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l`uso degli ultrasuoni alle frequenze terapeutiche - Padis

1. 300 4800 Spettri FTIR zona Amidi Acid Mucleici HIH 3T3 3 MHz _ Ctrl Sonic f SSD 5 cm Sonic 19 SSD 5 em Sonic 20 SSD 5 cm Sonic 44 SSD 5 cm Sonic GO SSD 5 cm 1600 1500 1400 1300 1200 1100 1000 400 ti Sonic 5 SSD 40 cm Sonic 19 550510 cm Sonit 30 S5010 em Sonic 49 SSD 10 em Sonic BO SSD 10 cm 1600 1500 1400 1200 1200 1100 1000 900 Ctrl Sonic 9 550s 15 cm Sonic 45 SSD 45 cm Sonic 30 SSB 15 cm Sonic 46 S50 15 cm Sonic 60 550515 cm 1600 1500 1400 1300 1200 1100 1000 900 lunghezza d onda fcm 14 Figura 5 11 spettro FTIR delle regione amidica e nucleotidica per esposizioni a US a 1 MHz e 3 MHz Per quanto riguarda la regione spettrale corrispondente alle bande P e P2 compresa tra 1500 1300 cm la figura 5 12 mostra l analisi PCA applicata alla derivata seconda degli spettri ottenuti per esposizione ad US alla frequenza di 1 MHz alla distanza campione trasduttore di 5 cm per tutti 1 tempi di esposizione I risultati mostrano che per questa configurazione espositiva la sonicazione sembra agire in maniera significativa per esposizioni ai tempi 5 e 60 La figura 5 13 mostra lo scatter plot per 1 dati spettroscopici nella stessa regione relativi alla esposizione ad US alla distanza SSD 10 cm In questo caso possibile rilevare una ampia separazione spaziale tra 1 punti dello score plot corrispondenti alle esposizioni per 1 tempi di 5 e 30
2. 2 5 cio devono contenere il 75 dell integrale spaziale della pressione acustica quadratica media Il valore di Agcs dunque dato da Agcs ZN s 2 6 dove s la distanza tra punti successivi dello scan e n derivato dalla 2 5 considerando tutti 1 punti che contengono il 75 del valore quadratico medio della potenza acustica totale pmst In finale l espressione per il parametro ERA pu essere scritta secondo la relazione ERA Si Ea Agcs 9 3 Fan s 2 7 Per quanto riguarda il parametro Beam Non Uniformity Ratio BNR esso rappresenta il rapporto tra l intensit di picco massimo nel campo acustico e l intensit media spaziale nel fascio BNR in accordo con la norma CEI EN 61689 2009 pari al rapporto tra il quadrato della massima pressione acustica rms Pmax rilevato nell intero campo acustico e la media spaziale del quadrato della pressione acustica rms ove la media spaziale presa sull area ERA Ai sensi della suddetta norma il parametro BNR definito come _ Panax ERA BNR 2 8 pmst s dove s lo step con cui viene effettuato il raster scan e pmst la pressione acustica quadratica media totale In particolare pmst riportato nella 2 4 mentre Pmax ricavato dai dati sperimentali e corrisponde al voltaggio massimo rilevato nel campo di misura Il prodotto pmst s calcolato mediando sull area del raster scan i valori di pressione quadratici rilevati nel piano a 0
3. 153 7 e 204 9 J cm riferibili appunto alla distanza campione trasduttore SSD 15 cm per 1 tempi t 45 e 60 anche con questa rappresentazione si evidenzia che le suddette configurazioni espositive appaiono essere quelle pi significative in termini di effetto spettroscopico indotto da esposizione ad US alla frequenza di 1 MHz 54 Itestdi vitalit del Trypan Blue risultati sperimentali Il test di esclusione del Trypan Blue permette di misurare la vitalit dei campioni cellulari a seguito di esposizione all agente fisico Il test stato eseguito subito dopo l esposizione al campo acustico per entrambe le frequenze di esposizione 1 MHz e 3 MHz per le tre distanze SSD 5 10 15 e per tutti 1 tempi t 5 15 30 45 60 153 Il test di vitalit per 1 campioni trattati stato effettuato sempre in concomitanza con 1 rispettivi controlli I risultati sono riportati nelle tabelle 5 3 e 5 4 per quanto riguarda rispettivamente le esposizioni ad US a 1 MHz 75 High e 3 MHz 100 High 1 MHz 75 High aaa Vitalit dei campioni sonicati Tempo di n dei SSD 5 cm SSD 10 cm SSD 15 cm esposizione campioni 1 0 09 W cm I 0 08 W cm I 0 06 W cm CTRL D Tabella 5 3 vitalit dei campioni esposti alla frequenza di 1 MHz I corrisponde a intensit incidente sul campione in corrispondenza della relativa SSD a 3 MHz 100 High SO A N ro dei SSD 10 cm SSD 15 cm esposizione campioni I 0 03 W cm I 0
4. P cF cgAm 2 11 dove c la velocit del suono nel fluido di propagazione 1482 36 m s dipendente dalla temperatura F la forza di radiazione sul target nella direzione di propagazione dell onda incidente g accelerazione di gravit Am l apparente variazione della massa bersaglio Pye 1996 suggerisce di effettuare una calibrazione annuale con il metodo della bilancia a forza di radiazione riferibile al National Physical Laboratory NPL Le linee guida IPSM 1988 raccomandavano addirittura una calibrazione completa ogni 3 mesi IEC 2317 06 Key 1 balance 2 balance control 3 transducer 4 target 5 transducer support 6 water vessel 7 generator and amplifier 8 voltage measurement Figura 2 8 bilancia a forza di radiazione 2 1 3 Normativa sugli ultrasuoni in estetica Come abbiamo visto precedentemente gli US sono utilizzati sia in estetica medica che in estetica non medica Per entrambi 1 settori va evidenziata l assenza di norme tecniche specifiche volte a dare indicazioni sulle definizioni delle quantit fisiche utili per determinare le caratteristiche di output dei sistemi sui valori massimi di tali grandezze e sulle modalit di effettuazione delle misure in analogia con le norme precedentemente trattate per la fisioterapia ossia CEI EN 60601 2 5 e CEI EN 61689 SI In teoria per alcune tipologie di strumenti utilizzati in estetica le quantita fisiche che descrivono l energia emessa dai
5. calceina sono nettamente distinte da quelle che legano IP figura 5 53 Figura 5 52 immagini del monostrato del campione sonicato 3 MHz alla distanza SSD 10 cm per t 30 171 Figura 5 53 immagini del monostrato del campione sonicato 3 MHz alla distanza SSD 10 cm per t 30 con IP 5 6 2 3 Risultati per esposizioni a 3 MHz 100 High SSD 10 cm t 45 La figura 5 54 mostra 1 risultati dell esposizione a SSD 10 cm per 45 I risultati mostrano una scarsa internalizzazione della calceina e mortalita cellulare comparabile con il controllo figura 5 55 Figura 5 54 immagini del monostrato del campione sonicato 3 MHz alla distanza SSD 10 cm per t 45 Figura 5 55 immagini del monostrato del campione sonicato 3 MHz alla distanza SSD 10 cm per t 45 con IP 172 5 6 2 4 Risultati per esposizioni a 3 MHz 100 High SSD 10 cm t 60 La figura 5 56 mostra le immagini relative all esposizione dei campioni cellulari ad US a SSD 10 cm per 60 I risultati mostrano anche in questo caso una scarsa internalizzazione della calceina nelle cellule esposte e una mortalita cellulare anch essa non dissimile rispetto al controllo Figura 5 56 immagini del monostrato del campione sonicato 3 MHz alla distanza SSD 10 cm per t 60 5 6 2 5 Risultati per esposizioni a 3 MHz 100 High SSD 15 cm t 30 t 45 e t 60 Le figure 5 57 5 58 e 5 59 mostrano 1 risultati dell esposizione dei campioni ad US alla frequen
6. considerato come uno dei metodi migliori per valutare 1 danni genotossici nella cellula a livello cromosomico in base alla capacita dell agente fisico in esame di aumentare la frequenza di cellule nei campioni esposti in cui sono presenti questo tipo di inclusioni Fenech 2000 I micronuclei sono corpi citoplasmatici di forma rotonda o ovale contenenti cromatina a seconda del contenuto di cromatina possono avere un diametro variabile tra 1 5 e 1 20 del diametro cellulare Queste inclusioni si possono trovare in ogni tipo di cellula fuori dal nucleo nel citoplasma assomigliano al nucleo per forma struttura e caratteristiche di colorazione si usa il termine micronuclei proprio a causa delle loro dimensioni ridotte rispetto al nucleo principale I micronuclei vengono espressi in cellule che hanno completato la loro divisione nucleare quindi sono osservabili nella fase del ciclo cellulare in cui la cellula binucleata Il rilevamento dei danni X citotossici a carico di cellule trattate rilevabile solo in cellule eucariote in divisione in altre parole 11 protocollo non utilizzabile 11 cellule che non si dividono o in cui la cinetica della divisione cellulare non ancora ben conosciuta o controllata Tra 1 protocolli sviluppati il pi semplice e pi utilizzato il Cytokinesis Block Micronucleus CBMN con citochinesi si intende il processo mediante 11 quale 11 citoplasma di una singola cellula viene distribuito tra due ce
7. son_El Son_5 son 15 son 30 son 4s son_60l Rea Acidi nucleici NIH 3T3 1 MHz 75 Rea Acidi nucleici NIH 3T3 3 MHz 100 e Fp4 550 5 cm tt Fp4 550 10 cm A Fip4 SSD 15 cm Fp4 SSD 5 cm a Rp4 SSD 10 cm Rp4 SSD 15 cm son 5 son 15 son 3 son 45 san 6 Son_5 Son_15 Son_30 Son 45 Son_60 Figura 5 29 andamento del parametro Rp in funzione del tempo di sonicazione per esposizioni della linea cellulare a 1 MHZ e a3 MHz alle 3 distanze SSD 5 10 15 cm Si osserva che lo stretching asimmetrico del gruppo PO valutato dal parametro R 3 presenta per la frequenza di 1 MHz variazioni per quasi tutti 1 tempi di sonicazione indipendentemente dalla distanza di sonicazione SSD In accordo con l analisi statistica possibile individuare le configurazioni espositive che determinano variazioni significative nelle aree dei campioni trattati rispetto ai controlli in SSD 5 cm t 15 SSD 10 cm sonicazione t 30 e 60 e SSD 15 cm t 45 e 60 Per la frequenza di 3 MHz 1 parametri Rp3 e Rp4 non mostrano variazioni importanti eccetto che per le distanze SSD 5 e tempi di esposizione pari a 60 5 3 4 Risultati complessivi delle misure di spettroscopia FTIR Le misure di spettroscopia FTIR su campioni biologici esposti ad US alle frequenze di 1 MHz e 3 MHz hanno consentito di rilevare variazioni conformazionali di gruppi funzionali nella regione dei lipidi
8. AI fine di ottimizzare 1 trattamenti fisioterapici con US sulla cui reale efficacia esistono ancora ampi margini di incertezza si evidenzia la necessit di implementare ulteriori studi sia clinici che 66 di laboratorio volti a determinare 1 meccanismi di azione ed 1 benefici dei trattamenti nonch a valutare 1 rischi connessi alle esposizioni Infine per quanto riguarda l intensit effettiva massima stabilita dalla norma CEI EN 60601 2 5 in 3 W cm sarebbe auspicabile che nella norme tecniche venisse evidenziato che il limite prescritto non una garanzia di assoluta innocuita del trattamento a tal proposito si sottolinea l importanza di programmare ricerche finalizzate a sottoporre a conferma il valore di 3 W cm dal momento che dalla letteratura scientifica sul tema si evince la presenza di limitati riferimenti bibliografici peraltro datati nel tempo Il valore della massima intensit efficace stato definito sulla base di studi su animali riportati dalla OMS WHO 1982 che indicano che gli effetti benefici degli US possono essere ottenuti utilizzando intensit inferiori a 3 W cm tuttavia la stessa WHO segnala che difficile effettuare una chiara valutazione rischio beneficio delle esposizioni agli US terapeutici perch sono stati condotti pochi studi clinici finalizzati a determinare 1 benefici dei trattamenti Come sottolinea Duck 2007 l esposizione prolungata dei tessuti ad un intensit di 3 W cm
9. Speed 2001 Secondo l autore nel trattamento ad US ci sono molte variabili tecniche che possono agire come fonti di errore tra queste l inadeguatezza della calibrazione per 1 macchinari la progettazione degli studi clinici in termini ad esempio di spettro troppo ampio di patologie all interno del gruppo in studio inadeguatezza nella durata del follow up nella dimensione del campione il dosaggio degli US inappropriato e variabile nei differenti studi e per differenti trattamenti ecc In effetti dalla letteratura s1 evidenzia variabilit nelle modalit con cui vengono eseguite le terapie ad US come sottolineato da ter Haar 2007 inizialmente l utilizzo degli US era pensato come un metodo di trattamento diatermico alternativo ad altri metodi quale l utilizzo di radiazione elettromagnetica per l induzione di un moderato riscaldamento Nel corso del tempo 1 regimi di trattamento sono stati modificati nel tentativo di utilizzare meccanismi benefici non termici utilizzando intensit inferiori e fasci di US pulsati Tuttavia a causa della carenza di studi clinici scientificamente progettati il regime di trattamento ultrasonico spesso determinato in modo empirico e secondo la ricetta particolare di ogni singola struttura Fino a quando non sar disponibile un maggior numero di studi scientifici rigorosi il meccanismo con cui il beneficio terapeutico se esiste ottenuto rester oggetto di speculazione e non sar p
10. complementare alla disciplina della direttiva Bassa Tensione quest ultima relativa alle garanzie di sicurezza che deve possedere 11 materiale elettrico destinato ad essere utilizzato entro dati limiti di tensione e secondo precise classi di infiammabilita La marchiatura CE sui dispositivi utilizzati nell estetica non medica attesta pertanto la rispondenza del prodotto alle Direttive BT e ECM le attrezzature che non soddisfano 1 requisiti previsti dalle suddette Direttive non possono essere commercializzate importate e messe in servizio nella UE 2 1 3 1 1 La norma tecnica CEI 62 39 La Norma CEI 62 39 Apparecchi elettrici per uso estetico Guida generale per la sicurezza non fa alcun riferimento agli US ma specifica in generale le prescrizioni per la sicurezza degli apparecchi elettrici per uso estetico ossia uso corretto dei macchinari avvertenze precauzioni da adottare uso improprio manutenzione spiegazione dei simboli normativi 22 Il normale utilizzo degli apparecchi per uso estetico da parte di un operatore estetico prevede una o pi parti applicate al soggetto da trattare che entrano in contatto fisico o elettrico con soggetto trattato e o trasferiscono energia verso o dal soggetto trattato La norma fornisce pertanto la definizione di parte applicata ossia 11 complesso di tutte le parti dell apparecchio compresi 1 conduttori collegati al soggetto trattato che vengono intenzionalmente messe in contatto con 1l so
11. max distance from transducer s Fresnel zonc Fraunhofer zone gt Figura 2 7 andamento spaziale del campo ultrasonoro generato da un generico trasduttore circolare Per una sorgente a disco ed un eccitazione sinusoidale la distribuzione del campo emesso piuttosto complessa e caratterizzata dalla presenza di due zone la zona cosiddetta di campo vicino o zona di Fresnel e la zona cosiddetta di campo lontano o zona di Fraunhofer Nella zona di Fresnel in cui il punto di osservazione prossimo alla superficie del trasduttore il fascio collimato cio la dimensione globale del fascio rimane relativamente costante anche se al suo interno la distribuzione dell intensit assiale presenta variazioni molto complesse con un certo numero di massimi la cui distanza diminuisce avvicinandosi alla sorgente e che si trovano in corrispondenza di e 4a 2m 1 di 44 2m 1 2 1 con m numero intero che cresce verso la sorgente e a raggio del trasduttore Questa zona seguita da una zona detta di campo lontano dove il fascio diverge e si registra un andamento dell intensit inversamente proporzionale alla distanza La figura 2 7 illustra il passaggio dalla regione di campo vicino a quella di campo lontano La distribuzione di campo lungo l asse di un trasduttore tale che possibile riscontrare un picco di intensit ad una distanza dalla superficie emittente data da 47 B 4a N Z i 4A 2 2 L esiste
12. Ba N LTS WN Figura 5 32 frequenze dei micronuclei dei campioni sonicati alla frequenza di 3 MHz per le 3 distanze SSD con esplicitate le relative intensita incidenti sul campione e per 5 15 30 45 e 60 minuti di esposizione I risultati mostrano che tutti 1 campioni esposti presentano frequenze di micronuclei maggiori del controllo eccetto che per 1 campioni sonicati per 5 minuti a SSD 10 e 15 cm nessuna differenza risultata statisticamente significativa E stata riscontrata una correlazione statisticamente significativa tra il tempo di esposizione e la frequenza dei micronuclei dei campioni esposti alla distanza SSD 5 cm r 0 9083 p 0 0122 alla distanza di 10 cm r 0 9722 p 0 0011 e a SSD 15 cm r 0 9969 p 0 00001 156 3 MHz 100 High Tempo di N ro di Micronucleated cells Binucleated cells Standard Deviation SSD 5 cm SSD 10 cm SSD 15 cm I 0 03 W cm I 0 01 W cm I 0 009 W cm 2 07 1 16 1 87 0 64 2 0 0 8 2 13 0 64 2 2 esposizione campioni 2 25 1 04 2 88 1 13 2 5 0 9 2 51 07 3 0 0 9 2 63 1 19 Tabella 5 6 frequenze dei micronuclei dei campioni sonicati alla frequenza di 3 MHz per le 3 distanze SSD e per 5 15 30 45 e 60 minuti di esposizione I intensit incidente sul campione in corrispondenza della selezionata SSD 2 13 0 83 2 38 1 06 2 38 0 92 e gt ELE i e Tali esperimenti mostrano che la sonicazione puo produrre danni genotossici e il principale meccanism
13. CH3 terminale dei fosfolipidi di membrana L2 2920 Stretching asimmetrico di CH nel gruppo metilene CH2 dei fosfolipidi di membrana Stretching simmetrico di CH nel gruppo metile CH3 nei lipidi di L3 2875 membrana L Stretching simmetrico di CH nel gruppo metilene CH presente negli acidi grassi dei fosfolipidi di membrana 4 AMIDE I C O stretching accoppiato al bending nel piano di NH dell Amide I DRD DR NH bending accoppiato con lo stretching di C N dell Amide II proteine 1455 CH bending dei gruppi metilene CH3 nei lipidi p2 1395 CH bending del gruppo metile CH nei lipidi di membrana e in alcune proteine cellulari Stretching asimmetrico dei gruppi fosfato PO presenti negli acidi nucleici Stretching simmetrico dei gruppi fosfato PO presenti negli acidi nucleici e in particolare nel DNA e in alcuni lipidi fosforilati C O e C C stretching per lo scheletro del DNA Tabella 5 1 assegnazione delle bande caratteristiche dello spettro di cellule viventi Il comportamento spettrale di ciascuna regione attribuita a lipidi 3000 2800 cm alle proteine bande dell amide I e II centrate rispettivamente a 1660 cm e 1545 cm ai fosfolipidi di membrana 1500 1300 em e gli acidi nucleici 1300 950 em stato analizzato per misurare le possibili variazioni relative al numero d onda del picco all area delle bande spettrali rispetto alle stesse bande nello spettro dei controlli Lo studio delle
14. Phosphate Buffered Saline una soluzione salina in grado di non alterare la pressione osmotica delle cellule e di mantenere costante 11 pH 3 si aggiunge un volume di tripsina necessario per coprire il monostrato da 500 ul a 1 ml a seconda delle dimensioni della flask si muove la piastra per assicurare un omogenea distribuzione si incuba a 37 C per 1 2 minuti 4 una volta staccate le cellule vengono risospese nel terreno di coltura 5 si spipettano le cellule per rompere meccanicamente gli eventuali agglomerati e si procede ad aliquotare le quantita cellulari necessarie per il passaggio Dopo alcune prove preliminari si deciso di preparare 1 campioni partendo sempre da una situazione di confluenza per la coltura Una coltura di cellule adese raggiunge la confluenza quando il monostrato compatto su tutto il recipiente di coltura I campioni sono stati preparati sempre partendo da una situazione di confluenza ma facendo attenzione a non portare mai la coltura nella fase in cui il campione cambia pH per l eccessivo sfruttamento del terreno fase che corrisponde ad 99 uno stato di latenza del ciclo cellulare fase Go in cui le cellule escono temporaneamente dal ciclo La necessita di avere misure su un insieme statistico di cellule ha portato a mantenere la coltura sempre al di sotto di questa fase I campioni per tutte le misure di questo lavoro sono stati fatti crescere in piastre petri di diametro 3 5 cm 4 2 Esposizi
15. amidi SSD 15 cm son 45 amidi SSD 15 cm son 60 _ amidi SSD 15 cm 1 1480 1530 1580 1630 1680 1 0 5 0 0 5 lunghezza d onda cm 1 PC1 93 Figura 5 20 PCA su dati spettroscopici per esposizione a US a 1 MHz SSD 15 cm regione amidica Per analizzare gli effetti degli US sulla struttura secondaria del contenuto proteico delle cellule nella figura 5 21 viene riportato l andamento del parametro R riferibile alle equazioni 5 2 e 5 3 per la frequenza di sonicazione di 1 MHz e per le tre distanze campione trasduttore investigate SSD 5 10 15 cm 145 NIH 3T3 1 MHz 52 SS0 10 cm tempo min B alpha helix Mbeta sheet Oturns Ounordered aggrstrands Figura 5 21 variazioni nelle strutture secondarie nella regione dell Amide I per esposizione a US a 1 MHz La figura 5 22 si riferisce al medesimo parametro calcolato per la frequenza di sonicazione di 3 MHz In particolare le variazioni del rapporto tra percentuale di struttura secondaria del campione sonicato e percentuale di struttura secondaria del controllo sono state graficate in funzione del tempo di esposizione per entrambe le frequenze Le variazioni dei rapporti tra le strutture secondarie considerate sono quelle relative alle alfa eliche ai foglietti beta ai turns alle strutture disordinate e agli aggregati strands 146 o a 10 Pi di Gal E ia n i E rel UT O38 ee ee ee 0 4 j 15 ap 45 Bt 0 0 5 tempo
16. ascissa riporta l intensit di fluorescenza e ordinata la frequenza ovvero il numero di eventi che esprimono tale propriet Dall istogramma a due parametri dei campioni misurati possibile ricavare la percentuale di cellule vive delimitando una regione denominata R1 o R2 ecc che consente di stabilire un gate soglia oltre il quale le cellule sono considerate positive a IP e quindi morte L istogramma ad un parametro consente la determinazione quantitativa degli eventi considerati positivi per la fluorescenza della calceina attraverso il posizionamento di un marker M1 che 176 definisce un gate sul campione di controllo il parametro Gated MI fornisce la percentuale degli eventi che cadono all interno del gate prefissato nei campioni sonicati 5 7 1 Risultati sperimentali per esposizione ad ultrasuoni a 1 MHz 75 High In figura 5 60 riportato l istogramma a due parametri registrato per 11 campione di controllo 1l quale mostra che la maggior parte dei conteggi spostata nel quadrante in basso a sinistra in cui sono posizionate le cellule vive negative per la calceina e per lo Ioduro di Propidio C PT La figura 5 60 evidenzia inoltre l estensione e il posizionamento per il campione di controllo della regione RI che identifica la vitalit cellulare all interno della quale la percentuale di cellule vive dell 89 7 L istogramma ad un parametro mostra che l intensit della fluorescenza dell
17. l utilizzo di US sulla colonna vertebrale in particolare in prossimit di aree dove sono state eseguite laminectomie NCRP 1983 La terapia a US non deve essere applicata a fegato ovaio testicolo che possono risultarne gravemente danneggiati Occorre evitare di esporre ad US pazienti con particolari stati patologici nei quali la ultrasuonoterapia pu interferire con l evoluzione della malattia o con la terapia in atto In particolare va evitata l esposizione in pazienti con vasi sanguigni in cattive condizioni per 1 quali gli impulsi ultrasonori possono danneggiare le deboli pareti dei piccoli capillari o creare scompensi 59 pressori localizzati alle zone trattate affetti da osteoporosi grave per il rischio di danneggiamenti delle ossa colpite da tale patologia Sono da rilevare controindicazioni all uso degli US in pazienti con ridotta sensibilita nervosa o patologie neurologiche ai quali la ridotta sensibilita cutanea puo impedire di avvertire il dolore in caso di malfunzionamenti dell apparecchio ad US Per pazienti affetti da arteriopatie obliteranti o emofilia la terapia ultrasonica pu determinare un aumento della fluidit del sangue e locali scompensi pressori Inoltre deve essere prestata attenzione a non irradiare con US 1 tessuti neoplastici in quanto vi evidenza che inappropriati riscaldamenti possono stimolare la crescita del tumore o promuovere metastasi Hynynen 1981 L esposizione ad US non dovre
18. la frequenza acustica di lavoro iv il rapporto di non uniformit del fascio v la durata degli impulsi v1 il periodo di ripetizione degli impulsi vii l indicazione quantitativa della potenza d uscita viii l indicazione quantitativa dell intensit effettiva 2 1 2 2 La norma CEI EN 61689 La norma CEI EN 61689 2009 Ultrasuoni Sistemi per fisioterapia specifiche di campo e metodo di misura nel campo delle frequenze comprese tra 0 5 MHz e 5 MHz definisce 1 parametri utili per la valutazione delle performances di un apparato per fisioterapia emittente US indicando le modalit di effettuazione delle misurazioni a garanzia del rispetto dei requisiti di sicurezza previsti dalle norme precedentemente trattate AI fine della valutazione delle caratteristiche di output di un apparato emittente US la norma evidenzia la necessit di conoscere un certo numero di quantit fisiche che caratterizzano la funzionalit dello stesso la frequenza di trattamento il pulse timing l area effettiva radiante ERA l intensit effettiva il beam non uniformity ratio BNR la potenza acustica Molte di queste quantit sono facilmente misurabili ad esempio la frequenza di trattamento pu essere determinata utilizzando un oscilloscopio mentre l ERA e il BNR necessitano di misure particolari da effettuare con l ausilio di un idrofono L area effettiva radiante ERA un parametro che definisce l area prossima alla faccia del t
19. nella variazione dei parametri R in corrispondenza del tempo di esposizione t 30 Si evidenzia un differente assorbimento dei modi di stretching e bending del gruppo CH alla frequenza di 1 MHz con diminuzione dell assorbanza dei modi di stretching R1 e un aumento dell assorbanza del modo di bending Rp dei campioni sonicati rispetto al controllo Va sottolineato che la distanza con variazioni pi rilevanti in entrambi 1 casi SSD 15 cm 1 MHz t 45 Per la frequenza di 3 MHz aumenti dell assorbanza per le 2 bande P e P2 sono rilevabili per la distanza SSD 10 cm e per tempi di sonicazione pari a 30 e 60 in accordo con quanto ottenuto dall analisi statistica Quindi in generale possiamo concludere che gli US a 1 MHz e a 3 MHz su fibroblasti sembrano produrre effetti sulla struttura lipidica pi evidenti per la frequenza di 1 MHz prevalentemente in corrispondenza delle configurazioni espositive SSD 5 cm t 60 e SSD 15 cm e il tempo di sonicazione di 45 per la frequenza di 3 MHz in corrispondenza della distanza SSD 10 cm e per il tempo di sonicazione pi lungo pari a 60 5 3 2 Effetti degli ultrasuoni sulle strutture dell Amide I e Amide II Lo studio delle bande Amide I e Amide II mediante spettroscopia IR utile in quanto ci permette di osservare eventuali variazioni nell assorbimento da parte di strutture proteiche presenti nella cellula In figura 5 11 sono gi stati riportati gli spettri registrati nell
20. peggiore il pattern di uscita che 1l dispositivo determina con possibile creazione di hot spot e quindi disomogeneit Idealmente il fascio ultrasonoro dovrebbe avere una sezione trasversale uniforme in realt basta osservare il pattern di uscita di generici trasduttori circolari Fyfe 1986 figura 2 4 area 5 cm operanti alle frequenze di 1 5 MHz e 3 MHz ottenuto effettuando uno scan con un idrofono alla distanza di cm dalla faccia del trasduttore in un piano normale al fascio per osservare che il campo ultrasonoro prodotto da tali dispositivi molto disomogeneo e non uniforme 1 5 MHz 3 0 MHz Figura 2 4 pattern di uscita di generici trasduttori circolare di area 5 cm operanti alle frequenze di 1 5 MHz e 3 MHz ottenuto facendo uno scan con un idrofono alla distanza di 1 cm dalla faccia del trasduttore in un piano parallelo alla faccia del trasduttore La figura 2 5 in particolare mostra le variazioni spaziali dei profili del fascio emesso da generici trasduttori ad US costruite riportando gli scan della pressione ultrasonora effettuati in un piano normale al fascio in corrispondenza del punto di massimo assiale zx Ferrari 2010 B 2 B 3 SENSNRALE 10 H a r tea Fai di A o 2 2 y 2 o 8 Figura 2 5 immagini del fascio acustico di generici apparecchi ad US rilevate in corrispondenza del piano relativo all ultimo di massimo della pressione zy a evidenzia una forma geometrica reg
21. 0 00001 MHz Posizione dell ultimo massimo assiale Area effettiva radiante ERA 14 79 cm2 20 Tabella 3 9 risultati per il trasduttore a 3 MHz frequenza 3 1 MHz Considerando l impiego di tali dispositivi per trattamenti estetici quanto riscontrato sperimentalmente richiede particolare attenzione per valutare gli effetti nonch l efficacia del trattamento stesso In figura 3 24 riportato il confronto dei due raster scan a 0 3 cm dalla faccia del trasduttore alle 2 frequenze indagate ossia 3 1 MHz e 3 158 MHz si osserva una maggiore irregolarit del campo di pressione prodotto alla frequenza di 3 1 MHz accompagnato tuttavia da una complessivo 94 abbassamento del livello di pressione anche se non cos evidente come nel caso del trasduttore ad 1 MHz Come specificato per il trasduttore a 1 MHz ci potrebbe essere causa di una ridotta efficacia del trattamento stesso Raster scan 3mm freq 3 1 MHz Raster scan 3mm freq 3 158MHz 15 PP Tg Urms V 10 3 000E 04 i 0 003300 wom 0 006300 F 0 009300 STO YA PAR SN 0 01230 E o JA ARIA I I Me 0 i 0 01530 23 0 01830 0 02130 0 02430 0 02730 L 0 03000 45 10 5 0 5 0 15 20 30 25 20 15 10 5 0 5 10 15 20 25 A mm mm 25 20 Figura 3 24 confronto tra i raster scan a 0 3 cm per f 3 1 MHz e 3 158 MHz Come precedentemente riportato anche su questo sistema stata effettuata presso INRIM Torino
22. 1 risultati dello studio mostrano che la potenza di uscita misurata differisce dalla potenza dichiarata pi di quanto ammesso dalla norma per 11 59 delle macchine testate da cui si evince che circa un paziente su due riceve una dose differente da quella prescritta dal fisioterapista L inaccuratezza delle apparecchiature esaminate risultata essere correlata alla loro et e alla frequenza con cui sono effettuate le calibrazioni Pye 1994 ha testato 85 macchinari ad US trovando che il 69 aveva potenze di uscita che differivano di oltre il 30 dai valori impostati riportati dal costruttore Secondo Pye 1996 caratterizzare un macchinario per terapia ad US alla massima potenza di uscita pu non essere sufficiente a caratterizzare completamente le prestazioni dell apparato stesso ed evidenzia la necessit di calibrare gli strumenti sull intero intervallo delle impostazioni di potenza utilizzate nella terapia clinica sia in onda continua che pulsata In particolare Pye 1994 ha analizzato 36 teste di trattamento trovando 11 di esse con meno di 5 anni di anzianit di esercizio correttamente calibrate in onda continua ma con problemi in onda pulsata Nel lavoro si evidenzia la necessit di un rigoroso programma di test e calibrazione di macchine per la terapia quale strumento 64 importante per la sicurezza dei pazienti e per l efficacia dei trattamenti Pye auspica che ogni strumento sia venduto con un certificato di calibrazi
23. 1 2 3 5 MHz sembra prendere a riferimento il limite di intensit effettiva massima per gli US per trattamenti fisioterapici e riferibile alla norma CEI 60601 2 5 pur non trattandosi di trattamenti medici Premesso che il decreto interministeriale contiene 11 nuovo elenco delle apparecchiature utilizzabili in estetica a cui corrispondono limitazioni e divieti all uso va rilevato che esso non limita la possibilit di costruire tali apparecchiature in Italia che possono essere esportate in altri Paesi 2 3 2 3 Applicazioni domestiche Il decreto n 110 del 2011 pur non consentendo alle estetiste la possibilit di eseguire trattamenti ad US in regime di cavitazione non limita la possibilit di comprare apparecchiature non ammesse nei centri estetici da parte di privati ad uso domestico Inoltre con una semplice ricerca su Internet possibile verificare che sono presenti numerosi siti in cui 1 dispositivi ad US per estetica in regime di cavitazione sono disponibili a costi accessibili gli utenti anche privi di specifica competenza possono pertanto procedere all acquisto sottoponendosi in regime fai da te ad un agente fisico potenzialmente pericoloso per la salute Da qui anche la necessit di avviare ricerche e studi scientifici che possano finalmente verificare la presenza assenza di pericoli o di rischio danno per l esposizione con finalit estetiche all agente fisico US 71 2 3 3 Proposte per il superamento delle
24. 1 MHz 75 in termini di dose 5 6 2 Risultati per esposizione ad ultrasuoni a 3 MHz 100 High Anche per questo esperimento il campione di controllo non ha evidenziato uptake del fluoroforo 5 6 2 1 Risultati per esposizioni a 3 MHz 100 High SSD 5 cm t 30 t 45 e t 60 Le figure 5 49 5 50 e 5 51 mostrano 1 risultati dell esposizione ad US a 3 MHz SSD 5 cm e tempi di esposizione 30 45 e 60 Figura 5 49 immagini del monostrato del campione sonicato 3 MHz alla distanza SSD 5 cm per t 30 169 Figura 5 50 immagini del monostrato del campione sonicato 3 MHz alla distanza SSD 5 cm per t 45 Figura 5 51 immagini del monostrato del campione sonicato 3 MHz alla distanza SSD 5 cm per t 60 170 Per tutte le configurazioni espositive si osserva scarso uptake della calceina e una mortalita cellulare leggermente superiore rispetto al controllo 5 6 2 2 Risultati per esposizioni a 3 MHz 100 High SSD 10 cm t 30 La figura 5 52 mostra 1 risultati dell esposizione a SSD 10 cm per 30 In particolare vengono riportati due esempi di monostrato in contrasto di fase seguiti dallo stesso campo in fluorescenza Anche in corrispondenza di questa configurazione espositiva si osserva una scarsa internalizzazione del fluoroforo L inserimento di IP sul campione cellulare evidenzia un aumento della mortalit cellulare rispetto al controllo mostrando comunque che le cellule che hanno internalizzato la
25. 10 cm 45 Semel Figura 5 64 vitalit cellulare per esposizioni ad US alla frequenza di 3 MHz nelle varie configurazioni espositive 5 8 Microscopia confocale risultati sperimentali Con la finalit di confermare che in accordo con la letteratura la calceina entra uniformemente all interno delle cellule stato utilizzato un microscopio confocale che fornisce sottili sezioni ottiche dei campioni cellulari a garanzia che le cellule che internalizzano il fluoroforo sono vitali stato utilizzato lo ioduro di propidio 10 ul inserito all interno del campione al termine della sonicazione e successivamente all acquisizione delle immagini in fluorescenza della calceina 181 AI fine di eliminare sovrapposizioni nella fluorescenza emessa dai due fluorofori in esame calceina A picco massimo di assorbimento 494 nm e picco massimo di emissione 514 nm e IP A picco massimo di assorbimento 535 nm e A picco massimo di emissione 617 nm sono stati eccitati da due linee di laser a ioni argon lunghezza d onda di eccitazione rispettivamente 458 e 543 nm ed un intervallo di emissione compreso tra 490 e 550 nm per la calceina e tra 550 650 nm per IP figura 5 65 60 40 20 300 Figura 5 65 Lunghezze d onda di assorbimento ed emissione per calceina e IP In figura 5 66 riportata un immagine del campione di controllo non sonicato marcato con calceina 10 uM per t 30 successivamente il campione stato
26. 109 Gli spettri di cellule NIH 3T3 sono stati acquisiti in modalita Trasmissione A questo scopo le cellule sono state coltivate in piastre petri su una finestra di CaF I vetrini di diametro 2 5 cm sono stati polilisinati perche la polilisina agevola l adesione delle cellule in monostrato sulla superficie di CaF I campioni sono stati preparati secondo la procedura seguente 1 l operazione iniziale quella di tripsinizzazione e risospensione delle cellule 2 1 vetrini polilisinati vengono depositati nelle petri di diametro 3 5 cm 3 un aliquota di cellule in sospensione viene depositata sul vetrino 4 vengono aggiunti 3 ml di terreno nella petri con vetrino 5 1 campioni cosi preparati vengono incubati per 2 3 giorni a 37 C il tempo di incubazione varia al variare della quantit di campione depositato Soltanto dopo che le cellule formano un monostrato uniforme sulla finestra di CaF sono pronte per essere sonicate 6 eliminazione del terreno di coltura che presenta assorbimenti nella regione dell infrarosso tra 900 cm e 4000 cm il vetrino viene asportato dalla petri di coltura e in un altra petri viene effettuato un lavaggio in PBS per minuto 7 asciugatura del vetrino 8 una volta asciugato il vetrino pronto per la misura spettroscopica Per ogni prova stato acquisito contemporaneamente ai campioni trattati uno spettro di controllo Per ogni spettro stata usata una risoluzione di 4 cm e sono stat
27. 21 CTRL son 5 _ac nucleici SSD 10 cm 4 0n15 _ac nucleici SSD 10 cm Sson 30 _ac nucleici SSD 10 cm son 45 _ac nucleici SSD 10 cm son 60 _ac nucleici SSD 10 cm 1 0 5 0 05 1 1250 1200 1150 1100 1050 PC1 75 lunghezza d onda cm 1 Figura 5 27 PCA su dati spettroscopici per esposizione a US a 3 MHz SSD 10 cm regione acidi nucleici 0 8 0 3 0 25 0 6 0 2 04 0 15 S 0 2 0 1 co So 0 05 D E A 0 2 2 0 0 05 04 e CTRL B son 5 _ac nucleici SSD 15 cm 0 1 06 ason15 _ac nucleici SSD 15 cm m son 30 _ac nucleici SSD 15 cm 0 15 son 45 _ac nucleici SSD 15 cm 0 8 son 60 _ac nucleici SSD 15 cm 0 2 0 25 1 05 0 05 1 1250 1200 1150 1100 1050 PC1 59 lunghezza d onda cm 1 Figura 5 28 PCA su dati spettroscopici per esposizione a US a 3 MHz SSD 15 cm regione acidi nucleici Anche per le bande spettroscopiche P3 e P4 sono stati valutati 1 parametri spettroscopici Rp3 e Rpg dove Rp3 P3 P3e e Rp4 P4y Puc 1 risultati sono riportati in figura 5 29 Cambiamenti del parametro R con il tempo la distanza e la frequenza di sonicazione denotano variazioni conformazionali dei gruppi fosfato caratteristici degli acidi nucleici 150 Res Acidi nucleici NIH 3T3 1 MHz 75 Rez Acidi nucleici NIH 3T3 3 MHz 100 Rp3 sSD 5 cm m Rps ssD 10 cm _ Rp3 SSD 15 cm Rp3 SS0 5 cm sa Rps S50 10 cm 4 Mp3 SSD 15 cm Son 5 son 15 son 3 Son 45
28. 212 206 E 200 206 Le figure 3 11 e 3 12 mostrano gli stessi parametri di cui sopra su un piano ortogonale all asse z del trasduttore alla distanza di 13 7 cm corrispondente alla posizione dell ultimo massimo assiale Zy 84 Raster scan 137mm freg 1 3MHz Urms VW 2 000E 04 0 002700 0 005200 0 007700 0 07020 i 0 01270 0 071520 0 01770 0 02020 0 02200 Figura 3 11 raster scan 2D tensione rms ai capi dell idrofono misurata sul piano ortogonale all asse di propagazione del fascio a z 13 7 cm dal trasduttore frequenza 1 320 MHz E 236 242 E 230 236 E 224 230 0218 224 0212 218 M 206 212 E 200 206 Figura 3 12 raster scan 3D pressione in dB calcolata sul piano ortogonale all asse di propagazione del fascio a z 13 7 cm dal trasduttore frequenza 1 320 MHz Si evidenzia un lieve errore di centratura del diffusore sul raster scan corrispondente all ultimo massimo In tabella 3 4 sono riportati 1 risultati delle misure con idrofono per il trasduttore alimentato alla frequenza di 1 320 MHz 85 Trasduttore 1 MHz Incertezza Frequenza ottimale di lavoro del diffusore 1 320 MHz 0 00001 MHz Area effettiva radiante ERA 20 Tabella 3 4 risultati per il trasduttore a 1 MHz frequenza 1 320 MHz Il risultato cos ottenuto mostra che il valore di BNR per il trasduttore che lavora a 1 320 MHz rientra nell istogramma dei valori forniti dalla norma individuando
29. 3 cm dalla faccia del trasduttore e nel piano che corrisponde all ultimo massimo assiale zy secondo l equazione 49 pmst s pmst 0 3 5 03 pmst Lx a eer yh 2 9 In finale il parametro BNR puo essere scritto come U x ERA BNR 2 gt _l_ O s DWRr 2 10 pi 47 03 8 03 Di U zah Cz 2 1 2 3 Altre norme la norma CEI EN 61161 Come abbiamo visto 1 dispositivi emittenti US per scopi terapeutici apparecchi elettromedicali sono corredati di schede tecniche contenenti i valori nominali di riferimento dei parametri BNR ERA e della potenza acustica di uscita possibile pertanto valutare le performances degli apparati ad US testando la stabilit dei parametri forniti dal costruttore nel tempo disponendo della adeguata catena di misura Per quanto riguarda la potenza acustica di uscita della testa emittente essa definisce l energia vibrazionale al secondo trasmessa dalla faccia del dispositivo E definita come il rateo con cui l energia emessa dal trasduttore ed misurata in Watt Joule sec La potenza ultrasonora una variabile molto importante poich assieme al tempo di esposizione determina la quantit di energia trasferita al tessuto e quindi l energia applicata al paziente La norma CEI EN 61161 2007 Ultrasuoni Misure di potenza Bilanci della forza di radiazione e requisiti di prestazione specifica un metodo per determinare la potenza acustica totale emessa da trasduttori ad US
30. 90 e il decreto n 110 del 2011 2 1 3 2 Normativa per l estetica medica 2 2 Problematiche connesse con l uso degli ultrasuoni in fisioterapia 2 2 1 Evidenze di efficacia e cautele d uso 15 23 25 29 30 33 35 35 35 39 41 41 43 50 51 52 52 54 56 56 56 2 2 2 Valutazione delle performances degli apparecchi ad ultrasuoni usati in fisioterapia 2 2 3 Criticita connesse agli aspetti di sicurezza 2 3 Problematiche connesse con l uso degli ultrasuoni in estetica 2 3 1 Gli ultrasuoni in estetica medica 2 3 1 1 Il caso francese 2 3 2 Gli ultrasuoni in estetica non medica 2 3 2 1 La cavitazione estetica 2 3 2 2 Applicazioni nei centri estetici aspetti normativi e criticit 2 3 2 3 Applicazioni domestiche 2 3 3 Proposte per il superamento delle problematiche connesse con l uso degli ultrasuoni in estetica PARTE II CAPITOLO 3 Caratterizzazione di dispositivi ad ultrasuoni per fisioterapia ed estetica 3 1 Descrizione delle sorgenti di ultrasuoni 3 2 Caratterizzazione presso INRIM Torino 3 3 Caratterizzazione presso CNR IDASC Roma 3 3 1 Procedure sperimentali e set up di misura 3 3 2 Risultati del diffusore a 1 MHz 3 3 3 Risultati del diffusore a 3 MHz 3 4 Valutazione delle performances di due dispositivi ad ultrasuoni per fisioterapia ed estetica conclusioni CAPITOLO 4 Materiali e metodi per lo studio degli effetti degli ultrasuoni su linee cellulari 4 1 Linea cellulare NIH 3T3 e condiz
31. Ahmadi F McLoughlin IV Chauhan S Ter Haar G Bio effects and safety of low intensity low frequency ultrasonic exposure Prog Biophys Mol Biol 2012 Apr 108 3 119 38 Apfel R E and Holland C K Gauging the likelyhood of cavitation from short pulse low duty cycle diagnostic ultrasound Ultrasound in Med amp Biol 1991 17 2 179 185 Artho P A Thyne J G Warring B P Willis C D Brism e J M Latman N S A calibration study of therapeutic ultrasound units Phys Ther 82 3 2002 257 263 Asher B Safety and efficacy of UltraShape Contour I treatments to improve the appearance of body Contours multiple treatments in shorter intervals Aesthetic Surgery Journal 2010 30 2 217 224 Baker Robertson Duck A review of therapeutic ultrasound biophysical effects Physical therapy vol 81 7 1351 1358 2001 Barnett SB 1980 The effect of ultrasonic irradiation on the structural integrity of the inner ear labyrinth Acta Otolaryngol 89 424 432 Barnett SB Walsh DA Angles JA 1990 Novel approach to evaluate the interaction of pulsed ultrasound with embryonic development Ultrasonics 28 166 170 Barnett Free radical production its biological consequences Ultrasound Med Biol 24 Suppl 1 1998 S29 S34 Barth G Wachsmann F Biological effects of ultrasonic therapy Stuttgart Congress Bericht Ter Erlanger Ulyruschall Tagung 1949 pp 162 205 Bombalska A Mularczyk Oliwa M Kwasny M Wlodarski M
32. I risultati mostrano la significativit dell effetto della sonicazione per 1 tempi di t 30 45 e 60 alla distanza SSD 5 cm per SSD 10 cm risultano significativi 1 dati ottenuti in corrispondenza di t 5 e 15 mentre per la distanza SSD 15 cm 1 dati a 15 e 60 di TRL gg ron S_scruidele 10cm a Fon i _acniudelcl Sab 106 Mm m ron SY _acnudelci 10 am 400 45 _acnudelci 10m 4 Fon 60 _acnudelcl 10 an E Bi 3 o 3 1 D5 O 0 5 1 1250 1200 1150 1100 1050 PCA BF Sp lunghezza d onda cm 1 Figura 5 24 PCA su dati spettroscopici per esposizione a US a 1 MHz SSD 10 cm regione acidi nucleici wo TRL 0 25 gion gt _ac racield S20 F cm i Atan iF acmleld S0 15 cm 02 mi on Sf_acrakcield 20 F cm pron 42_acrakcleld S F cm wi dn Sacred Sale 15cm 0 15 0 1 di 0 05 mJ D O a 8 0 05 0 1 0 15 0 2 0 25 q1 08 D D4 Of 0 Di OF G US 1250 1200 1150 1100 1050 FCA 62 lunghezza d onda cm 1 Figura 5 25 PCA su dati spettroscopici per esposizione a US a 1 MHz SSD 15 cm regione acidi nucleici PC2 21 loading CTRL son 5 _ac nucleici SSD 5 cm ASOn 15 _ac nucleici SSD 5 cm son 30 _ac nucleici SSD 5 cm son 45 _ac nucleici SSD 5 cm son 60 _ac nucleici SSD 5 cm 1250 1200 1150 1100 1050 lunghezza d onda cm 1 0 PC1 75 Figura 5 26 PCA su dati spettroscopici per esposizione a US a 3 MHz SSD 5 cm regione acidi nucleici 149 PC2
33. Kaliszewski M Kopczynskia K Szpakowska M and Trafny E A Classification of the biological material with use of FTIR spectroscopy and statistical analysis Spectrochim Acta Part A 78 2011 pp 1221 1226 Brown S A Greenbaum L Shtukmaster S Zadok Y Ben Ezra S Kushkuley L Characterization of non thermal focused ultrasound for non invasive selective fat cell disruption lysis technical and preclinical assessment Plastic and Reconstructive Surgery 124 1 2009 Busse J W 2004 Therapeutic ultrasound and fracture healing a survey of beliefs and practices Arch Phys Med Rehabil 85 10 1653 6 Canada 1989 Guidelines for the safe use of ultrasound part I Medical and paramedical Applications excerpt from safety code 23 1989 Health Canada www hc sc gc ca 190 Canada 2010 Radiation Emitting Devices Act Canadian Minister of Justice CEI 62 39 1998 Apparecchi elettrici per uso estetico Guida generale per la sicurezza Conti L Grimaldi P Udroiu I Bedini A Giliberti C Giuliani L Palomba R Congiu Castellano A Effects induced in cells by ultrasound revealed by ATR FTIR spectroscopy Vibrational Spectroscopy 52 2010 79 84 Crisci AR Ferreira AL 2002 Low intensity pulsed ultrasound accelerates the regeneration of the sciatic nerve after neurotomy in rats Ultrasound Med Biol 28 1335 1341 da Cunha A Parizotto NA Vidal BC 2001 The effect of therapeutic ultrasound on repair of the ach
34. aree delle bande dello spettro IR permette di ricavare informazioni sulle variazioni strutturali dei gruppi funzionali presenti nella cellula Una variazione strutturale si riflette in una variazione dell assorbimento di un gruppo determinando quindi un cambiamento nel segnale in assorbanza nel campione trattato Al fine di rendere confrontabili gli spettri IR tra di loro tenendo conto allo stesso modo del fondo stata eseguita una linea di base spezzata che comprende 1 numeri d onda 2996 2832 1766 1486 1356 1184 935 cm Gli spettri sono stati normalizzati all Amide I La preparazione dei campioni per le prove di spettroscopia IR infatti causa la perdita di informazioni sulla concentrazione cellulare e porta ad avere spettri con assorbanze diverse tra loro 129 Le aree delle bande sono state calcolate con il software OPUS e quindi confrontate con l area della corrispondente banda nel controllo La necessit di confrontare ogni spettro acquisito per il campione sonicato con il rispettivo controllo ci ha condotto a considerare il rapporto tra l area di ciascuna banda dello spettro sonicato e l area della stessa banda relativa al controllo E stato pertanto definito il parametro Ri definito come rapporto di aree _ Area del picco sonicato T Area del picco di controllo 5 1 dove l indice 1 diventa L nella regione dei lipidi Ri e P nella regione degli acidi nucleici Rp il parametro R stato infatti valutato per o
