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Manuale PAXgene® Blood RNA Kit

1. Digestione DNA eqnoy o Ns oz3 IDuuolnp ui lu uupi duuo gt Lavare Trasferire in una spin column PAXgene RNA PRC ev Eluire V Chiudere i tappi delle provette da em microcentrifuga MCT e trasferire Ee nell agitatore QIAcube v Riscaldare a 95 C RNA pronto all uso 18 Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 Purificazione dell RNA manuale Dettagliatamente il pellet risospeso viene incubato in tamponi con proteinasi K PK per la digestione delle proteine Per omogeneizzare il lisato cellulare e rimuovere i detriti cellulari si effettua una centrifugazione aggiuntiva utilizzando la colonna PAXgene Shredder PSC Il sovranatante dell eluato viene trasferito in una microprovetta per centrifuga pulita Per ottimizzare le condizioni di legame si aggiunge etanolo quindi il lisato viene introdotto nella spin column PAXgene RNA PRC Con una breve centrifugazione l RNA si lega selettivamente alla membrana in silice PAXgene mentre i contaminanti vengono eliminati Eventuali altri contaminanti vengono rimossi nelle successive ed efficienti fasi di lavaggio Fra la prima e la seconda fase di lavaggio la membrana viene incubata con DNasi RNFD per eliminare qualsiasi traccia di DNA legato Dopo le fasi di lavaggio FRNA viene eluito nel tampone di eluizione BR5 e denaturato al caldo L RNA totale purificato usando il sistema PAXgene Blood RNA estremamente puro Usando i
2. Assicurarsi che gli strumenti ad es pipette e incubatore agitatore vengano controllati e calibrati regolarmente in base alle indicazioni del produttore Per i passaggi 5 e 20 necessario un incubatore agitatore Impostare la temperatura di questo strumento a 55 C Dopo una lunga conservazione il tampone di legame BR2 pu formare un precipitato Se necessario riscaldare a 37 C per discioglierlo Il tampone di lavaggio 2 BRA viene fornito come concentrato Per ottenere una soluzione di lavoro al primo utilizzo aggiungere 4 volumi di etanolo 96 10096 grado di purezza p a per analisi come indicato sul flacone Se si utilizza il set DNAsi privo di RNAsi per la prima volta preparare una soluzione stock di DNAsi I Sciogliere la DNAsi RNFD 1500 unit Kunitz in 550 ul di tampone di risospensione DNAsi presente nel kit Assicurarsi di non disperdere DNAsi aprendo la fiala La DNAsi ricostituita non deve essere miscelata su vortex La DNAsi particolarmente sensibile alla denaturazione fisica Miscelare la soluzione con cautela capovolgendo e o agitando pi volte la provetta L unit Kunitz viene normalmente utilizzata per misurare la DNAsi Un unit Kunitz si definisce come la quantit di DNAsi I che a 260 nm A260 provoca un aumento dell assorbanza di 0 001 per minuto e millilitro a 25 C e pH 5 0 utilizzando come substrato DNA altamente polimerizzato Kunitz M 1950 J Gen Physiol 33 349 e 363
3. l pellet dell acido nucleico centrifugato lavato e risospeso vedi Concentrazione e purificazione dell RNA pag 16 viene trasferito dalla PAXgene Blood RNA Tube BRT nelle provette di reazione PT che sono posizionate nell unit termoshaker sul piano di lavoro QlAcube L operatore seleziona e fa partire il protocollo del PAXgene Blood RNA Part A dal menu Il QlAcube esegue le fasi del protocollo attraverso l eluizione dell RNA nel buffer di eluizione BR5 L operatore trasferisce i tubi per microcentrituga MCT contenenti l RNA purificato nell unit termoshaker del QlAcube L operatore seleziona e fa partire il protocollo PAXgene Blood RNA Part B dal menu e il QlAcube esegue la denaturazione a caldo Il tempo medio di preparazione del campione basato sui dati di 12 preparazioni di campioni di 125 minuti con circa 20 minuti di lavoro manuale Le rese dell RNA da 2 5 ml di sangue umano intero sono 3 ug per 95 dei campioni processati La figura 9 indica le rese dell RNA da un totale di 288 campioni preparati usando il protocollo automatico con 3 lotti di kit con tre diversi esecutori Quando per questi studi sono stati usati campioni di sangue in pool invece delle singole PAXgene Blood RNA Tubes BRT i risultati non riflettono la resa dell RNA attesa dai singoli campioni degli estratti di sangue individuali Poich le rese dipendono molto dal donatore le rese individuali possono variare Figura 9 Manual
4. a a T o a a ak 0541 alia tery n todos vs d Fl aa i sa 7 E a 4 ET b et t a k ia etti ante Tt s h ou 0 0 2 2 3 3 I 2 2 3 3 1 2 2 3 3 A B c Figura 11 L RNA stato purificato da 3 diversi esecutori A B C usando tre diversi lotti 1 2 3 del PAXgene Blood RNA Kit nell esperimento descritto nella figura 9 Le quantit di DNA genomico w w in tutti campioni individuali sono mostrate per ogni combinazione esecutore lotto Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 29 Il protocollo in automatico della purificazione dell RNA usando il sistema PAXgene Blood RNA fornisce risultati RT PCR altamente riproducibili e ripetibili come mostrato nella Figura 12 rendendolo estremamente robusto per test clinici diagnostici Riproducibilit della RT PCR tra protocolli in automatico e manuali Figura 12 L RNA stato purificato da tre diversi esecutori A B C usando 2 diversi lotti 1 2 3 del PAXgene Blood RNA Kit e il protocollo in automatico nell esperimento descritto in Figura 9 In parallelo l RNA stato purificato dalle corrispondenti provette in duplicati usando il protocollo manuale livelli relativi dei trascritti di E FOS e Ei ILIB sono stati determinati per real time duplex RT PCR usando 18S rRNA come standard interno Possibili differenze dei liv
5. Fax 800 847 2220 Technical support 800 631 0174 www bd com www PreAnalytiX com Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 63 10510831T127153017 QQ PreAnalytiX A GIAGEM BD Company
6. MCT e di ogni la provetta di reazione PT e alla parete esterna di ogni adattatore per rotore Versamenti di campioni e tamponi durante la procedura possono ridurre resa e purezza dell RNA Se non indicato diversamente tutte le fasi di questo protocollo incluse quelle di centrifugazione devono essere effettuate a temperatura ambiente 15 25 C A causa della sensibilit delle tecnologie di amplificazione degli acidi nucleici PCR durante la manipolazione dei campioni necessario attenersi alle seguenti precauzioni per evitare contaminazioni crociata e Pipettare con attenzione il campione nella provetta di reazione PT sul fondo della provetta senza bagnarne il bordo e Fra un trasferimento di liquido e l altro sostituire sempre i puntali delle pipette Utilizzare puntali con barriera aereosol anticontaminazione e Non toccare la membrana della colonna PRC PSC con il puntale della pipetta e Dopo la miscelazione con vortex o il riscaldamento di una provetta MCT centrifugare brevemente per rimuovere le gocce all interno del tappo della provetta e Indossare i guanti per tutta la durata della preparazione In caso di contatto fra guanti e campione sostituire immediatamente i guanti Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 Ulteriori accorgimenti prima di iniziare il protocollo l sangue deve essere raccolto nelle PAXgene Blood RNA Tubes BRT secondo le istruzioni nella descrizione del prodotto delle PAXgene Blood
7. Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 43 Dati attualmente disponibili mostrano che la DNAsi ricostituita RNFD si mantiene stabile per 6 settimane se conservata a 2 8 C Per periodi pi lunghi rimuovere la soluzione concentrata dalla fiala in vetro suddividerla in aliquote monouso utilizzare provette per microcentrifuga da 1 5 ml MCT presenti nel kit sono sufficienti per 5 aliquote e conservarla a 20 C fino a 9 mesi Le aliquote scongelate possono essere conservate a 2 8 C fino a 6 mesi Non ricongelare le aliquote dopo lo scongelamento Quando si ricostituisce e si aliquota la DNasi RNFD attenersi alle Note generali per il trattamento dell RNA Appendice A pagina 56 Esecuzione 1 44 Centrifugare la PAXgene Blood RNA Tubes BRT per 10 minuti a 3000 5000 x g utilizzando un rotore basculante D Assicurarsi che i campioni di sangue siano stati incubati nella PAXgene Blood RNA Tube BRT per almeno 2 ore a temperatura ambiente 15 25 C per garantire la completa lisi delle cellule ematiche Il rotore deve contenere adattatori per provette a fondo arrotondato Se si utilizzano altri tipi di adattatori le provette possono danneggiarsi durante la centrifugazione Rimuovere il sovranatante per decantazione o pipettamento Aggiungere al pellet 4 ml di acqua priva di RNasi RNFW e chiudere la provetta con una nuova chiusura Hemogard BD fornita con il kit Se il sovranatante viene eliminato per de
8. PRC in una provetta da 1 5 ml MCT e pipettare 40 ul di tampone di eluizione BR5 direttamente alla membrana della colonna PAXgene RNA PRC Centrifugare per 1 minuto a 8000 20000 x g per eluire l RNA Per la massima efficienza di eluizione importante bagnare l intera membrana con il tampone di eluizione BR5 19 Ripetere la fase di eluizione passaggio 18 come descritto utilizzando 40 pl di tampone di eluizione e la stessa provetta da 1 5 ml MCT 20 Incubare l eluato per 5 minuti a 65 C nell incubatore agitatore vedi passaggio 5 per senza agitare Dopo l incubazione raffreddare immediatamente in ghiaccio Questa incubazione a 65 C denatura l RNA per applicazioni downstream Non superare tempo e temperatura di incubazione 21 Se i campioni di RNA non vengono utilizzati immediatamente conservarli a 20 C o 70 C Poich l RNA rimane denaturato dopo ripetuti passaggi di congelamento scongelamento non necessario ripetere l incubazione a 65 C Se si utilizzano i campioni di RNA per test diagnostici attenersi alle istruzioni fornite dal produttore Per una pi precisa e attendibile quantificazione dell RNA misurando l assorbimento a 260 nm consigliamo di diluire il campione con 10 mM di Tris Cl pH 7 5 Una diluizione del campione con acqua priva di RNAsi potrebbe portare a risultati imprecisi o troppo bassi Per azzerare il fotometro utilizzare lo stesso tampone nel quale diluito l RNA e aggiungere lo
9. accensione vedi Figura 13 Si sentir un beep e apparir lo schermo di start up Lo strumento esegue automaticamente i test di inizializzazione Installazione dei protocolli sul QlAcube E richiesta l installazione iniziale di un protocollo prima che venga eseguita la prima corsa di preparazione dell RNA sul QlACube Installare entrambi i protocolli PAXgene Blood RNA Part A and PAXgene Blood RNA Part B protocolli sono disponibili a www qiagen com MyQlAcube e devono essere scaricati sullo stick USB fornito con il QlAcube e trasferiti sul QlAcube tramite la porta USB La porta USB posta dietro il pannello di protezione vedi Figura 13 permette la connessione del QlAcube allo stick USB fornito con il QlAcube files di dati come i file di log e di report possono essere anche trasferiti tramite la porta USB dal QlAcube allo stick USB D La porta USB solo per l uso con lo stick USB fornito da QIAGEN Non connettere altri dispositivi a questa porta D Non rimuovere lo stick USB mentre si scaricano protocolli o mentre si trasferiscono file di dati o durante l esecuzione di un protocollo 3 Incluso nello Starter Pack QIAGEN cat no 990395 32 Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 Parte anteriore del QIAcube sensa QUAGEN Figura 13 E porta USB dietro il pannello di LI Touchscreen protezione El Porta El Tasto di accensione E 85232 porta seriale dietro il pannello EM Cassetto per rifiuti protet
