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Inserto della confezione per il saggio MiSeqDx - Support

1. 7 Dispensare 45 u di tampone di lavaggio universale in ciascun pozzetto contenente il campione 8 Coprire la piastra filtro con il coperchio e centrifugare a 2 400 x g a 20 C per 10 minuti NOTA Accertarsi che tutto il liquido sia defluito dopo la centrifugazione Ripetere la centrifugazione se necessario Estensione ligazione degli oligonucleotidi legati Procedura 1 Aggiungere 45 pl di miscela di estensione ligazione a ogni pozzetto di campione della piastra filtro 2 Sigillare la piastra filtro con foglio di allumino adesivo e quindi coprire il coperchio 3 Incubare l unit FPU nell incubatore preriscaldato a 37 C per 45 minuti Amplificazione mediante PCR Preparazione 1 Preparare 0 05 N di NaOH freschi 2 Determinare i primer indice da utilizzare base alla stampa dello schema della piastra da Worklist Manager Illumina 3 Portare il Master Mix per PCR e i primer indice appropriati a temperatura ambiente Agitare ogni provetta scongelata per miscelare e quindi centrifugare brevemente le provette 4 Impostare una nuova piastra PCR con 96 pozzetti di seguito definita piastra AMP 5 Aggiungere i primer indice alla piastra AMP come segue a Dispensare 4 ul dei primer indice selezionati A A501 H A508 nel pozzetto appropriato in una colonna della piastra AMP b Smaltirei tappi bianchi originali e applicare tappi bianchi nuovi c Dispensare 4 ul dei primer indice selezionati 1 A701 12 A712 nella riga a
2. MiSeq MOS Interpretazione dei risultati 1 2 Il saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant Illumina progettato per rilevare le 139 varianti del gene CFTR incluse quelle raccomandate dall ACMG Tabella 2 Il report del saggio elenca i nomi dei campioni e il genotipo per ciascuna variante rilevata per un campione Tutti i campioni sono interrogati per le 134 varianti che causano la fibrosi cistica e la variante R117H raccomandata dall ACMG nel report del saggio sono elencati solo gli alleli mutanti rilevati La variante PolyTG PolyT viene riportata solo se la variante R117H viene identificata per un campione Per i pazienti con una variante R117H vengono eseguiti ulteriori test per determinare se una variante PolyTG PolyT che pu incidere sul fenotipo clinico ad es 12 13 TG o 5T in orientamento cis trans sulla variante R117H NOTA f Il genotipo PolyTG PolyT viene determinato dal saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant in base al conteggio delle letture del genotipo pi comune Grazie alla natura digitale del sequenziamento di nuova generazione il saggio in grado di raggiungere accuratezza elevata mediante osservazioni multiple rispetto a tecnologie basate sul sequenziamento che usano solo poche osservazioni Quando un campione presenta il genotipo omozigote F508del o I507del se sono rilevati uno o pi dei tre polimorfismi benigni I506V I1507V e F508C questo viene riportato per il campione Se tutti e tre i
3. definita come una serie di campioni elaborati in parallelo vengano inclusi un campione di DNA di controllo positivo e un controllo negativo NTC o No Template Control controllo senza templato Il campione di DNA di controllo positivo deve essere un campione ben caratterizzato con una o pi mutazioni note del gene CFTR Illumina raccomanda di usare un controllo wild type Il controllo wild type deve essere eseguito come un campione e non deve sostituire il controllo positivo o negativo Prima di iniziare il saggio MiSegDx Cystic Fibrosis 139 Variant estrarre e quantificare il DNA possibile utilizzare qualsiasi metodo di estrazione del DNA approvato Quantificare il DNA con uno spettrofotometro Verificare che il rapporto A260 A280 del campione di DNA sia gt 1 5 Normalizzare il campione di DNA a 50 ng ul Per ciascun campione sono necessari 5 ul di DNA genomico 250 ng totali Rendimento dei campioni e rappresentazione dell indice Per esse in b E il saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant Illumina il rendimento dei campioni per corsa di MiSeqDx pu re tra 8 e 48 campioni I primer di indicizzazione usati durante l amplificazione mediante PCR devono essere scelti ase al rendimento dei campioni finale desiderato per garantire diversit nella sequenza dell indice NOTA Per la massima efficienza di rendimento eseguire la preparazione della libreria per un massimo di 96 campioni e quindi dividere i campioni in due corse di seq
4. 1461ins4 DIV 32 N codice 15038347 Rev A ITA Gennaio 2014 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant Identificazioni positive varianti Identifica Identifica N di N di Concor Concor Concor Variante Tipo di zioni A n zioni identifica identifica danza danza danza f Nome cDNA 5 Campio Campio Campio j Fog ne di Nome comune variante totali per ni ni linee ni negative zioni zioni non positiva negativa complessiva a il g 0 0 0 variante dinici cellulari sineta wild type errate riuscite S549R SNV c 1645A gt C 500 1 499 100 100 c 1645A gt C m 00 33 N codice 15038347 Rev A ITA Gennaio 2014 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant Identificazioni positive varianti Identifica Identifica N di N di Concor Concor Concor Variante Tipo di zioni A i zioni identifica identifica danza danza danza i Nome cDNA Campio Campio Campio j Fog ne va E Nome comune variante totali per ni ni lina ni negative zioni zioni non positiva negativa complessiva variante wild type errate riuscite clinici cellulari sintetici CNC E SERENE EE se ear sa a e a w sn same so 0 0 1 e a Doe cem sm a e 0 mo se ce sm a e o o w se i ese sm a fe o o w 2622 1G gt A 3007delG 3121 1G gt A L1077P4 34 N codice 15038347 Rev A ITA Gennaio 2014 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant Iden
5. 2014 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant 17 Posizionare la piastra CLP sul supporto magnetico per un minimo di 2 minuti o finch il surnatante limpido 18 Impostare una nuova piastra MIDI di seguito definita piastra LNP 19 Trasferire 20 ul di surnatante dalla piastra CLP alla piastra LNP 20 Opzionale Trasferire i restanti 10 ul di surnatante dalla piastra CLP a una nuova piastra ed etichettare la piastra con il nome della corsa e la data Conservare questa piastra a una temperatura compresa tra 25 C e 15 C fino al completamento della corsa di sequenziamento e analisi dei dati I prodotti per PCR puliti possono essere usati per scopi di ricerca ed eliminazione guasti in caso di problemi a carico dei campioni PUNTO DI ARRESTO SICURO Se ci si ferma a questo punto sigillare la piastra LNP e centrifugare a 1 000 x g a 20 C per 1 minuto j La piastra stabile per un massimo di 3 ore a una temperatura compresa tra 2 C e 8 C Normalizzazione della libreria Preparazione 1 Preparare 0 1 N di NaOH freschi 2 Portare il diluente normalizzazione libreria le microsfere libreria e il Lavaggio di normalizzazione della libreria a temperatura ambiente 3 Agitare il diluente normalizzazione libreria energicamente e assicurarsi che tutti i precipitati si siano completamente sciolti 4 Agitare le microsfere libreria energicamente per 1 minuto con inversione intermittente fino a risospensione delle microsfere e assenza d
6. inferiore alla soglia viene riportato come No call Nessuna identificazione Si raccomanda di ripetere il campione Il risultato ottenuto viene considerato valido solo se la percentuale di identificazione gt 99 Se la percentuale di identificazione inferiore a 99 la prestazione verr riportata come Fail Non superato e il campione deve essere ripetuto NOTA se la percentuale di identificazione del campione lt 50 la prestazione verr riportata come Fail Non superato e il commento Sample Failed Campione non superato verr indicato nel report Non verranno visualizzate informazioni sulla variante Questo campione deve essere ripetuto Si raccomanda all utente di verificare le varianti convalidate usando campioni sintetici vedere la tabella Accuratezza usando un metodo di riferimento convalidato prima di riportare il primo risultato del paziente con quelle varianti Se per un campione vengono identificate pi di due varianti si raccomanda di verificare il risultato ripetendo il campione usando il saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant Illumina con gDNA estratto fresco per escludere la contaminazione incrociata del campione NOTA quando vengono rilevate due o pi varianti deve essere presa in considerazione la determinazione delle fasi phasing per l aplotipo Tutte le interpretazioni delle varianti devono essere eseguite da un genetista molecolare certificato o equivalente attendendosi alle procedure linee guida locali 5 I
7. la notte oppure pu essere conservata ad una temperatura compresa tra 2 C e 8 C per un massimo di due giorni Prima di conservare la piastra a una temperatura compresa tra 2 C e 8 C sigillarla bene 9 Non congelare il reagente delle microsfere libreria o miscelarlo con il reagente del diluente normalizzazione libreria se non vengono utilizzati immediatamente 10 La piastra completa di normalizzazione della libreria pu essere conservata a una temperatura compresa tra 25 C e 15 C per un massimo di 3 giorni Gennaio 2014 N codice 15038347 Rev A ITA 9 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant 11 La libreria di ampliconi raggruppati in pool pu essere conservata tra a una temperatura compresa tra 25 C e 15 C per un massimo di 3 giorni 12 Caricare immediatamente nella cartuccia del reagente un pool di ampliconi diluiti appena preparati Se conservato il pool di ampliconi diluiti pu comportare una riduzione significativa della densit dei cluster Apparecchiatura e materiali Apparecchiatura e materiali di consumo forniti venduti separatamente 1 Strumento MiSeqDx n catalogo DX 410 1001 2 Kit TruSeq Index Plate Fixture n di catalogo FC 130 1005 3 Kit TruSeq Index Plate Fixture amp Collar n di catalogo FC 130 1007 4 Tappi sostitutivi per adattatore indice n di catalogo DX 502 1003 Apparecchiatura e materiali richiesti non forniti Apparecchiatura e materiali per pre amplificazione 1 Blocco term
8. ml Soluzione acquosa tra2 Ce8 C stringente tamponata contenente sali 2 mercaptoetanolo e formammide Tampone di lavaggio 10 provette 1 provetta 4 8 ml Soluzione acquosa tra2 Ce8 C universale tamponata contenente sali Tabella 7 Scatola 3B Reagenti post amplificazione Componente ie Voda Ingredienti attivi Conservazione P DX 102 1003 DX 102 1004 riempimento 8 Microsfere per la 10 provette 1 provetta 5 ml Soluzione acquosa tra2 Ce8 C pulizia della PCR tamponata contenente microsfere paramagnetiche in fase solida e polietilene glicole Lavaggio di 20 provette 2 provette 4 8 ml Soluzione acquosa tra2 Ce8 C normalizzazione tamponata contenente sali della libreria 2 mercaptoetanolo e formammide Microsfere libreria 10 provette 1 provetta 1 2 ml Soluzione acquosa tra2 Ce8 C tamponata contenente microsfere paramagnetiche in fase solida Cella a flusso 20 contenitori 2 contenitori 1 cella a Substrato di vetro con tra2 Ce8 C MiSeqDx saggio CF flusso oligonucleotidi legati 139 Variant covalentemente Gennaio 2014 N codice 15038347 Rev A ITA 7 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant Scatola 4 Tabella 8 Scatola 4 Reagenti post amplificazione Componente b i Voli Ingredienti attivi P DX 102 1003 DX 102 1004 riempimento Soluzione MiSeqDx 20 flaconi 2 flaconi 353 1 ml Soluzione acquosa SBS PR2 Saggio tamponata CF 139 Variant Saggio MiSeqDx
9. riferimenti potenziali per l interpretazione includono ma non sono limitati a database CFTR2 classificazione di Sosnay linee guida 2004 dell ACMG e opinione 2011 della commissione ACOG Per informazioni su come vengono calcolati e presentati i risultati o per una descrizione del contenuto nel report dei file di testo vedere la Guida per l utente di MiSeq Reporter n codice 15038356_ITA Procedure per il controllo qualit Le buone pratiche di laboratorio impongono che i materiali di controllo siano valutati per rilevare le differenze nell elaborazione dei campioni e nelle procedure tecniche nel laboratorio dell utente che potrebbero produrre una variabilit significativa nei risultati 1 Controlli positivi un campione di DNA di controllo positivo richiesto su ciascuna corsa Il campione di DNA di controllo positivo deve essere un campione ben caratterizzato con almeno una variante del gene CFTR 6 Illumina raccomanda di usare i controlli positivi in rotazione coerenti con le linee guida e gli standard tecnici 2008 dell ACMG per l analisi delle mutazioni della fibrosi cistica e gli standard di laboratorio 2013 dell ACMG per il sequenziamento di nuova generazione 8 I campioni di controllo positivi devono generare il genotipo previsto Se il controllo positivo genera un genotipo diverso da quello previsto Gennaio 2014 N codice 15038347 Rev A ITA 23 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant significa che si verif
