HIV BLOT 2.2 - MP Biomedicals
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1. elettroforesi ed elettrotransblot e combinati col peptide sintetico HIV 2 specifico sulla stessa striscia consentono una maggiore delineazione delle risposte anticorpali a proteine virali specifiche Ciascuna striscia comprende anche un controllo interno aggiuntivo del campione atto a minimizzare il rischio di false negativit dovute ad errori operativi nonch a garantire l aggiunta di campioni DESCRIZIONE DEI SIMBOLI UTILIZZATI Sui prodotti MP Diagnostics e relative confezioni si possono trovare i simboli grafici riportati di seguito Sono i simboli generalmente utilizzati per l etichettatura dei dispositivi medici e dei relativi imballi Per informazioni pi dettagliate consultare la norma britannica ed europea BS EN 980 2003 Utilizzare entro Dispositivo medico Sinonimo Data di scadenza diagnostico in vitro Codice partita Numero di Sinonimi catalogo LOT Numero di lotto Numero di partita Attenzione Limitazi di Vedere le Istruzioni imitazione di per l uso temperatura Rappresentante Produttore autorizzato per la Comunit Europea Contiene il necessario per l esecuzione di lt n gt analisi Vedere le Istruzioni per l uso BE BE Non riutilizzare d E gt PRINCIPI CHIMICI E BIOLOGICI DEL METODO Alle strisce di nitrocellulosa vengono legate singole proteine antigeniche derivate da HIV 1 inattivato e parzialmente purificato mediante blotting elettroforetico nonch un peptide sintet2. infettati da HIV e campioni sani sono risultati reattivi a questo antigene non HIV la cui origine va ricercata verosimilmente nella linea cellulare umana utilizzata per la crescita del virus HIV 2 La banda p55 viene generalmente rilevata in presenza di una forte reattivit a p24 e o p17 Le bande osservate come p42 e p39 sono entrambe frammenti di GAG e non vanno interpretate come gp41 ENV 3 Le bande POL p66 p51 e p31 vengono in genere rilevate contemporaneamente Tuttavia la sensibilit di p66 e p 31 maggiore di quella di p51 4 La reattivit crociata ad HIV 2 variabile ma solitamente si manifesta con gli antigeni GAG e o POL Tuttavia in alcuni casi pu verificarsi reattivit crociata con la banda gp160 ma raramente con gp41 5 Esiste anche una banda ad alto peso molecolare attorno a 160KD che si presume essere un precursore proteico GAG POL Cio si nota con alcuni sieri a titolo elevato HIV 2 o indeterminati GAG Reactive Only ma si tratta di una banda evidente non marcata diversa dalla banda diffusa di gp160 ENV Il procedimento di interpretazione comporta quanto segue 1 Accertare che la banda di controllo del siero sia visibile Se la banda di controllo negativa i risultatinon devono essere considerati validi in quanto ci indice di un errore tecnico quale ad esempio la mancata aggiunta del campione del coniugato o del substrato 2 Individuare il peso molecolare di ciascuna banda della s
3. ne potrebbero derivare risultati erronei nonch la prematura riduzione della durata di conservazione del prodotto Utilizzare tecniche asettiche incluse pipette o puntali di pipette monouso per l aspirazione dei materiali dai flaconi I controlli del kit devono essere analizzati contemporaneamente ai campioni dei pazienti per ogni ciclo di analisi Per evitare una contaminazione incrociata cambiare il puntale della pipetta tra un campione e l altro Per ottenere migliori risultati dispensare tutti i reagenti a freddo e riportarli ad una temperatura di 2 C 8 C non appena possibile Tutto il materiale di vetro previsto per l utilizzo con i reagenti dovr essere lavato con acido cloridrico 2M e sciacquato abbondantemente con acqua distillata o deionizzata prima dell uso Utilizzare unicamente acqua ionizzata distillata o comunque di qualit idonea per la diluizione dei reagenti Tutti i reagenti dovranno essere miscelati accuratamente prima dell uso La soluzione di lavoro del coniugato il tampone di lavaggio diluito e il tampone di blotting devono essere preparati ogni volta prima dell uso 12 13 14 15 16 17 18 19 20 La soluzione di lavoro del coniugato deve essere preparata utilizzando un recipiente o un contenitore graduato in polipropilene Evitare di esporre i reagenti o di eseguire i test in un ambiente contenente un grado elevato di vapori di disinfettanti chimici es vapori di ip
4. 1 e HIV 2 e non reattivo per HBsAg e anti HCV Contiene sodio azide e thimerosal come conservanti CONTROLLO REATTIVO DEBOLE Siero umano inattivato contenente anticorpi a basso titolo SOLO anti HIV 1 e non reattivo all HBsAg e agli anticorpi anti HIV 2 e HCV Contiene sodio azide e thimerosal come conservanti SOLUZIONE TAMPONE CONCENTRATA 10x Tampone tris contenente siero di capra inattivato tramite calore Contiene thimerosal come conservante TAMPONE DI LAVAGGIO CONCENTRATO 20x Soluzione tris con Tween 20 Contiene thimerosal come conservante CONIUGATO IgG anti umane di capra coniugate con fosfatasi alcalina Contiene sodio azide come conservante SUBSTRATO Soluzione di 5 bromo 4 cloro 3 indolil fosfato BCIP e nitroblu di tetrazolio NBT POLVERE PER BLOT Latte scremato in polvere Vaschette per incubazione a 9 settori Manuale d istruzioni Pinzette 1 provetta 80 ul 1 provetta 80 ul 1 provetta 80 ul 1 flacone 20 ml 1 flacone 70 ml 1 provetta 120 ul 1 flacone 100 ml 10 confezioni 1 g ciascuna 2 0 4 vassoi 1 copia 1 paio Nota Il volume di reagenti fornito sufficiente per 4 sedute AVVERTENZE E PRECAUZIONI 1 Solo per uso diagnostico in vitro 2 Solo per uso professionale 3 Perinformazioni sui componenti potenzialmente pericolosi leggere le etichette apposte sui prodotti NORME DI SICUREZZA ATTENZIONE Questo kit contiene
