1 Plus Pr cision La r p tabilit intra essai la variation inter essais et inter personnes ont t valu es en interne Un chantillon amplifi en double l aide de trois cycleurs diff rents et en traitant deux s ries par cycleur a t
120. ns minimum prendre dans le cadre d une bonne pratique de laboratoire Eviter tout retour de la pi ce post amplification vers la pi ce pr amplification Il est recommand d utiliser du mat riel de laboratoire jetable autoclav Ne pas r utiliser le mat riel de laboratoire jetable Utiliser un nouveau c ne pour pipette st rile pour chaque aliquote d chantillon Ne pas utiliser les r actifs apr s la date de validit Ne pas m langer les r actifs de kits diff rents moins que les composants ne portent le m me num ro de lot Eviter toute contamination microbienne des r actifs 25 INNO LiPA HLA DRB1 Plus Proc dure manuelle NOTE Les bandelettes doivent rester dans le m me compartiment tout au long des diff rentes tapes d incubation Avant l incubation v rifier la temp rature du bain marie l aide d un thermom tre calibr et si n cessaire ajuster la temp rature avant de placer le support dans le bain marie Toujours fermer le couvercle Le contr le LiPA doit tre inclus dans chaque s rie Echantillons 1 Produit DRB1 amplifi utiliser 10 ul Pour la pr paration des chantillons voir le mode d emploi du test INNO LiPA HLA DRB1 Amp Plus 2 Contr le LiPA pour INNO LiPA HLA DRB1 Plus utiliser 10 ul l amplification n est pas requise 3 Contr le blanc amplifi contr le n gatif utiliser 10 ul D naturation et hybridation 1 Chauffer le bain marie 56 C 0 5 C V ri
121. nt les compartiments peuvent tre laiss s ouverts dans le bain marie Couvrir les compartiments l aide de feuilles adh sives pour microplaques peut tre source de contamination crois e Directives pour changement des solutions Aspirer le liquide de chaque compartiment l aide d une pipette de pr f rence branch e sur une pompe vide Incliner le support de mani re que le liquide s coule vers une extr mit du compartiment Ajouter 2 ml de la solution appropri e dans chaque compartiment et suivre le protocole Une multipipette de type Eppendorf est indiqu e pour cet usage R p ter cette tape le nombre de fois indiqu dans la proc dure de test NOTE Ne pas laisser s cher les bandelettes entre deux tapes Veiller ne pas endommager la surface des bandelettes lors de l aspiration du liquide Aspirer le liquide dans le haut de la bandelette au dessus de la ligne rep re e Veiller aspirer tout le liquide Veiller immerger enti rement les bandelettes dans la solution pour assurer un lavage correct A Adapter la vitesse de l agitateur si n cessaire Remarques et pr cautions A usage professionnel exclusivement Afin d viter toute contamination ADN il est recommand de s parer le plus possible physiquement les tapes de pr et post amplification pi ces s par es pipettes et mat riel de laboratoire diff rents blouses et gants et leurs stocks diff rents sont les pr cautio
122. ntig nio foi ambiguo para DRB1 13 15 em 12 97 12 4 das amostras onde estavam presentes quer o alelo DRB1 13 como o DRB1 15 Esta ambiguidade foi identificada pelo software LiPA Expert como DRB1 0304 x 1309 todas as doze amostras O alelo DRB1 1309 alternativo ao DRB1 15 na presenca do DRB1 03 um alelo raro de origem hisp nica O alelo DRB1 0304 relacionado tamb m raro tendo sido detectado pela primeira vez em tr s caucasianos n o relacionados Este alelo tem semelhangas de sequ ncia com DRB1 0301 o qual foi dado como primeira alternativa Reprodutibilidade Tipagens realizadas usando diferentes lotes de INNO LiPA HLA DRB1 e as mesmas amostras cl nicas de ADN obtidas durante o estudo deram em todos os casos resultados reproduz veis na reactividade das sondas Precis o Durante a avaliac o externa o INNO LiPA HLA DRB1 demonstrou uma completa concord ncia com os m todos de refer ncia Resumo do n mero de amostras 43 N mero total de tentativas de amplificag o nenhuma falha 211 N mero total de resultados n o ambiguos a nivel de grupo de alelos 32 ambiguidades 203 243 N mero total de amostras comparadas com o INNO LiPA DRB key usado para medir a concord ncia 40 243 N mero de amostras testadas por PCR SSP tamb m usadas para medir a concord ncia Desempenho do teste usando ADN obtido com a soluc o de iniciador DRB1 em combinac o com o PCR protocolo A B Bw4 C DRB1 DRB1 03 11 13 14 A fim d
123. o de PCR 66 5 INNO LiPA HLA DRB1 P Portugu s Uliliza o o eher te ELA EIE I Lige elle Ree BEER Reagentes ser HE e Oa BEN GE ew a ae Descri o prepara o para utiliza o e condi es de conserva o facomendadas e init ad Rx aee ped E A RE Material necess rio n o fornecido Seguran a e ambiente lge CECR Procedimentos de manipula o Manipula o das tiras Instru es para a incuba o manual Instru es para mudar manualmente o l quido nas cavidades Observa es e precau es Procedimento para teste manual usc Meet hv DERA EA e a APR RA NEGO Desnatura o e hibridiza o Lavagem Tigorosa u Er naar en tl A Revela o da cofa eiaei ana pai he ceed Procedimento de teste automatizado Auto LiPA Resultados ii ERRO d ET EFI es e ne Leit ra EE MELDE Interpreta o dos resultados Software de interpreta o LIRAS lees Limites do procedimento Desempenho do teste Desempenho do teste usando ADN obtido com a solu o de iniciador DRB1
124. o e a lavagem rigorosa deve colocar as cavidades na plataforma agitadora do banho de gua Ajuste o n vel da gua entre 1 3 e 1 2 da altura da cavidade Certifique se que as cavidades n o ficam a boiar na gua A gua deve estar em contacto directo com as cavidades As etapas de incubac o para a revelac o da cor devem encontrar se entre os 20 e os 25 C Uma temperatura inferior aos 20 C pode causar resultados mais fracos Uma temperatura superior aos 25 C pode causar uma cor de fundo acentuada e ou sinais positivos falsos Execute a incubac o durante o tempo indicado respeitando exactamente o protocolo A amplitude do movimento gerado tanto pela agitac o do banho de gua procedimento de hibridizag o como pelo agitador procedimento da revelac o da cor extremamente importante para obter a m xima sensibilidade e colorac o homog nea A superf cie da tira deve estar totalmente submergida A amplitude deve ser a mais alta poss vel No entanto o derrame de l quido pelos cantos da cavidade deve ser evitado Isto pode levar contaminac o cruzada e resultados inv lidos A agitac o durante a incubac o das tiras deve ser feita de forma a que tanto o l quido como as tiras de teste se movimentam de c para l dentro da cavidade sem fazer transbordar o l quido das cavidades N o tape as cavidades Durante as incubac es de hibridizac o e de lavagem rigorosa pode deixar as cavidades destapadas no banho de gua Tapar as c
125. o intensa o sefiales falsas Incube siempre durante el tiempo exacto especificado en el protocolo INNOGENETICS9 60 La amplitud del movimiento generado por el bafio de agua de agitaci n procedimiento de hibridaci n y el agitador procedimiento de revelado de color es fundamental para lograr la m xima sensibilidad y una coloraci n uniforme La superficie de la tira debe quedar completamente sumergida La amplitud debe ser lo m s elevada posible Pero debe evitar derramar l quido sobre los bordes de las cubetas Esto podr a provocar contaminaciones cruzadas y resultados no v lidos La agitaci n durante la incubaci n de las tiras debe realizarse de forma que tanto el l quido como las tiras de ensayo se muevan de ac para all en la cubeta sin que se derrame l quido sobre el borde de la misma No cubra la bandeja Durante las incubaciones de hibridaci n y lavado astringente puede dejar las cubetas descubiertas en el bafio de agua Si se cubren las cubetas con selladores de microplaca podr a producirse contaminaci n cruzada Instrucciones para el cambio manual del l quido de las cubetas Debe aspirarse el l quido de la cubeta con una pipeta preferiblemente conectada a un aspirador de vac o La bandeja debe sostenerse formando un ngulo para que el l quido pueda fluir a un extremo de la cubeta Afiada 2 ml de la soluci n apropiada a cada cubeta y siga el protocolo Una multipipeta de distribuci n Eppendorf es