10. su e gi 5 6 volte per miscelare accuratamente il DNA con la soluzione di lavoro per PCR d Trasferire le colonne restanti dalla piastra filtro alla piastra AMP in modo simile Le punte devono essere sostituite dopo ogni colonna per evitare la contaminazione incrociata Sigillare la piastra AMP e assicurare con un rullo di gomma Centrifugare a 1 000 x g a 20 C per 1 minuto Trasferire la piastra AMP sull area di post amplificazione Eseguire la PCR utilizzando il seguente programma su un termociclatore 95 C per 3 minuti 25 cicli di 95 C per 30 secondi 62 C per 30 secondi 72 C per 60 secondi 72 C per 5 minuti Mantenere a 10 C PUNTO DI ARRESTO SICURO Se non si procede immediatamente alla pulizia della PCR la piastra AMP pu restare sul termociclatore per la notte oppure pu essere conservata a una temperatura compresa tra 2 C e 8 C per massimo 48 ore Pulizia della PCR Preparazione 1 Portare le microsfere per la pulizia della PCR a temperatura ambiente 2 Preparare etanolo all 80 fresco dall etanolo assoluto Procedura 1 Centrifugare la piastra AMP a 1 000 x g a 20 C per 1 minuto 2 Impostare una nuova piastra MIDI di seguito definita piastra CLP 3 Capovolgere 10 volte le microsfere per la pulizia della PCR Agitare energicamente e quindi capovolgere altre 10 volte Controllare visivamente la soluzione per assicurarsi che le microsfere siano risospese 4 Aggiungere 45 ul di microsfere per la pulizia de
11. tampone di lavaggio stringente e il tampone di lavaggio universale a temperatura ambiente e agitare brevemente 2 Assemblare l unit piastra filtro d ora in avanti denominata FPU nell ordine dall alto verso il basso coperchio piastra filtro colletto adattatore e piastra MIDI 3 Pre lavare la membrana della piastra filtro come segue a Dispensare 45 u di tampone di lavaggio stringente in ciascun pozzetto b Coprire la piastra filtro con il coperchio e centrifugare a 2 400 x g a 20 C per 5 minuti Procedura 1 Estrarre la piastra HYB dal blocco termico e centrifugare a 1 000 x g a 20 C per 1 minuto 2 Trasferire tutto il volume di ciascun campione circa 55 ul nei corrispondenti pozzetti della piastra filtro 3 Coprire la piastra filtro con il coperchio e centrifugare a 2 400 x g a 20 C per 5 minuti 4 Lavare la piastra filtro come segue a Dispensare 45 u di tampone di lavaggio stringente in ciascun pozzetto contenente il campione b Coprire la piastra filtro con il coperchio e centrifugare a 2 400 x g a 20 C per 5 minuti 5 Ripetere il lavaggio come descritto nella fase precedente 16 N codice 15038347 Rev A ITA Gennaio 2014 6 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant j NOTA Se il tampone di lavaggio non asciuga completamente centrifugare di nuovo a 2 400 x g a 20 C finch tutto il liquido non viene espulso ulteriori 5 10 minuti Smaltire tutto il materiale defluito contenente formammide quindi riassemblare l FPU
12. termico deve soddisfare le seguenti specifiche di prestazione Intervallo di temperatura ambiente 5 C 99 C Regolazione della temperatura 0 1 C a 37 C 0 4 C a 60 C 5 Supporto magnetico necessario un supporto magnetico per una piastra da 96 pozzetti Le prestazioni migliori si osservano quando i magneti si trovano sul lato del supporto e non nella parte inferiore 6 Pipette di precisione necessaria una serie di pipette di precisione come specificato sopra nell area di pre amplificazione necessario un altro set L utilizzo di pipette di precisione necessario per assicurare un erogazione accurata di reagente e campione E possibile utilizzare sia pipette mono canale che multicanale se calibrate regolarmente e precise entro un margine del 5 del volume stabilito 7 Materiali di consumo sono necessari i seguenti materiali di consumo Piastre skirted per PCR a 96 pozzetti 0 2 ml polipropilene o equivalente NOTA assicurarsi che la piastra a 96 pozzetti sia compatibile con il supporto magnetico Piastre di conservazione da 96 pozzetti 0 8 ml piastre MIDI Provette coniche 15 ml Provette per microcentrifuga Eppendorf sono consigliate quelle con tappo a vite Striscia a otto provette per PCR Bacinella per soluzione in PVC priva di DNAasi RNAasi vaschetta Sigillo adesivo in alluminio Sigillo adesivo per piastre Punte di pipette dotate di barriera aerosol Prelievo trasporto e conservazione dei camp
13. totali Il n catalogo DX 102 1004 stato configurato per due corse con un massimo di 48 campioni per corsa fino a 96 campioni totali Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant Scatola 1 Tabella 3 Scatola 1A Reagenti pre amplificazione Componente Pool di oligonucleotidi per il saggio CF 139 Variant Tampone di ibridazione Miscela di estensione ligazione Primer indice A A501 H A508 Primer indice 1 A701 12 A712 PCR polimerasi Master Mix per PCR Quantit DX 102 1003 DX 102 1004 10 provette 1 provetta 10 provette 1 provetta 10 provette 1 provetta 10 provette per primer 10 provette per primer 10 provette 10 provette 1 provetta per primer 1 provetta per primer 1 provetta 1 provetta Tabella 4 Scatola 1B Reagenti post amplificazione Componente Diluente normalizzazione libreria Quantit DX 102 1003 DX 102 1004 10 provette 1 provetta 6 N codice 15038347 Rev A ITA Volume di riempimento 600 ul 4 32 ml 4 8 ml 192 ul 128 ul 56 ul 2 8 ml Volume di riempimento 4 6 ml Ingredienti attivi Conservazione Soluzione acquosa tra 25 C e 15 C tamponata contenente oligonucleotidi mirati al gene CFTR Soluzione acquosa tamponata contenente sali e formammide Soluzione acquosa tamponata contenente una miscela proprietaria di DNA polimerasi DNA ligasi e dNTP Primer per PCR con sequenze indice e adattatori di sequenziamento Pri
14. volumi per diluire la libreria del controllo interno PhiX a 2 nM Libreria del controllo interno PhiX da 10 nM 2 pl 1X tampone TE 8 pl 2 Combinarei seguenti volumi per ottenere una libreria del controllo interno PhiX da 1 nM Libreria del controllo interno PhiX da 2 nM 10 pl 0 1 N NaOH 10 pl 3 Inserire brevemente in un agitatore per miscelare la soluzione della libreria del controllo interno PhiX da 1nM 20 N codice 15038347 Rev A ITA Gennaio 2014 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant Centrifugare la soluzione di templato a 280 x g a 20 C per 1 minuto Incubare per 4 5 minuti a temperatura ambiente per denaturare la libreria del controllo interno PhiX in filamenti singoli Aggiungere il seguente volume di tampone di diluizione libreria pre raffreddato nella provetta contenente la libreria del controllo interno PhiX denaturata per ottenere una libreria del controllo interno PhiX da 20 pM Libreria del controllo interno PhiX denaturata 20 ul Tampone di diluizione libreria pre raffreddato 980 ul Preparazione della cartuccia di reagenti 1 Scongelare la cartuccia di reagenti MiSeqDx saggio CF 139 Variant in un bagnomaria contenente abbastanza acqua deionizzata a temperatura ambiente cos da immergere la base della cartuccia di reagenti fino alla linea di livello acqua stampata sulla cartuccia stessa Evitare che l acqua superi la linea di massimo livello acqua Lasciare la cartuccia di reagenti a scongelare a bagnom
15. 013 Rohlfs EM Zhou Z Heim R Nagan N Rosenblum L et al 2011 Cystic Fibrosis Carrier Testing in an Ethnically Diverse US Population Clinical Chemistry 57 6 841 848 agosto 2013 Gennaio 2014 Clinical and Functional Translation of CFTR CFTR2 Disponibile alla pagina Web www cftr2 org Online N codice 15038347 Rev A ITA 50 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant 12 The Clinical and Functional Translation of CFTR CFTR2 Project Disponibile alla pagina Web www nacfconference org art plenaryarchives 2011 Cutting pdf Online Presentato da Garry Cutting a nome del progetto CFTR2 al 25th Annual North American Cystic Fibrosis Conference NACFC sponsorizzato da Cystic Fibrosis Foundation 4 novembre 2011 Anaheim CA U S A 13 Sosnay PR Siklosi KR Van Goor F Kaniecki K Yu H et al 2013 Defining the disease liability of variants in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene Nat Genet 25 agosto Epub prima della stampa 14 Grody WW Cutting GR Klinger KW Richards CS Watson MS Desnick RJ March April 2001 Laboratory standards and guidelines for population based cystic fibrosis carrier screening Genetics in Medicine 3 2 149 154 15 Castellani C Cuppens H Macek H Jr Cassiman JJ Kerem E et al 2008 Consensus on the use and interpretation of cystic fibrosis mutation analysis in clinical practice J Cystic Fibrosis 7 179 196 16 Pratt VM Caggana M Bridges C Buller AM DiAntonio
16. 16 16 16 16 Concentrazione testata nel sangue limite superiore 684 umol l 13 mmol l 2 g l 37 mmol l 7 0 mg ml Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant Concentrazione testata nel sangue limite inferiore 137 umol l 2 6 mmol l 0 4 g l 7 4 mmol l 2 8 mg ml Percentuale di identificazione 100 100 100 100 100 I primer di indicizzazione dei campioni sono utilizzati nel saggio per assegnare un codice a barre univoco a ciascun campione di DNA consentendo di raggruppare in un pool pi campioni in una singola corsa di sequenziamento Sono stati testati complessivamente 96 indici di campioni mediante otto campioni di DNA unico al fine di verificare la capacit del saggio di identificare i genotipi in modo coerente per un dato campione fra diverse combinazioni di primer di indicizzazione Ciascun campione stato testato con 12 diverse combinazioni di primer di indicizzazione I risultati ottenuti dai campioni sono stati confrontati con i dati del sequenziamento bidirezionale Sanger per tutte le posizioni varianti eccetto due ampie delezioni confermate mediante un saggio di duplex PCR Riproducibilit e accuratezza sono risultate del 100 per tutte le combinazioni di primer indice campione Riferimenti Watson MS Cutting GR Desnick RJ Driscoll DA Klinger K et al 2004 Cystic fibrosis population carrier screening 2004 revision of American College of Medical Genetics mutation panel Genetics i
17. 83de1A A gt G 3659delC D110H A455E 2184insA S1196X R117C 1525 1G gt A 2184delA W1204X c 3611G gt A R117H S466X C gt A 2307insA W1204X c 3612G gt A Y122X 5466X C gt G L732X 3791delC 574delA L467P 2347delG 3849 10kbC gt T 621 1G gt T 1548delGt R764X G1244E 663delT 5489X 2585delT 3876delA G178R S492F E822X S1251N 711 1G gt T Q493X 2622 1G gt A 3905insT 711 3A gt G 1507del E831X W1282X 711 5 G gt A F508del W846X 4005 1G gt A 712 1 G gt T 1677delTA R851X N1303K H199Y V520F 2711delT 4016insT P2055 Q525X 2789 5G gt A Q1313X L206W 1717 8G gt A Q890X 4209TGIT gt AA Q220X 1717 1G gt A L927P CFTRdele22 23 852de122 G542X S945L 4382delA 1078delT S549R c 1645A gt C 3007delG 1506V G330X S549R c 1647T gt G G970R 1507V R334W S549N 3120G gt A F508C 1336K G551D 3120 1G gt A t Classificato nel database CFTR2 come una variante che causa la fibrosi cistica mentre Sosnay classifica la variante come indeterminata La classificazione in base al database pi attuale e riflette l analisi funzionale completa che non era disponibile al tempo della pubblicazione di Sosnay Gennaio 2014 N codice 15038347 Rev A ITA 3 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant Principi della procedura Il saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant Illumina comporta due procedure principali La prima consiste nel preparare manualmente i campioni per il sequenziamento un operazione detta preparazione della libreria La preparazione della libreria consist
18. A genomico e miscelati con campioni di DNA genomico umano di genotipo wild type a numero di copie equivalenti per imitare un campione eterozigote I risultati di genotipizzazione per 137 siti di SNV piccoli Indel inclusa la regione PolyTG PolyT sono stati confrontati con l analisi bidirezionale delle sequenze di Sanger Sono stati usati due saggi convalidati basati sulla PCR come metodo di riferimento per due ampie delezioni nel pannello Ciascun saggio di duplex PCR ha utilizzato due gruppi di primer per discriminare tra genotipi wild type eterozigote e omozigote Uno dei gruppi di primer stato progettato per affiancare i punti di rottura delle delezioni mentre l altro gruppo ha amplificato una regione interna alla delezione I due prodotti sono stati rilevati mediante separazione in base alla dimensione su un gel di agarosio I saggi PCR sono stati convalidati usando un pannello di 28 campioni in tutto 22 campioni per ciascuna delezione che consiste di campioni di DNA genomico di linee cellulari e derivati dal sangue e plasmidi sintetici che hanno incluso i genotipi WT HET e HOM per ciascuna ampia delezione stato confermato che i saggi PCR presentano una specificit e una riproducibilit del 100 per tutti i campioni testati mediante la valutazione dei prodotti della PCR su un gel di agarosio L accuratezza dei saggi PCR stata confermata usando il sequenziamento Sanger ed stata del 100 per tutti i campioni L accuratezza stata
19. CIC CIRCE saem m 6 6 6 se sof o o im w m a sesamo sio 6 e en sslsa 0 0 xe im m so ojojoj o o no x sw rome so jejej 6 sso sa o o w w x 3 mosen so 6 6 e ss sa o 0 sm 0 o mexem w elelejmj wj w o o mw w m 41 N codice 15038347 Rev A ITA Gennaio 2014 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant Identificazioni con Identificazioni con N di Identifica pg e ma vai N di N di Concor Concor Concor di Pan Wg zioni EA wild type identifica identifica danza danza danza cam Genotipo del campione Varianti i e SIE in i 4 nello noi totali per zioni zioni non positiva negativa complessiva pioni Pe Cen Cen Cen Cen Cen Cen e usa e e e A tro tro tro tro tro tro FES x i s 1 2 3 1 2 3 as o o m o se o o odaja 0 0 so mm men O w 6 e mis em o 0 m 10m F508del 3849 10kbC gt T 810 12 12 12 798 798 798 100 100 HET n 00 gt m 00 gt F508del 3659delC 810 12 12 12 798 798 798 100 100 HET 6 secon so 6 6 on am feo o o x sa w 42 N codice 15038347 Rev A ITA Gennaio 2014 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant Identificazioni con Identificazioni con N di Identifica sno piis ia Seggi N di N di Concor Concor Concor di Pan 7 Pe zioni VARENA wild type identifica identifica danza danza danza cam Genotipo del campione Varianti i BoF SEZ ini