10. campioni 7 campioni 8 campioni 9 campioni 10 campioni Figura 19 Le posizioni della centrifuga e dell agitatore sono riportate per processare da 2 2 campioni a dieci 10 campioni Uno o 11 campioni non possono essere processati Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 39 Provette di reazione PT Eliminare tutte le provette di reazione PT lasciate negli slot per provette da microcentrifuga e provenienti dalle corse precedenti vedi Figura 15 pagina 36 Riempire le provette di reazione PT con la quantit di reagenti data nella Tabella 5 Etichettare chiaramente le provette PT con nomi dei reagenti e posizionarle nella posizione appropriata negli slot per provette da microcentrifuga come indicato nella Tabella Pipettare il volume indicato di tampone per la digestione di DNA RDD in una provetta di reazione PT e aggiungere il volume indicato di soluzione stock DNase RNFD Miscelare delicatamente il tutto pipettando su e gi tre volte usando un puntale per pipetta da 1000 ul Usare le provette di reazione PT da 2 ml incluse nel PAXgene Blood RNA Kit Assicurarsi di pipettare solo il volume richiesto come indicato nella Tabella 5 Tabella 5 Volume dei reagenti richiesto nelle provette di reazione per gli slots delle provette da microcentrifuga Volume di regente richiesto per il numero di campioni indicato ul Numero di Proteinasi K i I Tampone di sampioni PK Mix per incubazione di DNase e
11. consultare immediatamente il medico e mostrargli il contenitore o l etichetta Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 9 Introduzione La raccolta del sangue intero la prima fase di molti test molecolari utilizzati per lo studio dell RNA cellulare Tuttavia uno dei problemi principali in questi casi l instabilit del profilo dell RNA cellulare in vitro Studi effettuati da PreAnalitiX hanno mostrato che il numero di copie delle singole specie di mRNA nel sangue intero pu variare di oltre 1000 volte durante la conservazione e il trasporto a temperatura ambiente Ci provocato dalla rapida degradazione dell RNA e dall espressione indotta di alcuni geni dopo il prelievo ematico Tali modifiche nel profilo dell RNA impediscono di effettuare studi attendibili sull espressione genica Per un analisi accurata dell espressione genica nel sangue intero umano quindi essenziale un metodo per conservare il profilo di espressione dell RNA durante e dopo la flebotomia Principio PAXgene e sua applicazione PreAnalytiX ha sviluppato un nuovo sistema che consente il prelievo la stabilizzazione la conservazione e il trasporto di campioni di sangue intero umano nonch un rapido ed efficiente protocollo per la purificazione dell RNA intracellulare Il sistema comprende le PAXgene Blood RNA Tubes BRT brevetti USA 6 602 718 e 6 617 170 per il prelievo ematico e la contemporanea stabilizzazione dell RNA e il kit PAXgene Blood RNA per la successi
12. della provetta BRT con carta assorbente Prendere le necessarie precauzioni per evitare contaminazioni crociate Quando si opera con sostanze chimiche indossare indossare sempre un camice da laboratorio guanti monouso e occhiali di protezione Per ulteriori infomrazioni consultare le relative schede di sicurezza dei materiali MSDS 54 Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 e Dopo il prelievo il sangue stato incubato meno di 2 ore nelle PAXgene Blood RNA Tubes BRT Basso rapporto A 6o A so a RNA diluito in acqua prima di misurarne la purezza b Spettrofotometro non azzerato completamente Malfunzionamento dello strumento QlAcube non utilizzato correttamente Commenti e suggerimenti Dopo il prelievo incubare il sangue nella PAXgene Blood RNA Tube BRT per almeno 2 ore Utilizzare 10 mM Tris HCl pH 7 5 per diluire l RNA prima di misurare la purezza vedere Appendice B pagina 57 Per azzerare lo spettrofotometro utilizzare un bianco contenente la stessa proporzione di tampone di eluizione BR5 e tamponi di diluizione presenti nel campione da misurare Il tampone di eluizione BR5 assorbe intensamente a 220 nm e ci pu portare ad alti valori di assorbimento di sfondo se lo spettrofotometro non stato azzerato correttamente Leggere il QlAcube User Manual porgendo particolare attenzione alla sezione Risoluzione dei problemi Assicurarsi che il QlAcube sia in corretta manutenzion
13. di RNA con differenti esecutori e diversi lotti di PAXgene Blood RNA Kit impiegando campioni di sangue in pool v gt 14 12 S 10 RU A A mua ifl Hi o d T Jil ue 1 J Ah 3 ril I PN TI NI i lt N ed 5 O 2 O d 2 pool di donatori B 50 gt 40 U S 30 20 RI i PU UP M pool di donatori Figura 6 Da 30 donatori sono stati raccolti campioni di sangue nelle PAXgene Blood RNA Tubes BRT 12 provette per donatore in tutto 360 provette Il contenuto di tutte le provette dei tre donatori stato costituito in pool e di seguito aliquotato in 36 campioni Questi 36 campioni per ogni pool di 3 donatori sono stati analizzati manualmente da tre diversi tecnici Ogni tecnico ha utilizzato il kit PAXgene Blood RNA da tre diversi lotti per l isolamento dell RNA e da quadruplicati gi processati da ognuno dei dieci pool a Resa dell RNA e deviazione standard per ogni combinazione lotto esecutore campioni di sangue di 10 pool di donatori sono stati processati da tre diversi tecnici A B e C con ognuno dei tre lotti di kit 1 2 e 3 Sono riportate le rese medie colonne e le deviazioni standard barre di errore per quadruplicato di campione dello stesso pool di donatori per diversi tecnici e lotti di kit El Coefficiente di variazione CV della resa di RNA per pool di donatori per tutte le combinazioni tecnico lotto A B e C 1 2 e 3 come calcolato dalle rese m
14. di lavoro QlAcube Supporto per 12 adattatori di rotore monouso per l uso con il QlAcube Prodotti che si possono ordinare presso BD e i rivenditori autorizzati BD PAXgene Blood RNA Tubes 100 Set prelievo sangue Supporto monouso BD Vacutainer Provette BD Vacutainer Plus Serum 100 provette per il prelievo Da utilizzare con il PAXgene Blood RNA Kit 50 BD Vacutainer Safety Lok Set prelievo sangue cannula da 0 75 pollici 21 G tubo da 12 pollici con adattatore luer 50 in ogni scatola 200 in ogni confezione Contenitore solo per diametro di 13 mm e 16 mm 1000 in ogni confezione 13x 75 mm per prelievo da 4 0 ml con chiusura di sicurezza BD Hemogard rossa e con etichetta in carta 100 in ogni scatola 1000 per ogni confezione Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 Cat n 990394 290390 290392 762165 367286 364815 368975 61 Questa pagina intenzionalmente bianca 62 Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 PreAnalytiX nel mondo I prodotti PreAnalitiX sono distribuiti dalle aziende QIAGEN e BD Australia Orders 03 9840 9800 Fax 03 9840 9888 Technical 1 800 243 066 Austria Orders 0800 28 10 10 Fax 0800 28 10 19 Technical 0800 28 10 11 Belgium Orders 0800 79612 Fax 0800 79611 Technical 0800 79556 Canada Orders 800 572 9613 Fax 800 713 5951 Technical 800 DNA PREP 800 362 7737 China Orders 021 51345678 Fax 021 51342500 Technical 021 5
15. intellectual property rights relating to the Kit and or its components For updated license terms see www preanalytix com 2005 2008 PreAnalytiX GmbH all rights reserved PreAnalytiX PreAnalytiX GmbH Feldbachstrasse CH 8634 Hombrechtikon Svizzera Distributori PreAnalytiX prodotti PreAnalytiX vengono realizzati per PreAnalytiX da QIAGEN o da BD e distribuiti per conto di PreAnalytiX da QIAGEN prodotti non possono essere ordinati direttamente presso PreAnalytix GmbH Consultare l ultima paaina del manuale per informazioni sui distributori locali pag p Sommario Spiegazione dei simboli 4 Contenuti del kit 5 Condizioni di conservazione 6 Uso previsto 6 Limitazioni all uso del prodotto 7 Controllo di qualit 7 Supporto tecnico 7 Informazioni di sicurezza 7 Introduzione 10 Principio PAXgene e sua applicazione 10 Prelievo e stabilizzazione del campione 10 Purificazione dell RNA manuale 19 Purificazione dell RNA in automatico 27 Attrezzature e reagenti richiesti ma non forniti 31 Note importanti 32 Uso del QlAcube 32 Avviamento del QlAcube 32 Installazione dei protocolli sul QlAcube 32 Caricare il QlAcube 34 Protocollo Purificazione manuale dell RNA totale dal sangue intero umano nelle PAXgene Blood RNA Tubes BRT 42 Protocollo Purificazione in automatico dell RNA totale da sangue umano intero raccolto nelle PAXgene Blood RNA Tubes BRT 48 Guida alla risoluzione dei problemi 54 Appendice A Note generali pe
16. le provette e le colonne siano etichettate in modo appropriato con un pennarello indelebile Applicare un etichetta al tappo e alla parete esterna PT MCT Per le colonne applicare un etichetta alla parete esterna della loro provetta di reazione PT Dopo avervi trasferito il liquido chiudere sempre ogni provetta e ogni colonna Versamenti di campioni e tamponi durante la procedura possono ridurre resa e purezza dell RNA Se non indicato diversamente tutte le fasi di questo protocollo incluse quelle di centrifugazione devono essere effettuate a temperatura ambiente 15 25 C A causa della sensibilit delle tecnologie di amplificazione degli acidi nucleici PCR durante la manipolazione dei campioni necessario attenersi alle seguenti precauzioni per evitare contaminazioni crociate e Pipettare con attenzione il campione nella colonna PRC PSC senza bagnarne il bordo e Fra un trasferimento di liquido e l altro sostituire sempre i puntali delle pipette Utilizzare puntali con barriera aereosol e Non toccare la membrana della colonna PRC PSC con il puntale della pipetta e Dopo la miscelazione con vortex o il riscaldamento di una provetta MCT centrifugare brevemente per rimuovere le gocce all interno del tappo e Indossare i guanti per tutta la durata della preparazione In caso di contatto fra guanti e campione sostituire immediatamente i guanti e Chiudere sempre la colonna PRC PSC prima di posizionarla nel
17. lo svolgimento del protocollo di estrazione Gli esperti del supporto tecnica QIAGEN sono sempre disponibili per rispondere a qualsiasi domanda su informazioni e i protocolli manuale e automatico inclusi nel presente manuale o per applicazioni in biologia molecolare per i recapiti vedere pagina 63 o visitate www qiagen com Commenti e suggerimenti RNA degradato Contaminazione da RNasi D Fare attenzione q non introdurre Rnasi nei reagenti durante la procedura o durante la manipolazione successiva del campione vedere anche Appendice A pagina 56 Bassa resa di RNA a Meno di 2 5 ml di Gi sangue nella PAXgene Ensure that 2 5 ml blood is collected in Blood RNA BRT the PAXgene Blood RNA Tube BRT see PAXgene Blood RNA Tube Product Circular b Concentrazione di RNA misurata in acquo D RNA concentration must be measured in 10 mM Tris Cl pH 7 5 for accurate quantification see Appendix B page 57 c Detriti cellulari trasferiti D nella colonna PAXgene RNA Evitare di trasferire particelle di grandi PRC nella fase 7 del dimensioni mentre si pipetta il sovranatante nel passaggio 7 del protocollo manuale il trasferimento di detriti di piccole dimensioni non influenza la procedura protocollo manuale d Sovranatante non eliminato completamente dopo la fase 3 D Assicurarsi di rimuovere completamente il sovranatante Se il sovranatante viene fatto decantare rimuovere le gocce dal bordo