126. o rare having first been detected in three unrelated Caucasians This allele has sequence similarities with DRB1 0301 which was given as the first alternative Reproducibility Repeated typing between differing batches of INNO LiPA HLA DRB1 using the DNA derived from clinical samples during the study resulted in reproducible probe reactivities in every case INNOGENETICS9 18 Accuracy During the external evaluation INNO LiPA HLA DRB1 showed complete concordance with the reference methods Summary of sample numbers 243 Total number of amplification attempts no failures 211 Total number of unambiguous results at allele group level 32 ambiguities 203 243 Number of samples compared with INNO LiPA DRB Key used to measure concordancy 40 243 Number of samples tested by PCR SSP also used to measure concordancy Test performance using DNA obtained with DRB1 Primer Solution in combination with PCR protocol A B Bw4 C DRB1 DRB1 03 11 13 14 In order to evaluate the equivalence between PCR protocols and II 42 samples were tested in house using both methods The PCR products of both protocols gave identical typing results for all samples Test performance using DNA obtained with DRB1 03 11 13 14 Primer Solution in combination with PCR protocol A B Bw4 C DRB1 DRB1 03 11 13 14 The performance of the DRB1 03 11 13 14 Primer Solution of INNO LiPA HLA DRB1 Plus was evaluated in house and in two Belgian tissue typing
127. olle der Temperaturabweichung Eine strenge Temperaturkontrolle mit einem kalibrierten Thermometer ist erforderlich Die Klappe des Wasserbades w hrend der Inkubation immer verschlossen halten um falsch positive Banden zu vermeiden Keinen Hei luftinkubator f r die Hybridisierung und den Waschvorgang mit Stringent Waschl sung verwenden A F r die Hybridisierung und den Waschvorgang mit Stringent Waschl sung m ssen die Wannen auf die Sch ttelvorrichtung des Wasserbads gelegt werden Den Wasserstand auf 1 3 bis Y der H he der Wanne einstellen Sicherstellen dass die Wannen nicht auf dem Wasser schwimmen Das Wasser muss in direktem Kontakt mit den Wannen sein Die Inkubationsschritte f r die Farbentwicklung m ssen bei 20 25 C durchgef hrt werden Liegt die Temperatur unter 20 C werden ggf schw chere Resultate erzielt Liegt die Temperatur ber 25 C entstehen ggf starke Hintergr nde und oder falsch positive Banden A Halten Sie die angegebenen Inkubationszeiten exakt ein INNOGENETICS9 36 Die Sch ttelamplitude von Wasserbad Hybridisierung und Sch ttler Farbentwicklung ist wichtig um eine maximale Sensitivit t und eine homogene F rbung zu erhalten Die Teststreifenoberfl che muss vollst ndig untergetaucht sein Die Amplitude muss so hoch wie m glich sein Es sollte jedoch ein berlaufen der Fl ssigkeit ber die R nder der Wannen vermieden werden Dies kann zu einer Kontaminierung und zu ung l
128. olu o de desnaturac o As amostras devem ser manipuladas como potencialmente infecciosas Todos os componentes sangu neos e materiais biol gicos devem ser considerados como sendo potencialmente infecciosos e devem ser manipulados em conformidade O procedimento do teste deve ser realizado apenas por pessoal com forma o e qualifica es necess rias Todos os componentes sangu neos e materiais biol gicos devem ser eliminados em conformidade com os procedimentos de seguran a estabelecidos Realize uma autoclavagem durante pelo menos 15 minutos a 121 C Incinere o material descart vel Misture os res duos l quidos com hipoclorito de s dio para que a concentra o final seja de 1 de hipoclorito de s dio Deixe em repouso durante a noite antes de eliminar CUIDADO neutralize os res duos l quidos que cont m cido antes de adicionar o hipoclorito de s dio E necess rio utilizar equipamento de protec o luvas e culos de seguran a quando manipular agentes perigosos ou infecciosos Os res duos devem ser manipulados de acordo com as directivas de elimina o de res duos da institui o Cumpra tamb m todos os regulamentos ambientais federais locais e nacionais Amostras Visto o teste LiPA utilizar como amostra material ADN biotinilado amplificado est dispon vel um kit de amplifica o INNO LiPA DRB1 Amp Plus que serve de instrumento adicional Procedimentos de manipula o Manipul
129. onmental regulations should also be observed Specimens Since the LiPA test utilizes biotinylated amplified DNA material as specimen an amplification kit INNO LiPA DRB1 Amp Plus is available as an accompanying tool Manipulations procedures Strip handling The strips are designed to be used only once Do not touch the strips with bare hands use clean forceps Use a pencil for identification of the test strips Do not use ballpoints etc Write the ID above the marker line on the strips Throughout the different incubation steps test strips should always remain in the same trough Unused or developed strips should be kept away from intense light and heat A Allow the developed strips to dry completely before interpretation covering and storing Developed dry strips should be stored preferably in the dark at 20 25 C INNOGENETICS9 12 Do not reuse the troughs Directions for manual incubation Incubation at 56 C 0 5 C during hybridization and stringent wash are the most critical steps in avoiding false positive temperature too low or false negative very weak signals temperature too high A shaking water bath with inclined lid allows a good control of temperature variations Strict temperature control with a calibrated thermometer is necessary Always close the lid of the water bath during incubations in order to avoid false positive signals Do not use a hot air shaker for the hybridization and st
130. orgage n a jamais t constat et que plus de 80 all les parmi tous les groupes ont t test s Cependant la possibilit d un manquement d all le ne peut pas tre totalement exclue face un r sultat homozygote Performances Performances l aide d ADN obtenu l aide de la Solution Amorce DRB1 associ e au protocole PCR Il DRB1 DRB1 3 4 5 86G 86V DQB1 Les performances du test INNO LiPA HLA DRB1 ont t valu es dans trois centres europ ens et deux centres nord am ricains d histocompatibilit sur des chantillons de routine typer Au total 243 chantillons ont t analys s avec INNO LiPA HLA DRB1 Les r sultats ont t compar s avec ceux obtenus avec des m thodes de typage classique bien tablies biologie mol culaire INNO LiPA DRB decoder SSP et ou s rologie Aucun chec d amplification INNO LiPA HLA DRB1 n a t constat durant cette tude R activit des sondes Au total 74 bandes faussement positives ont t observ es avec INNO LiPA HLA DRB1 Aucune bande faussement n gative n a t rapport e Consulter le guide pour des informations sp cifiques sur la r activit des sondes Une liste compl te des sp cificit s des sondes et des amorces est disponible Toutes les sondes sont concues pour hybrider la s quence compl mentaire une base pr s moins que cela ne soit pr cis autrement dans la liste Un rapport de contr le de qualit des r activit s des fins
131. ouler avant utilisation il est recommand de conserver le tube l horizontale R actifs fournis Composant Quantit R f Description Bandelettes 1x20 58191 20 bandelettes INNO LiPA HLA DRB1 Plus marqu es avec une ligne de rep re noire Contr le LiPA 1 x 0 05 ml 58192 Contient de l acide thyl nediaminet traac tique EDTA et 0 0196 m thylisothiazolone MIT 0 196 chlorac tamide CAA comme conservateur 21 INNO LiPA HLA DRB1 Plus Solution de D naturation 1 x 1 ml Solution d Hybridation 1x80 ml Solution de Lavage 1 x 200 ml Stringent Diluant Conjugu 1x80 ml Conjugu 100x 1 x 0 8 ml Tampon Substrat 1 x 180 ml Substrat BCIP NBT 100x 1 x 0 8 ml Solution de Rin age 5x 1x80 ml 56718 56719 56720 56951 56952 56953 56954 56721 Solution alcaline contenant EDTA Le flacon doit tre imm diatement referm apr s usage Une exposition prolong e l air de cette solution conduit une rapide d t rioration de son pouvoir d naturant Tampon SSPE saline sodium phosphate EDTA contenant 0 5 de dod cyl sulfate sodium SDS La Solution d Hybridation doit tre pr chauff e une temp rature d au moins 37 C sans d passer 56 C tous les cristaux doivent tre dissous avant utilisation Tampon SSPE contenant 0 196 SDS La Solution de Lavage Stringent doit tre pr chauff e une temp rature d au moins 37 C sans d passer 56 C tous les cristaux doivent t