5. 24 Diagnostics HIV BLOT 2 2 DOSAGGIO WESTERN BLOT CE 0123 DATA DI REVISIONE 05 05 MAE 0011 ITA 0 18 kit per test 11030 018 36 kit per test 11030 036 NOME E USO PREVISTO Il kit HIV BLOT 2 2 di MP Diagnostics MPD un dosaggio qualitativo immunoenzimatico per il rilevamento n vitro degli anticorpi del virus di immunodeficienza umana tipo 1 HIV 1 e tipo 2 HIV 2 nel siero o nel plasma umano indicato come test integrativo pi specifico da condurre su campioni di siero o plasma umano rilevati ripetutamente reattivi mediante procedure di screening come i test immunoenzimatici ELISA Enzyme Linked Immounosorbent Assays Nota modifiche evidenziate INTRODUZIONE Sono attualmente disponibili numerosi test di screening per la determinazione degli anticorpi anti HIV 1 e HIV 2 agenti eziologici della Sindrome di Immunodeficienza Acquisita AIDS Tali test possono essere estremamente sensibili ma potenzialmente meno specifici dando origine a interpretazioni falsamente positive Sar quindi necessario effettuare ulteriori test ad elevata specificit per confermare la presenza di anticorpi anti HIV 1 e o HIV 2 Il kit HIV BLOT 2 2 prodotto dalla MP Diagnostics rappresenta un test supplementare pi specifico da effettuare su campioni di siero o plasma umani risultati ripetutamente reattivi al test ELISA Gli antigeni virali specifici anti HIV 1 posti separatamente sulle strisce mediante procedure di
6. IVO o INDETERMINATO PROFILO INTERPRETAZIONE Assenza di specifiche bande virali NEGATIVO Determinazione di anticorpi p17 NEGATIVO SOLTANTO nessun altra banda POSITIVO ALLHIV 1 Determinazione di 2 ENV gp160 9p41 e gp120 e GAG p17 p24 p55 o POL p31 p51 p66 Determinazione di 2 ENV POSITIVO ALLHIV 1 gp160 gp41 e gp120 e GAG con p17 p24 p55 o POL INDICAZIONE DI p31 p51 p66 e banda HIV 2 HIV 2 specifica visibile Presenza di una delle bande virali INDETERMINATO specifiche ma il profilo non ha i requisiti di POSITIVO Presenza di una delle bande virali INDETERMINATO specifiche ma il profilo non ha i con requisiti per essere POSITIVO INDICAZIONE DI Banda HIV 2 specifica visibile HIV 2 LIMITI DELLA PROCEDURA La determinazione degli anticorpi anti HIV 1 non costituisce diagnosi di sindrome da immunodeficienza acquisita AIDS Un TEST NEGATIVO non garantisce che l agente infettivo dell AIDS non sia presente Sebbene un test POSITIVO per gli anticorpi anti HIV 1 indichi un infezione causata dal virus una diagnosi di AIDS pu essere eseguita solo clinicamente se un paziente corrisponde alla definizione di AIDS stabilita dal Center for Disease Control USA dal Organizzazione Mondiale della Sanit o da altre autorit competenti noto che i pazienti nei quali la sieroconversione si verificata recentemente possono presentare dei profili incompleti ma gli stessi svilupperanno un aumen
7. TAMPONE CONCENTRATA 10X in 9 volumi di acqua per reagenti Mescolare accuratamente c Aggiungere 1 g di POLVERE PER BLOT per 20 ml di SOLUZIONE TAMPONE CONCENTRATA preparata come indicato sopra al punto 2 b Agitare fino a sciogliere completamente la polvere d Agitare nuovamente prima di dispensare 3 SOLUZIONE DI LAVORO DEL CONIUGATO Nota Preparare la soluzione in un recipiente o contenitore graduato di polipropilene a La SOLUZIONE DI LAVORO DEL CONIUGATO deve essere preparata ogni volta prima dell uso b Preparare la SOLUZIONE DI LAVORO DEL CONIUGATO diluendo il CONIUGATO 1 1000 nel TAMPONE DI BLOTTING ad esempio 5 ul di CONIUGATO in 5 ml di TAMPONE DI BLOTTING 4 SOLUZIONE SUBSTRATO pronta per l uso a Dispensare il volume richiesto direttamente dal flacone Utilizzare una pipetta pulita Dopo l uso chiudere accuratamente PROCEDURA RAPIDA DEL TEST Nota a Gli utenti possono usare l analisi veloce o di notte per fare funzionare le prove Le fasce del HIV sono diventate e pi fasce possono comparire con l analisi di notte ma le prestazioni generali delle due analisi sono la stessa b Aspirare tutte le sostanze chimiche e i reagenti residui in un contenitore con ipoclorito di sodio c Ogni incubazione deve essere effettuata sull agitatore oscillante Attenzione Alcuni campioni provocano la formazione di macchie scure sulla striscia quando vengono aggiunti Per evitare questo inc