18. pu essere degradato Si sconsiglia per Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 questo la preparazione dei campioni durante la notte senza opportuna sorveglianza 16 Se i campioni di RNA non vengono usati immediatamente conservarli a 20 C o 70 C Poich RNA rimane denaturato dopo ripetuti congelamenti e scongelamenti non necessario ripetere il protocollo di incubazione a caldo PAXgene Blood RNA Part B Per la quantificazione in tampone Tris usare la relazione A 44 1 gt 44 ug ml Vedi Appendice B pag 56 17 Rimuovere la rastrelliera per i flaconi dei reagenti dal piano di lavoro QlAcube vedi Figura 15 pag 36 e chiudere tutti i flaconi con i tappi appropriatamente etichettati IL tampone conservato nei flaconi pu essere conservato a temperatura ambiente 15 25 C per pi di 3 mesi Rimuovere e scartare i reagenti rimasti nelle provette di reazione PT negli slots per provette da microcentrifuga del QlAcube vedi Figura 15 pag 36 Rimuovere e scartare gli adattatori del rotore dalla centrifuga vedi Figura 15 pag 36 Svuotare il cassetto dei rifiuti del QIAcube vedi Figura 13 pag 33 Chiudere la porta dello strumento QIAcube e spegnere lo strumento con il tasto di accensione vedi Figura 13 pag 33 Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 53 Guida alla risoluzione dei problemi Questa guida alla risoluzione dei problemi pu essere utile per chiarire qualsiasi dubbio che pu sorgere durante
19. si prega di richiedere maggiori informazioni 2005 2008 PreAnalytiX GmbH tutti i diritti riservati Limited License Agreement Use of this product signifies the agreement of any purchaser or user of the PAXgene Blood RNA Kit to the following terms an C N The PAXgene Blood RNA Kit may be used solely in accordance with the PAXgene Blood RNA Kit Handbook and for use with components contained in the Kit only PreAnalytiX grants no license under any of its intellectual property to use or incorporate the enclosed components of this Kit with any components not included within this Kit except as described in the PAXgene Blood RNA Kit Handbook and additional protocols available at www preanalytix com Other than expressly stated licenses PreAnalytiX makes no warranty that this Kit and or its use s do not infringe the rights of third parties This Kit and its components are licensed for one time use and may not be reused refurbished or resold PreAnalytiX specifically disclaims any other licenses expressed or implied other than those expressly stated The purchaser and user of the Kit agree not to take or permit anyone else to take any steps that could lead to or facilitate any acts prohibited above PreAnalytiX may enforce the prohibitions of this Limited License Agreement in any Court and shall recover all its investigative and Court costs including attorney fees in any action to enforce this Limited License Agreement or any of its
20. stesso volume di tampone di eluizione BR5 che corrisponde al volume dell RNA eluito Il tampone di eluizione BR5 assorbe intensamente a 220 nm cosa che pu portare ad alti valori di assorbimento di sfondo se lo zero del fotometro spettrale non stato impostato correttamente Notare per determinare la concentrazione di RNA nel tampone tris utilizzare il rapporto A 1 gt 44 ug ml vedi Appendice B a pagina 57 Quando si opera con sostanze chimiche indossare sempre un camice da laboratorio guanti monouso e occhiali di protezione Per ulteriori informazioni consultare le relative schede di sicurezza dei materiali MSDS Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 47 Protocollo Purificazione in qutomqtico dell RNA totale da sangue umano intero raccolto nelle PAXgene Blood RNA Tubes BRT Importante prima di iniziare 48 Assicurarsi che la confezione del kit sia intatta e non danneggiata e che la provette dei tamponi non mostrino perdite Non utilizzare un kit danneggiato Quando si utilizza una pipetta assicurarsi che sia impostata sul volume corretto e che il liquido venga aspirato e dispensato completamente Per evitare di trasferire un campione alla provetta o alla colonna sbagliata assicurarsi che tutti le provette di reazione PT le provette MCT e gli adattatori per rotore siano etichettate in modo appropriato con un pennarello indelebile Applicare un etichetta al tappo e alla parete esterna di ogni provetta
21. tempo reale di sequenze della betaglobina e dei trascritti FOS in campioni RNA Negativi acqua insieme a campioni RNA Positivi campioni di sangue intero nella stessa corsa L RNA purificato con il sistema PAXgene Blood RNA e il protocollo in automatico estremamente puro come evidente dall assenza di un inibizione di RT PCR vedi sopra e dai valori A340 A3g0 tra 1 8 e 2 2 Il DNA genomico presente a lt 1 w w in 95 di tutti i campioni come misurato dalla PCR quantitativa in tempo reale di una sequenza del gene beta actin Le figure 10 e 11 mostrano i valori As As o e II DNA genomico relativo di un totale di 288 campioni preparati usando il protocollo in automatico con 3 lotti di kit usati da tre esecutori 28 Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 Purezza dell RNA valori A A 4 Procedura in automatico 2 3 2 1 THERE EHHH FHH EE PERSE Ge FE HEE HHE HHEH TH HHE HH ES FEES STEFGESSEFEFEFEEF E HHHH E 1 9 F ra 37 s wa ope t TR PE Lai Lih Purezza dell RNA A 50 A3g0 Figura 10 L RNA stato purificato da 3 differenti esecutori A Be C usando 3differenti lotti 1 2 e 3 del PAXgene Blood RNA Kit nell esperimento descritto in Figura9 valori A260 A280 di tutti campioni individuali sono mostrati perognicombinazione esecutore lotto Purezza dell RNA 96 della contaminzaione del DNA genomico Procedura in automatico 3 0 2 5 DNA genomico w w 96 m E
22. 01292 QlAcube 230 V automatica del DNA dell RNA o delle 9001293 proteine usando i kit di colonne QIAGEN 1 anno di garanzia sulle parti e sul laboratorio Garanzia PLUS 2 Full 3 anni di garanzia 48 ore 2 giorni 9240834 QlAcube lavorativi di risposta prioritaria tutto il laboratorio viaggio e riparazioni delle parti Starter Pack QlAcube La confezione include racks per i 990395 flaconi per reagenti 3 etichette per i racks 8 puntali per filtro da 200 ul 1024 puntali per filtro da 1000 ul 1024 puntali per filtro da 1000 ul wide bore 1024 flaconi per reagenti da 30 ml 18 adattatori per rotore 240 supporti per adattatori per rotore Puntali per filtro Sterili monouso in rack 990352 1000 ul 1024 Flaconi per reagenti Flaconi per reagenti 30 ml con 990393 30 ml 6 tappi confezione da 6 per l uso con il rack dei flaconi per reagenti QlAcube USA Canada e Giappone t Resto del mondo Questi accessori per la raccolta del sangue rappresentano tipici prodotti che possono essere usati con le PAXgene Blood RNA Tubes Per saperne di pi visitare www bd com vacutainer products venous 60 Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 Prodotto Adattatori per rotore 10 x 24 Rack per flaconi per reagenti Supporto per adattatori di rotore Contenuto Per 240 preparazioni 240 adattatori per rotore monouso per uso con il QlAcube Rack per flaconi per reagenti da 6 x 30 ml sul tavolo
23. 1 posizione tappo L1 alla posizione 3 dell adattatore del rotore tappo posizione L2 tramite lo strumento vedi Figura 17 pag 38 Chiudere i tappi di tutte le provette da microcentrifuga MCT da 1 5 ml contenenti l RNA purificato negli adattatori del rotore posizione 3 posizione tappo L3 vedi Figura 17 pag 38 Trasferire le provette da microcentrifuga MCT da 1 5 ml sull adattatore dell agitatore del QlAcube vedi Figura 15 pag 36 Chiudere la porta dello strumento QlAcube vedi Figura 13 pag 33 Selezionare il protocollo PAXgene Blood RNA Part B e far partire il protocollo Seguire le istruzioni fornite sul touchscreen Questo programma incuba i campioni a 65 C e denatura l RNA per applicazioni downstream dell RNA Se l applicazione downstream comprende una fase di denaturazione a caldo non saltare questa fase Una sufficiente denaturazione dell RNA essenziale per ottenere la massima efficacia nelle appplicazioni downstream Quando terminato il programma PAXgene Blood RNA Part B aprire la porta dello strumento QlAcube vedi Figura 13 pag 33 Posizionare immediatamente le provette da microcentrifuga MCT contenenti l RNA purificato sul ghiaccio ATTENZIONE Superficie calda N L agitatore pu raggiungere temperature superiori a 70 C 158 F Evitare di toccarlo quando caldo D Non lasciare l RNA purificato nel QlAcube Poich i campioni non sono raffreddati l RNA purificato
24. 1345678 Denmark Orders 80 885945 Fax 80 885944 Technical 80 885942 Finland Orders 0800 914416 Fax 0800 914415 Technical 0800 914413 France Orders 01 60 920 920 Fax 01 60 920 925 Technical 01 60 920 930 Germany Orders 02103 29 12000 Fax 02103 29 22000 Technical 02103 29 12400 Ireland Orders 1800 555 049 Fax 1800 555 048 Technical 1800 555 061 Italy Orders 02 33430411 Fax 02 33430426 Technical 800 787980 Japan Telephone 03 5547 0811 Fax 03 5547 0818 Technical 03 5547 081 1 Luxembourg Orders 8002 2076 Fax 8002 2073 Technical 8002 2067 The Netherlands Orders 0800 0229592 Fax 0800 0229593 Technical 0800 0229602 Norway Orders 800 18859 Fax 800 18817 Technical 800 18712 Sweden Orders 020 790282 Fax 020 790582 Technical 020 798328 Switzerland Orders 055 254 22 11 Fax 055 254 22 13 Technical 055 254 22 12 UK Orders 01293 422 911 Fax 01293 422 922 Technical 01293 422 999 USA Orders 800 426 8157 Fax 800 718 2056 Technical 800 DNA PREP 800 362 7737 www qiagen com www PreAnalytiX com Australia BD North Ryde Orders 612 8875 7000 Fax 612 8875 7000 Belgium BD Erembodegem Orders 32 53 720 408 Fax 32 53 720 558 Canada BD Oakville Orders 800 268 5430 Fax 800 565 0897 Poland BD Warsaw Orders 48 22 651 75 88 Fax 48 22 651 75 89 USA BD Diagnostics Preanalytical Systems 1 Becton Drive Franklin Lakes NJ 07417 Orders 888 237 2762
25. 420213 Ip oJ4euunu Ip eBunpa e puujou p e10u9ju a cIpaw ejouiedns 8J0 DA OUDIIPUI e IFIDOINS Ip oJeuunu o spQ ur 1422s IIbis ouos ood 40jpuop ip jood y Ip pipi Bpup Isijouy OZ O8 l 66 8 OZ OZ l GE g LL S9 99 6 GL 60 rr I21U29J WIN IHO HAL Bm Brm oipew Br Gr paw Br Bri Bm Br Dp Ip AND as psoy ND as psoy AO GS pbilp ubs q Ad QS Dipaui psey ouoizDuiquio 5 Itu n 35 OL X Z 0 L Itu n 3 0L X 178 Itu n 3 OL X 79 luu n 3 0 X L S OL iOolpuop ID OOd 6 3iOIDuop Ip OOd 9 LIO DUOP Ip OOd HOJDUOP Ip jood IDIUD INI DAY IO IHAL DAY Dii Iqi9npoadiq CL pileqp1 OZ O8 l OZ 6 Va 661 9y g 6l LIZ 60 6 Lb LET 09 I31u291 IHN OHO 95 LET c 8 8L 9 G 9L v8 66 6 Yl 6 0 9 9 I210291 WIN Z OHOJ yl LIL ZO 6 6l 9 l c9 g Yl E L 99 6 6 690 96 I210291 IHN OHOJ o9 Bm 6n pipew Br Sri pip oui Bri 6n og 6n Bri 0p Ip AD as psegy AD as DSoy AD as Dipeul Dsed AD QS pip u bsay SUOIZIUIQUIO u n 95 OL X ZOL uu n 3 OL X t 8 u n 35 OL X G 9 luu n 3 0L X L S OL Holpuop ip ood 6 iolpuop ip ood 9 140DUop IP ood HOJDUOP IP Jood I231u29J IHN DA OHOJ ubo Ip ouau Jp PpijiqIINPOAdIY I D jPGDI 23 Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 Riproducibilit della RT PCR tra tecnici AAC Esecutore AA C Esecutore Figura 7 campioni di RNA isolat
