Kit di estrazione del DNA oCheck® Istruzioni per l`uso Preparazione
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1. Questa procedura di concentrazione pu essere eseguita unicamente sui campioni di strisci cervicali raccolti con il PapilloCheck Collection Kit il mezzo di raccolta PreservCyt o il mezzo di raccolta Surepath In caso di uso del mezzo di raccolta STM non possibile concentrare il campione mediante centrifugazione mg Pipettare 250 pl della soluzione del campione in un tubo di reazione da 1 5 ml o 2 ml Per evitare contaminazioni utilizzare tubi di reazione con chiusura di sicurezza o tappo a vite per la fase di lisi Si consiglia di validare l intera procedura di isolamento del DNA di ogni ciclo di estrazione del DNA utilizzando un controllo negativo 8 2 2 Preparazione dei campioni per il kit PelvoCheck CT NG campioni di urina umana raccolti in e PelvoCheck Collection Kit SAFE Greiner Bio One N cat 453 100 e PelvoCheck Collection Kit STRAW Greiner Bio One N cat 453 101 possono essere trattati direttamente mg Pipettare 250 ul del campione di urina in un tubo di reazione da 1 5 ml o 2 ml Si consiglia di utilizzare tubi di reazione con chiusura di sicurezza o tappo a vite per la fase di lisi Per validare l estrazione del DNA utilizzare un controllo negativo per ciascun ciclo di estrazione Kit di estrazione del DNA oCheck Istruzioni per l uso Revisione 00 Febbraio 2011 8 3 Protocollo standard 8 3 1 Preparazione IT IT DI IT DI Verificare che la centrifuga sia impostata a temperatura2. Rimuovere il portacolonnine insieme con le strip di legame e collocarlo su un foglio di carta pulito fornito nel kit Rimuovere il coperchio del collettore e il contenitore per i residui usato Inserire gli spaziatori per blocco con pozzetti rotondi e sopra di essi quelli per rack per microprovette nei lati corti della base del collettore figura 4b Collocare il rack per microprovette sugli spaziatori Collocare il numero appropriato di provette per PCR etichettate ogni 2 file del rack per microprovette iniziando dalla fila N 2 del rack Chiudere il collettore per vuoto e collocare le strip di legame in cima Verificare che ogni strip di legame sia posizionata direttamente al di sopra di una provetta per PCR per raccogliere il DNA eluito figura 4c Controllare nuovamente che tutte le strip di legame e le strip fittizie siano ancora correttamente inserite nel portacolonnine Figura 4c Ogni colonnina della strip di legame deve essere posizionata direttamente al di sopra di una provetta per PCR della strip per PCR Kit di estrazione del DNA oCheck Istruzioni per l uso Revisione 00 Febbraio 2011 9 3 Assemblaggio della pompa a vuoto oCheck VacPump Collocare la pompa a vuoto oCheck VacPump su un bancone di laboratorio stabile La pompa a vuoto oCheck VacPump deve essere assemblata come mostrato nella figura 5a Per collegare la pompa a vuoto oCheck VacPump al collettore per vuoto utilizzare il pi lungo dei due tubi di c
3. 9 2 1 Disposizione per il legame del DNA e il lavaggio mg Perle procedure di legame del DNA e di lavaggio punti 10 3 5 10 3 7 del protocollo preparare il collettore per vuoto come mostrato nella figura Aa mg Collocare uno dei due contenitori per i residui all interno della base del collettore mg Chiudere la base del collettore con il coperchio del collettore mg Collocare il portacolonnine nella guarnizione in gomma del coperchio del collettore mg Inserire il numero necessario di strip di legame nel portacolonnine mg Verificare che le strip di legame siano inserite correttamente e che si innestino saldamente nel portacolonnine quando scattano in posizione si udir distintamente un clic Se vengono trattati contemporaneamente meno di 48 campioni inserire nel portacolonnine soltanto il numero di strip di legame necessario e riempire le posizioni rimanenti del portacolonnine con il numero appropriato di strip fittizie Verificare che le strip di legame e le strip fittizie siano correttamente inserite nel portacolonnine prima di applicare il vuoto Non collocare il contenitore per i residui in lavastoviglie per pulirlo 22 Kit di estrazione del DNA oCheck Istruzioni per l uso Revisione 00 Febbraio 2011 9 2 2 Disposizione per l eluizione del DNA Per la fase di eluizione del DNA punto 10 3 8 del protocollo il collettore per vuoto deve essere modificato come mostrato nella figura 4b IT DI DI DI DI DI
4. ambiente 18 25 C Preparare i campioni come indicato nel capitolo 8 2 Impostare i blocchi riscaldanti o i bagni termostatici a 56 C e 70 C rispettivamente Prima dell eluizione incubare il tampone E di eluizione a 70 C Accertarsi che le soluzioni di lavoro siano state preparate come indicato nel capitolo 8 1 8 3 2 Prelisi DI DI DI DI DI Aggiungere 80 ul di tampone L1 Aggiungere 2 4 pl della soluzione di RNA carrier preparata Aggiungere 20 pl di soluzione di proteinasi K Chiudere il tappo e mescolare brevemente passando al vortex a impulsi Incubare a 56 C per almeno 30 minuti Agitare i campioni utilizzando un thermomixer a 650 rpm Se si utilizza un blocco riscaldante o un bagno termostatico durante il periodo di incubazione passare di tanto in tanto i campioni al vortex In caso di trattamento di vari campioni la proteinasi K il tampone L1 e I RNA carrier devono essere premiscelati subito prima dell uso Non miscelare mai il tampone L1 e la proteinasi K pi di 10 15 minuti prima dell aggiunta nel campione La proteinasi K tende all autolisi se posta in tampone L1 senza substrato 8 3 3 Lisi DI DI Ir DI Centrifugare brevemente il tubo di reazione per rimuovere eventuali gocce dall interno del tappo Aggiungere 250 pl di tampone L4 Chiudere il tappo e mescolare passando al vortex a impulsi per 10 secondi Incubare a 70 C per 15 minuti Chiudere saldamente i tappi dei tubi di
5. batch nr KW IK G TOApTI AG Parti kodu Important Note Wichtiger Hinweis Note im portante Nota im portante Nota im portante Aviso im portante Belangri jke op merking Vigtig henvis ning Viktigt medde lande Wa ne Viktig merknad 2 NpavTIK onpeiwon nemli Not INDICE i e COMPENSO DELI lia 5 APPARECCHIATURE E MATERIALI DI CONSUMO NECESSARI 6 2 1 Preparazione con colonnina singola N cat 515 040 iii 6 2 2 Preparazione con 8 colonnine N cat 515 050 iii 7 SPEDIZIONE E CONSERVAZIONE Lilla 8 GOAR e BT Rca 8 SMALTIMENTO DEI RIFIUTI Miiii 9 Jee Ka ei TAMPERE AA RARO RARO RE RE EA ARE EEE RETTA 10 SR EE 10 ZU IM FOD oa cca iii 10 le Le EE 11 6 4 Principio di base della purificazione del DNA iii 11 ISTRUZIONI PER IL FLUSSO DI LAVORO PER IL KIT oCheck _ 12 es klstruzioni generalia satana enon 12 2 Separazionedellocdli nen eno ui0 _ es 12 Fee Avvertenze precauzioni a E 13 fal Ee in EE eet lee WEE 13 e De De Ke ie genera sr Io eee 13 i3bilavorare insite Ae e 0 rei sh 14 PREPARAZIONE CON COLONNINA SINGOLA N cat 515 040 15 8 1 Preparazione delle soluzioni di lavoro e condizioni di conservazione 15 6 2 Preparazione dercampioni ci i
6. seguito e PelvoCheck Collection Kit SAFE Greiner Bio One N cat 453 100 e PelvoCheck Collection Kit STRAW Greiner Bio One N cat 453 101 Altri sistemi di raccolta dei campioni non sono stati validati e non vanno utilizzati con il Kit di estrazione del DNA oCheck 6 4 Principio di base della purificazione del DNA Il Kit di estrazione del DNA oCheck stato progettato per la purificazione di DNA genomico virale batterico e umano da campioni di origine umana campioni vengono lisati in maniera rapida ed efficiente mediante l aggiunta di proteinasi K e tampone L1 Il tampone di lisi e l etanolo creano le condizioni appropriate per il legame degli acidi nucleici alla membrana di silice delle colonnine di legame L RNA carrier favorisce il legame e il recupero di DNA virale batterico e genomico a bassa concentrazione Le sostanze contaminanti potenziali inibitori della PCR come sali metaboliti e componenti cellulari macromolecolari solubili vengono rimossi durante le fasi di lavaggio con tamponi di lavaggio a base di etanolo Infine il DNA genomico batterico virale e umano puro viene eluito in condizioni di bassa forza ionica in un tampone di eluizione leggermente alcalino Dopo la purificazione il DNA si trova in una soluzione adatta per l analisi diretta mediante saggi della linea di prodotti oCheck Kit di estrazione del DNA oCheck Istruzioni per l uso Revisione 00 Febbraio 2011 7 ISTRUZIONI PER IL FLUSSO DI LAVO
