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Capitolo 1 - POLITesi - Politecnico di Milano

1. 1 94e 00 Mi 9 88e 01 0 00e 00 Figura 2 29 Mappa colorimetrica di velocit m s all interno di un microcanale particolare di perdita concentrata Analogamente a quanto descritto nei punti precedenti stata impostata la simulazione relativa al terzo blocco di spillamento concentrazione 0 5 la griglia di calcolo stata realizzata con 1300000 elementi esaedrici mentre per quanto concerne le condizioni al contorno stata imposta una portata pari a 0 75Q e a Q 8 rispettivamente in ingresso al sistema e in uscita al condotto di spillamento la pressione stabilita in uscita al microcanale di distribuzione stata di 8635 Pa Le simulazioni hanno mostrato una non perfetta distribuzione delle perdite di carico per questo motivo nel condotto di distribuzione stato inserito un tratto di 7 mm con ampiezza 350 um in sostituzione del tratto a 400 um mentre nel microcanale di spillamento stato considerato un tratto di 6 5 mm con ampiezza 200 um un condotto con ampiezza uniforme 150 um genererebbe perdite di carico eccessive Le cadute di pressione registrate a partire dal punto di biforcazione sono risultate di 11241 e 11256 Pa nei due rami con una differenza pari allo 0 13 figura 2 30 1 18e 04 7 74e 03 3 49e 03 Figura 2 30 Mappa colorimetrica di pressione Pa relativa allo spillamento della concentrazione di farmaco 0 5 105 Capitolo 2 Infine a monte del dispositivo stato simulato il tratto relativo allo
2. 3 5 Analisi sperimentale del meccanismo di spillamento Nel presente paragrafo vengono proposti 1 risultati dei test sperimentali eseguiti sul dispositivo microfluidico discusso nel capitolo 2 paragrafo 2 3 il sistema basato su tre spillamenti a partire da un condotto centrale di ampiezza 530 um e profondit 50 um nel quale confluiscono due micro canali di ampiezza 260 um figura 3 8 Acqua deionizzata e rodamina WT sono erogate nei due ingressi con uguali portate di 0 015 ul min mediante pompa a siringa I profili di concentrazione ed 1 relativi valori medi sono stati valutati in termini di fluorescenza attraverso software Insight 3G in corrispondenza del punto di confluenza dei due condotti di ingresso e del punto di spillamento Figura 3 8 Immagini al microscopio ottico ingrandimento 40x relative al dispositivo basato sul meccanismo di spillamento sinistra e al processo diffusivo della rodamina destra 117 Capitolo 3 Il processo diffusivo della rodamina coefficiente di diffusione 7x10 m s mostrato in figura 3 8 attraverso un immagine in fluorescenza mentre 1 profili di concentrazione estratti sono riportati in figura 3 9 I valori medi di concentrazione rilevati in corrispondenza del punto di spillamento nei tre microcanali sono stati confrontati con le simulazioni computazionali 3D eseguite sul dispositivo nel microcanale di sinistra stato registrato un valore di concentrazione media di 0 0298 a fronte di un
3. Inserimento manuale di T 1 oO 0 EI Ila Io 1 4 ni for p l Z w p 1 wIN Z 1 p Z Definizione larghezza microcanali a partire da wIN l p 1 T p 1 w p 1 Definizione lunghezza microcanali come multipli lt della larghezza v p 1 01 Z p 1 Z w p 1 d Velocit in Ap m s e p 1 v p 1 w p 1 D Numero di P clet N p 1 int32 101 Z 1 p Z 2 p end N 1 1 101 La formula precedente non funziona per N 1 1 Parametri per approssimazione numerica g 0 01 Intervallo per creazione vettori M 1000 Infinito della sommatoria s zeros Z 1 Indice della matrice in cui si trova il primo valore da spillare 143 Appendice Q Vettore adimensionalizzato per lunghezza microcanale r A WINE N PRR PR li oO Vettore adimensionalizzato per larghezza microcanale e No No La 6 pi pi ee Q Q Q 49 19 40 QO mM a eS LH y4 0 OUTl zeros length yl length OUT2 zeros length y2 length OUT3 zeros length y3 length OUT4 zeros length y4 length media_Sl zeros l length x1 5 Sconcentrazione media_S2 zeros 1 length x2 media_S3 zeros 1 length x3 media_S4 zeros 1 length x4 No Matrice delle uscite soluzioni Calcoli per ottenere Cp ed lp A zeros Z 1 Costante da aggiungere ad OUT Ak zeros M Z Valore per ottenere OUT COC Calcolo IT 1 tic for i l M OUT1 OUT1 2 pi sin i alfa pi i
4. Livelli di concentrazione richiesti in uscita numero di colture cellulari Oc 1 83e 10 Portata desiderata alle cellule m 3 s Inserimento manuale dei valori di concentrazione richiesti eros Z 1 Vettore dei valori medi di concentrazione richiesti l 0 01 Primo valore di concentrazione richiesto min 0 max 1 0 1 Secondo valore di concentrazione richiesto min 0 max 1 0 5 Terzo valore di concentrazione richiesto min 0 max 1 0 97 Quarto valore di concentrazione richiesto min 0 max 1 0 Dimensionamento del microcanale wIN 600e 6 Width A1 m d 600e 6 Depth m i microcanali hanno tutti la stessa profondit Parametri relativi ai due ingressi AO 00b 1 2 0c Z Portata nel microcanale AO mezzo m 3 s 00a 00b Portata nel microcanale AO farmaco m 3 s gamma 00b 00a alfa 1 1 gamma Parametro utilizzato per il calcolo del profilo di Sconcentrazione 01 00a 00b Portata nel canale Al m 3 s 6 Vettori per la risoluzione dell algoritmo w zeros Z 1 Larghezze dei microcanali in cui avviene la diffusione m l zeros Z 1 Lunghezze dei microcanali in cui avviene la diffusione m v zeros Z 1 Velocit m s Pe zeros Z 1 Numeri di P clet nei microcanali in cui avviene diffusione N zeros Z 1 Livelli di concentrazione in ingresso al canale Ap T zeros Z 1 Rapporto lunghezza larghezza dei microcanali Parametri relativi ai canali di miscelamento 1 2000
5. osso ed una delle pi diffuse patologie a carico di questo tessuto l osteoporosi con riferimento a diverse terapie farmacologiche in uso per il suo trattamento Successivamente vengono illustrati alcuni dispositivi microfluidici utilizzati per la generazione di gradienti di concentrazione nonch le tecnologie ed 1 materiali necessari per la loro fabbricazione 1 1 Caratteristiche generali del tessuto osseo Il tessuto osseo un tessuto connettivo denso mineralizzato provvisto di dotti sanguigni linfatici e nervosi in grado di garantire l approvvigionamento di nutrienti ed ossigeno lo smaltimento dei cataboliti e l informatica delle cellule presenti al suo interno Il tessuto osseo costituisce le ossa che concorrono a costituire lo scheletro dei vertebrati svolgendo una funzione di sostegno del corpo e di protezione degli organi vitali come nel caso della cassa toracica e permettendo insieme ai muscoli 1l movimento il tessuto osseo costituisce inoltre un indubbia riserva di calcio e gruppi fosfato da cui l organismo attinge in particolari periodi di necessit per mezzo di una coordinazione ormonale Nelle estremit delle ossa lunghe le epifisi ospitato 1l midollo osseo rosso tessuto emopoletico costituito da cellule staminali per evitare che tale tessuto subisca variazioni di temperatura tali da influenzare il ciclo replicativo cellulare esso viene alloggiato nella porzione pi interna delle epifisi dell osso Figura
6. una costante generalmente compresa tra 0 6 e 0 8 come evidente il limite di risoluzione risulta tanto pi piccolo quanto pi ridotta la lunghezza d onda utilizzata ed elevato il valore di apertura numerica della lente Un ulteriore parametro da considerare costituito dal depth of field o profondit di campo figura 1 61 K A DOF 1 8 La riduzione eccessiva del limite di risoluzione determina un significativo decremento del parametro DOF con incapacit di penetrazione della radiazione UV nel film di fotoresist depositato quindi necessario un corretto bilanciamento tra 1 due indici al fine di ottimizzare il processo litografico Le costanti K e K dipendono da molteplici aspetti del processo tra cui tipologia di resist caratteristiche della maschera e pattern che deve essere trasferito DOF Depth of field DOF is the range of distance within which the image is in focus A NA DOF k 2 Figura 1 61 Formulazione matematica e rappresentazione schematica del concetto di profondit di campo Sordan Dispense del corso di Micro Nano Fabbricazione 2009 59 Capitolo 1 Il limite di risoluzione attualmente raggiunto da tecniche di fotolitografia projection configurazione pi utilizzata prossimo ai 100 nm l utilizzo di tecniche seriali basate su fascio elettronico consente una sensibile riduzione nel valore di limite di risoluzione raggiungibile circa 10 nm a disc
7. 2 5 4 sono state realizzate piccole modifiche tali da garantire l effettiva ripartizione delle portate desiderate Il sistema di distribuzione del fluido alle popolazioni cellulari sottoposte alle concentrazioni 0 ed 1 di farmaco figura 2 14 prevede la realizzazione di microcanali con resistenze completamente differenti rispetto a quelle progettate per 1 rimanenti livelli di concentrazione Il blocco di pozzetti centrale prevede un microcanale di ampiezza 500 um e lunghezza prossima ai 7 mm e due canali laterali di circa 5 5 mm con ampiezza 500 um 1 due sottosistemi laterali presentano invece un condotto centrale di 6 mm con ampiezza variabile tra 500 e 450 um e due canali laterali lunghi 4 5 mm e larghi 500 um 89 Capitolo 2 Figura 2 14 Rete di distribuzione del fluido con concentrazione 0 ed 1 di farmaco Un condotto di 4 5 mm con ampiezza 100 um con inserimento di due tratti di lunghezza complessiva 3 mm con ampiezza 500 um garantisce l approvigionamento del blocco centrale mentre dei condotti di circa 4 mm con ampiezza 100 um corredati da un breve tratto di 1 mm largo 500 um riforniscono le unit laterali anche in questo caso le perdite di carico risultano in prima approssimazione bilanciate cos da garantire una equa distribuzione delle portate 2 4 5 Progettazione dei micromixer Il dimensionamento dei micromixer per la miscelazione di farmaco e mezzo di coltura stato effettuat
8. Sornay Rendu E Arlot ME Delmas PD Vitamin D receptor gene polymorphisms are not related to bone turnover rate of bone loss and bone mass in postmenopausal women the OFELY study J Bone Miner Res 1996 11 827 834 Gorman BR Wikswo JP Characterization of transport in microfluidic gradient generators Microfluid Nanofluid 2008 4 273 285 Gunawan RC Silvestre J Gaskins HR Kenis PJA Leckband DE Cell migration and polarity on microfabricated gradients of extracellular matrix proteins Langmuir 2006 22 4250 4258 Hansen CL Skordalakes E Berger JM Quake SR A robust and scalable microfluidic metering method that allows protein crystal growth by free interface diffusion Proc Natl Acad Sci USA 2002 99 16531 16536 Hattori K Sugiura S Kanamori T Generation of arbitrary monotonic concentration profiles by a serial dilution microfluidic network composed of microchannels with a high fluidic resistance ratio Lab Chip 2009 9 1763 1772 Heit B Tavener S Raharjo E Kubes P An intracellular signaling hierarchy determines direction of migration in opposing chemotactic gradients J Cell Biol 2002 159 1 91 102 152 Bibliografia Hofstraat JW Steendijk M Vriezekolk G Schreurs W Broer GJAA Wijnstok N Determination of rhodamine WT in surface water by solid phase extraction and HPLC with fluorescence detection Water Res 1991 25 7 883 890 Holden MA Kumar S Castellana ET Beskok A Cr