132. pisierungsergebnisse berechnet gemessen am einzigartigen Typisierungsergebnis das mittels INNO LiPA HLA DRB1 Innogenetics oder einem alternativen Typisierungstest Olerup SSP GenoVision oder Allset DR Low Resolution Dynal ermittelt wurde Die Typisierungsergebnisse aller 87 Proben waren bereinstimmend mit dem Referenzassay was einer diagnostischen Genauigkeit von 100 87 87 95 CI 95 9 100 entspricht Reaktivit t der Sonden Bei einem Fall bzw mehreren F llen ergab en einige Proben w hrend der Studie nur schwache Reaktionen Es wurde eine konkordante Typisierung auf Allelgruppenebene erreicht wenn die LIRAS Interpretationssoftware verwendet wurde Aufl sung Typisierungstabelle v5 8 021112 Die DRB1 Primer L sung die in Kombination mit dem INNO LiPA HLA DRB 1 Teststreifen verwendet wird dient der Typisierung von HLA DRB1 Allelen auf Allelgruppenebene 43 INNO LiPA HLA DRB1 Plus Die DRB1 03 11 13 14 Primer L sung die in Kombination mit dem INNO LiPA HLA DRB1 Teststreifen verwendet wird dient der Aufl sung der h ufigsten Widerspr chlichkeiten i e Widerspr chlichkeiten in Bezug auf DRB1 03 11 13 und oder 14 Allele Alle Widerspr chlichkeiten auf Allelgruppenebene die nach dem Testen mit der DRB1 Primer L sung festgestellt wurden konnten unter Verwendung der DRB1 03 11 13 14 Primer L sung zu einem nicht widerspr chlichen Typisierungsergebnis reduziert werden DRB1 01 DRB1 13 oder DRB1 01
133. portavaschette inclinato e aspirare il liquido dalla vaschetta attraverso una pipetta preferibilmente attaccata a un aspiratore a vuoto Aggiungere 2 ml di Soluzione di Lavaggio Stringente preriscaldata in ciascuna vaschetta e lavare agitando brevemente il portavaschette da 10 20 secondi a temperatura compresa tra 20 25 C Aspirare la soluzione da ciascuna vaschetta Ripetere questo breve passaggio di lavaggio ancora una volta INNOGENETICS9 50 3 Altermine aspirare la soluzione e incubare ciascuna striscia in 2 ml di Soluzione di Lavaggio Stringente pre riscaldata nel bagnomaria in agitazione a 56 C 0 5 C per 10 minuti Chiudere il coperchio del bagnomaria Prima dell incubazione controllare la temperatura del bagnomaria usando un termometro tarato e regolare la temperatura se necessario Chiudere sempre il coperchio NOTA Diluire la Soluzione di Risciacquo concentrata 5x e il Coniugato 100x durante il lavaggio stringente Vedi Reagenti Sviluppo del colore Tutte le incubazioni successive sono eseguite a 20 25 C su un agitatore Durante le incubazioni il liquido e le strisce devono muoversi avanti e indietro nella vaschetta per ottenere una colorazione omogenea 1 Lavare due volte ogni striscia per 1 minuto usando 2 ml della Soluzione di Risciacquo 2 Aggiungere 2 ml di soluzione di lavoro Coniugato a ciascuna vaschetta e incubare per 30 minuti sull agitatore NOTA Diluire la soluzione Substrato BCIP NBT 10
134. re dissous avant utilisation Tampon phosphate contenant NaCl Triton prot ines stabilisatrices et 0 01 MIT 0 1 CAA comme conservateur Streptavidine marqu e la phosphatase alcaline en tampon Tris contenant des prot ines stabilisatrices et 0 0196 MIT 0 09896 CAA diluer au 1 100 en Diluant Conjugu avant utilisation Pr parer 2 ml de Solution de travail de Conjugu par compartiment la Solution de travail de Conjugu peut tre pr par e pendant le lavage stringent 2 ml suppl mentaires pour test en manuel Pour l Auto LiPA pr parer 10 ml suppl mentaires La Solution de travail de Conjugu est stable 24 heures temp rature ambiante 20 25 C et l obscurit Tampon Tris contenant NaCl MgCl et 0 0196 MIT 0 1 CAA comme conservateur 5 Bromo 4 chloro 3 indolyl phosphate sel de p toluidine BCIP et 4 nitrobleu tetrazolium NBT en dim thylformamide DMP diluer au 1 100 en Tampon Substrat avant utilisation Pr parer 2 ml de Solution de travail de Substrat par compartiment la Solution de travail de Substrat peut tre pr par e pendant l incubation du conjugu 2 ml suppl mentaires pour test en manuel Pour l Auto LiPA pr parer 10 ml suppl mentaires La Solution de travail de Substrat est stable 24 heures temp rature ambiante 20 25 C et l obscurit Tampon phosphate contenant NaCl Triton et 0 05 MIT 0 48 CAA comme conservateur diluer au 1 5 1 part 4
135. repare mais 10 ml A solug o conjugado de trabalho permanece est vel durante 24 horas se for armazenada temperatura ambiente Tamp o tris contendo NaCl MgCl e 0 0196 MIT 0 1 CAA como conservante Componente Quantidade Ref Descrig o Tiras 1x20 58191 Controlo LiPA 1 x 0 05 ml 58192 conservante Solu o de desnaturag o 1 x 1 ml 56718 Solu o de hibridiza o 1 x 80 ml 56719 sua utiliza o Solu o para lavagem 1 x 200 ml 56720 rigorosa Diluente de conjugado 1x80 ml 56951 Conjugado 100x 1x0 8 ml 56952 antes de usar de 20 25 C Tamp o de substrato 1x 180 ml 56953 Substrato BCIP NBT 100x1 x 0 8 ml 56954 Sal de 5 bromo 4 cloro 3 indolil fosfato p toluidina BCIP e 4 nitro azul tetraz lio NBT em dimetilformamida DMF para ser diluida a 1 100 no tamp o de substrato antes de usar Prepare 2 ml de solug o de substrato de trabalho para cada cavidade teste 2 ml em excesso a solug o de Substrato de trabalho pode ser preparada durante a incubac o do conjugado para o teste manual Para Auto LiPA prepare mais 10 ml A solug o substrato de trabalho permanece est vel durante 24 horas se INNOGENETICS9 70 for armazenada no escuro temperatura ambiente de 20 25 C Solu o de lavagem 5x 1 x 80 ml 56721 Tamp o fosfato contendo NaCl Triton e 0 05 MIT 0 48 CAA como conservante para ser dilu do a 1 5 1 parte 4 partes em gua destilada ou desionizada antes de usar Prepare 8 ml
136. ringent wash For hybridization and stringent wash the troughs should be placed on the shaking platform of the water bath Adjust the water level between 1 3 and 1 2 of the height of the trough Make sure that the troughs do not float on the water The water should be in direct contact with the troughs Incubation steps for the color development should be between 20 and 25 C If the temperature is below 20 C weaker results may be obtained If the temperature is above 25 C high background and or false positive signals may be obtained Always incubate exactly for the duration as mentioned in the protocol The amplitude of the motion generated by both the shaking water bath hybridization procedure and the shaker color development procedure is critical in achieving maximum sensitivity and homogeneous staining The strip surface should be completely submerged The amplitude should be as high as possible However spilling of liquid over the edges of the troughs should be avoided This can lead to cross contamination and invalid results Shaking during incubation of the strips should be performed in such a way that both the liquid and the test strips move back and forth in the trough without liquid being spilled over the edge of the troughs Do not cover the tray During hybridization and stringent wash incubations the troughs can be left uncovered in the water bath Covering the troughs with microplate sealers may cause cross contamination