7. ug Prima dell eluizione incubare il tampone E di eluizione a 70 C mg Accertarsi che le soluzioni di lavoro siano state preparate come indicato nel capitolo 10 1 10 3 2 Prelisi mg Aggiungere 80 pl di tampone L1 Aggiungere 2 4 pl della soluzione di RNA carrier preparata Aggiungere 20 pl di soluzione di proteinasi K mg Chiudere il tappo e mescolare brevemente passando al vortex a impulsi In caso di trattamento di vari campioni la proteinasi K il tampone L1 e I RNA carrier devono essere premiscelati subito prima dell uso Non miscelare mai il tampone L1 e la proteinasi K pi di 10 15 minuti prima dell aggiunta nel campione La proteinasi K tende all autolisi se posta in tampone L1 senza substrato mg Incubare a 56 C per almeno 30 minuti Agitare i campioni utilizzando un thermomixer a 650 rpm Se si utilizza un blocco riscaldante o un bagno termostatico durante il periodo di incubazione passare di tanto in tanto i campioni al vortex 10 3 3 Lisi mg Centrifugare brevemente il tubo di reazione per rimuovere eventuali gocce dall interno del tappo mg Aggiungere 250 pl di tampone L4 mg Chiudere il tappo e mescolare passando al vortex a impulsi per 10 secondi mg Incubare a 70 C per 15 minuti mg Chiudere saldamente i tappi dei tubi di reazione per evitare che si possano aprire accidentalmente 10 3 4 Ottimizzazione delle condizioni di legame del DNA mg Centrifugare brevemente il tubo di reazione per rimuovere even
8. A oCheck Greiner Bio One n cat 515 040 o n cat 515 050 un kit per uso diagnostico in vitro indicato per la preparazione di DNA da campioni di origine umana da analizzare mediante saggi della linea di prodotti oCheck La metodica di isolamento di acido nucleico in uso nelle varianti del Kit di estrazione del DNA oCheck produce DNA idoneo per la successiva analisi diretta con i seguenti kit Kit di estrazione del DNA oCheck Preparazione con colonnina singola N cat 515 040 e PapilloCheck Greiner Bio One N cat 465 060 e PapilloCheck high risk Greiner Bio One N cat 505 060 e PelvoCheck CT NG Greiner Bio One N cat 504 002 Kit di estrazione del DNA oCheck Preparazione con 8 colonnine N cat 515 050 e PapilloCheck Greiner Bio One N cat 465 060 e PapilloCheck high risk Greiner Bio One N cat 505 060 L uso del Kit di estrazione del DNA oCheck Preparazione con 8 colonnine per l isolamento del DNA per la successiva analisi con il saggio PelvoCheck CT NG Greiner Bio One N cat 504 002 sconsigliato finch non verranno completate le procedure di validazione Il Kit di estrazione del DNA oCheck deve essere utilizzato soltanto in combinazione con saggi della linea di prodotti oCheck Greiner Bio One Frickenhausen Germania nelle cui istruzioni per l uso sia specificato l impiego del Kit di estrazione del DNA oCheck Il Kit di estrazione del DNA oCheck soddisfa i requisiti
9. DNA BASSA O NULLA Lisi incompleta Reagenti non applicati correttamente Eluizione subottimale del DNA dalla colonnina COLONNINE OSTRUITE Lisi incompleta Reagenti non applicati correttamente PRESTAZIONI SUBOTTIMALI DEL DNA NELLE REAZIONI ENZIMATICHE Residui di etanolo o sale Contaminazione del DNA con sostanze inibenti Commenti e suggerimenti e Campioni non adeguatamente omogeneizzati e miscelati con il tampone L1 con la proteinasi K La miscela deve essere agitata vigorosamente al vortex subito dopo l aggiunta del tampone L1 e Numero insufficiente di cellule nel campione e Attivit ridotta della proteinasi K suddividere la soluzione in aliquote e conservarle a 20 C per un massimo di 6 mesi Non ricongelarle e Preparare i tamponi L4 e W2 l RNA carrier e la soluzione di proteinasi K come indicato nella sezione 8 1 o 10 1 Aggiungere l etanolo ai lisati prima di caricarli nelle colonnine e Preriscaldare il tampone E a 70 C prima dell eluizione Applicare il tampone E direttamente al centro della membrana di silice L efficienza di eluizione diminuisce drasticamente se l eluizione viene eseguita con tamponi con pH lt 7 0 Utilizzare tamponi di eluizione leggermente alcalini come il tampone E pH 8 5 e Campioni non adeguatamente omogeneizzati e miscelati con il tampone L1 con la proteinasi K La miscela deve essere agitata vigorosamente al vortex subito dopo l aggiunta del tampone L1 Attivit ri
10. IQATpIK OUOKEU In vitro diagnostik tibbi tan r n Tempe rature limitation Tempera turbegren zung Limite de temp ra ture Limitaci n de tempera tura Limiti di tempera tura Limita o de tempera tura Tempera tuurbeper king Tempera turbegra ens r Tempe ratur be gr nsning Ograni czenie tempera tury tempe raturbe grensning Mepio pio poi Bepuokpa loJ o S cakl k s n rlamas Contents sufficient for lt n gt tests Inhalt ausrei chend f r lt n gt Tests Contenu suffisant pour lt n gt tests Contenido suficiente para lt n gt ensayos Contenuto sufficiente per lt n gt test Conte do suficiente para lt n gt ensaios Voldoen de inhoud voor lt n gt tests Indehol der nok til lt n gt test Inneh llet racker till lt n gt tester Zawarto wystarcza na lt n gt test w Innhold tilstrekke lig for lt n gt tester TTEPI XEI ETTOPK G U IK VIA lt n gt dOKI HaO EG eri i lt n gt test i in yeter lidir Irritant Reizend irritant irritante Irritante irritante Irriterend Lokalirri terende irriterande dra ni cy irriterende Ep 8IOTIK Tahri edici Batch code Chargen bezeich nung N de lot C digo de lote Codice del lotto C digo do lote Lot nummer Lotnum mer Lot nummer Kod partii
11. Kit di estrazione del DNA oCheck Istruzioni per l uso Preparazione con colonnina singola N cat 515 040 Preparazione con 8 colonnine N cat 515 050 Per uso diagnostico in vitro unicamente da parte di personale di laboratorio qualificato Revisione 00 Febbraio 2011 Greiner Bio One GmbH Maybachstr 2 e 72636 Frickenhausen e Germania gt Tel 49 0 7022 948 0 Fax 49 0 7022 948 514 i info de gbo com e www gbo com bioscience g reiner b IO ONE e GLOSSARIO DEI SIMBOLI en de fr es pt ni da SV pl no el tr Do not reuse Nicht wieder verwen den Ne pas r utiliser No utilizar m s Non riutilizza bile N o utilz ar mais Niet opnieuw gebruiken M ikke genbru ges F r ej teran v ndas Nie stosowa ponownie M ikke brukes flere ganger poi v piag XP ONS Yeniden ullanmay n Use by Mindes tens haltbar bis Date limite de conser vation jusqu au A utilizar preferib lemente antes de Da utilizzare entro e non oltre A utilizar prefer velmente antes de Tenminste houdbaar tot Anvendes senest Sista f r bruknings dag Termin zydatno ci holdbar til Xp on WG Son kullanma tarihi Consult Instruc tions for Use Vor Gebrauch Anwei sung lesen Lire les in structions avant utilisation Antes de usar lea las instruccio nes Leggere le istr