9. calcolati con introduzione di notevoli errori nei risultati ottenuti Le equazioni di conservazione della quantit di moto e della massa vengono risolte in modo sequenziale in tale procedura l equazione di continuit conservazione massa utilizzata per il calcolo della pressione tuttavia la pressione non compare esplicitamente nell equazione considerata dal momento che la densit non direttamente legata a tale variabile la famiglia di algoritmi SIMPLE Semi Implicit Method for Pressure Linked Equations algoritmi di accoppiamento pressione velocit viene utilizzata per introdurre la pressione nell equazione di continuit L utilizzo dell algoritmo SIMPLE preferibile rispetto all algoritmo SIMPLEC il quale consente di raggiungere pi rapidamente la condizione di convergenza nei problemi in cui l incremento del fattore di rilassamento relativo alla pressione fino al valore unitario possa generare una condizione di instabilit Calcolo dei gradienti I gradienti possono essere calcolati secondo tre differenti metodi Green Gauss cell based Green Gauss node based e least square cell based Il teorema di Green Gauss pu essere utilizzato per calcolare il gradiente di una data variabile lea Vo D A A11 J in cui la sommatoria estesa a tutte le facce che costituiscono la cella computazionale Il valore della variabile di interesse sulla faccia considerata pu essere calcolato con il metodo Green G
10. composizioni si mantengono fissate Pendenza e caratteristiche del profilo di concentrazione possono essere modulate garantendo inoltre un controllo dinamico durante le prove sperimentali principali svantaggi sono costituiti dalla necessit di mantenere un flusso costante costi e sprechi elevati dagli sforzi meccanici a cui le cellule sono sottoposte e dalla necessit di limitare l analisi alla ridotta porzione iniziale dei canali dato il progressivo appiattimento del profilo di concentrazione I pi diffusi dispositivi appartenenti a questa classe sono certamente 7 Sensor Premixer Gradient Generator e Universal Gradient Generator Keenan et al 2008 I T Sensor figura 1 31 consistono in due o pi microcanali uniti in una configurazione a T utilizzati per creare profili di concentrazione di varie specie chimiche realizzare saggi biologici studiare la chemotassi batterica ed infettare cellule con differenti tipologie di virus 31 Capitolo 1 La perfusione costante applicata consente di evitare la diminuzione di nutrienti nonch l accumulo di prodotti di scarto permettendo lunghi periodi di coltura cellulare location of measurement ha al i i DES EE i mil Bag rsa Fi p a Bid Pag mia a Cae ara b Alera Sid inlet for chemoeffectore bacteria inlet for butter Figura 1 31 Schema di un dispositivo 7 Sensor con profilo di fluorescenza generato dalla interdiffusione di B galattosida
11. stato progettato con lunghezza 42 8 mm ed ampiezza 300 um per poter equilibrare le perdite di carico presenti tra il secondo punto di spillamento e 1 pozzetti di coltura pozzetto di recupero posti a pressione atmosferica sono stati inseriti dei mixer sezione di passaggio pari al 20 della sezione di uscita di 1 6 mm nel condotto di distribuzione e di 1 7 mm in quello di spillamento in grado di generare perdite di carico localizzate e consentire 1l rispetto delle specifiche di progetto la caduta di pressione complessiva rilevata in corrispondenza della biforcazione stata prossima a 8800 9000 Pa Le simulazioni computazionali mostreranno in seguito un valore inferiore di pressione ed un perfetto equilibrio tra 1 due rami considerati 1 calcoli eseguiti analiticamente pesano infatti in modo eccessivo le perdite concentrate presenti all interno del circuito Successivamente sono state identificate delle dimensioni ottimali per i microcanali presenti a monte la lunghezza del condotto di distribuzione portata 5 8 Q presente tra primo spillamento concentrazione 0 5 e secondo spillamento concentrazione 0 1 stata fissata a 21 9 mm mentre ampiezza impostata stata pari a 400 um secondo gli stessi principi descritti al punto precedente tratto di imbocco di 800 um il canale di spillamento stato progettato con un ampiezza di 150um 94 Capitolo 2 e con una lunghezza quasi predeterminata di circa 40 1 mm la perdita di carico r
12. 001 e 0 11 con un brusco gradino in corrispondenza del terzo microcanale dove si registra una concentrazione di 0 583 figura 2 10 a b 1 98e 02 1 00e 00 x E 0 00e 00 0 00e 00 Figura 2 9 Mappa colorimetrica delle velocit m s in corrispondenza del punto di spillamento a e mappa colorimetrica relativa alla distribuzione del farmaco rosso all interno del medium b Non stato possibile ottenere le concentrazioni definite nelle specifiche del dispositivo Si ritiene che attraverso l allungamento del microcanale centrale sia possibile ottenere un andamento del profilo di concentrazione pi graduale tale da consentire l ottenimento dei livelli di farmaco ottimali tuttavia un sistema basato unicamente su processi diffusivi e su microcanali di spillamento risulta fortemente influenzato dal valore del coefficiente di diffusione da difetti di fabbricazione e da particolari condizioni sperimentali Pertanto si stabilito di realizzare un sistema che consenta l ottenimento delle concentrazioni richieste attraverso il miscelamento di portate proporzionali di farmaco e mezzo di coltura La progettazione del dispositivo le simulazioni effettuate e la discussione dei risultati saranno trattate nel paragrafi SUCCESSIVI 83 Capitolo 2 1 006 00 2005 01 5006 01 7005 01 6008 01 bass 5006 01 fraction of 4006 01 farmaco di 2006 01 1 001 LO0e 00 OLO00S LOO 0007 a OOO CLODTE OOS OO Po
13. 3 500 508 Del Zoppo Dispense del corso di Nanomateriali 2008 Diao J Young L Kim S Fogarty EA Heilman SM Zhou P Shuler ML Wu M DeLisa MP A three channel microfluidic device for generating static linear gradients and its application to the quantitative analysis of bacterial chemotaxis Lab Chip 2006 6 381 388 Dittrich PS Manz A Lab on a chip microfluidics in drug discovery Nature Rev Drug Discov 2006 5 210 218 Du Y Shim J Vidula M Hancock MJ Lo E Chung BG Borenstein JT Khabiry M Cropek DM Khademhosseini A Rapid generation of spatially and temporally controllable long range concentration gradients in a microfluidic device Lab Chip 2009 9 761 767 Duffy DC McDonald JC Schueller OJA Whitesides GM Rapid prototyping of microfluidic systems in poly dimethylsiloxane Anal Chem 1998 70 4974 4984 151 Bibliografia El Ali J Sorger PK Jensen KF Cells on chips Nature 2006 442 403 411 Frevert CW et al Measurement of cell migration in response to an evolving radial chemokine gradient triggered by a microvalve Lab Chip 2006 6 7 849 856 Fuji SI Uematsu M Yabuki S Abo M Yoshimura E Sato K Microbioassay system for an anti cancer agent test using animal cells on a microfluidic gradient mixer Analytical Sciences 2006 22 87 90 Ganan Calvo AM Gordillo JM Perfectly monodisperse microbubbling by capillary flow focusing Phys Rev Lett 2001 87 Garnero P Borel O
14. IX71 TSI Inc dotato di ottiche con ingrandimento 4x e 10x e videocamera Power View Plus Olympus TSI Inc e PCdiacquisizione dei dati 111 Capitolo 3 he Figura 3 1 Componenti del sistema uPIV presente al Laboratorio di Meccanica delle Strutture Biologiche del Politecnico di Milano 3 3 Preparazione della Rodamina WT La rodamina WT formula bruta C29 H29 N2 O5 Cl un colorante fluorescente rosso brillante originariamente sviluppato per applicazioni di analisi delle acque in seguito utilizzato nella preparazione di liquidi antigelo per autoveicoli e in diverse tipologie di inchiostro La rodamina WT nota anche come Acid red 388 viene inoltre spesso utilizzata come tracciante in acqua per determinare la velocit e la direzione del flusso I test sperimentali descritti nel presente capitolo sono stati eseguiti utilizzando rodamina WT analizzando il processo di miscelamento convettivo diffusivo di tale molecola in acqua deionizzata Le analisi relative al dispositivo presentato nel capitolo 2 paragrafo 2 3 sono state effettuate sfruttando le propriet ottiche della rodamina che eccitata da una sorgente laser con lunghezza d onda 532 nm genera fluorescenza figura 3 2 La soluzione di rodamina stata preparata utilizzando 0 1 g di Orcoacid Rhodamine WT Liquid Organic Dyestuffs Corporation ogni 400 g di H2O deionizzata densit acqua pari a 998 2 Kg m la preparazione stata effettuata mediante bilancia d
15. Shaw Flow Micrechannel flow Gil eer microchannel flow Tabella A1 Tecniche utilizzate per la valutazione del campo di moto di un fluido Particle Image Velocimetry A Practical Guide 141 Appendice Rodamina WT Prove sperimentali effettuate mediante tecnologia uPIV possono essere eseguite utilizzando rodamina WT figura A5 possibile valutare la diffusione di tale molecola all interno di un dato solvente confrontare le prestazioni di differenti micromixer o in generale il funzionamento di molteplici dispositivi microfluidici la rodamina WT un colorante rosso che eccitato da una sorgente laser ad una lunghezza d onda prossima ai 540 nm presenta un picco di emissione intorno al 585 nm in figura A6 vengono riportati gli spettri di emissione relativi a due isomeri di rodamina WT la massima emissione viene rilevata a 585 nm per l isomero e a 588 nm per l isomero 2 400 isomer 1 isomer 2 200 illa 2 200 3 100 0 500 BOO 700 300 wavelength nm Figura A6 Spettri di emissione relativi a due isomeri di rodamina WT Sutton et al 2000 142 Appendice A 5 Modelli analitici oO Modello analitico utilizzato per la definizione dei punti di spillamento nel dispositivo presentato al capitolo 2 paragrafo 2 3 oO 0 Biblio Gfataoi Gorman et al 2008 Wu et al 2005 oO oO Parametri definiti dall utente D le 10 Coefficiente di diffusione m 2 s Z2 4
16. The general requirements of the device were established with the biologists of the Istituto Ortopedico Galeazzi in particular five concentration levels of strontium ranelate were established to infuse the culture wells containing the populations of osteoblasts For each concentration value nine shafts were required in order to perform cellular viability tests in six copies and proliferation tests in three copies An important requirement was to guarantee an optimal filling time of the microchambers using culture wells with a diameter of 6 4 mm and with a volume of 200 ul the biologists highlighted the need to create a thin layer of medium in a space of time of few minutes Dimensions and possible geometries of the microfluidic platform were established by the research group in Trento considering the technical limits of the microfabrication process the two proposed shapes were a circular structure with a diameter of 9 cm and a square structure characterized by a side of 7 18 cm In the beginning the design of the device was based on a concentration gradient generator with subsequent withdrawals two inlets containing medium for cell cultures and strontium ranelate converge into a central channel from which predetermined flows at desired concentration levels are extracted figure C the entire system relies on pure diffusion processes XIV drug inlet concentration F gradient SH EUS medium inlet Figure C Scheme of the microfluid