20. Cystic Fibrosis 139 Variant Scatola 5 Tabella 9 Scatola 5 Reagenti pre amplificazione Component ee Volume di Ingredienti attivi Om ponente DX 102 1003 DX 102 1004 riempimento 8 Piastra filtro 20 piastre 2 piastre N D Piastra di microtitolazione in polipropilene con una membrana di polietersulfone modificata Tabella 10 Scatola 5 Reagenti post amplificazione Componente Dudi volante di Ingredienti attivi DX 102 1003 DX 102 1004 riempimento Tampone di 10 provette 1 provetta 4 8 ml Soluzione acquosa eluizione tamponata Tampone di 10 provette 1 provetta 3 5 ml Soluzione acquosa conservazione della tamponata libreria Reagenti richiesti non forniti Reagenti pre amplificazione e 10 N NaOH preparare da compresse o con una soluzione standard e Tampone TE e Acqua priva di DNasi e priva di RNasi Reagenti post amplificazione e 10 N NaOH preparare da compresse o con una soluzione standard e Etanolo 200 proof vol 100 per biologia molecolare e Tampone TE e Acqua priva di DNasi e priva di RNasi Conservazione e manipolazione 1 Per temperatura ambiente si intende la temperatura compresa fra 15 C e 30 C Conservazione tra2 Ce8 C Conservazione tra 15 C e 30 C Conservazione tra 15 C e 30 C tra 15 C e 30 C 2 Ireagenti elencati di seguito sono spediti congelati e rimangono stabili se conservati a una temperatura fra 25 C e 15 C fino alla data di scadenza specificata Pool
21. L et al May 2009 Development of Genomic Reference Materials for Cystic Fibrosis Genetic Testing Journal of Molecular Diagnostics 11 3 186 193 17 Amos J Feldman GL Grody WW Monaghan K Palomaki GE et al 2008 Edition Revised 03 2011 American College of Medical Genetics Standards and Guidelines for Clinical Genetic Laboratories 18 Rehm HL Bale SJ Bayrak Toydemir P Berg JS Brown KK Deignan JL et al 2013 ACMG clinical laboratory standards for next generation sequencing Genetics in Medicine Genetics in Medicine 15 9 733 747 Brevetti e marchi registrati Questo documento e il suo contenuto sono di propriet di Illumina Inc e delle aziende a essa affiliate Illumina e sono destinati esclusivamente a uso contrattuale da parte dei clienti di Illumina per quanto concerne l utilizzo dei prodotti qui descritti con esclusione di qualsiasi altro scopo Questo documento e il suo contenuto non possono essere usati o distribuiti per altri scopi e o in altro modo diffusi resi pubblici o riprodotti in alcun modo senza preventiva approvazione scritta da parte di Illumina Mediante questo documento Illumina non trasferisce alcuna licenza sui propri diritti su brevetti marchi di fabbrica copyright o diritti secondo il diritto consuetudinario n alcun diritto similare di alcun terzo Al fine di assicurare un uso sicuro e corretto dei prodotti qui descritti le istruzioni riportate in questo documento devono essere scrupolosamente ed es
22. La posizione del wild type corrispondente alla variante N1303K per un replicato ha prodotto una mancata identificazione a causa della copertura insufficiente Un replicato dei campioni 5 e 75 ha registrato una percentuale di identificazione dello 0 Ulteriore investigazione indica che i campioni potrebbero non essere stati aggiunti alla piastra campioni prima della preparazione della libreria perch i volumi dei campioni rimanenti nelle provette erano coerenti con nessun volume rimosso Evidenze empiriche indicano che probabilmente i campioni 9 e 10 sono stati scambiati dall operatore prima della preparazione della libreria Concor danza negativa 100 100 100 100 99 88 Concor danza complessiva 100 100 100 100 99 88 5 La posizione del wild type corrispondente alla variante M1V per un replicato di ciascuno dei due campioni ha prodotto una mancata identificazione a causa della copertura insufficiente 46 N codice 15038347 Rev A ITA Gennaio 2014 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant Tabella 19 Informazioni aggiuntive sulle varianti dello studio di riproducibilit ia Tipo di variante pieni BEME PolyTG PolyT DIV composto Introne 9 CFTR dele2 3 Introne1l Introne3 1507del DIV Esone 11 2143delT DIV Esone 14 3876delA DIV Esone 23 R75X SNV Esone 3 E92X SNV Esone 4 L206W SNV Esone 6 R334W SNV Esone 8 47 N codice 15038347 Rev A ITA Gennaio 2014 Saggio MiSeqDx Cystic Fi
23. N codice 15038347 Rev A ITA Gennaio 2014 20 21 22 23 24 Note s 1 W Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant Durante la fase di normalizzazione della libreria estremamente importante risospendere completamente il pellet di microsfere della libreria Questo fondamentale per ottenere una densit dei cluster omogenea sulla cella a flusso MiSeqDx Rispettare i tempi di incubazione specificati per la fase di normalizzazione della libreria Un incubazione inadeguata pu influire sulla rappresentazione della libreria e sulla densit dei cluster A causa del numero di trasferimenti della piastra e della conseguente potenziale contaminazione importante fare molta attenzione per assicurare che il contenuto dei pozzetti rimanga totalmente al loro interno Non far schizzare il contenuto L input di DNA di 250 ng raccomandato permette la variazione della quantit del DNA le prestazioni del saggio si basano su questo livello di input Le varianti del campione indicate come No call Nessuna identificazione sul report del test indica che i dati per quella posizione della variante non corrisponde alle soglie di sequenziamento Le varianti indicate come No call Nessuna identificazione non devono essere riportate a meno che il test ripetuto fornisca valori che corrispondono alle soglie definite e non siano pi indicate come No call Nessuna identificazione ulle procedure Illumina ritiene necessario che per ogni corsa
24. TCACGAC Primer indice 2 A702 ACAGTGGT Primer indice 3 A703 CAGATCCA 14 N codice 15038347 Rev A ITA Gennaio 2014 Primer indice Sequenza Primer indice 4 A704 ACAAACGG Primer indice 5 A705 ACCCAGCA Primer indice 6 A706 ANAGGEGITE Primer indice 7 A707 CCCAACCT Primer indice 8 A708 CACCACAC Primer indice 9 A709 GAAACCCA Primer indice 10 A710 TGIGACCA Primer indice 11 A711 AGGGICAA Primer indice 12 A712 AGGAGTGG Istruzioni per l uso Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant Preparazione del foglio campioni per MiSeqDx 1 g Nella schermata Welcome Benvenuto di Worklist Manager Illumina selezionare Create Worklist Crea lista di lavoro Nel campo Test Type Tipo di test selezionare CF 139 Variant Assay Saggio CF 139 V ariant Nel campo Worklist Name Nome lista di lavoro immettere il nome per il foglio campioni Se per il nome del foglio campioni viene utilizzato l ID alfanumerico del codice a barre della cartuccia di reagenti il software operativo MiSeq MOS trover automaticamente il foglio campioni Se per il foglio campioni viene utilizzato un qualsiasi altro nome il pulsante Browse Sfoglia nel software operativo MiSeq MOS pu essere utilizzato per trovare il foglio campioni corretto Opzionale Immettere una descrizione per identificare la corsa Assicurarsi che la data corrisponda alla data di inizio della corsa Selezionare Next Avanti Inserimento informazioni sui ca
25. a di queste varianti da una prospettiva clinica funzionale e genetica ha prodotto 134 varianti univoche causanti la fibrosi cistica a 129 posizioni genomiche univoche poich per cinque posizioni due cambiamenti del nucleotide appaiono sulla stessa posizione attualmente contenute nel database CFTR2 ad agosto 2013 L uso di un pannello comprendente tutte queste varianti si prevede che equivalga al 95 4 degli alleli che causano la fibrosi cistica e mediante il rilevamento di entrambi gli alleli aumenta a circa il 91 l identificazione di coppie a rischio rispetto al 72 usando il pannello di 23 varianti raccomandato dall ACMG American College of Medical Genetics Varianti del gene CFTR nel pannello Le varianti riportate dal saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant sono state specificatamente scelte perch rappresentano il gruppo completo di varianti convalidate clinicamente classificate come causanti la fibrosi cistica nel database CFTR2 presso la Johns Hopkins University un prodotto dell iniziativa di CFTR2 Clinical and Functional Translation of CFTR 2 N codice 15038347 Rev A ITA Gennaio 2014 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant Il saggio testa 134 varianti che causano la fibrosi cistica una variante del pannello raccomandata dall ACMG R117H classificata come mutazione di varie conseguenze cliniche MVCC da CFTR2 una variante modificante riportata condizionatamente PolyTG PolyT e tre varianti benigne riportate
26. a in diversi gruppi etnici negli Stati Uniti Gruppo etnico Frequenza del portatore osservata Afroamericano 1 su 84 Ebrei aschenaziti 1su29 Asiatico 1 su 242 Caucasico 1 su 28 Ispanico 1su59 Ebreo 1 su 32 Medio orientale 1su91 Nativo americano 1su70 Sudasiatico 1su118 Altra etnia 1 su 111 gt 1 etnicit 1 su 34 Parte afroamericano 1 su 56 Parte caucasico 1 su 32 Parte ispanico 1 su 51 Non fornito 1 su 37 Tutti gli individui 1 su 38 Panoramica del progetto CFTR2 Il progetto CFTR2 un iniziativa internazionale guidata da un team di ricercatori e medici e supportata dal National Institute of Health e dalla fondazione statunitense Cystic Fibrosis Foundation 1112 CFTR2 mira a fornire informazioni complete e riviste da esperti sulle varianti funzionali e cliniche del gene CFTR In uno sforzo per convalidare clinicamente tutte le varianti CF con frequenze alleliche di 0 01 e di percentuali superiori 25 archivi e cliniche CF da tutto il mondo hanno unito le proprie risorse con lo scopo di confrontare le informazioni cliniche di pi di 39 000 pazienti affetti da fibrosi cistica con circa 1 900 varianti del gene CF che sono stati registrati negli anni nel database CFTRI dell ospedale Hospital for Sick Children di Toronto 1113 Le caratteristiche cliniche come concentrazione di cloro nel sudore FEVI1 prevista e stato del pancreas sono stati analizzati assieme alle informazioni del genotipo CFTR L approccio sistematico di analisi simultane
27. a piastra LNP dal supporto magnetico e lavare le microsfere con il lavaggio di normalizzazione della libreria come segue a Dispensare 45 u di lavaggio di normalizzazione della libreria in ciascun pozzetto contenente il campione b Sigillare la piastra LNP e agitare su un agitatore per micropiastre a 1 800 rpm per 5 minuti Gennaio 2014 N codice 15038347 Rev A ITA 19 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant c Posizionare la piastra sul supporto magnetico per un minimo di 2 minuti o finch il surnatante limpido d Rimuovere attentamente e smaltire il surnatante 7 Ripetere la procedura di lavaggio di normalizzazione della libreria come descritto nella fase precedente 8 Utilizzare una pipetta multicanale P20 impostata su 20 ul per rimuovere l eccesso di lavaggio di normalizzazione della libreria 9 Rimuovere la piastra LNP dal supporto magnetico e dispensare 30 ul di 0 1 N di NaOH in ogni pozzetto 10 Sigillare la piastra LNP e agitare su un agitatore per micropiastre a 1 800 rpm per 5 minuti 11 Durante l eluizione di 5 minuti impostare una nuova piastra PCR con 96 pozzetti di seguito definita piastra SGP 12 Dispensare 30 ul di tampone di conservazione della libreria a ciascun pozzetto da usare nella piastra SGP 13 Dopo l eluizione di 5 minuti assicurarsi che tutti i campioni nella piastra LNP siano completamente risospesi Se i campioni non sono completamente risospesi pipettare delicatamente i campioni su e gi oppure battere d
28. al minimo le distorsioni dovute all incorporazione Le identificazioni delle basi vengono effettuate direttamente dalle misurazioni dell intensit del segnale durante ogni ciclo di sequenziamento Il risultato finale un sequenziamento base per base Analisi dei dati MiSeq Reporter elabora le identificazioni delle basi generate durante l analisi primaria e produce informazioni su ciascun campione in base alle informazioni specificate nel foglio campioni questa elaborazione si chiama analisi secondaria L analisi secondaria include de multiplex generazione di file FASTO allineamento identificazione delle varianti e generazioni di file VCF che contengono le informazioni relative alle varianti del gene CFTR individuate in posizioni specifiche in un genoma di riferimento e Demultiplex il de multiplex costituisce la prima fase dell analisi se nel foglio campioni sono elencati pi campioni e la corsa presenta letture indici Il demultiplex separa i dati da un pool di campioni in base agli indici sequenza univoci che sono stati aggiunti durante la fase di amplificazione mediante PCR e Generazione di file FASTO dopo il de multiplex MiSeq Reporter genera file intermedi in formato FASTO un formato di testo utilizzato per rappresentare le sequenze I file FASTO contengono le letture di ciascun campione e i punteggi qualitativi con l esclusione delle letture dei cluster che non hanno attraversato il filtro e Allineamento mediante l allineamento p