35. attraverso 1 pori a seguito dell aumento della 26 permeabilita di membrana indotto da esposizione ad US Okada 2005 Zarnitsyn 2008 Zhou 2008 La trasfezione genica un processo che consiste nell introdurre DNA in cellule eucariote 11 DNA introdotto viene successivamente integrato nei cromosomi cellulari Le correnti di trasfezione sono divise in due categorie virali e non virali Pepe 2004 Le trasfezioni virali s1 basano sull utilizzo di particolari virus che hanno un ottima tendenza ad infettare le cellule e trasferirvi il proprio DNA Rispetto alle trasfezioni non virali hanno dunque un efficienza maggiore Le non virali comprendono l immissione nella cellula di DNA nudo all interno di liposomi o il bombardamento tramite particelle gene gun cavitation bubble forming ultrasound from shogk wave Caviation bubble implodir cel membrane Figura 1 16 rappresentazione schematica del processo di sonoporazione in prossimita della membrane cellulare La drug delivery consiste nel processo di uptake nella cellula di molecole o farmaci analgesici o anti infiammatori di peso molecolare elevato rendendo specifico il sito del rilascio degli stessi a seguito di irradiazione con US Dalecki 2004 riferisce che US di 20 100 kHz aumentano significativamente la veicolazione transdermica di anestetici topici insulina e altre proteine ad elevato peso molecolare L efficienza di sonoporazione influenzata dal set up
36. basse producono trattamenti inefficaci e privi del relativo beneficio clinico con conseguente esposizione inutile del paziente ad un agente fisico potenzialmente pericoloso Pye 1996 Pye sottolinea l importanza per la categoria dei fisioterapisti dell informazione sulla necessit della calibrazione delle macchine usate auspicando un controllo almeno annuale in termini di potenza emessa effettuato con strumentazione dotata di riferibilit metrologica Guirro 2002 indica nell assenza di una cultura metrologica tra gli 61 utilizzatori uno dei motivi per cui le calibrazioni spesso non vengono effettuate periodicamente l autore sottolinea inoltre la carenza di linee guida e norme che definiscano chiaramente la necessit di effettuare calibrazioni periodiche degli apparati evidenziando anche la mancanza di laboratori per la misura dei parametri cruciali per la valutazione delle performances degli apparati disponibili solo in specifici centri di ricerca e in particolari industrie L importanza della calibrazione degli apparati ad US stata identificata per la prima volta nel 1956 quando gli Stati Uniti stabilirono standard Rivest 1987 Numerose organizzazioni a livello internazionale hanno sottolineato l importanza della calibrazione degli strumenti stimando anche la periodicit per l effettuazione dei test e la tolleranza nella variabilit dei parametri misurati nel corso degli stessi Nel Radiation Emitting Devices A
37. causa aumenti di temperatura potenzialmente dannosi in modo particolare alla superficie delle ossa Questo limite relativamente ad alta intensit dovrebbe essere permesso secondo Duck per alcune applicazioni fisioterapiche che richiedono esposizioni brevi e per le quali il trasduttore e il fascio sono mantenuti in moto continuo rispetto al tessuto trattato Tuttavia nella norma 60601 2 5 non sono riportati limiti inferiori per il caso di esposizioni prolungate o nelle quali il trasduttore non in movimento Le esposizioni agli US per finalit fisioterapiche devono soddisfare requisiti sia di sicurezza che di efficacia che devono essere valutati accuratamente nell ambito di valutazioni rischi benefici alla luce delle problematiche evidenziate necessario quindi che vengano condotti ulteriori studi clinici finalizzati a determinare 1 benefici dei trattamenti ed a valutare 1 rischi connessi ad esposizioni anche qualora rispettino 1 limiti di intensit previsti dalle norme tecniche 2 3 Problematiche connesse con l uso degli ultrasuoni in estetica 2 3 1 Gliultrasuoni in estetica medica In estetica medica nei trattamenti di lisi adipocitaria con US la cavitazione instabile deliberatamente ricercata all interno dei tessuti adiposi con lo scopo di distruggere gli adipociti grazie all energia liberata dall implosione delle bolle di vapore Se da un lato il danno consistente nella distruzione dell adipocita costituisc
38. che gli eventuali rischi debbono essere di livello accettabile tenuto conto del beneficio apportato al paziente e compatibili con un elevato livello di protezione della salute e della sicurezza Nella direttiva 1 dispositivi medici vengono suddivisi in 4 classi I Ha IIb e IIT le regole di classificazione tengono conto dei rischi potenziali legati alla fabbricazione e all utilizzo di tali dispositivi e per ogni classe sono indicate specifiche prescrizioni classe I vengono allocati in questa classe i dispositivi generalmente riconosciuti di scarsa pericolosit rischio basso questa classe include la maggior parte di prodotti non invasivi e gli strumenti chirurgici riutilizzabili classe IIa vengono allocati in questa classe i dispositivi generalmente riconosciuti di pericolosit medio bassa questa classe include prodotti sia invasivi che non invasivi generalmente utilizzati per tempi limitati come la maggior parte dei prodotti per medicazione alcuni utilizzati per conservare a breve e trasportare il sangue altri prodotti invasivi utilizzati in chirurgia la maggior parte del dispositivi attivi elettromedicali utilizzati per scopi terapeutici altri dispositivi attivi che 35 inviano o scambiano energia col corpo del paziente ed 1 dispositivi attivi utilizzati in diagnostica che inviano energia nel corpo del paziente come ad esempio gli ecografi ad US le apparecchiature ad US per fisioterapia classe IIb vengono allocati in
39. cm alla distanza di 15 cm per la frequenza di 3 MHz 1 livelli di intensit per l esposizione ad 1 MHz in accordo con Krasovitski 2011 appaiono in prossimit della soglia della cavitazione indicata in letteratura in 100 mW cm In figura 4 5 riportata al variare della distanza campione trasduttore l intensit ultrasonora all interno della capsula Petri per US alle frequenze di 3 MHz 100 1 MHz 75 e per altre percentuali della potenza massima ad 1 MHz 10 30 40 50 investigate 103 0 20 0 18 0 16 0 14 0 12 0 10 0 08 0 06 0 04 0 02 0 00 Intensit acustica misurata con idrofono al centro della Petri W cm 1 MHz 10 1 MHz 30 A 1 MHz 50 3 MHz 100 A Za SHH FE aa lt gt 1 MHz 40 e 1 MHz 75 i e 0 11 12 1 3 4 5 6 7 8 9 1 distanza trasduttore petri cm 3 14 15 Figura 4 5 intensit acustica misurata con idrofono al centro della petri per le due frequenze 1 e 3 MHz a diverse percentuali della potenza massima Nota l intensit sul campione possibile ricavare un parametro indicativo dell energia del campo acustico che incide sul campione durante il processo di sonicazione definita dose D J cm come prodotto dell intensit del campo acustico I per il tempo di esposizione t D J cm I t 4 2 Nelle tabelle 4 3 e 4 4 sono quindi
40. composta al 32 da B strand e al 21 da B turns Gli esperimenti sono stati condotti utilizzando una sorgente di US alla frequenza di 1 MHz e posizionando la soluzione campione in un tubo di polipropilene 6 x 2 4 cm nel fondo di una vasca 19 5 cm x 11 5 cm x 7 5 cm riempita con acqua degassata alla temperatura controllata di 25 C I campioni sono stati posizionati alla distanza fissa di 3 cm dalla sorgente di US e sonicati per 10 20 30 40 50 60 min I risultati mostrano un effetto prodotto dalla sonicazione dipendente dal tipo di struttura secondaria dominante nelle diverse proteine e dal grado della loro struttura ordinata in particolare le proteine pi suscettibili agli US sono risultate quelle con PM pi basso e l effetto risultato decrescere linearmente dal citocromo c 12 384 Da all a chimotripsinogeno A 25 600 Da In particolare per quanto riguarda le proteine a dominanti 1 risultati hanno mostrato che la variazione della struttura principale inferiore nelle proteine con pi alta percentuale di struttura dominante la struttura ordinata sembrerebbe pertanto costituire uno schermo per le onde 23 ultrasonore Al contrario le proteine B dominanti non sembrano modificare la loro struttura principale per effetto dell esposizione all agente fisico Gli autori associano l effetto riscontrato alla produzione di radicali liberi prodotti dalla sonolisi dell acqua 1 quali modificano la struttura ordinata delle
41. compressioni e rarefazioni del mezzo in cui si propaga che comportano variazioni di pressione all interno dello stesso figura 1 2 Tr Pz compressione x eeeeeeee AZZZIZZZI eeeeeeese eeeseees N 000000008 EEEIEE asse gt compressione rarefa itudinale X a 1 ASS SSS i i Ione compressione rarefaz Figura 1 2 onde acustiche longitudinali La generazione e la rilevazione degli ultrasuoni avviene artificialmente mediante 1 cosiddetti trasduttori che sfruttano il fenomeno della piezoelettricita scoperto dai fratelli Pierre e Jacques Curie nel 1880 I due scienziati comprimendo con una pressa secondo varie direzioni un cristallo di quarzo osservarono il particolare fenomeno piezoelettrico le due facce schiacciate del cristallo si erano polarizzate elettricamente in maniera molto simile alle batterie chimiche dell epoca Il fenomeno della piezoelettricit consiste nella sovrapposizione di due manifestazioni una di natura meccanica l altra di origine elettrica e nel passaggio spontaneo dall una all altra in particolare se alle due superfici opposte di un blocco di materiale piezoelettrico lamine di quarzo dischi di materiale ceramico viene applicata una tensione elettrica 11 materiale si espande 0 si contrae di conseguenza sottoponendo tali elementi ad un campo elettrico alternato s1 ottiene un alternarsi di compressioni e di espansioni Tale pro
42. consente il sezionamento ottico di un sistema biologico consistente nella raccolta di una serie di immagini di piani paralleli spostando 11 fuoco dell obiettivo lungo un asse che generalmente coincide con l asse di propagazione della luce La tesi organizzata nel modo seguente nella prima parte viene trattata la fisica degli US l interazione degli US con la materia biologica ed 1 relativi effetti indotti una trattazione della legislazione e delle norme tecniche riguardanti l uso degli US nella fisioterapia nell estetica medica e nell estetica non medica le problematiche connesse con l utilizzo degli US in fisioterapia e in estetica e le criticit evidenziate Nella seconda parte vengono riportati 1 risultati della caratterizzazione di trasduttori ad US utilizzati in fisioterapia ed in estetica ai sensi delle norme tecniche internazionali 1 protocolli per la preparazione dei campioni per le indagini spettroscopiche e microscopiche la descrizione del set up utilizzato per l esposizione al campo ultrasonoro la caratterizzazione del campo ultrasonoro prodotto dalle sorgenti utilizzate 1 risultati delle misure effettuate con le tecniche sopra descritte PARTE I CAPITOLO 1 GLI ULTRASUONI L INTERAZIONE CON LA MATERIA VIVENTE E LE APPLICAZIONI TERAPEUTICHE 1 1 La fisica degli ultrasuoni Gli ultrasuoni US sono radiazioni non ionizzanti di natura meccanica a differenza delle radiofrequenze e microonde con cui si iden
43. corrente dei potenziali rischi B forniscono obiettivi da raggiungere nella costruzione degli apparecchi C 1 dispositivi che producono livelli dell agente fisico in esame in eccesso rispetto a quelli prestabiliti dalle norme dovrebbero essere identificati e opportune misure correttive dovrebbero 33 essere adottate D la presenza di norme costituisce la base per la sicurezza del lavoro per garantire che 1 lavoratori ed 1 pazienti non siano esposti a eccessivi livelli Inoltre le norme che si riferiscono alla valutazione delle performances dei dispositivi forniscono ai produttori ed agli utilizzatori procedure standardizzate per confrontare le prestazioni di diverse marche e modelli di apparecchiature destinate ad essere utilizzate per lo stesso scopo generale EHC 1982 In generale la protezione dalle esposizioni ad agenti fisici utilizzati per applicazioni mediche mediata da enti governativi Duck 2007 le decisioni prese da tali organismi sono spesso basate su norme internazionali la maggior delle quali sono pubblicate dalla International Electro technical Commission IEC Norme europee sono a carico di Comit Europ en de Normalisation Electrotechnique CENELEC e CEN Comit Europ en de Normalisation Negli Stati Uniti 1 regolamenti del Medical Device Amendments controllano la vendita di apparecchiature ad uso medico Di solito negli Stati Uniti 1 produttori che intendono commercializzare un apparecchiatura pass
44. corrispondenza delle quali l ampiezza della pressione acustica 3 dB al di sotto del picco Tale calcolo fornisce un valore della frequenza ottimale per il solo SI diffusore pari a 1 320 MHz Va sottolineato che la frequenza cosi ottenuta risulta diversa da quella a cui il sistema lavora quando il trasduttore collegato al suo generatore infatti dall analisi del segnale di output del suo generatore risulta una frequenza di lavoro centrata a 1 040 MHz corrispondente invece nella risposta in frequenza di figura 3 7 ad un massimo relativo 20 0 018 120 sa 10 ii 0 016 z ATA N a 0 I 0 014 4 10 100 I 1 m l ss 0 012 n A d Tom S30 80 5 0 010 o fl _ fas a i oe 1 E E 40 N E n aS Il pa 5 O 1 o0 8 7 Sal D 50 60 l d pan D i Q 0 006 An i V 60 n Vay 70 a0 0 004 l M yo z 80 0 002 yr 90 20 100 0 000 900000 1000000 1100000 1200000 1300000 1400000 400000 800000 1200000 1600000 2000000 frequenza Hz frequenza Hz a b Figura 3 7 a risposta in frequenza misurata in Zy b impedenza misurata con analizzatore HP 4194 Per confermare tale risultato si misurata l impedenza del trasduttore ampiezza e fase mediante HP 4194 Impedance Gain Phase Analyzer In figura 3 7 b quest ultima misura riportata in un intervallo di frequenza tra 1 KHz
45. cosiddetti Enti di normazione che sono organismi privati volontari e indipendenti senza obblighi di alcun genere Pur definendo il cosiddetto stato dell arte talvolta le norme assumono rilevanza giuridica poich in alcune circostanze 1 fabbricanti possono mettere in commercio solo prodotti conformi allo stato dell arte come nel caso dei requisiti per la sicurezza In conseguenza di ci ogni Stato ha dovuto definire per legge quale tra 1 numerosi Enti potesse o dovesse essere considerato come riferimento attendibile e giuridicamente valido per la definizione dello stato dell arte In Italia gli enti normativi riconosciuti sono il CEI Comitato Elettrotecnico Italiano per quanto riguarda le norme relative a requisiti elettrici elettronici e informatici e quindi per 1 dispositivi medici attivi elettromedicali PUNI Ente Italiano di Unificazione per la meccanica e tutto il resto per 1 dispositivi medici non attivi Oltre agli enti nazionali esistono due organismi mondiali VISO International Organization for Standardization e l IEC che sono le controparti internazionali di UNI e CEI Pur lasciando piena libert agli enti nazionali di emettere tutte le norma che ritengono opportune l ISO cerca di renderle il pi possibile uniformi proponendo dei modelli preconfezionati che se adottati facilitano molto gli scambi internazionali L UNI quindi pu emettere una sua norma semplicemente adottando una norma ISO e ci si fa scr
46. dei pori di membrana eventualmente prodotti dall esposizione ad US per l osservazione del fluoroforo rimasto intrappolato all interno della cellula 6 al termine dei 10 vengono effettuati almeno 3 lavaggi con PBS per eliminare la calceina non internalizzata dal fluido extracellulare 7 s1 aggiungono 2 ml di PBS e si osserva la fluorescenza al microscopio 8 al termine dell osservazione il campione viene marcato con 20 ul di Ioduro di Propidio Per valutare la vitalit delle cellule successivamente alla sonicazione con marcatore fluorescente stato usato lo Ioduro di Propidio IP marcatore con peso molecolare 668 4 Da picco massimo di assorbimento 535 nm e picco massimo di emissione 617 nm tale marcatore ha la caratteristica di legarsi al DNA fluorescendo solo se si intercala alla doppia elica mentre non in grado di fluorescere allo stato libero Lo IP non in grado di penetrare la membrana cellulare ma entra solo se nella membrana sono presenti zone di rottura Di conseguenza le cellule fluorescenti alla lunghezza d onda dello IP sono cellule danneggiate infatti questo marcatore viene utilizzato anche per valutare l integrit della membrana plasmatica Jamin N 2003 119 Le misure in microscopia a fluorescenza sono state eseguite esponendo 1 campioni di cellule NIH 3T3 alle due frequenze 1 MHz 75 High e 3 MHz 100 High per 1 tempi di sonicazione di 30 45 e 60 e alle 3 distanze campione
47. dell onda acustica possono portare alla formazione di rotture nella catena di DNA I legami che vengono degradati dai radicali sono in genere legami C C C O e C H presenti nella struttura del biopolimero Lo stress ossidativo derivato 19 dalla produzione di radicali liberi puo portare in alcuni casi alla modificazione delle basi azotate Miller 1997 I radicali liberi prodotti dalla cavitazione interagiscono anche con la membrana cellulare in particolare con 1 lipidi presenti sulle membrane cellulari L azione dei radicali liberi si esercita mediante la destrutturizzazione delle membrane fenomeno attraverso il quale il doppio strato lipidico modifica il suo ordine fisiologico al MIMBERANA INTEGRA pees Danno indosio dalla lpepercsmdanone nelle membris biclagiche Figura 1 10 destrutturizzazione di membrana ad opera degli ultrasuoni L azione degli US sulle strutture lipidiche pu avvenire anche per mezzo di rotture meccaniche di zone della membrana ad opera di microflussi o microbolle cavitanti che si trovano in prossimit della superficie In particolare in Pozzi 2011 stata investigata la correlazione tra possibili danni alla membrana cellulare e produzione di radicali liberi indotta da US terapeutici ad 1 MHz su una popolazione di fibroblasti murini utilizzando misure di EPR Electron Parametric Resonance e di FTIR spettroscopia infrarossa in traformata di Fouier I risultati mostrano che l esposizione de
48. delle proteine e degli acidi nucleici principalmente per effetto di sonicazione dei campioni alla frequenza di 1 MHz 151 In accordo con 1 risultati di Pozzi 2011 che per esposizioni della stessa linea cellulare alla frequenza di 1 MHz rilevava formazione di radicali liberi e con 11 modello proposto da Krasovitski 2011 relativo ai movimenti indotti dagli US sulla membrana cellulare con relativi effetti paragrafo 1 2 le variazioni osservate nelle bande Li L2 P e P2 possono essere legate sia a modificazioni della struttura lipidica con formazione di pori transienti nella membrana favoriti dalla formazione di radicali liberi o da fenomeni meccanici quali microflussi e onde di shock sia a danni permanenti L attivit cavitatoria intracellulare indotta dagli US pu portare a variazioni conformazionali delle strutture lipidiche possono dar luogo a una variazione di fluidit di membrana con cambiamenti della risposta funzionale della stessa Per quanto riguarda 1 radicali liberi prodotti dalla sonicazione essi interagiscono con 1 gruppi metile e metilene modificandone gli assorbimenti L azione dei radicali liberi pu provocare il fenomeno della perossidazione lipidica infatti 1 radicali liberi contengono elettroni non legati che li rendono particolarmente reattivi I lipidi vengono ossidati dall ossigeno molecolare causando la degradazione delle strutture lipidiche stesse Anche nel terreno di coltura delle cellule possono formar
49. devono eseguire prove per garantire che la progettazione dei loro prodotti sia intrinsecamente sicura vengono allora specificati 1 requisiti per le prove per la protezione dai potenziali pericoli elettrici fra cui il test della messa a terra di protezione continuit della messa a terra e le correnti di dispersione Da ogni apparecchio nonostante l elevata impedenza interna d isolamento fluisce una piccola corrente che si disperde verso terra sull involucro e nel paziente definita come corrente di dispersione che non ha uno scopo funzionale Le tipologie di correnti di dispersione sono riportate in figura 2 2 corrente di dispersione verso terra corrente di contatto corrente di dispersione nel paziente dispersione nel paziente dispersione verso terra dispersione sull involucro corrente di corrente di corente di Figura 2 2 le correnti di dispersione di un elettromedicale La corrente di dispersione verso terra quella che dalla parte dell apparecchio collegata alla rete elettrica attraverso o lungo l isolamento percorre il conduttore di protezione verso l impianto di terra La corrente di dispersione di contatto la corrente che percorre l involucro di un apparecchio in uso normale escluse le parti applicate accessibile al paziente o all operatore che pu attraversare il soggetto in collegamento tra l involucro e la terra o con due punti dell involucro Quando l apparecchio possiede parti applic
50. di conformit ai requisiti essenziali e non pu essere messa in discussione dagli Organismi Notificati b norme armonizzate nel senso che sono condivise da tutti gli enti di normazione europei ma non sono pubblicate sulla GUCE sono degli importanti riferimenti esprimono comunque lo stato dell arte e sono quindi accettate da tutti gli Organismi Notificati ma non hanno lo status di disposizioni legislative e restano norme volontarie c norme varie nazionali UNI CEI ecc ed extra europee FDA Giappone ecc non sono armonizzate quindi possono essere diverse nei vari paesi della UE o non esistere affatto in alcuni in mancanza di meglio si possono utilizzare ma la loro applicazione pu anche non essere accettata dagli Organismi Notificati d regole di buona prassi produttiva di associazioni di categoria riconosciute quando non esiste alcuna norma quest ultime possono anche andar bene ma solo se non contrastano con le norme nazionali compresa la Farmacopea o con quelle armonizzate Gli Organismi Notificati possono tenerne conto o rifiutarle Sicurezza ed Igiene del Lavoro 2000 38 2 1 1 2 La norma CEI EN 60601 1 sugli apparecchi elettromedicali Nell ambito delle norme tecniche armonizzate che assicurano il rispetto dei requisiti della Direttiva Europea 93 42 CEE sui dispositivi medici particolare importanza riveste la norma generale CEI EN 60601 1 2007 Apparecchi elettromedicali Parte 1 Prescrizioni generali relative a
51. di immagini relative ai risultati dell esposizione di campioni di fibroblasti ad US alla distanza SSD 10 cm per 30 ogni immagine in fluorescenza 5 40 d e f presenta il suo corrispondente in contrasto di fase 5 40 a b c Si osserva la presenza di un effetto bordo simile a quello osservato per il set up espositivo SSD 5 cm t 30 A differenza della precedente configurazione espositiva le cellule che appartengono al monostrato presentano una risposta inferiore in termini di internalizzazione del fluoroforo figura 5 40 g h L aggiunta di IP evidenzia una scarsa mortalit cellulare con netta separazione tra cellule che hanno internalizzato la calceina e cellule che legano IP figura 5 41 162 i g h Figura 5 40 immagini dei bordi del campione sonicato 1 MHz alla distanza SSD 10 cm per t 30 a b c sono immagini in contrasto di fase d e f rappresentano gli stessi campi in fluorescenza g e h rappresentano immagini del monostrato Figura 5 41 immagini del campione sonicato 1 MHz alla distanza SSD 10 cm per t 30 con IP 163 5 6 1 6 Risultati per esposizioni a 1 MHz 75 High SSD 10 cm t 45 La figura 5 42 mostra 1 risultati dell esposizione a SSD 10 cm per 45 Tale configurazione espositiva evidenzia un medio livello di uptake del fluoroforo nelle cellule esposte Figura 5 42 immagini del monostrato del campione sonicato 1 MHz alla distanza SSD 10 cm per t 45 La mortalit cel
52. distinti dal restante cluster di dati e dal controllo Da ultimo per questa regione spettrale la figura 5 14 si riferisce all analisi PCA per campioni relativi alla distanza campione trasduttore di 15 cm I risultati mostrano che in corrispondenza della suddetta distanza appaiono significativi 1 dati relativi ad esposizioni a 15 30 45 e 60 140 0 8 0 6 04 02 A 5 D T 0 2 8 04 e CTRL B son 5 _ac nucleici SSD 5 cm 0 6 ason15 _ac nucleici SSD 5 cm E son 30 _ac nucleici SSD 5 cm 0 8 son 45 _ac nucleici SSD 5 cm son 60 _ac nucleici SSD 5 cm 1 0 8 0 6 0 4 0 2 0 2 04 0 6 08 1500 0 PC1 97 1450 1400 1350 1300 lunghezza d onda cm 1 Figura 5 12 PCA su dati spettroscopici per esposizione a US a 1 MHz SSD 5 cm regione spettroscopica associata alle bande P e P e relativo loading plot 0 8 0 6 04 _ 0 2 2 2 D E o 2 0 2 e CTRL 0 4 Mson S _ac nucleici SSD 10 cm son 15 ac nucleici SSD 10 cm 06 E son 30 _ac nucleici 58D 10 cm 7 son 45 _ac nucleici SSD 10 cm son 60 _ac nucleici SSD 10 cm 0 8 0 8 0 6 0 4 0 2 0 0 2 04 0 6 0 8 1500 PC1 95 j i nJ V a i 1450 1400 1390 1300 lunghezza d onda cm 1 Figura 5 13 PCA su dati spettroscopici per esposizione a US a 1 MHz SSD 10 cm regione spettroscopica associata alle bande P e Pe relativo loading plot 9 Q gt N a e CTRL B son 5 _ac nucleici SSD 15 cm ason
53. fisiche pi significative sia di sviluppare procedure ad hoc per caratterizzare 1 trasduttori e monitorare le prestazioni degli apparati per quanto riguarda l HIFU la capacit di generare temperature elevate all interno dei tessuti rende oltremodo necessaria la garanzia che il trattamento venga fornito in modo adeguato e nel sito corretto per questa applicazione in particolare permangono problemi aperti connessi alla misura delle grandezze fisiche rilevanti che riguardano ad esempio i metodi pi appropriati per la misura della potenza in un campo ultrasonoro fortemente focalizzato Shaw 2008 Anche per la medicina estetica una caratterizzazione fisica del fascio ultrasonoro e della sua propagazione nei tessuti biologici necessaria a garanzia dell efficacia e della sicurezza del trattamenti 32 CAPITOLO 2 PROBLEMATICHE CONNESSE CON L USO DEGLI ULTRASUONI IN FISIOTERAPIA E IN ESTETICA Le apparecchiature emittenti US in relazione alle aree a cui fa riferimento il presente lavoro possono essere distinte sulla base del loro utilizzo in a apparecchi utilizzati in fistoterapia b apparecchi utilizzati nell estetica medica c apparecchi utilizzati nell estetica non medica Fanno parte della fisioterapia le apparecchiature ad US usate nella Medicina riabilitativa ad esempio nella riparazione delle fratture ossee e delle lesioni dei tendini nel trattamento dei tessuti cicatriziali rientrano invece nell ar
54. il fenomeno transiente e reversibile attraverso il quale a seguito di esposizione ad onde ultrasonore aumenta la permeabilit della membrana cellulare Karshafian 2010 consentendo l ingresso di molecole bioattive con alta efficienza e senza significativi cambiamenti della vitalit cellulare Tale processo impiegato in numerose applicazioni mediche tra cui la terapia genica e la drug delivery con la finalit di favorire il trasporto intracellulare di piccoli composti macromolecole DNA farmaci in cellule bersaglio in maniera efficiente e precisa ed investigato mediante numerosi esperimenti in vitro Hynynen 2008 Il meccanismo fisico alla base della sonoporazione non tuttora completamente noto tuttavia probabile che siano coinvolti meccanismi associati alla generazione di onde d urto e microjets Ohl 2006 alla presenza di microstreaming acustici Wu 2007 alla produzione di radicali liberi Miller 1993 causati dalla cavitazione acustica ossia l implosione di bolle di vapore in presenza di un campo di pressione acustica Tale meccanismo determina danni sulle membrane cellulari che possono essere reversibili determinando uptake in cellule vitali o non reversibili causando la morte delle cellule Anche se alcune applicazioni possono trarre beneficio dalle morte delle cellule la maggior parte dei meccanismi come la drug delivery e la terapia genica cercano di massimizzare la captazione intracellulare mantenendo alta vita
55. ingrandimento della bolla fino ad un volume molto pi grande di quello in condizioni di equilibrio Durante la fase di pressione positiva compressione l enorme pressione esercitata sulla bolla la comprime in modo rapido e violento fino a farla collassare su se stessa con conseguente implosione e rilascio di energia Con l implosione delle bolle di gas si verifica un emissione di grande quantit di energia localizzata con il raggiungimento di altissime pressioni e temperature che possono produrre effetti anche dannosi per il sistema biologico attraversato e la formazione di quelli che si definiscono hot spot cio punti caldi Plaja 2003 vengono valutati valori di temperatura anche superiori a 5000 K 17 una pressione di circa 1000 atmosfere un tempo di vita inferiore al us ed una velocit di riscaldamento e raffreddamento che supera 1 10 miliardi di gradi Celsius sec sound pressure compression WAVES changes in bubble size 00e O OE N time Figura 1 7 dinamica delle bolle sottoposte all onda acustica Le variazioni quasi istantanee di densit pressione temperatura all interno del fluido in cui si propaga l onda ultrasonica possono produrre anche eventuali onde cosiddette di shock ossia onde di pressione che possono anche essere estremamente intense La cavitazione inerziale un processo caratterizzato da una soglia in termini di ampiezza del campo acustico pi precisamente del
56. ipotizzabile che lo spazio idrofobico tra 1 due monostrati lipidici si gonfi e si sgonfi con una certa periodicit quando esposto agli US La pressione acustica che costituisce la forza oscilla tra pressione negativa rarefazionale in cui 1 due foglietti del doppio strato si allontanano tra di loro superando le forze di attrazione molecolare le forze inerziali dell acqua circostante e le forze viscose il contrario accade durante la fase di pressione positiva compressione Tali espansioni e contrazioni potrebbero stimolare cicli di stiramento e rilascio nella membrana cellulare e nel citoscheletro che potrebbero attivare proteine meccano sensibili aumentando la permeabilit cellulare Sulla base di studi sperimentali e teorici l autore sottolinea che pressioni acustiche modeste inferiori a 0 1 MPa possano gi superare le forze di attrazione tra 1 due strati lipidici in particolare secondo l autore la massima deformazione proporzionale all ampiezza della pressione acustica e inversamente proporzionale alla radice quadrata della frequenza Risultati di simulazioni mostrano che la membrana sottoposta agli US ad 1 MHz diviene un oscillatore meccanico e una sorgente essa stessa di attivit cavitatoria intracellulare in modo molto simile ad una bolla di gas in un campo acustico Secondo l autore differenti stadi nell interazione tra la membrana cellulare e 11 campo ultrasonoro possono indurre diversi bioeffet
57. l ampiezza maggiore in modulo della semionda negativa p del segnale in uscita dall idrofono In tabella 4 1 sono riportati per 1 diffusori a 1 MHz 75 e 3 MHz 1 valori della pressione acustica in MPa misurati ai capi dell idrofono libero e della relativa intensit del campo acustico in W cm alle tre distanze campione trasduttore indagate nel corso del presente lavoro Trasduttore Idrofono libero 1MHz 75 3 MHz 100 SSD Pressione Intensita del campo acustico Pressione Intensita del campo acustico MPa W cm MPa W cm Tabella 4 1 pressione e intensit del campo acustico ai capi dell idrofono libero per i due strumenti a 1 MHz e 3 MHz All interno della capsula petri le misure con l idrofono hanno rilevato l attesa attenuazione acustica in tabella 4 2 sono pertanto riportati 1 valori dell intensit del campo acustico in petri W cm alle tre distanze diffusore idrofono utilizzate nel corso delle esposizioni con i campioni biologici alle due frequenze 1 MHz e 3 MHz Trasduttore Idrofono in petri 1 MHz 75 3 MHz 100 SSD Intensit del campo acustico in petri W cm 10 cm 0 08 0 01 Tabella 4 2 intensit del campo acustico ai capi dell idrofono in petri per 1 due strumenti operanti a 1 MHz e 3 MHz Dalla tabella 4 2 si evince che l intensit acustica nella capsula Petri si estende da 0 09 W cm alla distanza di 5 cm per la frequenza di 1 MHz e scende progressivamente fino a 0 009 W
58. le indicazioni fornite dal costruttore nel manuale d uso entrambi i sistemi oie 2 PEN forniscono un intensita massima pari a 2 5 W cm in modalit pulsata Figura 3 2 immagine dello strumento operante a 3 MHz con particolare del diffusore circolare Il lavoro ha previsto la caratterizzazione delle modalit emissive dei trasduttori che stata effettuata presso l Istituto Nazionale di Ricerca Metrologica INRIM di Torino per quanto riguarda la valutazione della potenza totale presso il CNR IDASC Istituto di Acustica e sensoristica Orso Maria Corbino Roma per la valutazione dei parametri ERA e BNR ai sensi della norma CEI EN 61689 3 2 Caratterizzazione presso INRIM Torino AI fine di valutare le caratteristiche di output degli strumenti sono state effettuate presso l Istituto INRIM Istituto Nazionale di Ricerca Metrologica di Torino misurazioni di potenza totale con l ausilio di una bilancia a forza di radiazione I trasduttori uno alla frequenza di 1 MHz l altro alla frequenza di 3 MHz sono stati fatti lavorare in collegamento con 1 loro rispettivi controlli impostati su onda continua le misure di potenza totale sono state effettuata al 100 dell ampiezza dell onda emessa e al 50 della stessa 75 Dal punto di vista operativo stata fissata una distanza trasduttore bersaglio in corrispondenza della quale sono state effettuate misure di forza di radiazione ossia della variazione appare
59. manipoli sono le stesse degli apparati per fisioterapia di conseguenza potrebbero essere considerati come parametri fisicamente utili per definirne le caratteristiche emissive gli stessi ERA e BNR precedentemente definiti per gli apparati ad US per fisioterapia In realt per tutte le norme riportate nei paragrafi precedenti fanno specifico riferimento nel titolo stesso o nel corpo del testo al termine physiotherapy che riporta di fatto le suddette norme alle sole applicazioni fisioterapiche escludendo la strumentazione per estetica Di seguito vengono quindi trattate per l estetica medica e non medica e le normative generali a cui devono attenersi tali dispositivi 2 1 3 1 Normativa per l estetica non medica Ai fini della commercializzazione nell Unione Europea le norme a cui sono soggette le apparecchiature usate nell estetica non medica sono quelle relative alla conformit CE con riferimento a Direttive differenti rispetto a quelle dei dispositivi medici tra cui la Direttiva bassa tensione 2006 95 CE detta BT e la Direttiva Compatibilit elettromagnetica 2004 108 CE detta EMC e relativa normativa nazionale L obiettivo principale della legislazione sulla compatibilit elettromagnetica quello di assicurare che le apparecchiature elettriche ed elettroniche non creino eccessivi disturbi elettromagnetici e che il loro funzionamento non sia influenzato da altre sorgenti di disturbo La normativa della EMC
60. massimo negativo della pressione acustica di frequenza pi bassa pi lungo il tempo a disposizione per l espansione delle bolle e di dimensioni delle bolle presenti a tal proposito bolle molto piccole sono caratterizzate da un alta tensione superficiale che tende a limitarne l espansione mentre bolle con un raggio di equilibrio gia molto grande possono espandersi ma il collasso non sufficientemente violento Per esempio figura 1 8 alla frequenza di 10 MHz la minima pressione negativa che induce cavitazione inerziale di circa 0 84 MPa ed a questa pressione solo bolle di raggio iniziale di circa 0 2 um iniziano a cavitare Guiot 2010 SK Atv 10 MHz and peg O miS MPa this range of ab pJ Lane Peak negative pressure threshold MPa 5 gt __ Poy at 3 MHI 0 5 n val MHz 0 0 0 5 1 5 2 0 2 5 Initial radius pm Figura 1 8 soglia della cavitazione inerziale a 3 frequenze in funzione del raggio iniziale delle bolle Apfel 1991 18 Questo andamento violento del fenomeno della cavitazione puo portare alla formazione dei radicali liberi molecole o atomi estremamente reattivi che possono agire direttamente sulle catene polimeriche e sulle strutture presenti nel mezzo Langton 1962 I radicali liberi piu noti sono quelli derivanti dalla sonolisi dell acqua ed a contenuto di ossigeno detti ROS Reacting Oxygen Species Ulltrasouncds HO 0H H 20H H O 2H H H 0 gt HO HO
61. min E alpha helis mbeta sheet Oturns Ounordered Maggr strands Figura 5 22 variazioni nelle strutture secondarie nella regione dell Amide I per esposizione a US a 3 MHz La Figura 5 21 mostra che la sonicazione alla frequenza di 1 MHz 75 High determina un aumento della percentuale di strutture disordinate nei campioni sonicati rispetto al controllo tendenzialmente a tutte le distanze con diminuzione delle strutture ordinate alfa elica Tale risultato risulta in accordo con quanto rilevabile nei loading plots dell analisi PCA nei quali possibile individuare che le pi grandi differenze sono a carico di cambiamenti della struttura secondaria dell Amide I identificabili con le strutture disordinate tabella 5 2 In accordo con l analisi PCA precedentemente riportata la variazione nella percentuale di strutture secondarie pi significativa 147 puo considerarsi in corrispondenza della distanza SSD 5 cm tempo di esposizione 15 e in corrispondenza di SSD 15 cm per esposizioni ai tempi 15 30 e 60 Dalla figura 5 22 si evince che la sonicazione a 3 MHz non produce differenze sostanziali in merito alla variazione della percentuale di strutture secondarie dei sonicati rispetto ai controlli 5 3 3 Effetti degli ultrasuoni nella regione degli acidi nucleici Nella regione dello spettro attribuita principalmente agli acidi nucleici 1300 950 cm sono state valutate anche le variazioni di due ulteriori bande deno
62. necessari pertanto ulteriori studi sia clinici che di laboratorio volti a determinare 1 meccanismi di azione dell agente fisico 1 benefici dei trattamenti nonch a valutare 1 rischi connessi alle esposizioni al fine di ottimizzare le terapie Per entrambi 1 settori fisioterapico ed estetico si evidenzia la necessit di stabilire metodi accurati per predire la dose o comunque le grandezze fisiche pi significative nella propagazione del fascio ultrasonoro nei tessuti che possano mettere in relazione le esposizioni con gli effetti biologici La qualit dei trattamenti ovviamente influenzata anche dalle prestazioni delle apparecchiature che emettono gli US che dovrebbero essere garantite dal rispetto delle relative norme tecniche In 186 realta alcune criticita sono riscontrabili nelle norme tecniche stesse per esempio per quanto riguarda la manutenzione delle apparecchiature per fisioterapia la norma CEI EN 60601 2 5 potrebbe essere migliorata se prevedesse indicazioni piu precise circa la periodicit della verifica delle caratteristiche di emissione delle apparecchiature nonch un riferimento alla necessit di utilizzare strumenti di misura con riferibilit metrologica Per quanto riguarda la fisioterapia sarebbe inoltre auspicabile che le norme tecniche prevedessero un limite di intensit effettiva inferiore per trattamenti prolungati o con trasduttore immobile rispetto alla parte del corpo trattata evidenziando i
63. o in pazienti con presenza di frammenti metallici che possono disseminarsi o spostarsi per l effetto meccanico della terapia ultrasonora Occorrerebbe inoltre avere una visione completa della posizione di arterie e vene ghiandole e organi interni 1 quali potrebbero essere involontariamente raggiunti dagli US e danneggiati nel corso del trattamento L esposizione ad US vicino ad una superficie riflettente come le ossa pu portare alla formazione di onde stazionarie con la possibilit di produrre stasi del flusso sanguigno 60 e relativi effetti dannosi Gli US hanno le stesse controindicazioni dei mezzi fisici che agiscono con la produzione endogena di calore osteoporosi presenza di frammenti metallici vene varicose tromboflebiti arteriopatie obliteranti emorragie mestruazioni neoplasie tubercolosi e gravidanza e non vanno utilizzati in pazienti in eta infanto giovanile con ossa in fase di accrescimento Inoltre durante il trattamento con US si pu incorrere in ustioni che si verificano se la dose erogata eccessiva e se utilizzando un emissione a fascio continuo la testa emittente rimane ferma nella stessa zona di trattamento per lungo tempo Non sono consigliabili esposizioni ad US con la massima intensit ultrasonora effettiva superiore ai 3 W cm studi su animali riportati dalla World Health Organization hanno infatti stabilito che effetti benefici associati con la terapia ultrasonora possono essere raggiunti utilizz
64. per esposizioni in onda pulsata Milowska 2007 I due effetti non sono effettivamente separabili cio 15 non si pu assumere la presenza di soltanto una tipologia di effetti eccetto nel caso di litotrissia in cui l effetto indotto quello meccanico Per tutte le altre situazioni bene assumere che gli effetti non termici siano sempre accompagnati da sviluppo di calore Baker 2001 Effetti termici quando gli US si propagano in un mezzo l ampiezza dell onda acustica si riduce progressivamente cio gli US perdono la loro energia e il fascio si attenua a causa dell assorbimento e della dissipazione di energia ultrasonica Gli US producono calore attraverso le vibrazioni l urto e la frizione delle strutture cellulari ed intercellulari che compongono 1 tessuti attraversati L aumento di temperatura del mezzo pu provocare eventuali variazioni chimiche o strutturali dei biopolimeri Questo fenomeno influenzato sia dalle caratteristiche del fascio ultrasonoro cio intensit e frequenza dalla durata dell esposizione e dalle caratteristiche dei tessuti attraversati in particolare come gi visto gli US possono essere pi o meno attenuati in funzione della differenza tra le impedenze acustiche dei tessuti attraversati dalle onde sonore Il riscaldamento prodotto si instaura rapidamente tuttavia si stabilisce presto un equilibrio termico a causa della veloce dispersione del calore dovuta al flusso sanguigno L effetto t
65. riguarda l indicazione delle caratteristiche tecniche e delle norme di sicurezza seguite nella costruzione degli strumenti I risultati della campagna mostrano che 1 parametri dichiarati dalle ditte costruttrici non sono risultati in molti casi confrontabili tra loro inoltre sono emerse significative difformit nei manuali di alcuni prodotti riguardo alle istruzioni relative alla regolare manutenzione per il corretto funzionamento del dispositivo Il lavoro si conclude auspicando sia un sistema di verifiche pi congruo e omogeneo ma anche che le aziende del settore si rifacciano alle conoscenze tecniche in argomento per fornire indicazioni congrue e omogenee per ciascuna tipologia di apparecchio Inoltre per quanto riguarda 1 controlli periodici di sicurezza effettivamente condotti sulle apparecchiature nel lavoro si rileva che in molti casi essi si limitano sostanzialmente alla verifica del solo aspetto della sicurezza elettrica mentre solo occasionalmente si procede all ispezione dell apparato grafico etichette ecc dell apparecchiatura Appare cruciale quindi secondo 1l Ministero verificare che quanto dichiarato dal fabbricante e verificato dall Organismo Notificato che ha certificato il prodotto ai fini della marcatura CE riguardo alle specifiche funzionali es l energia erogata sia e si mantenga coerente nel tempo e che tutti 1 parametri previsti per il 65 funzionamento frequenza intensit ampiezza ecc siano
66. sonicazione al di sotto della quale si osservava una scarso uptake del fluoroforo per esposizione a 1 MHz 75 High 5 7 Citofluorimetria a flusso risultati sperimentali In tabella 5 12 riportato lo schema delle esposizioni per le misure di citofluorimetria a flusso eseguite con US alla frequenza di 1 MHz e 3 MHz a partire dai 30 minuti di esposizione per tutte le distanze SSD e per tutti 1 tempi di sonicazione Per studiare l internalizzazione di molecole extracellulari da parte delle cellule NIH 3T3 esposte ad US alle frequenze di 1 e 3 MHz anche in questo caso stata utilizzata la calceina 10 uM Per valutare la vitalit delle cellule post sonicazione con marcatore fluorescente stato usato IP 20 ul 1 MHz 75 High 3 MHz 100 High Distanza diffusore bersaglio SSD esposizione Tabella 5 12 tabella delle misure di citofluorimetria a flusso effettuate per esposizioni a 1 MHz e 3 MHz Inizialmente sono stati acquisiti 1 risultati per il campione di controllo e per il campione non marcato quest ultimo utile per la rilevazione dell autofluorescenza del campioni Per ogni campione si scelto di conteggiare 10 000 eventi cio 10 000 cellule e sono stati acquisiti 1 l istogramma a due parametri in cui ciascun punto corrisponde ad 1 evento contato dotato di un definito valore correlato ai parametri misurati nel nostro caso due tipi di fluorescenza IP e calceina 2 l istogramma ad un parametro dove l
67. sottoposto ad un lavaggio con PBS al fine di eliminare il fondo della fluorescenza della calceina non internalizzata Dopo l osservazione stato introdotto IP nella concentrazione suddetta L immagine mostra assenza di fluorescenza di calceina e IP a carico delle cellule Figura 5 66 immagine in fluorescenza e in trasmittanza del campione di controllo marcato con calceina Successivamente si proceduto ad effettuare esposizioni dei campioni ad US alla frequenza di MHz in una configurazione gi indagata con citofluorimetria a flusso ossia 1 MHz 75 High distanza campione trasduttore 5 cm e tempo di esposizione 60 la mancanza di integrit del 182 monostrato successivamente alle sonicazioni non ha consentito di acquisire le immagini nelle predette condizioni sperimentali con questa metodica I campioni marcati con calceina sono stati pertanto esposti in corrispondenza di intensit ultrasonore inferiori individuate dalla caratterizzazione di figura 4 5 in particolare si scelto di sonicare sempre alla frequenza di 1 MHz ma alla distanza campione trasduttore SSD 5 cm a cui corrisponde un intensit ultrasonora dello stesso ordine di grandezza di quella misurata per la stessa distanza con il trasduttore a 3 MHz 100 High 0 015 W cm 1 MHz a fronte di 0 03 W cm per lo strumento a 3 MHz tale set up sperimentale mantiene integro il monostrato per l osservazione in microscopia confocale Dal momento che con le metodiche
68. sperimentale e dal tipo di cellula esposta al campo ultrasonoro Diversi studi hanno mostrato che l efficienza risulta considerevolmente accresciuta con l aggiunta di agenti di contrasto Okada 2005 Hallow 2006 costituiti da microbolle gassose incapsulate usate spesso anche nell imaging in quanto sono in grado di riflettere l onda acustica La propriet principale di questi mezzi enfatizzare gli effetti del campo ultrasonico sul campione per cui aggiungendoli nel terreno di coltura cellulare vengono ridotti 1 livelli di intensit ultrasonora richiesta per generare la cavitazione Nel caso delle terapie ad US ad alta potenza che sfruttano il meccanismo termico la temperatura dei tessuti viene innalzata molto rapidamente tipicamente in meno di 3 secondi al di sopra di 56 C provocando la morte istantanea delle cellule tale effetto viene utilizzato per 21 P HIFU High Intensity Focused Ultrasounds tecnica che prevede applicazione di US focalizzati di elevata intensita 1 kW cm per l ablazione selettiva e non invasiva di tessuti tra cui alcune forme tumorali sorgente di j ultrasuoni f Te trasduttore FP tessuto sang lente focalizzatrice A pelle cellule da Y eliminare Figura 1 17 schema di principio della tecnica di focalizzazione di ultrasuoni di elevata intensit HIFU per applicazioni di terapia chirurgica fonte www inrim it Il fascio ultrasonor
69. tempo dipendente alle minori distanze campione trasduttore e l aumento maggiore nei campioni esposti ad US a 1 MHz La spettroscopia FTIR stata usata come strumento per rilevare cambiamenti strutturali nelle principali molecole biologiche I risultati combinati con l analisi statistica PCA con riferimento a tutte le componenti cellulari lipidi proteine acidi nucleici mostrano che le cellule NIH 3T3 sono sensibili agli US principalmente alla frequenza di 1 MHz mostrando variazioni significative dei parametri spettroscopici nella regione dei lipidi delle proteine e degli acidi nucleici 1 set up sperimentali in corrispondenza dei quali si verifica con maggior frequenza una variazione significativa dei parametri spettroscopici sono SSD 15 cm t 45 e SSD 15 cm t 60 alla frequenza di 1 MHz Le misure di microscopia a fluorescenza e citofluorimetria a seguito di esposizione dei campioni ad US alla frequenza di 1 MHz e 3 MHz sono state effettuate marcando 1 campioni con la calceina e valutandone la vitalit con lo Ioduro di Propidio per tutte le distanze campione trasduttore e per 1 188 tempi di sonicazione superiori ai 30 I risultati dell esposizione a 1 MHz mostrano che in corrispondenza delle stesse configurazioni espositive considerate spettroscopicamente attive nelle misure FTIR vengono indotte dagli US modificazioni a livello di membrana quali formazione di pori che costituiscono condizione favorevole all internal