137. s En pr sence de DRB1 03 alors que DRB1 13 est donn comme groupe d all le alternatif DRB1 11 l all le sp cifique DRB1 03 est dans chaque cas DRB1 0308 Cet all le a t d crit comme ayant une s quence tr s semblable DRB1 03011 except au codon 58 pour lequel la similarit de s quence est plut t avec le groupe d all le DRB1 11 De plus DRB1 0308 et aussi les all les sp cifiques DRB1 13 DRB1 1305 1307 1311 1314 et 1324 avec lesquels une ambiguit a t report e ont une fr quence attendue tr s faible En pr sence de DRB1 04 chacun des 2 all les rares de DRB1 13 1322 1323 est propos comme alternative au typage de groupe d all les DRB1 11 et le seul all le DRB1 04 qui tait rapport est DRB1 0415 Il a t document des similarit s de s quence entre les all les sp cifiques DRB1 13 impliqu s et le groupe d all les DRB1 11 Les fr quences des all les DRB1 13 pouvant causer des ambiguit s ainsi que celle de l all le DRB1 0415 sont pr sum es tre faibles Un antig ne tait ambigu pour DRB1 13 14 dans 9 66 chantillons 13 696 o pouvaient tre pr sent DRB 13 ou DRB 14 Ces all les responsables d ambiguit taient rapport s par le logiciel LIPA Expert comme suit DRB1 0103 x 1417 1430 trois chantillons DRB1 0402 0414c13H x 1421 cinq chantillons et DRB1 0402 0414 x 1417 1430 un chantillon En pr sence de DRB1 04 des all les de DRB1 14 1417
138. s avec les mains utiliser des pinces en plastique propres Utiliser un crayon pour identifier les bandelettes Ne pas utiliser de stylos bille etc Ecrire l identit au dessus de la ligne de rep re des bandelettes Les bandelettes doivent rester dans le m me compartiment tout au long des diff rentes tapes d incubation Les bandelettes non utilis es ou d velopp es doivent tre conserv es l cart de toute source de lumi re intense et de chaleur Laisser les bandelettes d velopp es s cher enti rement avant de les interpr ter de les couvrir et de les stocker Les bandelettes d velopp es s ches doivent de pr f rence tre conserv es l obscurit une temp rature de 20 25 C Ne pas r utiliser les compartiments Directives pour incubation manuelle L incubation 56 C 0 5 C pour l hybridation et le lavage stringent est l tape la plus critique pour viter les signaux faussement positifs temp rature trop basse ou faussement n gatifs tr s faibles temp rature trop lev e Un bain marie agitant avec couvercle inclin permet un bon contr le des variations de temp rature Un strict contr le de la temp rature l aide d un thermom tre calibr est indispensable Toujours fermer le couvercle du bain marie pendant l incubation afin d viter les signaux faussement positifs Ne pas utiliser d agitateur air chaud pour l hybridation et le lavage stringent Pour l hybridation et le lavage str
139. salt Substrate BCIP NBT 100x R43 S24 37 Irritant Xi Avoid contact with skin May cause sensitization by skin contact Wear suitable gloves Contains 2 Chloroacetamide Rinse Solution Substrate Buffer Conjugate Diluent and LiPA Control R36 38 S23 24 26 Irritant Xi Irritating to eyes and skin Do not breathe vapour Avoid contact with skin In case of contact with eyes rinse immediately with plenty of water and seek medical advice Contains sodium hydroxide Denaturation Solution Specimens should be handled as potentially infectious Therefore all blood components and biological materials should be considered as being potentially infectious and should be handled as such Only adequately trained personnel should be permitted to perform the test procedure All blood components and biological materials should be disposed of in accordance with established safety procedures Autoclave for at least 15 minutes at 121 C ncinerate disposable material Mixliquid waste with sodium hypochlorite so that the final concentration is 196 sodium hypochlorite Allow to stand overnight before disposal CAUTION Neutralize liquid waste that contains acid before adding sodium hypochlorite Use of personal protective equipment is necessary gloves and safety spectacles when manipulating dangerous or infectious agents Waste should be handled according to the institution s waste disposal guidelines Al federal state and local envir
140. ser realizadas num agitador a uma temperatura de 20 25 C Durante as incuba es tanto o l quido como as tiras de teste devem movimentar se para a frente e para tr s na cavidade para garantir uma colora o homog nea 1 Lave cada tira duas vezes durante 1 minuto com 2 ml de solu o de lavagem 2 Adicione 2 ml de solu o conjugado de trabalho a cada cavidade e incube durante 30 minutos agitando o suporte no agitador Nora Dilua a solu o de substrato BCIP NBT 100x uns 10 minutos antes de acabar a incuba o do conjugado Veja Reagentes 3 Lave cada tira duas vezes durante 1 minuto com 2 ml da solu o de lavagem de trabalho e adicionalmente mais uma vez com 2 ml de tamp o substrato 4 Adicione 2 ml da solu o dilu da de substrato de trabalho a cada cavidade e incube durante 30 minutos agitando o suporte no agitador CUIDADO Utilize luvas e culos de protec o 5 Pare a revela o da cor lavando as tiras duas vezes com 2 ml de gua destilada agitando o suporte no agitador durante pelo menos 3 minutos 6 Utilize pin as para retirar as tiras das cavidades e coloque as mesmas em papel absorvente Espere at as tiras estarem totalmente secas e s depois proceda leitura dos resultados Armazene em lugar escuro as tiras secas e processadas 75 INNO LiPA HLA DRB1 Plus Procedimento de teste automatizado Auto LiPA O procedimento de teste LiPA muito apropriado para a automatiza o O que signifi
141. siche standardizzate test su DNA INNO LiPA DRB key decoder SSP e o sierologia Non sono stati osservati fallimenti di amplificazione di INNO LiPA HLA DRB1 durante lo studio Reattivit delle sonde Sono state osservate in totale 74 bande false positive con INNO LiPA HLA DRB1 Nessuna banda falsa negativa stata rilevata durante lo studio Consultare le linee guida per informazioni specifiche sulla reattivit delle sonde E disponibile una lista completa delle specificit delle sonde e dei primers Tutte le sonde Sono state progettate per ibridare in maniera specifica con la loro sequenza complementare a livello di un mismatch a meno che non riportato diversamente nella lista Per scopi di accreditamento disponibile su richiesta un report sul controllo di qualit delle reattivit Range di applicazione Il limite basso del range di applicazione stato determinato utilizzando una serie di diluizione di DNA Una quantit di 0 05 ug di DNA estratto A260 nm A280 nm gt 1 5 pu essere usata nel test di amplificazione relativo producendo DNA in quantit pi che sufficiente per essere rilevato con il test LiPA Risoluzione Tabella di tipizzazione usata K 1067 v 5 x 1998 02 20 Le strisce INNO LiPA HLA DRB1 con 37 sonde immobilizzate in linee parallele consentono la tipizzazione a livello del gruppo allelico DRB1 La risoluzione teorica a livello generico da DRB1 01 a DRB1 16 calcolata essere 89 3 Durante lo stu
142. sidered in the event of a homozygous result Test performance Test performance using DNA obtained with DRB1 Primer Solution in combination with PCR protocol Il DRB1 DRB1 3 4 5 86G 86V DQB1 INNO LiPA HLA DRB1 has been evaluated in three European and two North American tissue typing laboratories on routine typing samples In the study a total of 243 samples were tested with INNO LiPAHLA DRB1 The results were compared to established classical typing techniques DNA based assays INNO LiPA DRB key decoder SSP and or serology There were no INNO LiPA HLA DRB1 amplification failures during the study Probe reactivity In total 74 false positive bands were observed with INNO LiPA HLA DRB1 No false negative bands were reported during the study Consult the guidelines for specific information about probe reactivity A complete list of probe and primer specificities is available All probes are designed to hybridize specifically with their complementary sequence at the level of one mismatch unless stated otherwise in the list A report on the quality control of the reactivities is available for accreditation purposes on request Application range The lower limit of the application range was determined using a DNA titration series As little as 0 05 ug extracted DNA A260 nm A280 nm gt 1 5 can be used in the accompanying amplification assay yielding more than sufficient DNA for detection in the LiPA Resolution Typing table use