26. Manuale PAXgene Blood RNA Kit Versione 2 Il sistema PAXgene Blood RNA costituito da una provetta per il prelievo ematico PAXgene Blood RNA Tube e dal kit per l estrazione acidonucleica PAXgene Blood RNA Kit Il sistema destinato al prelievo alla conservazione e al trasporto di campioni di sangue alla stabilizzazione dell RNA intracellulare in provetta chiusa nonch all isolamento e alla purificazione successivi dell RNA intracellulare da sangue intero L RNA purificato con il sistema PAXgene Blood RNA pu essere impiegato nei test di diagnostica molecolare basati sulla RT PCR Le caratteristiche di performance del sistema PAXgene Blood RNA indicate in questo manuale sono state stabilite solo per i trascritti genetici FOS e IL1B E responsabilit di chi utilizza il prodotto stabilire appropriate caratteristiche di performance del PAXgene Blood RNA Kit per altri trascritti target Per uso diagnostico in vitro CE 762174 1051083IT u d PreAnalytiX GmbH Feldbachstrasse CH 8634 Hombrechtikon Produced by QIAGEN GmbH for PreAnalytiX R1 MAT 1051083IT 9 PreAnalytiX Aprile 2008 ew A QIAGEN BD Company Marchi PAXgene PreAnalytiX PreAnalytiX GmbH QIAGEN QIAcube QIAGENGroup BD Vacutainer BD Hemogard Hemogard Safety Lok Becton Dickinson and Company Franklin Lakes NJ USA Eppendorf Eppendorf Netheler Hinz GmbH kit PAXgene Blood RNA non sono disponibili in tutti i Paesi
27. NA Tubes BRT i risultati di tali esperimenti non rispecchiano la precisione della ripetibilit del sistema che tiene conto anche delle differenze nel prelievo del sangue ma solamente la precisione della ripetibilita nella preparazione dell RNA vedi Fig 6 Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 19 Purificazione dell RNA riproducibile e ripetibile 24 A Ma E o 20 gt Oo c o r ld a S 12 T n li Im n E E amp i ic i I o O Ju II li I o c 8 9 Donatore B 24 T 20 gt Oo c n 16 E uy N 12 Oo lt x 8 x o9 4 o o cz 2 3 4 5 7 x 9 10 11 12 13 14 Donatore Figura 5 Campioni di sangue sono stati analizzati manualmente in quadruplicato da 3 tecnici A B C Sono stati utilizzati tre set di strumenti di laboratorio e tutti i campioni preparati da un tecnico sono stati elaborati con gli stessi strumenti ES Sono rappresentate medie e deviazioni standard della resa di RNA per campioni replicati dello stesso donatore e con tecnici diversi El Dodici campioni di sangue in replica da ciascuno dei 14 donatori sono stati elaborati da 3 tecnici diversi Sono rappresentate medie e deviazioni standard della resa di RNA per campioni dello stesso donatore e con tutti i tecnici Per tutti i campioni di RNA il rapporto A 40 A2g0 variava tra 1 8 to 2 2 20 Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 Ripetibilit e riproducibilit della resa
28. RNA Tube Se necessario vedere l Appendice C pagina 59 per consigli sull uso delle PAXgene Blood RNA Tubes BRT Assicurarsi che le PAXgene Blood RNA Tubes BRT vengano incubate per almeno 2 ore a temperatura ambiente dopo il prelievo di sangue per garantire la completa lisi delle cellule ematiche Incubazione delle PAXgene Blood RNA Tubes BRT per tutta la notte pu aumentare la resa Se una delle PAXgene Blood RNA Tubes BRT stata conservata a 2 8 C o 20 C o 70 C dopo il prelievo del sangue equilibrarla a temperatura ambiente e incubarla per almeno 2 ore prima di iniziare il protocollo Leggere le informazioni di sicurezza a pagina 7 Leggere Noti importanti pagine 32 42 Leggere le linee guida sulla manipolazione dell RNA Appendice A pagina 56 Leggere il QlAcube User Manual e ogni ulteriore informazione fornita con il QlAcube prestando particolare attenzione alle informazioni di sicurezza Assicurarsi che gli strumenti come le pipette e il QlAcube siano stati controllati e calibrati regolarmente secondo le raccomandazioni del produttore Dopo una lunga conservazione il tampone di legame BR2 pu formare un precipitato Se necessario riscaldare a 37 C per discioglierlo Il tampone di lavaggio 2 BR4 viene fornito come concentrato Per ottenere una soluzione di lavoro al primo utilizzo aggiungere 4 volumi di etanolo 96 10096 grado di purezza p a per analisi come indicato sul flacone Se si
29. T Provette di reazione I PROC TUBE Processing Tubes 2 ml Hemogard Chiusure secondarie BD CLOS Hemogard MCT Provette per TUBE microcentrifuga 1 5 ml RNFD DNasi I priva di RNasi liofilizzata La tabella continua alla pagina seguenre 50 762174 50 20 ml 18 ml 45 ml 11 ml ml 2x 125 ml 2x 1 4 ml 5x 10 6 x 50 50 3 x 50 1x10 500 Unit Kunitz Non compatibile con disinfettanti a base di candeggina Contiene un sale di guanidina Per le informazioni di sicurezza consultare pagina 7 t tampone di lavaggio 2 BRA viene fornito concentrato Per ottenere una soluzione di lavoro al primo utilizzo aggiungere 4 volumi di etanolo 96 100 grado di purezza p a per analisi come indicato sul flacone Le unit Kunitz vengono normalmente utilizzate per la misurazione della DNasi consultare pagina 43 o 49 per la definizione Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 PAXgene Blood RNA Kit 50 Catalogo n 762174 Numero di preparazioni 50 RDD Tampone di digestione 2x2 ml DNA tappo bianco DRB Tampone di risospensione BUF 2 ml DNasi provetta tappo lilla Colonne PAXgene Shredder SHRED COL lilla PAXgene Blood RNA Kit Handbook Versione 2 Condizioni di conservazione Le spin columns PAXgene RNA PRC le colonne PAXgene shredder PSC nonch la proteinasi K PK e i tamponi BR1 BR2 BR3 BRA e BR5 possono essere conservati in un luogo asciutto
30. TA 2 Allontanare il pollice prima di sollevare la chiusura NON utilizzare il pollice per rimuovere la chiusura dalla provetta BRT Attenzione Se la provetta BRT contiene sangue esiste un rischio di infezione Per evitare lesioni durante la rimozione della chiusura importante che il pollice utilizzato per spingerla verso l alto non venga in contatto con la provetta quando la chiusura Hemogard BD viene allentata 3 Sollevare la chiusura della provetta BRT Se come accade di rado la schermatura in plastica si separa dal fermo in gomma NON RIASSEMBLARE LA CHIUSURA Rimuovere con cautela il fermo in gomma dalla provetta BRT Istruzioni per inserire la chiusura secondaria Hemogard BD 1 Posizionare la chiusura secondaria sulla provetta BRT 2 Ruotaree spingere verso il basso con decisione finch non si blocca in posizione ll reinserimento completo del fermo necessario affinch la chiusura rimanga bloccata in posizione sulla provetta durante la manipolazione Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 59 Informazioni per l ordine Prodotto Contenuti Cat n Sistema PAXgene Blood RNA System Prodotti che possono essere ordinati presso QIAGEN PAXgene Blood RNA Kit 50 spin columns PAXgene RNA 762174 50 colonne PAXgene Shredder provette di reazione DNAsi priva di RNAsi Reagenti e tamponi privi di RNAsi Da utilizzare con le PAXgene Blood RNA Tubes QlAcube 110 V Stazione di lavoro per la purificazione 90
31. a provetta di reazione con il liquido eluito Pipettare con attenzione il campione nella colonna PRC e controllare che il campione sia completamente trasferito nella colonna PRC Pipettare 350 ul di tampone di lavaggio 1 BR3 nella colonna per centrifugazione PAXgene RNA PRC Centrifugare per 1 minuto a Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 45 12 13 14 15 16 17 46 8000 20000 x g Disporre la colonna PRC in una nuova provetta di reazione da 2 ml PT e smaltire la provetta di reazione PT utilizzata con il liquido eluito Aggiungere 10 pl di soluzione stock di DNasi RNFD a 70 pl di tampone per la digestione del DNA RDD in una provetta da 1 5 ml MCT Miscelare dando dei leggeri colpetti con le dita alla provetta e centrifugare brevemente per raccogliere il liquido residuo dalle pareti interne della provetta Se si opera ad esempio su 10 campioni aggiungere 100 pl di soluzione concentrata di DNasi RNFD a 700 ul di tampone di digestione DNA RDD Utilizzare le provette da 1 5 ml MCT in dotazione con il kit La DNasi particolarmente sensibile alla denaturazione fisica Per questo motivo miscelare la soluzione solo dando leggeri colpetti con le dita alla provetta Non utilizzare il vortex Pipettare la miscela di incubazione DNasi 80 pl direttamente alla membrana della colonna PAXgene RNA PRC e lasciare sul piano di lavoro 20 30 C per 15 minuti D Assicurarsi di pipetta
32. alla temperatura indicata sull etichetta del kit Il set DNasi priva di RNAsi che contiene DNasi RNFD tampone di digestione del DNA RDD e tampone di risospensione della DNasi DRB viene fornito a temperatura ambiente Alla consegna conservare tutti i componenti del set DNasi priva di RNasi alla temperatura indicata in etichetta Uso previsto Il kit PAXgene Blood RNA destinato alla purificazione del RNA intracellulare da sangue intero raccolto nella PAXgene Blood RNA Tube BRT Usando il kit in combinazione con la PAXgene Blood RNA Tube il sistema fornisce RNA intracellulare purificato da sangue intero umano per i test di diagnostica clinica molecolare basati sulla RT PCR Informazioni sull impiego delle PAXgene Blood RNA Tubes BRT si possono trovare nella descrizione del prodotto per le PAXgene Blood RNA Tubes Le caratteristiche di performance del sistema PAXgene Blood RNA indicate in questo manuale valgono per i trascritti genetici FOS e ILTB E responsabilit di chi utilizza il prodotto stabilire per il sistema PAXgene Blood RNA relative caratteristiche di performance per altri trascritti target 6 Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 Limitazioni all uso del prodotto Il kit PAXgene Blood RNA concepito per la purificazione dell RNA intracellulare da sangue intero umano 4 8 x 106 1 1 x 107 leucociti ml per applicazioni di diagnostica in vitro Non destinato alla purificazione del DNA genomico o di acidi nuc
33. ar il trattamento dell RNA Appendice A pagina 56 Installare il corretto adattatore per agitatore incluso nel QlAcube usare l adattatore per provette safe lock da 2 ml segnati con un 2 e porre la rastrelliera dell agitatore sopra l adattatore Controllare il cassette rifuti e se necessario svuotarlo Installare i protocolli se non lo si gi fatto per le corse precedenti Installare i protocolli PAXgene Blood RNA Part A and PAXgene Blood RNA Part B Vedere Installazione dei protocolli sul QIAcube pag 32 Procedura 1 50 Chiudere la porta del QIAcube e accendere il QIAcube con il tasto di accensione vedi Figura 13 pagina 33 Si sentir un beep e apparir lo schermo di partenza Lo strumento eseguir automaticamente i test di iniziazione Aprire la porta QlAcube e caricare i reagenti e gli attrezzi di plastica necessari nel QlAcube Vedi Caricare il QIAcube pag 34 41 Per guadagnare tempo si pu caricare durante uno o entrambe le successive fasi di centrifugazione da 10 minuti fasi 3 e 5 Centrifugare la PAXgene Blood RNA Tube BRT per 10 minuti a 3000 5000 x g usando un rotore basculante Assicurarsi che i campioni di sangue siano stati incubati nella PAXgene Blood RNA Tube BRT per almeno 2 ore a temperatura ambiente 15 25 C dopo il prelievo di sangue per garantire la completa lisi delle cellule ematiche Il rotore deve contenere adattatori per provette a fondo a