29. ale Sanger 37 N codice 15038347 Rev A ITA Gennaio 2014 Saggio MiSegDx M Cystic Fibrosis 139 Variant Il conteggio totale dei campioni per la variante PolyTG PolyT 448 perch tutti i campioni sintetici n 52 sono stati creati mescolando plasmidi linearizzati con uno o due campioni della linea cellulare Poich riportando la variante PolyTG PolyT per questi campioni sintetici aggiuntivi la variante verrebbe riportata eccessivamente i campioni sintetici sono stati esclusi da questa analisi 38 N codice 15038347 Rev A ITA Gennaio 2014 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant Riproducibilit La riproducibilit del sistema per fibrosi cistica MiSeqDx stata determinata mediante uno studio condotto in cieco in tre centri di sperimentazione con due operatori per ciascun centro Due pannelli ben caratterizzati di 46 campioni ciascuno sono stati testati da ciascun operatore in ciascun centro per un totale di 810 identificazioni per centro I panelli erano costituiti da una miscela di DNA genomico proveniente da linee cellulari linfoblastoidi con varianti note nel gene CFTR oltre che da sangue deleucocitato con aggiunta di linee cellulari linfoblastoidi con varianti note nel gene CFTR I campioni di sangue servivano per consentire l incorporazione delle fasi di estrazione necessarie per preparare il gDNA utilizzato come input primario per il flusso di lavoro del saggio La percentuale dei campioni pass vale a dire il numero di ca
30. anza negativa N di N di Dondi Conor Cono Pan Ndi c tipo del Varianti zioni varianti wild type identifica identifica danza danza danza nello toa dr i sc totali per Cen Cen Cen Cen Cem Cen zioni zioni non LOST mv complessiva centro t t io tro id tro errate riuscite 1 2 3 x 2 3 B 621 1G gt T A455E 810 12 12 12 798 798 798 100 100 100 HET s a wmon an e 66 eli sa o o w w w OICR EC DI DICCI CIRO CI B R117H F508del HET TG 10 100 1 9 TG 12 1 5 B 27895GA HOM 27895GA HOM B CFTR dele2 3 F508del 12 12 12 798 797 798 99 96 99 96 HET B F508del 1898 1G gt A 12 12 12 798 798 798 i N Ml IRE OE n 45 N codice 15038347 Rev A ITA Gennaio 2014 Saggio MiSegDx M Cystic Fibrosis 139 Variant P N di do cam Genotipo del campione PETA pioni B 89 F508del 2143delT HET B 90 3905insT HET B 91 394delTT HET B 92 F508del HET totali Varianti Identifica zioni totali per centro 810 810 810 810 74556 Identificazioni con concordanza positiva Cen tro 1 12 varianti Cen tro 2 12 2209 Cen tro 12 Identificazioni con concordanza negativa Cen tro 798 804 804 804 Cen tro 2 798 804 804 804 221182 wild type Cen tro 798 804 804 804 N di identifica zioni errate N di Concor identifica danza zioni non positiva riuscite 0 100 0 100 0 100 0 100 273 99 77
31. aria a temperatura ambiente per circa un ora o fino a completo scongelamento Rimuovere la cartuccia dal bagnomaria e batterla delicatamente sul banco per far fuoriuscire l acqua in eccesso dalla base Asciugare la base della cartuccia Verificare che sulla parte superiore della cartuccia di reagenti non sia caduta dell acqua Ispezione della cartuccia di reagenti 1 Capovolgere la cartuccia dieci volte per miscelare i reagenti scongelati e poi ispezionare visivamente tutti i serbatoi per accertarsi che siano scongelati NOTA E fondamentale che i reagenti nella cartuccia siano scongelati completamente e miscelati per assicurare il sequenziamento corretto Ispezionare visivamente il reagente nella posizione 1 per accertarsi che sia ben miscelato e privo di precipitati Battere delicatamente la cartuccia sul banco per ridurre le bolle d aria nei reagenti NOTA I tubi dei pescanti del MiSeqDx vanno fino al fondo di ciascun serbatoio per aspirare i reagenti per questa ragione importante che i serbatoi non contengano bolle Riporre la cartuccia in ghiaccio o conservarla a una temperatura compresa tra 2 C e 8 C fino a 6 ore finch non si pronti a impostare la corsa Per risultati ottimali procedere direttamente caricando il campione e impostando la corsa Preparazione dei campioni per il sequenziamento 1 I A UO N Portare il tampone di diluizione libreria a temperatura ambiente Agitare il tampone di diluizione librer
32. azione del saggio Descrizione clinica La fibrosi cistica CF una delle malattie genetiche pi comuni nel mondo occidentale ed la malattia autosomica recessiva potenzialmente letale pi comune nella popolazione bianca non ispanica La fibrosi cistica incide sulla viscosit delle secrezioni mucose e influenza l epitelio del tratto respiratorio del pancreas dell intestino del sistema epatobiliare del tratto genitale maschile nonch le ghiandole sudoripare causando una complessa patologia multisistemica e multiorgano 6 nella quale i polmoni sono il sistema d organi principalmente associato a morbilit e mortalit 8 In molti casi un declino nutrizionale preannuncia una progressione della malattia polmonare dovuta alla fibrosi cistica pertanto un elemento fondamentale delle attuali strategie di intervento la diagnosi precoce tramite screening neonatale che favorisce un accesso tempestivo ai servizi medici fondamentali e consente di ottenere il miglior risultato possibile per gli individui affetti dalla patologia Bench vi siano differenze tra i sessi per quanto riguarda la sopravvivenza e venga riferita una sopravvivenza mediana superiore per gli uomini rispetto alle donne negli Stati Uniti la sopravvivenza mediana generale di 38 3 annis Varianti del gene CFTR e incidenza Il gene regolatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica CFTR identificato nel 1989 si trova sul braccio lungo del cromosoma 7 e contie
33. base alle relative sequenze per conservare il bilanciamento cromatico nei canali verde e rosso Vedere la Tabella 13 e la Tabella 14 Come requisito minimo le corse con 8 o 48 campioni devono includere una combinazione di primer di indicizzazione identificata nella Tabella 12 Per elaborare in maniera accurata corse pi piccole devono essere presenti almeno otto campioni Se non sono disponibili sei campioni univoci esclusi i controlli positivi e negativi accettabile completare la corsa con replicati o qualsiasi campione di DNA genomico umano Per il set minimo di indici bilanciati per colore da usare nelle corse di sequenziamento a 8 campioni vedere la Tabella 12 Tabella 12 Combinazioni primer indice per corse di sequenziamento a 8 campioni Primer indice 1 A701 Primer indice 2 A702 Primer indice 10 A710 Primer indice C A503 Campione 1 Campione 2 Campione 3 Primer indice D A504 Campione 4 Campione 5 Campione 6 Primer indice E A505 Campione 7 Campione 8 Sequenze dei primer indice Tabella 13 Sequenze per Primer indice A A501 H A508 Primer indice Sequenza Primer indice A A501 TGAACCTT Primer indice B A502 TGCTAAGT Primer indice C A503 TGTTCTCT Primer indice D A504 TAAGACAC Primer indice E A505 CTAATCGA Primer indice F A506 CTAGAACA Primer indice G A507 TAAGTTCC Primer indice H A508 TAGACCTA Tabella 14 Sequenze per Primer indice 1 A701 12 A712 Primer indice Sequenza Primer indice 1 A701 A
34. brosis 139 Variant akio Tipo di variante DES SELE A455E SNV Esone 10 Q493X SNV Esone 11 1717 1G gt A SNV Introne 11 G542X SNV Esone 12 S549N SNV Esone 12 S549R c 1647T gt G SNV Esone 12 G551D SNV Esone 12 R553X SNV Esone 12 R560T SNV Esone 12 1812 1 G gt A SNV Introne 12 1898 1G gt A SNV Introne 13 W846X SNV Esone 15 2789 5G gt A SNV Introne 16 3120 1G gt A SNV Introne 18 3272 26A gt G SNV Introne 19 Y1092X C gt A SNV Esone 20 M1101K SNV Esone 20 R1158X SNV Esone 22 R1162X SNV Esone 22 3849 10kbC gt T SNV Introne 22 W1282X SNV Esone 23 N1303K SNV Esone 24 DIV un acronimo per Deletion Insertion Variant variante delezione inserzione Estrazione del DNA Tre diversi metodi di estrazione usati comunemente e disponibili in commercio estrazione mediante microsfere magnetiche precipitazione alcolica e isolamento mediante colonna di gel di silice sono stati valutati utilizzando sangue intero anticoagulato in EDTA Nello studio sono stati utilizzati complessivamente 14 campioni di sangue univoci che rappresentavano i wild type e i tre genotipi mutanti tre campioni con F508del un campione con I506V e un campione con D110H I tre metodi di estrazione del DNA sono stati analizzati indipendentemente da due diversi operatori e ciascuno di loro ha eseguito tre corse per ciascun metodo di estrazione Ciascuna estrazione stata eseguita da ciascun operatore in giorni diversi La concentrazione di DNA e il rapporto A260 A280 dei ca
35. che aggiungono sequenze di indici per il multiplex campioni oltre a comuni adattatori necessari per la generazione di cluster su MiSeqDx Al termine di questo processo una procedura di pulizia della PCR purifica i prodotti della PCR indicati come libreria D Normalizzazione della libreria la fase finale consiste nel normalizzare la quantit di ciascuna libreria onde garantire una rappresentazione pi equilibrata nel pool finale di librerie Al termine di questo processo il pool di librerie viene caricato su MiSeqDx per il sequenziamento mediante la chimica SBS Sequenziamento La chimica SBS utilizza un metodo che fa uso di terminatori reversibili per rilevare le singole basi nucleotidiche man mano che vengono incorporate in filamenti di DNA crescenti Durante ciascun ciclo di sequenziamento alla catena dell acido nucleico viene aggiunto un solo deossinucleotide trifosfato ANTP marcato in fluorescenza Il nucleotide 4 N codice 15038347 Rev A ITA Gennaio 2014 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant marcato funge da terminatore per la polimerizzazione cos dopo ogni incorporazione di dNTP il colorante fluorescente viene sottoposto a imaging al fine di identificare la base e quindi sottoposto a scissione enzimatica per consentire l incorporazione del nucleotide successivo Poich tutti e quattro i ANTP legati al terminatore reversibile A G T C sono presenti come molecole singole e separate la competizione naturale riduce
36. chiave dei simboli spediti con ciascun kit per un riferimento completo ai simboli che possono apparire sulla confezione e sull etichettatura del prodotto Gennaio 2014 N codice 15038347 Rev A ITA 52
37. condizionatamente 1506V 1507V F508C 4 per un totale di 139 varianti riportate Le 134 varianti che causano la fibrosi cistica corrispondono a 129 varianti che causano la fibrosi cistica contenute nel database CFTR2 Il database CFTR2 include cinque varianti che causano la fibrosi cistica per le quali lo stesso cambiamento nel livello della proteina pu verificarsi da due cambiamenti distinti del nucleotide ad es 5466X C gt A e 5466X C gt G Queste cinque varianti sono elencate in base al codone di aminoacido nel database CFTR2 ad es 5S466X mentre il saggio riporta ciascuna singola variante ad es 5466X C gt A e 5466X C gt G L elenco delle 139 varianti riportate dal saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant sono fornite nella Tabella 2 Tabella 2 Riepilogo delle varianti per il saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant prog p 88 q y Elencate in base alle coordinate genomiche Grassetto ACMG 23 Corsivo riportate condizionatamente 8 pP MIV T338I Q552X 3121 1G gt A CFTR dele2 3 1154insTC R553X 3272 26A gt G Q39X S341P A559T L1065P E60X R347H R560T R1066C P67L R347P R560K R1066H R75X R352Q 1811 1 6kb A gt G L1077P G85E 1213delT 1812 1 G gt A WI1089X 394delTT 1248 1G gt A E585X Y1092X C gt A 405 1 G gt A 1259insA 1898 1G gt A Y1092X C gt G 406 1G gt A WA01X c 1202G gt A 1898 3A gt G M1101K E92X WA01X c 1203G gt A 2143deIT E1104X E92K 1341 1G gt A R709X R1158X Q98X PolyTG PolyT K710X R1162X 457TAT gt G 1461ins4 21
38. determinata per ogni genotipo attraverso tre misurazione statistiche La concordanza positiva stata calcolata per ciascun genotipo di variante dividendo il numero di campioni con identificazioni di varianti concordanti per il numero totale di campioni con detta variante come identificata dai metodi di riferimento La concordanza negativa stata calcolata su tutte le posizioni wild type WT dividendo il numero di posizioni WT concordanti per il numero di posizioni WT come definiti dai metodi di riferimento La concordanza complessiva OA stata calcolata su tutte le posizioni riportate dividendo il numero di posizioni di WT e delle varianti concordanti per il numero di posizioni riportate come determinate dai metodi di riferimento Il saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant Illumina presenta una concordanza positiva PA a livello di genotipo del 100 La concordanza negativa NA per tutte le posizioni WT era gt 99 99 e la concordanza complessiva OA per tutte le posizioni riportate era gt 99 99 Tutti i risultati del test sono basati su test iniziali Gennaio 2014 N codice 15038347 Rev A ITA 25 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant Accuratezza complessiva del saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 V ariant Identificazioni positive varianti Identifica Identifica N di N di Concor Concor Concor Variante Tipo di Nome cDNA zioni Campio Campio Carpio zioni identificas identifica danza danza ginza Nome comune var
39. di oligonucleotidi per il saggio CF 139 Variant Tampone di ibridazione Miscela di estensione ligazione Primer indice A A501 H A508 Primer indice 1 A701 12 A712 8 N codice 15038347 Rev A ITA Gennaio 2014 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant PCR polimerasi Master Mix per PCR Diluente normalizzazione libreria Tampone di diluizione libreria Controllo interno PhiX Cartuccia di reagenti MiSeqDx saggio CF 139 Variant A eccezione della cartuccia di reagenti i reagenti rimangono stabili per un massimo di 6 cicli di congelamento scongelamento effettuati prima della data di scadenza specificata Non ricongelare la cartuccia di reagenti una volta scongelata Pu essere conservata per un massimo di 6 ore a una temperatura compresa tra 2 C e 8 C 3 Ireagenti elencati di seguito sono spediti refrigerati e rimangono stabili se conservati a una temperatura tra 2 Ce8 C fino alla data di scadenza specifica Tampone di lavaggio stringente Tampone di lavaggio universale Microsfere per la pulizia della PCR Microsfere libreria Lavaggio di normalizzazione della libreria Soluzione MiSeqDx SBS PR2 Saggio CF 139 Variant Cella a flusso MiSeqDx saggio CF 139 Variant 4 Ireagenti elencati di seguito sono spediti a temperatura ambiente e rimangono stabili se conservati a tale temperatura fino alla data di scadenza specificata Tampone di eluizione Piastra filtro Tampone di conservazione della libreria 5 Cambiamenti n