143. sing the reverse hybridization assay format at the allele group level this means the first two digits after the asterisk in an allele name when following standard HLA nomenclature e g HLA DRB1 01 In addition to the allele group interpretation the software will give all possible allele combinations This information however should be considered as extra and not as decisive 9 INNO LiPA HLA DRB1 Plus Reagents Description preparation for use and recommended storage conditions f kept at 2 8 C opened and unopened and stored in the original vials the reagents are stable until the expiry date of the kit Do not freeze reagents Do not use the reagents beyond the expiry date The kit should be stored isolated from any source of contaminating DNA especially amplified products A All reagents should be brought to room temperature 20 25 C approximately 60 minutes before use and should be returned to the refrigerator immediately after use A Alterations in physical appearance of the kit components may indicate instability or deterioration To minimise the possibility that strips curl before use it is recommended to store the tube horizontally Reagents supplied Component Quantity Ref Description Strips 1x20 58191 Containing 20 strips for INNO LiPA HLA DRB1 Plus marked with a black marker line LiPA Control 1x0 05 ml 58192 Containing ethylenediaminetetraacetic acid EDTA and 0 0196 methylisothiazolon
144. sur la r action en chaine par polym rase PCR Les produits amplifi s sont ensuite hybrid s avec 1 bandelette LiPA comportant 37 sondes ADN sp cifiques et 2 sondes de contr le Figure 1 L utilisation de ce produit est couverte par une licence de F Hoffmann La Roche Ltd et Roche Molecular Systems Inc INNOGENETICS9 20 INNO LiPA HLA DRB1 Plus tapes tape 1 Amplification de l exon 2 des all les HLA DRB1 tape 2 Hybridation et lavage stringent avec 37 sondes immobilis es sur une bandelette INNO LiPA HLA DRB1 Plus 56 C tape 3 R v lation tape 4 Interpr tation du profil de r activit des sondes tape 5 Si n cessaire le logiciel d interpr tation LIRAS recommande une tape d amplification et d hybridation suppl mentaire Lors de l utilisation du kit INNO LiPA HLA DRB1 Plus il est conseill de commencer par a et de continuer en b en cas d ambiguit s entre les all les DRB1 03 11 13 ou 14 et d autres all les DRB1 C est ce que recommandera le logiciel d interpr tation LIRAS a amplification de l exon 2 des all les HLA DRB1 03 11 13 14 l aide de la solution Primer HLA DRB1 avant test avec la bandelette INNO LiPA HLA DRB1 Plus b amplification sp cifique de groupe de l exon 2 des all les HLA DRB1 03 11 13 14 l aide de la solution Primer HLA DRB1 03 11 13 14 avant test avec la bandelette INNO LiPA HLA DRB1 Plus La solution Primer HLA DRB1 03 11 13 14 fournie amplifie l exon
145. t werden und m ssen unmittelbar nach dem Gebrauch wieder in den K hlschrank gelegt werden Ver nderungen im Aussehen der im Kit enthaltenen Komponenten k nnen auf eine Instabilit t oder Verschlechterung der Qualit t der Substanzen hinweisen Um ein Einrollen der Teststreifen vor dem Gebrauch zu verhindern wird empfohlen das R hrchen horizontal zu lagern Gelieferte Reagenzien Komponente Menge Ref Beschreibung Teststreifen 1x20 58191 Enth lt 20 Streifen f r INNO LiPA HLA DRB1 Plus markiert mit einer schwarzen Markierungslinie LiPA Kontrolle 1x0 05 ml 58192 Enth lt Ethylendiamintetraessigs ure EDTA und 0 01 Methylisothiazolon MIT 0 1 Chloroacetamid CAA als Konservierungsmittel Denaturierungsl sung 1x1 ml 56718 Alkalische L sung mit EDTA Das Fl schchen muss direkt nach dem Gebrauch wieder verschlossen werden l ngerer Kontakt mit Luft verschlechtert innerhalb kurzer Zeit die Denaturierungsst rke Hybridisierungsl sung 1 x 80 ml 56719 Natriumphosphat EDTA SSPE Puffer mit 0 596 Natriumdodezylsulfat SDS Die Hybridisierungsl sung muss auf mindestens 37 C erw rmt werden darf aber 56 C nicht bersteigen alle Kristalle m ssen sich vor dem Gebrauch aufgel st haben Stringent Waschl sung 1 x 200 ml 56720 SSPE Puffer mit 0 196 SDS Die Stringent Waschl sung muss auf mindestens 37 C erw rmt werden darf aber 56 C nicht bersteigen alle Kristalle m ssen sich vor dem Gebrauch aufge
146. ta la bandeja en el agitador NOTA Diluya la soluci n de sustrato BCIP NBT 100x unos 10 minutos antes del final de la incubaci n del conjugado Vea Reactivos 3 Lave cada tira dos veces durante 1 minuto con 2 ml de la soluci n de Lavado de trabajo y l vela otra vez m s con 2 ml de tamp n sustrato 4 Afiada 2 ml de la soluci n de sustrato de trabajo diluida a cada cubeta e incube durante 30 minutos a la vez que agita la bandeja en el agitador PRECAUCI N Use guantes y gafas protectoras 5 Detenga el revelado de color lavando las tiras dos veces en 2 ml de agua destilada al agitar la bandeja en el agitador durante al menos 3 minutos 6 Utilice las pinzas para retirar las tiras de las cubetas y colocarlas en papel absorbente Antes de leer los resultados espere a que las tiras se sequen completamente Almacene las tiras reveladas y secas en un lugar oscuro Procedimiento de ensayo automatizado Auto LiPA El procedimiento de ensayo LiPA es muy apropiado para la automatizaci n Por tanto el ensayo Auto LiPA se ha dise ado para controlar completamente los pasos de hibridaci n lavado astringente y revelado de color Este ensayo se ofrece como un sistema sencillo con calentamiento enfriamiento aspiraci n y pipeteado automatizados Para obtener m s informaci n y los protocolos espec ficos sobre Auto LiPA p ngase en contacto con su distribuidor local Resultados Lectura Una banda se considera positiva si aparece una
147. ta linea deve essere sempre positiva eccetto per il controllo negativo ma la sua intensit pu variare tra i diversi campioni Il risultato di ciascun controllo negativo non deve dare alcun segnale per ciascuna delle linee sulla striscia eccetto che per la linea di controllo del Coniugato Il Controllo LiPA per INNO LiPA HLA DRB1 Plus deve mostrare il seguente pattern di sonde positive controllo coniugato controllo HLA DRB 2 8 23 25 26 30 33 37 Questo controllo composto da oligonucleotidi biotinilati complementari alle sonde di ibridazione menzionate L ibridazione positiva su queste sonde dimostra cosi una esecuzione soddisfacente del test nei passaggi di ibridazione lavaggio stringente sviluppo del colore e rilevazione Un pattern differente pu indicare problemi di esecuzione quali temperatura non corretta durante l ibridazione o deviazioni dai tempi e temperature indicate Le intensit di colore delle sonde su una striscia possono differire da una linea all altra Interpretazione dei risultati Controllare il corretto schema di reattivit del campione di Controllo LiPA La linea di controllo del coniugato sulla striscia deve essere allineata con la linea di controllo del Coniugato sulla carta di lettura Controllare la positivit delle linee di controllo prime due linee per validare ciascuna singola striscia vedi Validazione risultati di tipizzazione si basano sulla reattivit delle sonde del kit La lista de