34. ay Media SD Media SD Confronto tra dati AA C AA Cr AA C4 AA C4 Sistema del test IL1B 18S rRNA assay Riproducibilit tra tutti i lotti per ogni tecnico Tutti i tecnici 0 00 0 00 0 00 0 00 lotto 1 lotto 1 Tutti i tecnici 0 03 0 48 0 07 0 66 lotto 2 lotto 2 Tutti i tecnici 0 21 0 52 0 11 0 71 lotto 3 lotto 3 Riproducibilit tra tutti i tecnici e all interno di ogni lotto Tutti i lotti 0 00 0 00 0 00 0 00 tecnico A tecnico A Tutti i lotti 0 46 0 44 0 06 0 69 tecnico A tecnico B Tutti i lotti 0 31 0 60 0 15 0 71 tecnico tecnico C Tecnico assistente tecnico che ha eseguito gli esperimenti Lotto numero di lotto del kit impiegato SD deviazione standard Sono riportati i valori medi dei valori AAC N 120 e le deviazioni standard dei dati rappresentati nelle figure 7 e 8 26 Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 Purificazione dell RNA in automatico La preparazione del campione usando il QlAcube segue le stesse fasi della procedura manuale e permette cos di continuare ad usare il PAXgene Blood RNA Kit per purificare RNA di alta qualit Vedi il QlAcube User Manual e www qiagen com MyQlAcube per ulteriori informazioni sul QlAcube Il protocollo per la purificazione dell RNA in automatico consiste di 2 parti o protocolli il PAXgene Blood RNA Part A e il PAXgene Blood RNA Part B con un breve intervento manuale tra le due parti
35. cantazione fare attenzione a non staccare il pellet e asciugare il bordo della provetta con carta assorbente pulita Miscelare con il vortex finch il pellet non si scioglie e centrifugare per 10 minuti a 3000 5000 x g utilizzando un rotore basculante Rimuovere ed eliminare tutto il sovranatante Eventuali detriti cellulari che rimangono nel sovranatante dopo la miscelazione con vortex non influenzano la procedura D La rimozione incompleta del sovranatante inibisce la lisi e diluisce il lisato compromettando le condizioni di legame dell RNA alla membrana PAXgene Aggiungere 350 ul di tampone di risospensione BR1 e miscelare su vortex fino alla completa dissoluzione del pellet Pipettare il campione in una provetta MCT da 1 5 ml Aggiungere 300 pl di tampone di legame BR2 e 40 pl di proteinasi K PK Miscelare su vortex per 5 secondi quindi incubare a 55 C per 10 minuti utilizzando un incubatore agitatore a 400 1400 rpm Dopo Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 8 10 11 l incubazione impostare la temperatura dell incubatore agitatore a 65 C per la fase 20 D Non mescolare il tampone di legame BR2 e la proteinasi K PK prima di aggiungerli al campione Pipettare il lisato direttamente nella colonna PAXgene Shredder PSC lilla posta in una provetta di reazione da 2 ml PT e centrifugare per 3 minuti alla velocit massima non superiore a 20000 x g Pipettare con attenzione il lisato nella
36. colonna PSC e controllare che il lisato sia trasferito completamente alla spin column PSC Per evitare danni a colonne PSC e provette di reazione PT non superare 20 000 x g Alcuni campioni possono uscire dalla colonna PAXgene Shredder PSC senza centrifugazione Questo dovuto alla bassa viscosit di alcuni campioni e non dovrebbe essere considerato un difetto del prodotto Con la massima cura trasferire il sovranatante della frazione eluita in una provetta per microcentrifuga pulita da 1 5 ml MCT senza interferire con il pellet nella provetta di reazione Aggiungere 350 ul di etanolo 96 100 grado di purezza p a Miscelare su vortex e centrifugare brevemente 1 2 secondi a 500 1000 x g per rimuovere le gocce all interno del tappo della provetta La durata della centrifugazione non deve superare 1 2 secondi in caso contrario possono precipitare gli acidi nucleici riducendo la resa di RNA totale Pipettare 700 ul di campione in una spin column PAXgene RNA PRC rossa posta precentamente in una provetta di reazione da 2 ml PT e centrifugare per 1 minuto a 8000 20000 x g Disporre la colonna PRC in una nuova provetta di reazione da 2 ml PT e smaltire la provetta di reazione PT con il liquido eluito Pipettare il campione rimanente in una spin column PAXgene RNA PRC e centrifugare per 1 minuto a 8000 20000 x g Disporre la colonna PRC in una nuova provetta di reazione da 2 ml PT e smaltire l
37. del gene FOS sono stati determinati mediante real time RT PCR duplex utilizzando l rRNA 18S come standard interno Nel grafico sono riportati i valori per tutti i campioni analizzati con le medie e le deviazioni standard Le linee tratteggiate indicano la precisione totale 3x del test 2 34 CT 14 Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 Stabilit dell RNA in campioni di sangue q 2 8 C IL 1B AAC T c Eg Conservazione giorni AAG e I ho Conservazione giorni Figura 4 Il prelievo del sangue e la purificazione dell RNA sono avvenuti dopo conservazione a 2 8 C come descritto nella Figura 3 livelli relativi di trascrizione di IL 1B sono stati determinati mediante real time RT PCR duplex utilizzando l rRNA 18S come standard interno Nel grafico sono riportati i valori per tutti i campioni analizzati con le medie e le deviazioni standard Le linee tratteggiate indicano la precisione totale 3x del test 1 93 CT Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 15 Concentrazione e purificazione dell RNA II PAXgene Blood RNA Kit destinato alla purificazione dell RNA totale da 2 5 ml di sangue intero umano raccolto in una PAXgene Blood RNA Tube BRT La procedura semplice e pu essere realizzata in automatico o manualmente vedi diagramma In entrambi i protocolli la purificazione inizia con una fase di centrifugazioni per pellettare gli acidi nucleici nella PAXgene Blood RNA Tube BRT Il pellet viene lavato e r
38. e PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 27 Resa dell RNA Procedura in automatico T Cit j FL o Sa EU t Ha PA y ul i 2 az pi a E 1 d a t L r t ll i 2 ET na T k E tus e d 1 CQ 8 oa f u ot Le k CE a e s da h ET B J sa a k O ni gt n l F a ot 4 4 da incra A d L i E lt a E a o Z s 4 cc E O 9 o a 2 3 2 3 2 3 A B cC Figura 9 Campioni di sangue di 48 differenti donatori sono stati raccolti nelle PAXgene Blood RNA Tubes BRT provette per donatore 288 provette in totale Il contenuto dei campioni da 6 donatori sono stati messi in pool e rialiquotati in 36 campioni Questi 36 campioni per un pool di 6 donatori sono stati processati da 3 differenti operatori A B e C Ogni esecutore ha usato 3 differenti lotti 1 2 3 del PAXgene Blood RNA Kit per l estrazione in automatico e ha processato campioni quadruplicati da ognuno degli 8 pool di donatori Le rese di RNA per tutti i campioni individuali sono mostrati per ogni combinazione esecutore lotto Almeno 95 dei campioni non ha mostrato inibizione nella RT PCR quando si usato pi del 30 dell eluato Usando il protocollo in automatico non sono rilevabili contaminazioni crociate tra i campioni come misurato con la RT PCR quantitativa in
39. e come descritto nel QlAcube User Manual Wilfinger W W Mackey M and Chomoczynski P 1997 Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity BioTechniques 22 474 Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 55 Appendice A Note generali per il trattamento dell RNA Trattamento dell RNA D Le ribonucleasi RNasi sono enzimi molto stabili e attivi che generalmente non richiedono cofattori per la loro azione Poich le RNasi sono difficili da inattivare e anche minime quantit sono sufficienti a distruggere l RNA non utilizzare materiale in plastica o vetro senza aver prima eliminato le possibili contaminazioni da RNasi Fare molta attenzione a non introdurre inavvertitamente RNasi nel campione di RNA durante o dopo la procedura di purificazione Per creare e mantenere un ambiente privo di RNasi occorre prendere le seguenti precauzioni durante il pre trattamento e l utilizzo di flaconi e soluzioni monouso e non mentre si opera con l RNA Raccomandazioni generali per il trattamento Quando si lavora con FRNA necessario utilizzare tecniche microbiologiche appropriate Le mani e le particelle di polvere trasportano batteri e muffe e rappresentano le fonti pi comuni di contaminazione do RNasi Indossare sempre guanti in lattice o vinile quando si manipolano i reagenti e i campioni di RNA per evitare la contaminazione da RNasi dovuta alla superficie della pelle o alla polvere delle a
40. e di stabilizzazione trascritti genetici FOS e IL 1B le caratteristiche di performance del kit non sono state definite per tutti trascritti E compito di chi utilizza il prodotto verificare se per altri trascritti sia necessaria una validazione Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 11 Stabilit dell RNA in campioni di sangue q 18 25 C FOS 9 12 13 Conservazione giorni e 9 12 13 Conservazione giorni Figura 1 Il sangue stato prelevato da 10 donatori con campioni in duplicato e conservato a 18 25 C per il numero di giorni indicato Quindi stata eseguita la purificazione dell RNA totale E3 Il sangue stato prelevato e conservato nelle PAXgene Blood RNA Tubes BRT e l RNA totale stato purificato utilizzando il kit PAXgene Blood RNA E sangue e stato raccolto e conservato in provette standard contenenti EDTA come sostanza anticoaugulante e l RNA totale stato purificato utilizzando un metodo standard di estrazione organica e con purificazione basata su membrane di silice livelli relativi di trascrizione del gene FOS sono stati determinati mediante RT PCR duplex in tempo reale utilizzando l rRNA 18S come standard interno Nel grafico sono riportati i valori per tutti i campioni analizzati con le medie e le deviazioni standard Le linee tratteggiate indicano la precisione totale 3x del test 2 34 CT 12 Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 Stabilit dell RNA in campioni di sa
41. edie e dalle deviazioni standard in figura 6A Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 21 Bri 9 QS Br DIp uu psay u e nje 301 x Z OL OL HojDuop IP Iood Bri 9 as Br DIp uu psay u e nje 301 x Z OL OL 1401Duop IP ood Bri 9 QS 67M A Bri DIp uu DSay ltu n 3 OL x vg 6 tolpuop ip ood Br gt GS peu ps y u e nje 301 x ve 6 tolpuop IP ood og Bn 9 QS br pip uu psoy ltu n 3 OL X S9 9 tioIDuop IP 00d veil Ord 9y Bri pip uu psoy og Bri 9 Gs ju e nje 301 x L S MOJDUOP IP ood IMO 1HN4 g o31u39 IMO 1404 g o2ru2e IMO iHni g o21u2e NOP Ip SUOIZDUIQUIO ODIUI9 IUDO Jed IHOJ IHN DAY DH Iqi2npoadry gi Oqo og bm 9 as br pip uu psoy ltu n 3 OL X 6 9 9 4O DUOP IP ood 5rl 9 Gs Br DIp uu psay u e nje 01 X L S MOJDUOP IP ood 7 0310294 OUO g 0210291 E oro V 021Uu29J E OUO V 021U29 Z OHO g 021029J Z OHO V ODIUD9 Z OHO 7 0310284 OUO g 0210281 OHO V 0O21Uu29J OHO HOP Ip SUOIZDUIQUIO 0210294 IUBO Jad e ouo IUBO Ip ouJ94u D DJ Iqionpoadry WL Dil qD L Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 22 jood 1UBO Ip uolpuop rep 190919 Ip u uunu rep DIPS p bop uouruuejep 404S ouos ITli2oon rp u uunu ju uro2ne OL X L L O1 X gp
42. ella 3 Posizioni nel rack per i flaconi di reagenti Posizione Reagente Tampone di legame BR2 Etanolo 96 100 Tampone di lavaggio 1 BR3 Tampone di lavaggio 2 BR4 lasciare vuoto lasciare vuoto Il tampone di lavaggio 2 BR4 viene fornito concentrato Prima di usarlo la prima volta per ottenere una soluzione che funzioni aggiungere 4 volumi di etanolo 96 100 grado di purezza p a come indicato sulla bottiglia 34 Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 Caricamento del rack per i flaconi di reagente i Posizione 2 etanolo al 96 100 Posizione 1 Tampone di legame BR2 Posizione 4 Tampone di lavaggio 2 BRA Posizione 3 Tampone di lavaggio 1 BR3 co mp o O D D D Q O O Cc O O O O RA e v Posizione 5 X Posizione 6 Vuota j Vuota Figura 14 E Schema delle posizioni e dei contenuti dei flaconi nel rack dei flaconi per reagenti El Caricamento del rack sul QlAcube Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 35 Interno del QIAcube Figura 15 36 T Coperchio centrifuga 2 Centrifuga Agitatore EY Rack per i flaconi dei reagenti El Sensore per puntali Slots per provetta da microcentrifuga Rack per puntali Slots per lo smaltimento di puntali e colonne L Braccio robot Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 Spin columns PRC PSC provette per microcentri