8. Z mesedald uou nuabeaY rep oyesneo ew jqod OAILISOd ollonuo Uolduleo ul 06 08 e eueiquiow Ip u bnue uejobal uolznpoud ej BJUCINP 1olqom y ep EZU l H lUI y TsifeEUE l p 8 ase eun 811 uou 29111 215 e e ibbouuep 20S1 S eudolduu UOIZEAH SUO BUN ip esneo e ensus eun ip euibunj o eonopeq UOIZEUIUIB u02 uou 1 un ul IUNWILUI iss ldulo Ip uolzeldio lci cz uoldule eulbunj o e L neq UOIZEUIUIB U02 O U UUEA LL ISeisjenb O O1 U0D OLOSSEA l p m zzod 611 8100 0 pueq IP SUOIZENPIAIPU 1014 aJanjod el ldulo ul uolzniossiq Dumolq IP uodule ip ewud QUOISJOLUWISIC ip ase ej odop aiebniose pe ayelose 29 1 ep pueh 1 5 2 alyooew IP essedwoo ej OURDOAOId y enep lloq IP ezu s Id Z OUOS S HS T UOIZEUIUIE1UO liQISSO i Ud ogy VTH ld l s Jed ajesin opesedaud jou lnu luo 6 H ul old l UOD 0 819019U1 Opou ul
9. anda del peptide HIV 2 con sieri HIV 1 sieropositivi campioni di donatori sani e sieri con altre infezioni virali TIPO DI CAMPIONE NUMERO REATTIVITA DEL PEPTIDE HIV 2 POSITIVO NEGATIVO HIV 1 sieropositivo 197 162 181 Donatori sani 208 208 HTLV 1 sieropositivo 5 5 CMV 5 5 V zoster IgG 5 5 Rosolia 5 5 Adenovirus 5 5 Dengue 5 Totale 455 16 439 a Quando testati con l HIV 2 Western Blot 6 di questi campioni sono risultati positivi a ENV GAG o POL 9 sono risultati positivi solo a GAG e o POL mentre 1 campione risultato negativo Un totale di 15 pannelli di sieroconversione HIV 1 commerciali stato analizzato con HIV Blot 2 2 di MPD e i risultati hanno mostrato che HIV Blot 2 2 di MPD era in grado di rilevare Panticorpo per l HIV anticipatamente o nello stesso campione in tutti i pannelli ESCLUSIONE DI GARANZIA E GARANZIA LIMITATA ESPRESSA Il produttore non fornisce altra garanzia esplicita per il kit tranne l uso come dosaggio diagnostico in vitro nel quadro delle specifiche e delle limitazioni indicate nel Manuale di istruzioni del prodotto sempre se viene usato seguendo le istruzioni ivi fornite Il produttore non fornisce alcuna garanzia espressa o implicita compresa qualsiasi garanzia espressa o implicita di commerciabilit adeguatezza all uso o utilit implicita ad altri scopi Il produttore riconosce solo la sostituzione del prodotto o il rimborso del prezzo di acquis
10. aso di lavaggio insufficiente a questo punto pu apparire uno sfondo scuro Prendere delicatamente le strisce con le pinzette e appoggiarle su fazzoletti di carta Coprire con altri fazzoletti e asciugare In alternativa lasciare asciugare le strisce nei pozzetti del Vassoio Sistemare le strisce su carta da lavoro carta bianca non assorbente Non applicare nastro adesivo sulle bande che si sono formate Osservare le bande vedere Interpretazione dei risultati e classificare i risultati Conservare le strisce al buio 2 ml 20 ul 60 minuti 3x2mi 2 mi 60 minuti 3x2ml 2 mi 15 minuti 3x2mi PROCEDURA ALTERNATIVA TEST OVERNIGHT Procedimento 1 2 Aggiungere 2 ml di SOLUZIONE DI LAVAGGIO DILUITA a ciascun pozzetto Prendere con cautela il numero di STRISCE occorrenti dalla confezione usando le pinzette e sistemarle con il lato numerato rivolto verso l alto una per pozzetto Disporre anche le strisce per i controlli reattivi forti reattivi deboli e non reattivi 2 ml 3 10 11 12 13 14 15 16 Incubare le strisce da 1 a 2 minuti a temperatura ambiente 25 3 C su una piattaforma oscillante alla velocita di 12 16 oscillazioni al minuto Eliminare la soluzione tampone mediante aspirazione Nota Non lasci che le strisce asciughino il guasto pu provocare i contrassegni acquosi sulle strisce sviluppate per alcuni esemplare Aggiungere 2 ml d
11. ce 224 506 608 CDC 1985 Provisional public health service inter agency recommendations for screening donated blood and plasma for antibody to the virus causing Acquired Immune Deficiency Syndrome United States Morbidity and Mortality Weekly Report 34 1 1 5 WHO Collaborating Group on HIV 2 1990 WHO Weekly Epidem Rec 10 p74 75 F Clavel D Guetard F Brun Vezinet et al 1986 Isolation of a new human retrovirus from West African patients with AIDS Science 233 343 346 F Clavel 1987 HIV 2 the West African AIDS virus AIDS 1 135 140 R S Tedder A Hughes T Corrah et al 1988 Envelope cross reactivity in Western Blot for HIV 1 and HIV 2 may not indicate dual infection Lancet 11 927 930 10 Bottiger B A Karlsson F Andreasson et al 1990 Envelope cross reactivity between Human Immunodeficiency Virus Type 1 and Type 2 detected by different serological methods Correlation between cross neutralization and reactivity against the main neutralizing site J Virol 64 7 3492 3499 MP Biomedicals Asia Pacific Pte Ltd 85 Science Park Drive 04 01 The Cavendish Singapore Science Park Singapore 118259 N tel 65 6775 0008 N fax 65 6775 4536 E mail enquiry_ap mpbio com Medical Technology Promedt Consulting GmbH EC REP Altenhofstrasse 80 D 66386 St Ingbert Germania N tel 49 68 94 58 1020 N fax 49 68 94 58 1021 E mail info 0 mt procons co