70. utilizzo di un idrofono ad ago cio un microfono progettato per essere usato sott acqua che sfrutta l effetto piezoelettrico ed quindi in grado di convertire le onde acustiche in segnali elettrici permettendo la misura della pressione acustica e l analisi delle sue variazioni nello spazio e nel tempo L idrofono dotato di un elemento sensibile posto sulla punta dell ago Il materiale di cui costituito un polimero Polivinildenfluoruro PVDF con impedenza acustica che pu essere agevolmente adattata a quella dell acqua Figura 3 3 idrofono ad ago L elemento sensibile ha la propriet di generare un segnale proporzionale alla sollecitazione provocata su di esso dalla pressione istantanea dell acqua Il campo acustico determinato dal trasduttore ultrasonoro fortemente dipendente dalle caratteristiche della sorgente e dal setup sperimentale usato Figura 3 4 catena di misura per le misurazioni ai sensi della norma CEI EN 61689 2009 Posizionando l idrofono a distanze opportune dal trasduttore e connettendo l uscita dell idrofono ad un oscilloscopio secondo la rappresentazione schematica della catena di misura riportata in figura 3 4 possibile visualizzare la variazione nel tempo della forma d onda e quindi della differenza di potenziale a seguito della deformazione dell elemento sensibile dell idrofono prodotta dall onda acustica incidente su di esso 78 Infatti 1 valori di
71. voltaggio letti sull oscilloscopio collegato all idrofono sono legati alla pressione acustica mediante la relazione y POMO 42 e e x e frequenza ed data dal rapporto tra il segnale in uscita e il segnale in ingresso dello strumento Nel caso degli idrofoni la sensibilit s1 rappresenta in decibel ed riferita a quella di un sensore che presenti una risposta di 1 V per un segnale di 1 uPa L unit di misura convenzionale per la sensibilit di un idrofono dBre 1V uPa dove re sta per riferita Per la caratterizzazione del campo acustico la sensibilit M f pu essere estrapolata da curve di taratura riportate in letteratura per idrofoni con caratteristiche simili a quelle dell idrofono utilizzato alla frequenza considerata Il set up sperimentale per le misure presso 11 CNR IDASC ha previsto l utilizzo di una vasca di dimensioni 1 2 x 0 3 x 0 3 m riempita di acqua bidistillata al fine di eliminare eventuali riverberazioni equipaggiata con sistemi per il posizionamento dei dispositivi idrofono e trasduttore figura 3 5 in base alle indicazioni fornite nella norma CEI EN 61689 2009 Il trasduttore e l idrofono sono stati immersi nella vasca fino a circa a met della sua profondit con 1 loro assi principali allineati in posizione orizzontale prima dell inizio di ogni sessione di misura stato effettuato un controllo sull allineamento dei due sistemi utilizzando un puntatore laser in riflessione su
72. 0 1 61 9 Frieder SJ Weisberg B Fleming B et al A pilot study the therapeutic effect of ultrasound following partial rupture of Achilles tendon in male rats J Orthop Sports Phys Ther 1988 10 39 46 Fuciarelli A F Sisk E C Ronald M T and Miller D L Induction of base damage in DNA solutions by ultrasonic cavitation Free Radical Biology and Medicine 1995 18 2 231 238 Fyfe M Bullock M Acoustic output from therapeutic ultrasound units The Australian Journal of Physioterapy vol 32 n 1 1986 13 16 Fyfe MC Parnell SM The importance of measurement of effective transducers radiating area in the testing and calibration of therapeutic ultrasonic instruments Health Phys 1982 43 377 381 Gadsden E Aguilar MT Smoller BR Jewell ML Evaluation of a novel high intensity focused ultrasound device for ablating subcutaneous adipose tissue for noninvasive body contouring safety studies in human volunteers Aesthet Surg J 2011 May 31 4 401 10 Gann N Ultrasound current concepts Clin Manage 1991 11 64 9 Gledhill M Survey of physiotherapy ultrasound equipment calibrations National Radiation Laboratory New Zealand Report NRL 1996 4 1996 192 Grimaldi P Di Giambattista L Giordani S Udroiu I Pozzi D Gaudenzi S Bedini A Giliberti C Palomba R Congiu Castellano A Ultrasound mediated structural changes in cells revealed by FTIR spectroscopy a contribution to the optimization of gen
73. 01 W cm I 0 009 W cm A I Tabella 5 4 vitalit dei campioni esposti alla frequenza di 3 MHz I corrisponde a intensit incidente sul campione in corrispondenza della relativa SSD Tutti 1 campioni esposti sia alla frequenza di 1 MHz che a quella di 3 MHz mostrano una vitalita inferiore rispetto al controllo ma nessuna differenza risultata significativa Per quanto riguarda l esposizione a 1 MHZz stata riscontrata una correlazione negativa statisticamente significativa tra il tempo di esposizione e la vitalit alla distanza SSD 15 cm r 0 9354 p 0 0061 Per quanto riguarda l esposizione a 3 MHz stata riscontrata una correlazione negativa statisticamente significativa tra il tempo di esposizione e la vitalit alla distanza SSD 10 cm r 0 8621 p 0 0272 154 5 5 Il test dei micronuclei risultati sperimentali La figura 5 31 e la tabella 5 5 mostrano le frequenze dei micronuclei dei campioni sonicati alla frequenza di 1 MHz I risultati mostrano che tutti 1 campioni esposti presentano frequenze di micronuclei maggiori del controllo L aumento risultato statisticamente significativo per le cellule esposte alla distanza SSD 5 cm per 30 45 60 minuti di esposizione ad US e per 1 campioni esposti a SSD 10 cm per 15 30 45 60 minuti p lt 0 05 Al contrario a 15 cm nessuna differenza risultata significativa ee DT 4 N Ln UT UA VLLLILILLLLLL A A ool MMMM MLL ie MMMM MLL
74. 1 2 3 0 4 nuclei L espressione per il calcolo dell NDI M1 2 M 2 3 M 3 4 M 4 N 4 3 NDI dove M1 M4 rappresentano il numero di cellule con 1 4 nuclei rispettivamente e N rappresenta il numero totale di cellule conteggiate 4 4 2 1 Il test dei micronuclei preparazione dei campioni Il protocollo sviluppato per la preparazione dei campioni 1l seguente a dopo l esposizione al campo acustico di una petri contenente il campione una aliquota dello stesso viene depositata nella petri b 6 ug ml di Citocalasina B disciolta in Dimetilsolfossido DMSO vengono aggiunti all aliquota di cellule lo stesso stato fatto per le cellule non sonicate e utilizzate come controllo c 1 campioni vengono messi in incubatore per 22 ore d dopo il periodo di latenza 1 campioni vengono centrifugati per 15 a 1200 rpm e il pellett di cellule viene risospeso con Cloruro di Potassio tiepido f le cellule vengono fissate con Carnoy una soluzione di acido acetico e metanolo in grado di bloccare e stabilizzare le cellule nel loro stato al momento del fissaggio g le cellule vengono depositate su un vetrino per microscopia h ai campioni cellulari viene aggiunto il DAPI 4 6 Diamidino 2 fenilindolo cloridrato 10 ug ml un marcatore per la colorazione in fluorescenza del DNA in grado di penetrare la membrana cellulare integra legandosi poi al DNA stata poi effettuata l osservazione microscopica dei nuclei cellul
75. 1 10 cm FL1 15 cm Son_15 son 3 son 45 son _6l son 5 Riz Lipidi NIH 3T3 3 MHz RAL 5 cm E FL 10 cm 4 FL 15 cm Ob 0 6 so 5 son 15 son 30 son 45 son_60 son 5 son 15 son ol son 45 son _60 Figura 5 10 andamenti dei parametri Rx R 2 in funzione del tempo di sonicazione per le 3 distanze SSD 5 10 15 cm alle due frequenze 1 MHz e 3 MHz La figura 5 11 mostra l intero spettro FTIR in assorbanza della regione amidica Amide I e II fino agli acidi nucleici per esposizioni a 1 MHz e 3 MHz in corrispondenza delle 3 distanze campione trasduttore SSD 5 10 15 cm e peri tempi 5 15 30 45 60 In questa regione sono localizzate anche le bande P 1455 em e P2 1395 em tipicamente associate al bending dei gruppi metilene CH2 e metile CH3 presenti nei lipidi di membrana 139 Spettr FTIR zona Amidi Acid Hueleici HIH 3T3 1 MHz Ctl Sonic S SSD 5 cm Sonic 19 SS0 5 cm Sonic 30 SS0 5 cm Sonic 4 SSD 5 em Sonic GO SS0 5 cm 1500 1700 1600 1500 1400 1200 1200 1100 1000 Sonic 5 SSD 10 cm Sonic 19 SSD 410 cm Sonic 30 S50 10 em Sonic 49 SSD 410 cm Sonic GO 5 SD 10 em 1500 1700 1 600 1500 1400 1300 1200 1100 1000 900 1500 Ctrl Sonic 9 SSD 15 cm Sonic 15 S8D 15 cm Sonic S0 SSD 15 cm Sonic 45 S50 15 cm Sonic 60 SSD 15 cm 1800 1700 1600 1500 1400 1300 1200 1100 1000 lunghezza d onda cm 1
76. 11 Tabella riassuntiva dei risultati ottenuti per esposizione ad ultrasuoni a 1 MHz 75 High La tabella 5 8 mostra lo schema riassuntivo dei risultati ottenuti con la microscopia a fluorescenza per esposizione dei campioni ad US alla frequenza di 1 MHz 75 High in termini di Elevato livello di uptake di calceina Medio livello di uptake di calceina Scarso livello di uptake di calceina per ciascuna distanza campione trasduttore SSD 5 10 15 cm e relativa intensit incidente sul campione per tutti 1 tempi di sonicazione 30 45 60 Si osserva che un elevato uptake di calceina stato rilevato per le configurazioni espositive SSD 5 cm t 30 SSD 10 cm t 30 SSD 15 cm t 45 e t 60 Anche in questo caso un importante internalizzazione del fluoroforo si riscontra in corrispondenza della configurazione espositiva SSD 15 cm a cui corrisponde un intensit acustica incidente sul campione pari a 0 06 W cm per i tempi di sonicazione di 45 e 60 Tale risultato assieme alle variazioni dei parametri spettroscopici rilevati per la stessa distanza campione trasduttore mediante la spettroscopia FTIR consente di supporre che in queste condizioni di esposizione vengano indotti da esposizione ad US cambiamenti a livello di membrana quali formazione di pori che costituiscono condizione favorevole all internalizzazione del fluoroforo Frequenza US 1 MHz 75 high LEGENDA ESPOSIZIONE DELLE CELLULE AD US 1 MH
77. 136 6 mm dal diffusore per una frequenza di eccitazione pari a 1 320 MHz 0 025 0 020 0 015 Urms V 0 010 0 005 0 000 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 distanza dal trasduttore mm Figura 3 8 valore rms della tensione lungo l asse z in funzione della distanza dal trasduttore per f 1 320 MHz Inoltre stato determinato 11 valore rms massimo della tensione Umax rms utile per calcolare la pressione acustica massima nell intero campo acustico e il parametro BNR pari a 0 028329 V posizionato a circa 33 mm dal diffusore Le figure 3 9 e 3 10 mostrano 1 raster scan 2D della tensione Urms V misurata e 3D della pressione in dB calcolata sul piano ortogonale all asse z del trasduttore alla distanza da questo di 0 3 cm per una frequenza del segnale di eccitazione del trasduttore di 1 320 MHz 83 Raster scan 3mm freg 1 3MHz Urms W 2 000E 04 0 002622 0 005044 0 007467 0 009569 0 01231 0 01473 0 01716 0 01958 0 02200 Figura 3 9 raster scan 2D tensione rms ai capi dell idrofono misurata sul piano ortogonale all asse di propagazione del fascio a z 0 3 cm dal trasduttore frequenza 1 320 MHz E 236 242 E 230 236 a E 224 230 fa pi if my it V i Ul Figura 3 10 raster scan 3D pressione in dB calcolata sul piano ortogonale all asse di propagazione del fascio a z 0 3 cm dal trasduttore frequenza 1 320 MHz 0218 224 0212 218 E 206
78. 15 _ac nucleici SSD 15 cm E son 30 _ac nucleici SSD 15 cm son 45 _ac nucleici SSD 15 cm son 60 _ac nucleici SSD 15 cm 1 0 5 0 0 5 1 1500 PC1 96 vl N IVI MAL n i o 1450 1400 1350 1300 lunghezza d onda cm 1 Figura 5 14 PCA su dati spettroscopici per esposizione a US a 1 MHz SSD 15 cm regione spettroscopica associata alle bande P e P e relativo loading plot 141 Per quanto riguarda la regione spettrale a cui appartengono le bande P e P2 per esposizioni dei campioni cellulari ad US alla frequenza di 3 MHz l analisi PCA per la distanza campione trasduttore SSD 5 cm figura 5 15 con relativo loading plot mostra che gli spettri per 1 quali presente una significativit sono quelli relativi ad esposizioni a 15 45 e 60 MA i fp l AV aa wh SU Uiii WV J PC2 2 loading e CTRL B son 5 _ac nucleici SSD 5 cm A son 15 _ac nucleici SSD 5 cm B son 30 _ac nucleici SSD 5 cm son 45 _ac nucleici SSD 5 cm son 60 _ac nucleici SSD 5 cm 1 08 06 04 02 0 02 04 06 08 1 1500 1450 1400 1350 1300 PC1 98 lunghezza d onda cm 1 Figura 5 15 PCA su dati spettroscopici per esposizione a US a 3 MHz SSD 5 cm regione spettroscopica associata alle bande P e P e relativo loading plot Dalla figura 5 16 si osserva che per esposizione dei campioni a 3 MHz distanza di sonicazione di 10 cm 1 tempi di esposizione in corrispondenza dei quali gli US sembrano produrre un effett
79. 2 5 6 2 4 Risultati per esposizioni a 3 MHz 100 High SSD 10 cm t 60 173 5 6 2 5 Risultati per esposizioni a 3 MHz 100 High SSD 15 cm t 30 t 45 e 173 t 60 5 6 2 6 Tabella riassuntiva dei risultati ottenuti per esposizione ad ultrasuoni a 175 3 MHz 100 High 5 7 Citofluorimetria a flusso risultati sperimentali 176 5 7 1 Risultati sperimentali per esposizione ad ultrasuoni a 1 MHz 75 High 177 5 7 2 Risultati sperimentali per esposizione ad ultrasuoni a 3 MHz 100 High 180 5 8 Microscopia confocale risultati sperimentali 181 CONCLUSIONI 186 BIBLIOGRAFIA 190 INTRODUZIONE Gli ultrasuoni US sono radiazioni meccaniche non ionizzanti di frequenze superiori ai 20 kHz quindi non percepibili dall orecchio umano L apparente innocuita insieme all ampia versatilita anche in campo industriale ne ha incrementato notevolmente l utilizzo specialmente in campo medico nella diagnostica e nella terapia 1l livello di intensit ultrasonora emessa dagli apparecchi consente di passare da onde acustiche utilizzate a fini diagnostici es ecografia intensit generalmente inferiori al centinaio di mW cm ad applicazioni di tipo terapeutico es onde d urto fisiatriche intensit dell ordine dei W cm utilizzate ad esempio nella riparazione delle fratture ossee dei tendini nel trattamento dei tessuti cicatriziali fino alle tecniche non invasive di ablazione chirurgica HIFU che impiegano US ad intensit dell ordine dei K
80. 2 mm a partire da 0 3 cm dalla faccia del trasduttore ricerca del massimo del campo di pressione Pmax 3 raster scan della pressione ultrasonora su 2 piani ortogonali all asse principale dei trasduttori alle distanze 0 3 cm e Zn 4 calcolo dei parametri ERA e BNR ai sensi della norma 61689 2009 3 3 2 Risultati del diffusore a 1 MHz Inizialmente 11 diffusore stato alimentato con tone burst sinusoidale alla sua frequenza nominale di MHz ed stato effettuato uno scan dell output dello stesso in termini di tensione ai capi dell idrofono lungo l asse orizzontale z a partire dalla distanza di 3 mm dal suo centro geometrico In questa condizione stata individuata grossolanamente la posizione dell ultimo massimo zy del trasduttore oltre il quale il campo acustico tende a decadere esso stato individuato a circa 130 mm dal trasduttore In corrispondenza di questa posizione stato eseguita la misura della risposta in frequenza del trasduttore valutata tra 900 kHz e 1 4 MHz a passi di 10 kHz al fine di individuare la frequenza che massimizza il segnale acustico letto dall idrofono I risultati sono riportati in figura 3 7 a dal grafico si evince che la risposta in frequenza per il trasduttore a 1 MHz non mostra un picco ben definito ma presenta un andamento con diversi massimi locali Ai sensi della norma CEI EN 61689 la frequenza di lavoro del sistema risulta pari alla media aritmetica delle frequenza f e fz in
81. 22 28 194 Karshafian R Bevan PD Williams R Samac S Burns PN Sonoporation by ultrasound activated microbubble contrast agents effect of acoustic exposure parameters on cell membrane permeability and cell viability Ultrasound Med Biol 2009 May 35 5 847 60 Karshafian R Samac S Bevan PD Burns PN Microbubble mediated sonoporation of cells in suspension clonogenic viability and influence of molecular size on uptake Ultrasonics 2010 Jun 50 7 691 7 Kim B S Cho M and Kim H J Mutat Res Statistical analysis of in vivo rodent micronucleus assay 469 2000 pp 233 241 Kimmel E 2006 Cavitation bioeffects Crit Rev Biomed Eng 34 105 161 Kodama T Hamblin M R and Doukas A G Cytoplasmic Molecular Delivery with Shock Waves Importance of Impulse Biophysical Journal Volume 79 October 2000 1821 1832 Kolar J Babickj A Kaslova J amp Kasi J 1965 The effect of ultrasound on the mineral metabolism of bones Travmatol protezinov 26 8 43 51 Krasovitski B Frenkel V Shoham S Kimmel E Intramembrane cavitaion as a unifying mechanism for ultrasound induced bioeffects Proc Natl Acad Sci U S A 2011 Feb 22 108 8 3258 63 Langton N H Vaugan P Cavitation and the ultrasonic degradation of high polymers Brit J Appl Phys 1962 13 478 482 Lazar DA Curra FP Mohr B McNutt LD Kliot M Mourad PD 2001 Acceleration of recovery after injury to the peripheral nervous system using ultrasound
82. Dalla determinazione di Agcs possibile ricavare il parametro ERA tramite la ERA F Ages 0 3 1 354 A 5 0 3 2 3 in cul Apcs 0 3 si riferisce alla beam cross sectional area determinata a 0 3 cm dalla faccia del trasduttore estrapolate indietro alla faccia del manipolo Agcs 0 che contiene il 100 della pressione acustica totale tramite il fattore adimensionale Fx collegato alla divergenza del fascio per un fascio collimato il fattore Fa pari a 1 354 La misura della beam cross sectional area Agcs viene operativamente eseguita effettuando uno scan di misura della pressione acustica con idrofono in un piano perpendicolare all asse di propagazione del fascio e parallelo alla faccia della testa emittente alla distanza di 0 3 cm dalla stessa contenente una griglia di almeno 31x31 punti e valutando la pressione quadratica media totale pmst N pmst p 1 M 2U i l i l 2 4 48 con N numero di punti dello scan della superficie U voltaggio di picco o r m s misurato ai capi dell idrofono in ciascun punto del raster scan p pressione in ciascun punto 1 dello scan del piano M sensibilit dell idrofono Agcs definito come la minima area in un piano perpendicolare all asse di allineamento del fascio che contiene il 75 del valore quadratico medio della potenza acustica totale pmst I valori di U cos determinati devono pertanto soddisfare la seguente relazione N 1 M YU lt 0 75 pmst lt 1 M X U
83. H 07 H HO H 0O HO HO gt H O Q R 0 ROO Figura 1 9 1 radicali liberi prodotti dagli ultrasuoni L irradiazione ultrasonora dell acqua porta alla formazione del radicale ossidrile e radicale idrogeno che danno come prodotti finali principali H202 perossido d idrogeno e Ho L esposizione ultrasonora in presenza di ossigeno porta alla formazione di atomi di ossigeno questi ultimi reagiscono con l ossigeno per formare 1 radicali HO Le specie reattive a contenuto di ossigeno sono principalmente radicale superossido OQ 2 radicale idrossido OH radicale perossido ROO e perossido di idrogeno H202 Riesz 1992 Barnett 1998 A livello cellulare la produzione di radicali indotti da esposizione ad US pu produrre anche effetti biologici sul DNA studi sperimentali e modelli teorici hanno messo in evidenza come gli effetti degli US sui biopolimeri riguardano soprattutto la degradazione delle strutture per via meccanica Langton 1962 Alcuni tipi di legami chimici nelle macromolecole vengono spezzati per le forze di impatto e di shear che si generano a causa delle variazioni di pressione o in seguito al fenomeni cavitatori che portano alla formazione dei radicali I danni al DNA possono essere attribuiti all azione meccanica e sonochimica della cavitazione L azione meccanica degli US si ha quando cellule e microbolle interagiscono direttamente Fuciarelli 1995 Le forze di shear dovute alla presenza
84. Incertezza mediato su 2 acquisizioni mm W 14 13 10 0 con 2 acquisizioni 15 14 28 10 A 4 con 2 acquisizioni 14 395 8 0 con 2 acquisizioni 15 14 4 8 A 4 con 2 acquisizioni 14 41 3 0 con 2 acquisizioni 15 14 46 3 4M 4 con 2 acquisizioni 50 continua 7 549 10 0 con 2 acquisizioni 15 7 5135 10 A 4 con 2 acquisizioni 7 5735 8 0 con 2 acquisizioni 15 7 6475 8 A 4 con 2 acquisizioni 7 571 3 0 con 2 acquisizioni 15 7 648 3 4M 4 con 2 acquisizioni Potenza totale 3 MHz 100 continua 4 61 W ERA stimato per trasduttore a 3 MHz 1 8 cm Tabella 3 2 risultati delle misure di potenza totale per il trasduttore a 3 MHz 3 3 Caratterizzazione presso CNR IDASC Roma Con la finalit di valutare le caratteristiche emissive degli strumenti per fisioterapia e estetica a disposizione 1 dispositivi sono stati caratterizzati ai sensi della norma CEI EN 61689 2009 Ultrasuoni Sistemi di fisioterapia le specifiche dei campi e metodi di misura nella gamma di frequenza da 0 5 MHz a 5 MHz per la determinazione dei parametri emissivi ERA e BNR non noti dal costruttore Tali misurazioni sono state effettuate presso il CNR IDASC Istituto di Acustica e sensoristica Orso Maria Corbino Area della Ricerca di Tor Vergata Roma che possiede l adeguata catena di misura T1 3 3 1 Procedure sperimentali e set up di misura Le misurazioni ai sensi della norma CEI EN 61689 2009 prevedono l
85. KI i IVI Il LU VITI TEO ae TAD 750 moc Figura 4 3 caratteristiche dell impulso con duty cycle High 4 3 Caratterizzazione del campo acustico prodotto dalle sorgenti di ultrasuoni Il lavoro ha previsto la caratterizzazione del campo acustico prodotto dalle sorgenti degli US a I MHz e 3 MHz attraverso la misura della pressione acustica con idrofono libero e idrofono inserito nella capsula petri riempita con PBS in corrispondenza delle distanze SSD a cui sono stati esposti 1 campioni biologici 11 calcolo dell intensit del campo acustico generato dai diffusori e della quantit di energia incidente sulle cellule durante la sonicazione che in questo lavoro abbiamo chiamato dose J cm in termini di prodotto dell intensit emessa dal trasduttore per il tempo di esposizione In accordo con le misure di pressione ultrasonora ai capi dell idrofono libero effettuate presso il CNR a varie distanze trasduttore idrofono sono stati individuati 1 parametri pi adeguati per le esposizioni dei campioni biologici in termini di distanza campione trasduttore SSD identificati in 101 5 10 e 15 cm per ciascuna distanza campione trasduttore 1 campioni biologici sono stati sonicati peri tempi di 5 15 30 45 e 60 minuti Figura 4 4 set up sperimentale per la caratterizzazione del campo acustico prodotto dal trasduttore Per la caratterizzazione stato utilizzato un idrofono della Precision Acousti
86. LLLLLLLLLD MLL MUL MLLLLLLLLL LLL LL w in j le ated cells 500 b leated cell A Oo ee AAAY Micronucleatedce 00 binucle ated cells be La C k amp Ym amp p ENAN I ene N WS ZN Figura 5 31 frequenze dei micronuclei dei campioni sonicati alla frequenza di 1 MHz per le 3 distanze SSD con esplicitate le relative intensita incidenti sul campione e per 5 15 30 45 e 60 minuti di esposizione Per quanto riguarda l esposizione a 1 MHz stata riscontrata una correlazione statisticamente significativa tra il tempo di esposizione e la frequenza dei micronuclei alla distanza SSD 5 cm r 0 9789 p 0 0007 a SSD 10 cm 1 0 9257 p 0 0081 e a SSD 15 cm r 0 9945 p 0 00004 La figura 5 32 e la tabella 5 6 mostrano le frequenze dei micronuclei dei campioni sonicati alla frequenza di 3 MHz 155 1 MHz 75 High Tempo di N ro di campioni Micronucleated cells Binucleated cells Standard Deviation esposizione SSD 5 cm SSD 10 cm SSD 15 cm I 0 09 W cm 0 08 W cm 0 06 W cm an a pa e r e e e r ST penare e Tabella 5 5 frequenze dei micronuclei dei campioni sonicati alla frequenza di 1 MHz per le 3 distanze SSD e per 5 15 30 45 e 60 minuti di esposizione I intensit incidente sul campione in corrispondenza della selezionata SSD r e B control Zi 0 03 W em2 60 01 Wem E 0 009 W cm2 YY cronucle ated cells 500 binucle ated cells
87. La norma CEI EN 60601 2 5 stabilisce che 11 BNR non deve superare il valore di 8 0 per ogni testa di trattamento la potenza di uscita deve rimanere costante entro il 20 dal valore iniziale durante un ora di funzionamento continuo ed infine l intensit effettiva massima non deve superare 3 W cm per ogni testa di trattamento la norma per non fornisce indicazioni chiare sulla tempistica per l effettuazione dei controlli sulla strumentazione La norma CEI EN 61689 stabilisce che la funzionalit e la qualit dei dispositivi ad US sono definite principalmente da frequenza acustica di lavoro che influenza la profondit di penetrazione degli US nei tessuti area effettiva radiante ERA area della sezione trasversale del fascio estrapolata alla superficie frontale della testa di 62 trattamento e moltiplicata per un fattore adimensionale parametro connesso alle dimensioni superficiali dell area trattata rapporto della non uniformita del fascio BNR rapporto tra il quadrato del valore efficace della pressione acustica di picco spaziale e la media spaziale del quadrato del valore efficace della pressione acustica dove la media spaziale calcolata sull ERA tale valore rilevante per la sicurezza in quanto determina la possibilit che all interno del fascio US si creino hot spot zone in cui la pressione acustica particolarmente elevata con rischio di riscaldamenti eccessivi dei tessuti esposti potenza di uscita media ne
88. SAPTENZA UNIVERSITA DI ROMA DOTTORATO DI RICERCA IN IGIENE INDUSTRIALE E AMBIENTALE XXIV CICLO L USO DEGLI ULTRASUONI ALLE FREQUENZE TERAPEUTICHE STUDIO DEGLI EFFETTI INDOTTI IN LINEE CELLULARI UTILIZZANDO SPETTROSCOPIA FTIR E MICROSCOPIA Tutore scientifico Candidato Prof ssa Agostina Congiu Castellano Claudia Giliberti ANNO ACCADEMICO 2010 2011 INDICE INTRODUZIONE PARTE I CAPITOLO 1 Gli ultrasuoni l interazione con la materia vivente e le applicazioni terapeutiche 1 1 La fisica degli ultrasuoni 1 2 Effetti biologici degli ultrasuoni 1 2 1 Studi in vitro degli effetti indotti da ultrasuoni utilizzando tecniche spettroscopiche 1 3 Applicazioni mediche degli ultrasuoni 1 4 Applicazioni estetiche degli ultrasuoni 1 5 La dosimetria degli ultrasuoni CAPITOLO 2 Problematiche connesse con l uso degli ultrasuoni in fisioterapia e in estetica 2 1 Normativa per le apparecchiature ad ultrasuoni in fisioterapia ed estetica 2 1 1 Normativa sui dispositivi medici 2 1 1 1 La Direttiva Europea 93 42 sui dispositivi medici 2 1 1 2 La norma CEI EN 60601 1 sugli apparecchi elettromedicali 2 1 2 Norme tecniche specifiche per gli ultrasuoni in fisioterapia 2 1 2 1 La norma CEI EN 60601 2 5 2 1 2 2 La norma CEI EN 61689 2 1 2 3 Altre norme la norma CEI EN 61161 2 1 3 Normativa sugli ultrasuoni in estetica 2 1 3 1 Normativa per l estetica non medica 2 1 3 1 1 La norma tecnica CEI 62 39 2 1 3 1 2 La legge 1
89. Therapeutic Applications of Ultrasound Ch 11 in Biological Effects of Ultrasound W L Nyborg and M C Ziskin eds Churchill Livingstone Dyson M Mechanisms involved in therapeutic ultrasound Physioterapy 1987 73 116 20 191 Edwards MJ Walsh DA Li Z 1997 Hyperthermia teratogenesis and the heat shock response in mammalian embryos in culture Int J Dev Biol 41 345 358 EHC Environmental Health Criteria 22 1982 Ultrasound FDA 1997 Information for manufacturers seeking marketing clearance of diagnostic ultrasound systems and transducers Division of Reproductive Abdominal Ear Nose Throat and Radiological Devices Office of Device Evaluation US Department of Health and Human Services Food and Drug Administration www fda gov cdrh ode ulstran pdf FDA 2006 Performance standards for sonic infrasonic and ultrasonic radiation emitting products Food and Drug Administration Available at http www accessdata fda gov scripts cdrh cfdocs cfCFRCFRSearch cfm CFRPart 1 5 amp showFR 1 Accessed September 22 2006 Fenech M The in vitro micronucleus tecnique Mutation Research 455 2000 81 95 Ferrari C B Andrade JC Adamowski RRJ Guirro Evaluation of therapeutic ultrasound equipments performance Ultrasonics 50 2010 704 709 Forbes MM Steinberg RL O Brien WD Jr Frequency dependent evaluation of the role of definity in producing sonoporation of Chinese hamster ovary cells J Ultrasound Med 2011 Jan 3
90. W cm utilizzate per il trattamento di tumori Da alcuni anni si ricorre all applicazione degli US anche in campo estetico sia medico che non medico nel primo caso 1 trattamenti afferiscono alla cosiddetta medicina estetica branca della medicina le cui terapie eseguite negli ambulatori sono dirette alla prevenzione ed alla correzione degli inestetismi costituzionali o acquisiti quali esiti di malattia Nell ambito della medicina estetica gli US vengono tipicamente impiegati in regime di cavitazione fenomeno associato alla variazione ciclica della pressione che si registra al passaggio del fascio ultrasonico che determina l implosione di bolle di vapore e la conseguente lisi degli adipociti con rilascio dei lipidi per il trattamento della cellulite Nel caso invece della cosiddetta estetica non medica ci troviamo di fronte ad applicazioni il cui aspetto terapeutico ricade nella sola sfera psicologica dell utente poich le prestazioni ed 1 trattamenti eseguiti dall estetista riguardano esclusivamente la superficie del corpo umano e il loro scopo quello di mantenerlo in perfette condizioni di migliorarne e proteggerne l aspetto estetico modificandolo attraverso l eliminazione o l attenuazione degli eventuali inestetismi presenti In questo caso l attivit pu essere svolta con l ausilio di apparecchi che nel caso di utilizzo degli US sono opportunamente progettati per lavorare a frequenze tali da non con
91. a Va tuttavia sottolineata l importanza di arrivare ad una definizione del concetto di dose per le applicazioni terapeutiche degli US che possa mettere in relazione l esposizione con l eventuale effetto biologico danno osservato Tale risultato potrebbe essere ottenuto mediante tecniche teoriche di simulazione numerica della propagazione del fascio ultrasonoro in tessuti e campioni biologici e tecniche sperimentali cio progettando e realizzando opportuni fantocci costituiti ad esempio da sandwich di elementi tessuto equivalenti accoppiati a termocoppie o termocamere per la misura della temperatura locale disponendo anche di un database consolidato per valutare 1 modelli dosimetrici attraverso studi in vivo e in vitro su questo argomento sono attualmente in corso progetti europei con lo scopo di arrivare finalmente ad una definizione del concetto di dose ultrasonora per il momento assente Tale obiettivo richiede una conoscenza approfondita delle caratteristiche del fascio ultrasonoro fondamentale sia nello studio degli effetti biologici degli US sia nella valutazione dell efficacia e dei possibili rischi per la salute connessi a determinati trattamenti terapeutici Sono stati identificati diversi meccanismi biofisici alla base di effetti biologici degli US di varia natura effetto meccanico effetto termico ecc 1 quali a loro volta possono costituire l effetto desiderato del trattamento oppure un effetto indesiderato poten
92. a calceina nel campione di controllo in accordo con quanto atteso posizionata su livelli bassi tra 10 e 10 Inoltre si evidenzia la determinazione del gate M1 regione considerata positiva per l uptake della calceina nel confronto con 1 campioni sonicati Per 11 campione di controllo la percentuale degli eventi gated che cadono nella regione M1 Gated M1 2 63 Figura 5 60 istogramma a 2 parametri e a 1 parametro per il campione di controllo 1 MHz In figura 5 61 riportato un esempio di istogramma per una delle configurazioni espositive indagate che ha mostrato un buon uptake della calceina in particolare SSD 10 cm t 60 177 Figura 5 61 istogramma a 2 parametri e a 1 parametro per il campione sonicato a 1 MHz SSD 10 cm t 60 In tabella 5 13 sono riportati 1 risultati complessivi delle misure di citofluorimetria per esposizioni dei campioni ad US alla frequenza di 1 MHz con riferimento alla percentuale degli eventi che cadono nel gate M1 gated M1 Si evidenzia un elevato uptake della calceina nei campioni sonicati rispetto al controllo per tutte le distanze campione trasduttore e tutti 1 tempi di sonicazione I risultati riportati in tabella 5 13 mostrano che per ciascuna intensit ultrasonora incidente sul campione l internalizzazione della calceina tende ad aumentare al crescere del tempo di sonicazione inoltre a parit di tempo di sonicazione si evidenzia un uptake indipendente dall intensi
93. a il tempo impiegato per percorrere una distanza pari alla lunghezza d onda la velocit di propagazione c m s caratteristica del mezzo nel quale si diffondono le onde meccaniche ed data da c A f Poich la frequenza una propriet intrinseca dell onda acustica la lunghezza d onda varia al passaggio tra due mezzi con velocit di propagazione differenti la potenza di un fascio ultrasonoro W energia trasportata nell unit di tempo la pressione acustica di un fascio ultrasonoro descrive il grado di compressione e rarefazione e quindi la forza per unit di superficie a cui sottoposto 11 materiale Le compressioni e rarefazioni hanno luogo alla frequenza del suono kHz o MHz nel caso degli US L unit di misura della pressione il Pascal Pa N m forza esercitata su una superficie e suoi multipli ad esempio MPa ic His piesa MPs Amplitude Lime i pes Figura 1 5 rappresentazione schematica di un onda acustica in termini di ampiezza vs distanza e vs tempo e pressione ultrasonora 14 Particolarmente importante la determinazione della pressione acustica negativa di cresta intesa come massimo del modulo della pressione acustica istantanea negativa in un campo acustico o in una superficie durante un periodo di ripetizione dell impulso ultrasonoro l intensit dell onda W cm quantit di energia che fluisce nell unit di tempo attraverso una superficie di area unitaria pe
94. a nella matrice extracellulare analogamente a quanto effettuato nella microscopia a fluorescenza Sono state acquisite infine immagini di sezioni ottiche del campione esposto pari a 1 Um ottenute attraverso un sezionamento ottico ripetuto 127 CAPITOLO 5 RISULTATI SPERIMENTALI E DISCUSSIONE 5 1 Misure di spettroscopia FTIR parametri spettrali Tutti gli spettri FTIR ottenuti hanno mostrato un buon rapporto segnale rumore e sono risultati riproducibili Le differenti bande di assorbimento dovute all elevato numero di modi vibrazionali possono essere fittate sommando il contributo delle principali macromolecole come proteine lipidi carboidrati e polinucleotidi La figura 5 1 mostra uno spettro di controllo di cellule NIH 3T3 ove vengono evidenziati gli assorbimenti delle varie strutture che compongono lo spettro Absorbance au 4000 3500 S000 2500 2000 1500 1000 Wavenumber cm 1 Figura 5 1 spettro di cellule NIH 3T3 con le bande di assorbimento caratteristiche L assegnazione delle bande osservate stata effettuata in base a dati precedentemente pubblicati Lin 2004 128 Nella Tabella 5 1 vengono riportate le assegnazioni delle varie strutture presenti nella figura 5 1 e in particolare il numero d onda dei picchi cm le labels e l assegnazione delle bande di assorbimento negli spettri IR delle cellule Seas ahs Assegnazione 1 d onda cm 8 Stretching asimmetrico di CH nel gruppo metile
95. a qualit e alla sicurezza dei suddetti trattamenti attraverso l esame della letteratura scientifica della legislazione e delle norme tecniche al fine di fotografare lo stato dell arte evidenziare le criticit e formulare proposte rivolte sia all autorit sanitaria sia al settore produttivo Per il settore estetico dal punto di vista normativo 1 risultati evidenziano l assenza sia in campo medico che non medico di norme tecniche specifiche volte a dare indicazioni sulle definizioni delle quantit fisiche utili per determinare le caratteristiche di output dei sistemi sui valori massimi di tali grandezze e sulle modalit di effettuazione delle misure in analogia con le norme presenti per la fisioterapia Per quanto riguarda le applicazioni degli US in medicina estetica si evidenzia la necessit di documentare scientificamente l effetto biologico indotto le eventuali controindicazioni gli effetti collaterali A maggior ragione dovrebbe sussistere l obbligo di documentare con riferimenti scientifici gli effetti biologici prodotti dai dispositivi utilizzati nell estetica non medica garantendo la sicurezza dei trattamenti estetici per mezzo di limiti di esposizione scientificamente fondati Per quanto riguarda le applicazioni fisioterapiche in cui le persone sono deliberatamente esposte agli US allo scopo di ottenere un beneficio terapeutico esistono ancora margini di incertezza circa la reale efficacia del trattamenti sono
96. a regione amidica in cui evidente il picco importante dell Amide I posizionato a circa 1640 cm oO hw i ta PC2 21 loading Co i A Ni IN y WIN CTRL B son 5 amidi SSD 5 cm son 15 amidi SSD 5 cm son 30 amidi SSD 5 cm son 45 _amidi SSD 5 cm son 60 _amidi SSD 5 cm c3 a hu t DA 0 8 0 6 04 0 2 0 0 2 04 0 6 0 8 1480 1530 1580 1630 1680 PC1 80 lunghezza d onda cm 1 Figura 5 18 PCA su dati spettroscopici per esposizione a US a 1 MHz SSD 5 cm regione amidica 144 In questa regione l analisi PCA applicata alla derivata seconda degli spettri ottenuti per esposizioni dei campioni cellulari ad US alla frequenza di 1 MHz per le distanze SSD 5 10 15 cm per 1 differenti tempi riportata nelle figure 5 18 5 19 5 20 I risultati mostrano che per SSD 5 cm la sonicazione sembra produrre variazioni significative per esposizioni a t 5 15 e 60 per SSD 10 cm per t 30 per SSD 15 cm per t 15 30 45 e 60 CTRL E son 5 _amidi SSD 10cm A son 15 amidi SSD 10 cm E son 30 amidi SSD 10 cm son 45 amidi SSD 10 cm son 60 _ amidi SSD 10 cm C2 12 1 1480 1530 1580 1630 1680 1 0 8 0 6 04 0 2 0 02 04 06 08 lunghezza d onda cm 1 PC1 93 Figura 5 19 PCA su dati spettroscopici per esposizione a US a 1 MHz SSD 10 cm regione amidica loading e CTRL B son 5 _amidi SSD 15 cm A SOn 15 amidi SSD 15 cm E son 30
97. ale cannula da aspirazione Questo approccio chirurgico seppur efficace presenta numerosi inconvenienti per 1 pazienti legati al ricovero all anestesia generale al dolore post operatorio alla presenza di ecchimosi e gonfiore nell area trattata al recupero post operatorio oltre ad altri rischi inerenti le procedure chirurgiche A questo 28 si aggiungono anche la tendenza a produrre complicazioni quali ustioni e irregolarita della pelle e la probabilita di danneggiare vasi sanguigni nervi e muscoli Asher 2010 Tecniche pi recenti prevedono l applicazione degli US senza intervento chirurgico utilizzando la cosiddetta cavitazione estetica che consiste nell applicazione di onde ultrasoniche che determinano l implosione di bolle di vapore e la conseguente lisi delle cellule del tessuto adiposo L energia ultrasonora attraverso questa procedura non invasiva pu essere fornita al tessuto in due forme non focalizzata e focalizzata Wer lls ta WL LULL hls Figura 1 18 estensione del fascio ultrasonoro quando l energia emessa da un trasduttore piano o focalizzato Nel primo caso poich l energia ultrasonora decresce con la distanza a causa dell attenuazione la pelle risulta esposta ad una intensit superiore rispetto al grasso sottocutaneo che costituisce invece il vero bersaglio del trattamento Nel caso di US focalizzati invece l energia ultrasonora viene concentrata in una pre
98. ale usa per eccitare le molecole una sorgente luminosa molto intensa il 124 laser La luce del laser viene fatta convergere dalle lenti dell obiettivo in un punto estremamente piccolo del campione osservato il punto stesso attraverso un sistema di specchi oscillanti viene spostato attraverso tutto il campo visivo dell obiettivo cos da effettuare una scansione completa di tutto il piano focale I campioni utilizzati per l analisi devono essere marcati con un probe 0 dye fluorescente Nella scelta del probe necessario considerare vari fattori le lunghezza d onda di eccitazione ed emissione le linee di laser disponibili 1 filtri da utilizzare ecc Il laser eccita 1 soli fluorocromi appartenenti al piano focale corrispondenti al punto di massima concentrazione del raggio in questo modo le sezioni non appartenenti al tale piano non vengono eccitate e il risultato complessivo una riduzione degli aloni e del rumore di fondo Il principio di funzionamento di un microscopio confocale illustrato in figura 4 22 la luce emessa dal laser viene deviata dallo specchio dicroico investe il campione e lo eccita I fluorocromi emettono una radiazione luminosa che catturata dalle lenti dell obiettivo colpisce nuovamente lo specchio dicroico attraverso 11 quale la luce riflessa deviata mentre la luce fluorescente viene inviata prima al pinhole e poi ad un filtro giungendo cos al fotomoltiplicatore Il pinhole funge da diafram
99. all energia fornita Tale risultato puo risultare utile nello studio della trasfezione genica in vitro mediata da US poich il movimento del doppio strato lipidico puo essere associato con il cambiamento di permeabilit della membrana plasmatica con formazione di pori temporanei In un ulteriore lavoro del 2011 Grimaldi 2011 sono stati posti a confronto gli effetti dell esposizione ad US terapeutici sui fibroblasti murini con quelli ottenuti sulla linea cellulare tumorale linfociti T Jurkat utilizzando la spettroscopia FTIR e il test dei micronuclei per rilevare danni genotossici e citotossici al variare delle condizioni di esposizione Il confronto tra 1 risultati della spettroscopia FTIR per tutte le componenti cellulari lipidi proteine acidi nucleici delle due linee ha mostrato che le cellule Jurkat sono molto sensibili agli US nella regione dei lipidi mentre 1 fibroblasti nella regione degli acidi nucleici Un importante effetto genotossico risultato presente per entrambe le linee cellulari solo per tempi di sonicazione lunghi 60 minuti per NIH 3T3 45 e 60 minuti per Jurkat alla distanza di 15 cm campione trasduttore mentre per le cellule Jurkat stato riscontrato anche un significativo effetto citotossico per lunghi tempi di esposizione Il lavoro mostra una radicale differenza di comportamento a seguito di esposizione ad US delle due linee cellulari a dimostrazione del fatto che l identificazione della tipologia di cellula
100. amenti graduando progressivamente 11 valore della densit di potenza e la durata dell applicazione evidente che l apparecchiatura deve essere provvista di un opportuno comando per variare la potenza emessa e di un temporizzatore per limitare l esposizione al tempo prestabilito L apparecchiatura non va utilizzata su soggetti portatori di impianti acustici attivi e o con problemi all apparato uditivo E sconsigliato il trattamento nei soggetti con protesi articolari metalliche portatori di pace maker in gravidanza con processi flogistici in atto affetti da neoplasie che presentino lesioni cutanee o varici E altres sconsigliato il trattamento in prossimit di cartilagini ossa apparato riproduttivo e regione cardiaca Il Decreto stabilisce infine che le norme tecniche da applicare per questa tipologia di apparecchi siano la Norma CEI 62 39 Anno 1998 Apparecchi elettrici per uso estetico Guida generale per la sicurezza e relative varianti la Norma CEI EN 60601 2 5 Anno 2001 Apparecchi elettromedicali Parte 2 Norme particolari per la sicurezza delle apparecchiature per la terapia a ultrasuoni e relative varianti con il solo riferimento alla stessa ai fini delle caratteristiche costruttive e dei meccanismi di regolazione in quanto la destinazione d uso delle apparecchiature non medica Si noti che il rispetto di dette norme diviene obbligatorio essendo citate in un provvedimento normativo 2 1 3 2 Normat
101. and other therapeutic modalities Neurosurg Clin N Am 12 353 357 Lehmann J F and de Lateur B J 1982 in Therapeutic Heat and Cold Ch 10 J F Lehmann Ed Williams and Wilkins Baltimore Lehmann JF Clinical evaluation of a new approach in the treatment of contracture associated with hip fracture after internal fixation Arch Phys Med Rehabil 1961 42 95 Leighton TG 1997 The Acoustic Bubble Academic London San Diego pp 312 426 Lele P P 1979 Safety and Potential Hazards in the Current Applications of Ultrasound in Obstetrics and Gynecology Ultrasound in Med and Biol Vol 5 pp 307 320 8 Lin S Y Wei Y S Li M J and Wang S L Effect of ethanol or and captopril on the secondary structure of human serum albumin before and after protein binding European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 57 2004 457 464 195 Marchioni C Riccardi E Spinelli S Dell Unto F Grimaldi P Bedini A Giliberti C Giuliani L Palomba R Congiu Castellano A Structural changes induced in proteins by therapeutic ultrasounds Ultrasonics 2009 Jun 49 6 7 569 76 Miller M W Brayman A A Biological effect of ultrasound The perceived safety of diagnostic ultrasound within the context of ultrasound biophysics a personal perspective Echocardiography A Jrnl Of CV Ultrasound and Allied Tech 1997 14 6 615 627 Miller DL Thomas RM Ultrasonic gas body activation in elodea leaves an
102. ando livelli di esposizione inferiori a 3 W cm Hill WHO 1981 Al di sopra di tale valore stato riscontrato ritardo nella crescita delle ossa e insorgenza di fenomeni di cavitazione con possibilit di danni tissutali Kolar 1965 Wells 1977 Lehmann 1982 Barth e Wachsmann nel 1949 e Payton 1975 trovarono che il limite nell intensit ultrasonora per danno alle ossa nei cani proprio di 3 W cm e che la probabilit dell insorgenza di effetti dannosi pi alta se si usano applicatori stazionari Barth 1949 2 2 2 Valutazione delle performances degli apparecchi ad ultrasuoni usati in fisioterapia L analisi della letteratura sul tema evidenzia grande attenzione alla valutazione delle caratteristiche di output degli apparecchi emittenti US per fisioterapia in termini di conformit alle norme di sicurezza 1 risultati degli studi mostrano che gli strumenti presentano ampia variabilit rispetto ai limiti di tolleranza stabiliti dalle norme tecniche Pye 1994 Pye 1996 Gledhill 1996 Artho 2002 L utilizzo di apparecchiature non calibrate pu avere serie implicazioni per quanto riguarda il trattamento fisioterapico sia in termini di sicurezza del paziente che di efficacia del trattamento stesso infatti macchine con potenze di uscita molto elevate possono produrre esposizioni eccessive con possibili ripercussioni sulla salute del paziente sottoposto a rischi inutili al contrario macchine con potenze di uscita troppo
103. ano attraverso la Food and Drug Administration utilizzando un processo noto come 510 k FDA 1997 Nel mondo 1 singoli governi hanno istituito analoghi processi legislativi che utilizzano criteri di sicurezza per consentire l approvazione alla vendita sul mercato delle apparecchiature Il Canada nel 2010 ha pubblicato Radiation Emitting Devices Regulations Canada 2010 ossia 1 Regolamenti concernenti 1 dispositivi che emettono radiazioni tra cui 1 forni a microonde le apparecchiature dentali e gli apparati diagnostici a raggi X 1 dispositivi per la terapia ad US 1 microscopi elettronici a bassa energia Per quanto riguarda gli apparati ad US part XIII particolare attenzione viene dedicata alle definizioni dei parametri in uso per quanto concerne la terapia ad US alle norme di progettazione e costruzione agli standards di funzionamento al warning signs Inoltre sempre il Canada nel sito riguardante la Environmental and Workplace Health Salute ambientale e sul posto di lavoro Canada 1989 pubblica le Guidelines for the Safe Use of Ultrasound Part I Medical and Paramedical Applications in cui particolare attenzione viene dedicata alla cura dei dispositivi ad US in termini di calibrazione e mantenimento degli stessi alle precauzioni da attuare per garantire la sicurezza dell operatore e del paziente alle controindicazioni all uso degli US al training per gli operatori 34 2 1 Normativa per le apparecchiature ad ult