12. RO PER IL KIT oCheck 1 1 Istruzioni generali Le istruzioni riportate di seguito sono basate sull esperienza di laboratorio con l implementazione di tecniche avanzate attualmente in uso in biologia molecolare e sono finalizzate a garantire la massima sicurezza per i metodi basati su PCR Durante l uso del Kit di estrazione del DNA oCheck in combinazione con ulteriori procedure di analisi del DNA purificato eseguite con saggi della linea di prodotti oCheck occorre adottare precauzioni ragionevoli In generale le procedure di biologia molecolare quali estrazione amplificazione e rilevazione del DNA devono essere eseguite da personale adeguatamente qualificato Inoltre necessario un flusso di lavoro pulito e ben strutturato per evitare risultati errati dovuti alla degradazione dell acido nucleico presente nei campioni o alla sua contaminazione con prodotti di amplificazione A tal fine occorre separare l area di estrazione da quella di amplificazione Non introdurre per nessun motivo un prodotto di amplificazione nell area destinata soltanto all estrazione Le due aree devono essere equipaggiate con apparecchiature materiali di consumo camici da laboratorio e guanti distinti Non trasferire per nessun motivo camici da laboratorio guanti o apparecchiature dall area destinata all estrazione a quella destinata all amplificazione 7 2 Separazione dei locali Nella Figura 1 mostrato un esempio della possibile suddivisione di un laborator
13. a 70 C Preparare i campioni come indicato nel capitolo 8 2 Pipettare 250 ul di campione in un tubo di reazione da 1 5 o 2 0 ml PRELISI 80 ul di tampone L1 2 4 ul di soluzione di RNA carrier 20 pl di soluzione di proteinasi K Passare brevemente al vortex 56 C per almeno 30 minuti Centrifugare brevemente LISI 250 pl di tampone L4 Passare brevemente al vortex 70 C per 15 minuti Centrifugare brevemente p R O T O C O L L O 4 OTTIMIZZAZIONE DELLE CONDIZIONI DI LEGAME DEL DNA m 300 pl di etanolo mg Passare brevemente al vortex m Centrifugare brevemente m lt mJy Kit di estrazione del DNA oCheck Istruzioni per l uso Revisione 00 Febbraio 2011 Estrazione del DNA 5 LEGAME DEL DNA mg Preparare le colonnine da centrifuga 450 pl di lisato 1 minuto a 11 000 g 450 pl di lisato 1 minuto a 11 000 g LAVAGGIO DELLE COLONNINE DA CENTRIFUGA 500 ul di tampone W1 1 minuto a 11 000 g 600 ul di tampone W2 1 minuto a 11 000 g 7 ESSICCAMENTO DELLE COLONNINE DA CENTRIFUGA mg Centrifugare 1 minuto a 11 000 g p R O Li O C O L L O ELUIZIONE DEL DNA 100 pl di tampone E preriscaldato a 70 C 1 minuto a temperatura ambiente 18 25 C 1 minuto a 11 000 g m lt mJy Kit di estrazione del DNA oCheck Istruzioni per l uso Revisione 00 Febbraio 2011 14 2 Protocollo breve per la preparazione con 8 colonnine N cat 515 050 Estrazione del DNA con il Kit d
14. ato bianco nei tamponi L1 L2 o L4 Tali precipitati possono essere facilmente disciolti incubando il flacone a 50 70 C prima dell uso Kit di estrazione del DNA oCheck Istruzioni per l uso Revisione 00 Febbraio 2011 8 2 Preparazione dei campioni 8 2 1 Preparazione dei campioni per i kit PapilloCheck e PapilloCheck high risk campioni di strisci cervicali umani raccolti in e PapilloCheck Collection Kit Greiner Bio One N cat 465 070 e mezzo di raccolta PreservCyt Hologic Bedford MA USA possono essere trattati direttamente campioni di strisci cervicali raccolti in e mezzo di raccolta Surepath BD Franklin Lakes NJ USA devono essere sottoposti a lavaggio prima dell uso centrifugare 250 ul del campione per 5 minuti a 11 000 g e risospendere il pellet in 250 ul di acqua distillata campioni di strisci cervicali raccolti in e mezzo di raccolta STM Qiagen Hilden Germania devono essere diluiti in acqua distillata 100 pl di campione 150 ul di acqua distillata In generale se il campione di striscio cervicale molto concentrato e gi aggregato deve essere diluito e omogeneizzato prima di iniziare l estrazione campioni di strisci cervicali molto diluiti che non presentano cellule visibili devono essere concentrati per ottenere una maggiore quantit di cellule per l estrazione Centrifugare fino a 1000 pl di campione per 5 minuti a 11 000 g e risospendere il pellet in 250 pl di acqua distillata
15. bile alla contaminazione e quindi essenziale osservare scrupolosamente le istruzioni contenute nel presente documento Inoltre occorre seguire le indicazioni per la prevenzione delle contaminazioni riportate nel paragrafo 7 3 1 Nel locale 2 su un bancone pulito va preparata e suddivisa la miscela di reazione per la PCR L aggiunta del DNA estratto nel locale 1 deve essere eseguita in uno spazio distinto all interno del locale 2 Dopo aver lasciato questo locale occorre cambiarsi il camice da laboratorio La reazione di ibridazione e le fasi di lavaggio dovranno avere luogo nel terzo locale del laboratorio Nel locale 3 deve anche essere installato il dispositivo CheckScanner insieme con il software CheckReport Software per l analisi finale dei saggi della linea di prodotti oCheck 7 3 Avvertenze e precauzioni 7 3 1 Prevenzione delle contaminazioni e l camice da laboratorio deve essere indossato durante l intero corso delle procedure e sono necessari set di camici differenti per ciascun locale del laboratorio e guanti devono essere indossati durante tutte le fasi dell analisi e vanno cambiati per ogni diversa fase e Pulizia del laboratorio l ambiente di lavoro deve essere decontaminato prima e dopo le procedure con una soluzione detergente appropriata e Tubi di reazione non toccare per nessun motivo la superficie interna del tappo dei tubi di reazione Per evitare contaminazioni crociate aprire un solo tubo per volta Per e
16. care il Manuale Kit di estrazione del DNA oCheck Istruzioni per l uso Revisione 00 Febbraio 2011 2 APPARECCHIATURE E MATERIALI DI CONSUMO NECESSARI 2 1 Preparazione con colonnina singola N cat 515 040 Materiali di consumo N cat Greiner Bio One Quantit pz Kit di estrazione del DNA oCheck S 3 515 040 Preparazione con colonnina singola Puntali sterili DNasi free con filtro per micropipetta Puntali con filtro da 0 5 10 pl 765 288 Puntali con filtro da 0 5 20 pl 774 288 Puntali con filtro da 10 100 pi 712 288 Puntali con filtro da 10 200 pl 739 288 Puntali con filtro da 100 1000 pl 750 288 Altri materiali di consumo necessari e Tubi di reazione da 1 5 o 2 0 ml con chiusura di sicurezza o tappo a vite per la fase di lisi Etanolo p a gt 99 8 e Guanti monouso Altre apparecchiature necessarie e Microcentrifuga per tubi di reazione da 1 5 o 2 0 ml in grado di raggiungere 11 000 g e Agitatore vortex e Blocco riscaldante bagno termostatico o thermomixer per tubi di reazione da 1 5 o 2 0 ml per incubazioni a 70 C e 56 C e Micropipette a volume variabile 1 1000 pl e Contenitore di rifiuti e Timer Kit di estrazione del DNA oCheck Istruzioni per l uso Revisione 00 Febbraio 2011 2 2 Preparazione con 8 colonnine N cat 515 050 Materiali di consumo N cat Greiner Bio One Quantit pz Kit di estrazione del DNA oCheck Preparazione con 8 colonnine 515 050 12 x 8 prep Punta
17. congelate le provette usate vanno gettate vie A seguito della conservazione specialmente se avvenuta a basse temperature si pu formare un precipitato bianco nei tamponi L1 L2 o L4 Tali precipitati possono essere facilmente disciolti incubando il flacone a 50 70 C prima dell uso Kit di estrazione del DNA oCheck Istruzioni per l uso Revisione 00 Febbraio 2011 25 10 2 Preparazione dei campioni 10 2 1 Preparazione dei campioni per i kit PapilloCheck e PapilloCheck high risk campioni di strisci cervicali umani raccolti in e PapilloCheck Collection Kit Greiner Bio One N cat 465 070 e mezzo di raccolta PreservCyt Hologic Bedford MA USA possono essere trattati direttamente campioni di strisci cervicali raccolti in e mezzo di raccolta Surepath BD Franklin Lakes NJ USA devono essere sottoposti a lavaggio prima dell uso centrifugare 250 ul del campione per 5 minuti a 11 000 g e risospendere il pellet in 250 ul di acqua distillata campioni di strisci cervicali raccolti in e mezzo di raccolta STM Qiagen Hilden Germania devono essere diluiti in acqua distillata 100 pl di campione 150 pl di acqua distillata In generale se il campione di striscio cervicale molto concentrato e gi aggregato deve essere diluito e omogeneizzato prima di iniziare l estrazione campioni di strisci cervicali molto diluiti che non presentano cellule visibili devono essere concentrati per ottenere una maggi
