HIV BLOT 2.2
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1. 5 10 gradi 17 In caso di impiego di strumentazione automatica accertarsi che questa sia validata prima dell uso 18 Accertarsi che i campioni vengano aggiunti dalla striscia Il vassoio pu essere titolato e il campione aggiunto quando il tampone viene raccolto all estremit inferiore In questo modo si impedisce la formazione di macchie scure dovute all aggiunta del campione sulla striscia 19 Evitare l impiego di congelatori a sbrinamento automatico per la conservazione di reagenti e campioni 17 Ensure that automated equipment if used is validated before use 20 Si sconsiglia l utilizzo di campioni diluiti o liofilizzati in quanto possono fornire risultati alterati Se costituiscono un pannello QC o una parte di esso dovrebbero essere considerati validi ISTRUZIONI PER LA CONSERVAZIONE 1 Conservare il kit HIV BLOT 2 2 di MPD e i relativi componenti a 2 8 C quando non sono utilizzati 2 Se conservati alla temperatura di 2 C 8 C tutti i reagenti e le strisce per test mantengono la stabilit fino alla data di scadenza riportata sul kit Non congelare i reagenti A Strisce Evitare inutili esposizioni delle strisce alla luce B Reagenti Conservare i reagenti nelle provette o nei flaconi originali con i cappucci correttamente serrati e Dispensare tutti i reagenti a freddo e riportarli ad una temperatura di 2 C 8 C non appena possibile e La conservazione del substrato a 2 C 8 C pu pro2. Aggiungere 2 ml di SOLUZIONE DI 2ml SUBSTRATO a ogni pozzetto 13 Coprire la vaschetta e incubarlo per 15 minuti sull agitatore oscillante Nota La reazione pu essere interrotta prima di 15 minuti se tutte le fasce sono visibili 14 Aspirare il SUBSTRATO e sciacquare 3x2 ml almeno tre volte le strisce con acqua per reagenti per arrestare la reazione In caso di lavaggio insufficiente a questo punto pu apparire uno sfondo scuro 15 Prendere delicatamente le strisce con le pinzette e appoggiarle su fazzoletti di carta Coprire con altri fazzoletti e asciugare In alternativa lasciare asciugare le strisce nei pozzetti della vaschetta 16 Sistemare le strisce su carta da lavoro carta bianca non assorbente Non applicare scotch sulle bande che si sono formate Osservare le bande vedere Interpretazione dei risultati e classificare i risultati Conservare le strisce al buio 30 minuti 15 minuti 9 Asciugare immediatamente ogni versamento di materiale potenzialmente infettivo con carta assorbente e tamponare l area contaminata con una soluzione di ipoclorito di sodio all 1 prima di riprendere il lavoro In presenza di versamenti contenenti sostanze acide asciugare l area con carta assorbente prima di utilizzare l ipoclorito di sodio Tutto il materiale usato inclusi i guanti monouso dovr essere smaltito come materiale a rischio biologico Non autoclavare il materiale contenente ipoclorito di sodio 10 Prima
3. Organizzazione Mondiale Sanit Due bande ENV con o senza GAG WHO 1990 oPOL Consorzio per la Standardizzazione Una banda ENV con p24 o p31 della Sierologia di Retrovirus CRSS 1988 USA Determinazione di 2 ENV POSITIVO ALL HIV 1 gp160 gp41 e gp120 e GAG con p17 p24 p55 o POL INDICAZIONE DI p31 p51 p66 e banda HIV 2 HIV 2 specifica visibile Presenza di una delle bande virali INDETERMINATO specifiche ma il profilo non ha i requisiti di POSITIVO Presenza di una delle bande virali INDETERMINATO specifiche ma il profilo non ha i con requisiti per essere POSITIVO INDICAZIONE DI Banda HIV 2 specifica visibile HIV 2 Croce Rossa Americana CRA 1988 USA Una banda ciascuno di GAG POL ed ENV Centro cinese per il controllo della malattia e la prevenzione CCDCP 2004 PRG Due bande ENV OPPURE una banda ENV con banda p24 National and State Reference Laboratories NRL 1987 Australia Una banda ENV con almeno tre bande GAG o POL Associazione tedesca per il controllo delle malattie virali DVV Una banda ENV e almeno una banda GAG o POL vedere anche DIN 58 969 parte 41 Si raccomanda di utilizzare le seguenti direttive per l interpretazione dell HIV BLOT 2 2 prodotto dalla MPD Per ciascuna banda individuata si devono rilevare i risultati ed interpretarli come NEGATIVO POSITIVO o INDETERMINATO PROFILO INTERPRETAZIONE Assenz
4. consultare immediatamente il medico 3 Incubare le strisce da 1 a 2 minuti a 2 minuti temperatura ambiente 25 3 C su una piattaforma oscillante alla velocit di 12 16 cicli al minuto Eliminare la soluzione tampone mediante aspirazione Nota Non lasci che le strisce asciughino il guasto pu provocare i contrassegni acquosi sulle strisce sviluppate per alcuni esemplare 4 Aggiungere 2 ml di SOLUZIONE DI 2ml BLOTTING a ciascun pozzetto 5 Aggiungere 20 pl di siero del paziente o 20 pl di controllo a seconda del pozzetto 6 Coprire il vassoio con il relativo coperchio tutta la e lasciare incubare per tutta la notte 16 notte 20 ore a temperatura ambiente 25 3 C sull agitatore oscillante 7 Scoprire con cautela la vaschetta per evitare la fuoriuscita del materiale o il rimescolamento dei campioni Inclinare la vaschetta per aspirare la miscela dai pozzetti Tra un campione e l altro cambiare il beccuccio dell aspiratore per evitare una contaminazione incrociata 8 Lavare ogni striscia per 3 volte con 2 ml 3x2ml di TAMPONE DI LAVAGGIO DILUITO lasciandola a bagno per 5 minuti sull agitatore oscillante tra ogni lavaggio 9 Aggiungere 2 ml di SOLUZIONE DI 2 ml CONIUGATO a ogni pozzetto 10 Coprire la vaschetta e incubarlo per 30 minuti a temperatura ambiente 25 3 C sull agitatore oscillante 11 Aspirare il CONIUGATO dai pozzetti 3x2 ml Eseguire un lavaggio come indicato al punto 8 12