17. Yr _ channel Tesi a chambers ig 00 pir Cells in Flow _ through P channels Cikel Figura 1 35 Vista superiore del dispositivo a particolare relativo alle test chambers in grado di connettere i microcanali di source e di sink b e migrazione di S Cerevisiae in risposta ad un gradiente di feromone c d Keenan et al 2008 Una interessante modifica quella proposta da Li e colleghi 2007 adiacente al canale di sink presente un array di cavit che si portano in una condizione di equilibrio chimico con il fluido contenuto nel canale alterando la lunghezza dei canali trasversali possibile creare gradienti di concentrazione lineari esponenziali e logaritmici figura 1 36 36 Capitolo 1 ee a i COTONE TOTO ae 1IATERN caries Figura 1 36 Vista superiore del dispositivo sviluppato da Li e colleghi nel 2007 e in grado di generare gradienti di concentrazione lineari f esponenziali g e logaritmici h Keenan et al 2008 L utilizzo di dispositivi microfluidici per la generazione di gradienti non si ancora affermato su vasta scala nella comunit dei biologi le principali cause spaziano dalla difficolt di progettazione e microfabbricazione allo specifico equipaggiamento richiesto per un funzionamento ottimale 1l disegno di nuovi dispositivi risponde necessariamente alle esigenze che determinati gruppi di biologi evidenziano discutendo con team di ingegneri limitando in tal
18. astrociti superiore in presenza di ridotte quantit di GF La principale differenza con 1 dispositivi presentati nelle pagine precedenti risiede nella presenza di una singola camera di coltura larga 2 4 mm e profonda 100 um in cui le cellule sono sottoposte gradualmente ad una variazione di concentrazione del soluto la portata considerata ottimizzata per consentire la diffusione ed il corretto miscelamento delle specie presenti stata di 0 1 ul min mentre il valore di shear stress cui le cellule sono state sottoposte stato mantenuto inferiore rispetto al valore critico sperimentato dalle cellule endoteliali durante condizioni di flusso fisiologiche A Gradient Chamber 0 Concentration Distance across channel mm Figura 1 45 a Disegno schematico del dispositivo microfluidico b profilo di concentrazione generato nella camera di coltura Chung et al 2005 Yamada e colleghi 2006 si discostano dai modelli presentati nelle pagine precedenti del capitolo realizzando un dispositivo compatto efficace e innovativo due fluidi miscibili vengono introdotti attraverso due ingressi separati e speculari e suddivisi attraverso una rete di microcanali la rete di 46 Capitolo 1 distribuzione dei due fluidi si combina in corrispondenza di specifici punti di confluenza in cui inizia il processo di mescolamento la lunghezza dei canali di distribuzione e la posizione del punto di confluenza determinano il rapport
19. condotte mediante software Fluent dei componenti 97 Capitolo 2 del sistema I disegni CAD delle differenti porzioni del circuito realizzati mediante software Rhinoceros sono stati esportati in formato IGES ed elaborati attraverso software Gambit quest ultimo ha consentito la generazione della griglia di calcolo e l impostazione delle condizioni al contorno del problema Ogni blocco stato discretizzato utilizzando elementi esaedrici in numero variabile in funzione delle dimensioni dei canali per limitare la pesantezza computazionale stata inoltre utilizzata una condizione di simmetria sulla profondit dei condotti dove sono stati posti 15 elementi Test preliminari sono stati eseguiti sui sistemi di distribuzione ai pozzetti di coltura cos da poter verificare l idonea collocazione di questi ultimi sulla piattaforma e sui micromixer in modo da valutare l effettiva miscelazione di farmaco e mezzo di coltura Le simulazioni sulla rete di distribuzione sono state eseguite a partire dai due blocchi di spillamento presenti pi a valle sui due rami del circuito relativi all estrazione della concentrazione di farmaco 0 01 per poi proseguire con l analisi delle unit strutturali presenti a monte I pozzetti di coltura sono stati impostati a pressione atmosferica cos come il pozzetto di recupero situato al margine inferiore del dispositivo ogni blocco stato analizzato considerando un breve tratto di ingresso sufficiente a gar
20. cumulativo dei diversi fattori esposti nel presente paragrafo la sovraregolazione sovra stimolazione del processo di riassorbimento osseo e la sottoregolazione della fase di apposizione di nuova matrice sebbene la completa comprensione delle cause della malattia non sia ancora stata raggiunta 1 1 5 1 Effetti dell osteoporosi sull osso trabecolare La struttura fisiologica dell osso spongioso caratterizzata da trabecole verticali e orizzontali le strutture trabecolari sono altamente interconnesse ed proprio tale organizzazione a garantire la notevole resistenza alla compressione tipica ad esempio dei corpi vertebrali L osteoporosi un disordine in cui la massa ossea totale notevolmente ridotta sebbene la sua qualit sia normale se una microsezione fosse analizzata dal punto di vista biochimico sarebbe possibile osservare un rapporto normale tra osteoide e mineralizzazione La struttura patologica evidenzia una netta diminuzione del numero di trabecole orizzontali con decremento nelle interconnessioni e conseguente decadimento nelle prestazioni della struttura ossea che va incontro a cedimenti catastrofici anche in presenza di carichi normalmente tollerati figura 1 15 Ante BS gu gie i i a i i 1 4 i w bj i ul hi i i z Ti ai Li 1 i a Ri sd g i 4 f fe r vi par 4 j R LI e T s vw 4 F fe li i ue La g 4 ga s 4 A 9 4 j i r TA gui SEN 1 amp t O i
21. descrizione del quale si rimanda in Appendice ed hanno consentito di validare 1 risultati delle simulazioni computazionali eseguite al calcolatore mediante il codice di calcolo commerciale Fluent In particolare verranno presentati 1 test eseguiti su due diverse tipologie di micromixer e gli esperimenti condotti sul dispositivo illustrato nel presente lavoro di tesi all interno del capitolo 2 paragrafo 2 3 In seguito verr esposto il test sperimentale volto all individuazione del coefficiente di diffusione dello stronzio cloruro SrCl principio attivo dello stronzio ranelato utilizzato per il trattamento dell osteoporosi La valutazione quantitativa del sistema di distribuzione alle cellule del mezzo di coltura non stata possibile a causa dell ottica presente sul microscopio in dotazione al laboratorio pertanto stata effettuata un osservazione puramente qualitativa Gli esperimenti sono stati realizzati mediante Rodamina WT liquida Organic Dyestuffs Corporation molecola che eccitata da una sorgente laser ad una lunghezza d onda di 532 nm genera fluorescenza 3 2 Componenti del sistema uPIV Viene di seguito proposta un immagine relativa al sistema Micro PIV TSI Inc presente al Laboratorio di Meccanica delle Strutture Biologiche figura 3 1 possibile osservare 1 seguenti componenti e sorgente laser Nd YAG Laser TSI Inc e sincronizzatore Model 610034 Laser Pulse Synchronizer TSI Inc e microscopio Olympus
22. di crescita dell osso e a livello articolare 10 Capitolo 1 1 1 4 Metabolismo osseo Figura 1 11 Schema semplificato dei processi di apposizione e riassorbimento di tessuto osseo Tratto da www wikipedia it X La componente mineralizzata dell osso per lo pi composta da calcio Ca e fosforo P con un contenuto medio di calcio del 60 la quantit di calcio presente all interno del corpo umano corrisponde a circa 1 1 5 del peso corporeo 1 Kg ogni 70 Kg gli osteoclasti scompongono mediamente 0 5 grammi di calcio al giorno ci significa che lo scheletro in un periodo di cinque sel anni viene completamente demolito e ricostruito 1000g 0 5 g giorno richiedendo notevoli sforzi metabolici figura 1 11 Al fine di garantire il corretto funzionamento del sistema nervoso e dell apparato muscolare 1l corpo umano necessita dell apporto quotidiano di calcio La concentrazione di calcio nel sangue detta calcemia regolata entro stretti limiti ed in genere varia tra 2 25 e 2 6 mmol l Il tessuto osseo oltre alle funzioni di protezione degli organi interni e locomozione funge da magazzino tampone per calcio e fosforo nel caso in cui la calcemia si abbassi eccessivamente gli osteoclasti intensificano 1l processo di riassorbimento osseo se viceversa la calcemia supera un limite critico gli osteoblasti producono un maggior quantitativo di fibrille di collagene sulle quali possibile depositare cristalli di idros
23. di perfezionare 1 diversi componenti e integrarne le funzionalit in sistemi completi ed efficienti che possano essere utilizzati anche da operatori non esperti E una combinazione di promesse illimitate aspettative e audaci scommesse un campo in continuo mutamento ma ancora non noto come si evolver nel proprio naturale processo di crescita molteplici sono 1 requisiti che dovr soddisfare per imporsi come tecnologia di ampio utilizzo dovr riscuotere un elevato successo commerciale piuttosto che rimanere confinata nei laboratori accademici e allo stesso tempo essere disponibile a prezzi contenuti Numerose sono le applicazioni di elevato valore in cui la microfluidica pu interpretare un ruolo di primo piano sebbene il loro sviluppo richieda importanti innovazioni sia sotto il profilo tecnologico sia dal punto di vista medico lo sviluppo di nuovi saggi in grado di monitorare la risposta di farmaci e terapie e la pianificazione di test innovativi nel campo della medicina preventiva rappresentano solo alcune delle vie verso cui si indirizzer la microfluidica L industria farmaceutica richiede nuovi strumenti che consentano di guidare lo sviluppo di nuovi farmaci applicazioni microfluidiche consentiranno di monitorare ed ottimizzare il processo di sintesi di nuove molecole e mediante l utilizzo di cellule di linea umane di verificarne in tempi molto rapidi le prestazioni in vitro Svariate applicazioni tecnologiche nel mondo richied