40. e una probabile tossina riproduttiva Per maggiori informazioni vedere Reagenti a pagina 6 L inalazione l ingestione il Gennaio 2014 N codice 15038347 Rev A ITA 11 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 contatto con la pelle o con gli occhi possono causare lesioni personali Smaltire i contenitori e i contenuti non utilizzati conformemente alle norme di sicurezza in vigore localmente Per informazioni contattare l Assistenza tecnica Illumina Alcuni componenti di questo saggio contengono 2 mercaptoetanolo un agente riducente Per maggiori informazioni vedere Reagenti a pagina 6 L inalazione l ingestione il contatto con la pelle o con gli occhi possono causare lesioni personali Utilizzarlo in un area ben ventilata e smaltire i contenitori e i contenuti non utilizzati conformemente alle norme di sicurezza in vigore localmente Per informazioni contattare l Assistenza tecnica Illumina Maneggiare tutti campioni come se fossero agenti potenzialmente infettivi Il mancato rispetto delle procedure descritte pu produrre risultati errati o una riduzione significativa della qualit del campione Adottare le normali precauzioni di laboratorio Non pipettare con la bocca Non mangiare bere o fumare nelle zone designate per il lavoro Manipolare i campioni e i reagenti del saggio indossando guanti e indumenti da laboratorio monouso Dopo aver maneggiato i campioni e i reag
41. e di quattro fasi principali ibridazione estensione ligazione amplificazione mediante PCR e normalizzazione della libreria La seconda procedura consiste nel sequenziare il campione preparato mediante la chimica SBS sequenziamento mediante sintesi su MiSeqDx Preparazione della libreria Sonda Regione di Sonda personalizzata 1 interesse personalizzata 2 iii Nt lf mM Sonda Sonda personalizzata 2 EC personalizzata 1 7 B O P7 Indice 1 Indice 2 PS P7 Indicel Indice 2 PS A Ibridazione la prima fase consiste nell ibridare un pool di oligonucleotidi a monte e a valle specifici per il saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant per il campione di DNA genomico Al termine di questo processo una procedura di lavaggio in tre fasi con un filtro in grado di selezionare le dimensioni rimuove gli oligonucleotidi non legati dal DNA genomico B Estensione ligazione la seconda fase collega gli oligonucleotidi a monte e a valle ibridati Una DNA polimerasi si estende dagli oligonucleotidi a monte fino alla regione target e successivamente si lega all estremit 5 dell oligonucleotide a valle mediante una DNA ligasi Il risultato consiste nella formazione di prodotti contenenti gli oligonudeotidi della fibrosi cistica specifici affiancati da sequenze necessarie per l amplificazione C Amplificazione mediante PCR la terza fase consiste nell amplificazione dei prodotti dell estensione ligazione mediante primer
42. e errate riuscite 100 SNV c 3717 12 500 11 2 487 100 100 191C gt T Gennaio 2014 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant Variante Tipo di P Nome cDNA Nome comune variante W1282X CFTR c 3964 78_ dele22 23 4242 577 del Q39X E92K c 325_327 Dia 711 3A gt G 712 1 G gt T Q220X 31 N codice 15038347 Rev A ITA delTATinsG Identificazioni positive varianti Identifica Identifica N di N di Concor Concor zioni 7 5 zioni identifica identifica danza danza 3 Campio Campio Campio j ta mia ra totali per Saa negative zioni zioni non positiva negativa iante i gt T wild type errate riuscite TARA dlinici cellulari sintetici i Concor danza complessiva 100 99 80 100 100 100 100 100 100 Gennaio 2014 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant Identificazioni positive varianti Identifica Identifica N di N di Concor Concor Concor Variante Tipo di zioni 7 A y zioni identifica identifica danza danza danza f Nome cDNA Campio Campio Campio j Fog ne va E Nome comune variante totali per ni ni lince ni negative zioni zioni non positiva negativa complessiva variante wild type errate riuscite clinici cellulari sintetici DIV CII2Z1 50 2 498 100 100 100 128insA WA401X SNV c 1203G gt A 50 1 499 100 100 100 c 1203G gt A l EEE 1259insA
43. elicatamente la piastra sul banco per risospendere le microsfere quindi agitare per altri 5 minuti 14 Posizionare la piastra LNP sul supporto magnetico per un minimo di 2 minuti 15 Trasferire il surnatante dalla piastra LNP alla piastra SGP Pipettare delicatamente su e gi 5 volte per miscelare 16 Sigillare la piastra SGP e centrifugare a 1 000 x g a 20 C per 1 minuto PUNTO DI ARRESTO SICURO Qualora non si proceda immediatamente alla creazione di un pool di librerie e al successivo 7 sequenziamento su MiSeqDx conservare la piastra SGP sigillata tra 25 C e 15 C per un massimo di 3 giorni Creazione di pool di librerie Preparazione del pool di librerie 1 Predisporre un blocco termico adatto a centrifugare provette da 1 5 ml a 96 C 2 Inun portaghiaccio preparare un bagno di acqua e ghiaccio Raffreddare il tampone di diluizione libreria nel bagno di acqua e ghiaccio 3 Cominciare a scongelare la cartuccia di reagenti MiSeqDx Preparazione di una soluzione di diluizione fresca di NaOH x ATTENZIONE L utilizzo di una soluzione di diluizione fresca di NaOH essenziale per denaturare completamente i n campioni in vista della generazione di cluster sul dispositivo MiSeqDx 1 Combinarei seguenti volumi in una provetta per microcentrifuga Acqua da laboratorio 900 ul 1 0 N di NaOH 100 pl 2 Capovolgere la provetta diverse volte per miscelare Denaturazione e diluizione del controllo interno PhiX 1 Combinare i seguenti
44. ell aspetto fisico dei reagenti forniti possono indicare un deterioramento dei materiali Non utilizzare i reagenti se si dovessero verificare tali cambiamenti ad es variazioni evidenti nel colore del reagente o opacit visibile con contaminazione microbica 6 Ireagenti del tampone di ibridazione tampone di lavaggio stringente e diluente normalizzazione libreria potrebbero formare precipitati o cristalli visibili Prima dell uso agitare energicamente quindi ispezionare a occhio nudo per accertarsi che non vi sia presenza di precipitati 7 Nella manipolazione delle microsfere per la pulizia della PCR e delle microsfere libreria attenersi alle migliori pratiche riportate di seguito Le microsfere non devono mai essere congelate Riportarle a temperatura ambiente Immediatamente prima dell uso agitarle bene finch sospensione e colore appaiono omogenei Dopo aver aggiunto le microsfere miscelare bene il campione pipettando su e gi dieci volte Per miscelare il campione possibile utilizzare un agitatore Incubare la miscela di microsfere campione a temperatura ambiente per tutta la durata indicata Seguire le istruzioni per l uso del supporto magnetico attendere che la soluzione diventi trasparente prima di aspirare Tenere la piastra sul supporto magnetico durante l aspirazione lenta del surnatante facendo attenzione a non toccare le microsfere separate 8 La piastra di amplificazione mediante PCR pu restare sul termociclatore per tutta
45. enti del saggio lavarsi bene le mani Non utilizzare i componenti del saggio oltre la data di scadenza indicata sull etichetta della confezione del saggio Non scambiare i componenti di diversi lotti di saggi I lotti di saggi sono identificati sull etichetta della confezione del saggio Conservare i componenti del saggio alla temperatura indicata e in aree designate per la pre amplificazione e la post amplificazione Cicli ripetuti di congelamento scongelamento fino a 6 dei componenti dalla scatola 1 non compromettono l integrit del saggio Onde evitare il degrado del campione o del reagente accertarsi che tutti i vapori di sodio ipoclorito si siano dissipati completamente prima di iniziare il protocollo necessario adottare idonee pratiche di laboratorio e una valida igiene per impedire la contaminazione di reagenti strumenti e campioni di DNA genomico con i prodotti della PCR La contaminazione da PCR pu produrre risultati inesatti e inaffidabili AI fine di prevenire la contaminazione accertarsi che le aree di pre amplificazione e post amplificazione siano dotate delle apposite attrezzature ad es pipette punte di pipette agitatori e centrifughe Evitare la contaminazione incrociata Utilizzare punte di pipette nuove fra un campione e l altro e fra le erogazioni di reagenti Miscelare i campioni con una pipetta e centrifugare la piastra ove indicato Non agitare le piastre L utilizzo di punte dotate di barriera aerosol riduce il
46. i pellet sul fondo della provetta quando quest ultima viene capovolta Procedura 1 Miscelare il diluente normalizzazione libreria e le microsfere libreria in una provetta conica fresca da 15 ml come segue NOTA Se si stanno analizzando meno di 24 campioni utilizzare una provetta nuova da 1 5 ml a Per 96 campioni dispensare 4 4 ml di diluente normalizzazione libreria b Pipettare le microsfere libreria su e gi 10 volte per risospendere di NOTA E fondamentale risospendere completamente il pellet di microsfere della libreria in fondo alla provetta L uso di una provetta P1000 garantisce che le microsfere vengano risospese in modo omogeneo e che non ci sia massa di microsfere sul fondo della provetta Questo fondamentale per ottenere una densit dei cluster omogenea sulla cella a flusso c Per 96 campioni pipettare 800 ul di microsfere libreria nella provetta contenente il diluente normalizzazione libreria d Miscelare capovolgendo la provetta 15 20 volte 2 Dispensare 45 pl della soluzione di lavoro di diluente normalizzazione libreria microsfere libreria combinata in ogni pozzetto della piastra LNP contenente le librerie 3 Sigillare la piastra LNP e agitare su un agitatore per micropiastre a 1 800 rpm per 30 minuti 4 Posizionare la piastra su un supporto magnetico per un minimo di 2 minuti o finch il surnatante scomparso 5 Con la piastra LNP sul supporto magnetico rimuovere attentamente e smaltire il surnatante 6 Rimuovere l
47. i polimorfismi o le varianti latenti nelle regioni che legano gli oligonucleotidi possono incidere sugli alleli sondati e di conseguenza sulle identificazioni effettuate 5 Il saggio non pu determinare se l orientamento della variante PolyTG PolyT si trova in cis trans sulla variante R117H Per i pazienti con una variante R117H dovrebbero essere eseguiti ulteriori test per determinare se una variante PolyTG PolyT che pu incidere sul fenotipo clinico ad es 12 13 TG o 5T in orientamento cis trans sulla variante R117H 6 PolyTG PolyT sono regioni omopolimeriche note per essere difficili da interpretare con saggi basati sulle sequenze dovuti a scivolamento della polimerasi stata osservata una percentuale di identificazioni errata dello 0 9 4 448 per i risultati PolyTG PolyT dimostrando una discrepanza 1 TG quando confrontato con il sequenziamento bidirezionale Sanger Tabella 17 Gennaio 2014 N codice 15038347 Rev A ITA 5 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant Componenti del prodotto La piattaforma MiSeqDx Illumina composta da e saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant N di catalogo DX 102 1004 or DX 102 1003 e Strumento MiSeqDx N di catalogo DX 410 1001 Reagenti Reagenti forniti I reagenti per il saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant Illumina sono forniti da Illumina Il n catalogo DX 102 1003 stato configurato per 20 corse con un massimo di 48 campioni per corsa fino a 960 campioni
48. ia energicamente e assicurarsi che tutti i precipitati si siano completamente sciolti Se la piastra SGP stata conservata congelata scongelarla fino a raggiungere la temperatura ambiente Centrifugare la piastra SGP a 1 000 x g a 20 C per 1 minuto Predisporre una provetta Eppendorf nuova d ora in avanti indicata come provetta PAL Determinare i campioni da raggruppare in pool per il sequenziamento Per il sequenziamento possibile utilizzare al massimo 48 campioni contemporaneamente Se la piastra SGP stata conservata congelata mescolare ciascuna libreria da sequenziare pipettando su e gi per 3 5 volte Trasferire 5 ul di ciascuna libreria da sequenziare dalla piastra SGP colonna per colonna a una striscia a otto provette per PCR Sigillare l SGP con un sigillo adesivo per piastre e metterla da parte 4 NOTA Dopo l uso conservare la piastra SGP fra 25 C e 15 C La piastra SGP sigillata rimane stabile per un massimo di 3 giorni Gennaio 2014 N codice 15038347 Rev A ITA 21 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Combinare e trasferire il contenuto della striscia a otto provette per PCR nella provetta PAL Miscelare energicamente la provetta PAL Predisporre una provetta Eppendorf nuova d ora in avanti indicata come provetta DAL Dispensare 585 ul di tampone di diluizione libreria nella provetta DAL Dispensare 6 ul di controllo interno PhiX 20 pM nella provetta DAL Pi