43. elli di trascritti tra RNA preparato da campioni di sangue in coppia usando entrambi i protocolli di estrazione in automatico e manuale sono stati calcolati dal metodo AAC Valori AAC individuali per tutte le coppie di campione 4 replicati per 8 pool di donatori per 3kit di lotti per 3 donatori 288 coppie per ogni gene sono segnati come singoli punti con medie punti pi grandi e deviazioni standard barre nere per tutti campioni mostrati Le linee tratteggiate indicano la precisione totale 3x dei test FOS 2 34 C IL1B 1 93 Cj 30 Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 Attrezzature e reagenti richiesti ma non forniti Quando si opera con sostanze chimiche indossare sempre un camice da laboratorio guanti monouso e occhiali di protezione Per ulteriori informazioni consultare le relative schede di sicurezza dei materiali MSDS disponibili presso il produttore Per tutti i protocolli Provette PAXgene Blood RNA Tubes BRT n cat 7642165 Etanolo 96 100 grado di purezza p a Pipette 10 ul 4 ml Puntali sterili privi di RNasiT con barriere aereosol anticontaminazione Cilindro graduato Centrifuga in grado di raggiungere 3000 5000 x g con rotore basculante e alloggiamenti per le PAXgene Blood RNA Tubes BRT Vortex Ghiaccio tritato Pennarello permanente per scrivere sulle etichette Per il protocollo manuale Microcentrifuga a velocit variabile capace di arrivare a 1000 8000 x g e con rotore per prove
44. fuga MCT e oggetti plastici del QIAcube Posizionare 2 racks per puntali con puntali per filtro da 1000 ul sul QlAcube vedi Figura 15 Caricare i racks con altri puntali quando necessario D Usare solo puntali per filtro da 1000 ul destinati all uso con il QlAcube Con un pennarello permanente etichettare gli adattatori per il rotore e le provette per microcentrifuga MCT per ogni campione Aprire le colonne PAXgene Shredder PSC da usare e tagliare completamente tappi con delle forbici vedi Figural 6 D Per un corretto funzionamento della pinza robotica del QlAcube rimuovere completamente tagliare i tappi e tutte le parti di plastica che uniscono il tappo alle colonne PAXgene shredder PSC vedi Figura 16 Diversamente la pinza robotica non pu afferrare correttamente le spin columns PSC PRC Caricare la spin column PAXgene RNA PRC la colonna Shredder PAXgene PSC senza tappo e la provetta per microcentrifuga MCT etichettata nelle posizioni relative in ciascun adattatore per rotore etichettato come riportato nella Tabella 4 e nella Figura 17 pagina 38 D Assicurarsi che i tappi della spin column PRC e della provetta per microcentrifuga MCT siano spinti completamente sul fondo degli slots al margine dell adattatore del rotore altrimenti i tappi potrebbero rompersi durante la centrifugazione Caricare una colonna PAXgene shredder PSC Tappo della colonna PSC rimosso scorrettamente rimosso erronea
45. i nell esperimento della figura 6 sono stati impiegati in esperimenti di real time RT PCR relativi livelli di trascrizione FOS e LE sono stati determinati tramite real time RT PCR duplex impiegando rRNA 18S come standard interno Sono riportati i valori di tutti i campioni relativamente ai valori per l esecutore 1 10 pool di donatori x 3 lotti x 4 ripetizioni 120 set di dati per ogni gene con valore medio linee rosse e deviazione standard barre nere Le linee tratteggiate indicano il range della precisione degli assay 3x precisione totale di 2 34 C FOS e 1 93 C IL1B 24 Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 Riproducibilit della RT PCR tra lotti Lotto Lotto Figura 8 campioni di RNA isolati nell esperimento della figura 6 sono stati impiegati in esperimenti di real time RT PCR relativi livelli di trascrizione FOS e EX ILTB sono stati determinati tramite real time RT PCR duplex impiegando rRNA 18S come standard interno Sono riportati i valori di tutti i campioni relativamente ai valori per lotto 1 10 pool di donatori x 3 esecutori x 4 ripetizioni 120 set di dati per ogni gene con valore medio linea rossa e deviazione standard barra nera Le linee tratteggiate indicano il range della precisione degli assay 3x precisione totale di 2 34 C FOS e 1 93 C IL1B Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 25 Tabella 2 Riepilogo dei risultati RT PCR riportati in Fig 7 e 8 FOS 18S rRNA ass
46. inclusi con il QlAcube negli slots sul bordo di ogni rack dell agitatore vicina ad ogni provetta di reazione Questo permette la rilevazione dei campioni durante il controllo del caricamento Assicurarsi che sia installato il corretto adattatore per agitatore adattatore agitatore 2 ml provette safe lock indicati con un 2 inclusi con il QlAcube D Se si processano meno di 12 campioni assicurarsi di caricare il rack dell agitatore come mostrato in Figura 19 pag 39 Uno o 11 campioni non possono essere processati 9 Chiudere la porta dello strumento QlAcube vedi Figura 13 pag 33 10 Selezionare il protocollo PAXgene Blood RNA Part A e far partire il protocollo Segurre le istruzioni date sul touchscreen QlAcube Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 51 11 12 13 14 15 52 D Assicurarsi che le due parti del programma parte A e B siano installate sullo strumento QlAcube vedi Installare i protocolli sul QlAcube pag 32 II QlAcube eseguir i controlli del caricamento dei campioni dei puntali degli adattatori del rotore e dei flaconi per reagenti Quando terminato il protocollo PAXgene Blood RNA Part A aprire la porta dello strumento QIAcube vedi Figura 13 pag 33 Rimuovere e scartare le colonne PAXgene RNA PRC dagli adattatori del rotore e le provette di reazione PT vuote dall agitatore Durante la corsa le colonne vengono trasferite dalla posizione
47. isospeso e segue poi la purificazione manuale e o in automatico Di massima i due protocolli seguono le stesse fasi del protocollo con gli stessi componenti del kit 16 Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 La procedura PAXgene Blood RNA manuale Sanque ee Se See ar Aggiungere proteinasi K PK bi e tampone di legame BR2 Incubare Trasferire in una colonna PAXgene Shredder PSC Miscelare i Trasferire il sovrana tante dell eluato inuna provetta per microcentrifuga Aggiungere etanolo J Caricare su una spin column PAXgene RNA PRC lavare il Legame RNA totale Lavare Digestione DNA risospendere trasferire in una provetta i pellet Lavare per micro centrifuga MCT IT Eluiere Riscaldare a 65 C RNA pronto qll uso Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 17 La procedura PAXgene Blood RNA in automatico Sangue I Aggiungere proteinasi K PK e tampone di legame BR2 Trasferire in una colonna miscelare PAXgene Shredder PSC 1 Aggiungere etanolo all eluato lavare il Caricare su una spin column PAXgene RNA PRC Legame RNA totale risospendere Lavare Trasferire in una provetta di reazione PT e caricare nell agitatore QIAcube Cd ci a sd pellet
48. ivi adatti 536 37 Indossare indumenti protettivi adatti e guanti S46 In caso di ingestione consultare immediatamente il medico e mostrargli il contenitore o l etichetta 8 Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 Proteinasi K PK mu Contiene proteinasi K Tritirachium album sensibilizzante irritante Frasi di rischio e consigli di prudenza R36 37 38 42 43 23 24 26 36 37 DNasi x Contiene desossiribonucleasi bovina sensibilizzante Frasi di rischio e consigli di prudenza R42 43 22 24 26 36 37 Informazioni di emergenza 24 ore su 24 E possibile ottenere informazioni mediche di emergenza in inglese francese e tedesco 24 ore su 24 presso Centro di informazioni antiveleni Magonza Germania Tel 49 6131 19240 R10 Infiammabile R20 21 22 Nocivo per inalazione contatto con la pelle e se ingerito R32 In contatto con acidi libera gas estremamente tossici R36 37 38 Irritante per gli occhi le vie respiratorie e la pelle R42 43 Pu provocare sensibilizzazione per inalazione e contatto con la pelle S13 Conservare lontano da cibi bevande e alimenti per animali S22 Non respirare le polveri S23 Non respirare gli aerosol S24 Evitare il contatto con la pelle S26 In caso di contatto con gli occhi lavare immediatamente e abbondantemente con acqua e consultare il medico S36 Indossare indumenti protettivi adatti 536 37 Indossare indumenti protettivi adatti e guanti S46 In caso di ingestione
49. l protocollo manuale i valori A260 A280 sono tra 1 8 e 2 2 e lt 1 w w di DNA genomico presente in gt 95 di tutti i campioni come misurato da PCR quantitativa in tempo reale di una sequenza del gene beta actin Almeno il 95 dei campioni non mostra inibizioni nella RT PCR se usato pi del 30 dell eluato Usando il protocollo manuale il tempo medio di preparazione dei campioni in base ai dati da 12 preparazioni circa 90 minuti con soli 40 minuti di passaggi manuali La resa di RNA da 2 5 ml di sangue intero umano da donatori sani gt 3 ug per 95 dei campioni elaborati Le rese sono in ogni caso strettamente legate allo stato di salute del donatore e possono variare da un individuo all altro Per le analisi di singoli donatori il sistema PAXgene Blood RNA fornisce rese riproducibili e ripetibili vedi Fig 5 e 6 alle pag 20 e 21 e risultati per la RT PCR riproducibili e ripetibili vedi Fig 7 e 8 alle pag 24 e 25 dimostrandosi quindi l ideale per i test di diagnostica clinica La figura 5 mostra la riproducibilit e la ripetibilit del PAXgene Blood RNA System In ulteriori esperimenti sono stati esaminati sia lotti diversi del kit PAXgene Blood RNA sia quanto l esecutore dei test influisce sulla riproducibilit della resa di RNA e dei risultati per la Real Time RT PCR Poich per queste analisi sono stati utilizzati campioni di sangue analizzati in pool anzich campioni raccolti singolarmente con le Paxgene Blood R
50. la microcentrifuga Centrifugare come descritto nel protocollo e Aprire una colonna PRC PSC per volta facendo attenzione a non creare aerosol Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 e Per un efficiente elaborazione in parallelo di campioni multipli preparare un rack con provette di reazione PT in cui trasferire le colonne PRC PSC dopo la centrifugazione Smaltire le provette PT che contengono gli eluati e disporre le nuove provette di reazione PT con le colonne PRC PSC direttamente nella microcentrifuga Ulteriori accorgimenti prima di iniziare il protocollo Il sangue va raccolto nelle PAXgene Blood RNA Tubes BRT secondo le istruzioni della descrizione del prodotto PAXgene Blood RNA Tube Se necessario vedere Appendice C pagina 59 per le raccomandazioni riguardo le PAXgene Blood RNA Tubes BRT Assicurarsi che le PAXgene Blood RNA Tubes BRT vengano incubate per almeno 2 ore a temperatura ambiente dopo il prelievo di sangue per garantire la completa lisi delle cellule ematiche L incubazione delle PAXgene Blood RNA Tubes BRT per tutta la notte pu aumentare la resa Se una delle PAXgene Blood RNA Tubes BRT stata conservata a 2 8 C o 20 C o 70 C dopo il prelievo del sangue equilibrarla a temperatura ambiente e incubarla per almeno 2 ore prima di iniziare il protocollo Leggere le informazioni di sicurezza a pagina 7 Leggere le linee guida sulla manipolazione dell RNA Appendice A pagina 56