24. di piccole modifiche rispetto a quanto stabilito precedentemente mediante 1 calcoli analitici In tabella 2 6 sono riportate le nuove dimensioni caratteristiche dei microcanali caratterizzati da una profondit di 500 um 106 Capitolo 2 Lunghezza mm Larghezza um Blocco spillamento 0 01 Microcanale di spillamento 37 200 Microcanale di distribuzione 45 437 Blocco spillamento 0 1 Microcanale di spillamento 42 100 Microcanale di distribuzione 21 277 Blocco spillamento 0 5 Microcanale di spillamento 33 5 6 5 150 200 Microcanale di distribuzione 14 7 400 350 Blocco spillamento 1 Microcanale di spillamento 7 100 Microcanale di distribuzione 62 800 Tabella 2 6 Dimensioni caratteristiche dei microcanali nella rete di distribuzione del farmaco Si sottolinea come il microcanale di spillamento relativo al livello di concentrazione 0 01 sia stato modificato rispetto al modello analitico con l inserimento di una resistenza concentrata della lunghezza di 10 mm mantenendo complessivamente inalterata la lunghezza totale del condotto Le modifiche apportate al blocco di spillamento 0 5 sono analoghe a quelle riportate nel paragrafo precedente inserimento di un tratto di 6 5 mm con ampiezza 200 um nel condotto di spillamento e di un tratto di 7 mm con ampiezza 350 um nel ramo di distribuzione Simulazioni numeriche del sistema di distribuzione ai pozzetti di coltura Il sistema di distribuzione alle cellule costituito da un microca
25. di pressione Pa relativa allo spillamento della concentrazione di farmaco 0 01 Con lo stesso schema di lavoro si passati all analisi del secondo blocco di spillamento concentrazione 0 1 applicando una griglia di calcolo composta da 1800000 celle esaedriche ed una condizione di simmetria si imposta in ingresso una condizione di portata pari a 5 8 Q in uscita al condotto di spillamento una portata pari a 0 9 4 Q ed in corrispondenza del canale di distribuzione il valore di pressione definito nella simulazione precedente 3493 Pa Le perdite di carico rilevate seppur ripartite in modo ottimale nei due rami considerati sono risultate inferiori di 200 Pa rispetto a quanto previsto attestandosi su un valore di 8635 Pa in corrispondenza del punto di biforcazione si ritiene che ci sia dovuto all inserimento di due resistenze concentrate utilizzate per equilibrare le cadute di pressione in corrispondenza delle quali le formule analitiche considerate 104 Capitolo 2 portano ad una sovrastima delle perdite di carico In figura 2 29 mostrata una mappa colorimetrica del profilo di velocit all interno dei condotti da sottolineare l instaurarsi di piccoli vortici all interno delle resistenze concentrate in corrispondenza delle quali vengono registrate perdite di carico di centinaia di Pascal la differenza rilevata in termini di perdite di carico nelle due diramazioni a partire dal punto di spillamento risultata dello 0 2
26. dn i 1 Xe a af se F 7 i pi STE b A EED A r Figura 1 15 Confronto tra osso fisiologico sinistra ed osteoporotico destra si osservi la notevole differenza in termini di interconnessioni e densit ossea Bono et al 2003 1 1 5 2 Effetti dell osteoporosi sull osso corticale La struttura delle ossa lunghe costituita principalmente da osso compatto o corticale la diminuzione di massa determina una minor resistenza della struttura a carichi di flessione e torsione con diminuzione dello sforzo a rottura fortunatamente le ossa lunghe presentano un meccanismo compensatorio per controbilanciare gli effetti meccanici della diminuzione di massa ossea con 15 Capitolo 1 l avanzare dell et infatti si assiste ad un progressivo riassorbimento dell endostio e ad una nuova apposizione di periostio con incremento nel diametro della struttura la resistenza delle ossa lunghe a fenomeni di flessione e torsione garantita proprio dai valori di momento di inerzia superficiale e momento di inerzia polare rispettivamente Questo aspetto caratteristico delle ossa lunghe non si riscontra nelle vertebre in cui la percentuale di osso corticale molto ridotta e rappresenta una delle principali motivazioni per cui fratture a livello vertebrale costituiscano la porzione pi rilevante dei cedimenti ossei in pazienti senescenti 1 1 5 3 Terapie farmacologiche per il trattamento dell osteoporosi Numerose ter
27. ed il graduale ripristino di un profilo di velocit parabolico in corrispondenza del tratto di uscita TRI Figura 2 27 Mappa colorimetrica di velocit m s relativa al mixer utilizzato per lo spillamento del livello di concentrazione 0 1 1 00e 00 5 00e 01 0 00e 00 103 Capitolo 2 Simulazioni numeriche della rete di distribuzione del mezzo di coltura L analisi dell unit strutturale legata al processo di spillamento della concentrazione 0 01 posta nella porzione pi a valle del circuito stata realizzata impostando in ingresso una condizione di portata pari a 3 2 8 Q in uscita al condotto di spillamento una portata pari a 0 99 4 Q ed in prossimit del pozzetto di recupero del medium una condizione di pressione nulla Le simulazioni sono state effettuate con una griglia di calcolo composta da 1815000 elementi esaedrici ed utilizzando una condizione di simmetria I calcoli effettuati analiticamente sono stati confermati dalle simulazioni sebbene sia stato necessario ridurre l ampiezza del microcanale di scarto a 245 um per poter equilibrare in modo ottimale le cadute di pressione presenti nei due rami risultate di 3493 Pa nel punto di biforcazione come evidenziato dalla mappa colorimetrica in figura 2 28 la differenza registrata in termini di perdite di carico nelle due diramazioni a partire dal punto di spillamento risultata dello 0 85 3 83e 03 1 90e 03 0 00e 00 Figura 2 28 Mappa colorimetrica
28. esaedrici con imposizione di una condizione di simmetria per ridurre la pesantezza computazionale della simulazione Nelle immagini sottostanti figure 2 23 e 2 24 vengono riportate le mappe colorimetriche relative all andamento delle pressioni e delle velocit nei microcanali la caduta di pressione complessiva di circa 220 225 Pa mentre la massima velocit registrata risulta di 0 458 m s all interno del condotto con ampiezza 130 um particolare in figura 2 23 infine possibile notare il parziale recupero di pressione presente in corrispondenza dei bruschi allargamenti del sistema La perdita di carico risulta leggermente inferiore rispetto a quanto previsto dal modello analitico e la ripartizione delle portate pressoch ottimale salvo correzioni nei punti di restringimento allargamento dei condotti dove stato necessario operare piccole modifiche In tabella 2 3 sono indicati 1 valori di portata rilevati in corrispondenza delle nove uscite del sistema considerando la numerazione progressiva dei microcanali da sinistra verso destra la massima differenza nei valori di portata presente tra le uscite numero 6 e 9 e risulta pari allo 0 86 3 38e 02 1 64e 02 1 70e 01 4 58e 01 2 34e 01 0 00e 00 Figura 2 23 Mappa colorimetrica di pressione Pa sopra e di velocit m s sotto del blocco di distribuzione centrale pozzetti 4 5 6 100 Capitolo 2 3 38e 02 1 64e 02 1 70e 01 Figura 2 24 Mappa colorim
29. idrofobiche l elevata energia superficiale del PDMS ossidato comporta una superiore capacit di interagire con liquidi polari rispetto al materiale non trattato e di conseguenza una maggior facilit di riempimento con acqua o soluzioni acquose come un medium per colture cellulari La formazione di bolle d acqua infine limitata rispetto alla condizione di pareti idrofobiche in cui si assiste al frequente distacco di filetti fluidi dalla superficie con generazione di microbolle Come osservato da Morra et al 1990 la creazione di una superficie idrofilica non permanente langolo di contatto relativo all acqua subisce una alterazione da 30 a 79 in un intervallo temporale di 15 minuti se il campione lasciato in atmosfera libera mentre dopo 45 minuti esso 70 Capitolo 1 ritorna pressoch identico al valore caratteristico del PDMS non trattato langolo di contatto risulta stabile nel caso in cui 11 PDMS ossidato venga posto all interno di una soluzione acquosa immediatamente dopo il trattamento 71 Capitolo 2 Capitolo 2 Progettazione di un dispositivo microfluidico per la generazione di diverse concentrazioni di farmaco 72 Capitolo 2 2 1 Introduzione Oggetto del presente lavoro la progettazione di un innovativo dispositivo microfluidico di mescolamento e distribuzione di specie chimiche tale da garantire l esposizione di una coltura cellulare a differenti valori di concentrazione Questo sistem
30. in cui il nutrimento delle cellule avviene per diffusione attraverso 43 Capitolo 1 gli spazi interstiziali in condizioni di ridotto shear stress a livello teorico tale processo descritto in modo dettagliato dal modello di Krogh Come mostrato nell immagine in figura 1 43 l anello a C costituito da un microcanale largo 20 um e profondo 2 um con un apertura di 50 um per consentire il caricamento delle cellule 11 canale esterno caratterizzato da una larghezza di 50 um e da un analogo valore di profondit Figura 1 43 Microscopia a scansione elettronica della singola camera di coltura la barra presente nel margine inferiore indica 100 um sopra sezione trasversale della camera di coltura sotto Lee et al 2006 Il sistema stato modellizzato mediante una rete resistiva utilizzando la relazione di Poiseuille des pel AP 0 R R w h 1 3 in cui AP rappresenta la caduta di pressione ai capi del condotto Q la portata volumetrica R la resistenza fluidodinamica u la viscosit del fluido 1 la lunghezza del microcanale w la larghezza ed h la profondit Lee e colleghi hanno dimostrato come la velocit media fosse nella zona di coltura circa 250 volte inferiore rispetto al valore rilevato nel microcanale esterno di alimentazione figura 1 44 44 Capitolo I Figura 1 44 Equivalente elettrico della camera di coltura in cui Ro rappresenta la resistenza dei canali di ingresso e uscita Rc
31. leggi di Fick sono equazioni di diffusione differenziali alle derivate parziali non lineari che descrivono le variazioni di densit e concentrazione nei materiali in cui sono in atto fenomeni di diffusione Prima legge di Fick L equazione differenziale alla base della descrizione dei fenomeni diffusivi la seguente J _p A3 T in cui J rappresenta il flusso lungo la direzione x la concentrazione della specie chimica D la diffusivit o coefficiente di diffusione dipendente strettamente dal soluto dal solvente e dalla temperatura di esercizio il segno negativo giustificato dal fatto che il flusso diretto da una concentrazione pi alta ad una inferiore L espressione della legge precedente per la descrizione di fenomeni in due o tre dimensioni richiede l utilizzo dell operatore V gradiente che generalizza la prima derivata si ottiene cos la seguente relazione J DV Seconda legge di Fick La seconda legge di Fick rappresenta un equazione di conservazione della massa in forma differenziale espressa come segue d Pg eS S A5 Ot dr Appendice in cui e Q rappresenta la concentrazione della specie molm gt e indica il tempo di osservazione del fenomeno s e D rappresenta il coefficiente di diffusione m s La variazione di concentrazione funzione del tempo e dello spazio nella forma precedente la legge esprime la variazione della concentrazione nella sola direzione x