18. dotta della proteinasi K suddividere la soluzione in aliquote e conservarle a 20 C per un massimo di 6 mesi Non ricongelarle e Preparare i tamponi L4 e W2 l RNA carrier e la soluzione di proteinasi K come indicato nella sezione 8 1 o 10 1 Aggiungere l etanolo ai lisati prima di caricarli nelle colonnine e Certificarsi che la centrifugazione duri almeno 1 minuto a 11 000 g per rimuovere tutto il tampone W2 contenente etanolo prima di eluire il DNA Se per un qualsiasi motivo il livello di tampone W2 ha raggiunto lo scarico della colonnina dopo l essiccamento ripetere la centrifugazione e Non raffreddare il tampone W2 prima dell uso Se il tampone freddo i sali verranno rimossi in maniera inefficiente Equilibrare il tampone W2 a temperatura ambiente prima dell uso e Non eluire il DNA con tampone TE L EDTA potrebbe inibire le reazioni enzimatiche Ripurificare il DNA ed eluirlo in tampone E e Se il rapporto A260 A280 dell eluato inferiore a 1 6 ripetere la procedura di purificazione aggiungere all eluato 1 volume di tampone L4 pi 1 volume di etanolo 96 100 Caricare la miscela su una colonnina da centrifuga e procedere con la fase di legame del DNA sezione 8 3 5 o 10 3 5 del protocollo standard Kit di estrazione del DNA oCheck Istruzioni per l uso Revisione 00 Febbraio 2011 33 12 ASSISTENZA TECNICA Greiner Bio One dispone di un Dipartimento di Assistenza tecnica dotato di personale esperto con app
19. e via il tubo di raccolta con il flow through e collocare le colonnine da centrifuga in nuovi tubi di raccolta 8 3 6 Lavaggio delle colonnine da centrifuga Applicare 500 pl di tampone W1 nella colonnina da centrifuga mm Centrifugare a 11 000 g per 1 minuto a temperatura ambiente mg Gettare via il tubo di raccolta con il flow through e collocare la colonnina da centrifuga in un nuovo tubo di raccolta Applicare 600 pl di tampone W2 nella colonnina da centrifuga Centrifugare a 11 000 g per 1 minuto a temperatura ambiente mg Gettare via il tubo di raccolta con il flow through e collocare la colonnina da centrifuga in un nuovo tubo di raccolta 8 3 7 Essiccamento delle colonnine da centrifuga Centrifugare a 11 000 g per 1 minuto per far seccare completamente la membrana Questo passaggio serve per eliminare eventuali tracce di etanolo L etanolo presente nel tampone W2 inibisce le reazioni enzimatiche e deve essere completamente rimosso prima dell eluizione del DNA Kit di estrazione del DNA oCheck Istruzioni per l uso Revisione 00 Febbraio 2011 8 3 8 Eluizione del DNA Utilizzare tampone E preriscaldato 70 C Per evitare cali di temperatura durante le operazioni di pipettaggio si consiglia di riempire i tubi di reazione da 1 5 o 2 0 ml con un massimo di 1 300 pl di tampone E sufficienti per n 12 campioni Per evitare contaminazioni prima di iniziare questa fase indossare un nuovo paio di gua
20. evisione 00 Febbraio 2011 10 PREPARAZIONE CON 8 COLONNINE N cat 515 050 10 1 Preparazione delle soluzioni di lavoro e condizioni di conservazione Tutti i componenti del kit devono essere conservati a temperatura ambiente 18 25 C e sono stabili per due anni dalla data di fabbricazione Prima di iniziare il protocollo del Kit di estrazione del DNA oCheck preparare le seguenti soluzioni 1 Soluzione di proteinasi K prima di utilizzare il kit per la prima volta aggiungere 3 35 ml di tampone per proteinasi PKB per disciogliere la proteinasi K liofilizzata Suddividere la soluzione in aliquote e conservarle a 20 C per un massimo di 6 mesi Non ricongelarle Tampone W2 aggiungere 200 ml di etanolo p a 99 8 al tampone W2 concentrato Segnare la data corrente sull etichetta del flacone Il tampone W2 stabile a temperatura ambiente 18 25 C fino a un anno Tampone L4 trasferire tutto il tampone L2 nel reagente L3 e mescolare bene Etichettare il flacone con l etichetta L4 fornita nel kit Segnare la data corrente sull etichetta del flacone Il tampone L4 ottenuto stabile fino a un anno a temperatura ambiente 18 25 C Soluzione di RNA carrier aggiungere 900 pl di tampone L1 per disciogliere l RNA carrier liofilizzato Suddividere in aliquote I RNA carrier disciolto ad es in aliquote di 50 ul per 16 estrazioni Conservare la soluzione di RNA carrier disciolto a 20 C Non ricongelarla Dopo essere state s
21. i estrazione del DNA oCheck Preparazione con 8 colonnine Greiner Bio One N cat 515 050 PREPARAZIONE Verificare che la centrifuga sia impostata a temperatura ambiente 18 25 C Preparare le soluzioni di lavoro come indicato nel capitolo 10 1 Impostare i blocchi riscaldanti o i bagni termostatici a 56 C e 70 C Preriscaldare il tampone E di eluizione a 70 C Preparare i campioni come indicato nel capitolo 10 2 Pipettare 250 ul di campione in un tubo di reazione da 1 5 o 2 0 ml PRELISI 80 ul di tampone L1 2 4 ul di soluzione di RNA carrier 20 pl di soluzione di proteinasi K Passare brevemente al vortex 56 C per almeno 30 minuti Centrifugare brevemente LISI 250 pl di tampone L4 Passare brevemente al vortex 70 C per 15 minuti Centrifugare brevemente 4 OTTIMIZZAZIONE DELLE CONDIZIONI DI LEGAME DEL DNA 300 pl di etanolo i Passare brevemente al vortex mg Centrifugare brevemente Kit di estrazione del DNA oCheck Istruzioni per l uso Revisione 00 Febbraio 2011 Estrazione del DNA p R O T O C O L L O m lt mJy Estrazione del DNA LEGAME DEL DNA Pipettare 900 ul di lisato nelle strip di legame Applicare il vuoto 200 mbar Evitare la formazione di schiuma LAVAGGIO DELLE STRIP DI LEGAME 1 lavaggio con 600 ul di tampone W1 2 lavaggio con 900 pl di tampone W2 3 lavaggio con 900 ul di tampone W2 Per ogni lavaggio mg 30 60 sec
22. indicati nella direttiva relativa ai dispositivi medico diagnostici in vitro 98 79 CE e pertanto provvisto del marchio di conformit CE Il prodotto deve essere utilizzato UNICAMENTE da operatori qualificati come tecnici e medici con formazione specifica nelle tecniche di biologia molecolare 6 2 Uso improprio Il Kit di estrazione del DNA oCheck NON indicato per l uso con i kit CarnoCheck Greiner Bio One ParoCheck Greiner Bio One n con qualsiasi altro prodotto non appartenente alla linea oCheck Kit di estrazione del DNA oCheck Istruzioni per l uso Revisione 00 Febbraio 2011 6 3 Campioni Per la successiva applicazione dei kit PapilloCheck Greiner Bio One N cat 465 060 e PapilloCheck high risk Greiner Bio One N cat 505 060 il Kit di estrazione del DNA oCheck stato progettato e testato per l estrazione di DNA genomico virale e umano da strisci cervicali umani raccolti con uno dei sistemi di raccolta dei campioni indicati di seguito e PapilloCheck Collection Kit Greiner Bio One N cat 465 070 e PreservCyt Hologic Bedford MA USA e Surepath BD Franklin Lakes NJ USA e STM Qiagen Hilden Germania Per la successiva applicazione del saggio PelvoCheck CT NG Greiner Bio One N cat 504 002 il Kit di estrazione del DNA oCheck stato validato per l estrazione di DNA genomico batterico e umano da campioni di urina umana utilizzando i sistemi di raccolta elencati di