49. iante totali per A Baa P negative zioni zioni non positiva negativa complessiva iant i Ta 7 wild rrat riuscit VARIANTE dinici cellulari sintetici type SESTO dai 2 i CFTR DEL c 54 5940_ 500 4 1 0 495 100 100 100 273 10250 dele2 3 deD1kb sn ansia m a 0 0 ee mo 406 1G gt A 100 R117H 26 N codice 15038347 Rev A ITA Gennaio 2014 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant Identifica Tdentificazioni positive varianti Identifica N di N di Concor Concor Concor Variante Tipo di zioni 7 S n zioni identifica identifica danza danza danza i Nome cDNA Campio Campio Campio j Fog ne di Nome comune variante totali per ni ni lince ni negative zioni zioni non positiva negativa complessiva variante wild type errate riuscite clinici cellulari sintetici 1078delT c 1022_1023 insTC 1154insTC 1548delG 27 N codice 15038347 Rev A ITA Gennaio 2014 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant Variante Tipo di P Nome cDNA Nome comune variante 1507del 1677delTA c 1545_1546 DIV delTA 1717 1G gt A S549N G551D A559T 1812 1 G gt A 28 N codice 15038347 Rev A ITA Identificazioni positive varianti Identifica Identifica N di N di Concor Concor zioni 7 5 zioni identifica identifica danza danza 3 Campio Campio Campio j ta mia ra totali per Sas negative zioni zioni non positiva
50. iastra a 96 pozzetti su 95 C 4 Preriscaldare un incubatore a 37 C 5 Creare la piastra campioni in base all immagine stampata da IWM Procedura 1 Impostare una nuova piastra PCR con 96 pozzetti si seguito definita piastra HYB 2 Aggiungere 5 ul di campione o controllo a 50 ng ul 250 ng totali ai pozzetti appropriati nella piastra HYB Seguire il layout della piastra generato per la corretta selezione dei pozzetti 3 Aggiungere 5 ul del pool di oligonucleotidi per il saggio CF 139 Variant a tutti i pozzetti contenenti il DNA genomico 4 Aggiungere 40 ul di tampone di ibridazione a ogni campione nella piastra HYB Pipettare delicatamente su e gi 3 5 volte per miscelare 5 Sigillare la piastra HYB e centrifugare 1 000 x g a 20 C per 1 minuto 6 Inserire la piastra HYB nel blocco preriscaldato a 95 C e incubare per 1 minuto 7 Ridurre la temperatura del blocco termico a 40 C e continuare a incubare fino a quando il blocco di calore raggiunge 40 C circa 80 minuti Il raffreddamento graduale essenziale per un ibridazione corretta pertanto per questo processo non si consigliano termociclatori per PCR con raffreddamento attivo ad es Peltier raffreddato termoelettricamente PUNTO DI ARRESTO SICURO Quando il blocco termico raggiunge i 40 C la piastra HYB stabile a una temperatura di 40 C per 2 f ore Rimozione degli oligonucleotidi non legati Preparazione 1 Portare la miscela di estensione ligazione il
51. icato un errore nel monitoraggio del campione oppure una registrazione errata dei primer di indicizzazione Il saggio deve essere ripetuto completamente a cominciare dalla preparazione delle librerie 2 Controllo negativo nessun templato nessun DNA l uso di un controllo negativo nessun templato nessun DNA richiesto su ciascuna corsa per rilevare possibili incidenze di contaminazione La percentuale di identificazioni per il controllo positivo deve essere di almeno il 10 Se un controllo negativo genera una percentuale di identificazioni di gt 10 potrebbe quindi essersi verificata una contaminazione durante l elaborazione del saggio Il saggio viene considerato non riuscito e deve essere ripetuto completamente a cominciare dalla preparazione delle librerie 3 Controllo wild type il campione di DNA di controllo raccomandato su ciascuna corsa Il campione di controllo wild type deve essere un campione ben caratterizzato che non contiene nessuna variante del gene CFTR Il campione di controllo positivo deve generare il genotipo previsto Se il controllo wild type genera un genotipo diverso da quello previsto significa che si verificato un errore nel monitoraggio del campione oppure una registrazione errata dei primer di indicizzazione Il saggio deve essere ripetuto completamente a cominciare dalla preparazione delle librerie 4 Prima di iniziare a usare questo prodotto nel laboratorio dell utente le prestazioni del saggio devono essere ve
52. ico necessario un blocco termico per una piastra da 96 pozzetti Il blocco termico deve soddisfare le seguenti specifiche di prestazione Sono accettabili i blocchi termici con coperchi riscaldati Intervallo di temperatura ambiente 5 C 99 C Regolazione della temperatura 0 1 C a 37 C 0 4 C a 60 C 2 Incubatore di campioni necessario un incubatore forno per ibridazione L incubatore deve soddisfare le seguenti specifiche di prestazione Intervallo di temperatura 10 C 100 C Regolazione della temperatura 0 2 C 3 Centrifuga da tavolo necessaria una centrifuga da tavolo in grado ci mantenere la temperatura di 20 C come specificato sopra nell area di post amplificazione necessaria un altra centrifuga Qualsiasi centrifuga per piastre che raggiunga le velocit previste dal protocollo da 280 a 2 400 x g accettabile 4 Pipette di precisione necessaria una serie di pipette di precisione come specificato sopra nell area di post amplificazione necessario un altro set L utilizzo di pipette di precisione necessario per assicurare un erogazione accurata di reagente e campione E possibile utilizzare sia pipette mono canale che multicanale se calibrate regolarmente e precise entro un margine del 5 del volume stabilito 5 Materiali di consumo sono necessari i seguenti materiali di consumo Piastre skirted per PCR a 96 pozzetti 0 2 ml polipropilene o equivalente NOTA assicurarsi che la
53. illumina Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO N catalogo DX 102 1004 2 corse fino a 96 campioni per kit N catalogo DX 102 1003 20 corse fino a 960 campioni per kit Uso previsto Il saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant Illumina un sistema diagnostico qualitativo in vitro per rilevare simultaneamente 139 varianti significative dal punto di vista clinico delle mutazioni che causano la fibrosi cistica e le varianti del gene regolatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica CFTR in DNA genomico isolato da campioni di sangue umaro periferico Le varianti includono quelle raccomandate nel 2004 dall American College of Medical Genetics ACMG e nel 2011 dall American College of Obstetricians and Gynecologists ACOG Il test previsto per lo screening di portatori negli adulti in et riproduttiva in analisi diagnostica di conferma nei neonati e nei bambini e come test iniziale per contribuire nella diagnosi di individui con sospetta fibrosi cistica I risultati di questo test devono essere interpretati da un gruppo di genetisti molecolari certificati o da un esperto equivalente e devono essere usati assieme ad altre informazioni cliniche e di laboratorio disponibili Questo test non indicato per la diagnosi neonatale la diagnosi prenatale l analisi pre impianto o per fini diagnostici indipendenti Il test deve essere usato sullo strumento MiSeqDx Illumina Riassunto e spieg
54. ioni NOTA k Maneggiare tutti campioni come se fossero agenti potenzialmente infettivi 1 Possono essere utilizzati campioni di sangue intero prelevati in provette K EDTA I campioni di sangue intero possono essere conservati per non pi di sette giorni a temperatura ambiente fino a 30 giorni a una temperatura compresa tra 2 C e 8 C o fino a 30 giorni se congelati tra 25 C e 15 C 3 Icampioni di sangue intero possono essere trasportati per non pi di sette giorni a temperatura ambiente fino a 30 giorni a una temperatura compresa tra 2 C e 8 C o fino a 30 giorni se congelati fra 25 C e 15 C Il trasporto di sangue intero deve essere conforme alle regolamentazioni nazionali federali statali o locali per il trasporto di agenti eziologici 4 Non sono stati osservati eventi avversi sulle prestazioni dei saggio allorch il DNA genomico stato sottoposto a sei cicli di congelamento scongelamento 5 Non sono stati osservati eventi avversi sulle prestazioni del saggio in presenza di campioni di sangue intero con elevati tassi di bilirubina colesterolo trigliceride EDTA o emoglobina Avvertenze e precauzioni a y ATTENZIONE La legge federale limita la vendita di questo dispositivo da parte o dietro prescrizione di un medico o di un medico autorizzato dalla legge dello stato in cui esercita ad usare o ad ordinare l uso del dispositivo 1 Alcuni componenti di questo saggio contengono formammide una ammide alifatica ch
55. iportata Nel caso di una variante F508del omozigote tre ulteriori basi wild type ad es varianti I506V I507V F508C che non sono state identificate nel campione sono state ulteriormente riportate Tabella 16 Accuratezza del saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant per I506V I507V e F508C Identificazioni positive varianti Identifica N di N di Concor Concor dan Variante Identifica pane sata sua Nome zioni totali Campio Campio zioni identifica identifica Concordanza danza za er variante ni linee ni negative wild zioni zioni non positiva negativa complessiva comune P cellulari sintetici type errate riuscite N di campioni N di campioni linee N di campioni N di identificazioni N di identificazioni non clinici cellulari sintetici errate riuscite accuratezza TG AT 7 TG 11 1 7 2 0 0 0 1 50 36 N codice 15038347 Rev A ITA Gennaio 2014 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant N di campioni N di campioni linee N di campioni N di identificazioni N di identificazioni non Genotipo PolyTGPolyT DI ita RIN ita dali oy clinici cellulari sintetici errate riuscite accuratezza D I campioni non sono stati analizzati nuovamente Uno dei risultati discordanti provenivano dallo studio di riproducibilit Il risultato PolyTG PolyT per il campione era concordante su tutti i 18 replicati ma discordante con il sequenziamento bidirezion
56. lla PCR a ogni pozzetto di campione della piastra CLP 5 Trasferire l intero prodotto per PCR dalla piastra AMP alla piastra CLP 6 Sigillare la piastra CLP e agitare su un agitatore per micropiastre a 1 800 rpm per 2 minuti 7 Incubare a temperatura ambiente senza agitare per 10 minuti 8 Posizionare la piastra su un supporto magnetico per un minimo di 2 minuti o finch il surnatante scomparso 9 Con la piastra CLP sul supporto magnetico rimuovere attentamente e smaltire il surnatante 10 Con la piastra CLP sul supporto magnetico lavare le microsfere come segue a Dispensare 200 pl di etanolo all 80 appena preparato in ogni pozzetto contenente il campione b Incubare la piastra sul supporto magnetico per un minimo di 30 secondi o finch il surnatante limpido c Rimuovere attentamente e smaltire il surnatante 11 Ripetere il lavaggio come descritto nella fase precedente 12 Utilizzare una pipetta multicanale P20 impostata su 20 ul per rimuovere l eccesso di etanolo 13 Rimuovere la piastra CLP dal supporto magnetico e asciugare all aria le microsfere per 10 minuti 14 Dispensare 30 u di tampone di eluizione in ciascun campione e agitare brevemente 15 Sigillare la piastra CLP e agitare su un agitatore per micropiastre a 1 800 rpm per 2 minuti Dopo l agitazione controllare che i campioni siano risospesi Altrimenti ripetere questo passaggio 16 Incubare a temperatura ambiente per 2 minuti 18 N codice 15038347 Rev A ITA Gennaio
57. mer per PCR con sequenze indice e adattatori di sequenziamento DNA polimerasi proprietaria tra 25 C e 15 C tra 25 C e 15 C tra 25 C e 15 C tra 25 C e 15 C tra 25 C e 15 C Soluzione acquosa tra 25 C e 15 C tamponata contenente sali e ANTP Ingredienti attivi Conservazione Soluzione acquosa tra 25 C e 15 C tamponata contenente sali 2 mercaptoetanolo e formammide Gennaio 2014 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant Componente ME o RI gt oane a Ingredienti attivi Conservazione DX 102 1003 DX 102 1004 riempimento diluizione libreria tamponata Controllo interno 1 provetta 1 provetta 10 ul Soluzione acquosa tra 25 C e 15 C PhiX tamponata contenente DNA genomico PhiX Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant Scatola 2 Tabella 5 Scatola 2 Reagenti post amplificazione Quantit Componente DX 102 1003 DX 102 1004 Indice Conservazione Cartuccia di reagenti 20 cartucce 2 cartucce Cartuccia monouso che contiene i reagenti per tra 25 C e 15 C MiSegDx saggio CF la generazione di cluster e il sequenziamento 139 Variant da utilizzarsi con MiSeqDx compresi formammide 2 mercaptoetanolo e DMSO lt 2 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant Scatola 3 Tabella 6 Scatola 3A Reagenti pre amplificazione Componente O M Ingredienti attivi Conservazione P DX 102 1003 DX 102 1004 riempimento S Tampone di lavaggio 10 flaconi 1 flacone 24
58. mpioni 1 Nella scheda Table Tabella o nella scheda Plate Piastra inserire le seguenti informazioni per ciascun pozzetto contenente campione a Sample ID ID campione inserire un ID campione univoco b Index 1 e Index 2 Indice 1 e Indice 2 specificare l adattatore dell indice che verr utilizzato per ogni Lettura indici Opzionale Per registrare informazioni pi dettagliate sui campioni inserire il nome e la descrizione di un campione Opzionale Per identificare i controlli sulla piastra selezionare Negative Negativo o Positive Positivo dal menu a discesa Control Controllo Andare alla scheda Plate Graphic Schema piastra e utilizzare l opzione Copy to Clipboard Copia in appunti o Print Stampa per acquisire un immagine della piastra campioni Selezionare Finish Fine Gennaio 2014 N codice 15038347 Rev A ITA 15 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant Ibridazione del pool di oligonucleotidi Preparazione 1 Portare a temperatura ambiente il pool di oligonucleotidi per il saggio CF 139 Variant il tampone di ibridazione i campioni di DNA genomici e il campione di controllo positivo 2 Inserire in unagitatore il pool di oligonucleotidi per il saggio CF 139 Variant e il tampone di ibridazione e agitare vigorosamente per assicurarsi che tutti i precipitati si siano completamente disciolti quindi centrifugare brevemente le provette per raccogliere il liquido 3 Impostare un blocco termico per p