32. non stato possibile rispettare le specifiche di progetto si stabilito di utilizzare un differente approccio per la progettazione del dispositivo Ac ay 0 oS a O y de fox x 00 y 0 y xk 4 AN WA L lt lt v 1 x 0 se 2 SIn Nar 4 2n n c x y ccos nay jexp x a IT n n Pe N Pe 4n 7 n 1 2 3 Figura D Modello analitico utilizzato per il calcolo dei profili di concentrazione del farmaco Wu et al 2005 IV Sommario DRUG INLET MEDIUM INLET Figura E Rappresentazione schematica del dispositivo microfluidico In figura E mostrato uno schema della soluzione adottata Le concentrazioni di farmaco desiderate 0 0 01 0 1 0 5 ed 1 sono ottenute attraverso la miscelazione di portate proporzionali di farmaco e mezzo di coltura Il dispositivo finale prevede due differenti reti per l erogazione del farmaco e del mezzo di coltura mediante una pompa a siringa I condotti principali sono disposti sulla circonferenza del dispositivo mentre canali di spillamento opportunamente dimensionati consentono l estrazione di portate proporzionali di fluido che si misc
33. obliquo rispetto all asse maggiore dell osso dette canali di Volkmann in grado di porre in comunicazione differenti sistemi haversiani figura 1 4 Figura 1 4 Connessione tra sistemi haversiani garantita da un canale di Volkmann Migliavacca Dispense del corso di Biomeccanica 2008 Capitolo 1 Una sezione trasversale di osso compatto come quella mostrata in figura 1 5 evidenzia la presenza di tre differenti sistemi di lamelle il sistema concentrico osteone 11 sistema delle lamelle interstiziali ed il sistema delle lamelle circonferenziali o limitanti interne ed esterne osteone Lamelle interstiziali Figura 1 5 Sezione trasversale di osso compatto e sistemi di lamelle in esso presenti Migliavacca Dispense del corso di Biomeccanica 2008 Le lamelle interstiziali colmano gli spazi presenti tra gli osteoni mentre le lamelle circonferenziali sono localizzate sulla superficie interna ed esterna dello spessore della diafisi delle ossa lunghe con andamento concentrico rispetto all asse maggiore della struttura ossea Il tessuto spugnoso figura 1 6 costituisce la maggior parte delle ossa brevi delle epifisi delle ossa lunghe e della parte interna delle ossa piatte costituito da trabecole diversamente orientate nei vari segmenti scheletrici in funzione delle sollecitazioni meccaniche a cui questi sono sottoposti le trabecole sono costituite dall associazione di strati lamellari e risultano variamente ana
34. osteone sono disposte concentricamente al canale di Havers e l andamento delle fibre di collagene di una lamella ortogonale o quasi a quello della lamella vicina nell ambito di ogni singola lamella le fibre di collagene risultano parallele e come visibile in figura 1 2 la lamella pi profonda quella di pi recente deposizione Figura 1 2 Sistema concentrico di Havers o osteone sinistra e struttura dell osso lamellare con disposizione delle fibre di collagene destra Migliavacca Dispense del corso di Biomeccanica 2008 Capitolo 1 DS e Nella struttura ossea possibile osservare la presenza di lacune contenenti osteociti da cui si dipartono canalicoli ramificati ed anastomizzati in cui sono presenti 1 prolungamenti citoplasmatici delle cellule in grado di garantire collegamento e comunicazione I canalicoli che s1 dipartono dalle lamelle pi profonde si aprono generalmente ad imbuto nel canale di Havers il sistema delle lacune a canalicoli ampiamente intercomunicante ed in stretto rapporto anche con 1 vasi sanguigni che decorrono nel canale di Havers assicurando un costante scambio metabolico per tutti gli osteociti Figura 1 3 Sezione istologica di osso corticale Redaelli e Montevecchi Biomeccanica Analisi multiscala di tessuti biologici Un aspetto particolarmente interessante dell architettura dell osso compatto figura 1 3 rappresentato dalla presenza di cavit con decorso trasversale od
35. osteoporosi e le sue complicazioni determinano un sensibile peggioramento nella qualit della vita dei soggetti colpiti Recenti avanzamenti nel campo farmacologico e chirurgico aprono nuove interessanti prospettive per il trattamento dei pazienti e l utilizzo di dispositivi microfluidici che consentano di ottenere concentrazioni di farmaco altamente controllate potr apportare significativi benefici nello studio degli effetti che nuove terapie avranno sulle cellule del tessuto osseo 19 Capitolo 1 1 2 Le origini e il futuro della microfluidica La microfluidica la scienza e tecnologia di sistemi che processano e manipolano ridotte quantit di fluidi da 10 a 1078 litri attraverso canali con dimensioni di centinaia di micrometri Le prime applicazioni delle tecnologie microfluidiche si sono concentrate nel campo della microanalisi grazie alla possibilit di utilizzare ridottissime quantit di campioni e reagenti di separare e individuare molecole con elevata risoluzione e sensitivit di controllare nello spazio e nel tempo la concentrazione di determinate specie chimiche e di ottenere risultati significativi in tempi brevi con costi limitati Whitesides 2006 Le origini della microfluidica risiedono in metodi microanalitici come cromatografia a fase gassosa cromatografia liquida ad alta pressione ed elettroforesi capillare che rivoluzionarono il settore delle analisi chimiche A seguito dell enorme successo riscontrato da tal
36. parametro in grado di influenzare la ripartizione dei flussi rappresentato dal numero di fori realizzati all aumentare di questo valore oltre un limite critico dipendente dalla geometria del dispositivo si assiste infatti progressivamente ad una ripartizione non equilibrata delle portate Il tratto compreso tra due fori consecutivi sembra avere un effetto di stabilizzazione e l aumento del numero di fori realizzati determina una sensibile diminuzione di tale fenomeno con effetti non trascurabili sulla distribuzione del fluido Il progetto iniziale prevedeva fori con dimensione caratteristica 10 um ma le simulazioni numeriche eseguite come mostrato nel paragrafo 2 5 4 hanno evidenziato migliori risultati in presenza di un sistema di distribuzione composto da fori di 5 um Da sottolineare infine come inizialmente fossero stati progettati dei fori quadrati mentre in seguito si sia optato per fori con dimensione 5 um x 500 um che garantiscono perdite di carico notevolmente inferiori e rispettano 1 vincoli costruttivi imposti dal processo di microfabbricazione condotto presso la fondazione FBK Figura 2 21 Sistema di distribuzione del fluido ai pozzetti di coltura 2 5 Simulazioni numeriche dei componenti del sistema 2 5 1 Generazione della griglia di calcolo e condizioni al contorno del problema La progettazione del circuito eseguita mediante calcoli analitici stata accompagnata come gi anticipato da simulazioni computazionali 3D
37. questi substrati figura 3 16 Saos 2 96h on Plastic 100x 160x Figura 3 15 Immagini ottenute con microscopia ottica relative a cellule SAOS 2 coltivate per 96 ore su polistirene controllo Porous PDM silaniz par eo ol NE ARE ae ry E i bs Fi A 24h 8 48h 96h Figura 3 16 Immagini ottenute con microscopia ottica ingrandimento 100x relative a cellule SAOS 2 coltivate per 24 48 e 96 ore su polistirene per colture cellulari TCPS COC PDMS poroso PDMS PDMS silanizzato e PDMS CNTs 123 Capitolo 3 Il dispositivo verr realizzato attraverso l applicazione di tecniche fotolitografiche con deposizione di fotoresist negativo SU 8 materiale polimerico basato su resine epossidiche chimicamente resistente in grado di consentire la generazione di multistrati e di microcanali caratterizzati da un rapporto altezza larghezza aspect ratio fino a 10 1 La maschera progettata verr esposta alla sorgente luminosa consentendo la generazione della microstrutturazione in SU 8 in seguito il processo di microfabbricazione proceder con l applicazione della tecnica di replica molding per la generazione della struttura in PDMS paragrafo 1 3 2 I test sperimentali eseguiti sui sistemi di distribuzione ai pozzetti di coltura hanno evidenziato il corretto funzionamento del dispositivo trattato nel capitolo 2 basato su 36 fori sebbene una valutazione quantitativa non sia stata possibile a causa dell o
38. this reason little corrections in the dimensions of the ducts in comparison with the initial calculations were necessary Figure G Complete design of the microfluidic device realized on a circular platform with a diameter of 9 cm XIX Summary In table A and B are reported the dimensions of the microchannels of the distribution network of the drug extraction microchannel is referred to the ducts which depart from the mean circuit to reach the cell culture wells In table C the characteristic dimensions of the micromixers are reported Computational simulations on the micromixers highlighted a complete mixing at the outlets Length mm Width um Concentration level 0 01 Extraction microchannel S72 200 Distribution microchannel 45 8 430 Concentration level 0 1 Extraction microchannel 42 9 100 Distribution microchannel 21 9 250 Concentration level 0 5 Extraction microchannel 40 1 150 Distribution microchannel 22 4 400 Concentration level I Extraction microchannel 8 3 100 Distribution microchannel 62 1 800 Table A Analytical calculations for the design of the delivery network of the drug Length mm Width um Concentration level 0 01 Extraction microchannel 37 200 Distribution microchannel 45 437 Concentration level 0 1 Extraction microchannel 42 100 Distribution microchannel 21 211 Concentration level 0 5 Extraction microchannel 33 5 6 5 150 200 Distribution microchannel 14 7 400 350 C
39. tuttavia modificata la rigidezza del materiale Da sottolineare infine come numerosi solventi organici siano solubili nel polimero portando ad un effetto di rigonfiamento Figura 1 65 Dispositivi microfluidici realizzati in PDMS Elasticit Il PDMS caratterizzato da propriet elastomeriche simili a quelle della gomma naturale vulcanizzata sottoposto ad uno sforzo di trazione monoassiale esso in grado di deformarsi notevolmente per poi recuperare velocemente dopo la rimozione del carico L elasticita del PDMS di natura entropica durante l applicazione dello sforzo le macromolecole polimeriche si orientano nella direzione della deformazione determinando uno sbilanciamento energetico vedi energia libera di Gibbs di natura entropica delta S negativo minor disordine entropico solo in presenza di elevate deformazioni cui il provino sottoposto si assiste ad un fenomeno di elasticit entalpica dovuto alla rottura di legami chimici e allo spostamento degli atomi dalle relative posizioni di equilibrio in genere tale effetto non riscontrabile a causa della preventiva rottura del materiale per la presenza di difetti Maggiore il contenuto di agente reticolante e minore sar l elasticit del polimero la propriet di elasticit particolarmente importante in applicazioni in cui 11 materiale dovrebbe essere sottoposto a flessioni o torsioni nelle applicazioni microfluidiche le pareti dei 64 Capitolo 1