51. leici virali da sangue intero umano Poich solo un numero limitato di trascritti RNA stato validato per le condizioni di stabilizzazione indicate in questo manuale trascritti FOS e IL1B non pu essere stabilita una caratteristica di performance per tutti i trascritti E responsabilit di chi utilizza il kit verificare i propri dati e quelli del produttore e decidere se necessaria una validazione per altri trascritti non indicati in questo manuale Controllo di qualit In conformit al sistema di gestione della qualit secondo le norme ISO di QIAGEN ogni lotto del kit PAXgene Blood RNA viene testato in base a criteri di controllo prestabiliti rispetto a specifiche prestabilite per garantire la costante qualit del prodotto Supporto tecnico Ai suoi clienti QIAGEN garantisce la qualit della consulenza scientifica del proprio supporto tecnico Personale qualificato e di grande esperienza nel settore della biologia molecolare a vostra disposizione per qualsiasi domanda riguardante i prodotti PreAnalytix In caso di dubbi sul kit PAXgene Blood RNA non esitate a contattarci Anche per ulteriori informazioni il supporto tecnico di QIAGEN vedi pag 63 a vostra disposizione Informazioni di sicurezza Quando si opera con sostanze chimiche indossare sempre un camice da laboratorio guanti monouso e occhiali di protezione Per ridurre il rischio di infezione ad es da HIV o dai virus dell epatite B o lesioni quand
52. lla preparazione del campione ad es i sovranatanti provenienti dalle fasi di centrifugazione delle procedure di purificazione dell RNA devono essere considerati sempre potenzialmente infettivi Per questo devono essere autoclavati o inceneriti per distruggere qualsiasi materiale infettivo Lo smaltimento deve essere effettuato in conformit alle normative ufficiali vigenti Ai componenti del kit PAXgene Blood RNA si applicano frasi di rischio e i consigli di prudenza frasi R e S di seguito riportate per le informazioni di sicurezza sulle PAXgene blood RNA Tubes consultare la descrizione del prodotto relativa Tampone di legame BR2 x Contiene guanidina tiocianato nocivo Xn Frasi di rischio e consigli di prudenza R20 21 22 32 S13 26 36 46 Tampone di lavaggio 1 BR3 Contiene etanolo infiammabile Frase di rischio R10 R10 Infiammabile R20 21 22 Nocivo per inalazione contatto con la pelle e se ingerito R32 In contatto con acidi libera gas estremamente tossici R36 37 38 Irritante per gli occhi le vie respiratorie e la pelle R42 43 Pu provocare sensibilizzazione per inalazione e contatto con la pelle S13 Conservare lontano da cibi bevande e alimenti per animali S22 Non respirare le polveri S23 Non respirare gli aerosol S24 Evitare il contatto con la pelle S26 In caso di contatto con gli occhi lavare immediatamente e abbondantemente con acqua e consultare il medico S36 Indossare indumenti protett
53. luzione BR5 126 187 23 DNase RNFD 164 RDD 313 170 260 33 DNase RNFD 228 RDD 399 213 334 42 DNase RNFD 292 RDD 486 256 407 51 DNase RNFD 356 RDD 572 342 554 69 DNase I RNFD 4 485 RDD 745 386 628 78 DNase RNFD 549 RDD 831 2 3 4 5 299 481 60 DNase RNFD 421 RDD 658 7 8 9 429 701 88 DNase RNFD 613 RDD 918 10 472 774 97 DNase RNFD 678 RDD 1004 12 558 921 115 DNase RNFD 806 RDD 1177 40 Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 Tabella 6 Slots delle provette da microcentrifuga Posizione A B C Mix per incubazione Tampone di Contenuto Proteinasi K PK DNase eluzione BR5 Recipiente provetta di provetta di provetta di reazione PT reazione PT reazione PT Usare le provette di reazione PT da 2 ml incluse nel PAXgene Blood RNA Kit Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 41 Protocollo Purificazione manuale dell RNA totale dal sangue intero umano nelle PAXgene Blood RNA Tubes BRT Accorgimenti importanti prima di iniziare la preparazione 42 Assicurarsi che la confezione del kit sia intatta e non danneggiata e che i tamponi non mostrino perdite Non utilizzare un kit danneggiato Quando si utilizza una pipetta assicurarsi che sia impostata sul volume corretto e che il liquido venga aspirato e dispensato completamente Per evitare di trasferire un campione alla provetta o alla colonna sbagliata assicurarsi che tutte
54. mente parte del tappo rimasto Tappo della colonna PSC rimosso correttamente Figura 16 La Shredder column PSC PAXgene caricata nella posizione centrale Tagliare il tappo prima di caricare la colonna PSC Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 37 Tabella 4 Strumenti nell adattatore per rotore Posizione Labware Posizione tappo Spin column PAXgene RNA rossa PRC L1 Colonna PAXgene Shredder lilla PSC tagliare il tappo prima di posizionare nell adattatore per rotore Provetta per microcentrifuga MCT L3 Usare le provette per microcentrifuga 1 5 ml MCT incluse nel kit PAXgene Blood RNA Figura 17 L adattatore per rotore ha tre posizioni per provette 1 3 e tre posizioni per tappi L1 L3 Caricare la centrifuga Caricare gli adattatori per rotore negli scomparti della centrifuga come in Figura 18 D Se si processano meno di 12 campioni assicurarsi di caricare il rotore della centrifuga bilanciato radialmente vedi Figura 19 Tutti gli scomparti della centrifuga devono essere montati prima di far partire un protocollo anche se i campioni da processare sono meno di 12 Un singolo uno campione o 11 campioni non possono essere processati Caricare la centrifuga Figura 18 Caricamento degli adattatori per rotore assemblati negli scomparti della centrifuga 38 Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 Loading the Centrifuge and Shaker 2 campioni 3 campioni 4 campioni 5 campioni 6
55. minazioni proteiche Se sono necessari dati precisi e affidabili consigliamo di determinare un rapporto di assorbanza A360 A3g0 in 10 mM di Tris Cl pH 7 5 L RNA puro ha un rapporto A o A ao pari a 1 8 2 2 Per azzerare il fotometro utilizzare lo stesso tampone nel quale diluito l RNA e aggiungere lo stesso volume di tampone di eluizione BR5 che corrisponde al volume dell RNA eluito Il tampone di eluizione BR5 assorbe intensamente a 220 nm e questo pu portare ad alti valori di assorbanza di sfondo se lo spettrofotometro non stato azzerato correttamente Wilfinger W W Mackey M and Chomoczynski P 1997 Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity BioTechniques 22 474 58 Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 Appendice C Utilizzo delle PAXgene Blood RNA Tubes D Le seguenti istruzioni di BD forniscono delle indicazioni per l uso delle PAXgene Blood RNA Tubes BRT Ulteriori informazioni sull impiego delle PAXgene Blood RNA Tubes BRT si trovano nella relativa descrizione del prodotto Istruzioni per rimuovere la chiusura Hemogard BD 1 Afferrare la PAXgene Blood RNA Tube BRT con una mano disponendo il pollice sotto la chiusura Hemogard BD per maggiore stabilit tenere il braccio su una superficie solida Con l altra mano ruotare la chiusura Hemogard BD e contemporaneamente spingere con il pollice verso l alto FINCH IL FERMO DELLA PROVETTA NON SI ALLEN
56. n cui viene diluito RNA e assicurarsi di aggiungere un volume di tampone di eluizione BR5 corrispondente a quello dell RNA eluito Il tampone di eluizione BR5 ha un alta assorbenza a 220 nm che pu portare ad alti livelli di assorbenza di sfondo se lo spettrofotometro non azzerato correttamente Di seguito riportato un esempio per il calcolo relativo alla quantificazione dell RNA Volume del campione di RNA 80 ul Diluizione 10 ul di campione di RNA 140 ul 10 mM Tris Cl pH 7 5 1 15 diluizione Misurare l assorbanza del campione diluito in una cuvetta priva di RNasi Asso 0 3 Concentrazione del campione di RNA 44 x Aso x fattore di diluizione 44 x 0 3 x 15 198 ug ml Resa totale concentrazione x volume del campione in millilitri 198 ug ml x 0 08 ml 15 8 ug RNA Quando si opera con sostanze chimiche indossare indossare sempre un camice da laboratorio guanti monouso e occhiali di protezione Per ulteriori informazioni consultare le relative schede di sicurezza dei materiali MSDS Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 57 Purezza dell RNA Il rapporto dei valori di assorbanza compresi tra 260 nm e 280 nm Ao As ao rappresenta una misura per la purezza dell RNA rispetto ai contaminanti che assorbono nell UV come le proteine Questo rapporto di assorbanza dipende dal valore pH Un pH relativamente basso genera un rapporto A240 A280 relativamente basso e riduce la sensibilit rispetto alle conta
57. ngue q 18 25 C IL 1B Fl e AAG C Conservazione giorni AAG eee ENT l HJ 4 Conservazione giorni Figura 2 Il prelievo del sangue e la purificazione dell RNA sono avvenuti dopo conservazione a 18 25 C come descritto nella Figura 1 livelli relativi di trascrizione di IL 1B sono stati determinati mediante real time RT PCR duplex utilizzando l rRNA 18S come standard interno Nel grafico sono riportati i valori per tutti i campioni analizzati con le medie e le deviazioni standard Le linee tratteggiate indicano la precisione totale 3x del test 1 93 CT Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 13 Stabilit dell RNA in campioni di sangue a 2 8 C FOS e 3 AAC 9 12 13 EE l5svs5 Ul i LL E SI IUOOO s GS Conservazione giorni 12 13 Conservazione giorni Figura 3 l sangue stato prelevato da 10 donatori con campioni in duplicato e conservato a 2 8 C per il numero di giorni indicato Quindi stata eseguita la purificazione dell RNA totale Il sangue stato prelevato e conservato nelle PAXgene Blood RNA Tubes BRT e l RNA totale purificato con il kit PAXgene Blood RNA Il sangue stato prelevato e conservato in provette standard per il prelievo ematico trattate con EDTA come anticoagulante L RNA totale stato purificato utilizzando un metodo standard di estrazione organica con purificazione basata su membrane di silice livelli relativi di trascrizione
58. o si opera con materiali biologici o sostanze chimiche indossare sempre un adeguato camice da laboratorio guanti monouso e occhiali di protezione Per ulteriori informazioni consultare le relative schede di sicurezza material safety data sheets MSDS Le schede MSDS sono disponibili on line nel comodo e compatto formato PDF all indirizzo www preanalytix com rna_msds asp dove si possono reperire visualizzare e stampare le schede di sicurezza per il presente kit e per ogni suo componente Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 7 Il tampone di legame BR2 e quello di lavaggio 1 BR3 contengono guanidina tiocianato che pu formare composti altamente reattivi in combinazione con la candeggina Se si rovescia liquido contenente questi tamponi pulire con un idoneo detergente da laboratorio con acqua Se il liquido contiene agenti potenzialmente infettivi innanzitutto pulire l area interessata con acqua e detergente da laboratorio e successivamente con una soluzione di ipoclorito di sodio all 1 v v ATTENZIONE NON aggiungere candeggina o soluzioni acide direttamente ai residui delle preparazioni dei campioni di RNA La soluzione di stabilizzazione per l RNA e il sangue contenuto nelle PAXgene Blood RNA Tubes BRT possono essere disinfettati utilizzando 1 volume di una soluzione di candeggina disponibile in commercio ipoclorito di sodio al 596 per 9 volumi di soluzione di stabilizzazione per l RNA e di sangue residui de