12. e specifiche HIV 1 e HIV 2 sulle strisce di controllo non reattivo Dovrebbe essere visibile la banda di controllo del siero Fig 1c 2 CONTROLLO REATTIVO FORTE Devono essere visibili tutte le bande di peso molecolare pertinenti La Figura 1a fornisce una guida al posizionamento relativo delle bande visualizzate con l HIV BLOT 2 2 di MPD consentendo l identificazione delle bande osservate per il CONTROLLO REATTIVO FORTE Le bande sono p17 p24 p31 gp41 p51 p55 p66 e gp120 gp160 Possono essere visibili anche altre bande associate ad antigeni del nucleo p39 p42 Fare attenzione a non interpretare queste ultime come gp41 Gli antigeni di rivestimento gp41 gp120 gp160 appaiono come bande diffuse in quanto fenomeno tipico delle glicoproteine La banda di controllo del siero e la banda specifica HIV 2 devono risultare visibili come indicato dalla Figura 1a 3 CONTROLLO REATTIVO DEBOLE Il controllo reattivo debole indica il livello di sensibilit del kit Devono comparire delle bande deboli alla p24 e o gp 41 e gp 120 160 Potrebbero essere presenti o meno delle deboli bande aggiuntive Deve essere visibile la banda per il controllo del siero Figura 1b INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI NOTA Per evitare ogni rischio di errata interpretazione le strisce devono essere completamente asciutte La presenza o assenza di anticorpi anti HIV 1 in un campione viene determinata confrontando ogni striscia di nitrocellulosa con le
13. er alcuni esemplare 10 11 12 13 14 15 16 Aggiungere 2 ml di SOLUZIONE DI BLOTTING a ciascun pozzetto Aggiungere 20 ul di siero del paziente o di controllo a seconda del pozzetto Evitare rigorosamente di aggiungere i campioni direttamente sulle strisce Coprire la vaschetta con il relativo coperchio e incubare per 1 ora a temperatura ambiente 25 3 C sull agitatore oscillante Scoprire con cautela la vaschetta per evitare la fuoriuscita del materiale o il rimescolamento dei campioni Inclinare la vaschetta per aspirare la miscela dai pozzetti Tra un campione e l altro cambiare il beccuccio dell aspiratore per evitare una contaminazione incrociata Lavare ogni striscia per 3 volte con 2 ml di TAMPONE DI LAVAGGIO DILUITO lasciandolola a bagno per 5 minuti sull agitatore oscillante tra ogni lavaggio Aggiungere 2 ml di SOLUZIONE DI CONIUGATO a ogni pozzetto Coprire la vaschetta e incubare per 1 ora a temperatura ambiente 25 3 C sull agitatore oscillante Aspirare il CONIUGATO dai pozzetti Eseguire un lavaggio come indicato al punto 8 Aggiungere 2 ml di SOLUZIONE DI SUBSTRATO a ogni pozzetto Coprire la vaschetta e incubare per 15 minuti sull agitatore oscillante Nota La reazione pu essere interrotta prima di 15 minuti se tutte le fasce sono visibili Aspirare il SUBSTRATO e sciacquare almeno tre volte le strisce con acqua per reagenti per arrestare la reazione In c
14. i SOLUZIONE DI BLOTTING a ciascun pozzetto Aggiungere 20 ul di siero del paziente o di controllo a seconda del pozzetto Coprire il vassoio con il relativo coperchio e lasciare incubare per tutta la notte 16 20 ore a temperatura ambiente 25 3 C sull agitatore oscillante Scoprire con cautela la vaschetta per evitare la fuoriuscita del materiale o il rimescolamento dei campioni Inclinare la vaschetta per aspirare la miscela dai pozzetti Tra un campione e l altro cambiare il beccuccio dell aspiratore per evitare una contaminazione incrociata Lavare ogni striscia per 3 volte con 2 ml di TAMPONE DI LAVAGGIO DILUITO lasciandola a bagno per 5 minuti sull agitatore oscillante tra ogni lavaggio Aggiungere 2 ml di SOLUZIONE DI CONIUGATO a ogni pozzetto Coprire la vaschetta e incubarlo per 30 minuti a temperatura ambiente 25 3 C sull agitatore oscillante Aspirare il CONIUGATO dai pozzetti Eseguire un lavaggio come indicato al punto 8 Aggiungere 2 ml di SOLUZIONE DI SUBSTRATO a ogni pozzetto Coprire la vaschetta e incubarlo per 15 minuti sull agitatore oscillante Nota La reazione pu essere interrotta prima di 15 minuti se tutte le fasce sono visibili Aspirare il SUBSTRATO e sciacquare almeno tre volte le strisce con acqua per reagenti per arrestare la reazione In caso di lavaggio insufficiente a questo punto pu apparire uno sfondo scuro Prendere delicatamente le strisce con le pinzette e app
15. ico HIV 2 specifico Le singole strisce di nitrocellulosa vengono incubate con siero o plasma diluiti e con i controlli Se presenti nel campione gli anticorpi specifici anti HIV 1 e HIV 2 si legheranno alle proteine HIV 1 e al peptide HIV 2 sulle strisce Queste ultime sono quindi sottoposte a lavaggio al fine di rimuovere le sostanze non legate possibile visualizzare gli anticorpi che si legano specificamente alle proteine HIV mediante una serie di reazioni che utilizzano immunoglobuline di capra anti lgG umane coniugate con fosfatasi alcalina e substrato BCIP NBT Grazie al suo elevato grado di sensibilit questo metodo consente la determinazione di quantit minime di anticorpi specifici anti HIV presenti nel siero o nel plasma umani COMPONENTI DEL KIT Descrizione dei componenti Quantit fornita STRISCE DI Disponibili NITROCELLULOSA in confezioni Contenenti lisato virale HIV 1 da 18 o 36 peptide di superficie HIV 2 strisce specifico e una banda per il controllo dell aggiunta del siero Conservare all asciutto e al riparo dalla luce CONTROL A BUF STOCK 10x BUF WASH 20x CONJUGATE SUBS BCIP7NET CONTROLLO NON REATTIVO Siero umano normale inattivato non reattivo per antigene di superficie dell epatite B HBsAg anticorpi HIV 1 2 e anti HCV Contiene sodio azide e thimerosal come conservanti CONTROLLO REATTIVITA FORTE Siero umano inattivato con un alto titolo di anticorpi HIV