5. dell eliminazione sterilizzare in autoclave tutto il materiale utilizzato e contaminato a 121 C a 15 p s i per 30 minuti In alternativa decontaminare i materiali in una soluzione di ipoclorito di sodio al 5 per 30 60 minuti prima di gettarli negli appositi contenitori a rischio biologico 11 Decontaminare tutti i reagenti e le sostanze chimiche impiegate in una soluzione di ipoclorito di sodio con una concentrazione finale pari almeno all 1 Lasciare agire per 30 minuti per garantire una efficace decontaminazione 12 Si sconsiglia il riutilizzo delle vaschette per incubazione PRECAUZIONI DI IMPIEGO 1 Per ottenere prestazioni ottimali dal test occorre SEGUIRE RIGOROSAMENTE le procedure illustrate nel presente Manuale di istruzioni Qualsiasi deviazione dalla procedura pu provocare risultati erronei 2 NON MODIFICARE O SCAMBIARE REAGENTI DI KIT APPARTENENTI A LOTTI DIVERSI controlli il coniugato e le strisce di Western Blot sono stati abbinati per ottenere prestazioni ottimali Utilizzare unicamente i reagenti forniti con il kit 3 Non utilizzare i componenti del kit dopo la data di scadenza riportata sulla confezione 4 Evitare la contaminazione microbica dei reagenti nell aprire le provette o i flaconi originali e prelevare i materiali poich ne potrebbero derivare risultati erronei nonch la prematura riduzione della durata di conservazione del prodotto Utilizzare tecniche asettiche incluse pipette o punta
6. distillata o di meno o di meno 3x2ml QUANTIT NECESSARIA DI REAGENTI PER NUMERO DI STRISCE Reagenti NUMERO DI STRISCE DA UTILIZZARE 3 6 9 15 20 27 36 1X Tampone di lavaggio ml 60 100 140 240 300 400 520 1X Tampone di blotting ml 20 40 60 80 100 120 160 Coniugato kl 11 17 23 35 45 59 77 Substrato ml 11 17 23 35 45 59 77 Polvere per blot 9 1 2 3 4 5 6 8 CONTROLLO DI QUALIT Si raccomanda di eseguire in ogni seduta il controllo non reattivo reattivo forte e reattivo debole indipendentemente dal numero di campioni esaminati risultati di un analisi possono essere considerati validi solo se soddisfano le seguenti condizioni 1 CONTROLLO NON REATTIVO Assenza di bande specifiche HIV 1 e HIV 2 sulle strisce di controllo non reattivo Dovrebbe essere visibile la banda di controllo del siero Fig 1c 2 CONTROLLO REATTIVO FORTE Devono essere visibili tutte le bande di peso molecolare pertinenti La Figura 1a fornisce una guida al posizionamento relativo delle bande visualizzate con l HIV BLOT 2 2 di MPD consentendo l identificazione delle bande osservate per il CONTROLLO REATTIVO FORTE Le bande sono p17 p24 p31 gp41 p51 p55 p66 e gp120 gp160 Possono essere visibili anche altre bande associate ad antigeni del nucleo p39 p42 Fare attenzione a non interpretare queste ultime come
7. il proprio distributore locale BIBLIOGRAFIA 1 V C W Tsang K Hancock M Wilson D F Palmer S Whaley J S Mc Dougal and S Kennedy March 1985 Developental Procedure Enzyme linked Immunoelectrotransfer Blot technique for HTLV III LAV antibodies CDC Altanta 2 H Towbin T Staehlin and J Gordon 1979 Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets procedure and some applications Proc Natl Acad Sci USA 76 4350 4354 3 J Schupbach M Popovic R V Gilden M A Gonds M G Sarngadharan and C Gallo 1984 Serological Analysis of subgroup of Human T Lymphotropic retroviruses HTLV III associated with AIDS Science 224 503 505 4 M G Sarngadharan M Popovic L Bruch J Schupbach and R C Gallo 1984 Antibodies reactive with human T Lymphotropic retroviruses HTLV III in the serum of 11 Centers for Disease Control 2001 Revised Guidelines for HIV Counseling Testing and Referral and Revised Recommendations for HIV Screening of Pregnant Women United States Morbid Mortal Weekly Rep 50 RR 19 12 Fiebig E W D J Wright B D Rawal P E Garrett R T Schumacher L Peddada C Heldebrant R Smith A Conrad S H Kleinman and M P Busch 2003 Dynamics of HIV viremia and antibody seroconversion in plasma donors implications for diagnosis and staging of primary HIV infection AIDS 17 1871 1879 13 Ly T D C Edlinger and A Vabret 2000 Contributio
8. 88 67 5420 degli antigeni virali HIV 1 con campioni sieropositivi Totale 455 16 439 9 R S Tedder A Hughes T Corrah et al 1988 Envelope cross E mail custserv eur mpbio com di HIV 1 Campioni testati 197 da NSW ea reactivity in Western Blot for HIV 1 and HIV 2 may not a Quando testati con l HIV 2 Western Blot 6 di questi campioni indicate dual infection Lancet 11 927 930 PROFILO HIV BLOT 2 2 DUPONT ORTHO sono risultati positivi a ENV GAG o POL 9 sono risultati posi SIEROLOGICO NUMERO HIV 1WB NUMERO ivi solo a GAG e o POL mentre 1 campione risultato negativo 10 Bottinger B A Karisson F Andreasson et al 1990 Envelope ENN PERCENTUALE PERCENTUALE cross reactivity between Human Immunodeficiency Virus Brevetto degli Stati Uniti 5 721 095 i si r i Type 1 and 2 detected by different serological methods GAG POL ed 192 97 5 188 95 4 Un totale i San in Ee A n Convistion between I aion and reactivity ENV stato analizzato con ot 2 2 di e i risultati hanno against the main neutralizing site J Virol 64 7 3492 3499 x i i p24 p31 gp41 mostrato che HIV Blot 2 2 di MPD era in grado di rilevare 9 3 9 i To e Heri ni i so elo 187 94 9 179 90 9 l anticorpo per l HIV anticipatamente o nello stesso campione In conza Qa ENEaDS lECNNGOgIOS Ne gp120 gp160 in tutti i pannelli ENV e GAG 0 197 100 197 100 POL 8 TAVOLA DI INDIVIDUAZIONE GUASTI Sviluppo di bande non specifiche e non Formazione di ulteriori t Band
9. LI UTILIZZATI Sui prodotti MP Diagnostics e relative confezioni si possono rovare i simboli grafici riportati di seguito Sono i simboli generalmente utilizzati per l etichettatura dei dispositivi medici e dei relativi imballi Per informazioni pi dettagliate consultare a norma britannica ed europea BS EN 980 2003 Non riutilizzare Utilizzare entro Dispositivo medico 3 Sinonimo diagnostico in vitro Data di scadenza Codice partita Numero di i Sinonimi catalogo Numero di lotto Numero di partita Attenzione iti Vedere le Istruzioni Limitazione di per l uso temperatura Rappresentante iiil Produttore Ec rer autorizzato per la Comunit Europea Contiene il necessario Vedere 7 per l esecuzione di cii a i lt n gt analisi Istruzioni per l uso PRINCIPI CHIMICI E BIOLOGICI DEL METODO Alle strisce di nitrocellulosa vengono legate singole proteine antigeniche derivate da HIV 1 inattivato e parzialmente purificato mediante blotting elettroforetico nonch un peptide sintetico HIV 2 specifico Le singole strisce di nitrocellulosa vengono incubate con siero o plasma diluiti e con i controlli Se presenti nel campione gli anticorpi specifici anti HIV 1 e HIV 2 si legheranno alle proteine HIV 1 e al peptide HIV 2 sulle strisce Queste ultime sono quindi sottoposte a lavaggio al fine di rimuovere le sostanze non legate possibile visualizzare gli anticorpi che si legano specificamente alle proteine HIV medi