59. r il trattamento dell RNA 56 Appendice B Determinazione della concentrazione resa e purezza dell RNA totale 57 Appendice C Utilizzo delle PAXgene Blood RNA Tubes 59 Informazioni per l ordine 60 Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 3 Spiegazione dei simboli lt N gt O ok co U STERILE R w ge D DNase RNase Free DNase Set rw j Q so bi O Contenuto sufficiente per lt N gt test Consultare le istruzioni per l uso Utilizzare entro Non riutilizzare Dispositivo medico per diagnostica in vitro Numero di catalogo Codice lotto Numero di materiale Componenti Numero Metodo di sterilizzazione con radiazioni Unit Kunitz Limite di temperatura Limite superiore di temperatura Fabbricante Nota importante Trascrivere la data corrente dopo aver aggiunto etanolo al flacone AI momento della consegna Aggiungere Contiene Ricostituito Desossiribonucleasi Etanolo Guanidina isotiocianato Set DNasi privo di RNasi Porta a Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 Contenuti del kit PAXgene Blood RNA Kit Catalogo n Numero delle preparazioni BR 1 Tampone di risospensione BR 2 Tampone di legame BIND BUF BR 3 Tampone di lavaggio 1 WASH BUF 1 BR 4 Tampone di lavaggio 272 WASH CONC concentrate BR5 Tampone di eluizione RNFW Acqua priva di RNasi WASH flacone PK Proteinasi K tappo verde PROTK PRC Spin Columns PAXgene PAXgene RNA rosse P
60. re la miscela di incubazione di DNasi RNFD e di tampone RDD direttamente alla membrana Se parte della miscela rimane sulle pareti o sull O ring della colonna per centrifugazione PRC la digestione della DNasi pu risultare incompleta Pipettare 350 pl di tampone di lavaggio 1 BR3 in una spin column PAXgene RNA PRC e centrifugare per 1 minuto a 8000 20000 x g Disporre la colonna PRC in una nuova provetta di reazione da 2 ml PT e smaltire la provetta di reazione PT con il liquido eluito Pipettare 500 ul di tampone di lavaggio 2 BR4 in una spin column PAXgene RNA PRC e centrifugare per 1 minuto a 8000 20000 x g Disporre la colonna PRC in una provetta di reazione da 2 ml PT e smaltire la provetta di reazione PT con il liquido eluito Il tampone di lavaggio 2 BRA viene fornito come concentrato Assicurarsi di avere aggiunto etanolo al tampone di lavaggio 2 BRA prima dell uso vedere Accorgimenti importanti prima di iniziare la preparazione pagina 42 Pipettare 500 pl di tampone di lavaggio 2 BRA nella colonna PAXgene RNA PRC Centrifugare per 3 minuti a 8000 20000 x g Smaltire la provetta di reazione PT con il liquido eluito e disporre la colonna PAXgene RNA PRC in una nuova provetta di reazione da 2 ml PT Centrifugare per 1 minuto a 8000 20000 x g Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 18 Smaltire la provetta di reazione PT con il liquido eluito Disporre la colonna PAXgene RNA
61. rrotondato Se si utilizzano altri tipi di adattatori le provette possono danneggiarsi durante la centrifugazione Rimuovere il sovranatante per decantazione o pipettamento Aggiungere al pellet 4 ml di acqua priva di RNasi RNFW e chiudere la provetta con una nuova chiusura Hemogard Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 Se il sovranatante viene eliminato per decantazione fare attenzione q non staccare il pellet e asciugare il bordo della provetta con carta assorbente pulita 5 Miscelare con il vortex finch il pellet non si scioglie e centrifugare per 10 minuti a 3000 5000 x g utilizzando un rotore bascolante Rimuovere ed eliminare tutto il sovranatante Eventuali detriti cellulari che rimangono nel sovranatante dopo la miscelazione con vortex non influenzano la procedura D La rimozione incompleta del sovranatante inibisce la lisi e diluisce il lisato compromettendo le condizioni di legame dell RNA alla membrana PAXgene 6 Aggiungere 350 pl di tampone di risospensione BR1 e miscelare su vortex fino alla completa dissoluzione del pellet 7 Pipettare il campione in una provetta di reazione da 2 ml PT D Usare le provette di reazione da 2ml PT incluse nel PAXgene Blood RNA Kit 8 Caricare le provette di reazione PT aperte contenenti il campione nell agitatore QlAcube vedi Figura 15 pag 36 Le posizioni del campione sono numerate per agevolare il caricamento Inserire gli innesti per i racks dell agitatore
62. tivo solo per l uso da parte di specialisti del QIAGEN Instrument Service Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 33 Caricare il QIAcube Per risparmiare tempo il caricamento pu essere eseguito durante una o entrambe le fasi di centrifugazione fase 3 e 5 in Protocollo Purificazione in automatico dell RNA totale da sangue umano intero raccolto nelle PAXgene Blood RNA Tubes BRT pag 48 Flaconi per reagenti Riempire con cautela 4 flaconi per reagenti QlAcube con i reagenti elencati nella Tabella 3 riempire i flaconi fino al livello indicato sulle stesse Etichettare i flaconi e i tappi chiaramente con i nomi del tampone e porle nella posizione appropriata nel rack apposito vedi Figure 14 e 15 Prima di ogni corsa sul QlAcube assicurarsi che i flaconi per reagenti siano riempiti fino ai livelli indicatori i volumi rimanenti nel kit originale dei flaconi di tampone dovrebbero essere usati per riempire i flaconi per reagenti Posizionare il rack con i flaconi appositamente riempiti sul piano da lavoro del QlAcube come nelle figure Figure 14 e 15 Assicurarsi di rimuovere i tappi dai flaconi prima di porli nel piano da lavoro volumi di tampone forniti nel PAXgene Blood RNA Kit 50 sono sufficienti per un massimo di 7 corse per la preparazione dell RNA sul QlAcube Si dovrebbero evitare corse multiple con pochi campioni per far s che ci siano volumi sufficienti di tampone per processare tutti i 50 campioni Tab
63. tte da microcentrifuga da 2ml Incubatore agitatore in grado di incubare a 55 C e 65 C e di miscelare a gt 400 rpm max 1400 rpm ad es Eppendorf Thermomixer Compact o equivalente Per il protocollo in automatico QlAcube QIAGEN cat no 9001292 110 V cat no 9001293 230 V Materiali di consumo per QlAcube Puntali per filtro 1000 ul 1024 QIAGEN cat no 990352 Flaconi per reagenti 30 ml 6 QIAGEN cat no 990393 Adattatori per rotore 10 x 24 QIAGEN cat no 990394 8 Assicurarsi che lo strumento sia stato controllato e calibrato regolarmente in base alle indicazioni del produttore Se si prepara l RNA per la prima volta prima della preparazione leggere le linee guida per il trattamento dell RNA vedi Appendice A pag 56 Per l aggiunta di etanolo al tampone BRA concentrato Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 31 Accessori QIAcube Rack rastrelliera per flaconi per reagenti QIAGEN cat no 990390 Supporto per l adattatore del rotore QIAGEN cat no 990392 Forbici Note importanti Uso del QIAcube Assicurarsi di avere familiarit con il QlAcube Leggere il QlAcube User Manual e ogni informazione ulteriore allegata al QlAcube ponendo particolare attenzione alle informazioni di sicurezza prima di iniziare i protocolli PAXgene Blood RNA in automatico Avviamento del QlAcube Chiudere lo sportello del QlAcube e accendere il QlAcube con il tasto di
64. ttrezzature di laboratorio Cambiare i guanti frequentemente e chiudere le provette subito dopo l uso Mantenere l RNA purificato in ghiaccio mentre si pipettano le aliquote per le applicazioni successive protocolli per eliminare la contaminazione da RNasi dalla vetreria e dalle soluzioni sono disponibili nelle guide generali di biologia molecolare ad es Sambrook J and Russell D W 2001 Molecular Cloning A Laboratory Manual 3rd ed Cold Spring Harbor NY Cold Spring Harbor Laboratory Press 56 Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 Appendice B Determinazione della concentrazione resa e purezza dell RNA totale Quantificazione dell RNA La concentrazione di RNA deve essere determinata misurando l assorbanza a 260 nm A250 con uno spettrofotometro Per garantire la significativit le letture devono rientrare nel range di linearit dello spettrofotometro L assorbanza di 1 unit a 260 nm corrisponde a 44 ug di RNA per ml A250 1 gt 44 ug ml Questa relazione valida solo per le misurazioni effettuate in 10 mM Tris Cl pH 7 5 Pertanto se occorre diluire il campione di RNA necessario utilizzare Tris CI 10 mM Come illustrato di seguito vedere Purezza dell RNA pagina 58 il rapporto fra i valori di assorbenza a 260 e 280 nm fornisce una stima della purezza dell RNA Quando si misurano campioni di RNA assicurarsi che le cuvette siano prive di RNasi Per azzerare lo spettrofotometro utilizzare il tampone i
65. utilizza il set DNAsi privo di RNAsi per la prima volta preparare una soluzione stock di DNAsi I Sciogliere la DNAsi RNFD 1500 unit Kunitz in 550 ul di tampone di risospensione DNAsi DRB presente nel kit Assicurarsi di non disperdere DNAsi I RNFD aprendo la fiala La DNAsi RNFD ricostituita non deve essere miscelata su vortex La DNAsi particolarmente sensibile alla denaturazione fisica Miscelare la soluzione con cautela capovolgendo la provetta L unit Kunitz viene normalmente utilizzata per misurare la DNAsi Un unit Kunitz si definisce come la quantit di DNAsi I che a 260 nm A260 provoca un aumento dell assorbanza di 0 001 per minuto e millilitro a 25 C e pH 5 0 utilizzando come substrato DNA altamente polimerizzato Kunitz M 1950 J Gen Physiol 33 349 e 363 Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 49 Dati attualmente disponibili mostrano che la DNAsi ricostituita RNFD si mantiene stabile per 6 settimane se conservata a 2 8 C Per periodi pi lunghi rimuovere la soluzione concentrata dalla fiala in vetro suddividerla in aliquote monouso utilizzare provette per microcentrifuga da 1 5 ml MCT presenti nel kit sono sufficienti per 5 aliquote e conservarla a 20 C fino a 9 mesi Le aliquote scongelate possono essere conservate a 2 8 C fino a 6 settimane Non ricongelare le aliquote dopo lo scongelamento Quando si ricostituisce e si aliquota la DNasi RNFD attenersi alle Note generali p
66. va purificazione dell RNA manuale o in automatico Entrambi i protocolli manuale e in automatico forniscono sostanzialmente un analoga performance per quanto riguarda la qualit e la resa dell RNA dati di performance per il protocollo manuale pagine 19 26 e il protocollo in automatico pagine 27 30 sono incluse in questo manuale Prelievo e stabilizzazione del campione Le PAXgene Blood RNA Tubes BRT contengono un reagente basato su una tecnologia di stabilizzazione dell RNA coperta da brevetto Questa composizione di reagenti protegge le molecole dalla degradazione causata dalla RNAsi e minimizza i cambiamenti ex vivo nell espresione genica Le PAXgene Blood RNA Tubes per il prelievo da sangue umano intero garantiscono la stabilizzazione dell RNA cellulare fino a 3 giorni a 18 25 C vedi Fig 1 e 2 pag 12 e 13 o fino a 5 giorni a 2 8 C vedi Fig 3 e 4 pag 14 e 15 dati attualmente disponibili mostrano che a 20 C o 70 C l RNA cellulare rimane stabile per almeno 24 mesi Per ulteriori informazioni su periodi di stabilizzazione pi lunghi contattare il supporto tecnico QIAGEN Rainen L et al 2002 Stabilization of mRNA expression in whole blood samples Clin Chem 48 1883 10 Manuale PAXgene Blood RNA Kit 04 2008 La durata reale della stabilizzazione dell RNA pu variare in base alla specie di RNA cellulare e dall applicazione downstream A causa del numero limitato di trascritti validati per le specifich

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