16. m Sedi regionali MP Biomedicals Suisse S A Halle de Fret Aeroport P O Box 1015 1211 Ginevra 5 Svizzera N tel 4122 788 1908 N fax 4122 788 1986 E mail mpbiosuisse 6 mpbio com Brevetto degli Stati Uniti 5 721 095 Il nome e il logo Genelabs sono concessi in licenza da Genelabs Technologies Inc FIGURA 1 a b gp 160 gp 120 L p66 NN Dpo0 p 51 Ii gp 41 A p 39 p17 Controllo m n E siero HIV 2 N B Controllo reattivo forte Reattivo a HIV 1 e HIV 2 Controllo reattivo debole Reattivo solo a HIV 1 Controllo non reattivo Tipico siero HIV 2 sieropositivo 10 27 Zyd Uejnjj99 ulI e Bul old eun Ip Isqenen qq nod Ly d QWOD 1 UON Z Eesnyip epueg eun 46 Ly d6 Ip epe IS UON L 909115 ll p eudoldul UOIZeAJO SUOD eun e olnAop uou ul oid uoo onea uoldule g Do OF E sou dns euoizeqnoul Ip y Islyeue a ueINp ol ldulo9ul Ol55EAET eBbunj oddoun jap auoizeqnou Z orebniuo9 jap o suoIidweI g QUOIZINIIG ojunibBe uou oyesjsqns py ojunibBe uou olebniuo2 ISITEUE 29S1 S Z ojuni6Be uou o lS 79113 1891 UOO 800 OS EL UN 9 qq nod 2 9 ajuejjio
17. nalisi campioni dei pazienti possono essere inattivati tuttavia cio non indispensabile per ottenere risultati ottimali Per Tinattivazione procedere nel modo seguente 1 Allentare i cappucci dei contenitori dei campioni 2 Riscaldare i campioni a 56 C per 30 minuti in un incubatrice ad acqua 3 Lasciare raffreddare i campioni prima di serrare nuovamente cappucci 4 Fino al momento dell analisi i campioni possono essere conservati congelati Si raccomanda di non sottoporre i campioni dei pazienti a ripetuti cicli di congelamento e scongelamento prima del test MATERIALI OCCORRENTI MA NON PRESENTI NEL KIT e Acqua deionizzata o distillata e Guanti monouso Agitatoreoscillante con una gamma di velocit di oscillazioni da 12 a 16 al minuto e in grado di inclinarsi ad un angolo compreso fra 5 e 10 per un lavaggio omogeneo delle membrane Pipette e puntali in quantit adeguate Aspiratore con filtro a ipoclorito di sodio Incubatore ad acqua a 56 C opzionale ipoclorito di sodio per la decontaminazione PREPARAZIONE DEI REAGENTI 1 TAMPONE DI LAVAGGIO DILUITO a II TAMPONE DI LAVAGGIO DILUITO deve essere preparato fresco prima dell uso b Diluire un volume di TAMPONE DI LAVAGGIO CONCENTRATO 20X in 19 volumi di acqua per reagenti Mescolare accuratamente 2 TAMPONE DI BLOTTING a II TAMPONE DI BLOTTING deve essere preparato fresco prima dell uso b Diluire 1 volume di SOLUZIONE
18. oclorito durante le fasi di conservazione e incubazione Il contatto inibisce la reazione cromatica Non esporre i reagenti ad eccessiva luminosit L analisi deve essere effettuata preferibilmente a temperatura ambiente 25 3 C Sistemare le strisce con il lato numerato rivolto verso l alto Per il dosaggio Western Blot necessario utilizzare un agitatore a piattaforma oscillante anzich un agitatore rotante In caso contrario le prestazioni del kit potrebbero essere pregiudicate Si raccomanda di azionare l agitatore ad una velocit di 12 16 cicli al minuto con un angolo di inclinazione di 5 10 gradi In caso di impiego di strumentazione automatica accertarsi che questa sia validata prima dell uso Accertarsi che i campioni vengano aggiunti dalla striscia Il vassoio pu essere titolato e il campione aggiunto quando il tampone viene raccolto all estremit inferiore In questo modo si impedisce la formazione di macchie scure dovute all aggiunta del campione sulla striscia Evitare l impiego di congelatori a sbrinamento automatico per la conservazione di reagenti e campioni 17 Ensure that automated equipment if used is validated before use Si sconsiglia l utilizzo di campioni diluiti o liofilizzati in quanto possono fornire risultati alterati Se costituiscono un pannello QC o una parte di esso dovrebbero essere considerati validi ISTRUZIONI PER LA CONSERVAZIONE 1 2 Attenzione Conservare il ki
19. oggiarle su fazzoletti di carta Coprire con altri fazzoletti e asciugare In alternativa lasciare asciugare le strisce nei pozzetti della vaschetta Sistemare le strisce su carta da lavoro carta bianca non assorbente Non applicare scotch sulle bande che si sono formate Osservare le bande vedere Interpretazione dei risultati e classificare i risultati Conservare le strisce al buio 2 minuti 2 mi 20 ul tutta la notte 3x2 ml 2 ml 30 minuti 3x2ml 2 ml 15 minuti 3x2 ml SOMMARIO PROTOCOLLI DI ANALISI Reagenti Quantit Temp ambiente Temp ambiente Proc rapida Proc overnight Striscia nitrocellulosa 1 Tampone lavaggio 2 m Tampone di blotting 2 ml Campione 20 ul 60 min Tutta la 7 eas Tampone lavaggio 3x2ml Coniugato m Tampone lavaggio 3x2 ml Substrato 2 ml a min E min Acqua distillata 3x2 ml x nn QUANTITA NECESSARIA DI REAGENTI PER NUMERO DI STRISCE 1X Tampone di lavaggio ml 1X Tampone di blotting ml Coniugato ul Substrato ml Polvere per blot 9 1 Polvere per blot 9 1 blot g CONTROLLO DI QUALITA Si raccomanda di eseguire in ogni seduta il controllo non reattivo reattivo forte e reattivo debole indipendentemente dal numero di campioni esaminati risultati di un analisi possono essere considerati validi solo se soddisfano le seguenti condizioni 1 CONTROLLO NON REATTIVO Assenza di band