59. mpioni che hanno superato la metrica QC al primo tentativo stato del 99 9 La concordanza positiva a livello di genotipo per tutte le varianti era del 99 77 La concordanza negativa per tutte le posizioni wild type era del 99 88 e la concordanza complessiva per tutte le posizioni riportate era del 99 88 Tutti i risultati del test sono basati su test iniziali Per lo studio di riproducibilit non sono Stati ripetuti test Tabella 18 Riproducibilit del saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant Identificazioni con Identificazioni con Identifica concordanza positiva concordanza negativa N di N di Conco Concor Concor Pan Nedi enotro del A Varianti zioni cicci wildtype identifica identifica danza danza danza nello ee ti aa i SER totali per Cen Cen Cen Cent Ca Cen zioni zioni non positiva negativa complessiva centro errate riuscite tro tro tro tro tro tro 1 2 3 1 2 3 A 1 5S549N HET 810 6 6 6 804 804 804 0 0 100 100 100 A DI 1812 1 G gt A HET 810 6 6 6 804 804 804 0 0 100 100 100 A 3 Q493X F508del HET 810 12 12 12 798 798 798 0 0 100 100 100 A 4 F508del 2184delA 810 12 12 12 797 798 798 0 da 100 100 100 HET A 54 Y122X R1158X HET 810 12 10 12 798 665 798 0 1354 94 44 94 44 94 44 A 6 F508del 2183A A gt G 810 12 112 12 798 798 798 0 0 100 100 100 HET 7 R75X HET 810 6 6 6 804 804 804 0 0 100 100 100 A 8 1507del F508del HET 810 12 12 12 798 798 798 0 0 100 100 100 39 N codice 15038347 Rev A ITA Ge
60. mpioni di gDNA estratto sono stati determinati usando spettrofotometria La dimensione complessiva del campione per ciascun Gennaio 2014 N codice 15038347 Rev A ITA 48 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant metodo di estrazione esaminato nello studio stato pari a 168 14 campioni x 2 operatori metodo di estrazione x 3 corse operatore x 2 replicati campioni di gDNA estratto Numero di HA ut Percentuale di 3 aiei Velocit di SOS Metodo di estrazione campioni apra Accuratezza campioni A identificazione ne analizzati first pass Precipitazione alcolica 168 100 100 100 Isolamento su colonna di gel di silice 168 100 100 100 Estrazione con microsfere magnetiche 168 100 100 100 La percentuale di campioni che presentano una percentuale di identificazione di gt 99 nella prima corsa DNA input Il range di input di DNA per la piattaforma del saggio MiSegDx Cystic Fibrosis 139 Variant Illumina stato valutato eseguendo uno studio di diluizione in serie usando 14 campioni di DNA rappresentativi che contenevano 16 varianti uniche del gene della fibrosi cistica Ciascun campione stato analizzato in duplicati a 9 livelli di input di DNA che andavano da 1250 ng a 1 ng 1250 ng 500 ng 250 ng 100 ng 50 ng 25 ng 10 ng 5 ng e 1 ng Per la determinazione dell accuratezza i genotipi dei campioni sono stati confrontati coni dati del sequenziamento bidirezionale Sanger mentre le delezioni sono state confrontate co
61. n Medicine 6 5 1 10 11 387 391 Committee on Genetics April 2011 The American College of Obstetricians and Gynecologists Committee Opinion Update on Carrier Screening for Cystic Fibrosis 486 1 4 Bobadilla JL Macek Jr M Fine JP Farrell PM 2002 Cystic Fibrosis A Worldwide Analysis of CFTR Mutations Correlation With Incidence Data and Application to Screening Human Mutation 19 575 606 Moskowitz SM Chmiel JF Sternan DL Cheng E Gibson RL et al 2008 Clinical practice and genetic counseling for cystic fibrosis and CFTR related disorders Genetics in Medicine 10 12 851 868 Moskowitz SM Chmiel JF Sternen DL Cheng E Cutting GR CFTR related disorders Pagon RA Bird TC Dolan CR Stephens K editors GeneReviews Seattle WA University of Washington 2008 Disponibile alla pagina Web www ncbi nlm nih gov books NBK1250 Online Aggiornato il 19 febbraio 2008 Katkin JP 2012 Cystic fibrosis Clinical manifestations and diagnosis Disponibile alla pagina Web www uptodate com Online 7 dicembre 2012 Farrell PM Rosenstein BJ White TB Accurso FJ Castellani C et al 2008 Guidelines for diagnosis of cystic fibrosis in newborns through older adults Cystic Fibrosis Foundation consensus report J Pediatr 153 2 S4 S14 Cystic Fibrosis Foundation Patient Registry Annual Data Report 2010 Cystic Fibrosis Mutation Database CFTR1 Disponibile alla pagina Web www genet sickkids on ca app Online agosto 2
62. n un saggio della PCR 1250 ng e 25 ng sono stati identificati come il legame superiore e inferiore per l input di DNA rispettivamente in quanto hanno ottenuto una percentuale di campioni first pass del 295 senza identificazioni errate 100 di accuratezza e percentuale di identificazione Gli input di DNA di 1250 ng 250 ng e 100 ng sono stati ulteriormente analizzati con 4 campioni di DNA rappresentativi e 20 replicati per ciascun livello di input di DNA per ciascun campione n 4x20 80 campioni mentre il legame inferiore di 25 ng stato analizzato con 14 campioni 20 replicati per ciascun campione n 14x20 280 campioni L accuratezza e la percentuale first pass dei campioni sono risultati pari al 100 a tutti i livelli di DNA input I risultati indicano che per produrre risultati accurati il saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant Illumina pu essere usato nel range di input di DNA da 1250 ng a 25 ng Sostanze interferenti Per valutare l impatto delle sostanze interferenti sul sistema per fibrosi cistica MiSeqDx Illumina le prestazioni del saggio sono state valutate in presenza e in assenza di potenziali sostanze interferenti Nello studio sono stati testati otto campioni di sangue intero inclusi tre campioni positivi CF con genotipi univoci Quattro sostanze interferenti endogene bilirubina colesterolo emoglobina e trigliceride sono state testate aggiungendole ai campioni di sangue prima dell estrazione del DNA I limiti di conce
63. ne 27 esoni codificanti distribuiti su oltre 230 kbt Un mRNA di 6 5 kb prodotto dall allele normale codifica il gene CFTR una proteina integrale di 1490 aminoacidi situata sulla membrana che funziona come canale di cloro regolato nelle cellule epiteliali di pi organi 5 Attualmente sono state descritte oltre 1900 varianti del gene CFTR Per la maggior parte si tratta di mutazioni puntiformi La variante del gene CFTR pi comune l allele F508del5 che rappresenta quasi il 70 di tutte le varianti del gene CFTR3 Tuttavia altre varianti comuni del gene CFTR spesso determinano un fenotipo CF e altre patologie correlate a CFTRS5 Gennaio 2014 N codice 15038347 Rev A ITA 1 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant La fibrosi cistica ha un incidenza di malattia stimata pari a un caso ogni 2 000 4 000 nati vivi e una prevalenza di circa 30 000 individui nella popolazione statunitense Si verifica in tutte le etnie e razze con frequenze diverse un caso ogni 3 000 caucasici un caso ogni 9 200 ispano americani un caso ogni 10 900 nativi americani un caso ogni 15 000 afroamericani e un caso ogni 31 000 asioamericani 6 La Tabella 1 fornisce le stime attuali della frequenza dei portatori della mutazione del gene CFTR in base all etnia negli Stati Uniti basate su una coorte di 364 890 individui testati per il portatore senza anamnesi familiare di fibrosi cistica Tabella 1 Frequenza generale del portatore della mutazione della fibrosi cistic
64. negativa iante gt T wild type errate riuscite PERAE clinici cellulari sintetici i Concor danza complessiva DIV c 1519_1521 500 4 2 0 494 100 100 100 delATC 100 100 100 100 100 100 Gennaio 2014 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant Identificazioni positive varianti Identifica Identifica N di N di Concor Concor Concor Variante Tipo di zioni 7 A y zioni identifica identifica danza danza danza f Nome cDNA Campio Campio Campio j Fog ne di Nome comune variante totali per ni ni lince ni negative zioni zioni non positiva negativa complessiva a il g 0 0 0 variante dinici cellulari in tid wild type errate riuscite 2184insA DIV c 2052_2 500 3 1 496 100 100 100 053insA 2307insA DIV c 2175_21 500 3 2 495 100 100 100 76insA Q890X 3120 1G gt A 29 N codice 15038347 Rev A ITA Gennaio 2014 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant Variante Nome comune R1066C W1089X M1101K R1162X S1196X 3849 10kbC gt T S1251N 30 N codice 15038347 Rev A ITA Identificazioni positive varianti Identifica Identifica N di N di Concor Concor Concor Tipo di zioni A n zioni identifica identifica danza danza danza Nome cDNA Campio Campio Campio variante totali per ni ni linee negative zioni zioni non positiva negativa complessiva variante dinici cellulari sineta wild typ
65. nello 5a totali per zioni zioni non positiva negativa complessiva pioni tio Cen Cen Cen Cen Cen Cen Ver de e i tro tro tro tro tro tro si i 1 2 3 1 2 3 F508del 1898 1G gt A 810 12 12 12 798 798 798 100 100 HET es m 00 HET s s aren so s 6 sw ss su 0 o x m s mmen mo e 6 6 ou ssa o x mm sv si ao 0 0 se se se o 0 No mm s ssi uo 00 0 se mja o 0 No w B al w me 0 0 so se se o no sm m 43 N codice 15038347 Rev A ITA Gennaio 2014 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant Identificazioni con Identificazioni con N di Identifica pg e ma vai N di N di Concor Concor Concor Pan vai Wg zioni EA wild type identifica identifica danza danza danza cam Genotipo del campione Varianti i e SIE in i 4 nello noi totali per zioni zioni non positiva negativa complessiva pioni Pe Cen Cen Cen Cen Cen Cen se tusei 0 e centro to tro Pea o irc ina errate uscite o o o 1 2 3 1 2 3 s es ao 0 se se se o o jm m s s menemn mo e 6 6 om ss sa 0 0 x mm B 100 67 S549R c 1647T gt G 810 804 804 804 100 100 HET e waan w eje smlm m o 0 mwi w xeen so 6 solm o o Mo 0_ 44 N codice 15038347 Rev A ITA Gennaio 2014 Saggio MiSegDxTM Cystic Fibrosis 139 Variant Identificazioni con Identificazioni con Identifica concordanza positiva concord
66. nnaio 2014 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant Identificazioni con Identificazioni con N di Identifica pg e ma vigne N di N di Concor Concor Concor di Pan 5 Wg zioni EA wild type identifica identifica danza danza danza cam Genotipo del campione Varianti i e SE ini 3 4 nello noi totali per zioni zioni non positiva negativa complessiva pioni do Cen Cen Cen Cen Cen Cen Dl dune 0 a tro tro tro tro tro tro si i i 1 2 3 1 2 3 A ge F508del W1282X 810 12 11 12 798 797 798 vai 97 22 99 96 99 92 HET A F508del 3849 10kbC gt T 810 12 12 12 798 798 798 100 100 HET voeon o ele e joi wijo o 0 o mo m 00 F508del 3659delC 810 12 12 12 798 798 798 100 100 HET 40 N codice 15038347 Rev A ITA Gennaio 2014 Saggio MiSegDxTM Cystic Fibrosis 139 Variant Identificazioni con Identificazioni con Identifica concordanza positiva concordanza negativa N di N di Dondi Conor Cono Pan Ndi RIE zioni varianti wildtype identifica identifica danza danza danza llo SANE Genotipo del campione Varianti totali per zioni zioni non ositiva negativa complessiva Pe pioni P Cen Cen Cen Cen Cen Cen ali P 5 P centro errate riuscite tro tro tro tro tro tro 1 2 3 1 2 3 A 19 621 1G gt T 711 1G gt T 810 12 12 12 798 798 798 100 100 100 HET A EE F508del R560T HET le 100 A F508del Y1092X C gt A 12 12 12 798 798 798 100 HET e PCI
67. ntrazione per ciascuna sostanza sono riportati nella tabella seguente Inoltre per valutare l interferenza risultante dalla raccolta del sangue prelievo breve EDTA stato aggiunto ai campioni di sangue e per valutare l interferenza risultante dalla preparazione dei campioni il tampone di lavaggio finale ottenuto mediante un metodo di isolamento su colonna di gel di silice stato aggiunto al DNA genomico purificato Il saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant ha raggiunto una percentuale di identificazione del 100 per tutti i campioni analizzati e una riproducibilit del 100 nell identificazione dei genotipi tra i campioni in presenza e in assenza delle sostanze interferenti Per valutare l impatto dell interferenza dei primer indice in multiplex stato eseguito uno studio sulla contaminazione incrociata usando due campioni ciascuno campione con genotipi omozigoti univoci a quattro diverse posizioni genomiche e due rispettivi primer indice Non stato osservato alcun cambiamento nell identificazione delle varianti con livelli di contaminazione lt 40 Il genotipo del campione diventato eterozigote quando i livelli di contaminazione erano gt 40 Non stata osservata alcuna interferenza da qualsiasi interferente endogeno o esogeno 49 N codice 15038347 Rev A ITA Gennaio 2014 Indicizzazione del campione Sostanza del test Bilirubina Colesterolo Emoglobina Trigliceride EDTA Numero totale di replicati 16
68. ossibile confrontare le sequenze rispetto a un riferimento al fine di identificare una relazione fra le sequenze e assegnare un punteggio in base a regioni di similarit Le letture allineate sono scritte nei file in formato BAM MiSeq Reporter utilizza un algoritmo di Smith Waterman con matrice a banda che esegue allineamenti locali di sequenze per determinare il grado di similarit fra due sequenze e Identificazioni delle varianti durante questa fase vengono registrate le varianti di singolo nucleotide SNV le inserzioni e delezioni Indel e altre varianti strutturali in un file di testo standardizzato chiamato MiSeqDxCF139VariantAssay txt Per maggiori informazioni vedere la sezione File report dell analisi nella Guida per l utente di MiSeq Reporter n codice 15038356_ITA Limiti della procedura 1 Per uso diagnostico in vitro I risultati ottenuti usando il saggio MiSegDx Cystic Fibrosis 139 Variant Illumina dovrebbero essere usati e interpretati nel contesto di una valutazione clinica completa 2 Il saggio progettato per identificare uno specifico sottogruppo di varianti note nel gene CFTR ma non include tutte le varianti identificate nel gene CFTR Quindi se una variante non viene identificata non garantisce che altre varianti del gene CFTR non siano presenti nei campioni analizzati 3 La frequenza delle varianti identificate mediante questo saggio varia fra le diverse popolazioni 4 Come per qualsiasi saggio basato su ibridazione