104. apporto tra l intensit di picco massimo nel campo acustico e l intensit media spaziale un diffusore operante ad un intensit media effettiva di 3 W cm e con un BNR pari a 8 pu produrre picchi di intensit spaziale di 3 x 8 24 W cm che aumenta notevolmente la possibilit di rischio per il paziente Dalla letteratura si evidenzia che controlli effettuati su alcuni dispositivi hanno fornito valori del BNR fino a 14 Hekkenberg 1994 La norma CEI EN 61689 riporta l istogramma dei valori di BNR figura 2 6 per 37 teste di trattamento di vari diametri e frequenze mostrando che normalmente BNR appare essere compreso nel range 3 7 mentre non viene considerato qualitativamente accettabile un BNR superiore a 8 1 3 5 7 9 11 13 15 17 X IEC 1358 07 X Ren Y Number of transducers Figura 2 6 norma CEI EN 61689 2009 istogramma dei valori di BNR 46 Ai sensi della norma CEI EN 61689 2009 il parametro BNR si ottiene analizzando 1 dati della pressione ultrasonora su due piani ortogonali all asse di propagazione del fascio il piano a 0 3 cm dal trasduttore e il piano in corrispondenza dell ultimo massimo assiale La figura 2 7 mostra l andamento teorico spaziale del campo ultrasonoro generato da un generico trasduttore circolare in funzione della distanza dalla sua superficie emittente Preston 1991 relative axial intensity transducer relative diametrical intensity transducer bill 0 x
105. ari La conta delle cellule non stata eseguita in maniera automatizzata ma manualmente Tramite le conte effettuate stato possibile stabilire la frequenza di micronuclei ottenuta contando il numero di micronuclei presenti in 500 cellule binucleate L indice di divisione nucleare NDI stato contato direttamente dai vetrini preparati per 1 micronuclei Le conte sono state eseguite su 15 campioni di controllo per quanto riguarda i campioni sonicati sono stati trattati 8 campioni per ogni misura di distanza e tempo I valori per ciascuna esposizione 113 sono stati confrontati con 1 relativi controlli utilizzando il test di Dunnett Kim 2000 con livello di significativit stabilito a p lt 0 05 Nelle prove di fluorescenza 11 DAPI eccitato da radiazione nel range dell ultravioletto quando legato ad una catena di DNA a doppia elica presenta un assorbimento massimo a 358 nm e un emissione massima a 461 nm L eccitazione nel range dell UV e l osservazione microscopica dei campioni cellulari marcati con DAPI stata effettuata con un microscopio Zeiss Axiophot UV presso il Dipartimento di Biologia Animale e dell Uomo sezione di Anatomia Comparata figura 4 14 utilizzando un filtro di eccitazione a 359 nm ed un filtro di barriera a 441 nm Figura 4 14 microscopio Zeiss Axiophot UV 4 4 3 Il test di vitalit Trypan blue I campioni sono stati sottoposti al test del Trypan Blue attraverso il quale possi
106. ate si deve parlare anche di corrente di dispersione nel paziente intesa come la corrente che dalla parte applicata quando l apparecchio in funzione pu fluire nel soggetto verso terra Le correnti di dispersione presenti nelle normali condizioni d uso possono aumentare in presenza di 40 anomalie nel circuito Si parla in tal caso di correnti di dispersione di primo guasto In funzione delle correnti di dispersione in condizioni normali e di primo guasto verso terra sull involucro e sul paziente gli apparecchi elettromedicali vengono classificati in apparecchi di tipo B BF CF Gli apparecchi di tipo BF e CF per limitare la corrente che puo fluire nel paziente hanno le parti a contatto isolate da terra flottanti mediante disaccoppiamento ad esempio mediante disaccoppiamento ottico ad elevata impedenza capacitiva L isolamento ulteriormente aumentato nelle parti applicate di tipo CF correnti di dispersione nel paziente non superiori a 10 microampere che sono pertanto applicabili direttamente sul cuore 2 1 2 Norme tecniche specifiche per gli ultrasuoni in fisioterapia 2 1 2 1 La norma CEI EN 60601 2 5 La Norma CEI EN 60601 2 5 seconda edizione 2001 Apparecchi Elettromedicali Parte 2 Norme particolari per la sicurezza delle apparecchiature per la terapia ad ultrasuoni nel titolo in inglese si specifica ultrasonic physiotherapy tornisce le prescrizioni e le specifiche relative alle prove rilevant
107. ativa di lavoro del sistema diffusore pi idrofono pari a 1 040 MHz In questo caso 1 risultati di tabella 3 5 mostrano un comportamento anomalo del sistema che presenta valori di BNR al di fuori del range specificato dalla norma BNR 36 85 In particolare il diffusore a 1 MHz presenta valori ottimali dei parametri di cui alla norma CEI EN 61689 2009 per una frequenza diversa da quella fornitagli dal suo generatore vedasi tabella 3 4 La conseguenza quella di aumentare il valore di BNR che risulta maggiore di quello accettato dalla norma libica dita di lavoro del sistema diffusore generatore 1 040 MHz 0 00001 MHz Area effettiva radiante ERA 8 72 cm2 20 Beam non uniformity ratio BNR 36 85 Tabella 3 5 risultati per il trasduttore a 1 MHz frequenza 1 040 MHz Considerando l impiego di tali dispositivi per trattamenti fisioterapici quanto riscontrato sperimentalmente richiede particolare attenzione per valutare gli effetti di un disaccordo in frequenza tra il diffusore e il suo generatore In figura 3 15 riportato il confronto dei due raster scan a 0 3 cm dalla faccia del trasduttore alle 2 frequenze indagate ossia 1 04 MHz e 1 320 MHz si osserva una maggiore irregolarit del campo di pressione prodotto alla frequenza di 1 040 MHz accompagnato tuttavia da un complessivo abbassamento del livello di pressione Ci potrebbe essere legato ad una ridotta efficacia del 87 trattamento stesso ottenuta facendo lavo
108. ativamente ridotti e sono stati caratterizzati valutandone le caratteristiche emissive al sensi della norma CEI EN 61689 2009 Va sottolineato che per questa tipologia di apparecchiatura per trattamenti in campo estetico per descrivere l energia emessa dal trasduttore possono essere utilizzati in linea di principio gli stessi parametri fisici ERA e BNR definiti per la fisioterapia per il caso specifico in assenza di specifiche norme tecniche di riferimento l applicazione della norma 61689 2009 stata estesa al trasduttore usato in estetica Figura 3 1 immagine dello strumento operante a 1 MHz con relativo trasduttore circolare La casa produttrice degli strumenti prevede la vendita del trasduttore abbinato ad un kit che consente all utente di assemblare su precise indicazioni l elettronica del generatore 74 Nessuna indicazione stata trovata sulle caratteristiche emissive dei sistemi eccetto l indicazione che l intensit massima emessa fosse inferiore ai 3 W cm oltre ad un elenco dettagliato delle controindicazioni d uso Gli apparecchi consentono di lavorare in modalit continua e impulsata quando si utilizza il generatore in modalit continua il segnale a 1 o 3 MHz viene applicato senza interruzioni al diffusore Gli strumenti possono lavorare nel range dal 10 al 100 della potenza massima attraverso una manopola sul display dello strumento che consente di variare l ampiezza dell onda emessa Secondo
109. ato con 118 un onda di shock in presenza di calceina si osserva una intensa fluorescenza uniformemente distribuita attraverso l intera cellula 4 4 4 2 Microscopia ottica a fluorescenza preparazione dei campioni Il protocollo utilizzato per effettuare le misure in fluorescenza il seguente 1 le cellule vengono preparate direttamente nelle petri ed incubate fino a confluenza 2 dalle petri lasciate in incubazione viene aspirato il terreno di coltura 3 viene effettuato un lavaggio nella petri con PBS per 1 minuto poi il PBS viene aspirato 4 si aggiunge calceina ad una concentrazione finale 10 uM 5 si effettuano le sonicazioni al termine delle quali in accordo con quanto previsto dalla letteratura Schlicher 2006 stato previsto un recovery di 10 al termine dei quali sono stati effettuati lavaggi con PBS per eliminare la calceina non internalizzata rimasta nel fluido extracellulare per poi procedere all osservazione al microscopio Ipotizzando infatti di produrre a seguito dell esposizione ad US pori transienti di membrana si ritiene che possa determinarsi a causa del gradiente di concentrazione del fluoroforo tra l ambiente extracellulare ricco di calceina e l ambiente intracellulare povero della stessa la presenza di un fenomeno dinamico all interno delle cellule con entrata e uscita del fluoroforo dai pori prodotti Si ipotizza che 1 10 di attesa dopo la sonicazione possano consentire la chiusura
110. azione alle tre distanze campione trasduttore SSD 5 10 15 cm e per 1 tempi 30 45 e 60 Al termine della sonicazione l intero contenuto della petri viene raccolto e depositato in un falcon il restante campione ancora adeso viene tripsinizzato per staccare il residuo del monostrato il campione viene poi sottoposto a due centrifugazioni 1800 rpm con eliminazione del sovranatante il pellet di cellule viene infine raccolto depositato in tubi adatti per la misura al citofluorimetro risospeso in PBS e marcato con 10 ul di Ioduro di Propidio 4 4 6 Microscopia confocale La microscopia confocale una tecnica ottica principalmente utilizzata per lo studio tridimensionale di strutture biologiche isolate o in situ mediante il loro sezionamento ottico consistente nella raccolta di una serie di immagini di piani paralleli spostando il fuoco dell obiettivo lungo un asse che generalmente coincide con l asse di propagazione della luce Per ottenere una perfetta rappresentazione di un singolo piano del campione si dovrebbe idealmente raccogliere soltanto la luce proveniente da quel particolare piano poich tuttavia anche 1 piani sovrastanti e sottostanti emettono luce vi una perdita di nitidezza dell immagine La chiave del successo della tecnica confocale consiste nella rimozione delle interferenze provenienti dai piani adiacenti a quello ove si focalizzati mediante l uso del cosiddetto pinhole La microscopia confoc
111. basandosi sull utilizzo della bilancia a forza di radiazione L onda ultrasonora esercita una forza nota come forza di radiazione su una qualsiasi superficie incidente e tale forza direttamente proporzionale alla potenza totale nel fascio I dispositivi per misurare tale forza sono le bilance a forza di radiazione che misurano la potenza media di un fascio ultrasonoro misurando la forza esercitata dal fascio stesso su un bersaglio all interno della bilancia Perkins 1989 Quando un oggetto solido inserito nel percorso di un onda ultrasonora piana viene trasferito un momento dal fascio all oggetto ed esso sperimenta una forza lungo la direzione di propagazione la forza di radiazione Se l oggetto solido o target pi grande del fascio la forza proporzionale alla potenza acustica totale Con la bilancia a forza di radiazione si dispone il trasduttore a piccole distanze da un bersaglio tipicamente un disco di materiale fonoassorbente collegato all organo di carico di una bilancia che intercetta la radiazione ultrasonora emessa da una sorgente il tutto 50 immerso in una vasca di plexiglass Si effettua una misura di forza di radiazione ossia della variazione apparente della massa del bersaglio che si determina tra il settaggio in cui il fascio ultrasonoro non attivato e il setting che corrisponde invece all attivazione della radiazione ultrasonora da cui si ricava la potenza con la semplice relazione
112. bbe essere effettuata in prossimit di aree con infezioni acute di osso o tessuto poich il trattamento potrebbe portare forzatamente pus nel tessuto circostante diffondendo cos l infezione Inoltre sono da evitare esposizioni dirette nella zona toracica di pazienti portatori di pacemakers o di altre apparecchiature elettromeccaniche impiantate per 1 possibili danni permanenti che ne possono derivare I pazienti con tromboflebiti non devono essere trattati con US in quanto anche la parziale disintegrazione del coagulo potrebbe tradursi in un ostacolo per l afflusso di sangue al cervello al cuore o ai polmoni I pazienti affetti da malattie cardiache non dovrebbero ricevere il trattamento ad US sui gangli cervicali il ganglio stellato il torace nella regione del cuore o il nervo vago poich l effetto potrebbe essere un vasospasmo coronarico attivato come riflesso Se questi pazienti necessitano di essere trattati in altre regioni del corpo vanno utilizzati US a bassa intensit e brevi tempi di trattamento in quanto la stimolazione di un qualsiasi nervo in particolare il nervo vago nel corpo pu causare un cambiamento nella frequenza cardiaca Si dovrebbe inoltre evitare l impiego di US nei pazienti portatori di protesi dentarie o di impianti metallici o in presenza di protesi articolari per il loro maggior assorbimento rispetto ai tessuti circostanti che provoca un azione termica eccessiva con danneggiamento dei tessuti stessi
113. bile determinare il numero di cellule vive e morte in una sospensione cellulare sfruttando il fatto che cellule sane presentano una membrana cellulare integra Il Trypan in grado di passare attraverso la parete lesionata delle cellule morte colorandole di blu Il test viene eseguito tramite l utilizzo di una camera di conta Conoscendo la concentrazione delle cellule vive e morte in una sospensione cellulare possibile calcolare la vitalit del campione secondo la relazione ua concentrazione cellule vive Vitalit A SHAHJ conc cell vive conc cell morte 4 4 Il test stato eseguito subito dopo l esposizione al campo acustico per entrambe le frequenze 1 MHz e 3 MHz per le tre distanze SSD 5 10 15 cm e per tutti 1 tempi di esposizione t 5 15 114 30 45 60 La vitalit stata eseguita su 15 campioni di controllo per quanto riguarda 1 campioni sonicati sono stati trattati campioni per ogni misura di distanza e tempo I valori per ciascuna esposizione sono stati confrontati con 1 relativi controlli utilizzando il test di Dunnet con livello di significativit stabilito a p lt 0 05 Va sottolineato che il test con Trypan Blue stato applicato ai campioni prima di ogni esposizione al campo acustico il test consente di misurare la vitalit del campione e la concentrazione cellulare Le esposizioni sono state eseguite su campioni con vitalit sempre maggiore del 90 4 4 3 1 Il test di vital
114. bili esterni altri dati specifici se del caso effetti fisiologici modalit di raffreddamento campo di temperatura di funzionamento mezzi di protezione ecc Un esempio di marcatura dei dispositivi elettromedicali riportato in figura 2 1 OC RE Leggere attentamente il ALIMENTAZIONE USCITA MICROONDE manuale d uso 230 Y S060Hz 15 YA Fms 40 mY Freg 2 45 105 GHz 0476 Matricola Figura 2 1 esempio di dati di targa di un elettromedicale Inoltre la norma stabilisce che l apparecchio deve essere munito di istruzioni d uso e descrizione tecnica in particolare le istruzioni d uso devono documentare l impiego dell apparecchio nel modo previsto dal fabbricante le funzioni frequentemente utilizzate ed eventuali altre controindicazioni note nell uso dell apparecchio le avvertenze e le segnalazioni di sicurezza 39 informazioni sufficientemente dettagliate sull esame preventivo la manutenzione e la taratura inclusa la frequenza di tale manutenzione La descrizione tecnica deve riportare 1 dati di targa dell apparecchio eventuali istruzioni specifiche per l installazione e la predisposizione all uso il tipo e le modalit di sostituzione dei fusibili o di parti intercambiabili schemi circuitali ed elenco dei componenti condizioni ambientali di trasporto e d immagazzinamento con indicati gli schemi circuitali 1 dati di targa Secondo la norma 1 produttori di apparecchi medicali
115. calceina le figure 5 34 b e c riportano separatamente 1l monostrato in contrasto di fase b e lo stesso campo investigato in sola fluorescenza c Le figure 5 35 a b c mostrano particolari del bordo del monostrato Le suddette immagini mostrano che tale configurazione espositiva appare responsiva in fluorescenza rispetto al controllo evidenziando un elevato livello di uptake del fluoroforo sia nel monostrato che nei bordi dello stesso In corrispondenza di alcuni set up espositivi le cellule ai bordi del monostrato tendono ad internalizzare in maniera importante la calceina risultando pi esposte all agente fisico a b c Figura 5 35 immagini in fluorescenza calceina del campione sonicato 1 MHz alla distanza SSD 5 cm per t 30 Nelle figure 5 36 possibile osservare per questa configurazione espositiva particolari di cellule che hanno internalizzato la calceina catturati con obiettivo 40X 159 Figura 5 36 differenti livelli di uptake di calceina per esposizioni ad US a 1 MHz SSD 5 cm t 30 Si evidenziano una colorazione non uniforme delle cellule differenti livelli di uptake del fluoroforo come riportato dalla letteratura Guzmann 2001 2002 e variazioni morfologiche Krasovitski 2011 le cellule prive di uptake sembrano mantenere la propria morfologia originaria rispetto alle cellule con internalizzazione del fluoroforo che presentano invece una forma allungata e appiattita L aggiunta di IP evi
116. ccuratamente nell ambito di valutazioni rischi benefici alla luce delle problematiche evidenziate 2 3 1 1 Il caso francese Nell ambito della medicina estetica nel corso del 2011 la Francia attraverso un decreto del Ministero del Lavoro e della Salute n 0 086 12 aprile ha vietato 1 trattamenti di medicina estetica per il dimagrimento localizzato che utilizzano mesoterapia ultrasuoni laser infrarossi e radiofrequenza in quanto rappresentano un pericolo grave per la salute umana o quantomeno sono sospettati di esserlo tra questi la cavitazione che usa gli US a bassa frequenza La decisione stata presa in seguito a un avviso della Haute autorit de sant Has sulle troppe segnalazioni dei pazienti che dopo il trattamento si erano rivolti al Ministero della Salute francese La Has ha infatti evidenziato complicazioni gravi su 23 pazienti che dopo essersi sottoposti a iniezioni di soluzioni ipo osmolari avevano riportato necrosi cutanee ematomi lesioni sub cutanee ulcerazioni trombosi Addirittura secondo le autorit sanitarie per altri dieci pazienti s1 sono resi necessari interventi chirurgici per risolvere 1 problemi causati Secondo il giudizio del Ministero le tecniche di lisi adipocitaria non invasive e invasive presentano rischi di danni gravi per la salute umana Il decreto ha creato polemiche e una domanda di sospensione e o cancellazione stata presentata al Consiglio di Stato da part
117. ce una attenuazione al crescere dell et gestazionale 13 In generale gli US con frequenza maggiore 3 MHz vengono assorbiti prima di quelli a frequenza minore 1 MHz 1 quali raggiungono profondita maggiori a seconda del tipo di tessuto attraversato Gli US alla frequenza di 1 MHz sono assorbiti principalmente dai tessuti alla profondita di 3 5 cm Gann 1991 e proprio per questa proprieta per quanto concerne ad esempio le loro applicazioni fisioterapiche sono raccomandati per lesioni pi profonde e in pazienti con pi grasso sottocutaneo Gli US alla frequenza di 3 MHz sono raccomandati invece per lesioni pi superficiali alla profondit di 1 2 cm Gann 1991 Ziskin 1990 per questa ragione oltre ad essere usati in fisioterapia sono utilizzati anche nell estetica medica e non medica Gli ultrasuoni possono essere definiti mediante i seguenti parametri fisici che caratterizzano un onda ultrasonora l ampiezza dell onda valore della massima pressione positiva o negativa raggiunta dal mezzo in fase di compressione indicativa della forza che l onda esercita sulle particelle del mezzo e quindi dell entit dello spostamento delle particelle dalla posizione di equilibrio la frequenza f Hz numero di cicli di compressione e rarefazione nell unit di tempo la lunghezza d onda m distanza tra due punti in fase tra loro di due cicli successivi il periodo T s inverso della frequenza e rappresent
118. cisa area sottocutanea ove produrre la lisi delle cellule adipose limitando invece 1 danni ai nervi al tessuto connettivo ai muscoli ai vasi sanguigni Brown 2009 Dopo la rottura delle cellule adipose il loro contenuto composto principalmente da trigliceridi viene disperso nei fluidi intracellulari trasportato nel fegato attraverso il sistema vascolare e linfatico ed eliminato attraverso le vie tradizionali di espulsione dall organismo 1 4 Applicazioni estetiche degli ultrasuoni Da alcuni anni si ricorre all applicazione di US anche in campo estetico non medico attraverso macchinari opportunamente progettati per lavorare a frequenze tali da non consentire la propagazione in profondit delle onde ultrasonore tipicamente intorno a 3 MHz si tratta infatti di applicazioni legate generalmente al trattamento delle rughe e alla cura delle adiposit localizzate 29 Secondo 1 costruttori delle apparecchiature ad US per applicazioni estetiche non mediche risulta l applicazione degli stessi per 1 seguenti trattamenti applicazione di agenti cosmetici l ultrasuono faciliterebbe l assorbimento di sostanze attive sul viso e sul corpo quali oli vitamine solubili grasse prodotti ai liposomi emulsioni e agenti idrosolubili l effetto sarebbe di aumentare la permeabilit delle cellule diminuire la barriera funzionale della pelle e aumentare l attivit dei canali degli ingredienti attivi sonoforesi trattamento per sten
119. cominciano ad avere alterazioni a livello delle funzioni di membrana e che legano entrambi 1 fluorocromi in grosse quantit PI C Esistono diversi modi per rappresentare un dato citofluorimetico la rappresentazione pi semplice e costituita dall istogramma dove l ascissa riporta l intensit di fluorescenza e l ordinata la frequenza ovvero il numero di eventi che esprimono una data propriet L analisi statistica consente di porre dei gates basati sull impostazione di cursori che delimitano le aree di interesse e sulla quantificazione degli eventi cellulari che rientrano in tali aree Per ogni picco rilevato nel diagramma possibile calcolare dati statistici valore medio deviazione standard coefficiente di variazione ecc 122 DI Nel nostro lavoro stato utilizzato un citoluorimetro a flusso modello FACSCalibur Becton Dickinson Biosciences dotato di due sorgenti luminose laser argon raffreddato ad aria con emissione a 488 nm e laser allo stato solido Visible Red Diode Laser con emissione a 635 nm situato presso il Dipartimento di Patologia Generale dell Universit Sapienza di Roma Figura 4 21 citofluorimetro a flusso FACSCalibur La citofluorimetria a flusso stata utilizzata per investigare l induzione di danni sulla membrana cellulare a seguito di irradiazione dei campioni cellulari con US alle frequenze di 1 e 3 MHz a tal proposito si fa riferimento al meccanismo della sonoporazione ossia
120. cs con dimensioni dell elemento sensibile PVDF pari a 1 mm e sensibilit alla frequenza di 1 MHz pari a 1670 4 mV MPa e sensibilit 958 2 mV MPa alla frequenza di 3 MHz entrambe riportate con una incertezza di misura pari al 14 Il segnale dell idrofono opportunamente preamplificato stato raccolto da un oscilloscopio e registrato I trasduttori sono stati fatti funzionare in modalit continua in accordo con 1 set up sperimentali utilizzati nel corso delle esposizioni con 1 campioni biologici il trasduttore a 3 MHz stato fatto lavorare alla potenza massima erogabile 100 quello a 1 MHz al 75 Conoscendo 1 valori di pressione acustica registrati dall idrofono ricavati dalla 3 2 possibile calcolare l intensit del campo acustico generato dal diffusore ultrasonoro assumendo infatti che le onde che si propagano nel mezzo siano piane si pu esprimere l intensit del campo acustico tramite la relazione I p pc 4 1 dove p la pressione acustica 0 la densit del mezzo e c la velocit del suono La densit e la velocit del suono considerati per 11 calcolo dell intensit acustica sono riferiti all acqua alla temperatura di 20 C e sono rispettivamente 1482 3 m s che corrisponde ad una lunghezza d onda pari a 1 5 mm mentre la densit del mezzo acquoso 0 9982 10 Kg m 102 I valori di pressione utilizzati per calcolare l intensit acustica sono stati ottenuti misurando
121. ct pubblicato dal Canadian Minister of Justice Canada 2010 vengono forniti una serie di tolleranze nella determinazione dei parametri utili a garantire il funzionamento delle apparecchiature ad US prima di tutto la calibrazione deve essere effettuata almeno una volta al mese per controllare che la potenza ultrasonora presenti una accuratezza del 20 inoltre la stessa potenza in uscita deve rimanere costante entro 20 del suo valore iniziale durante un ora di funzionamento continuo alla massima potenza alla tensione nominale della linea di alimentazione in acqua ad una temperatura di 22 C 3 C Inoltre la frequenza effettiva di un dispositivo terapeutico ad US non deve differire di oltre 5 da quella dichiarata dal costruttore L area effettiva radiante ERA indicata tra le caratteristiche di fabbrica del prodotto deve essere mantenuta entro il 20 del valore nominale Inoltre sono riportate una serie di precauzioni per l operatore per minimizzare le esposizioni indesiderate ed una serie di precauzioni per la sicurezza dei pazienti per evitare potenziali effetti avversi per la salute Il documento sottolinea anche l importanza di un adeguato training per gli operatori per la sicurezza e l efficacia dei trattamenti Analogamente le linee guida dell American Food and Drug Administration FDA 2006 mostrano grande variabilit nella determinazione di ERA e potenza totale 20 per la potenza totale 20 25 per ERA
122. ctrical Equipment Particular Requirements for the Safety of Ultrasound Physiotherapy Equipment International Electrotechnical Commission Geneva IEC 2001b IEC 60601 part 2 37 Medical Electrical Equipment Particular Requirements for the Safety of Ultrasound Diagnostic and Monitoring Equipment 2001 and Amendment 1 2005 International Electrotechnical Commission Geneva IPSM 1988 Institute of Physical Sciences in Medicine Report 58 Guidelines for the routine performance checking of medical ultrasound equipment edited by R E Richardson IPSM York Ishikawa N M Alvarenga A V Paes L F C Pereira W C A Machado J C An lise do desempenho de equipamentos de ultra som para fisioterapia operando nacidade do Rio de Janeiro conforme a norma NBR IEC 1689 da ABNT Rev Bras Fisioter 6 2 2002 63 69 Jamin N Miller L Moncuit J Fridman W H Dumas P Teillaud J L chemical heterogeneity in cell death combined synchrotron IR and fluorescence microscopy studies of single apoptotic and necrotic cells Biopolymers Biospectroscopy 2003 72 366 373 Johns L D Straub S J Howard S M Analysis of effective radiating area power intensity and field characteristics of ultrasound transducers Arch Phys Med Rehabil 88 1 2007 124 129 Johns Straub Howard Variability in Effective Radiating Area and Output Power of New Ultrasound Transducers at 3 MHz Journal of Athletic Training 2007 42 1
123. cy Fa n Ay ii i 4 A Figura 5 45 immagini con IP del campione sonicato 1 MHz alla distanza SSD 15 cm per t 30 in contrasto di fase e fluorescenza IP 5 6 1 9 Risultati per esposizioni a 1 MHz 75 High SSD 15 cm t 45 La figura 5 46 mostra 1 risultati dell esposizione a SSD 15 cm per 45 Si evidenzia un elevato livello di uptake del fluoroforo nel monostrato e ai bordi dello stesso La mortalit cellulare valutata con IP appare superiore rispetto al controllo ma senza evidenza di co localizzazione tra cellule che hanno internalizzato la calceina e cellule che legano lo IP figura 5 47 166 E i a j t i Figura 5 46 immagini in fluorescenza del monostrato del campione sonicato 1 MHz alla distanza SSD 15 cm per t 45 Figura 5 47 immagini in fluorescenza calceine e IP del campione sonicato 1 MHz alla distanza SSD 15 cm per t 45 5 6 1 10 Risultati per esposizioni a 1 MHz 75 High SSD 15 cm t 60 La figura 5 48 mostra 1 risultati dell esposizione a SSD 15 cm per 60 Si evidenzia un elevato livello di uptake del fluoroforo nel monostrato ed ai bordi dello stesso La mortalit cellulare valutata con IP appare superiore rispetto al controllo ma senza evidenza di co localizzazione tra cellule che hanno internalizzato il fluoroforo e cellule morte che hanno legato lo IP Figura 5 48 immagini del campione sonicato 1 MHz alla distanza SSD 15 cm per t 60 167 5 6 1
124. d the mechanical index Ultrasound Med Biol 1993 19 343 351 Miller M W Miller D L and Brayman A A A review of in vitro bioeffects of inertial ultrasonic cavitation from a mechanistic perspective Ultrasound in Med and Biol 1996 22 9 1131 1154 Milowska K Gabryelak T Reactive oxygen species and DNA damage after ultrasound exposure Biomol Eng 2007 24 263 267 Ministero della Salute Sicurezza ed efficacia delle apparecchiature in riabilitazione Quaderni del Ministero della Salute n 8 marzo aprile 2011 Moreno Moraga J Valero Alte s T Martinez Riquelme A Isarria Marcosy M I and J Royo de la Torre Body Contouring by Non Invasive Transdermal Focused Ultrasound Lasers in Surgery and Medicine 39 315 323 2007 Mourad PD Lazar DA Curra FP Mohr BC Andrus KC Avellino AM McNutt LD Crum LA Kliot M 2001 Ultrasound accelerates functional recovery after peripheral nerve damage Neurosurgery 48 1136 1140 NCRP Report No 74 1983 Biological Effects of Ultrasound Mechanisms and Clinical Implications National Council on Radiation Protection and Measurements 7910 Woodmont Avenue Bethesda MD 20814 issued December 30 Oakley E M 1978 Dangers and Contraindications of Therapeutic Ultrasound Physiotherapy Vol 64 p 174 O Brien WD Jr 2007 Ultrasound biophysics mechanisms Prog Biophys Mol Biol 93 212 255 Ohhashi Y Kihara M Naiki H Goto Y Ult
125. dei due raggi e quindi alla posizione dello specchio mobile in quell istante 107 Specchio fisso Las xi muori L a e ee d l l l l l l l l l l O amp r 4k it Sorgente I at JA A D LUI l Specchio Specchio mobile semitrasparente Figura 4 8 spettrofotometro FTIR In base al movimento dello specchio mobile tutte le radiazioni monocromatiche contenute nella luce emessa dalla lampada danno luogo all interferogramma cio un segnale complessivo di interferenza contenente tutte le informazioni riguardanti la frequenza e l intensit della radiazione emessa ma non utilizzabile in quanto l assorbimento funzione della frequenza A questo punto l utilizzo del calcolatore permette l acquisizione di pi scansioni dello spettro rapidamente presentando alla fine una media di tutte le scansioni lo spettro avr cos un migliore rapporto segnale rumore che aumenta infatti in maniera proporzionale alla radice quadrata del numero di scansioni La trasformata di Fourier effettuata dal calcolatore dello strumento una volta che 1l raggio ha raggiunto il detector mostra sullo schermo uno spettro infrarosso tradizionale trasformando il segnale di intensit luminosa in funzione del tempo spostamento dello specchio in segnale di intensit in funzione del numero d onda Nel corso di questo lavoro le misure degli spettri sono state effettuate utilizzando la tecnica della Tra
126. del fascio a z 38 5 cm dal trasduttore f 3 158 MHz E 236 242 230 236 E 224 230 0218 224 0212 218 E 206 212 200 206 Figura 3 21 raster scan 3D pressione in dB calcolata sul piano ortogonale all asse di propagazione del fascio a z 38 5 cm dal trasduttore f 3 158 MHz In tabella 3 8 sono riportati 1 risultati delle misure con idrofono per il trasduttore alimentato alla frequenza di 3 158 MHz Il risultato cos ottenuto mostra che in questo caso il BNR rientra nell istogramma dei valori forniti dalla norma individuando un trasduttore qualitativamente accettabile 92 Trasduttore 3 MHz Incertezza Frequenza ottimale di lavoro del diffusore 3 158 MHz 0 00001 MHz Area effettiva radiante ERA 20 Tabella 3 8 risultati per il trasduttore a 3 MHz frequenza 3 158 MHz Per valutare il comportamento del trasduttore nelle sue condizioni reali di funzionamento ossia quando collegato al suo generatore la medesima procedura precedentemente descritta stata ripetuta eccitando il trasduttore con un segnale alla frequenza di 3 1 MHz che quella a cui lo fa effettivamente lavorare il suo generatore In figura 3 22 quindi riportato l andamento del campo di pressione lungo l asse z del trasduttore eccitato alla frequenza di 3 1 MHz 0 025 0 020 0 015 Urms V 0 010 0 005 O 40 80 120 160 200 240 280 320 360 400 440 480 distanza dal trasduttore mm Figura 3 22 ampi
127. della norma CEI EN 61689 2009 deve essere eseguito uno scan per la misura della pressione ultrasonora emessa dalla testa emittente su una griglia in un piano perpendicolare all asse del trasduttore alla distanza di 0 3 cm dalla faccia del trasduttore stesso con la distribuzione di pressione determinata a partire dal campionamento del voltaggio rms o picco picco ai capi dell idrofono a passi di qualche mm nota la sensibilit dell idrofono alla frequenza in esame Va sottolineato che l ERA di un diffusore ad US non uguale all area della faccia anteriore della testa emittente n all area del disco di materiale piezoelettrico che genera gli US stessi Infatti poich l elemento piezoelettrico non vibra uniformemente ERA spesso pi piccolo dell area geometrica della testa di trattamento Un esempio che riporta la differenza tra area geometrica del trasduttore A e area effettiva radiante ERA riportato in figura 2 3 Figura 2 3 area geometrica A e area effettiva radiante ERA per una testa di trattamento ad US 44 Il parametro Beam Non Uniformity Ratio BNR definisce il rapporto tra la spatial maximum intensity e la spatial average intensity cio tra l intensit di picco massimo nel campo acustico e l intensit media spaziale Tale rapporto pu essere usato per determinare 1l punto di massima intensit nel fascio ultrasonoro in corrispondenza di una data intensit media spaziale Pi alto il valore di BNR
128. denzia una mortalit cellulare superiore al controllo ma con netta separazione tra cellule che hanno internalizzato la calceina e cellule morte che legano IP figura 5 37 come evidenziato dalla 5 37 c in cui la fluorescenza per entrambi 1 fluorofori calceina e IP stata osservata con il filtro passa banda nel range 515 560 nm verde al fine di analizzare contemporaneamente entrambe le fluorescenze IP e calceina presenti nel campione b Figura 5 37 vitalit cellulare IP per esposizioni a 1 MHz SSD 5 cm t 30 160 5 6 1 3 Risultati per esposizioni a 1 MHz 75 High SSD 5 cm t 45 In figura 5 38 sono riportati 1 risultati dell esposizione a SSD 5 cm per 45 Figura 5 38 immagini del campione sonicato 1 MHz alla distanza SSD 5 cm per t 45 per la fluorescenza della calceina e con IP Tale configurazione espositiva appare mediamente responsiva in fluorescenza con mortalit cellulare non dissimile rispetto al controllo 5 6 1 4 Risultati per esposizioni a 1 MHz 75 High SSD 5 cm t 60 In figura 5 39 sono riportati 1 risultati dell esposizione a SSD 5 cm per 60 Anche tale configurazione evidenzia un livello medio di uptake del fluoroforo con discreta mortalit cellulare valutata con IP 161 Figura 5 39 immagini del campione sonicato 1 MHz alla distanza SSD 5 cm per t 60 5 6 1 5 Risultati per esposizioni a 1 MHz 75 High SSD 10 cm t 30 In figura 5 40 sono riportati esempi
129. dere e o levigare le rughe superficiali l ultrasuono grazie ai suoi effetti termici riscalda 1 tessuti e favorisce processi biochimici e metabolici trattamenti anti cellulite per eliminare o ridurre le adiposit localizzate l ultrasuono effettua un azione di mobilizzazione del grasso della zona trattata favorendo il metabolismo del grasso e la sua rimozione Tale trattamento non per permesso in Italia dal 2011 nei centri estetici 1 5 La dosimetria degli ultrasuoni L uso degli US in ambito clinico viene comunemente considerato o almeno cos stato fino a non molto tempo fa una metodica completamente sicura e priva di rischi Gli US emessi dai cristalli piezoelettrici attraversano 1 tessuti biologici dando origine ai fenomeni di riflessione rifrazione assorbimento e diffusione che ne configurano un assorbimento da parte dei tessuti La valutazione di tale assorbimento e lo studio dei suoi effetti biologici sono normalmente legati allo sviluppo di una dosimetria che caratterizza l agente fisico e la sua potenziale o effettiva interazione con il materiale biologico e che richiede la presenza di tre fattori Guiot 2010 a quantificazione di una o pi grandezze univocamente misurabili che definiscono l uscita dalla sorgente b determinazione dell effetto sul materiale biologico dell energia propagata nelle varie modalit per riflessione rifrazione ecc c determinazione della relazio
130. di trattamento va collegata e con un numero di serie unico Inoltre in accordo con la norma l apparecchio deve includere istruzioni d uso che devono contenere 1 frequenza acustica di lavoro o frequenze in KHz o MHz e area di radiazione effettiva in cm 2 una raccomandazione che richiami l attenzione dell operatore sulla necessit di una manutenzione periodica ed in particolare intervalli di tempo per l esame periodico e la calibrazione ad opera dell utilizzatore esame della testa di trattamento per rilevare crepe che potrebbero consentire l ingresso di liquido conduttore esame dei cavi e dei connettori della testa di trattamento 3 un avvertenza sulle procedure necessarie per l utilizzazione in condizioni sicure 4 un avvertenza per l operatore di maneggiare con cura la testa di trattamento perch una manipolazione non attenta pu influenzare negativamente le sue caratteristiche 5 un elenco di condizioni per cui controindicato il trattamento con US 6 una dichiarazione della destinazione d uso La norma fornisce indicazioni per la compatibilit elettromagnetica e stabilisce che la temperatura della faccia anteriore del trasduttore non deve superare 1 41 C quando opera sott acqua Un importante indicazione contenuta nella norma consiste nel fissare che l intensit effettiva massima degli US non deve superare i 3 W cm determinati tenendo conto di considerazioni della pratica clinica e di sicurezza La norma s
131. duce a causa di fenomeni di scattering allora la 1 2 diventa I I exp 2 z 1 3 dove a rappresenta il coefficiente di attenuazione di scattering L interazione degli ultrasuoni con i tessuti biologici produce assorbimento dell energia del fascio che dipende dal tipo di tessuto attraversato e dalla frequenza delle onde In tabella 1 2 sono riportati alcuni coefficienti di assorbimento per tipologie di tessuti attraversati da US alle frequenze di 1 MHz e 3 MHz Coefficienti di assorbimento cm per tipologia di tessuti attraversati da US alle frequenze di 1 MHz e 3 MHz 1MHz 3 MHz Sangue 0 028 0 084 feste SE Tessuto muscolare 2 28 Acqua 20 C 0 0006 0 0018 reset 0 Tabella 1 2 coefficienti di assorbimento di tessuti attraversati da US alle frequenze di 1 MHz e 3 MHz Basso assorbimento e quindi alta penetrazione dell onda ultrasonora osservabile in acqua e nel grasso in quanto tessuto ricco di acqua O 0 14 e 0 42 rispettivamente a 1 e 3 MHz pertanto non viene prodotto riscaldamento significativo quando l onda ultrasonora passa attraverso tali mezzi Al contrario l assorbimento pi elevato nel tessuto osseo e nei tendini Dyson 1987 In generale 1 tessuti molli assorbono circa il 10 20 della potenza per centimetro mentre l osso adulto assorbe completamente il fascio ultrasonoro in una brevissima distanza particolare il comportamento dell osso del feto che produ
132. e 2 MHz mostrando la corrispondenza con la misura con idrofono e la presenza di un ulteriore picco di risonanza alle basse frequenze Trasduttore Frequenza operativa del sistema Frequenza ottimale di lavoro f wf trasduttore generatore per il solo trasduttore Tabella 3 3 risultati della risposta in frequenza del trasduttore a 1 MHz Si pertanto fissata la frequenza del segnale sinusoidale di eccitazione del trasduttore a 1 320 MHz che costituisce la frequenza di risonanza ottimale a cui lavora il diffusore a 1 MHz ed stata eseguita la scansione della tensione registrata ai capi dell idrofono lungo l asse z principale della testa emittente a passi di 2 mm a partire dal centro geometrico del trasduttore alla distanza di 0 3 cm dalla faccia del trasduttore tale procedura stata effettuata per individuare in maniera precisa la posizione della tensione rms di picco nell intero campo acustico e quella della tensione a cui corrisponde l ultimo massimo Zn In figura 3 8 mostrato l andamento del campo di pressione lungo l asse z del trasduttore che consente di verificare le posizioni dei massimi e dei minimi con quelle previste dalla teoria I 82 risultati mostrano che l ultimo massimo zx per il trasduttore a 1 MHz poco marcato e posizionato alla distanza di circa 13 cm dal diffusore si scelto pertanto di posizionare l ultimo massimo Zy in corrispondenza del dato teorico che fornisce una posizione di Zy pari a
133. e ad US che rimangono di pertinenza delle estetiste Non infatti chiaro su quale 70 base scientifica siano stati definiti 1 limiti di potenza emessa tabella 2 1 per l apparecchiatura Vibrazione meccanica peeling ed 1 limiti di intensit per l apparecchiatura Ultrasuoni per trattamenti superficiali per quest ultima apparecchiatura desta inoltre perplessit la scelta di imporre specifici limiti in relazione ad intervalli predeterminati di frequenza degli US Probabilmente la spiegazione risiede nella differente profondit di penetrazione degli US alle varie frequenze tuttavia sono possibili due differenti ragionamenti che portano a conclusioni opposte Il ragionamento che sembra alla base della scelta operata dal legislatore consiste nel limitare maggiormente l intensit del fascio ultrasonoro a pi bassa frequenza circa 1 MHz che penetra maggiormente all interno del corpo al fine di preservare organi interni potenzialmente critici Considerando invece il fatto che gli US a pi alta frequenza circa 3 MHz penetrano di meno perch depongono una maggiore energia in un percorso ridotto volendo evitare eccessivi riscaldamenti o altri fenomeni eventualmente dannosi e connessi ad un elevata deposizione di energia sarebbe stato al contrario opportuno limitare maggiormente l intensit degli US alle frequenze pi elevate Inoltre 11 limite pi elevato in intensit 3 W cm per gli US compresi nell intervallo
134. e and drug delivery Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc 2011 Dec 15 84 1 74 85 Guiot C Spagnolo R Ultrasuoni in Medicina Principi fisici e applicazioni UTET 2010 Guirro R J Serrao F Elias D Bucalon A J Calibration of therapeutic ultrasound equipment Physiotherapy 83 8 1997 419 422 Guirro R S Britshcy Dos Santos Evalujation of the acoustic intensity of the new ultrasound therapy equipment Ultrasonics 39 2002 553 557 Guzman H R Nguyen D X McNamara A J Prausnitz M R Equilibrium loading cells with macromolecules by ultrasound effect of molecular size and acoustic energy Journal of pharmaceutical sciences vol 91 n 7 july 2002 Guzman H R Nguyen D X Khan S and Prausnitza M R Ultrasound mediated disruption of cell membranes IJ Heterogeneous effects on cells J Acoust Soc Am 110 1 July 2001 Hallow DM Mahajan AD McCutchen TE Prausnitz MR Measurement and correlation of acoustic cavitation with cellular bioeffects Ultrasound Med Biol 2006 Jul 32 7 1111 22 Hekkenberg R T Characterising ultrasonic physiotherapy systems by performance and safety now internationally agreed Ultrasonics 36 1998 713 720 Hekkenberg R T Reibold R and Zegiri B 1994 Development of standard measurement methods for essential properties of ultrasonic therapy equipment Ultrasound in Medicine and Biology 20 1 83 98 Hill C R ter Haar G Ultrasound in non ionizing radiation
135. e delle imprese francesi e medici che praticavano queste tecniche Il giudice competente del Consiglio di Stato francese ha inizialmente sospeso l esecuzione del decreto in attesa di assumere decisioni definitive successivamente si pronunciato consentendo le applicazioni con tecniche non invasive che utilizzano agenti fisici a causa della mancanza di dati a sostegno della tesi relativa alla possibilit di rischi gravi per la salute 69 Il dibattito resta comunque aperto in Francia ma anche in Italia il Ministero della Salute sottolineava infatti nel 2011 l importanza di avviare un indagine con l Istituto Superiore di Sanita per verificare la sicurezza delle pratiche di lipolisi e se ci sia anche in Italia una casistica relativa alle complicanze collegate a tali trattamenti che possa portare a seguire la via decisa dalla Francia 2 3 2 Gli ultrasuoni in estetica non medica 2 3 2 1 La cavitazione estetica La pubblicazione nel 2011 del decreto n 110 ha di fatto tolto alle estetiste la possibilit di eseguire trattamenti per la rimozione della adiposit localizzate in regime di cavitazione Negli ultimi anni molti centri estetici hanno acquistato e utilizzato apparecchiature ad US in regime di cavitazione per il trattamento della cellulite questo fatto una conseguenza del vuoto normativo dovuta alla mancata emanazione del decreto relativo alle caratteristiche delle apparecchiature ammesse nei trattamenti estetici no
136. e la finalit del trattamento estetico non comunque possibile escludere la possibilit che il fenomeno della cavitazione instabile possa verificarsi anche 67 in altri tessuti interessati al passaggio dell onda ultrasonora che dall esterno del corpo ed a contatto della pelle viene immessa nel corpo in direzione del tessuto sottocutaneo adiposo Al fine di garantire la sicurezza e l efficacia dei trattamenti la letteratura scientifica attraverso studi in vitro e in vivo o una adeguata casistica clinica dovrebbero documentare l effettiva capacit degli US di determinare l implosione selettiva delle cellule del tessuto adiposo risparmiando invece nervi muscoli tessuto connettivo e vasi sanguigni Brown 2009 ha riportato 1 risultati di esperimenti condotti con un dispositivo transcutaneo a US focalizzati alla frequenza di 20 kHz UltraShape Contour I di fabbricazione israeliana utilizzando come modello preclinico suini in vivo 1 risultati del lavoro mostrano che campioni istologici della pelle e del grasso sottocutaneo escissi dopo 1l trattamento rivelano lisi delle cellule di grasso anche ben al di sotto del derma senza distruzione osservabile di vasi sanguigni nervi e tessuto connettivo Tuttavia lo stesso autore rileva che queste osservazioni non sono direttamente estrapolabili all uomo per cui sono necessari studi clinici controllati alcuni dei quali sono in corso negli Stati Uniti Inoltre una volta prodotta la dis
137. e libero in condizioni specificate in acqua intensit temporale massima nel caso di una forma d onda modulata in ampiezza il rapporto tra la potenza d uscita temporale massima e l area radiante effettiva Le procedure di prova 41 per il calcolo di questi parametri ed 1 limiti di accettabilita dei valori misurati sono contenuti nella Norma CEI EN 61689 del 2009 La norma stabilisce che l apparecchiatura ad US debba presentare una serie di contrassegni al suo esterno o su parti dello stesso che consentano di identificarlo con chiarezza in particolare il generatore dell apparecchio deve essere provvisto dei seguenti dati frequenza acustica di lavoro in MHz forme d onda continue modulate in ampiezza o ad impulsi se l ampiezza modulata o ad impulsi una descrizione delle forme d onda d uscita insieme ai valori di durata degli impulsi del periodo di ripetizione degli impulsi e del fattore di rendimento per ciascuna modulazione impostabile Il generatore deve riportare una targhetta permanentemente attaccata all apparecchio sulla quale sia riportato il numero di serie cos da identificare univocamente l apparecchio la testa di trattamento deve essere contrassegnata con la sua potenza d uscita nominale in Watt con la sua area radiante effettiva in cm con il rapporto di non uniformit del fascio con il tipo del fascio con la designazione dello specifico generatore dell apparecchio al quale la testa