148. tata valutata in sede e presso due laboratori di tipizzazione dei tessuti belgi Sono stati analizzati un totale di 89 campioni anonimi 50 campioni esternamente 39 in sede Tutti i campioni sono stati preventivamente tipizzati con INNO LiPA HLA DRB1 campioni includevano 14 campioni ambigui sei diverse ambiguit e 75 campioni non ambigui Tutti i campioni ambigui sono stati ulteriormente tipizzati su un unico risultato con uno o pi test di tipizzazione alternativi su base DNA Tutte le ibridazioni sono state eseguite usando lo strumento Auto LiPA utilizzando il programma HLA56v3 e l interpretazione stata fatta con una versione di test clinico di LIRAS per il software d interpretazione LIPA HLA v3 00 Sensibilit del test La sensibilit del test di valutazione a livello del gruppo di allele stata calcolata come il numero di risultati di tipizzazione positivi rispetto al numero totale di campioni testati La sensibilit del test in questa valutazione stata del 100 89 89 95 CI 95 9 100 Precisione diagnostica calcoli di precisione diagnostica sono stati eseguiti esclusivamente su campioni per cui era disponibile un unico risultato di riferimento Di conseguenza sono stati esclusi due campioni da questo calcolo Un unico risultato di tipizzazione HLA DRB1 stato ottenuto per i restanti 87 campioni La precisione diagnostica della valutazione rispetto al livello di gruppo di allele stata calcolata come
149. tecci n adecuados En caso de accidente o si no se siente bien acuda al m dico de inmediato muestre la etiqueta si es posible Evite la exposici n consulte las instrucciones especiales de uso Uso limitado al personal especializado Contiene dimetilformamida sal p toluidina de 5 bromo 4 cloro 3 indolil fosfato Sustrato BCIP NBT 100x x R43 S24 37 Producto irritante Xi Evite el contacto con la piel Puede causar sensibilizaci n si entra en contacto con la piel Utilice guantes apropiados Contiene 2 cloracetamida soluci n de lavado tamp n sustrato diluyente de conjugado y control LiPA x R36 38 S23 24 26 Producto irritante Xi Irrita los ojos y piel Evite inhalar el vapor Evite el contacto con la piel En caso de contacto con los ojos limpie inmediatamente la parte afectada con abundante agua y busque atenci n m dica Contiene hidr xido de sodio Soluci n de desnaturalizaci n 59 INNO LiPA HLA DRB1 Plus Las muestras deben manipularse como productos potencialmente infecciosos Por lo tanto toda la sangre y hemoderivados y los materiales biol gicos deber n considerarse como potencialmente infecciosos y manipularse como tales Unicamente el personal debidamente capacitado debe llevar a cabo el procedimiento de ensayo Toda la sangre y hemoderivados y todos los materiales biol gicos deben desecharse de acuerdo con los procedimientos de seguridad establecidos Esterilice en autoclave durante 15
150. test l aide de l instrument Auto LiPA Ce protocole a t ex cut en double par deux personnes diff rentes Aucune variation significative n a t observ e et un r sultat de typage identique a t obtenu dans tous les cas sans besoin d dition Deutsch Verwendungszweck Bei dem INNO LiPA HLA DRB1 Plus handelt es sich um einen line probe assay f r die in vitro Verwendung der f r die molekulare Typisierung von DRB1 Allelen des Humanen Leukozyten Antigens HLA auf Allelgruppenniveau entworfen wurde DRB1 01 bis DRB1 16 Funktionsweise des Tests Der INNO LiPA HLA Typisierungstest basiert auf dem Prinzip der reversen Hybridisierung Amplifiziertes biotinyliertes DNA Material wird chemisch denaturiert und die Einzelstr nge werden mit spezifischen Oligonukleotidsonden hybridisiert die als parallele Linien auf Membranstreifen aufgetragen wurden Anschlie end wird ein Waschschritt mit Stringent Waschl sung vorgenommen um unspezifisch gebundenes Amplifikat zu entfernen Nach diesem Waschschritt mit Stringent Waschl sung wird mit alkalischer Phosphatase markiertes Streptavidin hinzugef gt und dieses wird dann von dem zuvor gebildeten biotinylierten Hybriden gebunden Die Inkubation mit einer Substratl sung die Chromogen enth lt f hrt zur einem violett braunen Niederschlag Die Reaktion wird durch einen Waschvorgang gestoppt und das Reaktionsmuster der Sonden wird interpretiert Zus tzlich zum INNO LiPA HLA
151. tigen Ergebnissen f hren Das Sch tteln w hrend der Inkubation der Teststreifen sollte so durchgef hrt werden dass sowohl die Fl ssigkeit als auch die Teststreifen in der Wanne hin und herbewegt werden jedoch ohne dass die Fl ssigkeit ber die Wannenr nder l uft Die Inkubationswannen nicht abdecken W hrend der Hybridisierung und des Waschvorgangs mit Stringent Waschl sung k nnen die Wannen im Wasserbad ohne Abdeckung verbleiben Das Abdecken der Wannen mit Abklebefolien f r Mikrotiterplatten kann zu einer Kreuzkontamination f hren Anleitung f r das manuelle Auswechseln der Fl ssigkeit in den Wannen Die Fl ssigkeit wird mittels einer Pipette aus den Wannen entnommen vorzugsweise sollte die Pipette an eine Vakuumpumpe angeschlossen sein Die Wanne wird so geneigt dass die Fl ssigkeit sich an einem Ende der Wanne sammelt Geben Sie in jede Wanne 2 ml der entsprechenden L sung und befolgen Sie das Protokoll Eine Dispensier Multipipette Eppendorf ist f r diesen Zweck hilfreich Diesen Schritt so oft wiederholen wie in der Testanleitung angegeben HINWEIS Die Streifen d rfen zwischen zwei Schritten nicht antrocknen Darauf achten dass die Oberfl che der Teststreifen beim Absaugen der Fl ssigkeit nicht besch digt wird Die Fl ssigkeit am oberen Ende des Teststreifens ber der Markierungslinie absaugen Sicherstellen dass die gesamte Fl ssigkeit abgesaugt wurde Damit effizientes Waschen ge
152. to de trabalho durante o processo de detec o Esta linha deve ser alinhada com a linha de controlo de conjugado no cart o de pl stico para leitura Esta linha deve ser sempre positiva e ter aproximadamente a mesma intensidade em todas as tiras utilizadas durante o mesmo teste A linha seguinte a linha de controlo positivo do HLA DRB1 controlo HLA DRB no cart o de leitura que indica se foi ou n o adicionado uma quantidade adequada de material amplificado HLA DRB1 hibridiza o Esta linha deve ser sempre positiva excep o do controlo negativo mas a sua intensidade pode divergir entre amostras O resultado do ensaio de cada controlo negativo n o deve apresentar nenhum sinal vis vel em nenhuma das linhas da tira excepto para a linha de controlo do conjugado A amostra de controlo LIPA para o INNO LiPA HLA DRB1 Plus deve apresentar os seguintes padr es de sondas positivas controlo conjugado controlo HLA DRB 2 8 23 25 26 30 33 37 Esta amostra de controlo composta por oligonucle tidos biotinilados complementares s sondas de hibridiza o mencionadas Portanto a hibridiza o positiva demonstra o desempenho satisfat rio do ensaio incluindo a hibridiza o lavagem rigorosa revela o da cor e detec o Um padr o diferente pode indicar problemas no desempenho do ensaio tais como a utiliza o de uma temperatura incorrecta durante a hibridiza o ou o desvio da temperatura ou das vezes de inc
153. uba o prescritas As intensidades das cores nas sondas numa tira podem divergir de uma linha para a outra Interpreta o dos resultados Verifique a ocorr ncia de um padr o de reactividade correcto na amostra de controlo LiPA A linha de controlo de conjugado na tira deve estar alinhada com a linha de controlo de conjugado do cart o de pl stico para leitura INNOGENETICS9 76 Verifique se as linhas de controlo as primeiras duas linhas s o positivas a fim de poder validar cada tira individualmente veja Validac o Os resultados de tipagem baseiam se na reactividade das sondas do kit A pedido encontra se dispon vel uma lista de especificidades da sonda Identifique todos os n meros das sondas que est o positivos na tira INNO LiPA HLA DRB1 Plus e deduza o tipo de DRB1 usando a tabela de tipagem INNO LiPA HLA DRB1 Plus ou a vers o de software de interpretac o LiPA LIRAS Na maioria das vezes o software oferece mais resultados do que indicado na utilizac o uma interpretac o ao n vel do grupo de alelos bem como todas as combinac es de alelos poss veis No entanto esta informac o deve ser considerada como informa o adicional e n o como sendo informa o decisiva Software de interpretag o LiRAS O software LiIRAS foi desenvolvido para ajudar a interpretar os resultados da LiPA Para obter a vers o mais recente contacte o seu distribuidor local Limites do procedimento A utiliz