40. valore di 0 0141 calcolato dalle simulazioni numeriche le prove sperimentali hanno inoltre evidenziato una concentrazione media di 0 6019 e di 0 9303 rispettivamente nel condotto centrale e nel canale di scarto laddove le simulazioni computazionali hanno invece mostrato valori di 0 3304 e 0 9012 Si sottolinea come il sistema analizzato sia fortemente influenzato dal coefficiente di diffusione della specie chimica considerata dalle portate impostate e da difetti di micro fabbricazione un dispositivo basato unicamente su processi diffusivi per l ottenimento delle concentrazioni desiderate risulta pertanto inaffidabile come mostrato dalle simulazioni eseguite e dai test sperimentali svolti 60 50 40 Intensit di fl NO O oO 200 400 600 Ampiezza microcanale Pixel 70 60 50 40 30 20 10 0 0 200 400 600 Ampiezza microcanale Pixel Intensit di fluorescenza Figura 3 9 Profilo di concentrazione della rodamina in corrispondenza dell ingresso del sistema sopra e del punto di spillamento sotto dati filtrati mediante media mobile 118 Capitolo 3 3 6 Calcolo del coefficiente di diffusione dello stronzio cloruro N Il dispositivo microfluidico progettato nel presente lavoro di tesi pensato per la valutazione dell efficacia terapeutica dello stronzio cloruro nel trattamento dell osteoporosi in soluzione acquosa il sale si disso
41. wafer priming lt resist 2 spin coating wafer prebake UV light eel Mask 3 exposure post exp pakel water 4 development postbake Figura 1 58 Principio generale delle tecniche litografiche basate su un approccio parallelo Sordan Dispense del corso di Micro Nano Fabbricazione 2009 Le tecnologie litografiche appartengono alla famiglia delle tecniche di fabbricazione top down in cui a partire da un materiale massivo si procede alla realizzazione del dispositivo attraverso la progressiva rimozione di materia alcune tipologie di litografia quali litografia ottica fotolitografia litografia a raggi X utilizzano un approccio parallelo in cui attraverso la progettazione di 56 Capitolo I opportune maschere possibile ottenere almeno a livello teorico infinite copie del prodotto desiderato figura 1 58 litografie a fascio elettronico sono basate su un approccio seriale senza interposizione di maschere tra la sorgente di energia ed il substrato da modificare Sistemi per litografia ottica convenzionale e fotolitografia litografia UV si basano su una sorgente luminosa in genere laser ArF 193 nm un collimatore una fotomaschera un sistema ottico ed un fotoresist depositato su un wafer di silicio 11 processo litografico si basa in estrema sintesi sulla capacit del fotoresist di conservare una replica della fotomaschera che potr essere utilizzata per successivi passaggi tra cul
42. wet dry etching oppure evaporazione Esistono due diverse tipologie di fotoresist positivo e negativo il resist positivo viene esposto alla sorgente luminosa raggi ultravioletti nel caso della fotolitografia in corrispondenza dei punti in cui il materiale sottostante deve essere rimosso in tali resist l esposizione alla luce ultravioletta determina una modifica della struttura chimica del materiale che diviene maggiormente solubile nell agente di sviluppo che verr utilizzato il resist esposto viene successivamente lavato attraverso la soluzione di sviluppo quindi la maschera contiene una copia esatta del pattern che dovr essere trasferito sul substrato Resist negativi sono caratterizzati da un comportamento opposto in cui l esposizione alla sorgente luminosa determina la formazione di legami chimici che rendono tali materiali difficoltosi da sciogliere attraverso l agente di sviluppo le maschere utilizzate con resist negativi contengono l inverso o negativo del modello che dovr essere trasferito sul wafer Il metodo di deposizione dei fotoresist pi utilizzato rappresentato dal processo di spin coating figura 1 59 in cui il substrato da rivestire viene posto in rotazione con velocit 5000 rotazioni min per 60 secondi e la soluzione polimerica che costituir il rivestimento viene distribuita in modo omogeneo rapido e semplice lo spessore del resist determinato dalla viscosit del materiale e dalla velocit dello spinner co
43. 0 um L utilizzo di tecniche di rapid prototyping consente di ottenere una serie di vantaggi rispetto alle tecniche di fabbricazione tradizionali le maschere stampate da una stampante 68 Capitolo 1 ad alta risoluzione sono prodotte in tempi inferiori ore invece di giorni o settimane e risultano sensibilmente meno costose rispetto alle classiche maschere in cromo 20 contro 500 1500 la lavorazione del fotoresist sulla superficie del master per la generazione della microstrutturazione risulta pi semplice e flessibile rispetto ai processi standard di lavorazione che implicano l ablazione o etching del silicio in particolare il trattamento convenzionale dei master in silicio rende difficoltosa la creazione di canali di orientazione arbitraria o ancora di reservoir circolari a causa dei diversi piani cristallografici presenti 1 3 4 2 Replica molding del master Sulla superficie del master strutturato sono posizionate quattro colonne in vetro di silice per la definizione dei reservoir figura 1 68B in seguito 11 PDMS preparato miscelando prepolimero ed agente di reticolazione colato sulla superficie del substrato allo scopo di replicare la rete di micro canali realizzata l angolo tra fotoresist e silicio prossimo a 90 consente la generazione di condotti con sezione rettangolare le cui pareti come mostrato nell immagine ottenuta mediante microscopia a scansione elettronica presentano una microrugosit superficiale
44. 03 h 210um Q 0 3 ul min 0 0106 0 0534 Tabella D Deviazione standard sulla concentrazione di rodamina in uscita ai mixer confronto sperimentale computazionale X Sommario Infine prove sperimentali eseguite mediante un saggio colorimetrico per la detezione dei cloruri hanno permesso di identificare il coefficiente di diffusione dello stronzio cloruro quantificandolo in Q 2 i parc a circa 3x10 m s Le simulazioni numeriche sono state eseguite considerando un valore di 10 2 edi 5 x 10 ms con lo scopo di garantire un certo margine di sicurezza al processo di miscelamento nei micromixer Il sistema di erogazione alle cellule del fluido analizzato al calcolatore ha evidenziato una portata 5 i ia 10 3 bies volumetrica media attraverso ognuno dei 36 fori di 1 5431x10 m s con una deviazione standard di 0 0225x10 m s ad indicare una omogenea distribuzione all interno della camera di coltura Conclusioni La progettazione di un dispositivo in grado di generare diverse concentrazioni di farmaco inizialmente impostata su un meccanismo di spillamenti successivi stata indirizzata verso un sistema basato sulla miscelazione di portate proporzionali di mezzo di coltura e farmaco in grado di generare le concentrazioni di stronzio ranelato stabilite I risultati raccolti dalle numerose simulazioni effettuate hanno mostrato come un progetto basato su spillamenti successivi sia incompatibile con le specifi
45. 1 N 2 1 A 2 1 A 2 1 17 N 2 1 C firnl i max C finl 1 N 2 1 1 j end Calcolo della soluzione for k 1 M for z 1 N 2 1 1 Ak k 2 AkX k 2 t sgrt 2 k pa F C_Finl z C tint gl sink pi z7 Ni 2 1 r end end for k 1 M QUT2 0U0T2 tsqrt 2 AK k 2 Cos k pi y2 exp DAKO OI 2x27 PS 2 1 eeget Pe 271 274 kop 2 j end OUT2 OUT2 A 2 1 Matrice della concentrazione lungo A2 C_fin2 0UT2 length x2 Concentrazioni spillamento 2 media_2 mean 0UT2 Cm 2 1 mean 0UT2 1 N 2 1 1 length x2 Vettore della media delle sconcentrazioni sulla larghezza di microcanale che continua il miscelamento Cs 2 1 mean 0UT2 N 2 1 1 1 128 length x2 Vettore della media delle S6concentrazioni sulla larghezza di microcanale che viene spillata surf 0UT2 Visualizzazione del profilo di concentrazione nel microcanale di Smiscelamento 2 fino al punto di spillamento LOG lt Calcolo 3 1 LO Definizione della costante A for i l N 3 1 ct A 3 1 A 3 1 L N 3 1 C fin2 i t max C_fin2 1 N 3 L 1 j end Calcolo della soluzione for k 1 M tor zl N 5 L 1 148 Appendice Ak k 5 Ak k 3 sqgre 2 k pi C fin2 z C_ fin2 z 1l 3 sin k pi z N 3 1 j end end for k 1 M QOUT3 OUT34 sqrt 2 FAk k 3 cos k p1l y3 exp DEKE DAO eso Pe gt a 1 tsart Pe 3 I ora tk 22 J J end OUT3 OUT3 A 3 1 Matrice della con
46. 1 1 Sezione di tessuto osseo compatto colorata chimicamente che mostra l organizzazione lamellare concentrica degli osteoni Redaelli e Montevecchi Biomeccanica Analisi multiscala di tessuti biologici z Capitolo I 1 1 1 Struttura e composizione Il tessuto osseo costituito da una componente cellulare osteoblasti osteociti osteoclasti e da matrice extracellulare ECM quest ultima composta per il 30 da un impalcatura di fibrille proteiche di collagene di tipo I amminoacidi glicina prolina idrossiprolina lisina idrossilisina che conferiscono elasticit e flessibilit e da una abbondante componente minerale 70 costituita prevalentemente da cristalli aghiformi di idrossiapatite Cajo PO 4 6 OH 2 con lunghezza compresa tra 20 e 40 nm piccole percentuali di carbonato apatite e fluoro apatite in grado di apportare durezza e rigidezza La componente non minerale dell osso costituita per il 90 in massa da collagene e per il restante 10 da proteoglicani acido ialuronico glicoproteine e acqua la componente proteica differenziata in osteonectina in grado di ancorare le fibre di collagene ai minerali dell osso fosfatasi alcalina necessaria per la sintesi di ECM fibronectina osteopontina fondamentali per 1 processi di adesione cellulare ed osteocalcina generazione di legami con il calcio Le ossa presenti nel corpo umano possono essere classificate in quattro gruppi distinti e Ossa lunghe arti sup
47. 200 um wide 50 or 210 um deep and 3 mm long were tested The main ducts of the micromixers have two inlets through which are introduced deionized water and rhodamine WT supplied by a syringe pump The tests were conducted with two different flow rates of 0 3 ul min and 3 ul min The results were obtained and analyzed in terms of standard deviation of the concentration of rhodamine at the microchannel outlet Finally an experimental test with a colorimetric assay was performed to evaluate the diffusion coefficient of strontium chloride which is the active principle of strontium ranelate XVIII Summary Results and discussion The designed device includes a microchannels network for the delivery of medium and drug three micromixers for the mixing system and 45 cell culture wells each one characterized by 36 holes 5 um wide 500 um high and 40 um deep to allow an homogeneous distribution of the fluid to the cells A flow rate Q 2x10 m s was set to grant a quick filling of each well the estimated time to reach the volume of 200 ul is about 36 seconds Figure G shows a scheme of the microfluidic platform in which the arrangement of the whole device is visible The results of the numerical simulations highlight that the pressure drops are generally slightly different in comparison with the ones predicted by the analytical model especially in the points of narrowing enlargement of the microchannels or in the areas where bifurcations occur for