138. ea dell estetica medica le apparecchiature usate per il trattamento della cellulite con applicazione degli US in regime di cavitazione per la lisi degli adipociti e il trattamento delle masse adipose in eccesso Per quanto riguarda l estetica non medica si fa riferimento alle apparecchiature tipicamente impiegate nei centri estetici per il trattamento di rughe a livello superficiale Le apparecchiature ad US utilizzate in fisioterapia e nell ambito della medicina estetica si configurano come dispositivi medici e sono soggetti ad una specifica normativa che disciplina le prestazioni delle attrezzature la sicurezza le norme di buona pratica per la costruzione la progettazione o il funzionamento in sicurezza dei dispositivi Per quanto riguarda 1 macchinari ad US utilizzati nell estetica non medica non trattandosi di dispositivi medici le norme a cui fanno riferimento sono completamente differenti Per quanto riguarda le normative tecniche a cui sono soggetti 1 dispositivi di cui sopra in generale l implementazione di norme che regolamentano l esposizione ad agenti fisici a beneficio della salute delle persone esposte e fornisce un quadro di riferimento per l igiene industriale Tali norme possono essere utili poich Repacholi 1979 A la loro elaborazione serve come un segnale per l industria e la popolazione in generale che vi preoccupazione per l esposizione ad un dato agente fisico e che 1 pazienti dovrebbero essere al
139. effettivamente mantenuti Conseguentemente sarebbe auspicabile che le autorit competenti nei loro periodici controlli presso 1 presidi medici richiedessero oltre alla documentazione relativa ai test di sicurezza la dimostrazione del corretto funzionamento dell apparato in termini di erogazione della prestazione a partire da quanto richiesto dall impianto normativo disponibile per quel prodotto Ministero della Salute 2011 Prendendo spunto dal suddetto lavoro e alla luce delle criticit rilevate si evidenzia la necessit di procedere innanzitutto ad una analisi approfondita dei manuali d uso della strumentazione ad US per fisioterapia per valutare in primo luogo come garantita la qualit della manutenzione della strumentazione Si fa presente a tal proposito che la norma tecnica CEI EN 60601 2 5 non da indicazioni precise circa le modalit con cui effettuare le calibrazioni delle apparecchiature Come sottolineato da Pye 1996 le apparecchiature ad US per fisioterapia dovrebbero essere calibrate almeno ogni due anni o preferibilmente ogni anno con una bilancia a forza di radiazione dotata di riferibilit metrologica Sarebbe quindi auspicabile che la normativa tecnica desse indicazioni pi precise circa la periodicit della verifica delle caratteristiche di ouput delle apparecchiature nonch un riferimento alla necessit di utilizzare strumenti di misura con riferibilit metrologica A tal proposito risulterebbe utile s
140. el generatore perch il trasduttore possa effettivamente lavorare alla sua frequenza ottimale Le prestazioni di tali dispositivi sembrerebbero infatti dipendere dall insieme delle due unit e non sufficiente studiare le propriet del campo emesso dal solo diffusore senza aver verificato anche output del suo generatore Un ampliamento dell indagine su un pi esteso numero di dispositivi con verifica dei parametri di output eventualmente forniti dal costruttore e caratterizzazione sia dei singoli diffusori che del sistema nel suo insieme altamente raccomandato al fine di concentrarsi sui principali aspetti critici per questo tipo di dispositivi attualmente sul mercato ed a disposizione degli utenti e di mettere in relazione questi dati con il livello di prestazione di tali apparecchiature in termini di rischi benefici ed efficacia dei trattamenti 97 CAPITOLO 4 MATERIALI E METODI PER LO STUDIO DEGLI EFFETTI DEGLI ULTRASUONI SU LINEE CELLULARI 4 1 Linea cellulare NIH 3T3 e condizioni di coltura Alla luce delle considerazioni fatte nel precedente capitolo in merito alla necessit a partire da una pi approfondita conoscenza del funzionamento tecnico dei dispostivi emittenti US di estendere la ricerca verso gli effetti dell irradiazione ultrasonora sui sistemi biologici s1 proseguito nello studio degli effetti indotti dall esposizione ad US generati da apparecchi disponibili sul mercato e comunemente usati p
141. enco di requisiti specifici compilato da una commissione di esperti Data la sua origine una norma descrive lo stato dell arte di un prodotto e di un servizio ovvero il rapporto ottimale tra caratteristiche tecniche e fattibilit tecnologica Le norme in s non rappresentano alcun vincolo o obbligo mentre rappresentano un patrimonio di conoscenze Sicurezza e Igiene del Lavoro 2000 L adempimento delle richieste contenute nelle norme presunzione di conformit di un prodotto ai requisiti essenziali della Direttiva Nel caso in cui il produttore non utilizzi dette Norme armonizzate dovr farsi carico di dimostrare con metodologie appropriate la conformit ai requisiti essenziali delle Direttive Ministero della Salute 2011 Le valutazioni di conformit e la certificazione CE tranne che per dispositivi di classe I sono affidate ad enti particolari chiamati Organismi Notificati Questi enti devono soddisfare criteri ben precisi specificati nell allegato 11 della Direttiva altrimenti perdono la competenza Gli Organismi Notificati applicano le norme armonizzate Se 1 controlli hanno esito positivo si procede alla marcatura CE obbligatorio applicarla su tutti 1 dispositivi tranne sui dispositivi su misura come gli occhiali da vista e le lenti a contatto e poche altre eccezioni In ogni caso il marchio va applicato sempre sulle istruzioni per l uso L attivit di compilazione e aggiornamento delle norme viene svolta dai
142. endono dalla frequenza e dall ampiezza della pressione acustica applicata dal raggio delle bolle e dalle propriet del liquido in cui esse sono intrappolate Questo fenomeno si manifesta nel liquidi che contengono aria o gas fatto questo che ovviamente facilita la cavitazione ma il fenomeno pu manifestarsi anche in un liquido privo di gas se la pressione acustica applicata pi grande della pressione idrostatica nel liquido stesso 16 Quando una bolla esposta ad US la pressione acustica agisce come una forza esterna che ne fa variare il raggio aumentando le sue dimensioni la bolla si comporta come un sistema oscillante con una elasticit che data dal gas contenuto al suo interno e una inerzia che quella del liquido che circonda la bolla e che oscilla con la parete della bolla stessa Il risultato che essa ha una frequenza propria il cui valore inversamente proporzionale al suo raggio in condizioni di equilibrio quando la frequenza del campo acustico applicato si avvicina alla frequenza propria della bolla questa tende ad avere un comportamento risonante e l ampiezza delle sue oscillazioni dipende da quanto sono vicini 1 due valori di frequenza e dal valore della pressione applicata In prossimit della risonanza le oscillazioni assumono un carattere di forte non linearit con generazione di armoniche di ordine superiore e con effetti che s1 manifestano sia nel campo acustico sia nel mezzo stesso talvolta prod
143. eneratore in 100 modalita continua tutta la potenza indicata dal valore sul display viene trasferita durante l applicazione e il segnale a 1 o 3 MHz viene applicato senza interruzioni al diffusore in questa modalit gli strumenti possono lavorare nel range dal 10 al 100 della potenza massima In modalit pulsata gli strumenti consentono di selezionare il duty cycle dell onda definito come 1l rapporto d T t dove Tt rappresenta il tempo in cui il generatore trasmette il segnale e T il periodo totale I valori del duty cycle sono riportati in percentuale se si utilizza 11 generatore in modalit pulsata High il segnale viene erogato per la durata di 750 ms seguiti da una pausa di 250 ms figura 4 3 in questo modo la potenza viene ridotta al 75 anche in questa modalit gli strumenti possono lavorare nel range dal 10 al 100 della potenza massima Per gli esperimenti di esposizione a 3 MHz stato utilizzato il modo pulsato in modalit High 100 per quanto riguarda le esposizioni a 1 MHz esse sono state effettuate sempre in modalit High ma al 75 il distacco del monostrato dal fondo della petri con perdita del materiale cellulare dopo la sonicazione osservato per esposizioni nella modalit 100 High ha indotto a diminuire l ampiezza dell onda ultrasonora incidente sul campione biologico fino ad ottenere una condizione adeguata per le osservazioni sperimentali individuata appunto in 75 High Pea INNILIIIIIIIIK
144. equenze di 1 MHz e 3 MHz in modalit pulsata 75 High per 1 MHz 100 High per 3 MHz Gli effetti sono stati studiati con diverse tecniche Spettroscopia Infrarossa in Trasformata di Fourier Test dei Micronuclei Test di vitalit Microscopia a Fluorescenza Citofluorimetria a flusso Microscopia confocale in un set up sperimentale costituito da una vasca 30x30x30 cm che consente di variare la distanza trasduttore campione SSD 5 10 15 cm a differenti tempi di esposizione t 5 15 30 45 e 60 minuti I due dispositivi sono stati caratterizzati nel set up sperimentale all interno del quale sono state effettuate le esposizioni cellulari consentendo il calcolo della intensit del campo acustico incidente sul campioni per le varie distanze campione trasduttore indagate Il test di esclusione del Trypan Blue ha permesso di misurare la vitalit dei campioni cellulari a seguito di esposizione all agente fisico il test stato eseguito subito dopo l esposizione al campo acustico per entrambe le frequenze di esposizione per le tre distanze campione trasduttore e per tutti 1 tempi in concomitanza con 1 rispettivi controlli I risultati mostrano una vitalit del campioni esposti ad US a 1 MHz e 3 MHz non dissimile rispetto al controllo Per quanto riguarda la genotossicit indotta da esposizione ad US 1 risultati mostrano che l esposizione ultrasonora ad entrambe le frequenze 1 MHz e 3 MHz causa un aumento della frequenza dei micronuclei
145. er 1 differenti tempi di esposizione in corrispondenza delle 3 distanze SSD 5 10 e 15 cm alle frequenze di 1 MHz e 3 MHz Si considera che il parametro RL varia in maniera significativa solo se la differenza rispetto all unit maggiore di 0 2 0 8 gt R gt 1 2 Dalla figura 5 10 si osserva una diminuzione dei modi vibrazionali di stretching associati alle strutture CH banda L per esposizione alla frequenza di 1 MHz In particolare in accordo con l analisi PCA si osserva che variazioni significative dei parametri analizzati possono essere attribuite alle configurazioni espositive relative alla distanza campione trasduttore SSD 15 cm per il tempo di sonicazione di 45 e alla distanza SSD 5 cm e al tempo di sonicazione di 60 L area della banda Lz dei campioni sonicati alla frequenza di 1 MHz non mostra variazioni al crescere del tempo di sonicazione rispetto ai controlli I parametri RL e Ry2 alla frequenza di 3 MHz non mostrano variazioni significative eccetto che per la distanza SSD 10 cm per 1 tempi di sonicazione 15 e 60 tale risultanza appare in accordo con la significativit statistica dei dati analizzati con PCA in figura 5 8 138 Ruy Lipidi NIH 3T3 1 MHz 75 FL 5 cm m RLI 10 cm FLI 15 cm 05 Ob son 5 son 15 son 30 son 45 son _60 T Riz Lipidi NIH 3T3 1 MHz 75 E FL 10 cm RL 15 cm DB Rui Lipidi NIH 3T3 3 MHz RL15 cm ms RL
146. er la fisioterapia e l estetica operanti alle frequenze di 1 e 3 MHz su campioni di cellule in vitro provenienti dalla linea cellulare NIH 3T3 fibroblasti murini che cresce in adesione al variare dei parametri sperimentali ossia durata dell esposizione e distanza campione diffusore Le cellule NIH 3T3 provengono da una linea cellulare stabilita nel 1962 da due scienziati del Dipartimento di Patologia della University School of Medicine di New York con NIH si intende la provenienza dei tessuti di topo da cui stata generata la linea National Institute of Health negli USA Inizialmente le 3T3 sono state ottenute da embrioni di tessuto di topo successivamente sono divenute la linea cellulare standard per 1 fibroblasti figura 4 1 Figura 4 1 foto di un campione di fibroblasti NIH 3T3 non trattato I fibroblasti sono le cellule pi comuni di tessuto connettivo di animali la cui principale funzione mantenere l integrit strutturale dei tessuti mediante la secrezione di precursori della matrice extracellulare Infatti essi svolgono un ruolo determinante nella guarigione di una ferita poich un 98 danno ai tessuti stimola 1 fibroblasti e ne induce la mitosi In particolare la linea cellulare NIH 3T3 viene utilizzata per effettuare trasfezioni mediante virus I fibroblasti sono largamente utilizzati perch non sono cellule tumorali ma cellule selezionate da tessuto sano immortalizzate facilmente coltivabili in lab
147. ermico pi evidente a livello dell interfaccia dei tessuti ed in particolare a livello del periostio e della zona di passaggio tra grasso e muscolo il periostio per la sua struttura anatomica e per la continuit con l osso assorbe una grande quantita di energia ed pertanto sede di elevato riscaldamento L elevazione termica genera come effetti secondari aumento del metabolismo cellulare e vasodilatazione in particolare quest ultima propriet risulta importante nell utilizzo terapeutico degli US in fisioterapia Effetti non termici Cavitazione fenomeno che consiste nella formazione crescita e implosione di bolle di gas all interno del fluido sottoposto ad un campo ultrasonoro In generale la cavitazione pu essere vista come la rottura di un liquido e la conseguente formazione all interno dello stesso di cavit propriamente di bolle contenenti gas disciolto o vapore del liquido stesso si manifesta in molte situazioni per esempio nell acqua in ebollizione o in vicinanza dell elica in rotazione di una nave e comunque in tutte le regioni di un liquido soggette ad alte e brusche variazioni di pressione In particolare all interno di un liquido sottoposto all azione di un campo ultrasonoro particolarmente intenso si parla di cavitazione acustica che in genere viene distinta in due categorie inerziale o transiente e non inerziale o stabile Leighton 1997 Le condizioni che si stabiliscono dip
148. etro determina una sorta di bilanciamento tra l effetto desiderato dell esposizione ultrasonora uptake e l effetto distruttivo prodotto morte delle cellule esposte 179 1 MHz 75 High S505 cm 1 0 09 Yemi 550510 cm l 0 08 Wiicmz A SSDE15 cm 20 06 Wier bh Lun DI Therapeutic ratio 1 00 25 a0 35 40 45 50 55 60 p5 tempo di esposizione minuti Figura 5 63 Therapeutic ratio in funzione del tempo di sonicazione nelle differenti configurazioni espositive indagate 1 MHz 75 High I risultati riportati in figura 5 63 mostrano che l andamento di TR dipende dalle condizioni sperimentali il massimo del TR si ottiene in corrispondenza della configurazione espositiva relativa alla distanza campione trasduttore SSD 10 cm per lunghi tempi di sonicazione 60 in considerazione di una elevata permeabilit della membrana indotta dall esposizione ad US a 1 MHz 75 High e di una elevata vitalit dei campioni mentre il minimo per SSD 5 cm 5 7 2 Risultati sperimentali per esposizione ad ultrasuoni a 3 MHz 100 High In tabella 5 14 sono riportati 1 risultati complessivi delle misure di citofluorimetria per esposizioni dei campioni ad US alla frequenza di 3 MHz con riferimento alla percentuale degli eventi che cadono nel gate M1 gated M1 quindi positivi alla fluorescenza della calceina gated M1 3 MHz 100 High SSD 5 cm SSD 10 cm SSD 15 cm I 0 03 W cm I 0 01 W cm 1 0 009 W cm Controll
149. ezza rms in funzione della distanza dal trasduttore lungo l asse z per f 3 1 MHz Nella figura 3 23 sono riportati 1 raster scan a 3 mm e in corrispondenza di zx stavolta individuato a 330 mm dal trasduttore per una frequenza di eccitazione di 3 1 MHz 93 Raster scan 3mm freq 3 1 MHz Raster scan 330mm freq 3 1 MHz Urms V 0 001600 3 000E 04 0 004725 0 003300 0 007850 0 006300 0 01097 0 009300 mm mm 0 01410 0 01230 0 01722 0 01530 0 02035 0 01830 0 02347 0 02130 0 02490 0 02340 mm mm Figura 3 23 raster scan a z 0 3 cm e z 3 3 cm dal trasduttore alla frequenza di 3 1 MHz In tabella 3 9 sono riportati 1 risultati delle misure con idrofono per il trasduttore alimentato con un segnale alla frequenza operativa di lavoro del sistema trasduttore pi generatore pari a 3 1 MHz Anche in questo caso nonostante la leggera differenza tra la frequenza di risonanza del trasduttore 3 158 MHz e la frequenza operativa di lavoro del sistema diffusore generatore 3 1 MHz si osserva una variazione del parametri ERA e BNR Infatti per il trasduttore eccitato da un segnale alla frequenza di 3 1 MHz 11 valore del parametro BNR risulta all interno dei valori previsti dalla norma BNR 4 92 ma l area effettiva radiante ERA presenta un valore incoerente rispetto alle caratteristiche costruttive dello strumento 14 79 cm Frequenza operativa di lavoro del sistema diffusore generatore 3 1 MHz
150. flessa e la parte rimanente prosegue il suo cammino nel mezzo come fascio trasmesso La massima trasmissione di un onda ultrasonica da un mezzo ad un altro si verifica quando le impedenze acustiche dei due mezzi in questione sono uguali Riflessione Trasmissione Zi 7 Za Figura 1 4 riflessione e trasmissione di un onda acustica di pressione all interfaccia tra due mezzi Nel corso della propagazione in un mezzo l onda acustica soggetta ad una progressiva perdita dell energia ad essa associata e pi propriamente s1 determina una diminuzione dell intensit in funzione della distanza dalla sorgente Le cause sono essenzialmente due l assorbimento processo in base al quale l energia meccanica dell onda in parte convertita in calore e lo scattering cio l interazione tra londa ed eventuali strutture e disomogeneit presenti nel mezzo determinate principalmente da variazioni locali di densit o di propriet elastiche che determina una parziale diffusione dell energia lungo direzioni diverse da quella di propagazione dell onda diretta L effetto complessivo in un mezzo omogeneo tale che un campo d onda di intensit iniziale I dopo una cerca distanza z ha una intensit che decresce esponenzialmente secondo la relazione 12 I I exp 2q z 1 2 in cui rappresenta l intensit iniziale e il coefficiente di assorbimento del mezzo cm Se il mezzo non omogeneo l ampiezza si ri
151. fluorescente prodotta dal campione e veicolata dall oculare Figura 4 16 Microscopio Leica DMI 116 Nel corso di questo lavoro stato utilizzato un microscopio ottico invertito Leica DM IL dotato di lampada a fluorescenza e un modulo con tre filtri con cui osservare la fluorescenza emessa dal campione nei range 470 490 nm azzurro 515 560 nm verde 620 660 nm rosso figura 4 16 Per studiare l internalizzazione di molecole extracellulari stata utilizzata la calceina PM 622 Da lunghezza d onda del picco massimo di assorbimento 494 nm e lunghezza d onda del picco massimo di emissione 514 nm Guzman 2002 ad una concentrazione finale 10 uM 4 4 4 1 La Calceina I campioni per la microscopia a fluorescenza sono stati marcati con la calceina Sigma St Louis MO con lo scopo di valutare uptake di molecole da parte delle cellule NIH 3T3 esposte ad US alle frequenze di 1 MHz e 3 MHz Tale fluoroforo presenta un basso peso molecolare pari a 622 Da picco massimo di assorbimento 494 nm e A picco massimo di emissione 514 nm Dalla letteratura Guzman 2002 si evince che sono stati quantificati per la calceina 1 livelli di trasferimento intracellulare stato inoltre osservato che la calceina raggiunge un equilibrio termodinamico con la soluzione extracellulare mostrando grande variabilit dipendente dalla tipologia cellulare in esame tale variabilit risulta riproducibile e correlata fortemente con l energia ac
152. ggetto trattato Per alcuni tipi di apparecchi parti applicate possono essere considerate le parti in contatto con l operatore estetico In particolare parte applicata isolata tipo F flottante viene definita come parte applicata isolata da tutte le altre parti dell apparecchio in modo tale che la corrente di dispersione nel soggetto trattato ammissibile in condizione di primo guasto non venga superata quando tra la parte applicata e la terra si applica una tensione pari a 1 1 volte la pi elevata tra le tensioni nominali di rete In particolare la norma stabilisce l elenco dei dati di targa figura 2 9 che devono essere riportati nella targhetta identificativa posta all esterno dell apparecchio Tra questi vi l origine dell apparecchio ovvero il produttore il modello dell apparecchio la frequenza di rete espressa in hertz simbolo Hz la potenza assorbita e la potenza d uscita espressa in watt o volt ampere simboli rispettivamente W e VA la classe di isolamento elettrico di tipo I o di tipo II ta 11 Dati di targa ed altre indicazioni all esterno dell apparecchio Apparecchi Apparecchi con Apparecchi Prescrizioni alimentati sorgente alimentati da specificate Oggetto dalla rete elettrica interna alimentatore in vedi 6 1 a vedi 6 1 b specificato vedi 6 1 c lel Origine x x x 6 16 Riferimento di modello o di tipo x x x 6 1 glo Connessione alla rete Kiz 1h Prequenza di rete in Hr 6 1 P
153. gni singola banda nella regione dei lipidi delle proteine e degli acidi nucleici Gli spettri IR di polipeptidi mostrano una serie di bande chiamate Amidi direttamente correlate a diversi modi vibrazionali del legame idrogeno In particolare l Amide I una banda compresa tra 1600 cem e 1700 cm ed associata per il 70 80 allo stretching del gruppo C O L Amide II compresa tra 1500 cm e 1600 cm associata per il 40 60 al bending del gruppo NH e per il 18 40 allo stretching del gruppo CN La banda pi intensa di uno spettro cellulare sicuramente Amide I la cui forma influenzata dall intera struttura secondaria delle proteine cellulari L analisi degli spettri IR nella zona dell Amide I consente lo studio dei cambiamenti della struttura secondaria del contenuto proteico delle cellule dove per struttura secondaria si intende l arrangiamento in strutture spaziali regolari e ripetitive mediante legami idrogeno tra punti della catena amminoacidica Esistono tipi diversi di struttura secondaria 1 principali sono a elica foglietto B e random coil Alfa elica amp elica che consiste in un arrangiamento elicoidale della catena di amminoacidi In questa conformazione lo scheletro del polipeptide strettamente arrotolato attorno a un asse centrale immaginario Foglietto beta B sheet che consiste in una struttura planare formata da due o pi sequenze amminoacidiche A differenza della struttura ad a elica che
154. he ad intensita ultrasonore inferiori rispetto a quelle investigate in citofluorimetria e microscopia a fluorescenza e comunque inferiori alla soglia di cavitazione determinano modificazioni della membrana cellulare che favoriscono l uptake della calceina all interno della cellula L assenza di internalizzazione in corrispondenza di esposizioni ad US alla frequenza di 3 MHz ad intensit ultrasonore comparabili tra le due frequenze di esposizione 1 MHz e 3 MHz indica che il parametro determinante ai fini della rilevazione dell effetto dell agente fisico sul campione cellulare la frequenza dell onda ultrasonora piuttosto che l intensit W cm alla quale esso sottoposto 185 CONCLUSIONI Tra gli agenti fisici potenzialmente nocivi per la salute gli ultrasuoni US in relazione al loro crescente utilizzo nelle applicazioni mediche dalla fisioterapia alla drug delivery e all HIFU fino all estetica medica e non medica presentano nuove problematiche che vanno dalle questioni legate all efficacia dei trattamenti agli aspetti connessi all efficienza e affidabilit delle apparecchiature impiegate fino alla conoscenza delle caratteristiche del fascio durante la sua propagazione nei tessuti ed allo studio dei relativi effetti biologici Alla luce della recente diffusione dei dispositivi ad US soprattutto in ambito fisioterapico ed estetico stata effettuata un analisi delle problematiche sanitarie connesse all
155. i acquisiti 64 interferogrammi Gli spettri IR delle cellule non trattate e trattate sono stati acquisiti nell intervallo 900 4000 cm Per strumenti a singolo fascio come il Jasco FT IR 410 necessario acquisire prima lo spettro della sorgente che sar il background e poi quello trasmesso attraverso il campione in questo modo il software di Jasco sottrae il fondo dall assorbimento del campione Il protocollo di misura prevede che l acquisizione del background venga fatta in single beam con un vetrino polilisinato nel supporto l andamento di questo spettro simile a quello di corpo nero eccetto per l assorbimento dell anidride carbonica e del vapore acqueo presenti nell atmosfera Dopo aver acquisito il background possibile mettere nel supporto il vetrino con il campione e acquisire subito lo spettro del campione Quando si acquisiscono spettri IR l idratazione del campione pu costituire un problema in quanto l acqua una molecola IR attiva Il protocollo utilizzato per l asciugatura dei vetrini consente di minimizzare il grado di idratazione dei campioni assumendo quindi che l acqua influenzi allo stesso modo tutti gli spettri acquisiti Tutti gli spettri IR sono stati corretti per baseline e smoothing e normalizzati per intensit all amide I L analisi dei dati IR stata effettuata utilizzando il software OPUS 5 0 fornito da Bruker Optik 110 4 4 2 Il test dei micronuclei Il test dei micronuclei
156. i applicazioni terapeutiche degli US Shaw 2008 20 MHz 10 MHz wi 2 5 MHz z 1 MHZ THERAPY MHz Figura 1 15 range di utilizzo degli ultrasuoni nella diagnosi e nella terapia medica La maggior parte delle applicazioni terapeutiche degli US utilizzano il riscaldamento per ottenere l effetto desiderato Nel caso di terapie ad US a bassa potenza aumentando la temperatura di pochi gradi al di sopra dei livelli normotermici possibile indurre vasodilatazione temporanea e aumentare l afflusso di sangue nella zona interessata Questo meccanismo stato proposto per spiegare gli effetti benefici che si ottengono nelle applicazioni fisioterapiche con sollievo nei dolori articolari e muscolari accelerazione nella cicatrizzazione delle ferite maggiore estensibilit dei tessuti molli riduzione del gonfiore riparazione delle lesioni dei tendini ecc In questo caso gli US vengono utilizzati in regime continuo e impulsato con frequenze da 500 kHz a 5 MHz ed intensit comprese tra 0 5 W cm e 3 0 W cm Trattamenti terapeutici con US Intensit W cm MHz Tabella 1 3 frequenza pressione intensita degli US usati per differenti applicazioni terapeutiche Trasfezione genica drug delivery tali applicazioni degli US sfruttano la sonoporazione fenomeno transiente e reversibile che permette a molecole di dimensioni tali da non poter attraversare la membrana cellulare in condizioni normali di passare
157. i per la sicurezza delle apparecchiature per gli US usati in fisioterapia Tale standard fornisce una serie di definizioni importanti quali apparecchiatura di fisioterapia ad US apparecchio per la generazione e l applicazione di US ad un paziente a scopo terapeutico trasduttore ultrasonico dispositivo in grado di convertire energia elettrica in energia meccanica all interno dell intervallo delle frequenze ultrasoniche frequenza acustica di lavoro frequenza di un segnale acustico basato sull osservazione dell uscita di un idrofono posto in un campo acustico potenza nominale di uscita massima potenza di uscita dell apparecchio alla tensione nominale di rete area effettiva radiante area della sezione trasversale del fascio estrapolata alla superficie frontale della testa di trattamento e moltiplicata per un fattore dimensionale in conformit alla Norma IEC 61689 rapporto della non uniformit del fascio rapporto tra il quadrato del valore efficace della pressione acustica massima e la media spaziale del quadrato del valore efficace della pressione acustica dove la media spaziale presa sull area radiante effettiva determinata in accordo alla Norma CEI EN 61689 intensit effettiva rapporto tra la potenza d uscita e l area radiante effettiva potenza di uscita media nel tempo della potenza ad US irradiata dalla testa di trattamento di un apparecchio in un campo approssimativament
158. ica non medica alla luce delle normative vigenti al fine di fornire un contributo per il miglioramento della qualit e della sicurezza dei trattamenti Lo sviluppo tecnologico e la sempre pi ampia applicazione degli US nella terapia hanno posto l attenzione anche sulla necessit di una approfondita comprensione dell interazione tra onde ultrasoniche e materia biologica Tale studio essenziale poich in grado di favorire la produzione in sicurezza di apparecchi a livello industriale segnalando eventuali problematiche sanitarie Alla luce di quanto sopra esposto in questo lavoro sono stati studiati gli effetti indotti in campioni di cellule in vitro provenienti dalla linea cellulare NIH 3T3 fibroblasti murini dall esposizione ad US alle frequenze di 1 MHz e 3 MHz utilizzate tipicamente per trattamenti di tipo fisioterapico ed estetico variando l intensit del campo acustico e il tempo di esposizione I metodi di indagine utilizzati sono di tipo microscopico e spettroscopico la spettroscopia infrarossa in trasformata di Fourier FTIR il test dei micronuclei il test del Trypan blue la microscopia a fluorescenza la citofluorimetria a flusso la microscopia confocale La spettroscopia FTIR permette di rilevare cambiamenti strutturali nelle principali molecole biologiche operati da un dato agente fisico chimico E una tecnica di analisi non distruttiva che consente di ottenere simultaneamente informazioni su tutte le macr
159. iderazione l intero sistema ossia il trasduttore pi il suo generatore In particolare 1 risultati mostrano che 1 diffusori si configurano come qualitativamente accettabili ai sensi della norma mostrando valori ottimali degli indicatori ERA e BNR soltanto se eccitati alle loro frequenze di risonanza peraltro diverse da quelle fornitegli dai loro rispettivi generatori Questa indagine ha pertanto evidenziato che non sufficiente studiare le propriet emissive del singolo diffusore senza aver verificato l output del suo generatore gli apparecchi devono pertanto essere caratterizzati sia singolarmente sia come sistema nel suo insieme Emerge pertanto l esigenza di ampliare lo studio al fine di effettuare test per verificare le caratteristiche emissive di dispositivi similari in commercio verificando il livello delle loro prestazioni in termini di rischi benefici la funzionalit degli stessi e l efficacia dei trattamenti 187 Tali risultati evidenziano la necessita di approfondire la valutazione dei possibili effetti connessi con l utilizzo di tali apparecchi A tale scopo in questo lavoro sono stati studiati gli effetti prodotti su campioni in vitro provenienti dalla linea cellulare NIH 3T3 fibroblasti murini dall esposizione al campo acustico dei due dispositivi normalmente utilizzati per trattamenti di tipo fisioterapico ed estetico costituiti da diffusori circolari e dai loro generatori operanti rispettivamente alle fr
160. ilizzato per individuare le regioni dello spettro IR che maggiormente contribuiscono al clustering 134 osservato nello score plot L analisi statistica evidenzia che per SSD 5 cm le popolazioni relative ai campioni esposti ad US per 45 e 60 sono nettamente separate rispetto al controllo e dagli altri esposti che formano invece un cluster Dallo score plot si evince pertanto che la sonicazione per 1 suddetti tempi agisce in maniera significativa sulle strutture lipidiche dei campioni esposti alla distanza campione trasduttore pari a 5 cm SPETTRI ZONA LIPIDI 373 MHz 100 SPETTRI FTIR ZONA LIPIDI MIM 3T3 iMh 75 5005 em aszottanza u A as scrhanza us se obana ua astortanza ua asian 8 lureri A hraber za donda om RITI Figura 5 3 spettri FTIR del controllo e dei campioni esposti a US a 1 MHz 75 e 3 MHz 100 alle distanze campione trasduttore SSD 5 10 15 cm ai tempi di sonicazione 5 15 30 45 e 60 zona lipidi CTRL E Son 5 SSD 5 cm Son 15 SSD 5 cm Son 30 SSD 5 cm Son 45 SSD 5 cm Son 60 SSD 5 cm PC2 26 loading 0 8 0 6 0 4 0 2 0 0 2 04 0 6 0 8 3000 2950 2900 2850 2800 PC1 63 lunghezza d onda cm 1 Figura 5 4 PCA su dati spettroscopici per esposizioni a US a 1 MHz SSD 5 cm regione dei lipidi e relativo loading plot 135 La figura 5 5 mostra l analisi PCA effettuata sui dati spettroscopici riferiti alla sonicazione alla frequenza di 1 MHz in co
161. illes tendon tendo calcaneus of the rat Ultrasound Med Biol 27 1691 169 Dalecki D 2004 Mechanical bioeffects of ultrasound Annu Rev Biomed Eng 6 229 248 Daniel D M Rupert R L Calibration and electrical safety status of therapeutic ultrasound used by chiropractic physicians J Manip Physiol Ther 26 3 2003 171 175 Di Giambattista L Grimaldi P Udroiu I Pozzi D Cinque G Frogley M D Bedini A Giliberti C Palomba R Giuliani L Buogo S Giansanti A and Congiu Castellano A The Ultrasound effects on non tumoral cell line at 1 MHz therapeutic frequency Journal of Physics Conference Series 279 2011 Direttiva 2004 108 CE del Parlamento Europeo e del Consiglio del 15 dicembre 2004 concernente il ravvicinamento delle legislazioni degli Stati membri relative alla compatibilita elettromagnetica e che abroga la direttiva 89 336 CEE Direttiva 2006 95 CE del Parlamento Europeo e del Consiglio del 12 dicembre 2006 concernente il ravvicinamento delle legislazioni degli Stati membri relative al materiale elettrico destinato ad essere adoperato entro taluni limiti di tensione Direttiva Europea 93 42 European Communities 1993 Council Directive 93 42 EEC of 14 June 1993 concerning medical devices Off J Eur Communities 169 12 7 1993 Duck FA Medical and non medical protection standards for ultrasound and infrasound Progress in Biophysics and molecular biology 93 2007 176 191 Dyson M 1985
162. ime fai da te per quanto riguarda l esposizione ad un agente fisico potenzialmente dannoso per la salute L utilizzo degli US nella medicina estetica pone ulteriori problematiche legate alla valutazione delle caratteristiche di efficienza e affidabilit della strumentazione utilizzata nonch lla caratterizzazione del fascio ultrasonoro durante la sua propagazione nei tessuti biologici A tal proposito una caratterizzazione fisica del fascio ultrasonoro e della sua propagazione nei tessuti biologici necessaria a garanzia dell efficacia e della sicurezza dei trattamenti Ci significa che dovrebbero essere stabiliti metodi accurati per predire la dose o comunque le grandezze fisiche pi significative e procedure ad hoc per caratterizzare 1 trasduttori e monitorare le prestazioni degli apparati T2 PARTE II 73 CAPITOLO 3 CARATTERIZZAZIONE DI DISPOSITIVI AD ULTRASUONI PER FISIOTERAPIA ED ESTETICA 3 1 Descrizione delle sorgenti di ultrasuoni Con la finalit di valutare le performances tecniche di apparecchi normalmente usati per applicazioni fisioterapiche ed estetiche ai fini del loro utilizzo in sicurezza in campo medico e non medico sono stati presi in considerazione due dispositivi per trattamenti di tipo fisioterapico e estetico costituiti da diffusori a pistone circolare del diametro di circa 6 cm e dai relativi generatori operanti rispettivamente alle frequenze di 1 e 3 MHz disponibili sul mercato a costi rel
163. in fluorescenza Questa forma di microscopia ottica ha come maggiore punto di forza la sua scarsa invasivita che consente di avere immagini di campioni biologici con una buona risoluzione spaziale La microscopia in fluorescenza pu essere applicata allo studio di materia vivente con l uso di fluorofori in vivo o in vitro spesso molto specifici nella loro selezione del sito e capaci di assorbire e di re irradiare la luce 115 L assorbimento energetico necessario per l eccitazione dei fluorofori richiede una sorgente di illuminazione che deve essere focalizzata sul campione attraverso un sistema di lenti figura 4 15 La luce di eccitazione viene collimata da una lente e un diaframma per poi giungere ad un filtro di eccitazione che seleziona le lunghezze d onda di interesse e poi riflessa verso l obiettivo che illumina il campione detector ocular Ce dichroic mirror specimen emission filter light source excitation filter Figura 4 15 sistema di lenti per la microscopia a fluorescenza La fluorescenza nel campione d luogo a luce emessa che focalizzata sul detector dallo stesso obiettivo usato per l eccitazione Un filtro tra l obiettivo e il detector va a separare la luce di eccitazione dalla luce di fluorescenza quindi l obiettivo porta sull oggetto un fascio di luce incidente a lunghezza d onda pari a quella della luce eccitante e in senso inverso raccoglie la luce
164. in modo qualitativo la fluorescenza in termini di Elevato uptake di calceina Medio uptake di calceina Scarso uptake di calceina nei campioni cellulari investigati 5 6 1 Risultati per esposizione ad ultrasuoni a 1 MHz 75 High 5 6 1 1 Il campione di controllo In figura 5 33 vengono riportate le immagini in fluorescenza ottenute per 11 controllo non esposto e lasciato con calceina 10 uM in PBS per 30 minuti al buio a b c d Figura 5 33 immagini del controllo in contrato di fase e in fluorescenza con calceina e IP Le immagini si riferiscono ad un obiettivo 20X le a e c si riferiscono al campione in contrasto di fase mentre le b e d fanno riferimento agli stessi campi ottici ma analizzati in fluorescenza I risultati non evidenziano uptake del fluoroforo nelle cellule del campione di controllo caratterizzato da scarsa emissione in fluorescenza e buona vitalit cellulare a seguito dell aggiunta di un aliquota di IP 20 ul 5 6 1 2 Risultati per esposizioni a 1 MHz 75 High SSD 5 cm t 30 In figura 5 34 sono riportate le immagini dei campioni di cellule NIH 3T3 marcate con calceina ed esposte per 30 ad US a 1 MHz 75 High alla distanza dal trasduttore di 5 cm 158 a b c Figura 5 34 immagini in fluorescenza calceina del campione sonicato 1 MHz alla distanza SSD 5 cm per t 30 La figura 5 34 a mostra sovrapposti il monostrato di cellule e la relativa fluorescenza della
165. ina Frequenza US 3 MHz 100 high sso Sem tem em intensit 0 03 Wiem 0 01 Wicm 0 009 Wicm Scarso livello di uptake di Tempo di calceina esposizione minuti LEGENDA ESPOSIZIONE DELLE CELLULE AD US 3 MHz Tabella 5 10 schema riassuntivo dei risultati della microscopia in fluorescenza per le esposzioni a 3 MHz 100 in termini di intensit acustica incidente sul campione Tale risultato assieme con quanto rilevato in spettroscopia FTIR con la microscopia a fluorescenza per esposizione dei campioni a 1 MHz 75 High sembra confermare un relazione tra frequenza e quindi intensit del campo ultrasonoro incidente 1 e 3 MHz ed effetto indotto In tabella 5 11 riportato un tentativo di correlare 1 risultati ottenuti in microscopia a fluorescenza con l energia incidente sul campione per 1l tempo di sonicazione dose 3 MHz 100 high Stima dell energia incidente sul campione in petri durante la sonicazione dose Dose Jfem2 LEGENDA ESPOSIZIONE DELLE CELLULE AD US 3 MHz Scarso livello di uptake di calceina dose 146 Jem Tabella 5 11 schema riassuntivo dei risultati della microscopia in fluorescenza per le esposzioni a 3 MHz 100 175 Si osserva la corrispondenza con quanto rilevato per esposizione dei campioni a 1 MHz 75 High infatti in questa configurazione espositiva le dosi risultano comunque inferiori a 146 J cm energia incidente sul campione nel tempo di
166. inger Verlag 1991 Pye S C Milford C 1994 The Performance of Ultrasound Physiotherapy machines in Lothian Scotland Ultrasound Med Biol 20 4 347 359 Pye S Ultrasound therapy equipment does it perform Physioterapy January 1996 vol 82 n 1 39 44 Reid D C 1981 Possible Contraindications and Precautions Associated with Ultrasound Therapy In A Mortimer N Lee eds Proceedings of International Symposium on Therapeutic Ultrasound Canadian Physiotherapy Association Repacholi M H amp Benwell D A 1979 Using surveys of ultrasound therapy devices to draft performance standards Health Phys 36 679 686 Riesz P Kondo T 1992 Free radical formation induced by ultrasound and its biological implications Free Radic Biol Med 13 247 270 Rivest M Quirion de Girardi C Seaborne D et al Evaluation of therapeutic ultrasound devices performance stability over 44 weeks of clinical use Physiother Can 1987 39 77 86 Robertson V 2002 Dosage and treatment response in randomised clinical trials of therapeutic ultrasound Physical Ther Sport 3 124 133 197 Robertson V Therapeutic Ultrasound at 1 MHz Invited Commentary Physical Therapy vol 88 number 1 2008 Schabrun Walzer Chipchase How accurate are therapeutic ultrasound machines Hong Kong Physiotherapy Journal Volume 26 2008 Schlicher RK Radhakrishna H Tolentino TP Apkarian RP Zarnitsyn V Prausnitz MR Mecha
167. inguibili da artefatti o frammenti all interno della cellula b non devono essere connessi tramite ponti ai nuclei c 1 micronuclei possono toccare 1 nuclei principali ma non sovrapporli Ps a i i a dl di ia o p i I Ja j x J NES cal I Ser a b C d Figura 4 12 criteri per scegliere cellule binucleate nel protocollo CBMN a cellula binucleata ideale b cellula binucleata con nuclei in contatto c cellula binucleata con ponte citoplasmatico sottile d cellula binucleata con ponte citoplasmatico ampio In figura 4 13 si vede l aspetto tipico dei micronuclei in cellule binucleate a cellula con due micronuclei di dimensioni diverse b cellula con micronuclei che toccano ma che non si sovrappongono ai nuclei principali c cellula con micronuclei e un ponte citoplasmatico tra 1 nuclei principali d cellula binuclata con sei micronuclei di grandezze diverse fenomeno raramente osservabile iam ff la 4a A gt A 3 k y X VON A ee hi 4 o a b c d Figura 4 13 aspetto tipico dei micronuclei in cellule binucleate 112 Il protocollo utilizzato nella conta dei micronuclei prevede l analisi della frequenza di micronuclei su 500 cellule binucleate Un parametro che possibile analizzare l Indice di Divisione Nucleare NDI valutato contando 500 cellule binucleate e rilevando la frequenza di cellule con
168. ioni di coltura 4 2 Esposizione agli ultrasuoni descrizione del set up di esposizione e misura 4 3 Caratterizzazione del campo acustico prodotto dalle sorgenti di ultrasuoni 4 4 Tecniche d indagine sui campioni cellulari 4 4 1 Spettroscopia infrarossa 4 4 1 1 Spettroscopia IR a trasformata di Fourier FT IR 4 4 1 2 Spettroscopia FTIR preparazione dei campioni 61 65 67 67 69 70 70 70 71 T2 73 74 74 15 71 78 SI 89 96 98 98 100 101 105 105 107 109 4 4 2 Il test dei micronuclei 4 4 2 1 Il test dei micronuclei preparazione dei campioni 4 4 3 Il test di vitalita Trypan blue 4 4 3 1 Il test di vitalita Trypan blue preparazione dei campioni 4 4 4 Microscopia ottica a fluorescenza 4 4 4 1 La Calceina 4 4 4 2 Microscopia ottica a fluorescenza preparazione dei campioni 4 4 5 Citofluorimetria a flusso 4 4 5 1 Citofluorimetria a flusso preparazione dei campioni 4 4 6 Microscopia confocale 4 4 6 1 Microscopia confocale preparazione dei campioni CAPITOLO 5 Risultati sperimentali e discussione 5 1 Misure di spettroscopia FTIR parametri spettrali 5 2 Analisi statistica dei dati FTIR la PCA 5 3 Spettroscopia FTIR risultati sperimentali 5 3 1 Effetti degli ultrasuoni sulle strutture lipidiche 5 3 2 Effetti degli ultrasuoni sulle strutture dell Amide I e Amide II 5 3 3 Effetti degli ultrasuoni nella regione degli acidi nucleici 5 3 4 Risultati complessivi delle misure di spettroscopia FTIR 5 4 Il te
169. it Trypan blue preparazione dei campioni La preparazione dei campioni per il test Trypan blue prevede l effettuazione dei passaggi descritti nel paragrafo 4 1 con tripsinizzazione delle cellule cresciute adese nella petri Successivamente allo spipettamento delle cellule per rompere gli eventuali agglomerati viene prelevata una aliquota di campione 10 ul di trypan blue vengono depositati su un vetrino e mescolati con la stessa quantita di campione cellulare Tale aliquota viene poi depositata in una camera di conta per 1 conteggi delle cellule vive e morte 4 4 4 Microscopia ottica a fluorescenza La fluorescenza la propriet di alcuni atomi e molecole di assorbire la luce a particolari lunghezze d onda e successivamente di emettere luce dopo un breve intervallo di tempo In seguito all assorbimento di energia da parte degli atomi gli elettroni si spostano da un livello energetico ad uno superiore e la permanenza al livello energetico superiore molto breve quando gli elettroni tornano al livello energetico originario liberano l energia assorbita sotto forma di radiazioni elettromagnetiche Le radiazioni liberate saranno di lunghezza d onda superiore e quindi di energia minore rispetto a quella eccitatrice La microscopia a fluorescenza rappresenta un eccellente mezzo per studiare materiali che sono in grado di fluorescere sia in maniera naturale sia nel caso in cui vengano trattati con prodotti chimici capaci di emettere
170. iva per l estetica medica Per questa tipologia di apparecchiature trattandosi di dispositivi medici sicuramente vale la norma CEI EN 60601 1 Apparecchi elettromedicali Parte l Prescrizioni generali relative alla sicurezza fondamentale e alle prestazioni essenziali 2007 Va inoltre rilevata l assenza di norme tecniche specifiche per gli US 2 2 Problematiche connesse con l uso degli ultrasuoni in fisioterapia 2 2 1 Evidenze di efficacia e cautele d uso In fisioterapia gli US sono usati principalmente in applicazioni che riguardano il rilasciamento dei muscoli contratti Lehmann 1961 Wessling 1987 il trattamento dei tessuti cicatriziali con azione fibrolitica da Cunha 2001 la riparazione dei danni tissutali e la risoluzione dei processi infiammatori Frieder 1988 la guarigione delle fratture Busse 2004 Dalecki 2004 la rigenerazione di nervi periferici Paik 2002 Lazar 2001 Mourad 2001 Crisci 2002 56 Il dibattito sull efficacia terapeutica degli US tuttavia ancora aperto a tal proposito mentre ben nota l efficacia degli US pulsati a bassa intensit per la riparazione delle fratture ossee Robertson 2008 ter Haar 2007 al contrario esiste grande incertezza circa l efficacia degli US in altre tipologie di trattamento ad esempio alcune rassegne relative ai trial clinici sul trattamento delle lesioni dei tessuti molli non mostrano evidenze che suggeriscano l efficacia dei trattamenti con US
171. ivendo UNI ISO xxxx per rendere esplicita tale origine L ISO definisce poi armonizzate le norme adottate da pi enti nazionali 37 Con la costituzione dell Unione Europea era indispensabile che gli Stati membri armonizzassero le loro norme anche e soprattutto quelle che riguardavano requisiti di sicurezza e quindi erano di fatto obbligatorie A tal fine si sono costituiti 11 CEN e il CENELEC il primo con lo scopo di armonizzare le norme emesse dal UNI e corrispettivi Europei e il secondo quelle del CEI e corrispettivi Europei Le norme emesse da CEN o dal CENELEC portano il nome EN xxx Norma Europea numero xxx e sono adottate da tutti gli Enti nazionali europei con l aggiunta della propria sigla ad esempio UNI EN xxx Il risultato che ci possono essere molti tipi di norme quali UNI xxx noma solo italiana non armonizzata EN xxx norma solo europea armonizzata UNI EN xxx norma europea armonizzata e adottata dall UNI UNI EN ISO xxx norma ISO adottata dal CEN quindi armonizzata e dall UNI UNI ISO xxx norma ISO adottata dall UNI non armonizzata Le norme si possono suddividere in almeno 4 categorie di importanza a norme armonizzate cio approvate dalla Commissione Europea e pubblicate sulla Gazzetta Ufficiale della Comunit Europea GUCE Queste norme sono riconosciute da tutti gli Stati membri acquisite nel corpus legis e quindi con valore legale l osservanza di queste norme presunzione