23. io in 3 sezioni distinte Una utilizzata unicamente per l estrazione del DNA un altra destinata alla preparazione e all esecuzione delle reazioni di PCR e l ultima viene impiegata per l ibridazione e l analisi Per evitare la contaminazione dei campioni ciascun locale deve essere impiegato esclusivamente per l applicazione o la tecnica indicata Potrebbe essere utile utilizzare colori differenti per evitare lo scambio accidentale di apparecchiature e materiali di consumo tra le diverse aree Le apparecchiature e i materiali di consumo non devono essere scambiati tra locali o spazi diversi del laboratorio Pertanto la presenza di apparecchiature e materiali di consumo in doppio una necessit e deve essere attentamente considerata Locale 2 Figura 1 Separazione dei locali nel flusso di lavoro per il kit oCheck Locale 1 estrazione del DNA locale 2 preparazione della reazione di PCR e suddivisione della miscela di reazione su un bancone pulito spazio distinto per l aggiunta del templato di DNA locale 3 ibridazione e analisi Kit di estrazione del DNA oCheck Istruzioni per l uso Revisione 00 Febbraio 2011 L intera procedura di estrazione del DNA con il Kit di estrazione del DNA oCheck deve essere eseguita nel locale 1 quello destinato all estrazione del DNA Dopo aver lasciato questo locale occorre cambiarsi il camice da laboratorio Nel flusso di lavoro per il kit oCheck l estrazione del DNA la procedura pi sensi
24. li sterili DNasi free con filtro per micropipetta Puntali con filtro da 0 5 10 pl 765 288 Puntali con filtro da 0 5 20 pl T14 288 Puntali con filtro da 10 100 pl T12 288 Puntali con filtro da 10 200 pl 739 288 Puntali con filtro da 100 1000 pl 750 288 Strip da 8 provette per PCR senza tappo 673 210 Strip di tappi per strip da 8 provette 373 270 Provette singole per PCR 671 201 Apparecchiature N cat Greiner Bio One Quantit pz Set per vuoto oCheck VacSet 863 080 1 Pompa a vuoto oCheck VacPump 863 070 1 Altri materiali di consumo necessari e Tubi di reazione da 1 5 o 2 0 ml con chiusura di sicurezza o tappo a vite per la fase di lisi e Vaschetta per pipetta multicanale vaschetta usa e getta per reagenti volumi 25 e 100 ml e Puntali per volumi di 1200 pl per pipetta a 8 canali Etanolo p a gt 99 8 e Guanti monouso Altre apparecchiature necessarie e Microcentrifuga per tubi di reazione da 1 5 o 2 0 ml in grado di raggiungere 11 000 g e Agitatore vortex Blocco riscaldante bagno termostatico o thermomixer per tubi di reazione da 1 5 o 2 0 ml per incubazioni a 70 C e 56 C e Micropipette a volume variabile 1 1000 pl e Pipetta multicanale a 8 canali per volumi grandi da 50 a 1200 pl e Contenitore di rifiuti e Timer e Rack per PCR Kit di estrazione del DNA oCheck Istruzioni per l uso Revisione 00 Febbraio 2011 3 SPEDIZIONE E CONSERVAZIONE Il Kit di estrazione del DNA oCheck deve es
25. mg Aggiungere 900 pl di tampone W2 in ciascun pozzetto delle strip di legame mg Impostare il vuoto su 200 mbar mediante il regolatore del vuoto mg Applicare il vuoto finch tutto il tampone non passato attraverso le colonnine circa 30 secondi mg Arrestare il vuoto chiudendo la valvola del collettore subito dopo il passaggio di tutto il liquido attraverso le colonnine circa 30 secondi per evitare la formazione di schiuma mg Spegnere la pompa a vuoto e ripristinare le normali condizioni di pressione 30 Kit di estrazione del DNA oCheck Istruzioni per l uso Revisione 00 Febbraio 2011 10 3 7 Essiccamento delle strip di legame ug Dopo l ultimo lavaggio arrestare il vuoto e ventilare il collettore per vuoto sezione 9 6 Rimuovere il portacolonnine insieme con le strip di legame Nel frattempo rimuovere il coperchio del collettore e il contenitore per i residui usato e sostituirlo con quello ancora inutilizzato pulito mg Inserire il coperchio del collettore insieme con il portacolonnine e le strip di legame nella base del collettore Verificare nuovamente che il collettore sia ben chiuso e che tutte le strip di legame o le strip fittizie siano inserite correttamente mg Applicare il vuoto massimo almeno da 400 a 600 mbar di differenza di pressione per 10 minuti per far seccare completamente la membrana mg Spegnere la pompa a vuoto e ripristinare le normali condizioni di pressione Questo passaggio serve per eliminare event
26. ne Tutti i componenti del kit devono essere conservati a temperatura ambiente 18 25 C e sono stabili per due anni dalla data di fabbricazione Prima di iniziare il protocollo del Kit di estrazione del DNA oCheck preparare le seguenti soluzioni 1 Soluzione di proteinasi K prima di utilizzare il kit per la prima volta aggiungere 1 35 ml di tampone per proteinasi PKB per disciogliere la proteinasi K liofilizzata Suddividere la soluzione in aliquote e conservarle a 20 C per un massimo di 6 mesi Non ricongelarle Tampone W2 aggiungere 56 ml di etanolo p a 2 99 8 al tampone W2 concentrato Segnare la data corrente sull etichetta del flacone Il tampone W2 stabile a temperatura ambiente 18 25 C fino a un anno Tampone L4 trasferire tutto il tampone L2 nel reagente L3 e mescolare bene Etichettare il flacone con l etichetta L4 fornita nel kit Segnare la data corrente sull etichetta del flacone Il tampone L4 ottenuto stabile fino a un anno a temperatura ambiente 18 25 C Soluzione di RNA carrier aggiungere 900 pl di tampone L1 per disciogliere l RNA carrier liofilizzato Suddividere in aliquote l RNA carrier disciolto ad es in aliquote di 35 pl per 12 estrazioni Conservare la soluzione di RNA carrier disciolto a 20 C Non ricongelarla Dopo essere state scongelate le provette usate vanno gettate vie A seguito della conservazione specialmente se avvenuta a basse temperature si pu formare un precipit
27. ne per inalazione Frasi di sicurezza S7 Conservare il recipiente ben chiuso S16 Conservare lontano da fiamme e scintille Non fumare S 22 Non respirare le polveri S 24 Evitare il contatto con la pelle S25 Evitare il contatto con gli occhi S 26 In caso di contatto con gli occhi lavare immediatamente e abbondantemente con acqua e consultare un medico S 36 37 Usare indumenti protettivi e guanti adatti La versione aggiornata della scheda di dati di sicurezza di questo prodotto pu essere scaricata dal sito web di Greiner Bio One www gbo com bioscience biochips_download Kit di estrazione del DNA oCheck Istruzioni per l uso Revisione 00 Febbraio 2011 5 SMALTIMENTO DEI RIFIUTI Se combinata con candeggina la guanidina cloridrato presente nei tamponi L2 e W1 pu formare composti altamente reattivi Evitare di aggiungere direttamente candeggina o soluzioni acide ai residui derivanti dalla preparazione dei campioni La contaminazione dei residui liquidi con materiale infettivo altamente improbabile ma non pu essere completamente esclusa Pertanto i residui liquidi devono essere considerati come materiale infettivo e trattati e smaltiti in conformit con le normative locali di sicurezza Osservare scrupolosamente le linee guida locali e statali sullo smaltimento dei rifiuti Kit di estrazione del DNA oCheck Istruzioni per l uso Revisione 00 Febbraio 2011 6 INTRODUZIONE 6 1 Uso previsto Il Kit di estrazione del DN
28. ner A L A 16 8 2 1 Preparazione dei campioni per PapilloCheck e PapilloCheck high risk 16 8 2 2 Preparazione dei campioni per bevoCheckC NG 16 8 3 Protocollo RE ae E EE 17 EH 17 o e GE 17 EC e E A E E E N E E E A E E EE A E E E A TE E TATE 17 8 3 4 Ottimizzazione delle condizioni di legame del DNA UE do En e Eine EE a a 18 8 36 e elle ge E ee ei le Re te 18 8 3 7 Essiccamento delle colonnine da centnfuga asa 18 38 Ee Eege Ee E 19 Kit di estrazione del DNA oCheck Istruzioni per l uso Revisione 00 Febbraio 2011 9 GUIDAALL INSTALLAZIONE E ALL USO DEL SET PER VUOTO oCheck VACSET E DELLA POMPA A VUOTO oCheck Vini 20 EE RR A 20 9 1 1 Set per vuoto oCheck VacSet i 20 9 1 2 Pompa a vuoto oCheck VacPuUmMp E 21 9 2 Assemblaggio del set per vuoto oCheck VacSet snnnussnnnnnnunnnnnnnnnnnnnnnnnnnnennnnnnnnnnnnnnn EEN 22 9 2 1 Disposizione per il legame del DNA e il lavaggio ban 22 9 2 2 Disposizione per l eluizione del DNA i 23 9 3 Assemblaggio della pompa a vuoto oCheck VacPump iii 24 9 4 impostazione d l VUOTO E 24 DS Applicazione del VUOTO EE 24 9 6 Veniilazione del coletor saaa A E A Ea A AENA 24 10 PREPARAZIONE CON 8 COLONNINE N cat 515 050 25 10 1 Preparazione delle soluzioni di lavoro e condizioni di conservazione 25 10 2 Preparazione del campioni co se EEN 26 10 2 1 Prepara