10. MP a Diagnostics HIV BLOT 2 2 DOSAGGIO WESTERN BLOT CE 0123 DATA DI REVISIONE 03 07 MAE 0011 ITA 1 18 kit per test 11030 018 36 kit per test 11030 036 NOME E USO PREVISTO Nota modifiche evidenziate Il kit HIV BLOT 2 2 di MP Diagnostics MPD un dosaggio qualitativo immunoenzimatico per il rilevamento in vitro degli anticorpi del virus di immunodeficienza umana tipo 1 HIV 1 e ipo 2 HIV 2 nel siero o nel plasma umano E indicato come est integrativo pi specifico da condurre su campioni di siero o plasma umano rilevati ripetutamente reattivi mediante procedure di screening come i test immunoenzimatici ELISA Enzyme Linked Immounosorbent Assays INTRODUZIONE Sono attualmente disponibili numerosi test di screening per la determinazione degli anticorpi anti HIV 1 e HIV 2 agenti eziologici della Sindrome di Immunodeficienza Acquisita AIDS Tali test possono essere estremamente sensibili ma potenzialmente meno specifici dando origine a interpretazioni falsamente positive Sar quindi necessario effettuare ulteriori test ad elevata specificit per confermare la presenza di anticorpi anti HIV 1 e o HIV 2 Il kit HIV BLOT 2 2 prodotto dalla MP Diagnostics rappresenta un test supplementare pi specifico da effettuare su campioni di siero o plasma umani risultati ripetutamente reattivi al test ELISA Gli antigeni virali specifici anti HIV 1 posti separatamente sulle strisce me
11. a con alcuni sieri a titolo elevato HIV 2 o indeterminati GAG Reactive Only ma si tratta di una banda evidente non marcata diversa dalla banda diffusa di gp160 ENV Il procedimento di interpretazione comporta quanto segue 1 Accertare che la banda di controllo del siero sia visibile Se la banda di controllo negativa i risultati non devono essere considerati validi in quanto ci indice di un errore tecnico quale ad esempio la mancata aggiunta del campione del coniugato o del substrato 2 Individuare il peso molecolare di ciascuna banda della striscia utilizzando le strisce di Controllo REATTIVO FORTE e o DEBOLE come guida 3 L interpretazione della striscia si basa quindi sull individuazione di profili specifici delle bande secondo le raccomandazioni delle autorit competenti ad es Ministero della Sanit Organizzazione Mondiale della Sanit etc Poich le direttive per l interpretazione possono variare da Paese a Paese MPD raccomanda di consultare le autorit locali Di seguito vengono elencati i criteri d interpretazione stabiliti dai diversi organismi internazionali ORGANISMO CRITERI INTERPRETATIVI DI POSITIVIT PER IL TEST WESTERN BLOT Almeno due bande di p24 gp41 o gp120 gp160 Association of State and Territorial Public Health Laboratory Directors Centers for Disease Control ASTPHLD CDC 1989 USA Centre National Transfusion Due bande ENV 2 con GAG o POL Sanguine
12. a di specifiche bande virali NEGATIVO Determinazione di anticorpi p17 NEGATIVO SOLTANTO nessun altra banda Determinazione di 2 ENV POSITIVO ALL HIV 1 gp160 gp41 e gp120 e GAG p17 p24 p55 o POL p31 p51 p66 a gp 160 gp 120 p 66 p55 p51 gp 4i 2 p39 Aa p31 E p 24 E pi Controllo __ va si siero HIV 2 a Controllo reattivo forte Reattivo a HIV 1 e HIV 2 b Controllo reattivo debole Reattivo solo a HIV 1 so Controllo non reattivo Tipico siero HIV 2 sieropositivo CRITERI PER INTERPRETARE IL TEST COME INDETERMINATO Un test INDETERMINATO non pu essere considerato determinante per una diagnosi di infezione da HIV 1 Poich la maggior parte dei soggetti con un risultato inizialmente INDETERMINATO sviluppano anticorpi anti HIV entro 1 mese se sono stati infettati dall HIV 1 il CDC degli USA 2001 raccomanda che questi soggetti ripetano il test per l infezione da HIV 1 dopo lt 1 mese soggetti che continuano a presentare un test INDETERMINATO dopo 1 mese presentano una scarsa probabilit di essere stati infettati dall HIV a meno che non si sospetti un esposizione recente all HIV Sulla base di uno studio recente di Fiebig et al 2003 bench il periodo finestra per il Western blot possa durare fino a 22 giorni nel caso di un infezione primaria da HIV 1 la progressione da un blot INDETERMINATO a un profilo pienamente POSITIVO rich
13. a netta e distinta Sviluppo mancato o di indicative per HIV 2 bande oltre alle bande difettose a livello di gp 41 debole intensit delle di controllo del siero Comparsa di Songe previte Formazione di uno strato Sul controllo negativa macchie scure spesso sulla striscia in assenza sulle strisce Comparsa di macchie bianche sulle strisce 1 Le strisce sono state capovolte durante l analisi 2 Vassoi non lavati accuratamente prima dell uso 3 Dissoluzione incompleta della polvere per blot 4 Interferenza da elettroblot durante la produzione 1 Contaminazione batterica o fungina del campione Verifica del controllo positivo o presenza di bande positive 1 Campione fortemente reattivo e reagisce con quantit minime di intermedi 2 Il campione reagisce in modo incrociato con le proteine H 9 contenute nel preparato virale per esempio HLA ABC DR 3 Individuazione di bande regolari antigene di membrana deglicosilata a circa 80 90 kD in alcuni campioni 1 Strisce ipersviluppate 2 Precipitazione di complessi immuni in un campione non recente 3 Contaminazione batterica o fungina di una striscia a causa di una conservazione impropria 4 Strisce danneggiate fisicamente rotte o graffiate 5 Strisce non accuratamente lavate tra una fase e l altra dell analisi causato dai reagenti 1 Reagenti non 2 Diluizione errata del coniugato di esposizione a temperature impropr