20. onveniente procedere come segue i Aggiungere il campione soltanto dopo aver aggiunto il TAMPONE DI BLOTTING ii Inclinare leggermente il vassoio sollevandolo dall estremita superiore o inferiore Il tampone di blotting dovr fluire verso l estremit inferiore del vassoio Aggiungere il campione nel punto di raccolta del tampone di blotting Una volta aggiunti tutti i campioni riportare il vassoio in posizione orizzontale Accertarsi che le strisce rimangano costantemente umide durante l operazione iii In alternativa se non si desidera inclinare il vassoio i campioni possono essere aggiunti sull estremit superiore o inferiore del pozzetto In questo modo anche in caso di comparsa di macchie scure la lettura dei risultati della strisce non viene influenzata Procedura 1 Aggiungere 2 ml di SOLUZIONE DI 2 ml LAVAGGIO DILUITA a ciascun pozzetto 2 Prendere con cautela il numero di STRISCE occorrente dalla confezione usando le pinzette e sistemarle con il lato numerato rivolto verso l alto una per pozzetto Utilizzare strisce per i controlli reattivi forti reattivi deboli e non reattivi 3 Incubare le strisce da 1 a 2 minuti a 2 minuti temperatura ambiente 25 3 C su una piattaforma oscillante alla velocit di 12 16 oscillazioni al minuto Eliminare la soluzione tampone mediante aspirazione Nota Non lasci che le strisce asciughino il guasto pu provocare i contrassegni acquosi sulle strisce sviluppate p
21. reattivit degli antigeni virali HIV 1 con campioni sieropositivi di HIV 1 Campioni testati 197 PROFILO HIV BLOT 2 2 DUPONT ORTHO SIEROLOGICO NUMERO HIV 1 WB NUMERO PERCENTUALE PERCENTUALE GAG POL ed 192 97 5 188 95 4 ENV 024 p31 gp41 e o 187 94 9 179 90 9 gp120 gp160 ENV e GAG o POL 197 100 197 100 Tabella 2 Studio sulla specificit basato sul livello di reattivit degli antigeni virali HIV 1 su campioni di sangue proveniente da donatori sani e su sieri con altre infezioni virali TIPO DI NUMERO POSITIVO REATTIVITA ALL HIV 1 CAMPIONE INDETERMINATO Donatori sani 208 0 11 mvi s o o 5 ew ls EBV IgM V zoster IgG Morbillo Parotite Dengue Totale 258 0 21 237 aN Tutti apparsi soltanto come banda p24 o p17 Tabella 3 Studio sulla sensibilita della banda del peptide HIV 2 con campioni HIV 2 sieropositivi Campioni testati 178 HIV 2 Western Blot Reattivita del Peptide HIV 2 Profilo sierologico Positivo Negativo GAG POL e 2 ENV 160 0 GAG POL e 1 ENV 6 sieri sono stati definiti positivi in base ai risultati ottenuti con il New LAV Blot 2 della Pasteur dati sono stati forniti dal Dott Oliviero E Varnier e dalla Dr ssa Flavia Lillo del Laboratorio per lo Studio dei Retrovirus Umani Universit di Genova Tabella 4 Studi sulla specificit della b
22. rischi R R20 21 22 Nocivo per inalazione contatto con la pelle ed ingestione 1 Evitare la contaminazione microbica dei reagenti durante l apertura delle provette o dei flaconi originali e durante il prelievo dei materiali 2 Non pipettare con la bocca 3 Maneggiare i campioni di analisi le strisce di nitrocellulosa i controlli reattivi reattivi deboli e non reattivi come agenti potenzialmente infettivi 4 Indossare indumenti da laboratorio e guanti monouso durante l esecuzione delle analisi guanti devono essere gettati negli appositi contenitori a rischio biologico Lavarsi accuratamente le mani al termine dell operazione 5 Si raccomanda di eseguire il test in uno spazio apposito per procedure con rischio di contaminazione biologica 6 Evitare il contatto dei materiali con cibi e bevande 7 In caso di contatto con gli occhi sciacquare immediatamente con abbondante acqua e richiedere assistenza medica 8 In caso in ingestione o di contatto dei materiali contaminati con ferite aperte o altre lacerazioni cutanee consultare immediatamente il medico 10 11 12 Asciugare immediatamente ogni versamento di materiale potenzialmente infettivo con carta assorbente e tamponare Parea contaminata con una soluzione di ipoclorito di sodio al 176 prima di riprendere il lavoro In presenza di versamenti contenenti sostanze acide asciugare l area con carta assorbente prima di utilizzare l ipoclorito di sodio Tut
23. so 1 pun Ip osod e 14 eun Ip 05 1 eudosdw 12 ojuawe abuoos 2 Ip 1919 nadu Ip esneo e o ye suoidweo jap 188589 0 0010 jep 4 2 eye uoidweL ep uo z n qg uoldulE jep olesneo lu uul qeqold ew jqod ew jqoud 2 ewud eje 185920 59 BINDS uOIZEULO El S BILN BOSS ll p IUO Z UO PunuSede elle pulbuni QUOIZEIBII 01d ep Ip EZU S LG Ol ldulooul cbbene 77 osud nid je 28 ej yeddnilAsi di osiS L lunoye YO 11800 02140 ajuejjioso pun Ip 1500 e ewozeyerd eun ip osn 2 TEso Ip EYA QUOIZEIJUBDUOD eun 1 enboe o nu p l 40SSEA 9 quaonpii n be o AN IBL no e volzisods ile oyessqns jap 0 uewn o ep 6 1 audoudwi aunyesodwa e uolz sods Ip esneo e Ijiqeisui nu 5b k oyeBniuoo QUOIZINIG