29. nti IT IT DI DI Collocare la colonnina da centrifuga in un tubo di reazione da 1 5 ml pulito Applicare 100 pl di tampone E preriscaldato 70 C al centro della membrana nella colonnina da centrifuga Chiudere il tappo e incubare a temperatura ambiente per 1 minuto Centrifugare a 11 000 g per 1 minuto Per garantire che il DNA isolato offra prestazioni ottimali nelle applicazioni successive si raccomanda di eseguire l eluizione con il tampone E fornito Conservare il DNA estratto a 20 C Per ulteriori analisi con saggi della linea di prodotti oCheck fare riferimento alle rispettive Istruzioni per l uso PapilloCheck PapilloCheck high risk e PelvoCheck CT NG Kit di estrazione del DNA oCheck Istruzioni per l uso Revisione 00 Febbraio 2011 9 GUIDAALL INSTALLAZIONE E ALL USO DEL SET PER VUOTO oCheck VACSET E DELLA POMPA A VUOTO oCheck VACPUMP Il collettore per vuoto oCheck stato progettato per la rapida purificazione manuale parallela di acidi nucleici utilizzando il Kit di estrazione del DNA oCheck Preparazione con 8 colonnine Questo sistema permette la rapida purificazione simultanea di acidi nucleici di alta qualit Le lunghe operazioni di centrifugazione e decantazione vengono eliminate grazie all uso del vuoto Kit di estrazione del DNA oCheck si basano sulla tecnologia di ultrafiltrazione e offrono un sistema di purificazione degli acidi nucleici pratico e veloce Quando si utili
30. ollegamento forniti Tagliare il tubo di collegamento pi corto in due parti di circa 4 e 5 cm Utilizzare il tubo di collegamento di 5 cm per collegare la pompa a vuoto oCheck VacPump al regolatore del vuoto Fissare il silenziatore sul lato opposto della pompa a vuoto oCheck VacPump in corrispondenza dello scarico utilizzando il tubo di collegamento di 4 cm Fissare qui il edi silenziatore Valvola del collettore 3 Vite di regolazione Figura 5 a Assemblaggio della pompa a vuoto oCheck VacPump b Regolatore del vuoto 9 4 Impostazione del vuoto Verificare che il coperchio del collettore il portacolonnine e le strip di legame siano posizionati correttamente Chiudere la valvola del collettore figura 5a Avviare la pompa a vuoto Regolare il vuoto come indicato nel protocollo del kit per mezzo del regolatore del vuoto figura 5b Aprire la vite di regolazione fino a ottenere il vuoto desiderato 9 5 Applicazione del vuoto Caricare i campioni nelle singole strip di legame Aprire la valvola del collettore e se necessario premere brevemente le strip di legame fino all avvio del flusso 9 6 Ventilazione del collettore Quando i campioni sono passati attraverso il filtro delle strip di legame chiudere la valvola del collettore e spegnere la pompa a vuoto Attendere circa 30 secondi finch il portacolonnine con le strip di legame non risulta facile da rimuovere Kit di estrazione del DNA oCheck Istruzioni per l uso R
31. on il numero appropriato di strip fittizie Verificare che le strip di legame e le strip fittizie siano correttamente inserite nel portacolonnine prima di applicare il vuoto Non collocare il contenitore per i residui in lavastoviglie per pulirlo 28 Kit di estrazione del DNA oCheck Istruzioni per l uso Revisione 00 Febbraio 2011 mg Pipettare attentamente 900 ul dei lisati nei pozzetti delle strip di legame e fare attenzione a non bagnare i bordi dei pozzetti figura 7 Figura 7 Pipettaggio del lisato nei pozzetti delle strip di legame mg Impostare il vuoto su 200 mbar tramite il regolatore del vuoto figura 8a mg Applicare lentamente il vuoto aprendo la valvola del collettore finch tutti i lisati non sono passati attraverso le colonnine figura 8b Vite di regolazione Valvola del collettore Figura 8 a Regolatore del vuoto b Valvola del collettore mg Arrestare il vuoto subito dopo il passaggio di tutto il liquido attraverso le colonnine circa 30 secondi per evitare la formazione di schiuma chiudendo la valvola del collettore mg Spegnere la pompa a vuoto e ripristinare le normali condizioni di pressione 29 Kit di estrazione del DNA oCheck Istruzioni per l uso Revisione 00 Febbraio 2011 10 3 6 Lavaggio delle strip di legame Per le operazioni descritte di seguito consigliabile utilizzare la pipetta a 8 canali e le apposite vaschette per reagenti i volumi di tampone necessari in caso di
32. ondi mg 200 mbar mg Evitare la formazione di schiuma ESSICCAMENTO DELLE STRIP DI LEGAME 10 minuti a 600 mbar p R O LI O C O L L O ELUIZIONE DEL DNA 100 pl di tampone E preriscaldato a 70 C 5 minuti a temperatura ambiente 18 25 C Applicare il vuoto 400 mbar Evitare la formazione di schiuma Riduzione della pressione atmosferica a seconda della viscosit del campione potrebbe essere necessario prolungare il tempo di filtrazione o aumentare il vuoto ad es da 200 a 400 mbar Kit di estrazione del DNA oCheck Istruzioni per l uso Revisione 00 Febbraio 2011
33. ore quantit di cellule per l estrazione Centrifugare fino a 1000 pl di campione per 5 minuti a 11 000 g e risospendere il pellet in 250 pl di acqua distillata Questa procedura di concentrazione pu essere eseguita unicamente sui campioni di strisci cervicali raccolti con il PapilloCheck Collection Kit il mezzo di raccolta PreservCyt o il mezzo di raccolta Surepath In caso di uso del mezzo di raccolta STM non possibile concentrare il campione mediante centrifugazione mg Pipettare 250 ul della soluzione del campione in un tubo di reazione da 1 5 ml o 2 ml Per evitare contaminazioni utilizzare tubi di reazione con chiusura di sicurezza o tappo a vite per la fase di lisi Si consiglia di validare l intera procedura di isolamento del DNA di ogni ciclo di estrazione del DNA utilizzando un controllo negativo Kit di estrazione del DNA oCheck Istruzioni per l uso Revisione 00 Febbraio 2011 10 3 Protocollo standard Quando si utilizza il Kit di estrazione del DNA oCheck Preparazione con 8 colonnine sotto vuoto necessario un sistema di vuoto appropriato Per le apparecchiature necessarie e per le istruzioni di installazione e d uso fare riferimento al capitolo 9 10 3 1 Preparazione mg Verificare che la centrifuga sia impostata a temperatura ambiente 18 25 C mg Preparare i campioni come indicato nel capitolo 10 2 mg Impostare i blocchi riscaldanti o i bagni termostatici a 56 C e 70 C rispettivamente
34. portacolonnine Kit di estrazione del DNA oCheck Istruzioni per l uso Revisione 00 Febbraio 2011 Figura 11 Ogni colonnina della strip di legame deve essere posizionata direttamente al di sopra di una provetta per PCR della strip per PCR DI DI DI Ir DI DI Pipettare 100 pl di tampone E preriscaldato 70 C direttamente sulla membrana di ciascuna strip di legame adoperando una pipetta monocanale Utilizzare un puntale nuovo per ogni campione Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente Applicare lentamente il vuoto fino a un massimo di 400 mbar aprendo la valvola del collettore Arrestare rapidamente il vuoto chiudendo la valvola del collettore subito dopo il passaggio di tutto il liquido attraverso le colonnine per evitare la formazione di schiuma Spegnere la pompa a vuoto e ripristinare le normali condizioni di pressione Chiudere le provette per PCR etichettate e conservarle Per garantire che il DNA isolato offra prestazioni ottimali nelle applicazioni successive si raccomanda di eseguire l eluizione con il tampone E Conservare il DNA estratto a 20 C Per ulteriori analisi con saggi appartenenti alla linea di prodotti oCheck fare riferimento alle rispettive Istruzioni per l uso PapilloCheck e PapilloCheck high risk 32 Kit di estrazione del DNA oCheck Istruzioni per l uso Revisione 00 Febbraio 2011 11 RISOLUZIONE DEI PROBLEMI Problema e causa RESA DI