14. ante una serie di reazioni che utilizzano immunoglobuline di capra anti IgG umane coniugate con fosfatasi alcalina e substrato BCIP NBT Grazie al suo elevato grado di sensibilit questo metodo consente la determinazione di quantit minime di anticorpi specifici anti HIV presenti nel siero o nel plasma umani COMPONENTI DEL KIT Descrizione dei componenti Quantit fornita ANTIGEN STRIPS STRISCE DI Disponibili NITROCELLULOSA in confezioni Contenenti lisato virale HIV 1 da 180 36 peptide di superficie HIV 2 strisce specifico e una banda per il controllo dell aggiunta del siero Conservare all asciutto e al riparo dalla luce 3 SOLUZIONE DI LAVORO DEL CONIUGATO Nota Preparare la soluzione in un recipiente o contenitore graduato di polipropilene a La SOLUZIONE DI LAVORO DEL CONIUGATO deve essere preparata ogni volta prima dell uso b Preparare la SOLUZIONE DI LAVORO DEL CONIUGATO diluendo il CONIUGATO 1 1000 nel TAMPONE DI BLOTTING ad esempio 5 pl di CONIUGATO in 5 ml di TAMPONE DI BLOTTING 4 SOLUZIONE SUBSTRATO pronta per l uso a Dispensare il volume richiesto direttamente dal flacone Utilizzare una pipetta pulita Dopo l uso chiudere accuratamente PROCEDURA RAPIDA DEL TEST Nota a Gli utenti possono usare l analisi veloce o di notte per fare funzionare le prove Le fasce del HIV sono diventate e pi fasce possono comparire con l analisi di notte ma le prestazioni g
15. azide come conservante suss scie N5T SUBSTRATO A Soluzione di 5 bromo 4 cloro 3 indolil fosfato BCIP e nitroblu di tetrazolio NBT POLVERE PER BLOT Latte scremato in polvere Vaschette per incubazione a 9 settori Manuale d istruzioni Pinzette 1 provetta 80 ul 1 provetta 80 ul 1 provetta 80 ul 1 flacone 20 ml 1 flacone 70 m 1 provetta 120 pl 1 flacone 100 ml 10 confezioni 1 g ciascuna 2 o 4 vassoi 1 copia 1 paio Nota Il volume di reagenti fornito sufficiente per 4 sedute 10 11 12 13 14 15 16 Aggiungere 2 ml di SOLUZIONE DI BLOTTING a ciascun pozzetto Aggiungere 20 pil di siero del paziente o di controllo a seconda del pozzetto Evitare rigorosamente di aggiungere i campioni direttamente sulle strisce Coprire la vaschetta con il relativo coperchio e incubare per 1 ora a temperatura ambiente 25 3 C sull agitatore oscillante Scoprire con cautela la vaschetta per evitare la fuoriuscita del materiale o il rimescolamento dei campioni Inclinare la vaschetta per aspirare la miscela dai pozzetti Tra un campione e l altro cambiare il beccuccio dell aspiratore per evitare una contaminazione incrociata Lavare ogni striscia per 3 volte con 2 ml di TAMPONE DI LAVAGGIO DILUITO lasciandolola a bagno per 5_minuti sull agitatore oscillante tra ogni lavaggio Aggiungere 2 ml di SOLUZIONE DI CONIUGATO a ogni pozzetto Co
16. che le NAT possono essere utili per determinare lo stato infettivo delle persone con un Western Blot iniziale INDETERMINATO se effettuate in consultazione con specialisti clinici e laboratoristici LIMITI DELLA PROCEDURA La determinazione degli anticorpi anti HIV 1 non costituisce diagnosi di sindrome da immunodeficienza acquisita AIDS Un TEST NEGATIVO non garantisce che l agente infettivo dell AIDS non sia presente Sebbene un test POSITIVO per gli anticorpi anti HIV 1 indichi un infezione causata dal virus una diagnosi di AIDS pu essere eseguita solo clinicamente se un paziente corrisponde alla definizione di AIDS stabilita dal Cen er for Disease Control USA dall Organizzazione Mondiale della Sanit o da altre autorit competenti E noto che i pazienti nei quali la sieroconversione si verificata recentemente possono presentare dei profili incompleti ma gli stessi svilupperanno un aumento di reattivit sia nel numero che nell intensit delle bande nell arco di 2 6 mesi La maggior parte delle strisce con risultati POSITIVI presenter altre bande virali specifiche Un test INDETERMINATO non pu essere considerato determinante per una diagnosi di infezione da HIV 1 Si consiglia di ripetere tutti i test INDETERMINATI utilizzando sia il primo prelievo che i successivi donatori di sangue che presentano un profilo INDETERMINATO devono essere riesaminati dopo un mese utilizzando un campione appena pre
17. diante procedure di elettroforesi ed elettrotransblot e combinati col peptide sintetico HIV 2 specifico sulla stessa striscia consentono una maggiore delineazione delle risposte anticorpali a proteine virali specifiche Ciascuna striscia comprende anche un controllo interno aggiuntivo del campione atto a minimizzare il rischio di false negativit dovute ad errori operativi nonch a garantire l aggiunta di campioni RACCOLTA TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI possibile utilizzare campioni di siero o di plasma raccolti in EDTA eparina o citrato di sodio Prima della conservazione accertarsi che i coaguli o le cellule ematiche siano state separate prima della centrifugazione I campioni devono essere conservati a 2 8 C se il test deve essere eseguito entro 7 giorni dalla raccolta oppure congelati a 20 C o temperature inferiori se il test previsto per una data successiva Utilizzare preferibilmente campioni trasparenti e non emolizzati campioni lipemici itterici o contaminati particelle devono essere filtrati 0 45 um o centrifugati prima dell analisi I campioni dei pazienti possono essere inattivati tuttavia ci non indispensabile per ottenere risultati ottimali Per l inattivazione procedere nel modo seguente 1 Allentare i cappucci dei contenitori dei campioni 2 Riscaldare i campioni a 56 C per 30 minuti in un incubatrice ad acqua 3 Lasciare raffreddare i campioni prima di serra