48. 4 1 1 s 4 1 1 end Calcolo della soluzione for k 1 M for z 1 N 4 1 1 Ak k 4 Ak k 4 sqrt 2 k pi OUT3 z s 4 1 1 OUT3 z 1 s 4 n ly sim k pi ZN 1 end end for k 1 M OUT4 OUT4 sqrt 2 Ak k 2 Cos k p1 y4d exp 2 k 2 pi 2 x4 Pel 4 1 sqrt Pe 4 1 244 k 2 p1 2 end OUT4 OUT4 A 4 1 Matrice della concentrazione lungo A4 media_S4 mean OUT4 Media delle concentrazioni nella zona di spillamento ultimo canale for j l length x4 if s 4 1 if media_S4 1 gt C 4 1 0 01 C 4 1 amp media_S4 1 j lt C 4 1 0 01 C 4 1 Scelta di un intorno del livello di Sconcentrazione ai end end end if s 4 1 1 s 4 1 100 end C_fin4 0UT4 s 4 1 Concentrazioni spillamento 4 snold on ssur f 0UT4 1 s 4 1 Visualizzazione del profilo di concentrazione nel microcanale di miscelamento 4 fino al punto di spillamento toc Lo for p 1 2 l p 1 sL p 1 s p 1 L g T p 1 Calcolo lunghezza microcanale di Smiscelazione m end toc 146 Appendice Modello analitico utilizzato per il calcolo del profilo di concentrazione in un microcanale dotato di spillamenti successivi Capitolo 2 paragraro 2 3 0 oO oO Bibliografia Gorman et al 2008 Wu et al 2005 oO oO Parametri definiti dall utente D le 10 Coefficiente di diffusione m 2 s Z 3 Livelli di concentrazione richiesti in uscita numero di colture ce
49. 99 4 na 0 01 4 Concentrazione 0 01 elica anca Concentrazione 0 01 a 0 4 1 22 8 O 4 78 8 O Figura 2 12 Equivalente elettrico del circuito 2 4 3 Perdite di carico L analisi del sistema stata condotta valutando le perdite di carico distribuite e concentrate le prime sono state calcolate mediante la relazione di Poiseuille adattata per condotti a sezione rettangolare in condizioni di moto laminare e profilo sviluppato di velocit 12 10 40 3 AP Q0 R R 2 5 dove Q rappresenta la portata R la resistenza fluidodinamica del circuito u la viscosit del fluido considerato W la larghezza del condotto h la profondit ed I la lunghezza 87 Capitolo 2 Le perdite di carico concentrate sono state calcolate in corrispondenza di bruschi allargamenti o restringimenti dei microcanali oltre che nei punti di biforcazione o confluenza la relazione utilizzata basata su un legame quadratico tra caduta di pressione e portata viene di seguito riportata AP 4 pv 2 6 dove p rappresenta la densit del fluido V la velocit e il fattore di resistenza Il parametro stato assunto pari ad 1 in presenza di bruschi allargamenti e a 0 5 in corrispondenza di repentini restringimenti dei condotti nei punti di biforcazione assume valore 0 2 per il microcanale che prosegue con la medesima direzione del condotto a monte ed 1 per la linea che subisce un cambio di direzione viceversa in caso di confluenze 11 fat
50. CyQuant 2 esperimenti Proliferation timecourse 20000 T plastic 40000 m POV ai o POVS CNT CE o POMS porous 20000 m POMS silanized 10000 m COC o E epoxy resin time Figura 3 13 Test di proliferazione cellulare eseguiti a differenti time point Il test di vitalit un esperimento effettuato mostra risultati particolarmente interessanti sin dalle 24 ore immediatamente successive alla semina la vitalit delle cellule disposte su resina epossidica marcatamente ridotta rispetto a quella delle stesse cellule seminate sugli altri substrati mantenendosi tale fino alle 96 ore I due substrati sui quali le cellule sembrano essere pi vitali sono il COC ed il PDMS poroso probabilmente perch maggiormente idrofilici figura 3 14 Vitalit Alamar blue 1 esperimento Viability timecourse 200000 B plastic 150000 m POV z O POMS ONT SE 400000 o POMS porous G PM silanized 50000 m OC E epoxy resin 0 1 time Figura 3 14 Test di vitalit cellulare eseguiti mediante Alamar Blue 122 Capitolo 3 L analisi morfologica evidenzia come le cellule seminate su COC e PDMS poroso presentino un aspetto simile a quello dei campioni seminati su plastica polistirenica comunemente utilizzata per colture cellulari Prove di coltura su PDMS PDMS CNT e PDMS silanizzato evidenziano come le cellule sembrino raggrupparsi in cluster probabilmente per la maggior idrofobicit di
51. Figure D Analytical model for the evaluation of the concentration profiles of the drug Wu et al 2005 XV Summary DRUG INLET MEDIUM INLET eee i a Figure E Sketch of the microfluidic device In figure E the sketch of the ultimate solution is shown The desired concentrations of drug 0 0 01 0 1 0 5 and 1 are obtained through the mixing of proportional flows of medium and drug The final device is based on two different networks for the distribution of drug and medium using a syringe pump The main channels are located on the circumference of the device while the extraction channels adequately designed make possible the drawing of proportional flows of fluid which will mix at the intersection points To insure the complete mixing of the two fluids a micromixer was put downstream from every intersection point Concentration levels 0 and 1 are extracted immediately downstream from the inlets The distribution of the microchannels responds to functionality and to a precise logic criterion and considers the limited available spaces because of the compactness of the device The general principle considered during the planning was
52. Kim C Lee K Kim JH Shin KS Lee KJ Kim TS Kang JY A serial dilution microfluidic device using a ladder network generating logarithmic or linear concentrations Lab Chip 2008 8 473 479 Kuswandia B Nuriman Huskens J Verboom W Optical sensing systems for microfluidic devices a review Analytica Chimica Acta 2007 601 141 155 Leclerc E David B Griscom L Lepioufle B Fujii T Layrolle P Legallaisa C Study of osteoblastic cells in a microfluidic environment Biomaterials 2006 27 586 595 Lee PJ Hung PJ Rao VM Lee LP Nanoliter scale microbioreactor array for quantitative cell biology Biotechnol Bioeng 2006 94 6 14 Lee K Kim C Ahn B Panchapakesan R Full AR Nordee L Kang JY Oh KW Generalized serial dilution module for monotonic and arbitrary microfluidic gradient generators Lab Chip 2009 9 709 717 Li CW Yang J Yang M Dose dependent cell based assays in V shaped microfluidic channels Lab Chip 2006 6 921 929 Li CW Chen R Yang M Generation of linear and non linear concentration gradients along microfluidic channel by microtunnel controlled stepwise addition of sample solution Lab Chip 2007 7 10 1371 1373 Lin F Nguyen CMC Wang SJ Saadi W Gross SP Jeon NL Effective neutrophil chemotaxis is strongly influenced by mean IL 8 concentration Biochemical and Biophysical Research 2004 319 576 581 Lin F Saadi W Rhee SW Wang SJ Mittal S Jeon NL Generation of dynamic tem
53. LE dia IR 3 La n i J a PA i Si y ii f f i hs di pi ra 4 gi wad 2 fi 4 f e t UE I Par si A i am ni 4 T a i 7 i i PESES 4 L a Fa CA dg iv Te a e ic lt p v IRN 4 j d pae duc ie hi Sai tt si ita Pie T a af o l ra Ea si N ri i gt a Ci a i 2 P Di anm LB ya Figure B Comparison between physiological left and pathological right bone it is possible to observe the great difference in terms of interconnections and bone density Bono et al 2003 XII Summary The aim of the work The goal of this work is the design of an innovative microfluidic system that allows to evaluate the efficacy of an anti osteoporotic drug on cellular populations Particularly the aim is the possibility to connect the concentration of the drug with the effects on the cellular metabolism The device is based on the exposure of cellular cultures to five different concentration levels of the drug strontium ranelate through a microfluidic network for the distribution of the fluids to the cells The project was developed in cooperation with the laboratory of cell culture and molecular biology of the Istituto Ortopedico Galeazzi located in Milan and with the Center for Materials and Microsystems of the Fondazione Bruno Kessler FBK located in Trento thanks to the financing of the Fondazione Cassa di Risparmio di Trento e Rovereto Caritro Materials and methods
54. Modello di micromixer utilizzato per l ottenimento della concentrazione 0 01 Le lunghezze dei mixer sono differenti per ognuno dei tre livelli di concentrazione richiesti e 2 514 mm per il mixer deputato all ottenimento della concentrazione 0 01 figura 2 15 e 2426 mm per il mixer utilizzato in corrispondenza del livello di concentrazione 0 1 e 2 946 mm per il mixer destinato al livello di concentrazione 0 5 Come evidente il caso critico rappresentato dalla concentrazione 0 5 che richiede un mixer di lunghezza superiore rispetto agli altri due casi per poter ottenere una distribuzione omogenea di farmaco I calcoli analitici tengono conto della perdita di carico distribuita all interno del micromixer ipotizzando una sezione di passaggio di 100 um x 500 um della caduta di pressione nel tratto di uscita oltre che delle perdite concentrate dovute al brusco restringimento ed al repentino allargamento del condotto Le perdite stimate risultano rispettivamente di 3500 Pa 3400 Pa e 3950 Pa per 1 mixer destinati ai livelli di concentrazione 0 01 0 1 e 0 5 si sottolinea come 1 calcoli effettuati tenendo conto di una sezione di passaggio di soli 100 um x 500 um comportino una sovrastima delle cadute di pressione come risulter evidente dalle simulazioni numeriche in cui 1 dati rilevati risulteranno generalmente inferiori a quanto riportato nel presente paragrafo La valutazione delle perdite di carico nel resto del capitolo terr conto delle si
55. NA Qi JC Tokita A Kelly PJ Crofts L Nguyen TV Sambrook PN Eisman JA Prediction of bone density from vitamin D receptor alleles Nature 1994 367 284 287 Mundy GR Pathogenesis of osteoporosis and challenges for drug delivery Advanced Drug Delivery Reviews 2000 42 165 173 155 Bibliografia O Donnell S Cranney A Wells GA Adachi J Reginster JY Strontium ranelate for preventing and treating postmenopausal osteoporosis Review The Cochrane Library 2008 4 1 49 Paguirigan AL Beebe DJ Microfluidics meet cell biology bridging the gap by validation and application of microscale techniques for cell biological assays BioEssays 2008 30 811 821 Paliwal S Iglesias PA Campbell K Hilioti Z Groisman A Levchenko A MAPK mediated bimodal gene expression and adaptive gradient sensing in yeast Nature 2007 446 7131 46 51 Pihl J Sinclair J Sahlin S Karlsson M Petterson F Olofsson J Orwar O Microfluidic gradient generating device for pharmacological profiling Anal Chem 2005 77 3897 3903 Raffel M Willert C Wereley S Kompenhans J Particle Image Velocimetry A Practical Guide Second Edition Springer Ramsey RS Ramsey JM Generating electrospray from microchip devices using electroosmotic pumping Anal Chem 1997 69 1174 1178 Redaelli Montevecchi Biomeccanica Analisi multiscala di tessuti biologici Patron Editore Saadi W Wang SJ Lin F Jeon NL A parallel gradient microfluidic chamb