172. izzato di Microscopia Ottica ed Elettronica dell Universita Cattolica Sacro Cuore DMIRE2 Leica Microsystems Germania dotato di un obiettivo ad immersione in olio 40 x NA 1 4 e software di acquisizione LCS 2 61 Leica Microsystems Germania figura 4 24 Le ricostruzioni 3D e l analisi delle immagini acquisite sono state eseguite utilizzando ImageJ 1 41 NIH 126 Figura 4 24 Microscopio Confocale con sorgente multispettrale ad eccitazione multifotonica 4 4 6 1 Microscopia confocale preparazione dei campioni Le cellule lasciate crescere in terreno in capsule petri con fondo adatto per le misure in microscopia confocale al fine di creare un monostrato adeguato ma non confluente sono state preparate per l esposizione nelle medesime condizioni indicate per la microscopia in fluorescenza I campioni marcati con calceina alla concentrazione finale 10 uM sono stati esposti in PBS ad US alla frequenza di 1 MHz 10 High e 3 MHz 100 High in corrispondenza della sola distanza campione trasduttore pari a SSD 5 cm e per 1 tempi di 15 e 30 minuti per 1 MHz solo 30 per 3 MHz Tali configurazioni sperimentali sono state individuate in accordo con le peculiarit della metodica poich lasciano integro il monostrato e consentono la sua visualizzazione ed analisi post sonicazione Successivamente all esposizione 1 campioni sono stati sottoposti a lavaggio con PBS per eliminare il fondo di fluorescenza della calceina non internalizzat
173. izzazione del fluoroforo nelle cellule determinando elevati livelli di uptake di calceina Tale risultato puo risultare molto importante per esempio per la drug delivery Al contrario l esposizione dei fibroblasti alla frequenza di 3 MHz determina scarsi livelli di uptake della sonda fluorescente calceina quindi assenza di modificazioni significative indotte a livello di membrana dalla sonicazione alla suddetta frequenza Ulteriori investigazioni eseguite con la microscopia confocale alla frequenza di 1 MHz 10 per la sola distanza campione trasduttore SSD 5 cm e t 15 e 30 e alla frequenza di 3 MHz 100 per la stessa SSD e t 30 a basse intensit ultrasonore comparabili tra le due frequenze e al di sotto della soglia di cavitazione hanno confermato che l uptake del fluoroforo efficiente per sonicazione dei campioni alla frequenza di 1 MHz ed evidenziano che il parametro determinante per la rilevazione dell effetto biologico la frequenza del fascio piuttosto che l intensit alla quale il campione biologico sottoposto Una interessante conclusione di questo studio in relazione alla caratterizzazione degli apparati emittenti e agli effetti su campioni biologici che particolare attenzione deve essere dedicata alla valutazione degli eventuali effetti sulla salute degli US terapeutici ad 1 MHz e alla verifica dell effettiva efficacia dei trattamenti per esposizioni ad US alla frequenza di 3 MHz 189 BIBLIOGRAFIA
174. l onda impostata al 50 sul display del generatore dello strumento A partire dalle misurazioni di potenza totale possibile ricavare indirettamente il valore del parametro ERA area effettiva radiante cm per 1 sistemi in uso Infatti le caratteristiche tecniche degli strumenti evidenziano che la massima intensit effettiva W cm pari a 2 5 W cm come rapporto tra la massima potenza ultrasonora misurata in Watt e l area effettiva radiante in cm Nota l intensit fornita dal costruttore e la potenza media misurata possibile ricavare indirettamente la misura del parametro geometrico ERA pari a 2 6 cm per il trasduttore a 1 MHz 1 8 cm per il trasduttore a 3 MHz Si osserva che il valore di tale parametro appare compatibile con le caratteristiche tecniche costruttive del trasduttore poich l area dell elemento piezoelettrico risultata pari a 5 7 cm 76 Trasduttore 1 MHz T 22 C 100 continua mediato su 2 acquisizioni mm W 24 11 10 A 4 con 2 acquisizioni 24 08 3 0 con 2 acquisizioni 15 24 05 3 4M4 con 2 acquisizioni 50 continua 18 58 10 A 4 con 2 acquisizioni 18 565 3 4M4 con 2 acquisizioni Potenza totale 1 MHz 100 continua 6 57 W ERA stimato per trasduttore a 1 MHz 2 6 cm Tabella 3 1 risultati delle misure di potenza totale per il trasduttore a 1 MHz Trasduttore 3 MHz T 22 6 C 100 continua Vims V Distanza trasduttore bersaglio Potenza media
175. l tempo della potenza irradiata dalla testa di trattamento di un apparecchio in un campo approssimativamente libero in condizioni specificate preferibilmente in acqua intensit effettiva rapporto tra potenza di uscita e ERA parametro connesso alla dose impartita al paziente nell unit di tempo le cui limitazioni concettuali sono state discusse in precedenza I Tale norma stabilisce inoltre le tolleranze ammesse per 1 suddetti parametri potenza massima 20 ERA 20 intensit effettiva alla potenza massima 30 frequenza acustica di lavoro 10 BNR 30 L azione degli US terapeutici sui tessuti biologici dipende dall intensit acustica impiegata che pu presentare errori nella calibrazione con conseguente eventuale inefficienza dei trattamenti o addirittura produzione di danni Guirro 2002 Ferrari 2010 ha valutato le performances di 31 apparati ad US usati per fisioterapia in termini di intensit emessa dai dispositivi ai sensi della norma 61689 2009 rilevando che il 68 degli stessi risultava al di fuori dei limiti tollerati dalla norma I risultati risultano in accordo con gli studi di Pye e Milford 1994 e Repacholi 1979 in cui rispettivamente il 69 e 72 degli apparati valutati risultavano al di fuori della stessa norma Altri studi di Artho 2002 e Daniel 2003 ottenevano percentuali di apparecchiature fuori norma comprese tra il 39 e il 44 Variazioni pi elevate sono state invece riscontrate
176. la misurazione della potenza totale con bilancia a forza di radiazione Nota la potenza totale e noto 1l valore del parametro ERA possibile calcolare il valore dell intensit effettiva generata dal trasduttore come rapporto tra potenza emessa e area effettiva radiante tale calcolo stato effettuato a partire dai due diversi valori dell ERA ottenuti per le due frequenze I risultati sono riportati in tabella 3 10 Frequenza di lavoro 3 158 MHz 3 1 MHz Area effettiva radiante ERA 14 79 cm W Limite massimo di intensita effettiva 2 5 W cm dichiarato dal costruttore Tabella 3 10 risultati del confronto in termini di intensit emessa tra le due frequenze di eccitazione del trasduttore 95 Si osserva che l intensit effettivamente emessa sembrerebbe ben al di sotto dei limiti massimi dichiarati dal costruttore 2 5 W cm sia che il trasduttore lavori alla frequenza di 3 158 MHz 0 96 W cm sia alla frequenza di 3 1 MHz 0 31 W cm Anche in questo caso ci si pone interrogativi in merito all effettiva efficacia del trattamento estetico operato nelle condizioni sperimentali precedentemente descritte 3 4 Valutazione delle performances di due dispositivi ad ultrasuoni per fisioterapia ed estetica conclusioni I risultati della valutazione delle performances dei due dispositivi per fisioterapia ed estetica hanno evidenziato innanzitutto l assenza nelle caratteristiche tecniche degli stessi fornite dal costrutto
177. lit delle cellule Guzman 2002 L uso futuro della sonoporazione nelle applicazioni cliniche dipende molto sia dalla conoscenza di quali dei meccanismi suddetti mediatori del processo di sonoporazione produce 1 cambiamenti nella permeabilit della membrana cellulare sia dalla progettazione dell esposizione agli US che massimizza tale effetto Forbes 2011 In realt 1 bioeffetti possono essere difficili da controllare e 123 riprodurre anche in sistemi in vitro semplificati poich la cavitazione un ambiente stocastico caratterizzato da oscillazioni di bolle e collassi Gli US sono stati utilizzati in svariati esperimenti con l impiego di cellule in sospensione in monostrato e tessuti in vivo e in vitro cellule di mammifero e vegetali Il trasferimento intracellulare stato investigato utilizzando piccole molecole fluorescenti macromolecole come proteine e DNA fino alle nanoparticelle al variare dei parametri acustici quali frequenza energia pressione tempo di esposizione e duty cycle Hallow 2006 4 4 5 1 Citofluorimetria a flusso preparazione dei campioni Le cellule lasciate crescere nelle capsule petri in terreno al fine di creare un monostrato adeguato vengono preparate per l esposizione come per la microscopia a fluorescenza il protocollo per la preparazione dei campioni prevede per la calceina la medesima molarit usata in microscopia a fluorescenza 10 uM I campioni vengono poi sottoposti a sonic
178. ll analisi del segnale di output del suo generatore risulta una frequenza di lavoro centrata a 3 1 MHz leggermente inferiore rispetto alla frequenza di risonanza del diffusore Trasduttore Frequenza operativa del sistema Frequenza ottimale di lavoro f wr diffusore generatore per il solo trasduttore Tabella 3 7 risultati della risposta in frequenza del trasduttore a 3 MHz 89 In figura 3 17 mostrato l andamento del campo di pressione lungo l asse z ottenuto per la frequenza di eccitazione del trasduttore pari a 3 158 MHz verificando le posizioni dei massimi e dei minimi con quelle previste dalla teoria I risultati mostrano che l ultimo massimo zy per il trasduttore a 3 MHz posizionato a circa 38 5 cm dal diffusore il risultato ottenuto sufficientemente in accordo con 1l dato teorico che fornisce una posizione di zy pari a 33 25 cm dal diffusore per una frequenza di eccitazione pari a 3 158 MHz La tensione nel massimo Umax rms utile per calcolare la pressione acustica massima nell intero Campo acustico pmax quindi il parametro BNR risultata pari a 0 027706 V posizionato a circa 12 1 cm dal diffusore 0 030 0 025 0 020 0 015 Urms V 0 010 0 005 0 000 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 distanza dal trasduttore mm Figura 3 17 ampiezza rms in funzione della distanza dal trasduttore lungo l asse z per f 3 158 MHz Le figure 3 18 e 3 19 mostrano 1 raste
179. lla densit p del mezzo kg m per la velocit di propagazione c m s Z pc 1 1 La sua unit di misura Pa s m equivalente a kg m s Viene tuttavia piu frequentemente indicata come rayl 1 rayl 1 Pa s m dal nome del famoso scienziato inglese Lord Rayleigh 1842 1919 matematico e teorico dei sistemi vibrazionali e ottici In tabella 1 1 vengono riportati 1 valori di impedenza per alcuni mezzi biologici in generale 1 valori pi elevati si riscontrano nei solidi es alluminio Z 13 8 x10 rayl In aria a 20 C tipicamente Z risulta pari a 415 rayl p 1 204 kg m c 343 4 m s mentre in acqua alla stessa temperatura poich p 998 kg m e c 1484 m s si ha Z 1 5x10 rayl L impedenza acustica costituisce una grandezza chiave in diverse applicazioni biomediche da cui discende l interesse pratico a conoscerne il valore nei diversi mezzi biologici Mentre in alcuni casi 1 valori sono noti con discreta affidabilit come il sangue 1 6x10 rayl 1 tessuti grassi 1 36 x 10 rayl o 1 vasi sanguigni 1 65x10 rayl in altri sono soggetti a notevole variabilit conseguenti all indeterminatezza con cui nota la velocit di propagazione delle onde esempi evidenti sono le ossa e la pelle 11 Tabella 1 1 impedenza caratteristica di alcuni mezzi Quando un fascio ultrasonoro incontra l interfaccia acustica di due mezzi con impedenze acustiche differenti Z e Z2 una parte della sua energia viene ri
180. lla faccia del trasduttore successivamente mantenuto in una posizione fissa Inizialmente per valutare la quantita di riverbero presente quando 1l sistema operativo in modalit continua stata monitorata la pressione acustica in varie posizioni all interno della vasca Durante questi primi test stata rilevata la presenza di rumore di riverberazione eccessivo rispetto al segnale diretto anche quando stato Impiegato del materiale assorbente per ridurre le riflessioni dalle pareti del serbatoio Le misure sono state pertanto eseguite in condizioni echo free il trasduttore non stato collegato al suo generatore ma stato eccitato con un tone burst sinusoidale utilizzando cos una energia totale ridotta rispetto alle normali condizioni di lavoro del trasduttore e tagliando le eventuali riflessioni A tale scopo 1 trasduttori sono stati collegati ad un amplificatore di potenza RF a sua volta guidato da un generatore di funzioni Agilent impostato su un opportuna frequenza ampiezza 2 3 V picco picco e lunghezza del burst tra gli 80 e 1 120 cicli a seconda del trasduttore periodo di ripetizione pari a 0 001 s garantendo cos una porzione stazionaria del segnale acquisito Per le misurazioni stato Impiegato un idrofono ad ago della Precision Acoustics con diametro di 0 5 mm e dotato di un preamplificatore immergibile che presenta una sensibilit di 29 mV MPa alle 79 frequenze di 1 e 3 MHz collegato infine ad una scheda di ac
181. lla sicurezza fondamentale e alle prestazioni essenziali tale norma non specifica per 1 dispositivi che impiegano US si riferisce alle prescrizioni generali relative alla sicurezza e alle prestazioni essenziali degli apparecchi elettromedicali con particolare riferimento alla sicurezza elettrica le prescrizioni della norma si devono applicare nell uso normale e nell uso improprio ragionevolmente prevedibile Secondo la norma gli apparecchi elettromedicali devono essere progettati e costruiti in modo da rimanere sicuri nelle cosiddette condizioni di primo guasto ossia nelle condizioni in cui difettoso un solo mezzo per la riduzione del rischio oppure si verifica una singola condizione anormale La norma ha lo scopo di spiegare le prescrizioni di sicurezza e di illustrare gli interventi periodici per garantire l efficienza delle apparecchiature Altro scopo della guida la descrizione delle modalit di esecuzione delle prove di accettazione all atto della fornitura di un apparecchiatura Secondo la norma l apparecchio e 1 suoi componenti separabili devono essere marcati con 1 cosiddetti dati di targa contenenti il nome o il marchio commerciale del fabbricante e con il riferimento di modello o di tipo nel caso in cui la loro erronea identificazione comporti un rischio inaccettabile dati di alimentazione elettrica tensione numero di fasi frequenza corrente o potenza assorbita classificazione classe e tipo dati dei fusi
182. lle cellule ad intensit di circa 0 04 W cm al di sotto della soglia della cavitazione fissata in letteratura in 100 mW cm Krasovitski 2011 per 30 minuti alla distanza campione trasduttore di 3 cm porta ad un aumento statisticamente significativo di radicali liberi che pu alterare l equilibrio cellulare inducendo stress perossidativo sulle componenti cellulari ad esempio la componente fosfolipidica della membrana plasmatica modificando la permeabilit della membrana stessa senza indurre morte cellulare I radicali liberi inoltre possono modificare le interazioni lipide proteina con conseguenze sulla funzionalit di trasporto della membrana 20 L effetto del campo acustico viene esercitato anche sulle proteine presenti all interno delle cellule Alcuni studi su proteine in soluzione hanno evidenziato come l azione degli US pu portare alla formazione di strutture amiloidi e aggregati Ohhashi 2005 Marchioni 2009 Il campo acustico pu indurre l esposizione del sito attivo della proteine attraverso un processo di unfolding o portare a variazioni funzionali dovute al distacco di un complesso molecolare In particolare cambiamenti nella struttura secondaria di proteine di membrana possono provocare cambiamenti anche nella microviscosit di membrana Huang 1995 collegato al fenomeno della sonoporazione Inactive Conformation Active Conformation Active Site Treat with ultrasound Figura 1 11 esposi
183. llule figlie Nel protocollo CBMN le cellule che hanno completato una divisione nucleare vengono bloccate nel performare la citocinesi mediante la Citocalasina B Cyt B Le cellule in cui la divisione cellulare avvenuta una sola volta si presentano come binucleate figura 4 11 La Citocalasina B inibisce la divisione citoplasmatica bloccando la formazione di microfilamenti contrattili che costringono il citoplasma tra 1 nuclei delle cellule figlie durante la citochinesi Mediante questo test 1 micronuclei si trovano solo nelle cellule binucleate a AN 6 0 b AR E dh WOOT A NISVTVHOOLAO 000o Figura 4 11 formazione dei micronuclei 111 Le cellule trattate con il protocollo CBMN rilevanti per la conta dei micronuclei devono avere le seguenti caratteristiche a devono essere binucleate b 1 due nuclei della cellula possono toccarsi ma non devono sovrapporsi Anche se 1 nuclei si toccano questi devono rimanere distinguibili c 1 due nuclei possono essere attaccati da un ponte citoplasmatico che non deve superare 1 4 del diametro nucleare d 1 due nuclei della cellula devono avere la membrana nucleare intatta e 1 due nuclei devono avere approssimativamente le stesse dimensioni I micronuclei devono avere la stessa morfologia dei nuclei ma dimensioni pi piccole I criteri per la scelta dei micronuclei devono rispettare le seguenti caratteristiche figura 4 12 a devono essere ben dist
184. lo studio delle conseguenze sulla salute di eventuali sostanze tossiche contenute nel tessuto adiposo e immesse in circolo a seguito della lisi adipocitaria prodotta da US Tuttavia l assenza in letteratura di riferimenti a danni conseguenti al trattamenti pu essere dovuta alla recente introduzione di questa tecnologia la possibilit di tali danni plausibile per cui pur 68 DI non essendo accertati non almeno per il momento possibile escluderli come non per il momento possibile valutare l entit dei possibili rischi per la salute Inoltre poich le apparecchiature in questione sono di introduzione relativamente recente ed essendo ancora aperti molti problemi relativi alla caratterizzazione fisica del fascio ultrasonoro e alla sua propagazione nei tessuti biologici non possibile avere dati certi sulla loro sicurezza per la salute A tal proposito sarebbe necessario definire una accurata dosimetria attraverso studi in vivo e in vitro e studiare la propagazione degli US nei tessuti corporei per definire la dose utile per l efficacia e la sicurezza dei trattamenti L analisi approfondita e la valutazione esaustiva dei rischi associati all uso degli US in campo estetico medico dunque ancora in itinere e lungi dall essere soddisfacente Le esposizioni agli US per finalit terapeutiche pur deliberate dalle persone devono soddisfare requisiti sia di sicurezza che di efficacia che devono essere valutati a
185. ltre come gi illustrato quando gli US attraversano un tessuto vi anche trasformazione di parte dell energia associata in calore Tale produzione di calore pu essere responsabile di un danno appunto di natura termica delle cellule di quel tessuto esso dipende non soltanto dalla temperatura della fonte di calore ma anche dal tempo di esposizione nonch dai meccanismi di propagazione del calore presenti nel tessuto stesso ed quantificato dal cosiddetto indice termico Gli indici meccanico e termico sono ampiamente utilizzati nelle applicazioni diagnostiche ad alta frequenza come indicatori della sicurezza dell esposizione agli US recentemente stata studiata l applicazione degli stessi indici come parametri di sicurezza per applicazione degli US a bassa frequenza Low Frequencies LF 20 100 kHz utilizzati per diverse applicazioni terapeutiche mediche in particolare sonoforesi rimodellamento del corpo ecc Il lavoro di Ahmadi 2012 indica che l applicazione diretta di questi indici alle basse frequenze ha bisogno di un accurata investigazione per cui mentre l indice termico pu essere usato direttamente nella gamma delle LF l indice meccanico sembra diventare meno affidabile alle frequenze piu basse Va sottolineata l importanza soprattutto per quanto riguarda le applicazioni mediche emergenti degli US ossia HIFU e medicina estetica di determinare sia metodi accurati per predire la dose o comunque le grandezze
186. ltri Le assegnazioni dei picchi delle gaussiane corrispondenti a ciascuna struttura utilizzate in questa analisi sono quelle riportate in letteratura Lin 2004 in accordo con lo studio della derivata seconda degli spettri tabella 5 2 Strutture secondarie Numero d onda cm antip sheets 1670 1683 B turns 1660 1683 3 10 helix 1650 1658 unordered 1652 1660 a helix 1640 1648 B sheet 1628 1633 B strands 1618 1628 saddle 1585 amide II 1545 Tabella 5 2 strutture secondarie usate nella deconvoluzione delle regioni dell amide I e II attraverso curve Gaussiane con i corrispondenti range di numeri d onda Per fittare l Amide I si ipotizzato che possa essere deconvoluta in sei Gaussiane mentre per l Amide II la deconvoluzione stata effettuata con due curve figura 5 2 ove riportato il fit di uno spettro di controllo di cellule NIH 3T3 Si scelto di aggiungere alle campane relative a ciascuna struttura altre due campane che assorbono in prossimit della coda dell Amide I infatti una campana centrata nel massimo dell Amide II e l altra nel punto di sella tra le due Amidi La coda delle gaussiane di queste strutture infatti cade nell Amide II e verrebbe troncata nel caso in cui il fit venisse fatto solo sull Amide I 131 0 35 0 30 Experimental spectrum Curve fit spectrum j soo AO 1750 1 00 1650 1600 1550 1500 1450 1 Wavenumber cm Figura 5 2 fit di uno spettr
187. lulare valutata con IP appare non superiore rispetto al controllo sempre senza evidenza di co localizzazione tra cellule che hanno internalizzato la calceina e cellule che legano IP 5 6 1 7 Risultati per esposizioni a 1 MHz 75 High SSD 10 cm t 60 La figura 5 43 mostra 1 risultati dell esposizione a SSD 10 cm per 60 Anche tale configurazione espositiva evidenzia una medio livello di uptake del fluoroforo nelle cellule esposte La mortalit cellulare valutata con IP appare superiore rispetto al controllo ma senza evidenza di co localizzazione tra cellule che hanno internalizzato la calceina e cellule che legano IP 164 Figura 5 43 immagini del campione sonicato 1 MHz alla distanza SSD 10 cm per t 60 5 6 1 8 Risultati per esposizioni a 1 MHz 75 High SSD 15 cm t 30 La figura 5 44 mostra 1 risultati dell esposizione a SSD 15 cm per 30 Tale configurazione evidenzia una risposta agli US a 1 MHz non dissimile dal controllo con scarso livello di uptake della calceina Anche la mortalit cellulare valutata con IP figura 5 45 appare leggermente superiore rispetto al controllo 165 Figura 5 44 immagini del monostrato del campione sonicato 1 MHz alla distanza SSD 15 cm per t 30 in contrasto di fase e in fluorescenza Nan toe aa na Per ge eni i ee a i i Ah rey Ws LI I AT LA HI a E f MAN Mi W A i r hh
188. luorescenza proveniente dalle cellule stante 11 medesimo spettro di emissione della fluorescenza post sonicazione proveniente dalla calceina e dalle cellule per entrambe le configurazioni espositive figura 5 69 1 80E 01 50 o 1 10E 01 post 5 cm 10 15 min post 5 cm 10 30 min 1 70 01 5 1 08E 01 1 60E 01 40 1 06E 01 40 1 50E401 35 1 04E 01 35 30 1 02E 01 30 1 40E 01 25 1 00E 01 25 3 0 e gt n 5 1 30E 01 30 cellule 9 80E 00 20 cellule i calceina H calceina L 40E401 15 SIRENE 9 60E 00 15 1 10E 01 10 9 40E 00 10 1 00E 01 5 9 20E 00 5 9 00E 00 0 9 00E 00 0 500 520 540 560 580 600 620 640 490 510 530 550 570 590 610 630 1 nm nm Figura 5 69 Assenza di autofluorescenza dei campioni per esposizioni a 1 MHz 10 High alla distanza SSD 5 cm per t 15 e 30 L efficienza di uptake valutata per entrambe le configurazioni espositive indagate stata stimata in 34 per SSD 5 cm t 15 52 per sonicazioni a SSD 5 cm t 30 Ulteriori investigazioni effettuate in corrispondenza della distanza campione trasduttore SSD 5 cm per esposizioni dei campioni cellulari alla frequenza di 3 MHz 100 High per t 30 hanno consentito di stimare l efficienza di uptake della calceina post sonicazione al 2 in accordo con 1 risultati ottenuti in citofluorimetria a flusso 184 Le suddette misure mostrano che esposizioni dei campioni cellulari ad US alla frequenza di 1 MHz per tempi brevi 15 e 30 anc
189. ma e impedisce che la luce proveniente dalle zone fuori fuoco raggiunga il fotomoltiplicatore In questo modo solo il segnale luminoso relativo al piano focale contribuisce alla formazione dell immagine finale Il fotomoltiplicatore trasforma invece l intensit luminosa rilevata in un segnale elettrico proporzionale all intensit stessa Tale segnale poi elaborato via software e viene cos registrata l intensit luminosa in ogni punto i valori di intensit sono utilizzati per ricostruire l immagine Laser Forellini confocali pinholes Rivelatore Obirttivo rr Figura 4 22 Principio di funzionamento del microscopio confocale 125 Per ottenere la rappresentazione non di una porzione microscopica del campione ma di un intero piano si muove il fascio di luce lungo il campione di punto in punto in modo che tutto il piano situato alla profondit voluta venga illuminata dal fascio di luce secondo una precisa sequenza Questo processo viene detto scansione Variando la messa a fuoco possibile effettuare scansioni a piani focali variabili queste sono dette sezioni ottiche e la loro unione consente di ricostruire un immagine complessiva dell intero volume figura 4 23 PIO Singole sezioni ottiche Figura 4 23 Sezioni ottiche e ricostruzione 3D di un immagine al confocale Nel corso del presente lavoro stato utilizzato un microscopio confocale invertito disponibile presso il Laboratorio Central
190. minate P3 e P4 vedi tabella 5 1 Le bande P3 1240 em e Py 1080 em sono associate allo stretching rispettivamente asimmetrico e simmetrico dei gruppi fosfato presenti negli acidi nucleici In figura 5 11 sono gi stati riportati gli spettri FTIR relativi a questa regione spettrale L analisi PCA applicata alle derivate seconde degli spettri nella regione a cui appartengono le bande P3 e P4 perla frequenza di esposizione di 1 MHz e le distanze campione trasduttore di 5 10 e 15 cm riportata nelle figure 5 23 5 24 e 5 25 con 1 relativi loading plots CTRL son 5 _ac nucleici SSD 5 cm amp son 15 _ac nucleici SSD 5 cm son 30 _ac nucleici SSD 5 cm son 45 _ac nucleici SSD 5 cm son 60 _ac nucleici SSD 5 cm PC2 13 loading 0 05 1 1250 1200 1150 1100 1050 PC1 81 lunghezza d onda cm 1 Figura 5 23 PCA su dati spettroscopici per esposizione a US a 1 MHz SSD 5 cm regione acidi nucleici I risultati mostrano che per la distanza SSD 5 cm l unico dato significativo quello relativo al tempo di sonicazione di 15 per SSD 10 cm figura 5 24 le popolazioni relative ai tempi di esposizione di 15 e 30 risultano lontane dal controllo e dagli altri esposti per SSD 15 cm figura 5 25 sono individuabili 3 distinti cluster di dati Per quanto riguarda l esposizione ad US alla frequenza di 3 MHz l analisi PCA applicata ai dati spettroscopici riportata nelle figure 5 26 5 27 e 5 28 148
191. n medici Va sottolineato che il trattamento ad US in regime di cavitazione trattandosi di trattamento profondo probabilmente non sarebbe potuto essere di pertinenza delle estetiste sin dal suo primo comparire sul mercato estetico infatti la legge che disciplina l attivit di estetista stabilisce che siano di competenza delle estetiste tutte le prestazioni ed i trattamenti eseguiti sulla superficie del corpo umano il cui scopo esclusivo o prevalente sia quello di mantenerlo in perfette condizioni di 3 migliorarne e proteggerne l aspetto estetico Dette apparecchiature per in assenza del richiamato decreto sono state effettivamente utilizzate Le richieste dei costruttori di apparecchiature e dei titolari dei centri estetici di autorizzare l impiego degli US in regime di cavitazione per trattamenti volti a ridurre la cellulite molto forte possibile che in futuro il legislatore riconsideri 11 problema e che si cerchi una soluzione accettabile se esiste che consenta di espandere le attivit economiche e allo stesso tempo di tutelare la salute dei cittadini che decideranno eventualmente di sottoporsi a simili trattamenti 2 3 2 2 Applicazioni nei centri estetici aspetti normativi e criticit Per quanto riguarda le applicazioni previste dal decreto n 110 del 2011 si evidenzia una specifica criticit relativa al razionale sottostante 1 limiti di intensit di emissione prescritti per le apparecchiatur
192. n soluzione acquosa con differente peso molecolare e differente struttura secondaria utilizzando spettroscopia FTIR spettroscopia UV VIS dicroismo circolare e light scattering In particolare sono stati indagati due set di proteine uno con struttura secondaria alfa dominante uno con beta dominante Il set con struttura secondaria alfa dominante costituito da citocromo c proteina coinvolta nel trasporto di elettroni la cui struttura secondaria composta al 41 da a elica e al 21 9 da B turns lisozima enzima che catalizza la rottura idrolitica dei polisaccaridi della parete cellulare protettiva di alcune famiglie di batteri la cui struttura secondaria composta al 41 9 da a elica e al 6 2 da B strands e 30 6 da B turns mioglobina proteina globulare con la funzione di conservare e facilitare la diffusione dell ossigeno nelle cellule muscolari la cui struttura secondaria composta al 75 8 da a elica e 12 4 da B turns albumina sierica bovina enzima che regola la corretta distribuzione dei liquidi corporei nei compartimenti intervascolari e nei tessuti la cui struttura secondaria composta al 67 da a elica E stato inoltre studiato un set di proteine caratterizzate da struttura beta dominante costituito da tripsinogeno la cui struttura secondaria composta al 10 1 da a elica 32 3 da B sheets e 25 3 da B turns a chimotripsinogeno A enzima che catalizza il taglio del legame peptidico la cui struttura secondaria
193. ne causa effetto tra le quantit precedenti La storia degli altri tipi di radiazione mostra che sempre difficile definire il concetto di dose o concetti simili nel campo delle radiazioni ionizzanti per esempio la principale grandezza dosimetrica la dose assorbita energia impartita per unit di massa nel sito di interesse ma accanto a questa la spiegazione di molti effetti biologici richiede l introduzione dei concetti di dose cumulativa dose equivalente dose di soglia ecc Analogamente in fotobiologia ci si riferisce alla radiazione ultravioletta come energia per unit di superficie e nel campo della radiazione elettromagnetica si utilizzano il SAR Specific Absorption Rate e la densit di potenza assorbita 30 La dosimetria nel campo ultrasonico viceversa molto meno sviluppata e rappresenta ancora oggi un problema aperto 1 parametri dosimetrici per gli US terapeutici sono stati determinati attraverso osservazioni sperimentali dei bioeffetti dovuti all esposizione in questo ambito le quantit pi utilizzate sono la pressione acustica MPa e l intensit W em Va tuttavia sottolineato che la determinazione dell intensit come grandezza dosimetrica ha lo stesso problema della variabile esposizione nel campo delle radiazioni ionizzanti ossia in realt non rappresenta una misura di dose in quanto stabilisce soltanto l energia a cui il tessuto sottoposto ma non l assorbimento che ne deriv
194. nei lavori di Guirro 1997 e Ishikawa 2002 in cui gli autori osservano errori addirittura superiori all 80 Guirro 2002 analizzando 48 apparecchiature mai utilizzate appartenenti a otto differenti modelli prodotti da diversi costruttori ha riscontrato in cinque modelli errori di calibrazione superiori alle tolleranze previste dalle norme a pi livelli di intensit emessa impostati questi risultati indicano la necessit di maggiori controlli di qualit sulla strumentazione prodotta da parte dei costruttori In termini di ERA Ferrari 2010 mostra che il 68 dei trasduttori investigati presentava valori di tale parametro differenti da quanto dichiarato dal costruttore pi di quanto tollerato secondo la norma Le cause della variabilit riscontrata nei trasduttori di apparecchiature dello stesso modello possono essere dovute all utilizzo con conseguente dislocazione delle ceramiche o riduzione dell effetto piezoelettrico o essere dovute a fattori connessi al processo di produzione quali la qualit dei materiali e 11 processo di assemblaggio dei trasduttori Fyfe 1982 in un campione di 18 63 diffusori ad US rileva che soltanto 5 rientravano nel range dei valori aspettati per ERA e 5 per potenza totale Johns 2007 ha esaminato 66 trasduttori operanti alle frequenze di 1 e 3 MHz riscontrando soltanto tre trasduttori al di fuori dei valori attesi per ERA Ishikawa 2002 ha rilevato che il 42 3 degli apparati testati non ris
195. nism of intracellular delivery by acoustic cavitation Ultrasound Med Biol 2006 32 915 924 Shaw Hodnett Calibration and measurement issues for therapeutic ultrasound Ultrasonics 48 2008 234 252 Sicurezza e Igiene del Lavoro Raccolta Normativa a cura della Te S1 A S r l anno 2000 Speed C A Review Therapeutic Ultrasound in soft tissue Rheumatology 2001 40 1331 1336 Teitelbaum S A Burns J Kubota J Matsuda H Otto M Shirakabe Y Suzuki Y Brown S Noninvasive Body Contouring by Focused Ultrasound Safety and Efficacy of the Contour I Device in a Multicenter Controlled Clinical Study Plastic and Reconstructive Surgery September 1 2007 ter Haar G Therapeutic applications of ultrasound Progress in Biophysics and Molecular Biology 93 2007 111 129 Wells PNT Biomedical Ultrasonics New York Academic Press Inc 1977 Wessling KC DeVane DA Hylton CR Effects of static stretch versus static stretch and ultrasound combined on triceps surae muscle extensibility in healthy women Phys Ther 1987 67 674 679 WHO International Programme on Chemical Safety Environmental Health Criteria 22 1982 Wu J Shear stress in cells generated by ultrasound Prog Biophys Mol Biol 2007 93 363 373 Zarnitsyn V Rostad C A Prausnitz M R Modeling transmembrane transport through cell membrane wounds created by acoustic cavitation Biophysical Journal 95 4124 4138 2008 Zhou Y Cui J Deng C X Dynamics of sonoporation co
196. noltre che il limite prescritto di 3 W cm non una garanzia di assoluta innocuit del trattamento anche alla luce del fatto che tale valore viene assunto arbitrariamente come limite per alcuni trattamenti di natura estetica non medica Il sempre maggiore utilizzo degli US pone problematiche in relazione all efficienza e all affidabilit degli apparecchi utilizzati caratteristiche anch esse che dovrebbero essere garantite dal rispetto delle relative norme tecniche In realt l analisi della letteratura internazionale ha evidenziato che spesso le apparecchiature non rispettano 1 limiti di tolleranza stabiliti dalle norme in termini di parametri di output quali potenza ERA BNR frequenza intensit effettiva E stata pertanto approfondita la valutazione delle caratteristiche emissive di due dispositivi commerciali emittenti US a 1 MHz e 3 MHz utilizzati rispettivamente per la fisioterapia e l estetica ai sensi della norma tecnica CEI EN 61689 2009 I risultati della caratterizzazione dei trasduttori ad US mostrano che la frequenza del segnale di eccitazione dei trasduttori rappresenta un parametro cruciale per determinare le condizioni ottimali di funzionamento degli stessi in particolare 1 valori dei parametri ERA e BNR definiti dalla norma tecnica dai quali possibile ricavare informazioni sulle propriet emissive dei diffusori ad US sono molto diversi se il trasduttore caratterizzato da solo o se viene preso in cons
197. nte della massa del bersaglio 4m che si determina tra il settaggio in cui il fascio ultrasonoro non attivato e il settaggio che corrisponde invece all attivazione della radiazione ultrasonora tipicamente 10 msec di misura seguite da 10 msec di stop poi ulteriori 10 msec di misura seguiti da 10 msec di stop da cul possibile ricavare la potenza emessa con la semplice relazione P cF cgAm 3 1 dove c la velocit del suono nel fluido di propagazione F la forza di radiazione sul target nella direzione di propagazione dell onda incidente g accelerazione di gravit e 4m l apparente variazione della massa bersaglio Per ogni acquisizione possibile estrapolare 1 valori del voltaggio Vins voltaggio P potenza e T temperatura Al fine di compensare eventuali errori nella misura della distanza di separazione tra il trasduttore e 11 mezzo assorbente la determinazione della potenza stata effettuata anche a distanze z pari a z A 4 con A c frequenza I risultati delle misure di potenza totale misurata sui due strumenti sono riportati nelle tabelle 3 1 e 3 2 per l operativit al 100 e al 50 per entrambi gli strumenti Si osserva che 1 valori ottenuti per la potenza media appaiono costanti al variare della distanza trasduttore bersaglio sia per l impostazione al 100 sia al 50 Si osserva inoltre per entrambi gli strumenti linearit nella determinazione della potenza totale che si dimezza quando l ampiezza del
198. nza e la determinazione sperimentale della posizione di quello che viene comunemente definito come l ultimo massimo assiale zx un fattore importante che caratterizza sia 1 campi ultrasonori che l interpretazione di alcuni dati biologici riguardanti l esposizione ad US L intensit ultrasonica in corrispondenza di questo picco lungo l asse del campo indicato come 1l picco di intensit spaziale del campo Inoltre la norma stabilisce la misura della pressione prodotta dal trasduttore lungo il suo asse principale la misura dettagliata attraverso un raster scan della pressione ultrasonora in tutti 1 punti dei piani ortogonali all asse principale di propagazione del fascio posti alle distanze di 0 3 cm e alla distanza a cui collocato zy il calcolo della pressione quadratica media totale pmst 11 calcolo della beam cross sectional area Agcs la determinazione dell area effettiva radiante ERA ottenuta tenendo conto di Agcs 11 calcolo del beam non uniformity ratio BNR In particolare la norma 61689 2009 stabilisce che un parametro importante e intermedio nella definizione di ERA la beam cross sectional area Agcs cm tale parametro definito come la minima area che contiene il 75 della somma di tutti 1 valori quadratici dei voltaggi determinati effettuando uno scan su un piano parallelo alla faccia del trasduttore alla distanza di 0 3 cm dalla faccia dello stesso determinabile attraverso un analisi dei dati acquisiti
199. o significativo sono 30 e 60 che appaiono separati dal restante cluster di dati e dal controllo CTRL son 5 _ac nucleici SSD 10 cm amp SOn 15 ac nucleici SSD 10 cm son 30 _ac nucleici SSD 10 cm son 45 _ac nucleici SSD 10 cm son 60 ac nucleici SSD 10 cm PC2 8 loading 1 0 5 0 0 5 1 1500 1450 1400 1350 1300 PC1 96 lunghezza d onda cm 1 Figura 5 16 PCA su dati spettroscopici per esposizione a US a 3 MHz SSD 10 cm P P regione spettroscopica associata alle bande P e Pe relativo loading plot Per quanto riguarda le bande P e P2 sono stati calcolati in accordo con la 5 2 1 parametri spettroscopici riferibili a rapporti di aree Rp e Rp2 Rp1 Pisonicato P1controto Pis Pic Rp P25 Pxe La 142 Figura 5 17 mostra 1 cambiamenti nei parametri Rp in corrispondenza dei differenti tempi di esposizione per le 3 distanze SSD 5 10 15 cm rispettivamente alle frequenze di 1 MHz e 3 MHz Rey NIH 3T3 1 MHz 15 Rey NIH 3T3 3 MHz 100 Rpl SS0 5 cm 8 Fip SS0 10 cm Fip Ss0 15 cm Fpl SSD 5 cm a Rip SSD 10 cm Ai Rpt SSD 15 cm Son 5 Son_15 Son_S0 Son_45 son_60 Sor 5 son 15 Son 30 son 45 son _60 Res NIH 3T3 1 MHz 75 Res NIH 3T3 3 MHz 100 e Rp2 S5D 5 cm 18 1 Rp2 SSD 5 cm E Rp2 SSD 10 cm m Fp2 SSD 10 cm dk Rp2 SSD 15 cm L ETI 4 Rp2 SSD 15 cm Son 4 Son 15 Son 30 Son 45
200. o 1 4 1 1 1 96 0 5 1 29 1 4 2 16 0 5 2 11 1 1 5 87 2 1 1 58 0 7 3 64 0 8 1 79 0 5 3 88 1 2 Tabella 5 14 risultati delle misure di citofluorimetria a flusso effettuate per esposizioni a 3 MHz 180 Un confronto quantitativo in termini di uptake di calceina tra quanto ottenuto per esposizione dei campioni ad US alle due frequenze di 1 MHz e 3 MHz tabelle 5 13 e 5 14 mostra che al crescere della frequenza diminuisce in modo importante la permeabilit cellulare divenendo comparabile con il controllo Tale risultato assieme con quanto rilevato con la spettroscopia FTIR e con la microscopia in fluorescenza sembra ulteriormente confermare una relazione tra frequenza 1 e 3 MHz ed eventualmente intensit del campo ultrasonoro incidente ed effetto indotto Infine in figura 5 64 riportato il grafico della vitalit cellulare rilevata attraverso le misure di citofluorimetria per esposizioni dei campioni ad US a 3 MHz nelle configurazioni indagate Si osserva che la vitalit pi bassa si ottiene per la configurazione espositiva SSD 5 cm t 60 40 88 contro 85 03 del controllo mentre la pi alta per le configurazioni espositive riferibili alla distanza campione trasduttore pi elevata pari a 15 cm Vitalit citofluorimetria 3 MHz 100 High Vitalit cellulare Controllo Sonicato Sonicata Sonicata Sonicata Sonicato Sonicata Sonicata Sonicato Sonicato 15 cm 30 15 cm 60 10 cm 30 5 cm 45 Somali 15 cm 45 10 cm l
201. o attraverso il quale ci avviene potrebbe essere la formazione dei radicali liberi a seguito della sonicazione Fuciarelli 1995 Milowska 2007 Pozzi 2011 I risultati evidenziano che l esposizione ultrasonora sembra causare un aumento della frequenza dei micronuclei dipendente dal tempo per esposizione dei campioni ad entrambe le frequenze 1 MHz e 3 MHz e l aumento maggiore nei campioni esposti ad US a 1 MHz Per entrambe le esposizioni le frequenze dei micronuclei sono pi elevate in corrispondenza delle minori distanze campione trasduttore 5 6 Microscopia a fluorescenza risultati sperimentali In tabella 5 7 riportato lo schema delle esposizioni eseguite a 1 MHz e 3 MHz effettuate a partire dai 30 minuti di esposizione per tutte le distanze SSD e per tutti 1 tempi di sonicazione 1MHz 75 High 3 MHz 100 High Distanza diffusore bersaglio SSD esposizione Tabella 5 7 tabella delle misure di microscopia in fluorescenza effettuate per esposizioni a 1 MHz e 3 MHz 157 Per la valutazione dell uptake di molecole da parte delle cellule NIH 3T3 esposte ad US alle frequenze di 1 MHz e 3 MHz nel corso delle nostre misure stata utilizzata la calceina 10 uM Per valutare la vitalit delle cellule successivamente alla sonicazione con marcatore fluorescente stato usato lo Ioduro di Propidio IP 20 pl Le immagini registrate a seguito della marcatura dei campioni con calceina hanno consentito di valutare
202. o di controllo di cellule NIH 3T3 Nella figura lo spettro di controllo ha linea spessa le otto curve gaussiana sono riportate con linee sottili e il fit risultante ha la linea tratteggiata I fit sui dati sperimentali sono stati eseguiti con 11 programma OPUS 5 0 Bruker Optik Agli spettri analizzati con questa procedura di fitting stata fatta una baseline tra 1 numeri d onda 1730 1475 cm anche in questo caso per rendere gli spettri confrontabili e per tenere conto del fondo allo stesso modo per tutti gli spettri analizzati Una volta eseguito il fit per determinare il contributo percentuale delle varie strutture alla struttura secondaria viene calcolato il peso dell area di ciascuna gaussiana rispetto alla somma delle aree delle singole gaussiane ovviamente omettendo nel calcolo 1 contributi dovuti ad amide II e sella E stato pertanto introdotto un ulteriore parametro R definito come R Area della curva gaussiana relativa a ciascuna struttura sec ondaria S Somma delle aree di tutte le curve gaussiane 5 2 dove l indice s relativo a ciascuna struttura secondaria presente nella tabella 5 2 Effettuare misure di spettroscopia infrarossa su cellule viventi vuol dire misurare sistemi dinamici Le caratteristiche strutturali delle cellule si modificano nel tempo a seconda di fattori esterni quali le perturbazioni apportate dal procedimento di misura e la preparazione dei campioni e fattori intrinseci alle cellule
203. o non deve essere effettuato su soggetti con pelle sensibile o che abbiano effettuato il peeling anche con altre modalit da meno di 30 giorni oppure portatori di impianti acustici attivi e o con problemi all apparato uditivo Il trattamento deve interessare soltanto la pelle integra vanno evitate le parti arrossate escoriazioni e ferite Prima di ogni trattamento bisogna procedere a sterilizzare e o disinfettare tutte le parti a contatto e verificare che la lamina dell applicatore sia liscia e il suo margine perfettamente arrotondato Il secondo tipo di apparecchiatura ad US ad alta frequenza utilizzato per trattamenti volti a dare maggiore tonicit all epidermide diminuire la lassit cutanea di modesta entit e ridurre le rughe superficiali in tabella 2 1 sono riportate le intensit ammesse nei due intervalli di frequenza 0 8 1 2 MHz e 1 2 3 5 MHz 0 8 MHz lt f lt 1 2 MHz 1 5 Tabella 2 1 range di frequenza e relativa intensit per gli apparecchi ad US nei trattamenti estetici previsti dal decreto n 110 del 2011 riveduta e corretta per via di imprecisioni nella tabella riportata nel Decreto 110 2011 E necessario ottenere un contatto perfetto fra applicatore e cute che si ottiene applicando il gel conduttivo nella zona da trattare A tale riguardo non si devono trattare soggetti con pelle sensibile e o con intolleranza a detti gel 55 Poich la scheda raccomanda di effettuare un ciclo di tratt
204. o viene applicato per un tempo molto breve tipicamente tra 1 e 16 s ad una frequenza che nei sistemi dedicati per la prostata compresa tra 3 e 4 MHz La frequenza del fascio deve essere tale da consentire un adeguata concentrazione di energia nel fuoco a distanza dal trasduttore senza determinare un assorbimento significativo nella regione tra il trasduttore ed il fuoco stesso l assorbimento degli US in grado di produrre una necrosi irreversibile nella regione bersaglio salvaguardando in larga misura 1 tessuti sani circostanti Litotrissia nell ambito delle terapie ad US ad alta potenza tale tecnica consente la rottura dei calcoli biliari renali uretrali per mezzo di US ad ampiezza elevata Tra le applicazioni mediche pi recenti degli US occorre annoverare anche la medicina estetica in questo ambito l utilizzo degli US rivolto essenzialmente al trattamento delle masse adipose in eccesso Nel passato l unico modo per la riduzione delle adiposit localizzate era la liposuzione o altre procedure chirurgiche Nel corso degli anni 80 stata introdotta la liposuzione assistita da US UAL la tecnica consiste nell utilizzo degli US contemporaneamente ad un aspirazione di tipo tradizionale La UAL prevede un incisione chirurgica con l applicazione sottocutanea direttamente nel pannicolo adiposo da trattare di un manipolo emettitore di US alla frequenza di circa 20 KHz che per dimensioni paragonabile ad una norm
205. olare a cono b evidenziano forme geometriche irregolari che indicano fasci non centrati po di a o 0 45 La maggior parte delle figure evidenzia distribuzioni non uniformi del fascio che in alcuni casi appare non centrato con varie biforcazioni che generano una distribuzione di energia disomogenea Tali disomogeneita derivano sia dalle caratteristiche costruttive degli apparecchi sia dalle condizioni operative di funzionamento dei sistemi ma l effetto finale pu essere la produzione di un calore eccessivo in piccole regioni del tessuto trattato con potenziali effetti dannosi per la salute dei pazienti sottoposti al trattamento Tale risultato evidenzia la necessit di valutare il campo di pressione ultrasonora dei diffusori normalmente usati per la terapia ad US poich l eventuale presenza di queste disuniformit nella distribuzione di pressione pu essere considerata come un indicatore della bassa qualit del trasduttore stesso La norma IEC 150 1995 stabiliva che per una testa emittente che opera in onda continua in condizioni ideali 11 minimo valore di BNR era 4 Ci vuol dire che alcune regioni del fascio avranno un intensit quattro volte superiore rispetto alla media spaziale attraverso il fascio Valori di BNR da 3 a 7 identificano diffusori operanti in condizioni accettabili Valori di BNR superiori a 8 individuano diffusori non sicuri e di scarsa qualita Per esempio poich il BNR il r