35. reazione per evitare che si possano aprire accidentalmente 8 3 4 Ottimizzazione delle condizioni di legame del DNA rin n Ir IT Centrifugare brevemente il tubo di reazione per rimuovere eventuali gocce dall interno del tappo Aggiungere 300 pl di etanolo p a 2 99 8 al campione Chiudere immediatamente il tappo e mescolare accuratamente mediante passaggio sul vortex a Impulsi per 15 secondi Centrifugare brevemente il tubo di reazione per rimuovere eventuali gocce dall interno del tappo Kit di estrazione del DNA oCheck Istruzioni per l uso Revisione 00 Febbraio 2011 8 3 5 Legame del DNA Per evitare contaminazioni prima di iniziare questa fase indossare un nuovo paio di guanti mg Per ciascun campione collocare una colonnina da centrifuga in un tubo di raccolta mg Pipettare attentamente 450 pl dei lisati nella colonnina da centrifuga e centrifugare a 11 000 g per 1 minuto a temperatura ambiente Non gettare via il resto del lisato mg Gettare via il tubo di raccolta con il flow through Per evitare contaminazioni prima di iniziare questa fase indossare un nuovo paio di guanti Preparare nuovi tubi di raccolta e collocare le colonnine da centrifuga al loro interno mm Pipettare i restanti 450 pl di lisato nella colonnina da centrifuga m Centrifugare a 11 000 g per 1 minuto a temperatura ambiente Per evitare contaminazioni prima di iniziare questa fase indossare un nuovo paio di guanti mg Gettar
36. rofondite competenze pratiche e teoriche in biologia molecolare e nei prodotti oCheck Per qualsiasi domanda o in caso di problemi nell uso dei prodotti oCheck non esitare a contattare il proprio distributore locale Greiner Bio One 13 CARATTERISTICHE PRESTAZIONALI Il Kit di estrazione del DNA oCheck un dispositivo per uso diagnostico in vitro per saggi della linea di prodotti oCheck Le prestazioni analitiche e specifiche del Kit di estrazione del DNA oCheck sono state testate in combinazione con il saggio corrispondente Fare riferimento alle Istruzioni per l uso dei rispettivi prodotti oCheck per una descrizione dettagliata delle prestazioni PapilloCheck Greiner Bio One N cat 465 060 PapilloCheck high risk Greiner Bio One N cat 505 060 e PelvoCheck CT NG Greiner Bio One N cat 504 002 Kit di estrazione del DNA oCheck Istruzioni per l uso Revisione 00 Febbraio 2011 34 Estrazione del DNA 14 PROTOCOLLI BREVI 14 1 Protocollo breve per la preparazione con colonnina singola N cat 515 040 Estrazione del DNA con il Kit di estrazione del DNA oCheck Preparazione con colonnina singola Greiner Bio One N cat 515 040 PREPARAZIONE Verificare che la centrifuga sia impostata a temperatura ambiente 18 25 C Preparare le soluzioni di lavoro come indicato nel capitolo 8 1 Impostare i blocchi riscaldanti o i bagni termostatici a 56 C e 70 C Preriscaldare il tampone E di eluizione
37. sere spedito e conservato a temperatura ambiente Per la conservazione delle soluzioni di lavoro preparate vedere le sezioni 8 1 e 10 1 4 ISTRUZIONI DI SICUREZZA seguenti componenti del Kit di estrazione del DNA oCheck contengono sostanze pericolose Indossare guanti e occhiali di protezione e seguire le istruzioni di sicurezza fornite in questa sezione Sostanza Simbolo Frasi Frasi Frasi Componente i a SETE Ce H pericolosa di pericolo di rischio di rischio di sicurezza Nocivo per ingestione Irritante per gli occhi R 22 36 38 e la pelle Guanidina Tampone o cloridrato Infiammabile Nocivo per ingestione Irritante per gli occhi e la pelle Guanidina Tampone Wi cloridrato isopropanolo lt 25 R 10 22 36 38 S7 16 25 Irritante per gli occhi le vie respiratorie Proteinasi K e la pelle liofilizzata Pu provocare sensibilizzazione per inalazione Proteinasi K R 36 37 38 42 S 22 24 26 36 37 L etichettatura delle sostanze pericolose non necessaria se la quantit per flacone inferiore a 125 g o ml ai sensi delle direttive 67 548 CEE Art 25 1999 45 CE Art 12 e delle GefStoffV 20 3 e TRGS 200 7 1 tedesche Per ulteriori informazioni consultare la scheda di dati di sicurezza Frasi di rischio R10 Infiammabile R22 Nocivo per ingestione R 36 37 38 Irritante per gli occhi le vie respiratorie e la pelle R 36 38 Irritante per gli occhi e la pelle R 42 Pu provocare sensibilizzazio
38. tuali gocce dall interno del tappo mg Aggiungere 300 pl di etanolo p a 2 99 8 al campione mg Chiudere immediatamente il tappo e mescolare accuratamente mediante passaggio sul vortex a Impulsi per 15 secondi mg Centrifugare brevemente il tubo di reazione per rimuovere eventuali gocce dall interno del tappo 27 Kit di estrazione del DNA oCheck Istruzioni per l uso Revisione 00 Febbraio 2011 10 3 5 Legame del DNA w Preparare il collettore per vuoto oCheck come mostrato nella figura 6 fare riferimento al capitolo 9 per una descrizione pi dettagliata Portacolonnine con strip di legame Coperchio del collettore Contenitore per i residui Base del collettore Valvola del collettore Figura 6 Disposizione per il legame del DNA e il lavaggio mg Collocare uno dei due contenitori per i residui all interno della base del collettore mg Chiudere la base del collettore con il coperchio del collettore mg Collocare il portacolonnine nella guarnizione in gomma del coperchio del collettore mg Inserire il numero necessario di strip di legame nel portacolonnine Verificare che le strip di legame siano inserite correttamente e che si innestino saldamente nel portacolonnine quando scattano in posizione si udir distintamente un clic Se vengono trattati contemporaneamente meno di 48 campioni inserire nel portacolonnine soltanto il numero di strip di legame necessario e riempire le posizioni rimanenti del portacolonnine c
39. uali tracce di etanolo L etanolo presente nel tampone W2 inibisce le reazioni enzimatiche e deve essere completamente rimosso prima dell eluizione del DNA 10 3 8 Eluizione del DNA Per la procedura di eluizione descritta di seguito il collettore per vuoto deve essere modificato come mostrato nella figura 10 Portacolonnine con strip di legame Coperchio del collettore Rack per microprovette Spaziatore Microtube Rack Spaziatore Round Well Block Base del collettore Figura 10 Disposizione per l eluizione del DNA mg Rimuovere il portacolonnine insieme con le strip di legame e collocarlo su un foglio di carta pulito fornito nel kit mg Rimuovere il coperchio del collettore e il contenitore per i residui usato mg Inserire gli spaziatori per blocco con pozzetti rotondi e sopra di essi quelli per rack per microprovette nei lati corti della base del collettore figura 10 mg Collocare il rack per microprovette sugli spaziatori mg Collocare il numero appropriato di provette per PCR etichettate ogni 2 file del rack per microprovette iniziando dalla fila N 2 del rack per microprovette mg Chiudere il collettore per vuoto e collocare le strip di legame in cima Verificare che ogni strip di legame sia posizionata direttamente al di sopra di una provetta per PCR per raccogliere il DNA eluito figura 11 Controllare nuovamente che tutte le strip di legame e le strip fittizie siano ancora correttamente inserite nel