18. enerali delle due analisi sono la stessa b Aspirare tutte le sostanze chimiche e i reagenti residui in un contenitore con ipoclorito di sodio c Ogni incubazione deve essere effettuata sull agitatore oscillante Attenzione Alcuni campioni provocano la formazione di macchie scure sulla striscia quando vengono aggiunti Per evitare questo inconveniente procedere come segue i Aggiungere il campione soltanto dopo aver aggiunto il TAMPONE DI BLOTTING ii Inclinare leggermente il vassoio sollevandolo dall estremit superiore o inferiore Il tampone di blotting dovr fluire verso l estremit inferiore del vassoio Aggiungere il campione nel punto di raccolta del tampone di blotting Una volta aggiunti tutti i campioni riportare il vassoio in posizione orizzontale Accertarsi che le strisce rimangano costantemente umide durante l operazione iii In alternativa se non si desidera inclinare il vassoio i campioni possono essere aggiunti sull estremit superiore o inferiore del pozzetto In questo modo anche in caso di comparsa di macchie scure la lettura dei risultati della strisce non viene influenzata Procedura 1 Aggiungere 2 ml di SOLUZIONE DI 2ml LAVAGGIO DILUITA a ciascun pozzetto 2 Prendere con cautela il numero di STRISCE occorrente dalla confezione usando le pinzette e sistemarle con il lato numerato rivolto verso l alto una per pozzetto Utilizzare strisce per i controlli reattivi forti reattivi debol
19. erminato non esclude la possibilit di infezione con 14 ci sti a service inter agency recommendations for screening VERE altri ceppi di HIV 2 Hiva siorop sitiyo 197 do 181 donated blood and plasma for antibody to the virus causing N fax a 4968 94 59 1021 Donatori sani _ 208 0 208 Acquired Immune Deficiency Syndrome United States E mail info mt procons com I campioni riscontrati indicativi per infezioni da HIV 2 devono HTLV 1 sieropositivo 5 0 5 Morbidity and Mortality Weekly Report 34 1 1 5 essere ulteriormente riesaminati con un kit Western Blot per CMV 5 0 5 6 Proposed WHO criteria for interpreting results from EBV IgM 5 0 5 Western blot assays for HIV 1 HIV 2 and HTLV I HTLV TET V zoster IgG 5 0 5 Il 1990 WHO Weekly Epidemiological Record No 37 Sedi regionali CARATTERISTICHE SPECIFICHE DI ESECUZIONE Morbillo 6 0 6 p282 283 REATO a Rosolia 5 0 5 7 F Clavel D Guetard F Brun Vezinet etal 1986 Isolation I risultati del test HIV BLOT 2 2 di MPD per la determinazione Parotite 4 0 4 of a new human retrovirus from West African patients with Pare dimo zion BP soog degli anticorpi anti HIV 1 e HIV 2 sono stati oggetto di numerosi AIDS Science 233 343 346 67402 ILLKIRCH CEDEX studi clinici Adenovirus 5 0 5 i a France HSV 5 0 5 8 F Clavel 1987 HIV 2 the West African AIDS virus AIDS N tel 33 388 67 4607 Tabella 1 Studio sulla sensibilit basato sul livello di reattivit Dengue 5 0 5 Toi S9HA60 N fax 33 3
20. gp41 Gli antigeni di rivestimento gp41 gp120 gp160 appaiono come bande diffuse in quanto fenomeno tipico delle glicoproteine La banda di controllo del siero e la banda specifica HIV 2 devono risultare visibili come indicato dalla Figura 1a 3 CONTROLLO REATTIVO DEBOLE Il controllo reattivo debole indica il livello di sensibilit del kit Devono comparire delle bande deboli alla p24 e o gp 41 e gp 120 160 Potrebbero essere presenti o meno delle deboli bande aggiuntive Deve essere visibile la banda per il controllo del siero Figura 1b 12 La soluzione di lavoro del coniugato deve essere preparata utilizzando un recipiente o un contenitore graduato in polipropilene 13 Evitare di esporre i reagenti o di eseguire i test in un ambiente contenente un grado elevato di vapori di disinfettanti chimici es vapori di ipoclorito durante le fasi di conservazione e incubazione Il contatto inibisce la reazione cromatica Non esporre i reagenti ad eccessiva luminosit 14 L analisi deve essere effettuata preferibilmente a temperatura ambiente 25 3 C 15 Sistemare le strisce con il lato numerato rivolto verso l alto 16 Per il dosaggio Western Blot necessario utilizzare un agitatore a piattaforma oscillante anzich un agitatore rotante In caso contrario le prestazioni del kit potrebbero essere pregiudicate Si raccomanda di azionare l agitatore ad una velocit di 12 16 cicli al minuto con un angolo di inclinazione di
21. i e non reattivi 3 Incubare le strisce da 1 a 2 minuti a 2 minuti temperatura ambiente 25 3 C su una piattaforma oscillante alla velocit di 12 16 cicli al minuto Eliminare la soluzione tampone mediante aspirazione Nota Non lasci che le strisce asciughino il guasto pu provocare i contrassegni acquosi sulle strisce sviluppate per alcuni esemplare Eonar CONTROL gt CONTROLLO NON REATTIVO Siero umano normale inattivato non reattivo per antigene di superficie dell epatite B HBsAg anticorpi HIV 1 2 e anti HCV Contiene sodio azide e thimerosal come conservanti CONTROLLO REATTIVIT FORTE Siero umano inattivato con un alto titolo di anticorpi HIV 1 e HIV 2 e non reattivo per HBsAg e anti HCV Contiene sodio azide e thimerosal come conservanti contro weaK CONTROLLO A REATTIVO DEBOLE Siero umano inattivato contenente anticorpi a basso titolo SOLO anti HIV 1 e non reattivo all HBsAg e agli anticorpi anti HIV 2 e HCV Contiene sodio azide e thimerosal come conservanti BUF stock 10x SOLUZIONE TAMPONE CONCENTRATA 10x Tampone tris contenente siero di capra inattivato tramite calore Contiene thimerosal come conservante BUF wasn 2 TAMPONE DI LAVAGGIO CONJUGATE CONCENTRATO 20x Soluzione tris con Tween 20 Contiene thimerosal come conservante CONIUGATO IgG anti umane di capra coniugate con fosfatasi alcalina Contiene sodio
22. ide in abbondante acqua corrente onde evitare l accumulo di metallo azide nell impianto idraulico Qui di seguito sono elencate le frasi relative ai rischi R R22 Nocivo per ingestione Il substrato contiene 5 bromo 4 cloro 3 indolil fosfato e nitroblu di tetrazolio classificato secondo le direttive della Comunit Economica Europea CEE come nocivo Xn Qui di seguito sono elencate le frasi relative ai rischi R R20 21 22 Nocivo per inalazione contatto con la pelle ed ingestione 1 Evitare la contaminazione microbica dei reagenti durante l apertura delle provette o dei flaconi originali e durante il prelievo dei materiali 2 Non pipettare con la bocca 3 Maneggiare i campioni di analisi le strisce di nitrocellulosa i controlli reattivi reattivi deboli e non reattivi come agenti potenzialmente infettivi 4 Indossare indumenti da laboratorio e guanti monouso durante l esecuzione delle analisi guanti devono essere gettati negli appositi contenitori a rischio biologico Lavarsi accuratamente le mani al termine dell operazione 5 Si raccomanda di eseguire il test in uno spazio apposito per procedure con rischio di contaminazione biologica 6 Evitare il contatto dei materiali con cibi e bevande 7 In caso di contatto con gli occhi sciacquare immediatamente con abbondante acqua e richiedere assistenza medica 8 In caso in ingestione o di contatto dei materiali contaminati con ferite aperte o altre lacerazioni cutanee