206. olazioni spettrali relative ai tempi di sonicazione di 15 e 60 appaiono distanti dal controllo e dalle popolazioni relative ad altri tempi che formano invece un cluster La sonicazione sembra pertanto agire in maniera significativa per 1 soli tempi di esposizione di 15 e 60 alla distanza SSD 10 cm 137 Per quanto riguarda la distanza SSD 15 cm l analisi PCA figura 5 9 e relativo loading plot mostra che la sonicazione sembra produrre variazioni significative nelle strutture lipidiche per esposizioni a 5 e 60 che risultano separate dal controllo e dagli altri esposti DIO PC2 29 loading a CTRL son 5 _lipidi SSD 15 cm son 15 lipidi SSD 15 cm son 30 _lipidi SSD 15 cm a son 45 _lipidi SSD 15 cm son 60 _lipidi SSD 15 cm 1 0 5 0 0 5 1 3000 2950 2900 2850 2800 PC1 40 lunghezza d onda cm 1 Figura 5 9 PCA su dati spettroscopici per esposizione a US a 3 MHz SSD 15 cm regione dei lipidi e relativo loading plot In figura 5 10 sono riportati le variazioni dei parametri Ry e Ry2 in funzione del tempo per differenti distanze campione trasduttore per esposizioni ad US a 1 MHz e 3 MHz I parametri spettroscopici RL sono stati calcolati in accordo con la 5 1 considerando 1l rapporto tra l area di una banda dello spettro sonicato e l area della stessa banda relativa al controllo tali parametri si riferiscono ai seguenti rapporti di aree Rr1 Lisonicato Licontrollo L15 L1c Rr2 Lzs Lze p
207. olgono l applicazione di US sono riportati in figura 2 11 Effetti clinici Livelli di evidenza scientifica Patologie degenerative dolore e limitazione funzionale nell osteoartrosi A Patologie acute dei tessuti molli Lombalgia Rotture tendinee parziali Algie di spalla tendinopatie calcifiche di spalla Sindrome del tunnel carpale Lesioni muscolari Ulcere da pressione Ulcere venose delle gambe Herpes zoster nevralgia posterpetica Consolidamento osseo Pseudoartrosi Osteoporosi Figura 2 11 effetti clinici per applicazione degli US in terapia e relativi livelli di evidenza scientifica Ministero della Salute 2011 58 Essi mostrano ampia variabilit nell evidenza di efficacia dei trattamenti che coinvolgono US con riferimento ad alcune patologie specifiche Ministero della Salute 2011 Una serie di cautele d uso e controindicazioni all applicazione degli US in fisioterapia sono elencate in numerose pubblicazioni NCRP 1983 WHO 1982 Lehmann 1982 Dyson 1985 Reid 1981 Oakley 1978 Ministero della Salute 2011 alcune di queste sono basate su una conoscenza generale dei principi e della pratica della terapia ad US altre derivano da estrapolazione dei risultati di specifici esperimenti scientifici o sono basate sulla esperienza clinica personale dei fisioterapisti La letteratura evidenzia che nessun paziente in stato di gravidanza o potenzialmente in gravidanza deve ricevere una terapia ad US in qualsiasi
208. olo di esempio il risultato di una misura ottenuta mediante citofluorimetro costituita da un istogramma a due parametri 121 loduro di propidio Calceim C Figura 4 20 esempio del risultato di una misura con citofluorimetro a flusso istogramma a 2 parametri Si tratta in pratica di un grafico in scala logaritmica che riporta due parametri misurati sugli assi x e y che si riferiscono agli eventi relativi alla fluorescenza della Calceina asse x e dello Ioduro di Propidio asse y il risultato rappresenta 11 numero di cellule conteggiate tramite un gradiente di densit Ogni figura divisa in 4 quadranti e in ognuno dei quattro quadranti rappresentato lo stato delle cellule del campione considerato All aumentare del numero di cellule marcate con ioduro di propidio ma non con la calceina C si passa dal quadrante in cui si trovano le cellule vive che non hanno internalizzato 1 due fluorocromi quadrante in basso a sinistra negativo alla calceina C cos come allo ioduro di propidio PI C a quello in cui si trovano le cellule morte quadrante in alto a sinistra PI C AI crescere del numero di cellule marcate con C ma non con PI si passa dal quadrante in cui si trovano le cellule vive quadrante in basso a sinistra PI C a quello in cui si trovano le cellule che hanno internalizzato la calceina quadrante in basso a destra PT C Nel quadrante in alto a destra ci dovrebbero essere invece le cellule apoptotiche che
209. omolecole presenti all interno di una popolazione di cellule ed in grado di rilevare cambiamenti conformazionali nei gruppi funzionali dei campioni biologici analizzati Il test dei micronuclei considerato come uno dei metodi migliori per valutare 1 danni nella cellula a livello cromosomico operati da un agente fisico chimico infatti consente la misura di cromosomi persi e danneggiati Tale test consiste nell osservazione microscopica dei nuclei cellulari con l utilizzo di un opportuno marcatore che permette la visualizzazione in fluorescenza dei nuclei stessi Il test del Trypan blue consente una misura della vitalit cellulare del campione esposto ad un dato agente La microscopia a fluorescenza rappresenta un eccellente mezzo per studiare materiali che sono in grado di fluorescere sia in maniera naturale sia nel caso in cui vengano trattati con prodotti chimici fluorofori capaci di emettere in fluorescenza Questa forma di microscopia ottica ha come maggiore punto di forza la sua scarsa invasivit che consente di avere immagini di campioni biologici con una buona risoluzione spaziale La citofluorimetria a flusso una tecnica che permette il conteggio e la caratterizzazione di cellule in sospensione marcate con fluorofori tramite l uso di laser e di rilevatori ottici La microscopia confocale una tecnica ottica principalmente utilizzata per lo studio tridimensionale di strutture biologiche isolate o in situ la metodica
210. one con tracciabilit agli standard nazionali il certificato dovrebbe inoltre dettagliare le performances dell apparato sull intero range dei settagli sia in onda continua che impulsata 2 2 3 Criticita connesse agli aspetti di sicurezza In accordo con le norme tecniche precedentemente illustrate nei contrassegni posti sull apparecchiatura o in alcune sue parti quali 1 trasduttori e nelle istruzioni d uso devono essere riportati 1 valori dei parametri rilevanti per il buon funzionamento dello strumento tra cui la frequenza acustica di lavoro la potenza d uscita nominale l area radiante effettiva il rapporto di non uniformit del fascio inoltre se l ampiezza modulata o pulsata la durata degli impulsi il periodo di ripetizione degli impulsi e il duty factor per ciascuna modulazione impostabile A tal proposito nel lavoro pubblicato dal Ministero della Salute nel 2011 riguardante la Sicurezza ed efficacia delle apparecchiature in riabilitazione sono state individuate significative criticit sul tema dell utilizzo di strumenti nella Medicina fisica e riabilitativa tra cui anche quelli che usano US per la fisioterapia effettuando un analisi sui manuali d uso di alcune apparecchiature Pur trattando l intero panorama delle apparecchiature comprendente apparati per Diatermia da contatto Elettroterapia Laserterapia Energia vibratoria Ultrasuoni da questo lavoro emerge una significativa eterogeneit per quanto
211. one agli ultrasuoni descrizione del set up di esposizione e misura Gli esperimenti di esposizione ad US di materiale biologico sono stati effettuati in una vasca in plexiglass di dimensioni 30x30x30 cm realizzata con la possibilit di variare le condizioni di esposizione delle cellule al campo acustico In questo setup sperimentale 1 trasduttori a 1 e 3 MHz sono stati posizionati sul fondo della vasca riempita di acqua bidistillata e mantenuta a temperatura ambiente Una piastra con coperchio capsula Petri contenente la coltura cellulare la cui superficie di 9 6 cm stata posizionata a pelo dell acqua e inserita per met del suo spessore nel bagno in linea con 1l trasduttore La distanza tra la sorgente di US e la superficie della piastra d ora in poi denominata SSD ultrasonic source dish surface distance indicata in figura 4 2 con d stata variata diminuendo aumentando 1l livello dell acqua La temperatura all interno e all esterno della capsula stata monitorata mediante una termocoppia durante l esposizione ultrasonora l aumento massimo della temperatura all interno della petri stato valutato in circa 2 C Peeri dish Figura 4 2 foto della vasca utilizzata e schema del set up sperimentale di esposizione Per l esposizione agli US sono stati utilizzati due apparecchi operanti alle frequenze di 1 e 3 MHz che consentono di lavorare in modalit continua e impulsata quando si utilizza il g
212. one prosegue nel capillare trasportato dallo sheath fino allo scarico in una tanica A fine acquisizione importante curare con attenzione la pulizia interna dello strumento utilizzando ipoclorito di sodio ed acqua distillata per eliminare le impurit residue ed impedire ostruzioni del sistema La citofluorimetria a flusso consente di ricavare informazioni sui parametri fisici dei campioni in esame quando viene colpita dal fascio di luce emesso dal laser la cellula emette segnali di luce diffusa in base alle proprie caratteristiche fisiche e morfologiche per fenomeni di rifrazione riflessione e diffrazione In particolare la luce dispersa in avanti forward scatter legata alle dimensioni delle cellule mentre la luce riflessa a 90 side scatter da attribuire a parametri della morfologia cellulare come la granulosita del citoplasma il rapporto nucleo citoplasma la rugosita di superficie Il cistogramma diagramma bidimensionale ottenuto dalla combinazione del forward dimensioni e del side granulosit scatter permette di discriminare tra diverse popolazioni cellulari basandosi solamente sulle loro caratteristiche fisiche In un cistogramma ogni punto rappresenta un evento contato dotato di un definito valore correlato ai parametri misurati nel nostro caso due tipi di fluorescenza per le nostre misure abbiamo infatti usato due fluorocromi 1 lo ioduro di propidio IP 2 la calceina C In figura 4 20 riportato a tit
213. ontrolo Sonicato Sonicato Sonicato Sonicato Sonicato Sonicato Sonicato Sonicato Sonicato 10 cm 30 10 cm 60 10 cm 45 Seems 15 om 30 15 cm 45 cmb 5cm45 Secmeo Figura 5 62 vitalit cellulare per esposizioni ad US 1 MHz nelle varie configurazioni espositive I risultati mostrano che 1 valori pi bassi per la vitalit 41 7 e 56 6 si ottengono alla minima distanza trasduttore campione SSD 5 cm e per i tempi di sonicazione pi elevati 45 e 60 Inoltre per quanto riguarda la vitalit cellulare stato effettuato un confronto tra quanto determinato con la tecnica del Trypan blue ed 1 dati ottenuti con la citofluorimetria a flusso 1 risultati mostrano una buona compatibilit tra le tecniche con un coefficiente di correlazione r 0 7 Il processo di sonoporazione ossia la porazione delle membrane delle cellule esposte agli US che consente l uptake di molecole del fluoroforo richiede l individuazione delle sue condizioni ottimali che da una parte mantengano una buona vitalit cellulare dall altra garantiscano una buona efficienza di internalizzazione nelle cellule di molecole di interesse a tale scopo stato determinato il cosiddetto therapeutic ratio TR Karthafian 2009 ossia il rapporto tra il numero delle cellule in cui stata indotta permeabilit a seguito di esposizione ad US e il numero delle cellule che sono state conteggiate come morte nell ambito della medesima esposizione Tale param
214. opio confocale di 117 tre cellule adiacenti mostrano la presenza di 3 popolazioni di uptake di calcina A indicativa di un elevato livello di uptake di calceina B indicativa di un basso livello di uptake di calceina C indicativa di un uptake nominale I nuclei delle cellule sono identificati da un asterisco b Figura 4 17 immagine al microscopio confocale di 3 cellule adiacenti che mostrano la simultanea presenza di 3 differenti subpopolazioni di uptake di calceina Il lavoro di Kodama del 2000 studia la variazione della permeabilit di membrana delle cellule utilizzando onde di shock per introdurre macromolecole e piccole molecole polari nel citoplasma L uptake della calceina viene studiato in cellule umane leucemiche HL 60 le cellule sono state esaminate mediante la microscopia confocale Tale tecnica consente di ottenere sottili sezioni ottiche attraverso il campione cellulare i risultati mostrano che la calceina produce una fluorescenza uniforme nelle cellule la figura 4 18 mostra 1 risultati dello studio Figura 4 18 immagine al microscopio confocale di cellule umane HL 60 esposte a un onda di shock in presenza di calceina In particolare 1 campioni a e c rappresentano immagini di cellule viventi della linea HL 60 in contrasto di fase l immagine b mostra la fluorescenza del campione di controllo che si presenta molto debole a causa di lieve uptake di calceina l immagine d relativa al campione tratt
215. oratorio con la caratteristica di crescere in adesione a superfici di flasks piastre petri in monostrato Come la maggior parte delle colture cellulari primarie hanno una durata limitata dopo un certo numero di divisioni sono soggette al processo di senescenza e smettono di dividersi Le cellule sono state coltivate in incubatore alla temperatura di 37 C e atmosfera modificata con l aggiunta del 5 di anidride carbonica con lo scopo di mantenere costante il pH dei campioni incubati Per 1 fibroblasti si utilizzato un terreno di coltura denominato DMEM Doulbecco s Modified Eagle s Medium con l aggiunta del 10 di Siero Fetale Bovino SFB Streptomicina Penicillina 1 e L Glutammina 1 Per la preparazione di campioni in adesione si dovuto tener conto del fatto che cellule di questo tipo devono essere staccate dal contenitore di coltura ad ogni passaggio ossia in ogni step necessario per portare avanti la linea cellulare Questa operazione stata effettuata mediante l utilizzo di un enzima proteolitico in grado cio di ridurre le proteine a polipeptidi pi piccoli la Tripsina EDTA dove EDTA sta per acido etilendiamminotetraacetico che aumenta l attivit della tripsina rimuovendo calcio e magnesio dalla superficie delle cellule Il protocollo utilizzato per effettuare 1 passaggi il seguente 1 si aspira il terreno di coltura dalla flask in cui crescono le cellule 2 s1 effettua un lavaggio con una quantit di PBS
216. ossibile ottimizzare 1 trattamenti sulla base della comprensione dei meccanismi di interazione In un indagine su studi clinici randomizzati relativi agli US in fisioterapia non stata determinata una relazione tra la dose e il risultato terapeutico tuttavia stato osservato che la maggioranza dei trattamenti efficaci utilizzavano US pulsati con intensit mediate spazialmente e temporalmente comprese tra 0 16 e 0 5 W cm ter Haar 2007 Ai fini di una valutazione di efficacia dei trattamenti fisioterapici che utilizzano diversi tipi di energia compresi gli US il Ministero della Salute ha effettuato nel 2011 un analisi della letteratura scientifica internazionale con lo scopo di vagliare le diverse applicazioni cliniche in relazione a specifiche patologie Ministero della Salute 2011 Le evidenze relative alle tecniche terapeutiche vengono riportate all interno di una cosiddetta Piramide delle Evidenze sulla base della quale 1 lavori scientifici vengono classificati secondo uno schema che vede alla base gli studi preliminari su modelli animali o in vitro a seguire quelli che esprimono opinioni di esperti o pareri di commissioni di esperti le citazioni di casi clinici le serie di casi gli studi caso controllo 57 gli studi di coorte e all apice gli studi clinici randomizzati e le metanalisi Ministero della Salute 2011 Nel lavoro 1 livelli di evidenza clinica sono suddivisi in e Ia revisioni sistema
217. otenza assorbita xe GLE Potenza d uscita xl 611 Classificazione yl x xL 6 1m Modalit d impiego xl y xu amp 1n Fusibili yl xil x 6 1 p Caratteristiche di uscita xl yil xil amp 1q Efetti fisiologici yi x ie 615 A disposizione 6 15 Dispositivi di collegamento di alta tensione Kel x xi LI 6 1 8 Modalit di raffreddamento ah x xil llu Stabilita meccanica yil x a 61 x Imballaggio di protezione xh yil xu Gly Terminali di terra ie gl tar G12 Mezzidi protezione amovibili gii x ee x Dati di targa richiesti se del caso i 2 Non per gli apparecchi installati permanentemente se marcati all interno Vedi anche 62 a Figura 2 9 dati di targa di un apparecchio ad uso estetico da norma CEI 62 39 La norma stabilisce che l apparecchio deve essere accompagnato da una documentazione contenente almeno le istruzioni d uso una descrizione tecnica ed un indirizzo a cui l operatore estetico possa fare riferimento Deve contenere la descrizione delle modalit di uso corretto e le avvertenze sulla sicurezza dei dispositivi le precauzioni da adottare uso improprio eventuale 53 manutenzione prevista La documentazione annessa deve essere considerata come parte integrante dell apparecchio Importante anche nella Norma la presenza dei cosiddetti simboli normativi ovvero immagini che descrivono in maniera visiva e immediata alcune propriet dell apparecchio un esempio riportato in fig
218. p Ramide sono SSD 15 cm t 45 e SSD 15 cm t 60 a cui corrisponde un intensit acustica incidente sui campioni 0 06 W cm inferiore rispetto a quanto rilevato per le distanze SSD 5 cm 2 e 10 cm rispettivamente 0 09 W cm e 0 08 W cm Le variazioni riscontrate nei parametri spettroscopici sembrano suggerire un relazione tra frequenza del campo ultrasonoro incidente 1 e 3 152 MHz ed effetto indotto A parita di frequenza sembra giocare un ruolo importante anche la distanza a cui posizionato il trasduttore rispetto al campione a cui corrispondono variazioni dell intensit acustica In figura 5 30 riportato un tentativo di correlare le variazioni di ciascun parametro spettroscopico con l energia incidente sul campione nel tempo di sonicazione dose dati in tabella 4 3 a cui corrisponde tale valore per la frequenza di esposizione di 1 MHz 1 MHz 75 High Variazione massima dei parametri spettroscopici valore 0 al 100 150 200 250 300 390 Dose Jicm energia incidente sul campione nel tempo di sonicazione Figura 5 30 massima variazione dei parametri spettroscopici in funzione della dose per esposizione ad US a 1 MHz La massima variazione dei parametri spettroscopici concentrata nel range di dosi comprese tra circa 100 e circa 200 J cm all interno del quale le variazioni di un numero maggiore di parametri spettroscopici si riscontrano in corrispondenza delle dosi
219. pali ortogonali cio indipendenti tra di loro che conservano al massimo la variabilit del dati da cui provengono tale trasformazione proietta le variabili originarie in un nuovo sistema cartesiano nel quale le variabili vengono ordinate in ordine decrescente di varianza Dal punto di vista geometrico la PCA consiste in un processo di rotazione dei dati originali effettuato in modo che il primo nuovo asse che costituisce la prima componente principale PC1 sia orientato nella direzione di massima varianza dei dati 11 secondo PC2 sia perpendicolare al primo e sia nella direzione della successiva massima varianza dei dati e cos di seguito Poich 1 componenti principali sono gli assi relativi alle direzioni di massima varianza in ordine via via decrescente la prima componente principale sar in grado di spiegare la maggior percentuale di varianza la seconda ne spiegher un po meno la terza meno ancora e cos via fino a che le ultime componenti contribuiranno a spiegare poco o nulla della variabilit presente nei dati in esame In questi casi quindi possibile eliminare parte della variabilit residua e quindi anche parte del rumore che accompagna l informazione rilevante prendendo in considerazione solo un numero di componenti minore del numero delle variabili originali Nel corso di questo lavoro per l analisi dei dati due PCs sono state selezionate dai dati spettroscopici PCA procede sostituendo tutte le variabili s
220. per eliminare le impurit il campione viene iniettato dalla pressione generata da una pompa ad aria nel centro di un flusso laminare 11 quale orienta le cellule verso una sorgente luminosa tipicamente una luce laser figura 4 19 POMPA ARIA TANICA FILTRO SHEATH SK NNA SALINO FLUID Capillare interno Ago d aspirazione Pressione Differenziale Figura 4 19 sistema di aspirazione del campione in un citofluorimetro 120 Il flusso laminare attraversa ortogonalmente un raggio laser nella maggior parte degli strumenti viene impiegato un laser a ioni di Argon con lunghezza d onda di 488 nm blu che pu eccitare fino a 3 diversi fluorocromi in contemporanea Al passaggio del campione la luce laser viene diffusa e 1 fluorocromi vengono eccitati Ogni singola cellula del campione viene attraversata dal fascio di luce laser che eccita 1 fluorocromi ad uno stato di energia pi alto 1 fotoni emessi a seguito della diseccitazione determinano l emissione di un segnale fluorescente Il segnale passando attraverso un sistema di filtri e specchi raggiunge un rivelatore viene quindi processato elettronicamente trasformato da analogico a digitale e inviato all analizzatore che elabora il dato e lo visualizza tramite un grafico Attraverso piastre di deflessione le cellule analizzate possono essere raccolte separatamente tramite un processo definito sorting Dopo aver attraversato il punto di misura il campi
221. pettavano le tolleranze previste dalle norme in termini di ERA In termini di BNR nel lavoro di Ferrari 2010 viene riportato che tutti i trasduttori rientravano nella tolleranza prevista dalla norma tuttavia tre di questi presentavano valori superiori al massimo ammesso pari a 8 Tali risultati sono in disaccordo con quelli di Ishikawa 2002 che non aveva trovato alcun apparecchio con BNR superiore a 8 al contrario Hekkenberg 1998 trov il 33 degli apparati analizzati con valori di BNR superiori a 8 La frequenza del fascio ultrasonoro correlata alla profondit a cui viene irradiato il tessuto pi alta la frequenza minore la profondit raggiunta dal fascio In termini di frequenza Ferrari 2010 ha mostrato che in circa il 10 degli strumenti operanti alla frequenza nominale 1 MHz e in nessuno di quelli operanti alla frequenza nominale 3 MHz la differenza tra il valore misurato di frequenza e il valore nominale non rientrava nella tolleranza ammessa dalla norma Tali risultati differiscono da quelli dello studio di Ishikawa 2002 in cui il 33 degli strumenti a 1 MHz e 1l 75 di quelli a 3 MHz non rientravano nei limiti di tolleranza In termini di potenza Artho 2002 ha effettuato misurazioni su 83 unit usate in ambito clinico mostrando che pi di un terzo dei macchinari non rispettavano le tolleranze previste per la potenza di uscita Allo stesso modo Schabrun 2008 ha effettuato test su 64 macchine per fisioterapia
222. pettrali in combinazioni lineari di PCs Similarit e differenze tra gli spettri IR ottenuti alle 3 distanze campione trasduttore per 1 differenti tempi di esposizione agli US possono essere individuate realizzando uno score plot bidimensionale in cui l informazione spettroscopica viene ridotta in un unico punto che ha come coordinate le 133 componenti PCA scelte come assi per lo score plot Una crescente separazione spaziale tra 1 punti nello score plot proporzionale al livello di dissimilarit negli spettri in termini di assorbanza Attraverso l analisi dei loading plot le componenti PCA consentono di individuare le regioni ossia i numeri d onda dello spettro FTIR che pi contribuiscono al clustering osservato nello score plot Gli spettri IR sono stati elaborati prendendone la derivata seconda secondo l algoritmo Savitzky Golay con 13 punti di smoothing e normalizzati all intensit dell Amide I 5 3 Spettroscopia FTIR risultati sperimentali Di seguito sono riportati 1 risultati sperimentali relativi alla spettroscopia FTIR su campioni di cellule NIH 3T3 irradiati con US alle frequenze di 1 MHz 75 High e 3 MHz 100 High al variare della distanza campione trasduttore SSD 5 10 15 cm e del tempo di esposizione t 5 15 30 45 60 5 3 1 Effetti degli ultrasuoni sulle strutture lipidiche Lo studio degli spettri IR di campioni cellulari permette di valutare variazioni conformazionali di gruppi f
223. precedentemente descritte non stato rilevato a seguito di esposizione dei campioni ad US alla frequenza di 3 MHz 100 High un significativo uptake della calceina nelle cellule alla distanza campione trasduttore di 5 cm si scelto di investigare se a parit di basse intensit ultrasonore incidenti sul campione l internalizzazione del fluoroforo dipenda o meno dalla frequenza 1 MHz o 3 MHz I campioni cellulari sono stati pertanto irradiati con US alla frequenza di 1 MHz 10 High alla distanza campione trasduttore di 5 cm per tempi di esposizione pari a 15 e 30 minuti le relative immagini sono riportate nelle figure 5 67 e 5 68 ottenute sommando lungo l asse z le emissioni in fluorescenza provenienti da tutti 1 piani ottici della cellula investigati Figura 5 67 immagini in microscopia confocale per il campione sonicato 1 MHz 10 High alla distanza SSD 5 cm per t 15 in rosso l emissione di IP in verde l emissione della calceina con i corrispondenti risultati in trasmittanza 183 Figura 5 68 immagini in microscopia confocale per il campione sonicato 1 MHz 10 High alla distanza SSD 5 cm per t 30 Per entrambi i setup si evidenzia importante internalizzazione della calceina all interno della cellula 1 risultati mostrano assenza di colocalizzazione tra cellule con uptake positivo della calceina e cellule morte che hanno legato IP Ulteriori investigazioni hanno consentito di escludere la presenza di segnale di autof
224. priet consente di convertire l energia elettrica applicata in energia meccanica cio in un onda acustica di pressione Allo stesso modo per la medesima propriet se si sottopone il trasduttore ad uno sforzo capace di deformarlo tra le superfici opposte si realizza una tensione elettrica tale caratteristica consente pertanto la rilevazione di un onda acustica di pressione 10 L assenza di un centro simmetria condizione necessaria affinch si manifesti la piezoelettricita Dal materiale naturale si passati a materiali ceramici come il titanato zirconato di piombo PZT 1950 e poi al materiale plastico come il floruro di polivinildene pVF2 1970 F lt _ MATERIALE PIEZOELETTRICO F Per quanto riguarda la propagazione degli ultrasuoni quando un onda ultrasonora passa da un ELETTRODI lt ARMATURE Figura 1 3 effetto piezoelettrico mezzo ad un altro si assiste generalmente al verificarsi di fenomeni che contribuiscono in maniera diversa alla ridistribuzione dell energia trasportata dall onda stessa una parte viene riflessa e una parte viene trasmessa secondo le leggi della meccanica classica Ciascun mezzo attraversato caratterizzato intrinsecamente da una grandezza complessa l impedenza Z che sintetizza le caratteristiche acustiche del mezzo attraversato e quantifica la resistenza che il mezzo stesso oppone al passaggio delle onde sonore L impedenza acustica definita come il prodotto de
225. problematiche connesse con l uso degli ultrasuoni in estetica Il sempre maggiore utilizzo degli US nella medicina estetica pone nuove problematiche in relazione alla valutazione sia dei potenziali danni per la salute del paziente che dell efficacia delle applicazioni Per quanto riguarda le applicazioni degli US per la rimozione del tessuto adiposo si evidenzia la necessit sia di ampliare la ricerca per valutare il rapporto rischio beneficio sia di documentare scientificamente o con una appropriata casistica clinica l effetto biologico indotto le eventuali controindicazioni 1 rischi gli effetti collaterali A maggior ragione dovrebbe sussistere l obbligo di documentare con riferimenti scientifici gli effetti biologici prodotti dai dispositivi utilizzati nell estetica non medica e soprattutto che la sicurezza dei trattamenti estetici sia garantita per mezzo di limiti di esposizione scientificamente fondati Appare inoltre fondamentale colmare al pi presto il vuoto normativo per 1 dispositivi usati nell estetica medica e non medica con l emanazione a livello europeo di norme tecniche specifiche analoghe a quelle definite per la fisioterapia il tutto al fine di fornire all operatore la garanzia di un corretto funzionamento dei dispositivi ed al pazienti di essere sottoposti ad un trattamento efficace e SICUrO Occorre infine che al pi presto venga emanata una normativa per 1 prodotti ad uso domestico per regolamentare il reg
226. protection in M J Suess Ed WHO Regional Publications European Series No 10 WHO Copenhagen 1981 Huang YM Sun SQ Zhao J Yu X and Zhong W Effects of free radicals on the molecular fluidity and structure of the membrane RBS Biorheology 1995 2 2 321 21 Humphrey V F 2007 Ultrasound and matter Physical interaction Biophys Mol Bio 93 195 2ER Hynynen and Mc Dannold N MRI guided and monitored focused ultrasound thermal ablation methods a review of progress Int J of Hypertherm 2004 20 725 737 193 Hynynen K Watmough D J and Mallard J R 1981 The Effects of Some Physical Factors on the Production of Hyperthermia by Ultrasound in Neoplastic Tissues Radiat Environ Biophys Vol 19 pp 215 226 Hynynen K Ultrasound for drug and gene delivery to the brain Adv Drug Deliv Rev 2008 60 1209 1217 IEC 150 1995 International Electrotechnical Commission 1995 Physiotherapy systems Performance requirements and methods of measurement in the frequency range 0 5 to 5 MHz IEC draft revision of publication 150 IEC Geneva IEC 61161 2007 Ultrasuoni Misure di potenza Bilanci della forza di radiazione e requisiti di prestazione International Electrotechnical Commission Geneva Switzerland IEC 61689 2009 Ultrasuoni Sistemi per fisioterapia specifiche di campo e metodo di misura nel campo delle frequenze comprese tra 0 5 MHz e 5 MHz IEC 2001 IEC 60601 part 2 5 Medical Ele
227. proteine molto pi facilmente quando la proteina piccola e quindi con basso peso molecolare e caratterizzata da bassa struttura ordinata In un ulteriore lavoro Conti 2010 la spettroscopia infrarossa in trasformata di Fourier ATR FTIR stata utilizzata per la prima volta per rilevare effetti indotti dall esposizione ad US terapeutici alla frequenza di 1 MHz sulla linea cellulare tumorale linfociti T Jurkat In questo caso sono stati utilizzati due diversi set up sperimentali per variare 1 parametri del campo acustico modificando la posizione del campione in piastra Petri rispetto al trasduttore 0 8 5 15 e 20 cm posizionato sul fondo di una vasca e il tempo di sonicazione I danni genotossici nelle cellule esposte sono stati ricercati mediante il Protocollo Cytokinesis Block Micronucleus CBMN I risultati hanno mostrato cambiamenti dei gruppi funzionali tipici delle proteine degli acidi nucleici e dei lipidi a dosi corrispondenti ad esposizioni alla distanza trasduttore campione di 15 cm in corrispondenza della quale il test dei micronuclei non ha mostrato per tossicit indotta nei campioni Dosi pi elevate relative alla distanza campione trasduttore pari a 5 cm hanno invece prodotto sia effetti tossici che cambiamenti strutturali L aumento nell assorbimento di tutti 1 gruppi funzionali rilevato dalla spettroscopia FTIR in corrispondenza della dose erogata a 15 cm risultato un fenomeno probabilmente dovuto all in
228. pu essere assimilata ad un bastoncino la struttura B pu essere assimilata ad un foglietto ripiegato Le strutture foglietto B hanno una caratteristica conformazione a zig zag Le porzioni di sequenza legate possono avere la stessa direzione e allora si definiscono foglietti B paralleli la direzione opposta si definiscono foglietti B antiparalleli Ripiegamento beta B turns si tratta di strutture che spesso uniscono due filamenti B antiparalleli a formare un ansa simile a una forcina per capelli tale ripiegamento responsabile dei 130 cambiamenti di direzione delle catene polipeptiche tipici delle proteine che assumono forma globulare Strutture disordinate random coils date dalla disposizione non ordinata e ripetitiva della catena amminoacidica In questo lavoro al fine di risalire alle eventuali variazioni sulla struttura secondaria del contenuto proteico presente nei campioni cellulari per effetto dell esposizione ad US stata effettuata una procedura di fitting sull Amide I e sull Amide II La procedura di fitting stata effettuata assumendo che le bande analizzate siano scomponibili in un certo numero di gaussiane ove ogni gaussiana rappresenta il contributo di un tipo di struttura secondaria Il numero d onda l area e la larghezza delle gaussiane sono 1 dati in input per il fit Di questi parametri si sono fissati solo 1 numeri d onda delle campane sotto l Amide I lasciando liberi gli a
229. quali la vitalit e le caratteristiche biologiche dei campioni Insieme alle misure di spettroscopia su campioni trattati sono state eseguite misure su cellule non esposte al campo acustico campioni di controllo Nel presentare i risultati sperimentali relativi alla variazione di struttura secondaria nelle cellule esposte al campo acustico si scelto pertanto di considerare un parametro R che definito come 132 _ struttura secondaria campione sonicato 53 struttura secondaria campione controllo La variazione del rapporto tra percentuali di struttura secondaria del campione sonicato rispetto al relativo controllo permette di tenere conto delle diverse caratteristiche dei campioni per ogni prova 5 2 Analisi statistica dei dati FTIR la PCA L analisi statistica dei dati spettroscopici stata effettuata mediante Analisi delle componenti principali PCA tecnica utilizzata nell ambito della statistica multivariata per estrarre la massima informazione possibile contenuta in una struttura di dati Bombalska 2011 L idea principale su cui s1 basa la PCA quella di rappresentare un insieme di dati pi o meno complesso con un numero inferiore di variabili non correlate che siano ottenute da una particolare combinazione lineare delle variabili originali e che riassumano le caratteristiche dei dati stessi Ci avviene tramite una trasformazione lineare delle variabili in un nuovo insieme di variabili composite componenti princi
230. questa classe i dispositivi generalmente riconosciuti di pericolosit medio alta e vi sono compresi 1 dispositivi attivi che forniscono al paziente energia o sostanze sotto forma potenzialmente pericolosa Si trovano in questa classe le sacche di sangue alcuni prodotti invasivi posti nel corpo con una operazione chirurgica apparecchiature a raggi X dispositivi medici ad US come litotritori device ad US chirurgici classe III i dispositivi di questa classe sono generalmente considerati di alta pericolosit e includono prodotti che entrano in contatto diretto col sistema circolatorio 0 col sistema nervoso centrale come le protesi vascolari La direttiva stabilisce che 1 dispositivi devono recare al momento dell immissione in commercio una marcatura di conformit CE apposta in modo visibile leggibile ed indelebile Il simbolo CE significa Conformit Europ enne ed indica che il prodotto conforme ai requisiti essenziali previsti da Direttive in materia di sicurezza sanit pubblica tutela del consumatore ecc pertanto non rappresenta un marchio di qualit del prodotto L articolo 11 della Direttiva europea descrive le procedure per la valutazione della conformit a seconda della classe di appartenenza del dispositivo 1 controlli sono pi o meno severi per cui si va da una semplice autocertificazione da parte del fabbricante per 1 dispositivi di classe I ai rigorosi controlli per le fasi di progettazione e fabbricazione per 1 di
231. quisizione installata su un PC 12 bit 10 Msamples s input range utilizzato 1 V Figura 3 5 particolari del set up di misura presso il CNR Figura 3 6 sistema di coordinate sul diffusore Una procedura dedicata realizzata in ambiente LabView esegue il calcolo delle ampiezze rms su una media di 100 acquisizioni filtrando il segnale tra le frequenze di taglio 500 kHz e 2 MHz per il trasduttore a 1 MHz e tra 1 MHz e 4 MHz per il trasduttore a 3 MHz 80 Per eliminare la presenza di un disturbo elettromagnetico riscontrato nel corso delle misure stato necessario effettuare la messa a terra della faccia dei trasduttori attraverso il collegamento con il corpo dell idrofono Le misure sono state eseguite nelle seguenti condizioni temperatura dell acqua 24 C 1 C temperatura ambiente 26 C 1 C Ai sensi della norma CEI EN 61689 2009 sono stati seguiti 1 seguenti step per entrambi 1 trasduttori a 1 e 3 MHz 1 analisi della risposta in frequenza dei trasduttori e ricerca della frequenza di lavoro calcolata come arithmetic mean acoustic working frequency fawf ossia media aritmetica di due frequenze in corrispondenza delle quali l ampiezza della pressione sonora di 3 dB al di sotto del picco 2 ricerca della posizione dell ultimo massimo zy del campo di pressione della pressione di picco Zp nel campo acustico entrambi mediante la scansione lungo l asse z orizzontale dei trasduttori ad intervalli di
232. r scan 2D della tensione Urms V misurata e 3D della pressione in dB calcolata sul piano ortogonale all asse z del trasduttore alla distanza da questo di 0 3 cm ottenuti eccitando il trasduttore con un segnale alla frequenza di risonanza del trasduttore ossia 3 158 MHz Le figure 3 20 e 3 21 mostrano gli stessi su un piano ortogonale all asse z del trasduttore alla distanza di 38 5 cm corrispondente alla posizione dell ultimo massimo assiale zn 90 Raster scan 3mm freg 3 158MHz Urms V 3 000E 04 0 003300 0 006300 0 009300 0 01230 0 01530 0 01830 0 02130 0 02430 0 02730 0 03000 30 25 A0 15 10 5 O 5 10 15 20 25 HX mm Figura 3 18 raster scan 2D tensione rms ai capi dell idrofono misurata sul piano ortogonale all asse di propagazione del fascio a z 0 3 cm dal trasduttore f 3 158 MHz E 236 242 E 230 236 E 224 230 0218 224 0212 218 fi TAN gli da Mii di ie i E 206 212 E 200 206 Figura 3 19 raster scan 3D pressione in dB calcolata sul piano ortogonale all asse di propagazione del fascio a z 0 3 cm dal trasduttore f 3 158 MHz 91 Raster scan 385mm freg 3 158MHz 3 000E 04 0 003300 0 006300 0 009300 0 01230 0 01530 0 01830 0 02130 0 02430 0 02730 0 03000 gU 29 20 15 10 5 O 5 10 15 20 25 Ww mm Figura 3 20 raster scan 2D tensione rms ai capi dell idrofono misurata sul piano ortogonale all asse di propagazione
233. ra 5 6 PCA su dati spettroscopici per esposizione a US a 1 MHz SSD 15 cm regione dei lipidi e relativo loading plot 136 La figura 5 7 mostra l analisi PCA sui dati spettroscopici relativi alla regione dei lipidi per esposizioni dei campioni cellulari ad US alla frequenza di 3 MHz alla distanza SSD 5 cm con il relativo loading plot in questa condizione sperimentale le popolazioni spettrali dei campioni esposti per 15 e 60 appaiono nettamente distinte dal controllo e dagli altri esposti 1 quali formano un cluster PC2 4 loading a CTRL B son 5 _lipidi SSD 5 cm A son 15 _lipidi SSD 5 cm son 30 _lipidi SSD 5 cm m son 45 _lipidi SSD 5 cm son 60 _lipidi SSD 5 cm 1 0 5 0 0 5 3000 2950 2900 2850 2800 PC1 95 lunghezza d onda cm 1 Figura 5 7 PCA su dati spettroscopici per esposizione a US a 3 MHz SSD 5 cm regione dei lipidi e relativo loading plot 1 CTRL 0 8 m son 5 lipidi SSD 10 cm son 15 lipidi SSD 10 cm 0 6 son 30 lipidi SSD 10 cm E son 45 lipidi SSD 10 cm 04 gw son 60 lipidi SSD 10 cm 0 2 0 PC2 28 0 2 loading 0 4 0 6 0 8 1 0 8 0 6 0 4 0 2 O 0 2 04 0 6 0 8 3000 2950 2900 2850 2800 PC1 89 lunghezza d onda cm 1 Figura 5 8 PCA su dati spettroscopici per esposizione a US a 3 MHz SSD 10 cm regione dei lipidi e relativo loading plot Alla distanza campione trasduttore di 10 cm l analisi PCA figura 5 8 con relativo loading plot mostra che le pop
234. rare il diffusore ad una frequenza differente rispetto a quella di risonanza del trasduttore piezoelettrico Raster scan 5mm freq 1 04 MHz Raster scan 3mm freq 1 3MHz Urms v 2 0006 04 0 002622 0 0065044 0 007467 mm mm 0 009889 0 01231 9 01472 0 0171 1 01956 0 02200 Figura 3 15 confronto tra i raster scan a 0 3 cm per f 1 040 MHz e 1 320 MHz Come precedentemente riportato su questo sistema stata effettuata presso INRIM Torino la misurazione della potenza totale con bilancia a forza di radiazione Nota la potenza totale e noto 1l valore del parametro ERA ottenuto attraverso misure sperimentali e calcoli ai sensi della norma CEI EN 61689 2009 possibile calcolare 11 valore dell intensit effettiva generata dal trasduttore come rapporto tra potenza emessa e area effettiva radiante tale calcolo stato effettuato a partire dai due diversi valori dell ERA ottenuti facendo lavorare il diffusore rispettivamente alla frequenza propria di risonanza e alla frequenza del suo generatore I risultati sono riportati in tabella 3 6 Frequenza di lavoro 1 320 MHz 1 040 MHz Area effettiva radiante ERA 8 72 cm Beam non uniformity ratio BNR 36 85 ca Intensita effettiva 1 14 W cm 0 76 W cm Limite massimo di Intensita effettiva 2 5 Wien dichiarato dal costruttore Tabella 3 6 risultati del confronto in termini di intensita emessa tra le due frequenze di eccitazione del trasdutto
235. rasduttore sulla quale distribuita la maggior parte della potenza ultrasonora emessa Nel 1981 la World Health Organization a seguito di studi sugli effetti degli US su animali ha stabilito che effetti benefici associati con la terapia ultrasonora possono essere raggiunti utilizzando 43 un intensita potenza radiante per unit di area non superiore a 3 W cm Al fine di proteggere il paziente dal pericolo di insorgenza di effetti avversi sulla salute i 3 W cm sono stati pertanto adottati negli standard di sicurezza internazionali come limite massimo dell intensit effettiva per gli apparati ad US ad uso terapeutico Ora poich troppo complesso definire direttamente questo parametro chiave per la sicurezza con un certo grado di accuratezza si ritenuto di dover derivare l intensit effettiva applicata al paziente dal quoziente tra la massima potenza ultrasonora misurata in Watt e un area nota appunto come area effettiva radiante ERA in cm entro la quale distribuita la maggior parte della potenza ultrasonora La misura di quest ultimo parametro effettuata valutando direttamente attraverso un idrofono la pressione acustica nel campo ultrasonoro emesso da una testa emittente consente quindi di determinare indirettamente l intensit efficace in termini di intensit media spaziale emessa dal dispositivo come energia che attraversa l unit di area nell unit di tempo W em A tal fine ai sensi
236. rasonication induced amyloid fibril formation of 82 microglobulin J Biol Chem 2005 280 32843 32848 Ohl CD Arora M Ikink R de Jong N Versluis M Delius M Lohse D Sonoporation from jetting cavitation bubbles Biophys J 2006 91 4285 4295 196 Okada K Kudo N Niwa K Yamamoto K A basic study of sonoporation with microbubble exposed to pulsed ultrasound J Med Ultrasonics 2005 32 3 11 Paik NJ Cho SH Han TR 2002 Ultrasound therapy facilitates the recovery of acute pressure induced conduction block of the median nerve in rabbits Muscle Nerve 26 356 361 Payton Lamb and Kasey 1975 Effects of Therapeutic Ultrasound on Bone Marrow in Dogs Phys Ther 55 270 275 Pepe J Rincon M Wu Junru Experimental comparison of sonoporation and electroporation in cell transfection application Acoustics Research Letters Online 2004 5 2 62 67 Perkins M A 1989 A versatile force balance for ultrasound power measurement Physics in Medicine and Biology 34 11 1645 51 Plaja J 2003 Analgesia por Medios Fisicos Editorial Mc Graw Hill Pozzi D Fattibene P Viscomi D Di Giambattista L Grimaldi P Udroiu I Bedini A Giliberti C Palomba R Congiu Castellano A Use of EPR and FTIR to detect biological effects of ultrasound and microbubbles on a fibroblast cell line Eur Biophys J 2011 Vol 40 No 10 pp 1115 1120 Preston R C Output measurements for medical ultrasound Spr
237. rasuoni in fisioterapia ed estetica 2 1 1 Normativa sui dispositivi medici 2 1 1 1 La Direttiva Europea 93 42 sui dispositivi medici Le apparecchiature ad US utilizzate in fisioterapia si configurano come dispositivi medici sulla base della Direttiva 93 42 CEE modificata dalla Direttiva 2007 47 CE recepita in Italia dal D Lgs 46 97 e da ultimo modificata dal D Lgs 37 2010 La Direttiva sui dispositivi medici Direttiva 93 42 CEE del Consiglio del 14 Giugno 1993 un documento che riporta 1 criteri generali da utilizzare nella progettazione e realizzazione degli stessi In generale la norma fornisce una definizione di dispositivo medico ossia qualsiasi strumento apparecchio impianto sostanza usato da solo o in combinazione compreso l eventuale software informatico impiegato destinato dal fabbricante ad essere utilizzato sull uomo allo scopo di diagnosi prevenzione controllo terapia di una malattia o di una ferita diagnosi controllo terapia attenuazione compensazione di un handicap studio sostituzione o modifica dell anatomia o di un processo fisiologico La norma stabilisce che detti dispositivi possano essere immessi in commercio e messi in servizio unicamente se non compromettono la sicurezza e la salute dei pazienti degli utilizzatori ed eventualmente di terzi qualora siano correttamente installati formino oggetto di un adeguata manutenzione e siano utilizzati alle condizioni e per 1 fini previsti fermo restando
238. re Si osserva che l intensit effettivamente emessa ben al di sotto dei limiti massimi dichiarati dal costruttore 2 5 W cm sia che il trasduttore lavori alla frequenza di 1 320 MHz 1 14 W cm sla alla frequenza di 1 040 MHz 0 76 W cm Alla luce dei bassi livelli di intensita effettiva calcolati 88 1 risultati sollevano dubbi in merito all effettiva efficacia del trattamento eseguito nelle condizioni sperimentali precedentemente descritte 3 3 3 Risultati del diffusore a 3 MHz La medesima procedura stata eseguita anche per la caratterizzazione del diffusore operante a 3 MHz L andamento della risposta in frequenza di questo secondo trasduttore riportata in figura 3 16 stata effettuata posizionando l idrofono in corrispondenza della posizione dell ultimo massimo del trasduttore individuata in modo orientativo a circa 320 mm dal trasduttore e scansionando in frequenza da 2900 kHz a 3300 KHz a passi di 10 kHz Come possibile osservare dalla figura 3 16 la risposta in frequenza di questo secondo trasduttore ha evidenziato un picco con frequenza centrata attorno a 3 158 MHz fawf Urms V 2900 2950 3000 3050 3100 3150 3200 3250 3300 frequenza KHz Figura 3 16 risposta in frequenza del trasduttore a 3 MHz alla posizione zy Anche in questo caso la frequenza di risonanza del trasduttore risulta diversa da quella ottenuta quando il trasduttore collegato al suo generatore infatti da
239. re di specifiche indicazioni sui parametri di output dei sistemi con la sola eccezione dell intensit effettiva massima tale mancanza appare in accordo con le criticit evidenziate dal lavoro del Ministero della Salute del 2011 per quanto riguarda 1 sistemi per fisioterapia Al contrario la presenza dei suddetti parametri non risulta obbligatoria per le apparecchiature la cui destinazione d uso estetica per la mancanza di norme tecniche specifiche in questo settore Da qui la necessit gi riportata nel precedente capitolo di verificare che effettivamente 1 costruttori di apparecchi che emettono US per la fisioterapia dichiarino nel manuale d istruzioni e o sugli strumenti 1 valori dei parametri che influenzano direttamente la quantit di energia erogata dal trasduttori e l output nonch la necessit di colmare il vuoto normativo per il settore estetico Dai risultati sperimentali delle misurazioni effettuate sulle caratteristiche di output dei due trasduttori in esame operanti alle frequenze di 1 MHz e 3 MHz rispettivamente usate per la fisioterapia e 1 trattamenti estetici emerge chiaramente una certa variabilit nelle caratteristiche di emissione dei sistemi fortemente dipendente dalla frequenza a cui 1 trasduttori vengono fatti lavorare Infatti 1 risultati mostrano che 1 valori dei parametri ERA e BNR dai quali possibile ricavare informazioni sulle propriet emissive dei diffusori ad US sono molto diversi se il