154. ubation verd nnen Siehe Reagenzien 3 Jeden Teststreifen f r 1 Minute mit 2 ml der Sp larbeitsl sung sp len und anschlie end nochmals mit 2 ml Substratpuffer waschen 4 2mlder verd nnten Substratgebrauchsl sung in jede Wanne geben und f r 30 Minuten inkubieren wobei die Schale auf dem Sch ttler bewegt wird ACHTUNG Handschuhe und Schutzbrille tragen 5 Die Farbentwicklung durch zweimaliges Waschen der Teststreifen mit 2 ml destilliertem Wasser stoppen w hrend die Schale auf einem Sch ttler f r mindestens 3 Minuten bewegt wird 6 Mittels Pinzette die Streifen aus den Wannen nehmen und sie auf absorbierendes Papier legen Die Teststreifen vollst ndig trocknen lassen bevor Sie die Resultate ablesen Die entwickelten und trockenen Teststreifen im Dunkeln lagern Automatisches Testverfahren Auto LiPA Das LiPA Testverfahren eignet sich hervorragend f r eine Automatisierung Daher wurde der Auto LiPA entwickelt der in der Lage ist die Schritte Hybridisierung Waschvorgang mit Stringent Waschl sung und Farbentwicklung vollst ndig automatisiert durchzuf hren Der Auto LiPA kann ohne Uberwachung arbeiten Heizen K hlen Pipettieren werden automatisch durchgef hrt Weitere Informationen und spezifische Protokolle f r den Auto LiPA k nnen Sie bei Ihrem lokalen Vertreter erfragen Ergebnisse Ablesen Eine Linie gilt als positiv wenn ein klares violett braunes Band am Ende des Testverfahrens zu erkennen ist A
155. uppe 86 8 211 243 Insgesamt wurden 32 nicht eindeutige Ergebnisse erhalten Diese wurden bei sieben Sondenkombinationen innerhalb der folgenden Allelkombinationen erhalten DRB1 03 x 11 13 8 Proben DRB1 04 x 11 13 3 Proben DRB1 01 x 13 14 3 Proben DRB1 04 x 13 14 6 Proben DRB1 03 x 13 15 12 Proben 41 INNO LiPA HLA DRB1 Plus Bei 11 83 13 396 Proben die entweder DRB1 11 oder DRB1 13 enthielten war ein Antigen bei DRB1 11 13 nicht eindeutig Diese Allele die zu Nicht Eindeutigkeit f hren werden von der LiPA Expert Software wie folgt angegeben DRB1 0308 x 1324 2 Proben DRB1 0415 x 1322 1323 3 Proben und DRB1 0308 x 1305 1307 1311 1314c75L 1314c75V 6 Proben In Gegenwart von DRB1 03 wird DRB1 13 als alternative Allelgruppe zu DRB1 11 angegeben In jedem Fall ist das spezifische DRB1 03 Allel DRB1 0308 Es hat eine sehr hnliche Sequenz wie DRB1 03011 bis auf Codon 58 das Ahnlichkeit mit der DRB1 11 Allelgruppe aufweist treten sowohl DRB1 0308 als auch die spezifischen DRB1 13 Allele DRB1 1305 1307 1311 1314 and 1324 mit denen zusammen es nicht eindeutig bestimmt werden kann selten auf In Gegenwart von DRB1 04 wird bei der Allelgruppen Typisierung eines der beiden selten auftretenden Allele von DRB1 13 1322 1323 als Alternative zu DRB1 11 angegeben Das einzige DRB1 04 Allel mit dem sie zusammen aufgef hrt werden ist DRB1 0415 Zwischen den spezifischen beteiligten DRB1 13
156. ura del test NOTA Non lasciare asciugare le strisce tra due lavaggi Assicurarsi di non danneggiare la superficie delle strisce durante l aspirazione Aspirare il liquido sopra la linea di identificazione della striscia Assicurarsi che tutto il liquido sia stato aspirato Assicurarsi che l intera striscia venga accuratamente lavata immergendola completamente nella soluzione Adattare se necessario la velocit dell agitatore Note e precauzioni Solo per uso professionale Per evitare contaminazione da DNA si raccomanda la massima separazione fisica tra i passaggi di pre e post amplificazione stanze separate pipette e altro materiale di laboratorio dedicato camici e guanti separati comprese le loro Scorte sono precauzioni minime per una buona pratica di laboratorio Evitare di tornare dalla stanza di post amplificazione alla stanza di pre amplificazione Si raccomanda l uso di materiale di laboratorio monouso autoclavato Non riutilizzare il materiale di laboratorio monouso Usare un nuovo puntale sterile per ciascun campione aliquotato Non usare i reagenti oltre la data di scadenza Non miscelare i reagenti tra kit a meno che i componenti abbiano lo stesso numero di lotto Evitare la contaminazione microbica dei reagenti Procedura manuale del test NOTA Nel corso dei vari passaggi d incubazione le strisce del test devono sempre rimanere nella medesima vaschetta 49 INNO LiPA HLA DRB1 Plus Prima del
157. ve ser tida em considerac o no caso de se obter um resultado homog neo Desempenho do teste Desempenho do teste usando ADN obtido com a soluc o de iniciador DRB1 em combinag o com PCR protocolo Il DRB1 DRB1 3 4 5 86G 86V DQB1 O kit INNO LiPA HLA DRB1 foi avaliado em laborat rios de tr s centros Europeus de tipagem de tecidos e dois Norte Americanos com amostras de rotina No estudo testou se um total de 243 amostras com o INNO LiPA HLA DRB1 Os resultados foram comparados com t cnicas de tipagem cl ssicas estabelecidas ensaios baseadas em ADN INNO LiPA DRB key decoder SSP e ou serologia Durante o estudo nao houve problemas de amplificag o com INNO LiPA HLA DRB1 Reactividade das sondas No total foram observadas 74 bandas falso positivas com INNO LiPA HLA DRB1 N o foram referidas bandas falso negativas durante o estudo Consultar as directivas para informac o espec fica sobre reactividade das sondas Est dispon vel uma lista completa de especificidades das sondas e dos primers Todas as sondas est o concebidas para hibridizar especificamente com a sua sequ ncia complementar a n vel de um erro mismatch se n o estiver especificado 77 INNO LiPA HLA DRB1 Plus na lista de modo diferente Est tamb m disponivel a pedido um controlo de qualidade das reactividades para fins de acreditac o Intervalo da Aplicag o O limite inferior da intervalo da aplicac o foi determinado usando diluigdes em s
158. ved after testing with the DRB1 Primer Solution were reduced to an unambiguous typing result using the DRB1 03 11 13 14 Primer Solution DRB1 01 DRB1 13 or DRB1 01 DRB1 14 3 cases DRB1 04 DRB1 13 or DRB1 04 DRB1 14 6 cases DRB1 08 DRB1 11 or DRB1 11 DRB1 13 1 case DRB1 11 DRB1 12 or DRB1 12 DRB1 13 2 cases For all ambiguous results the LIRAS interpretation software advised DRB1 03 11 13 14 amplification followed by hybridization with the INNO LiPA HLA DRB1 strip 19 INNO LiPA HLA DRB1 Plus Precision Repeatability intra assay inter assay and inter person variation were evaluated in house One sample amplified in duplicate using three different cyclers and processing two runs per cycler was tested using the Auto LiPA instrument This protocol was performed in duplicate by two different persons No significant variation was observed and an identical typing result was obtained in all cases without the need for editing Accuracy Calculations of diagnostic accuracy were only carried out on samples for which a unique reference result was available As a consequence two samples were excluded from this calculation A unique HLA DRB1 typing result was obtained for the remaining 87 samples Diagnostic accuracy of the assay at allele group level was calculated as the number of correctly obtained typing results compared to the unique typing result obtained with INNO LiPA HLA DRB1 Innogenetics or an alternativ
159. w hrleistet ist m ssen die Streifen vollst ndig in die L sung eingetaucht werden Wenn n tig die Geschwindigkeit des Sch ttlers anpassen Hinweise und Vorsichtsma nahmen Darf nur von Fachpersonal verwendet werden Um eine DNA Kontamination zu vermeiden wird eine maximale r umliche Trennung zwischen den pr und post Amplifikationsschritten empfohlen Separate R ume separate Pipetten und anderes Labormaterial separate Laborkittel und handschuhe und des entsprechenden Vorrats sind die Mindestvoraussetzungen f r eine gute Laborpraxis Vermeiden Sie einen Wechsel zwischen dem post Amplifikationsraum und dem pr Amplifikationsraum Die Verwendung von autoklaviertem Einweglabormaterial wird empfohlen Einweglabormaterial nicht mehrmals verwenden Verwenden Sie f r jede Probe eine neue Pipettenspitze Verwenden Sie den Kit nicht nach berschreitung des Verfallsdatums Keine Reagenzien unterschiedlicher Kits mischen es sei denn die Bestandteile weisen dieselbe Chargennummer auf Vermeiden Sie mikrobielle Kontaminierung der Reagenzien Manuelles Testverfahren HINWEIS W hrend der verschiedenen Inkubationsschritte m ssen die Teststreifen immer in derselben Wanne verbleiben berpr fen Sle vor der Inkubation die Temperatur des Wasserbads mit einem kalibrierten Thermometer und passen Sie die Temperatur wenn erforderlich an bevor die Wannen in das Wasserbad gelegt werden Deckel des Wasserbads immer