40. uso di vaschette per reagenti sono indicati nella tabella 1 Se si usano vaschette per i tamponi preparare la quantit appropriata di soluzioni tampone Numero di campioni da estrarre Tampone W1 17 5 ml 28 5 ml Tampone W2 Tabella 1 Quantit di soluzioni tampone necessaria per n x campioni Prima di usarlo per la prima volta aggiungere 200 ml di etanolo vedere anche il capitolo 10 1 mg Aggiungere 600 ul di tampone W1 in ciascun pozzetto delle strip di legame figura 9 a b Figura 9 a Pipettaggio del tampone W1 dalla vaschetta del tampone b Aggiunta del tampone W1 nei pozzetti delle strip di legame Impostare il vuoto su 200 mbar mediante il regolatore del vuoto mg Applicare lentamente il vuoto aprendo la valvola del collettore finch tutti i lisati non sono passati attraverso le colonnine figura 8 mg Arrestare il vuoto chiudendo la valvola del collettore subito dopo il passaggio di tutto il liquido attraverso le colonnine circa 30 secondi per evitare la formazione di schiuma mg Aggiungere 900 pl di tampone W2 in ciascun pozzetto delle strip di legame Impostare il vuoto su 200 mbar mediante il regolatore del vuoto mg Applicare il vuoto finch il tampone non passato attraverso le colonnine circa 30 secondi mg Arrestare il vuoto chiudendo la valvola del collettore subito dopo il passaggio di tutto il liquido attraverso le colonnine circa 30 secondi per evitare la formazione di schiuma
41. uzi oni prima del uso Antes de usar leia as instru es Gebruik saanwij zing lezen L s brugsan visningen L s bruk sanvisnin gen f re anv nd ning Przed u yciem przeczyta instrukcj Les bruksan visning f r bruk 2uUu Bou NEUTE TE TIG O nvieg XPnons Kullanma dan Once talimati okuyun Catalog Number Katalog nummer Num ro de r f rence Numero de cat lo go Numero catalogo Numero de catalo go Catalo gusnum mer Katalog nummer Katalog nummer Numer katalo gowy katalog nummer Apouoc KOTO AOVOU Katalog numaras Kit di estrazione del DNA oCheck Istruzioni per l uso Revisione 00 Febbraio 2011 Manufac turer Hersteller Fabricant Fabri cante Produt tore Fabri cante Fabrikant Producent Tillverkare Producent produsent KaTAOKEU OOTTIC Uretici firma In Vitro Diag nostic Me dical Device In vitro Diagnosti kum Produit m di cal de diagnostic in vitro Producto medicinal de diagn sti ca in vitro Dispositivo medico diagnosti co in vitro Producto medicinal de diagn sti ca in vitro In vitro diag nostisch medisch product In vitro meskdicin doag nose apparat In vitro medicinsk doag nostisk apparatur Diag nostyka in vitro Produkt yw in vitro di agnostisk medisinsk utstyr In Vitro lIAYVWOTI K
42. vitare contaminazioni utilizzare tubi di reazione con chiusura di sicurezza o tappo a vite per la fase di lisi e Devono essere utilizzati puntali con filtro per micropipetta sterili privi di DNasi di RNasi e di DNA umano Occorre cambiare il puntale per ogni trasferimento di liquido 7 3 2 Precauzioni generali e All arrivo controllare che i componenti del Kit di estrazione del DNA oCheck non siano danneggiati Se uno dei componenti appare danneggiato ad es flaconi di tampone contattare il distributore Greiner Bio One locale L uso di componenti danneggiati potrebbe compromettere le prestazioni del kit e Non utilizzare reagenti scaduti e Non utilizzare il Kit di estrazione del DNA oCheck dopo la data di scadenza e Non mescolare reagenti provenienti da lotti diversi e Utilizzare unicamente reagenti apparecchiature forniti con il kit o consigliati dal produttore e Le pipette il bagno termostatico e il blocco riscaldante devono essere sottoposti a calibrazione controlli periodici e l pipettaggio di piccole quantit di liquido dell ordine dei microlitri non facile Pertanto importante adoperare le micropipette con la massima precisione possibile e Tutte le procedure di centrifugazione devono essere eseguite a temperatura ambiente 18 25 C e lreagentiinutilizzati e i materiali di rifiuto devono essere smaltiti in conformit con le disposizioni locali e statali Kit di estrazione del DNA oCheck Istru
43. zione dei campioni per PapilloCheck e PapilloCheck high risk 26 10 S Protocolo stondard o a ani 27 OES AN EE T EE 27 10 a Eros ooo dd o d _ 0 d0 27 E e EC EE E E 27 10 3 4 Ottimizzazione delle condizioni di legame del DNA ii 27 10 gt Legame delDNA TEETE a a a 28 10 36 Lavaggio delle stip dHegame RR 30 10 Geet Essiccamento delle ee Me eu Ite sana EE EE EN 10 3 8 Eluzione delDNA EE 31 11 RISOLUZIONE DEI PROBLEMI ee eege eege 33 12 ASSISTENZA TECNICA ATA a a EEN NEEN RE ENKER EEN NEE REEN NEE KE NEEN 34 13 CARATTERISTICHE PRESTAZIONALI M in 34 M PROTO ei E WR A EE 35 14 1 Protocollo breve per la preparazione con colonnina singola N cat 515 040 35 14 2 Protocollo breve per la preparazione con 8 colonnine N cat 515 050 37 Kit di estrazione del DNA oCheck Istruzioni per l uso Revisione 00 Febbraio 2011 1 CONTENUTO DEL KIT Kit di estrazione del DNA Preparazione con Preparazione oCheck colonnina singola con 8 colonnine N cat 515 040 N cat 515 050 Tampone L1 Tampone L2 Reagente L3 Wi Tampone W1 w2 Tampone W2 concentrato EI Tampone E K Proteinasi K liofilizzata Tampone per proteinasi PKB RNA carrier liofilizzato Colonnine da centrifuga Tubi di raccolta Strip di legame Foglio di carta Etichetta per tampone L4 Istruzioni per scari
44. zioni per l uso Revisione 00 Febbraio 2011 7 3 3 Lavorare insicurezza e Questo kit esclusivamente per uso diagnostico in vitro e deve essere utilizzato unicamente da personale con formazione specifica nelle procedure di laboratorio di diagnostica in vitro e Non pipettare mai soluzioni con la bocca e Non mangiare bere fumare o applicare prodotti cosmetici negli ambienti di lavoro e Fare attenzione quando si maneggiano campioni biologici contenenti materiale umano potenzialmente infettivo Per ridurre al minimo il rischio di infezione associato a materiale potenzialmente infettivo si consiglia di lavorare sotto una cappa a flusso laminare fino alla lisi dei campioni Tutti i campioni biologici devono essere maneggiati e smaltiti come se potessero trasmettere agenti infettivi Evitare il contatto diretto con i campioni biologici e cercare di non provocare schizzi o spruzzi e Lavarsi accuratamente le mani dopo aver maneggiato campioni e reagenti e Quando si lavora con campioni umani indossare sempre camice da laboratorio guanti e occhiali protettivi La versione aggiornata della scheda di dati di sicurezza di questo prodotto pu essere scaricata dal sito web di Greiner Bio One www gbo com bioscience biochips_download Kit di estrazione del DNA oCheck Istruzioni per l uso Revisione 00 Febbraio 2011 8 PREPARAZIONE CON COLONNINA SINGOLA N cat 515 040 8 1 Preparazione delle soluzioni di lavoro e condizioni di conservazio
45. zza il Kit di estrazione del DNA oCheck Preparazione con 8 colonnine sotto vuoto consigliabile impiegare il set per vuoto oCheck VacSet N cat 863 080 e la pompa a vuoto oCheck VacPump N cat 863 070 9 1 Contenuto 9 1 1 Set per vuoto oCheck VacSet Rack per microprovette Strip fittizie 12x Spaziatori Contenitori per i residui Regolatore del vuoto Figura 2 Contenuto del set per vuoto oCheck VacSet 20 Kit di estrazione del DNA oCheck Istruzioni per l uso Revisione 00 Febbraio 2011 9 1 2 Pompaa vuoto oCheck VacPump Pompa a vuoto oCheck VacPump Tubi di collegamento Silenziatore Figura 3 Contenuto della pompa a vuoto oCheck VacPump 21 Kit di estrazione del DNA oCheck Istruzioni per l uso Revisione 00 Febbraio 2011 9 2 Assemblaggio del set per vuoto oCheck VacSet mg Collocare la base del collettore su un bancone di laboratorio stabile Il collettore per vuoto deve essere preparato come mostrato nella figura 4 a b Portacolonnine con ACETTETET Portacolonnine con strip di legame lt gt lt gt n strip di legame Coperchio del Coperchio del collettore collettore Contenitore Rack per micro per i residui provette Spaziatore Base del collettore sMicrotube Rack Spaziatore sRound Well Block Base del collettore Valvola del collettore Figura 4 a Disposizione per il legame del DNA e il lavaggio b Disposizione per l eluizione del DNA
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