24. sosibees auoidweo IVZ IDQLUIQZUI Ip uululul eujuenb 5 5 lins ONIS 8115 0 9 5 uou apueq IP uolzEuL O BUNSSAN 049IS JOP ollonuo IP epueg ezuassy uoo sosIbeaI auOIdwey leddnilAS 39S14 S lins asonboe 2996 AHISOd apueg Ip ezuasald o EZU SSE Ul BIOSIJ S ejns ossads 5 oun Ip QUOIZEWIJOY ewid UOU IOSSEA Z ISITEUE 5 OUOS 291115 T OAIISOd 0 O4 UO9 JEP BIHA BOSS linS ayouelq luoopul Ip 65464 102 Ly dB Ip ll Ali e pluuns p epueg 251 1 1 4 apueq oAne5 u ollosnuo ins OJ9IS ollonuo ip pueq lIE 314 0 pueq Hon lin IP uolzeuo i Z AlH q d anneoipui uou vu l ds uou pueq Ip oddnilAS elsu lul Ip oddnilAS os s lins 5 luoopul Ip esyedwioy ILSVNO ANOIZVOACIAIGNI Id V TOAVL
25. sostanze di origine umana Nessun metodo di prova in grado di garantire con assoluta certezza che i prodotti derivati dal sangue umano non trasmettano infezioni MANEGGIARE TUTTI CAMPIONI D ANALISI NONCH CONTROLLI REATTIVI FORTI REATTIVI DEBOLI E NON REATTIVI COME AGENTI POTENZIALMENTE INFETTIVI Si consiglia di maneggiare i componenti e i campioni di analisi nel rispetto delle pratiche operative di laboratorio Lo smaltimento del materiale dovr essere effettuato in conformit alle procedure di sicurezza stabilite Il controllo reattivo forte il controllo reattivo debole e il controllo non reattivo contengono thimerosal e sodio azide la soluzione tampone concentrata e il tampone di lavaggio contengono thimerosal mentre il coniugato contiene sodio azide Il sodio azide pu reagire con il rame o il piombo utilizzati in alcuni impianti idraulici con la conseguente formazione di sali esplosivi Sebbene le quantit utilizzate in questo kit siano limitate si raccomanda comunque di smaltire sempre i materiali contenenti azide in abbondante acqua corrente onde evitare l accumulo di metallo azide nell impianto idraulico Qui di seguito sono elencate le frasi relative ai rischi R R22 Nocivo per ingestione Il substrato contiene 5 bromo 4 cloro 3 indolil fosfato e nitroblu di tetrazolio classificato secondo le direttive della Comunit Economica Europea CEE come nocivo Xn Qui di seguito sono elencate le frasi relative ai
26. strisce utilizzate per i controlli NEGATIVO REATTIVO FORTE E REATTIVO DEBOLE La figura 1a viene utilizzata per individuare le bande sviluppate sulla striscia con il controllo REATTIVO FORTE N B Lestremita numerata delle strisce deve essere disposta in basso come mostrato nella figura es le bande gp120 gp160 sono le pi lontane dall estremit numerata PESO ANTIGENE DESCRIZIONE MOLECOLARE gp 160 ENV Forma polimerica Ampia glicoproteina di gp41 diffusa gp 120 Membrana esterna Glicoproteina diffusa POL Transcriptasi Banda non marcata inversa aa Precursore proteico Banda non marcata POL Transcriptasi Banda non marcata inversa appena sotto p55 eda Frammento di p55 Banda non marcata gp41 Transmembrana Glicoproteina diffusa Endonucleasi Sdoppiata p24 GAG Proteina del nucleo Banda ampia p17 GAG Proteina del nucleo Banda ampia Alcuni dei diversi antigeni elencati in questa tabella derivano dallo stesso precursore proteico e potrebbero avere epitopi sovrapposti Ci va tenuto in considerazione nell interpretazione del profilo ad esempio 1 improbabile individuare gp41 in assenza di gp160 in quanto gp160 la forma polimerica di gp41 e la concentrazione di gp160 maggiore di quella di gp41 sull HIV BLOT 2 2 di MPD Il gp41 appare come banda diffusa Un eventuale banda evidente non marcata nella regione gp41 non dovr essere interpretata come banda gp41 Numerosi campioni non
27. t HIV BLOT 2 2 di MPD e i relativi componenti a 2 8 C quando non sono utilizzati Se conservati alla temperatura di 2 C 8 C tutti i reagenti e le strisce per test mantengono la stabilit fino alla data di scadenza riportata sul kit Non congelare i reagenti Strisce Evitare inutili esposizioni delle strisce alla luce Reagenti e Conservare i reagenti nelle provette o nei flaconi originali con i cappucci correttamente serrati Dispensare tutti i reagenti a freddo e riportarli ad una temperatura di 2 C 8 C non appena possibile e La conservazione del substrato a 2 C 8 C pu provocare la formazione di precipitato Questo tuttavia non avr alcuna influenza sulle prestazioni del kit Evitare l esposizione non strettamente necessaria del substrato alla luce RACCOLTA TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI possibile utilizzare campioni di siero o di plasma raccolti in EDTA eparina o citrato di sodio Prima della conservazione accertarsi che i coaguli o le cellule ematiche siano state separate prima della centrifugazione campioni devono essere conservati a 2 8 C se il test deve essere eseguito entro 7 giorni dalla raccolta oppure congelati a 20 C o temperature inferiori se il test previsto per una data successiva Utilizzare preferibilmente campioni trasparenti e non emolizzati campioni lipemici itterici o contaminati particelle devono essere filtrati 0 45 um o centrifugati prima dell a