23. ie Controllo positivo debole Il problema probabilmente adeguatamente preparati 3 Reagenti instabili a causa 4 Coniugato contaminato da IgG umane 5 pH del substrato inadeguato dovuto all esposizione a forti raggi UV o agenti riducenti 6 Vassoi reagenti o acqua contenenti una concentrazione elevata di fosfati interrompere la reazione al pi presto Controllo positivo OK 2 Lavaggi incompleto 1 Siero non aggiunto 2 Strisce capovolte durante Il problema probabilmente l analisi causato dal campione 1 Diluizione del campione errata 2 Campione contaminato dal coniugato 3 Campioni gravemente immunocomplessati 4 lgG del campione alterate o denaturate a causa di ripetuti cicli di congelamento e scongelamento o conservazione impropria 5 Uso di una piattaforma rotante al posto di una piattaforma oscillante 6 1l campione potrebbe risultare un falso positivo con il test ELISA Assenza della banda di controllo del siero 3 Coniugato non aggiunto 4 Substrato non aggiunto Nessuna formazione di bande non specifiche e o strato scuro sulle strisce Possibile contaminazione incrociata tra i pozzetti del vassoio e il controllo 1 Diluizione errata del campione o del coniugato 2 Incubazione del campione reagente troppo lunga 3 Lavaggio incompleto durante l analisi 4 Temperatura di incubazione superiore a 30 C 5 Campione reattivo con pro
24. iedeva non pi di 8 giorni Inoltre nel caso di una reale infezione il periodo in cui il risultato del Western Blot era INDETERMINATO era sempre accompagnato da RNA dell HIV 1 rilevabile Invece negli studi di follow up di individui che erano risultati positivi allo screening e che presentavano un Western Blot INDETERMINATO non si osservava nessuna sieroconversione nel caso in cui i risultati ottenuti tramite metodiche basate sulla PCR erano negativi Sethoe et al 1995 E quindi ragionevole ritenere che i soggetti che presentano un Western Blot INDETERMINATO ma che sono negativi a un test sull RNA abbiano scarse probabilit di essere stati infettati dall HIV specialmente se gli individui testati non presentano alcun fattore di rischio associato all esposizione In particolare i soggetti che presentano un Western Blot INDETERMINATO derivato da un algoritmo diagnostico che utilizza ELISA di quarta generazione come test di screening primario dovrebbero essere ulteriormente analizzati per la presenza di RNA virale utilizzando un test di biologia molecolare come la RT PCR effettuata con coppie di primer che includano HIV 1 2 O Se necessario effettuare un follow up con un qualsiasi test supplementare un mese dopo La progettazione unica degli ELISA di quarta generazione permette una rilevazione simultanea dell antigene e dell anticorpo Di conseguenza i campioni identificati come positivi da un ELISA di quarta generazione dovrebbero con
25. lcuni dei diversi antigeni elencati in questa tabella derivano dallo stesso precursore proteico e potrebbero avere epitopi sovrapposti Ci va tenuto in considerazione nell interpretazione del profilo ad esempio 1 improbabile individuare gp41 in assenza di gp160 in quanto gp160 la forma polimerica di gp41 e la concentrazione di gp160 maggiore di quella di gp41 sull HIV BLOT 2 2 di MPD Il gp41 appare come banda diffusa Un eventuale banda evidente non marcata nella regione gp41 non dovr essere interpretata come banda gp41 Numerosi campioni non infettati da HIV e campioni sani sono risultati reattivi a questo antigene non HIV la cui origine va ricercata verosimilmente nella linea cellulare umana utilizzata per la crescita del virus HIV 2 La banda p55 viene generalmente rilevata in presenza di una forte reattivit a p24 e o p17 Le bande osservate come p42 e p39 sono entrambe frammenti di GAG e non vanno interpretate come gp41 ENV 3 Le bande POL p66 p51 e p31 vengono in genere rilevate contemporaneamente Tuttavia la sensibilit di p66 e p31 maggiore di quella di p51 4 La reattivit crociata ad HIV 2 variabile ma solitamente si manifesta con gli antigeni GAG e o POL Tuttavia in alcuni casi pu verificarsi reattivit crociata con la banda gp160 ma raramente con gp41 5 Esiste anche una banda ad alto peso molecolare attorno a 160KD che si presume essere un precursore proteico GAG POL Ci si not
26. levato CDC degli USA 2001 Inoltre gli anticorpi anti p24 e p31 diminuiscono durante il decorso dell AIDS producendo un mutamento nell interpretazione del test da POSITIVO a INDETERMINATO In tali situazioni l interpretazione dei risultati deve essere basata su una successiva analisi e su valutazioni cliniche Tabella 2 Studio sulla specificit basato sul livello di reattivit degli antigeni virali HIV 1 su campioni di sangue proveniente da donatori sani e su sieri con altre infezioni virali TIPO DI NUMERO POSITIVO REATTIVIT ALL HIV 1 CAMPIONS INDETERMINATO NEGATIVO Donatori sani 208 0 11 197 HTLV 1 5 0 0 5 CMV 5 0 1 4 EBV IgM 5 0 1 4 V zoster IgG 5 0 1 4 Morbillo 6 0 2 4 Rosolia 5 0 1 4 Parotite 4 0 1 3 Adenovirus 5 0 2 3 HSV 5 0 0 5 Dengue 5 0 1 4 Totale 258 0 21 237 Tutti apparsi soltanto come banda p24 o p17 Tabella 3 Studio sulla sensibilit della banda del peptide HIV 2 con campioni HIV 2 sieropositivi Campioni testati 178 HIV 2 Western Blot Reattivit del Peptide HIV 2 Profilo sierologico Positivo Negativo GAG POL e 2 ENV 160 0 GAG POL e 1 ENV 18 0 sieri sono stati definiti positivi in base ai risultati ottenuti con il New LAV Blot 2 della Pasteur dati sono stati forniti dal Dott Oliviero E Varnier e dalla Dr ssa Flavia Lillo del Laboratorio per l