69. pettare su e gi per 3 5 volte per sciacquare la punta e assicurare che il trasferimento sia completo Trasferire 9 ul di PAL nella provetta DAL contenente tampone di diluizione libreria Pipettare su e gi per 3 5 volte per sciacquare la punta e assicurare che il trasferimento sia completo Mescolare la DAL agitando la provetta molto velocemente Centrifugare la provetta DAL a 1 000 x g a 20 C per 1 minuto Incubare la provetta DAL in un blocco termico a 96 C per 2 minuti Dopo l incubazione capovolgere la provetta DAL 1 2 volte per mescolarla quindi porla immediatamente in un bagno di acqua e ghiaccio Tenere la provetta DAL nel bagno di acqua e ghiaccio per 5 minuti Caricamento delle librerie di campioni nella cartuccia 1 2 Utilizzare la punta di una pipetta pulita e vuota da 1 ml per forare la capsula di alluminio che sigilla il serbatoio contrassegnato con la dicitura Load Samples Caricamento campioni Pipettare 600 ul delle librerie di campioni nel serbatoio contrassegnato con la dicitura Load Samples Caricamento campioni Fare attenzione a evitare di toccare la capsula sigillante durante l erogazione del campione Una volta caricato il campione verificare la presenza di bolle d aria nel serbatoio In caso di presenza di bolle d aria picchiettare delicatamente la cartuccia sul banco in modo da farle fuoriuscire Passare direttamente alla procedura di impostazione della corsa usando l interfaccia del software operativo
70. piastra a 96 pozzetti sia compatibile con il supporto magnetico Piastre di conservazione da 96 pozzetti 0 8 ml piastre MIDI Bacinella per soluzione in PVC priva di DNAasi RNAasi vaschetta Sigillo adesivo in alluminio Sigillo per piastre PCR appropriato Punte di pipette dotate di barriera aerosol Apparecchiatura e materiali per post amplificazione 1 Termociclatore necessario un termociclatore Il termociclatore deve essere dotato di un coperchio riscaldato e soddisfare le seguenti specifiche di prestazione Intervallo di controllo della temperatura tra 4 C e 99 C Accuratezza del controllo 0 25 C da 35 C a 99 C 2 Agitatore per micropiastre nell area adibita al laboratorio post amplificazione necessario un agitatore di micropiastre L agitatore di piastre deve soddisfare le seguenti specifiche di prestazione Velocit massima di miscelazione 3 000 rpm giri min Intervallo di velocit di miscelazione 200 3 000 rpm giri min 10 N codice 15038347 Rev A ITA Gennaio 2014 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant 3 Centrifuga da tavolo necessaria una centrifuga da tavolo in grado ci mantenere la temperatura di 20 C come specificato sopra nell area di pre amplificazione necessaria un altra centrifuga Qualsiasi centrifuga per piastre che raggiunga le velocit previste dal protocollo da 280 a 2 400 x g accettabile 4 Blocco termico necessario un blocco termico per le provette Il blocco
71. plicitamente seguite da personale qualificato e adeguatamente addestrato Leggere e comprendere a fondo tutto il contenuto di questo documento prima di usare tali prodotti LA LETTURA INCOMPLETA DEL CONTENUTO DEL PRESENTE DOCUMENTO E IL MANCATO RISPETTO DI TUTTE LE ISTRUZIONI IVI CONTENUTE PU CAUSARE DANNI AL PRODOTTO LESIONI PERSONALI A UTENTI E TERZI E DANNI MATERIALI ILLUMINA NON SI ASSUME ALCUNA RESPONSABILIT DERIVANTE DALL USO IMPROPRIO DEI PRODOTTI QUI DESCRITTI COMPONENTI E SOFTWARE INCLUSI O DA QUALSIASI USO DI TALI PRODOTTI NON ESPLICITAMENTE CONTEMPLATO NELLE LICENZE SCRITTE O NELLE AUTORIZZAZIONI CONCESSE DA ILLUMINA IN OCCASIONE DELL ACQUISIZIONE DEI PRODOTTI STESSI DA PARTE DEL CLIENTE PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO 2012 2014 Illumina Inc Tutti i diritti riservati Illumina e MiSeqDx sono marchi o marchi registrati di Illumina Inc Tutti gli altri marchi e denominazioni qui citati sono di propriet dei rispettivi titolari AMPure Beckman e Beckman Coulter sono marchi di fabbrica o marchi registrati di Beckman Coulter Inc 51 N codice 15038347 Rev A ITA Gennaio 2014 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant Informazioni di contatto td ee 7 Ilumina Emergo Europe San Diego California 92122 U S A Molenstraat 15 1 800 809 ILMN 4566 2513 BH L Aia 1 858 202 4566 fuori dal Nord America Paesi Bassi techsupport illumina com www illumina com Etichettatura del prodotto Fare riferimento alla
72. polimorfismi sono wild type il report indica che le varianti I506V 1507V e F508C non sono presenti per il campione 22 N codice 15038347 Rev A ITA Gennaio 2014 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant 4 NOTA Poich questo un saggio basato sul sequenziamento non ci sono interferenze nel riportare F508del o 1507del dovute ai tre polimorfismi benigni Quindi non verranno eseguite correzioni sul risultato rilevato Il risultato del genotipo riportato come HET quando un campione identificato come eterozigote e per il campione sono stati rilevati sia wild type che alleli mutanti Il risultato del genotipo riportato come HOM quando un campione identificato come omozigote e per il campione rilevato solo l allele mutante Se per un campione non viene identificata alcuna variante il report indica No panel variants are detected Non stata rilevata alcuna variante per il pannello Il report del saggio fornisce informazioni sulla percentuale di identificazione del campione per ciascun campione La percentuale di identificazione calcolata come il numero di posizioni regioni della variante che corrisponde a un valore di soglia di affidabilit predefinito per il numero totale di posizioni regioni interrogate Per i campioni che richiedono report condizionale anche le varianti aggiuntive interrogate sono usate per il calcolo della percentuale di identificazione Qualsiasi variante con un valore di affidabilit predefinito
73. ppropriata della piastra AMP Le punte devono essere sostituite dopo ogni riga per evitare la contaminazione incrociata d Smaltirei tappi arancioni originali e applicare tappi arancioni nuovi 6 Preparare una soluzione di lavoro per la PCR Master Mix per PCR PCR polimerasi nel modo seguente a Per 96 campioni aggiungere 56 ul di PCR polimerasi a 2 8 ml di Master Mix per PCR b Capovolgere 20 volte la soluzione di lavoro per la PCR preparata per miscelarla La soluzione di lavoro per la PCR si mantiene stabile a temperatura ambiente per 10 minuti Procedura 1 Rimuovere l FPU dall incubatore e rimuovere il sigillo in alluminio 2 Coprire la piastra filtro con il coperchio e centrifugare a 2 400 x g a 20 C per 2 minuti 3 Aggiungere 25 ul di 0 05 N di NaOH a ogni pozzetto di campione sulla piastra filtro Pipettare NaOH su e gi 5 6 volte 4 Coprire e incubare la piastra filtro a temperatura ambiente per 5 minuti 5 Durante l incubazione della piastra filtro trasferire 22 ul della soluzione di lavoro per PCR in ogni pozzetto della piastra AMP contenente i primer indice 6 Trasferire i campioni eluiti dal filtro alla piastra AMP come segue a Pipettare i campioni nella prima colonna della piastra filtro su e gi 5 6 volte b Trasferire 20 ul dalla piastra filtro alla colonna corrispondente della piastra AMP Gennaio 2014 N codice 15038347 Rev A ITA 17 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant O o N c Pipettare delicatamente
74. rificate testando un numero di campioni positivi e negativi con caratteristiche delle prestazioni note 5 Tutti i requisiti di controllo della qualit devono essere eseguiti in conformit alle regolamentazioni locali statali e o e ai requisiti di certificazione 24 N codice 15038347 Rev A ITA Gennaio 2014 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant Caratteristiche prestazionali Accuratezza L accuratezza del saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant Illumina stata stimata valutando 500 campioni che rappresentano una vasta gamma di varianti del gene CFTR da quattro fonti separate La fonte principale dei dati di accuratezza stato uno studio di accuratezza clinica condotto usando un pannello di 366 campioni La maggior parte n 355 dei campioni consisteva di campioni clinici di gDNA archiviati anonimizzati e isolati da sangue umano i restanti 11 campioni sono stati ottenuti da campioni di linee cellulari disponibili in commercio I dati di questo studio sono stati integrati con i dati di accuratezza ottenuti da 68 campioni di linee cellulari nello studio di riproducibilit 14 campioni clinici ottenuti dallo studio di valutazione analitica del metodo di estrazione e 52 campioni di plasmidi sintetici I plasmidi sintetici sono stati progettati per includere il contesto genomico di varianti rare e contenuti ovunque da una a nove varianti entro lo stesso costrutto Sono stati linearizzati diluiti a numero di copie equivalenti di DN
75. rischio di contaminazione incrociata da carry over di ampliconi o da campione a campione Le combinazioni indice campione devono corrispondere esattamente a quelle del foglio campioni La non corrispondenza fra il foglio campioni e il layout della piastra risulter in una perdita di identificazione dei campioni positivi e nella refertazione di risultati errati Preparare sempre al momento l etanolo all 80 per le fasi di lavaggio L etanolo pu assorbire l acqua dall aria e influire sui risultati Assicurarsi che tutto l etanolo venga rimosso dal fondo dei pozzetti durante le fasi di lavaggio L etanolo residuo pu influire sui risultati Rispettare il tempo di asciugatura indicato dopo la fase del supporto magnetico al fine di garantire che l evaporazione sia completa L etanolo residuo pu influire sulle prestazioni delle reazioni successive Non mescolare il pool di oligonucleotidi per il saggio CF 139 Variant e il tampone di ibridazione per la conservazione Usato in combinazione il pool di oligonucleotidi per il saggio CF 139 Variant diventa instabile anche se conservato congelato L utilizzo di termociclatori a raffreddamento attivo ad es Peltier raffreddato termoelettricamente non consigliato per la fase di ibridazione La fase di raffreddamento passivo cruciale per un adeguata ibridazione Aggiungere sempre PCR polimerasi al Master Mix per PCR subito prima dell uso Non conservare mai la soluzione di lavoro combinata 12
76. tificazioni positive varianti Identifica Identifica N di N di Concor Concor Concor Variante Tipo di zioni 7 A y zioni identifica identifica danza danza danza f Nome cDNA Campio Campio Campio j ao pa na o Nome comune variante totali per ni ni lince ni negative zioni zioni non positiva negativa complessiva f il aa PI a na variante dinici cellulari sita wild type errate riuscite W1204X SNV c 3612G gt A 500 0 0 1 499 100 100 100 c 3612G gt A DIV un acronimo per Deletion Insertion Variant variante delezione inserzione Il report Sanger indicava la variante P2055 come eterozigote per il campione clinico Una revisione dei dati ottenuti dalla traccia Sanger indicava tuttavia che la variante era in effetti omozigote e riportata correttamente MiSeqDx ha riportato la variante come omozigote 35 N codice 15038347 Rev A ITA Gennaio 2014 Saggio MiSeqDx M Cystic Fibrosis 139 Variant Un campione eterozigote sintetico per l esone 8 stato riportato come eterozigote per la variante dele22 23 del gene CFTR Ulteriori indagini hanno rilevato che questo risultato proveniva da un livello di contaminazione ridotto stato determinato che il campione eterozigote sintetico originale era stato preparato impropriamente Quando stato analizzato successivamente dopo essere stato preparato usando lo stesso plasmide stato rilevato Quando R117H positivo la variante PolyTG PolyT viene ulteriormente r
77. uenziamento con un massimo di 48 campioni ciascuno MiSeqDx utilizza un LED verde per il sequenziamento delle basi G T e un LED rosso per il sequenziamento delle basi A C Per garantire la corretta registrazione a ogni ciclo deve essere letto almeno uno dei due nucleotidi per ogni canale cromatico importante conservare l equilibrio cromatico per ogni base dell indice letta sottoposta a sequenziamento altrimenti potrebbe verificarsi un problema di registrazione durante il sequenziamento della Lettura indici Per scegliere le combinazioni di primer indice per corse a 48 o 96 campioni vedere la Tabella 11 Tabella 11 Combinazioni primer indice per corse di sequenziamento a 48 campioni o 96 campioni Righe A H Colonne 1 6 Colonne 7 12 Primer indice A A501 Primer indice 1 A701 Primer indice 6 A706 Primer indice B A502 Primer indice 2 A702 Primer indice 7 A707 Primer indice C A503 Primer indice 3 A703 Primer indice 8 A708 Gennaio 2014 N codice 15038347 Rev A ITA 13 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant Righe A H Colonne 1 6 Colonne 7 12 Primer indice D A504 Primer indice 4 A704 Primer indice 9 A709 Primer indice E A505 Primer indice 5 A705 Primer indice 11 A711 Primer indice F A506 Primer indice 10 A710 Primer indice 12 A712 Primer indice G A507 Primer indice H A508 Se si sequenziano meno di 48 campioni in una corsa di sequenziamento selezionare gli indici appropriati in

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