28. to del prodotto stesso l produttore non potr essere ritenuto responsabile nei confronti dell acquirente o di terzi per danni lesioni o danni economici di qualsiasi entit comunque causati dal prodotto nell uso o nell applicazione sopra indicati PROBLEMI TECNICI RECLAMI In caso di problemi tecnici o di reclami attenersi alla seguente procedura 1 Annotare il numero di lotto del kit la data di scadenza e il numero di lotto della striscia 2 Conservare i kit e risultati ottenuti 3 Contattare il pi vicino centro MP Biomedicals o il proprio distributore locale BIBLIOGRAFIA 1 V C W Tsang K Hancock M Wilson D F Palmer S Whaley J S Mc Dougal e S Kennedy March 1985 Developmental Procedure Enzyme linked Immunoelectro transfer Blot technique for HTLV III LAV antibodies CDC Altanta H Towbin T Staehlin e J Gordon 1979 Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets procedure and some applications Proc Natl Acad Sci USA 76 4350 4354 J Schupbach M Popovic R V Gilden M A Gonda M G Sarngadharan e R C Gallo 1984 Serological Analysis of subgroup of Human T Lymphotropic retroviruses HTLV II associated with AIDS Science 224 503 505 M G Sarngadharan M Popovic L Bruch J Schupbach e R C Gallo 1984 Antibodies reactive with human T Lymphotropic retroviruses HTLV III in the serum of patients with AIDS Scien
29. to di reattivit sia nel numero che nell intensit delle bande nell arco di 2 6 mesi La maggior parte delle strisce con risultati POSITIVI presenter altre bande virali specifiche Un test INDETERMINATO non pu essere considerato determinante per una diagnosi di infezione da HIV 1 Si consiglia di ripetere tutti i TEST INDETERMINATI utilizzando sia il primo prelievo che prelievi successivi donatori di sangue che presentano un profilo INDETERMINATO devono essere riesaminati dopo un periodo da due a sei mesi utilizzando un campione appena prelevato noto altres che gli anticorpi anti p24 e p31 diminuiscono durante il decorso dell AIDS producendo un mutamento nell interpretazione del test da POSITIVO a INDETERMINATO In tali situazioni Pinterpretazione dei risultati deve basarsi su una successiva analisi e su valutazioni cliniche Data la sua natura altamente specifica la NON REATTIVIT di campioni con peptide di superficie HIV 2 specifico su un test virale indeterminato non esclude la possibilit di infezione con altri ceppi di HIV 2 campioni riscontrati indicativi per infezioni da HIV 2 devono essere ulteriormente riesaminati con un kit Western Blot per HIV 2 CARATTERISTICHE SPECIFICHE DI ESECUZIONE risultati del test HIV BLOT 2 2 di MPD per la determinazione degli anticorpi anti HIV 1 e HIV 2 sono stati oggetto di numerosi studi clinici Tabella 1 Studio sulla sensibilit basato sul livello di
30. to il materiale usato inclusi i guanti monouso dovr essere smaltito come materiale a rischio biologico Non autoclavare il materiale contenente ipoclorito di sodio Prima dell eliminazione sterilizzare in autoclave tutto il materiale utilizzato e contaminato a 121 C a 15 p s i per 30 minuti In alternativa decontaminare i materiali in una soluzione di ipoclorito di sodio al 5 per 30 60 minuti prima di gettarli negli appositi contenitori a rischio biologico Decontaminare tutti i reagenti e le sostanze chimiche impiegate in una soluzione di ipoclorito di sodio con una concentrazione finale pari almeno all 1 Lasciare agire per 30 minuti per garantire una efficace decontaminazione Si sconsiglia il riutilizzo delle vaschette per incubazione PRECAUZIONI DI IMPIEGO 1 10 11 Per ottenere prestazioni ottimali dal test occorre SEGUIRE RIGOROSAMENTE le procedure illustrate nel presente Manuale di istruzioni Qualsiasi deviazione dalla procedura pu provocare risultati erronei NON MODIFICARE O SCAMBIARE REAGENTI DI KIT APPARTENENTI A LOTTI DIVERSI controlli il coniugato e le strisce di Western Blot sono stati abbinati per ottenere prestazioni ottimali Utilizzare unicamente i reagenti forniti con il kit Non utilizzare i componenti del kit dopo la data di scadenza riportata sulla confezione Evitare la contaminazione microbica dei reagenti nell aprire le provette o i flaconi originali e prelevare i materiali poich
31. triscia utilizzando le strisce di Controllo REATTIVO FORTE e o DEBOLE come guida 3 L interpretazione della striscia si basa quindi sull individuazione di profili specifici delle bande secondo le raccomandazioni delle autorit competenti ad es Ministero della Sanit Organizzazione Mondiale della Sanit etc Poich le direttive per l interpretazione possono variare da Paese a Paese MPD raccomanda di consultare le autorit locali Di seguito vengono elencati criteri d interpretazione stabiliti dai diversi organismi internazionali AUTORIT CRITERI DI COMPETENTE INTERPRETAZIONE Centro Controllo Malattie CDC Almeno 1 ENV gp41 e gp120 160 e ASTPHLD e p24 American Food and Drug p24 e p31 e gp41 o gp120 gp160 Administration FDA Centre National Transfusion Due bande ENV 2 con GAG o POL Sanguine Organizzazione Mondiale Sanit Due bande ENV con o senza GAG WHO o POL Consorzio per la Standardizzazione Una banda di p24 o p31 e una banda della Sierologia di Retrovirus ENV Croce Rossa Americana Una banda ciascuno di GAG POLed ENV Associazione tedesca per il Una banda ENV e almeno una banda controllo delle malattie virali DVV GAG o POL band vedere anche DIN 58 969 parte 41 Si raccomanda di utilizzare le seguenti direttive per Pinterpretazione dell HIV BLOT 2 2 prodotto dalla MPD Per ciascuna banda individuata si devono rilevare i risultati ed interpretarli come NEGATIVO POSIT
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