27. li di pipette monouso per l aspirazione dei materiali dai flaconi 5 1 controlli del kit devono essere analizzati contemporaneamente ai campioni dei pazienti per ogni ciclo di analisi 6 Per evitare una contaminazione incrociata cambiare il puntale della pipetta tra un campione e l altro 7 Per ottenere migliori risultati dispensare tutti i reagenti a freddo e riportarli ad una temperatura di 2 C 8 C non appena possibile 8 Tutto il materiale di vetro previsto per l utilizzo con i reagenti dovr essere lavato con acido cloridrico 2M e sciacquato abbondantemente con acqua distillata o deionizzata prima dell uso 9 Utilizzare unicamente acqua ionizzata distillata o comunque di qualit idonea per la diluizione dei reagenti 10 Tutti i reagenti dovranno essere miscelati accuratamente prima dell uso 11 La soluzione di lavoro del coniugato il tampone di lavaggio diluito e il tampone di blotting devono essere preparati ogni volta prima dell uso SOMMARIO PROTOCOLLI DI ANALISI Reagenti Quantit Temp ambiente Temp ambiente Proc rapida Proc overnight Striscia nitrocellulosa 1 Tampone lavaggio 2 ml 1 2 min 1 2 min Tampone di blotting 2 ml Campione 20 pl 60 min Tutta la notte 16 20 ore Tampone lavaggio 3x2ml 3x5 min 3x5 min Coniugato 2ml 60 min 30 min Tampone lavaggio 3x2ml 3x5 min 3x5 min Substrato 2ml 15 min 15 min pronto per l uso Acqua
28. n of combined detection assays of p24 antigen and anti human immunodeficiency virus HIV antibodies in diagnosis of primary HIV infection by routine testing J Clin Microbiol 38 2459 2461 14 Sethoe S Y A E Ling E H Sng E H Monteiro R K Chan 1995 PCR as a confirmatory test for human immunodeficiency virus type 1 infection in individuals with indeterminate western blot immunoblot profiles J Clin Microbiol 33 3034 3036 15 Constantine N T and H Zink 2005 HIV testing technologies after two decades of evolution Indian J Med Res 121 519 538 16 World Health Organization 2004 Guidelines for HIV Diagnosis and monitoring of antiretroviral therapy Regional Office for South East Asia New Delhi India MP Biomedicals Asia Pacific Pte Ltd 85 Science Park Drive 04 01 The Cavendish Singapore Science Park Singapore 118259 N tel 65 6775 0008 N fax 65 6775 4536 E mail enquiry_ap mpbio com Medical Technology Promedt Ec REP Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 Tracce acquose sulle strisce sviluppate x i j i 3 D 66386 St Ingbert Data la sua natura altamente specifica la NON REATTIVIT TIPO DI CAMPIONE NUMERO _REATTIVIT DEL PEPTIDE HIV 2 patients with AIDS Science 224 506 608 Germania di campioni con peptide di superficie HIV 2 specifico su un test POSITIVO NEGATIVO 5 Centre for Disease Control 1985 Provisional public health N tel 49 68 94 58 1020 virale indet
29. o Studio dei Retrovirus Umani Universit di Genova Tabella 4 Studi sulla specificit della banda del peptide HIV 2 con sieri HIV 1 sieropositivi campioni di donatori sani e sieri con altre infezioni virali ESCLUSIONE DI GARANZIA E GARANZIA LIMITATA ESPRESSA Il produttore non fornisce altra garanzia esplicita per il kit tranne l uso come dosaggio diagnostico in vitro nel quadro delle specifiche e delle limitazioni indicate nel Manuale di istruzioni del prodotto sempre se viene usato seguendo le istruzioni ivi fornite Il produttore non fornisce alcuna garanzia espressa o implicita compresa qualsiasi garanzia espressa o implicita di commerciabilit adeguatezza all uso o utilit implicita ad altri scopi Il produttore riconosce solo la sostituzione del prodotto o il rimborso del prezzo di acquisto del prodotto stesso Il produttore non potr essere ritenuto responsabile nei confronti dell acquirente o di terzi per danni lesioni o danni economici di qualsiasi entit comunque causati dal prodotto nell uso o nell applicazione sopra indicati PROBLEMI TECNICI RECLAMI In caso di problemi tecnici o di reclami attenersi alla seguente procedura 1 Annotare il numero di lotto del kit la data di scadenza e i numero di lotto della striscia 2 Conservare i kit e risultati ottenuti 3 Contattare il pi vicino centro MP Biomedicals o
30. o rivolto verso l alto una per pozzetto Disporre anche le strisce per i controlli reattivi forti reattivi deboli e non reattivi 2 ml AVVERTENZE E PRECAUZIONI 1 Solo per uso diagnostico in vitro 2 Solo per uso professionale 3 Per informazioni sui componenti potenzialmente pericolosi leggere le etichette apposte sui prodotti NORME DI SICUREZZA ATTENZIONE Questo kit contiene sostanze di origine umana Nessun metodo di prova in grado di garantire con assoluta certezza che i prodotti derivati dal sangue umano non trasmettano infezioni MANEGGIARE TUTTI CAMPIONI D ANALISI NONCH CONTROLLI REATTIVI FORTI REATTIVI DEBOLI E NON REATTIVI COME AGENTI POTENZIALMENTE INFETTIVI Si consiglia di maneggiare i componenti e i campioni di analisi nel rispetto delle pratiche operative di laboratorio Lo smaltimento del materiale dovr essere effettuato in conformit alle procedure di sicurezza stabilite Il controllo reattivo forte il controllo reattivo debole e il controllo non reattivo contengono thimerosal e sodio azide la soluzione tampone concentrata e il tampone di lavaggio contengono thimerosal mentre il coniugato contiene sodio azide Il sodio azide pu reagire con il rame o il piombo utilizzati in alcuni impianti idraulici con la conseguente formazione di sali esplosivi Sebbene le quantit utilizzate in questo kit siano limitate si raccomanda comunque di smaltire sempre i materiali contenenti az