160. wie in zwei belgischen Laboren f r Gewebetypisierung bewertet Insgesamt wurden 89 anonyme Proben analysiert 50 Proben au er Haus 39 hausintern Alle Proben waren zuvor mit INNO LiPA HLA DRB1 typisiert worden Die Proben enthielten 14 widerspr chliche sechs verschiedenen Widerspr chlichkeiten und 75 nicht widerspr chliche Proben Alle widerspr chlichen Proben wurden weiter mit einem oder mehreren alternativen DNA basierten Typisierungstests auf ein eindeutiges Ergebnis typisiert Alle Hybridisierungen wurden mit dem Auto LiPA Instrument unter Verwendung von Programm HLA56v3 durchgef hrt und die Auswertung erfolgte mittels einer klinischen Versuchsversion der LIRAS for LIPA HLA v3 00 Interpretationssoftware Testsensitivit t Die Testsensitivit t des Assays auf Allelgruppenebene wurde als die Anzahl der erfolgreichen Typisierungsergebnisse berechnet gemessen an der Gesamtzahl der getesteten Proben Die Testsensitivit t bei dieser Bewertung lag bei 100 89 89 95 CI 95 9 100 Diagnostische Genauigkeit Die Berechnung der diagnostischen Genauigkeit wurde nur f r solche Proben durchgef hrt f r die individuelle Referenzergebnisse zur Verf gung standen Daher wurden zwei Proben von der Berechnung ausgeschlossen F r die verbleibenden 87 Proben wurden einzigartige HLA DRB1 Typisierungsergebnisse erhalten Die diagnostische Genauigkeit des Tests auf Allelgruppenebene wurde als die Anzahl der korrekt ermittelten Ty
161. y new test procedure the inclusion of additional positive and negative controls is to be considered until a high degree of confidence is reached in the ability to correctly perform the test procedure It is suggested that reference DNA should be used to validate that the proper test conditions have been established The uppermost line on the INNO LiPA HLA DRB1 Plus strip is the marker line black line This line allows correct orientation of the strip The next line controls the addition of reactive Conjugate and Substrate Solution during the detection procedure This line should be lined up with the Conjugate control line on the plastic reading card This line should always be positive and should have approximately the same intensity on each strip in the same test run The next line is the HLA DRB positive control line HLA DRB control on the reading card which indicates whether or not an appropriate amount of HLA DRB1 amplified material was added for hybridization This line should always be positive except for the negative control but its intensity may vary between samples The assay result of each negative control should give no apparent signal for any of the lines on the strip except for the conjugate control line The LiPA Control sample for INNO LiPA HLA DRB1 Plus should yield the following pattern of positive probes conjugate control HLA DRB control 2 8 23 25 26 30 33 37 This control sample is composed of biotinylated oligonuc
162. yond the expiry date Do not mix reagents between kits unless the components have identical lot numbers Avoid microbial contamination of reagents Manual test procedure NOTE Throughout the different incubation steps the test strips should always remain in the same trough Before incubation check the temperature of the water bath using a calibrated thermometer and adjust the temperature if necessary before placing the tray in the water bath Always close the lid The LiPA Control should be included in each test run Samples 1 DRB1 amplified product use 10 ul For ample preparation see INNO LiPA HLA DRB1 Amp Plus instructions for us 2 LiPA Control sample for INNO LiPA HLA DRB1 Plus use 10 ul amplification is not required 3 Blank amplified control sample negative control use 10 pl Denaturation and hybridization 1 Heata shaking water bath to 56 C 0 5 C Check the temperature using a calibrated thermometer and adjust the temperature if necessary Do not exceed the indicated temperatures Pre warm the Hybridization Solution and Stringent Wash Solution in a water bath of at least 37 C and do not exceed 56 C Mix before use All crystals should be dissolved 2 Using forceps remove the required number of INNO LiPA HLA DRB1 Plus strips from the tube one strip per test sample Include a strip for the LiPA Control sample for INNO LiPA HLA DRB1 Plus and for the blank amplified control sample Pencil an identif
163. za con DRB1 0301 che era stato dato come prima alternativa Riproducibilit Tipizzazioni ripetute con diversi lotti di INNO LiPA HLA DRB1 usando DNA derivato dai campioni clinici durante lo studio hanno fornito risultati sempre riproducibili nelle reattivit delle sonde Accuratezza Nella validazione esterna INNO LiPA HLA DRB1 ha mostrato una completa concordanza con i metodi di riferimento Riassunto del numero dei campioni 243 Numero totale di tentativi di amplificazione nessun fallimento 211 Numero totale di risultati non ambigui a livello di gruppo allelico 32 ambiguit 203 243 Numero totale di campioni comparati con INNO LIPA DRB key usato per misurare la concordanza 40 243 Numero di campioni testati tramite PCR SSP anche usata per misurare la concordanza INNOGENETICS9 54 Esecuzione del test usando DNA ottenuto con soluzione primer DRB1 in combinazione con protocollo PCR I A B Bw4 C DRB1 DRB1 03 11 13 14 Allo scopo di valutare l equivalenza tra dei protocolli PCR e Il sono stati testati in sede quarantadue campioni utilizzando entrambi i metodi prodotti PCR di entrambi i protocolli hanno dato risultati di tipizzazione identici per tutti i campioni Esecuzione dei test usando DNA ottenuto con soluzione primer DRB1 03 11 13 14 in combinazione con protocollo PCR A B Bw4 C DRB1 DRB1 03 11 13 14 L esecuzione del test della soluzione primer DRB1 03 11 13 14 di INNO LiPA HLA DRB1 Plus s
164. zioni di alcuni alleli possono portare ad una combinazione di sonde non unica e quindi fornire una risposta ambigua per due o pi combinazioni INNOGENETICS9 52 alleliche possibili La conoscenza delle frequenze alleliche della popolazione in studio indicher il tipo DRB1 pi probabile Nel caso sia richiesta una tipizzazione in alta risoluzione utilizzare il kit decoder INNO LiPA HLA DRB I nuovi alleli possono avere polimorfismi al di fuori delle regioni delle sonde e di questo si deve tenere conto quando si interpretano i risultati La sequenza a livello del sito di legame del primer non conosciuta per tutti gli alleli Il rischio di mismatch a livello del sito di legame del primer da considerarsi molto basso tanto che un fallimento del primer non mai stato osservato e sono stati testati pi di 80 alleli appartenenti a tutti i gruppi Tuttavia nel caso di un risultato omozigote deve essere presa in considerazione la possibilit di una perdita allelica Performance del Test Esecuzione del test usando DNA ottenuto con soluzione primer DRB1 in combinazione con protocollo PCR Il DRB1 DRB1 3 4 5 86G 86V DQB1 L INNO LiPA HLA DRB1 stato valutato su campioni di tipizzazione di routine in tre laboratori di tipizzazione tissutale europei e due laboratori Nord Americani Nello studio sono stati testati con INNO LiPA HLA DRB1 un totale di 243 campioni risultati sono stati comparati con tecniche di tipizzazione clas

INNO-LiPA HLA-DRB1 Plus

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