240. riportati 1 calcoli della stima indicativa dell intensit acustica incidente sul campione per il tempo di trattamento dose per entrambi gli strumenti 1 MHz modalit 75 High e 3 MHz 100 High 1 MHz 75 High Stima dell energia incidente sul campione in Petri durante la sonicazione Dose J em 14 Tempo in Sen Mem om 26 7 5 15 30 45 10 cm 24 3 72 9 se 15 cm 17 0 512 153 9 145 9 102 5 AS 230 9 218 9 153 7 p60 307 9 291 9 204 9 Tabella 4 3 dose stimata sul campione cellulare per lo strumento operante a 1 MHz 75 High 104 3 MHz 100 High Stima dell energia incidente sul campione in Petri durante la sonicazione Dose J cm 14 i a A E s gt f a m sa j Tabella 4 4 dose stimata sul campione cellulare per lo strumento operante a 3 MHz 100 High Tali valori sono stati calcolati per le tre distanze di esposizione SSD 5 10 15 cm e per 1 5 tempi di sonicazione 5 15 30 45 60 minuti 4 4 Tecniche d indagine sui campioni cellulari Le tecniche sperimentali usate per valutare l effetto prodotto dagli US sui campioni cellulari per esposizioni alle frequenze di 1 e 3 MHz sono la spettroscopia infrarossa in trasformata di Fourier FTIR il test dei micronuclei il test di vitalit la microscopia a fluorescenza la citofluorimetria a flusso la microscopia confocale 4 4 1 Spettroscopia infrarossa La spettroscopia infraros
241. rpendicolare alla direzione di propagazione dell onda L intensit pu variare nel tempo se si impiega onda continua o onda impulsata in particolare la presenza di un campo pulsato introduce una variazione temporale definendo un duty cycle come rapporto tra la durata dell impulso ultrasonoro in unit di tempo e la lunghezza del periodo calcolato come una percentuale Pulsed Wave Represeniation Figura 1 6 rappresentazione schematica di onde continue e onde impulsate con PRF frequenza di ripetizione dell impulso e t durata dell impulso ultrasonoro E possibile pertanto calcolare un intensit basata sulla pressione massima misurata nel campo ultrasonoro spatial maximum intensity o basata sulla pressione mediata su un area specifica spatial average intensity Quando si descrive l energia rilasciata dall esposizione ultrasonora anche importante distinguere se l intensit mediata solo quando l impulso on pulse average o se stata mediata su un tempo che include l intera durata del trattamento considerando cio l impulso ultrasonoro on e off temporal average 1 2 Effetti biologici degli ultrasuoni Gli US attraversando 1 tessuti determinano effetti tradizionalmente separati in termici e non termici Miller 1996 1 non termici riguardano principalmente la cavitazione Gli effetti termici si verificano tipicamente per esposizioni in onda continua mentre gli effetti non termici
242. rrelated with acoustic cavitation activities Biophysical Journal Biophysical Letters 94 L51 L53 2008 Ziskin M McDiarmid T Michlovitz S Therapeutic ultrasound In Michlovitz S ed Thermal agents in rehabilitation Philadelphia F A Davis 1990 198
243. rrispondenza della distanza campione trasduttore pari a SSD 10 cm per tutti 1 tempi In questo caso 1 risultati mostrano che le popolazioni esposte per 5 e 45 appaiono distinte dal controllo e dagli altri esposti si ipotizza pertanto per 1 suddetti tempi di sonicazione una significativit statistica dell effetto dell esposizione ad US in corrispondenza della distanza SSD 10 cm CTRL E Son 5 SSD 10 cm 450n15 SSD 10 cm E Son30 SSD 10 cm Son45 SSD 10 cm Son60 SSD 10 cm PC2 21 loading 0 8 06 04 02 0 0 2 04 0 6 0 8 3000 2950 2900 2850 2800 PC1 59 lunghezza d onda cm 1 Figura 5 5 PCA su dati spettroscopici per esposizione a US a 1 MHz SSD 10 cm regione dei lipidi e relativo loading plot In figura 5 6 sono riportati 1 risultati dell analisi PCA applicata ai dati spettroscopici ottenuti per esposizioni dei campioni cellulari ad US alla distanza campione trasduttore SSD 15 cm per tutti 1 tempi di esposizione la figura 5 6b mostra il relativo loading plot I risultati mostrano che in questa N configurazione la popolazione relativa al tempo di sonicazione di 45 l unica non clusterizzata e separata rispetto al controllo CTRL E Son 5 lipidi SSD 15 cm Son 15 lipidi SSD 15 cm E Son 30 lipidi SSD 15 cm Son 45 lipidi SSD 15 cm Son 60 lipidi SSD 15 cm PC2 7 loading 2950 2900 2850 2900 1 2 085 0 4 0 04 0 8 1 2 3000 lunghezza d onda cm 1 PCI 83 Figu
244. sa studia 1 modi vibrazionali degli atomi di una molecola infatti 1 sistemi molecolari se sottoposti ad una radiazione elettromagnetica risultano perturbati nei loro livelli vibrazionali e rotazionali Le frequenze di questi modi sono caratteristiche dei legami formati tra gli atomi dipendendo dalle masse degli atomi coinvolti dalla lunghezza dei legami dalla forza del legame e in generale da tutti 1 parametri che costituiscono la struttura della molecola permettendone quindi l identificazione Ogni gruppo funzionale ha infatti un assorbimento ad una precisa lunghezza d onda e da questi assorbimenti specifici possibile risalire al componenti della molecola figura 4 6 105 wavelength microns 2 5 3 4 5 6 7 8 10 it 12 13 14 15 16p I I I I I I I I I I I I I I CEN O H N H ce rs co i cH ta C 0 oa essi es bi In amp CNO lt gt s e C C C 0 CN ei s TZ r i 68 66 UUI A DI e ni In t y E Ca 05 as EOG 4000 JE 1493 1100 1000 1900 S600 1400 1190 1000 1000 1500 1733 1600 1500 1400 1100 1030 1250 1100 1055 10000 GEO god 50 FOO 750 700 BEG rm frequency 4 Figura 4 6 vibrazioni dei gruppi funzionali Per questa ragione la spettroscopia infrarossa una tecnica che consente l identificazione la quantificazione e l analisi strutturale di piccole molecole permettendo di ottenere informazioni sui cambiamenti conformazionali nei gruppi funzionali dei campioni biologici anali
245. sentire la propagazione in profondit delle onde ultrasonore si tratta infatti di applicazioni legate generalmente al trattamento delle rughe e delle masse adipose Negli ultimi anni 1 dispositivi ad US per fisioterapia ed estetica sono risultati disponibili sul mercato tradizionale farmacie centri specializzati ecc e su quello pi moderno virtuale siti Internet a costi relativamente ridotti gli utenti anche privi di specifica competenza tecnica nel settore possono pertanto procedere all acquisto sottoponendosi in regime fai da te ad un agente fisico potenzialmente pericoloso per la salute nel caso in cui l applicazione non fosse guidata da personale competente Visto quanto sopra in questo lavoro si intende approfondire l analisi delle problematiche sanitarie connesse alle esposizioni deliberate delle persone agli US per finalit che vanno da quelle fisioterapiche a quelle di natura estetica L analisi di queste questioni non pu prescindere dall esame della letteratura scientifica della legislazione e delle norme tecniche al fine di fotografare lo stato dell arte evidenziare problematiche e criticit e formulare proposte rivolte sia all autorit sanitaria sia al settore produttivo Stante la recente diffusione nell utilizzo di dispositivi ad US in questo lavoro stato effettuato uno studio delle propriet emissive di apparecchiature disponibili sul mercato e utilizzate per la fisioterapia e l estet
246. si radicali idrossilici a causa della dissociazione dell acqua la migrazione dei radicali liberi dall esterno all interno della cellula pu essere facilitata da un aumento nella permeabilit della membrana cellulare In questo caso 1 radicali liberi prodotti nel mezzo di coltura possono penetrare all interno della cellula e interagire con le strutture lipidiche e nucleotidiche insieme con 1 radicali prodotti direttamente all interno della cellula Per quanto riguarda le variazioni osservate nell assorbanza dei gruppi funzionali associati alle bande P3 e P4 esse concordano con l ipotesi che l interazione con 1 radicali liberi e le reazioni sonochimiche che avvengono per effetto del campo acustico possono contribuire alla modificazione del DNA In particolare un aumento di R pu essere attribuito a modificazioni strutturali dovute all interazione degli acidi nucleici carichi negativamente per la presenza di gruppi fosfato sullo scheletro con 1 radicali idrossido e perossido di idrogeno generati nel mezzo per idrolisi Dai risultati sperimentali si evince che tali variazioni avvengono soprattutto per sonicazioni alla frequenza di 1 MHz Per sonicazione dei campioni con US alla frequenza di 1 MHz 75 High Vanalisi dei risultati ottenuti ha permesso di rilevare che le configurazioni espositive in corrispondenza delle quali si verifica con maggior frequenza una variazione significativa dei parametri spettroscopici analizzati RL R
247. smissione quest ultima prevede l utilizzo di vetrini di Fluoruro di Calcio CaF trasparente all infrarosso su cui 1 campioni sono fatti crescere I vetrini vengono poi posizionati in un apposito supporto per le misure in trasmissione di cui dotato l interferometro figura 4 9 La radiazione infrarossa modulata nel tempo dagli specchi mobili attraversa direttamente il campione Nonostante questa tecnica permetta di ottenere un buon segnale di assorbanza gli spettri ottenuti sono sensibili alla presenza di acqua che attiva nella regione dell infrarosso e d luogo quindi ad 108 un assorbimento importante della radiazione IR Particolare cura deve quindi essere posta nel processo di asciugatura del campione dall acqua in esso contenuta Figura 4 9 particolare del supporto contenente la finestra di Fluoruro di Calcio 4 4 1 2 Spettroscopia FTIR preparazione dei campioni In questo paragrafo vengono descritti 1 protocolli per la preparazione dei campioni e le procedure di acquisizione dei dati sperimentali per la linea cellulare NIH 3T3 Gli spettri sono stati registrati con uno spettrometro FTIR 410 Jasco Jasco Co Hachioji City Tokyo Japan figura 4 10 Allo strumento collegato un circuito attraverso cui fluisce dell azoto gassoso che ha la doppia funzione di ridurre l umidit in tutto il sistema e di mantenere pulita l ottica da eventuali impurit Figura 4 10 spettrofotometro FTIR 410 Jasco
248. son 60 Son 5 son 15 son SL son _45 son bl Figura 5 17 andamenti dei parametri R R 2 in funzione del tempo di sonicazione per le 3 distanze SSD 5 10 15 cm alle due frequenze 1 MHz e 3 MHz La figura 5 17 mostra come nei campioni sonicati alla due frequenze l andamento dei rapporti tra le aree del campioni sonicati rispetto ai controlli simile per le due bande prese in considerazione In particolare per la frequenza 1 MHz gli andamenti del parametro R per le bande P bending asimmetrico del gruppo metilenico CH2 e P2 bending del gruppo metile CH3 nei lipidi di membrana mostrano che l area del campione sonicato quasi sempre maggiore di quella del controllo e comunque superiori rispetto a P2 con aumento dell assorbanza dei campioni trattati rispetto al controlli Va sottolineato che la distanza con variazioni pi rilevanti nei parametri Rp e Rp sicuramente SSD 15 cm 1 MHz per tempi di sonicazione superiore ai 30 in accordo con quanto rilevato con l analisi PCA Anche alla distanza SSD 5 cm si evidenziano variazioni importanti per tempi di sonicazione di 45 e 60 In accordo con quanto ottenuto dall analisi delle componenti principali la variazione dei parametri Rp e Rm che a questa distanza pu essere considerata significativa quella relativa a SSD 5 cm t 60 Per quanto riguarda la distanza SSD 10 cm in accordo con 143 l analisi statistica dei dati si pu riconoscere significativit
249. spositivi di classe II L applicazione puntuale della Direttiva 93 42 CE garantisce agli utenti pazienti e agli utilizzatori che un dispositivo medico stato progettato e fabbricato per rispondere ai requisiti essenziali di sicurezza ed efficacia quindi al fine di erogare prestazioni valide in base allo stato dell arte e che il suo impiego pu essere considerato sicuro nelle normali condizioni di utilizzo per il paziente l utilizzatore ed eventualmente di terzi in relazione all uso previsto I requisiti relativi alla progettazione e alla costruzione di tali apparecchiature prevedono anche le informazioni che devono essere fornite dal fabbricante con le apparecchiature stesse Quest ultime sono costituite dalle indicazioni riportate sull etichetta e dalle indicazioni contenute nelle istruzioni per l uso Ministero della Salute 2011 In considerazione della sua destinazione d uso e delle sue caratteristiche tecniche il dispositivo deve soddisfare requisiti essenziali di efficacia e sicurezza specifici che devono essere garantiti non solo al momento dell immissione in commercio ma anche mantenuti nel tempo per tutto il suo ciclo di vita utile grazie ad una corretta istallazione e adeguata manutenzione A tali fini il fabbricante pu riferirsi alle Norme armonizzate di settore norme riviste a livello europeo su cui 36 ogni Stato ha espresso parere favorevole in sintesi una Norma costituita da un el
250. st di vitalit del Trypan Blue risultati sperimentali 5 5 Il test dei micronuclei risultati sperimentali 5 6 Microscopia a fluorescenza risultati sperimentali 5 6 1 Risultati per esposizione ad ultrasuoni a 1 MHz 75 High 5 6 1 1 Il campione di controllo 5 6 1 2 Risultati per esposizioni a 1 MHz 75 High SSD 5 cm t 30 5 6 1 3 Risultati per esposizioni a 1 MHz 75 High SSD 5 cm t 45 5 6 1 4 Risultati per esposizioni a 1 MHz 75 High SSD 5 cm t 60 5 6 1 5 Risultati per esposizioni a 1 MHz 75 High SSD 10 cm t 30 5 6 1 6 Risultati per esposizioni a 1 MHz 75 High SSD 10 cm t 45 5 6 1 7 Risultati per esposizioni a 1 MHz 75 High SSD 10 cm t 60 5 6 1 8 Risultati per esposizioni a 1 MHz 75 High SSD 15 cm t 30 5 6 1 9 Risultati per esposizioni a 1 MHz 75 High SSD 15 cm t 45 5 6 1 10 Risultati per esposizioni a 1 MHz 75 High SSD 15 cm t 60 111 113 114 115 115 117 119 120 124 124 127 128 128 133 134 134 144 148 151 153 155 157 158 158 158 161 161 162 164 164 165 166 167 5 6 1 11 Tabella riassuntiva dei risultati ottenuti per esposizione ad ultrasuoni a 168 1 MHz 75 High 5 6 2 Risultati per esposizione ad ultrasuoni a 3 MHz 100 High 169 5 6 2 1 Risultati per esposizioni a 3 MHz 100 High SSD 5 cm t 30 t 45 169 e t 60 5 6 2 2 Risultati per esposizioni a 3 MHz 100 High SSD 10 cm t 30 171 5 6 2 3 Risultati per esposizioni a 3 MHz 100 High SSD 10 cm t 45 17
251. sting bending wasene bending fuon dal piano fuon dal piano Figura 4 7 stretching e bending L assorbimento della radiazione infrarossa regolato dalla legge di Lambert Beer Nelle misure sperimentali di assorbimento si paragona l intensit Io della radiazione incidente sul campione con l intensit I della radiazione trasmessa attraverso il campione Il rapporto Ilo dipende dallo spessore dalla natura e dalla concentrazione del mezzo 4 4 1 1 Spettroscopia IR a trasformata di Fourier FT IR L unita principale che costituisce uno spettrofotometro FTIR l interferometro di Michelson composto da due specchi uno fisso e l altro mobile e da uno specchio semitrasparente o Beam Splitter figura 4 8 Il raggio luminoso nel campo dell IR emesso da una sorgente termica costantemente preriscaldata giunge allo specchio semiriflettente beam splitter che lo divide in due raggi Un raggio viene riflesso verso lo specchio fisso l altro verso lo specchio mobile 1 raggi da questi specchi sono inviati nuovamente al beam splitter che li ricongiunge e li invia al rivelatore che trasforma il segnale luminoso in segnale elettrico Anche se 1 due raggi hanno raggiunto il rivelatore congiunti essi hanno compiuto un diverso cammino ottico a seconda della differenza del cammino ottico dei due raggi si creano delle interferenze costruttive o distruttive che generano un segnale al rilevatore proporzionale alla differenza di cammino ottico
252. t incidente sul campione Tale risultato potrebbe essere associato ad una sorta di saturazione dell effetto indotto dagli US con uptake della calceina che sembrerebbe dipendere pi dal tempo di sonicazione che dall intensit per tempi di sonicazione uguali o superiori al 45 gated M1 1MHz 75 High SSD 5 cm SSD 10 cm SSD 15 cm I 0 09 W cm I 0 08 W cm I 0 06 W cm Controllo 2 63 1 1 74 8 2 9 49 45 1 6 64 63 1 3 84 06 4 1 86 79 1 5 87 04 1 7 97 48 0 9 99 27 0 5 99 5 0 5 Tabella 5 13 risultati delle misure di citofluorimetria a flusso effettuate per esposizioni a 1 MHz Tali dati mostrano un buon accordo con quanto precedentemente rilevato in microscopia a fluorescenza e spettroscopia anche in questo caso le configurazioni con percentuale pi elevata di eventi positivi alla fluorescenza sono quelle corrispondenti alla distanza SSD 15 cm per 1 tempi di sonicazione pi lunghi pari a 60 Tale risultato sembra confermare che le modificazioni indotte dagli US alla frequenza di 1 MHz a livello della membrana costituiscono condizione favorevole 178 all internalizzazione del fluoroforo evidenziata in modo quantitativo dalle misure di citofluorimetria In figura 5 62 riportato il grafico della vitalit cellulare rilevata attraverso le misure di citofluorimetria per esposizioni dei campioni ad US a 1 MHz nelle configurazioni indagate Vitalit citofluorimetria 1 MHz 75 high Vitalit cellulare C
253. tabilisce che la conformit deve essere verificata con misure di area radiante effettiva e misure di potenza d uscita nominale in accordo al paragrafo 8 della Norma CEI EN 61689 2009 Viene stabilito anche che al fine di garantire precisione nei dati di funzionamento e protezione da errori di erogazione il sistema deve essere provvisto di indicatori quantitativi sul pannello di 42 controllo che devono mostrare a la potenza di uscita e l effettiva intensit nel caso di modo di funzionamento ad onda continua e b l intensit di picco temporale massima e la potenza d uscita temporale massima nel modo di funzionamento con forma d onda modulata in ampiezza La conformit deve essere verificata con misure in accordo al paragrafo 8 della Norma CEI EN 61689 Ogni indicazione di potenza non deve differire dal valore reale pi del 20 del valore reale AI fine di garantire l omogeneit del campo radiante il rapporto della non uniformit del fascio BNR non deve superare il valore di 8 0 per ogni testa di trattamento e per assicurare la stabilit dell uscita nel tempo la potenza di uscita deve rimanere costante entro il 20 del suo valore iniziale durante un ora di funzionamento continuo alla massima potenza d uscita e alla tensione nominale di rete in acqua a 22 C 3 C Infine la norma stabilisce che nei documenti di accompagnamento possano essere specificati 1 l area radiante 11 la potenza d uscita nominale 111
254. target dell agente fisico fondamentale al fine dell efficienza ed efficacia di una eventuale terapia genica 1 3 Applicazioni mediche degli ultrasuoni In medicina le applicazioni degli US possono essere suddivise in due grandi categorie formazione di immagini a scopo diagnostico e terapia Per quanto riguarda la diagnosi gli US vengono tipicamente utilizzati nella formazione delle immagini per ecografie addominali ginecologiche ecc utilizzando le riflessioni subite dal fascio ultrasonoro nell attraversare 1 tessuti biologici Nella diagnostica il range di frequenza utilizzato generalmente tra 1 2 5 e 1 7 5 MHz e l intensit mediata nel tempo dell ordine delle decine di mW cm L applicazione degli US a parti superficiali del corpo come la tiroide o gli occhi necessita invece di frequenze piu alte nel range 7 5 15 MHz caratterizzate da una scarsa capacita di penetrazione nei tessuti Le terapie che impiegano US possono essere suddivise in due gruppi ad alta potenza ed a bassa potenza ter Haar 2007 Le applicazioni ad alta potenza comprendono HIFU High Intensity Focused Ultrasounds e litotrissia mentre le applicazioni a bassa potenza includono fisioterapia sonoforesi sonoporazione terapia genica La tabella 1 3 mostra la frequenza l intensit di picco spaziale mediata nel tempo e la pressione nel punto focale o massima spaziale 25 per gli US non focalizzati utilizzati per le principal
255. terazione dei radicali liberi generati dagli US all esterno e all interno della cellula con le strutture lipidiche e nucleotidiche all interno della cellula In questi ultimi anni stato investigato l utilizzo degli US per aumentare 1l trasporto di membrana a causa della non invasivit e dell efficienza del metodo gli US potrebbero infatti aprire in modo reversibile la membrana protettiva delle cellule viventi consentendo di far entrare medicinali o molecole terapeutiche sonoporazione Futuri progressi in questo campo richiedono per una conoscenza approfondita di come gli US e la cavitazione agiscono sui sistemi biologici In questo ambito particolare importanza rivestono 1 risultati del lavoro di Di Giambattista 2011 in cul 1 fibroblasti murini NIH 3T3 sono stati studiati come sistema modello per la terapia genica e la drug delivery e utilizzati come target dell esposizione ad US terapeutici Il setup sperimentale prevedeva l irradiazione dei campioni per 15 30 45 e 60 minuti alle distanze campione trasduttore di 10 e 15 cm 1 cambiamenti indotti nei gruppi funzionali sono stati investigati con la spettroscopia FTIR Dall analisi degli spettri IR stato rilevato che l esposizione ad US di cellule non tumorali induce un cambiamento di intensit per la banda relativa allo stretching asimmetrico del gruppo CH 2924 cm nella regione lipidica 3000 2800 cem dipendente dal tempo di esposizione e quindi 24 d
256. ti sulla membrana cellulare e il citoscheletro figura 1 14 man mano che la tensione sulla membrana aumenta rispetto allo stadio iniziale S0 possono prodursi effetti reversibili per effetto delle espansioni e contrazioni indotte dagli US del doppio strato lipidico con ad esempio attivazione delle proteine di membrana meccano sensibili S1 la tensione crescente pu portare a danni sulle proteine di membrana e o al citoscheletro S2 e pu indurre la formazione di pori S3a S3b e anche rotture ad elevati livelli di stretching della stessa facilitando l uptake di farmaci o geni e aumentando la permeabilit cellulare So E T 6560 555556566565656555656655655655555565656565659 506 149 Pinan ere Wa A 9 VO A TB 455556550856 9200 O o o 55680 S 89655555555 o 55555089 6 Figura 1 14 differenti stadi dell interazione tra doppio strato lipidico e US 27 1 2 1 Studi in vitro degli effetti indotti da ultrasuoni utilizzando tecniche spettroscopiche Nel corso degli ultimi anni la spettroscopia infrarossa in trasformata di Fourier FTIR stata utilizzata in modo innovativo per investigare gli effetti indotti su proteine e campioni cellulari esposti ad US terapeutici frequenza 1 MHz in termini di cambiamenti strutturali ricavando informazioni sulle macromolecole presenti in una popolazione cellulare In particolare Marchioni 2009 ha studiato gli effetti indotti da esposizione ad US a 1 MHz su sei proteine i
257. tiche di studi clinici randomizzati e Ib almeno uno studio clinico controllato e randomizzato e fa almeno uno studio clinico controllato non randomizzato e Ib altri tipi di studi controllati di buona qualit e if studi non controllati di buona qualit serie di casi studi di correlazione studi descrittivi e IV opinione di esperti La forza delle raccomandazioni divisa in e A basate su informazioni scientifiche di livello Ia o Ib e B basate su informazioni scientifiche di livello Ia Hb e HI C basate unicamente su opinioni di esperti Livello IV Per comprendere quali gradi di evidenza siano disponibili in relazione a specifiche tecniche terapeutiche occorre procedere all analisi della letteratura per 1 casi ove il livello di evidenza risultasse il pi basso fra 1 tre previsti necessario continuare a monitorare la letteratura nel tempo al fine di identificare eventuali nuovi studi che possano variare il livello di evidenza assegnato alle varie tecniche terapeutiche Ove le evidenze siano ancora modeste occorre procedere all effettuazione di nuovi studi metodologicamente robusti e con un numero di casi appropriato al fine di consentire un giudizio sull efficacia clinica delle singole tecniche terapeutiche in s o di loro specifiche applicazioni Ministero della Salute 2011 I risultati del lavoro per quanto riguarda 1 livelli di evidenza scientifica per gli effetti clinici che coinv
258. ticolo 10 comma 1 della legge 4 gennaio 1990 n 1 relativo agli apparecchi elettromeccanici utilizzati per l attivit di estetista dopo un lungo iter di pareri e richieste di osservazioni e modifiche fra 1 quali 11 Consiglio Superiore di Sanit In 5 articoli e 2 allegati 11 decreto del 2011 disciplina l impiego degli apparecchi elettromeccanici alimentati alla corrente di rete e o a batteria che possono essere utilizzati per l attivit di estetista 54 in particolare ai sensi di quanto previsto dalla legge 1 90 l elenco degli apparecchi elettromeccanici ad uso estetico stato aggiornato tenuto conto dell evoluzione tecnologica del settore includendo nuove apparecchiature che non esistevano negli anni 90 Ad ogni apparecchio viene dedicata una scheda tecnica nella quale vengono indicati 1 requisiti e le norme tecniche da applicare in materia di sicurezza Dal decreto si evince che nella categoria Stimolatori ad ultrasuoni scheda tecnico informativa 2A soltanto due tipi di apparecchiature emittenti US possono essere utilizzate dalle estetiste 1 Vibrazione meccanica peeling 2 Ultrasuoni per trattamenti superficiali Il primo tipo di apparecchiatura utilizza vibrazioni meccaniche per l esfoliazione peeling e la pulizia della pelle rimuovendo le cellule morte superficiali La potenza massima degli US emessi non deve superare 1 10 W totali e la loro frequenza deve essere compresa fra 22 e 28 kHz 1l trattament
259. tificano specifiche regioni dello spettro elettromagnetico sono una forma di energia meccanica e perci per potersi propagare necessitano di un mezzo elastico quale plasma o liquidi Humphrey 2007 Si estendono a partire da frequenze superiori ai 20 kHz limite superiore di udibilit per l orecchio umano fino alle frequenze di qualche centinaio di MHz e intorno a 1 GHz lasciano il posto al regime cosiddetto ipersonico 100 MHz ULTRASOUND l MHz 10 kHz ALIDIBLE SOUND 100 Hz A Hz INFRASOUND Y Figura 1 1 range delle frequenze per gli ultrasuoni Gli US essendo onde meccaniche s1 propagano in un mezzo con trasferimento di energia e non di particelle queste ultime infatti oscillano semplicemente attorno alla loro posizione di equilibrio con trasferimento di energia da una particella ad un altra L oscillazione molecolare pu propagarsi nel mezzo in varie direzioni pertanto si possono distinguere onde longitudinali e onde trasversali nelle onde longitudinali 11 movimento oscillatorio delle particelle del mezzo di trasmissione parallelo alla direzione di propagazione mentre nelle onde trasversali perpendicolare Le onde longitudinali di compressione possono propagarsi in qualsiasi mezzo mentre le onde trasversali solo in quelli solidi a causa dei deboli legami che si instaurano tra atomi e molecole nei tessuti liquidi L onda ultrasonora pertanto longitudinale caratterizzata dall alternanza di
260. trasduttore caratterizzato da solo o se viene preso in considerazione l intero sistema ossia 1l trasduttore stesso pi la sua unit di controllo In particolare 1 risultati mostrano che 1 diffusori si configurano come qualitativamente accettabili ai sensi della norma CEI EN 61689 mostrando valori ottimali di ERA e BNR soltanto se vengono fatti lavorare alle loro frequenze di risonanza peraltro diverse da quelle fornite dai loro rispettivi generatori in caso contrario la conseguenza nel caso del diffusore ad 1 MHz quella di aumentare il BNR verso valori maggiori di quelli accettati dalla norma nel caso del trasduttore a 3 MHz quella di fornire un valore incoerente per il parametro ERA In entrambi 1 casi tali risultati 96 richiedono una attenzione particolare per valutare gli eventuali effetti prodotti dai trattamenti fisioterapici ed estetici nonch efficacia degli stessi I risultati pertanto mostrano che un analisi pi approfondita sulle prestazioni di tali dispositivi pu essere fornita da un esame della risposta in frequenza dell emettitore ad US pi estesa di quanto si evince dalla norma stessa e dalla ulteriore caratterizzazione del generatore Sarebbe pertanto opportuno che venisse riportata nel manuale d uso anche la risposta in frequenza del trasduttore facendo attenzione che per il sistema integrato trasduttore generatore ci sia accordo sulla frequenza di lavoro valutando 1 requisiti tecnici d
261. trasduttore 5 10 e 15 cm 4 4 5 Citofluorimetria a flusso La citofluorimetria a flusso una metodica largamente utilizzata nella routine di laboratorio e nella ricerca che permette di valutare contemporaneamente pi parametri fisici e chimici di diverse migliaia di particelle biologiche o cellule contenute in sospensione in un fluido A questo scopo si usa la luce diffusa dalle particelle del campione e la luce di fluorescenza emessa da opportuni agenti chimici detti fluorocromi si tratta di molecole che quando sono colpite eccitate da una luce di una certa lunghezza d onda emettono luce di lunghezza d onda maggiore I segnali di fluorescenza sono misurati come impulsi di ampiezza proporzionale al numero di molecole di fluorocromo che s1 legano a determinate strutture cellulari Il citofluorimetro trova applicazione in diversi settori della medicina e della biologia cellulare quali diagnosi di linfomi leucemie differenziazione di popolazioni di linfociti B e T studi sulla replicazione del DNA e sulla proliferazione neoplastica identificazione di condizioni di sofferenza cellulare che precedono la morte della cellula tramite apoptosi Nel citofluorimetro la sospensione cellulare viene aspirata da un ago e spinta da aria compressa pressione differenziale in un capillare 200um all uscita del quale incontra il liquido guaina sheath fluid proveniente da una tanica esterna Dopo aver attraversato un filtro salino 0 45 um
262. truzione degli adipociti appare determinante affrontare la problematica relativa allo smaltimento da parte dell organismo dei trigliceridi liberati e se ci possa portare ad eventuali rischi per la salute per esempio dovuti all aumento dei trigliceridi circolanti nel sangue in soggetti sani o gi affetti da dislipidemie o dovuti al sovraccarico del fegato in particolare nei soggetti con alterazioni della funzionalit epatica Teitelbaum 2007 e Moreno Moraga 2007 hanno dimostrato l assenza di cambiamenti clinici significativi nei parametri ematici rappresentativi del metabolismo dei grassi in pazienti sottoposti a trattamenti con il sistema Contour I Ultrashape Anche in questo caso una adeguata casistica clinica dovrebbe documentare l assenza di controindicazioni o di modificazioni cliniche significative anche a distanza di tempo dal trattamento in pazienti sottoposti a trattamenti ad US Sono stati recentemente oggetto di sperimentazione clinica anche dispositivi per l ablazione delle masse adipose mediante la tecnica HIFU Gadsden et al 2011 hanno descritto 1 risultati di una sperimentazione clinica per valutare la sicurezza di trattamenti con US focalizzati alla frequenza di 2 MHz la cui intensit raggiungeva 1000 W cm nel fuoco del trasduttore Anche in questo caso non sono stati riportati danni ai tessuti adiacenti a quelli trattati n sono state osservate alterazioni metaboliche Un ulteriore problematica consiste nel
263. ucendo sensibili modificazioni chimiche e fisiche I comportamenti delle bolle in oscillazione sotto l azione del campo acustico possono essere diversi una possibilit consiste nella cosiddetta diffusione rettificata in conseguenza della quale il raggio di equilibrio della bolla tende a crescere nel tempo Tale effetto si presenta alle intensit acustiche pi basse con sviluppo della cavit in un processo lento La ragione che durante le fasi di compressione e di espansione del gas pu diffondere attraverso la superficie della bolla rispettivamente verso il liquido esterno o verso l interno della bolla stessa e poich l area della superficie pi grande durante l espansione che nel corso della compressione il risultato che entra pi gas di quello che esce tale processo corrisponde alla cavitazione non inerziale o stabile Tale fenomeno avviene solo con l irradiazione di fasci ultrasonori continui e ad esempio occorrono circa 1000 cicli affinch una bolla arrivi in condizioni di risonanza ad 1 MHz Va sottolineato che questo tipo di cavitazione importante nell utilizzo terapeutico degli US oppure in ecografia Doppler Guiot 2010 La cavitazione inerziale o transiente invece caratterizzata da una fase di relativamente lenta espansione della bolla all interno del campo ultrasonoro quest ultimo caratterizzato da onde di compressione e depressione Durante la fase di pressione negativa depressione si ha l
264. un trasduttore qualitativamente accettabile Per valutare il comportamento del trasduttore nelle sue condizioni reali di funzionamento ossia quando collegato al suo generatore la medesima procedura precedentemente descritta stata ripetuta eccitando il trasduttore con un burst sinusoidale alla frequenza di 1 040 MHz che quella a cui lo fa effettivamente lavorare il suo generatore In figura 3 13 quindi riportato l andamento del campo di pressione lungo l asse z del trasduttore eccitato alla frequenza di 1 040 MHz 0 025 0 020 0 015 Urms V 0 010 0 005 0 000 0 20 40 60 80 100 120 140 distanza dal trasduttore mm Figura 3 13 valore rms della tensione lungo l asse z in funzione della distanza dal trasduttore per f 1 040 MHz Nella figura 3 14 sono riportati 1 raster scan a 3 mm dal trasduttore e in corrispondenza di Zy individuato per la frequenza di eccitazione di 1 040 MHz a 9 6 cm dalla faccia del trasduttore 86 Raster scan 3mm freq 1 04 MHz Raster scan 96mm freq 1 04 MHz Urms V 2 000E 04 catia 0 001450 0 001285 mm 0 003950 0 003535 mm 0 005200 0 004660 0 006450 0 005785 0 007700 0 006910 0 008950 0 008035 0 009550 0 008960 mm Figura 3 14 raster scan a z 0 3 cme a Zy 9 6 cm dal trasduttore frequenza 1 040 MHz In tabella 3 5 sono riportati 1 risultati delle misure con idrofono per il trasduttore alimentato con un segnale alla frequenza oper
265. unzionali appartenenti a strutture lipidiche In base all assegnazione delle bande dello spettro IR si ha che le bande denominate Li Lo P e P2 possono essere correlate ai lipidi presenti nella cellula La regione dello spettro tra 3000 2800 cem assegnata principalmente alle strutture lipidiche dei fosfolipidi di membrana di cui L e Lz sono le bande pi intense Le bande L 2960 em ed Lo 2920 cm sono riferite allo stretching asimmetrico di CH rispettivamente nel gruppo metile CH3 e metilene CH2 dei fosfolipidi di membrana che rappresentano in genere il 70 del peso lipidico totale Variazioni nell assorbanza relativa ai gruppi CH presenti nei gruppi metile e metilene terminale di queste strutture rappresentano quindi un parametro in grado di caratterizzare lo stato strutturale e funzionale delle membrane cellulari In figura 5 3 sono riportati gli spettri FTIR nella regione dei lipidi tra 3000 e 2800 cm registrati per esposizione dei campioni ad US alla frequenza di 1 MHz 75 High e 3 MHz 100 High alle 3 distanze campione trasduttore SSD 5 10 15 cm per 1 diversi tempi di sonicazione t 5 15 30 45 60 Per esposizioni ad US alla frequenza di 1 MHz la figura 5 4 mostra l analisi PCA applicata alla derivata seconda degli spettri relativi alla regione dei lipidi in relazione alla distanza campione trasduttore SSD 5 cm per 1 5 tempi di sonicazione considerati la figura 5 4b mostra 11 loading plot ut
266. ura 2 10 Figura 2 10 simboli normativi utilizzati per apparecchi ad US Il simbolo della figura 2 10 a rimanda ad una attenta lettura del manuale d uso il simbolo della figura 2 10 b caratterizza tutti gli apparecchi che erogano forme di energia radianti non ionizzanti come US radiofrequenze campi magnetici ecc 2 1 3 1 2 La legge 1 90 e il decreto n 110 del 2011 Il quadro normativo di riferimento per l estetica non medica la Legge 4 gennaio 1990 n 1 che disciplina l attivit di estetista In particolare l articolo 10 della legge forniva un elenco di apparecchiature che potevano essere utilizzate nei centri estetici e demandava ad un successivo 66 provvedimento normativo la determinazione delle caratteristiche tecnico dinamiche ed i meccanismi di regolazione nonch le modalit di esercizio e di applicazione e le cautele d uso degli apparecchi elettromeccanici di cui all elenco allegato alla presente legge Per pi di venti anni tale decreto non stato emanato e durante questo periodo nei centri estetici si sono diffuse apparecchiature di vario tipo non comprese nell elenco della legge 1 90 incluse alcune apparecchiature utilizzanti US in particolare quelle per il rimodellamento corporeo dichiaratamente basate sul fenomeno della cavitazione e la conseguente lisi degli adipociti Nel corso del 2011 stato infine pubblicato il Decreto 12 maggio 2011 n 110 Regolamento di attuazione del ar
267. ustica di esposizione Nel lavoro di Guzman 2002 campioni di cellule linea DU145 del cancro della prostata sono stati esposti a US a 500 kHz utilizzando un duty cycle al 6 con tempi di esposizione di 120 545 e 1000 ms e osservati al microscopio confocale per visualizzare l uptake di molecole fluorescenti nelle cellule Tale strumento stato utilizzato per determinare se l uptake ha luogo nel citoplasma e o nei nuclei delle cellule vive in figura 4 17 a viene riportata l immagine al microscopio confocale di tre cellule adiacenti L immagine mostra che la calceina si distribuisce all interno dell intera cellula mostrando la simultanea presenza di 3 differenti subpopolazioni di uptake di calceina La cellula Al evidenzia una fluorescenza luminosa indicativa di un elevato uptake di calcina la cellula A2 evidenzia un basso uptake mentre la cellula A3 indicativa di un uptake nominale In figura 4 17 b sono riportati 1 risultati di un ulteriore lavoro di Guzman del 2001 In questo studio la citofluorimetria a flusso stata usata per identificare e quantificare l eterogeneit degli effetti dell esposizione a US sull uptake di molecole per la linea cellulare DU145 del cancro della prostata I campioni sono stati esposti a pressioni acustiche da 0 6 3 MPa per tempi di esposizione di 120 2000 ms e lunghezza degli impulsi di 0 02 60 ms in presenza dell agente di contrasto Optison Anche in questo caso le immagini del microsc
268. viluppare dei protocolli per 1l Controllo di Qualit da mettere a disposizione delle strutture sanitarie analoghi a quelli per la diagnostica che prevedano una valutazione dell efficienza delle apparecchiature ci richiederebbe la realizzazione di appropriati laboratori di prova e caratterizzazione per l area degli US in medicina dotati di strumentazione di misura con riferibilit metrologica a garanzia per gli operatori di un corretto funzionamento dei dispositivi e per 1 pazienti di essere sottoposti ad un trattamento efficace e sicuro Sarebbe inoltre utile prevedere l effettuazione di una serie di misurazioni dei parametri di output della strumentazione ad US per fisioterapia a campione su strumentazioni appena uscite dalla fabbrica e su apparecchi in uso da diverso tempo per valutare la variazione percentuale degli stessi in funzione dell utilizzo e in relazione ai dati forniti dal costruttore ed alle tolleranze stabilite dalle norme tecniche Infatti apparecchiature utilizzate per molte ore al giorno molti giorni alla settimana avrebbero bisogno di una maggiore frequenza di calibrazione rispetto a quelle apparecchiature che presentano un tempo di utilizzo inferiore I fattori che possono contribuire alla perdita di taratura delle apparecchiature sono infatti la frequenza di utilizzo la potenza emessa 1l tempo dall acquisto fattori ambientali come temperatura e umidit processi di produzione qualit dei materiali utilizzati
269. z Elevato livello di uptake di calceina Medio livello di uptake di calceina Scarso livello di uptake di calceina 0 09 Wicm 0 08 Wiem 0 06 Wiem ag BOR ag BOR Tempo dli esposizione 45 45 rit 50 5 Evidenza di effetto bordo Tabella 5 8 schema riassuntivo degli esiti della microscopia in fluorescenza per le esposzioni a 1 MHz 75 In tabella 5 9 riportato un tentativo di correlare l effetto riscontrato in microscopia in fluorescenza con l energia incidente sul campione per il tempo di sonicazione dose In particolare si osserva che elevati livelli di uptake di calceina nelle cellule esposte agli US a 1 MHz si ottengono per configurazioni espositive a cui corrisponde una energia incidente sui campioni durante la sonicazione compresa tra 146 e 205 J cm Medi livelli di uptake del fluoroforo si osservano per dosi superiori a 205 J cm fino a 308 J cm mentre scarsi livelli per dosi inferiori a 146 J cm e in particolare pari a 102 J cm 168 1 MHz 75 high Stima dell energia incidente sul campione in petri durante la sonicazione dose LEGENDA ESPOSIZIONE DELLE CELLULE AD US 1 MHz LL 2 14 Dose J cm a Elevato livello di uptake di calceina 146 lt dose lt 205 J cm Medio livello di uptake di calceina dose gt 205 J cm Scarso livello di uptake di calceina doses 146 J cm Tabella 5 9 schema riassuntivo degli esiti della microscopia in fluorescenza per le esposizioni a
270. za di 3 MHz in corrispondenza della distanza campione trasduttore SSD 15 cm e per 1 tempi di esposizione di 30 45 e 60 173 Figura 5 57 immagini del mononostrato del campione sonicato 3 MHz alla distanza SSD 15 cm per t 30 I risultati mostrano scarsa fluorescenza e scarsa mortalit cellulare evidenziando netta distinzione tra cellule che internalizzano la calceina e cellule morte che legano lo IP Figura 5 58 immagini del monostrato del campione sonicato 3 MHz alla distanza SSD 15 cm per t 45 Figura 5 59 immagini del monostrato del campione sonicato 3 MHz alla distanza SSD 15 cm per t 60 174 5 6 2 6 Tabella riassuntiva dei risultati ottenuti per esposizione ad ultrasuoni a 3 MHz 100 High La tabella 5 10 mostra lo schema riassuntivo dei risultati ottenuti con la microscopia a fluorescenza per esposizione dei campioni ad US alla frequenza di 3 MHz 100 High in termini di Elevato livello di uptake di calceina Medio livello di uptake di calceina Scarso livello di uptake di calceina per ciascuna distanza campione trasduttore SSD 5 10 15 cm e relativa intesit incidente sul campione per tutti 1 tempi di sonicazione 30 45 60 Si osserva che in corrispondenza di tutte le intensit acustiche incidenti sul campione inferiori rispetto a quelle relative all esposizione ad US a 1 MHz 75 per tutti 1 tempi di sonicazione sono presenti scarsi livelli di uptake di calce
271. ziale causa di rischio Per ognuno di questi meccanismi pu essere maggiormente rilevante una particolare caratteristica del fascio ultrasonoro per questo motivo non possibile identificare un unico concetto di dose che possa mettere in relazione le esposizioni ad US con gli effetti biologici Sicuramente l intensit una grandezza significativa nel caso degli effetti di natura termica per gli effetti di natura non termica invece possono essere maggiormente significative altre grandezze fisiche come per esempio la pressione di picco negativa di rarefazione nel caso degli effetti di natura meccanica connessi alla cavitazione Sono state proposte in passato alcune grandezze ultrasoniche dosimetriche ma si trattato di casi molto specifici e non facilmente generalizzabili La norma internazionale della International Electro technical Commission IEC 60601 2001 part 2 37 IEC 2001b nata per i sistemi ad US 31 per la diagnosi e il monitoraggio introduce un importante parametro per la sicurezza legata all esposizione agli US l indice meccanico utilizzato per indicare la possibilit di un danno meccanico ai tessuti per effetto di bolle o gas legato al fenomeno della cavitazione tale parametro stato definito come indice di esposizione o di sicurezza poich prende in considerazione le propriet dei tessuti attraversati dall onda ultrasonora 1 processi biofisici e le propriet acustiche del sistemi in esame Ino
272. zione del sito attivo di una proteina in seguito a trattamento con US Sequestered molecule Active complex Treat with I P D Active site Figura 1 12 distacco dalla proteina di un inibitore Multimolecular complex Active site Treat with E maiaren MC d Functional Nonfunctional Figura 1 13 transizione della proteina da uno stato funzionale ad uno stato non funzionale Come abbiamo visto un ipotesi centrale che riguarda gli effetti non termici dell interazione tra US e tessuti biologici che essi siano primariamente mediati dalla cavitazione in realt modificazioni della membrana cellulare con evidenza di bioeffetti in cellule e tessuti possono essere indotte anche in assenza di cavitazione stabile o inerziale Daleki 2004 Kimmel 2006 O Brien 2007 Krasovitski 2011 con livelli di intensit ultrasonora al di sotto della soglia della cavitazione 100 mW cm Secondo Krasovitski 2011 possibile spiegare sia gli effetti biologici indotti dalla cavitazione che quelli indotti in condizioni di non cavitazione mediante un modello che fa riferimento all interazione diretta tra la pressione acustica oscillante e 11 doppio strato della membrana cellulare L autore ipotizza infatti che la membrana cellulare sia in grado di assorbire l energia meccanica dal campo ultrasonoro trasformando l energia acustica in stress meccanici ZI attraverso espansioni e contrazioni dello spazio intermembrana in particolare
273. zona del corpo che sia suscettibile di poter provocare esposizione per il feto poich l applicazione degli US pu determinarne surriscaldamento Lele 1979 infatti il sistema nervoso fetale in via di sviluppo profondamente suscettibile al calore e al danni fisici o chimici L ipertermia ha dimostrato essere un effetto teratogeno in molte specie animali compresi gli esseri umani in particolare il feto non riesce ad eliminare il calore indotto a causa dell immaturit dei suoi meccanismi di termoregolazione Inoltre studi su animali hanno mostrato anomalie fetali e peso ridotto dei feti in femmine di topo gravide esposte ad US ad intensit terapeutica Edwards 1997 Barnett 1990 Gli organi sensoriali cio l occhio l orecchio e il tessuto nervoso sono particolarmente sensibili agli US in quanto sono scarsamente vascolarizzati quindi vulnerabili al trasferimento di calore per conduzione In particolare 11 neuroepitelio dell orecchio interno pu con facilit essere danneggiato in modo irreparabile da dosi terapeutiche di onda ultrasonora continua quindi termica Barnett 1980 Per lo stesso motivo ogni regione corporea caratterizzata da ridotta circolazione del sangue non dovrebbe essere sottoposta a irradiazione ultrasonora Gli US non devono essere applicati al cervello al midollo spinale o in prossimit di grandi nervi periferici sottocutanei Per evitare la possibilit di danni al midollo spinale consigliabile evitare
274. zzati Le bande di assorbimento delle transizioni vibrazionali nello spettro elettromagnetico generalmente sono comprese tra 5000 cm e 500 cm Affinch la radiazione venga assorbita o emessa dal sistema necessario che gli atomi del legame chimico coinvolto nella transizione presentino un dipolo elettrico e che questo dipolo vari durante la vibrazione degli atomi della molecola Questo assicura l accoppiamento tra il campo elettromagnetico oscillante della radiazione e gli atomi oscillanti alla stessa frequenza della radiazione Gli atomi che fanno parte di un legame possono muoversi in diversi modi dando luogo a diversi assorbimenti Per una molecola semplice sono possibili due tipi di modi stretching e bending Per stretching si intende un movimento lungo l asse di legame con conseguente aumento e diminuzione della distanza interatomica questo pu essere simmetrico o asimmetrico Per bending si intende la deformazione dell angolo che il legame forma con i legami adiacenti Si hanno due tipi di bending sul piano ovvero un movimento a forbice che cambia l angolo formato tra 1 legami nei quali le distanze di legame restano invariate mentre cambiano uno o pi angoli di legame fuori dal piano in cui l oscillazione avviene fuori dal piano definito da almeno tre atomi figura 4 7 106 vl be stretching simmetrico stretching asimmetrico AZ Ke scissorine bending nel piano rockine bending nel piano si M twi

l`uso degli ultrasuoni alle frequenze terapeutiche - Padis

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