31. prire la vaschetta e incubare per 1 ora a temperatura ambiente 25 3 C sull agitatore oscillante Aspirare il CONIUGATO dai pozzetti Eseguire un lavaggio come indicato al punto 8 Aggiungere 2 ml di SOLUZIONE DI SUBSTRATO a ogni pozzetto Coprire la vaschetta e incubare per 15 minuti sull agitatore oscillante Nota La reazione pu essere interrotta prima di 15 minuti se tutte le fasce sono visibili Aspirare il SUBSTRATO e sciacquare almeno tre volte le strisce con acqua per reagenti per arrestare la reazione In caso di lavaggio insufficiente a questo punto pu apparire uno sfondo scuro Prendere delicatamente le strisce con le pinzette e appoggiarle su fazzoletti di carta Coprire con altri fazzoletti e asciugare In alternativa lasciare asciugare le strisce nei pozzetti del vassoio Sistemare le strisce su carta da lavoro carta bianca non assorbente Non applicare nastro adesivo sulle bande che si sono formate Osservare le bande vedere Interpretazione dei risultati e classificare i risultati Conservare le strisce al buio 2ml 20 pl 60 minuti 3x2 ml 2 ml 60 minuti 3x2 ml 2 ml 15 minuti 3x2 ml PROCEDURA ALTERNATIVA TEST OVERNIGHT Pro ie 2 cedimento Aggiungere 2 ml di SOLUZIONE DI LAVAGGIO DILUITA a ciascun pozzetto Prendere con cautela il numero di STRISCE occorrenti dalla confezione usando le pinzette e sistemarle con il lato numerat
32. re nuovamente i cappucci 4 Fino al momento dell analisi i campioni possono essere conservati congelati Si raccomanda di non sottoporre i campioni dei pazienti a ripetuti cicli di congelamento e scongelamento prima del test MATERIALI OCCORRENTI MA NON PRESENTI NEL KIT Acqua deionizzata o distillata Guanti monouso Agitatore oscillante con una gamma di velocit di oscillazioni da 12 a 16 al minuto e in grado di inclinarsi ad un angolo compreso fra 5 e 10 per un lavaggio omogeneo delle membrane Pipette e puntali in quantit adeguate Aspiratore con filtro a ipoclorito di sodio Incubatore ad acqua a 56 C opzionale e ipoclorito di sodio per la decontaminazione PREPARAZIONE DEI REAGENTI 1 TAMPONE DI LAVAGGIO DILUITO a II TAMPONE DI LAVAGGIO DILUITO deve essere preparato fresco prima dell uso b Diluire un volume di TAMPONE DI LAVAGGIO CONCENTRATO 20X in 19 volumi di acqua per reagenti Mescolare accuratamente 2 TAMPONE DI BLOTTING a Il TAMPONE DI BLOTTING deve essere preparato fresco prima dell uso b Diluire 1 volume di SOLUZIONE TAMPONE CONCENTRATA 10X in 9 volumi di acqua per reagenti Mescolare accuratamente c Aggiungere 1 g di POLVERE PER BLOT per 20 ml di SOLUZIONE TAMPONE CONCENTRATA preparata come indicato sopra al punto 2 b Agitare fino a sciogliere completamente la polvere d Agitare nuovamente prima di dispensare DESCRIZIONE DEI SIMBO
33. teine non virali 1 Le strisce sono rotte 2 Presenza di bolle d aria che provocano la comparsa di macchie bianche nelle zone reattive sufficientemente grandi da impedire qualsiasi rilevamento 3 Presenza di macchie scure da proliferazione fungina alla prima apertura delle confezioni delle strisce Tuttavia se la formazione delle macchie scure avviene successivamente alla prima apertura della confezione il problema dovuto a una conservazione impropria delle strisce 7 Uso di una piattaforma rotante al posto di una piattaforma oscillante 11 1 Strisce lasciate ad asciugare dopo la fase di preimmersione prima di aggiungere il tampone di blotting 1 Non si tratta di gp 41 poich gp 41 una banda diffusa 2 Non interpretare come gp 41 3 Potrebbe trattarsi di una proteina a linee cellulari p42
34. tenere l anticorpo o l antigene oppure entrambi Bench oltre il 95 dei casi identificati come veri positivi da un ELISA di quarta generazione siano correlati alla presenza di anti HIV e verificabili confermati tramite Western Blot Ly et al 2000 l effettuazione di un test supplementare che utilizzi l RT PCR sembra inevitabile per la piccola porzione di reattivit correlata all antigene p24 Anche in questo caso i soggetti senza alcun rischio di esposizione presentano scarse probabilit di essere infettati dall HIV se sono stati identificati come positivi da un ELISA di quarta generazione accompagnato da un Western Blot INDETERMINATO in assenza di un risultato POSITIVO ottenuto utilizzando un test sull RNA effettuato con coppie di primer che includano HIV 1 2 0 FIGURA 1 Tuttavia l applicazione a scopo diagnostico delle analisi degli acidi nucleici NAT per il DNA e I RNA_dell HIV stata approvata dalle autorit competenti CDC degli USA 2001 Constantine amp Zink 2005 soltanto di recente Ad oggi soltanto un test qualitativo per l RNA stato approvato dalla FDA degli USA per la diagnosi di infezione primaria e acuta da parte dell HIV 1 Quindi gli algoritmi diagnostici raccomandati dal CDC degli USA 2001 e dell OMS 2004 devono essere ancora aggiornati e i NAT devono essere ancora inclusi come metodi per risolvere i casi di risultato INDETERMINATO al Western Blot Ciononostante la CDC degli USA 2001 riconosceva
35. vocare la formazione di precipitato Questo tuttavia non avr alcuna influenza sulle prestazioni del kit Attenzione Evitare l esposizione non strettamente necessaria del substrato alla luce INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI NOTA Per evitare ogni rischio di errata interpretazione le strisce devono essere completamente asciutte La presenza o assenza di anticorpi anti HIV 1 in un campione viene determinata confrontando ogni striscia di nitrocellulosa con le strisce utilizzate per i controlli NEGATIVO REATTIVO FORTE E REATTIVO DEBOLE La figura 1a viene utilizzata per individuare le bande sviluppate sulla striscia con il controllo REATTIVO FORTE N B L estremit numerata delle strisce deve essere disposta in basso come mostrato nella figura es le bande gp120 g9p160 sono le pi lontane dall estremit numerata PESO GENE ANTIGENE DESCRIZIONE MOLECOLARE gp 160 ENV Forma polimerica Ampia glicoproteina di gp41 diffusa gp 120 ENV Membrana esterna Glicoproteina diffusa p66 POL Transcriptasi Banda non marcata inversa p55 GAG Precursore proteico Banda non marcata p51 POL Transcriptasi Banda non marcata inversa appena sotto p55 p39 GAG Frammento di p55 Banda non marcata gp41 ENV Transmembrana Glicoproteina diffusa p31 POL Endonucleasi Sdoppiata p24 GAG Proteina del nucleo Banda ampia p17 GAG Proteina del nucleo Banda ampia A
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