56. PIV Particle Image Velocimetry A Practical Guide Numero di componenti del vettore velocit A causa dell illuminazione planare del campo di moto solo due componenti del vettore velocit possono essere identificate mediante la tecnologia PIV standard denominata 2C PIV sono disponibili metodi per l estrazione della terza componente del vettore velocit tra cui la cosiddetta dual plane PIV che consentono di definire la tecnica 3C PIV Si sottolinea infine la possibilit di definire differenti light sheets paralleli all interno di un volume tale tecnica prende il nome di 2 1D PIV in quanto introduce un analisi tridimensionale del campo di moto Risoluzione temporale e spaziale La risoluzione temporale dei sistemi PIV frame rate of recording PIV images non particolarmente elevata sebbene lo sviluppo attuale di laser ad alta velocit di emissione e di sistemi di acquisizione adeguati stia migliorando sensibilmente la situazione La dimensione delle interrogation areas deve essere sufficientemente ridotta per evitare la generazione di errori nei risultati essa determina il numero di vettori velocit indipendenti e quindi la massima risoluzione spaziale della mappa di velocit che pu essere ottenuta una volta fissata la risoluzione spaziale del sensore utilizzato per l acquisizione 139 Appendice Tecnologia PIV e microscala La tecnologia PIV apre nuove prospettive nel campo della fluidodinamica specialmente in presenza
57. POLITECNICO DI MILANO Facolt di Ingegneria dei Sistemi Corso di Laurea Specialistica in Ingegneria Biomedica PROGETTAZIONE DI UN SISTEMA MICROFLUIDICO PER TEST FARMACOLOGICI Relatore Prof Gabriele DUBINI Correlatore Ing Francesca NASON Tesi di Laurea Specialistica di Simone BERSINI Matricola 734617 Anno Accademico 2009 2010 Desidero ringraziare il Professor Gabriele Dubini per il supporto fornito i preziosi suggerimenti e la disponibilit mostrata durante il lavoro di tesi Un sincero ringraziamento alla Professoressa Federica Boschetti per l aiuto fornito durante le prove sperimentali ed al Professor Giancarlo Pennati per gli utili consigli che hanno contribuito al completamento del progetto Un grazie speciale a Francesca per la pazienza disponibilit e competenza mostrate in questi mesi di lavoro e per essere stata un costante punto di riferimento Al miei genitori e a coloro che mi sono stati vicino va il mio grazie pi grande per avermi supportato nei momenti di difficolt Indice Indice ULI PRO I EA I SMI XII ODUCT UV OCI Isis slo XXIII Capitolo I VUOI ARR RR RAIN Neer ee tera rae eet PICENO SRO 1 INIZIO ida E oi 2 1 1 Caratteristiche generali del tessuto 0SS 0 i 2 Dead TS EVI COMP OSIZI ONG eane a e a R 3 Did C U OSS CO ici 7 TOTO ii i rai 9 ded IVI ADOOS nei 11 1 1 5 Malattie metaboliche ossee e tessuto osseo senescente i 13 Willie 19 L Eesori
58. a concentrazione di determinate specie chimiche e di ottenere risultati significativi in tempi brevi con costi limitati Whitesides 2006 La ricerca costante ha portato allo sviluppo di apparecchiature sempre pi compatte e versatili ed ha consentito di individuare nuove potenziali applicazioni nei campi della biochimica e della biologia molecolare e cellulare Un dispositivo microfluidico figura A composto generalmente da una serie di componenti specifici tra cui un sistema per l introduzione di campioni e reagenti per la movimentazione e per l eventuale miscelamento dei fluidi all interno dei microcanali presenti sul chip sensori per analisi chimiche ed eventuali sistemi di purificazione nel caso in cui il sistema sia utilizzato per scopi di sintesi Figura A Dispositivo microfluidico utilizzato per studi su cellule procariote Whitesides 2006 Sommario Lo sviluppo delle tecniche di soft lithography e l utilizzo del polidimetilsilossano PDMS hanno consentito di realizzare numerosi prototipi e di testare nuove soluzioni progettuali e componenti Il PDMS grazie alla trasparenza ottica all elevata permeabilit ai gas e all ottima risposta evidenziata nei test di citotossicit costituisce un materiale adatto per la realizzazione di microcamere in cui coltivare cellule osservarne il comportamento e studiarne il citoscheletro Un interessante campo di ricerca quello rappresentato dallo studio delle malattie metabolic
59. a determinazione dello spostamento tra le due immagini acquisite delle particelle con buona risoluzione e sufficientemente breve tale da evitare che particelle dotate di una componente di velocit fuori dal piano siano in grado di lasciare il cosiddetto light sheet tra le due illuminazioni consecutive Distribuzione delle particelle all interno del fluido Qualitativamente possono essere distinte tre diverse tipologie di immagini di densit come riportato in figura A3 nel caso di immagini a bassa densit possibile identificare singole particelle ed osservare immagini della medesima particella originate da diverse illuminazioni 1 due impulsi questa situazione nota come PTV cio particle tracking velocimetry Nel caso di immagini a media densit ancora possibile localizzare le singole particelle mentre risulta impossibile identificare coppie di immagini dall analisi visiva delle acquisizioni immagini di questo tipo sono richieste per applicare le tecniche statistiche di valutazione PIV Immagini ad alta densit sono 138 Appendice caratterizzate dall impossibilita di detettare singole particelle dal momento che queste si sovrappongono in molti casi originando 1 cosiddetti speckle questa situazione denominata laser speckle velocimetry o LSV mf Li da x pane TARE 5 E ed RoG Figura A3 Immagini a bassa sinistra media centro ed alta destra densit ottenibili mediante sistema
60. a o agarosio sono comunemente utilizzati per la generazione di gradienti di concentrazione molecolari Heit et al 2002 le cellule vengono seminate all interno di comuni pozzetti di coltura in polistirene per poi essere rivestite mediante il gel oppure vengono inserite nella miscela prima della gelificazione la molecola di interesse viene depositata sulla superficie dell idrogelo ed in grado di diffondere gradualmente all interno della matrice polimerica portando alla generazione di un gradiente che evolve nello spazio e nel tempo figura 1 21 Tali sistemi sono molto semplici da realizzare consentono un discreto controllo sulla posizione della sorgente e determinano un ambiente tridimensionale molto simile a quello biologico l assenza di riproducibilit e di controllo sull evoluzione spazio temporale del gradiente di concentrazione e la difficolt di monitorare il comportamento cellulare a causa delle propriet ottiche del gel e dell ambiente tridimensionale rappresentano importanti limiti di tale metodologia 24 Capitolo 1 um Figura 1 21 Tessuto neurale coltivato in un gel di collagene a neutrofili esposti ad un gradiente di concentrazione in un gel di agarosio b variazione del gradiente di concentrazione generato in un idrogelo nello spazio e nel tempo c Keenan et al 2008 Un altro metodo tradizionale per la generazione di gradienti di concentrazione rappresentato dall utilizzo di micropipette ques
61. a risulta essere un valido strumento per individuare il range di concentrazione capace di garantire l efficacia terapeutica di farmaci In particolare l applicazione considerata riguarda l ottimizzazione terapeutica per il trattamento dell osteoporosi con stronzio ranelato Il progetto realizzato in collaborazione con 1l laboratorio di colture cellulari e biologia molecolare dell Istituto Ortopedico Galeazzi di Milano e con il Center for Materials and Microsystems della Fondazione Bruno Kessler FBK di Trento grazie al finanziamenti della Fondazione Cassa di Risparmio di Trento e Rovereto Caritro La progettazione del dispositivo stata condotta presso il Laboratorio di Meccanica delle Strutture Biologiche LaBS del Politecnico di Milano attraverso l utilizzo di modelli analitici e simulazioni numeriche In fase iniziale stata adottata la trattazione a parametri concentrati per modellizzare 1 rami del circuito Simulazioni computazionali eseguite mediante il codice commerciale Fluent Ansys Inc Canonsburg PA USA hanno consentito di ottimizzare le resistenze fluidodinamiche delle differenti porzioni di circuito I ricercatori dell Istituto Ortopedico Galeazzi hanno condotto una campagna di prove di biocompatibilit per la scelta ottimale dei substrati adatti al dispositivo di interesse In particolare stata eseguita la valutazione della proliferazione della vitalit e della morfologia di campioni cellulari di osteosarcoma seminati
62. a specie chimica e dai componenti del mezzo di coltura che possono degradare o sostituire le molecole adsorbite Il metodo proposto da Delamarche et al 1998 utilizza un microcanale dotato di un reservoir ad una delle estremit la soluzione contenente le biomolecole viene inserita nel reservoir per poi essere attirata nel canale vuoto per capillarit o diffondere nel condotto precaricato adsorbendosi alle pareti A causa dell elevato rapporto superficie volume presente il livello di biomolecole adsorbite impoverisce sensibilmente la soluzione iniettata si origina un gradiente di molecole adsorbite con il livello pi alto di concentrazione in corrispondenza del reservoir le caratteristiche del gradiente di concentrazione dipendono unicamente dal coefficiente di diffusione dal materiale con cui il canale realizzato e dall intervallo di tempo destinato alla formazione del profilo di concentrazione Il gradiente creato relativamente stabile anche se risulta estremamente complicato raggiungere 1 livelli di concentrazione desiderati dall utente e si dimostra molto elevato il rischio di denaturazione delle biomolecole utilizzate Figura 1 26 Generazione di un gradiente di concentrazione mediante adsorbimento selettivo di biomolecole sulla superficie di un microcanale Keenan et al 2008 28 Capitolo 1 200 400 600 800 10000 1200 Distance um Figura 1 27 Gradienti di concentrazione generati per adsorbimento sele
63. a valle dei due sistemi pompanti vengono estratte le concentrazioni di farmaco 0 ed 1 le portate a disposizione per l ottenimento dei rimanenti livelli di farmaco risultano pari a 0 75Q Il criterio logico seguito durante la progettazione stato quello di creare un primo livello destinato all ottenimento della concentrazione 0 5 e alla disposizione dei relativi nove pozzetti di coltura per poi procedere con la realizzazione dei livelli 0 1 e 0 01 rispettivamente per questo motivo due portate identiche e pari a Q 8 sono spillate dai rami di farmaco e mezzo di coltura per il livello 0 5 il sistema di pozzetti con concentrazione 0 1 alimentato con portate pari a 0 9 4 Q lato medium e 0 1 4 Q lato farmaco mentre il livello 0 01 riceve 0 99 4 Q dalla rete di distribuzione del mezzo e 0 01 4 Q dal circuito del farmaco Le rimanenti quantit di fluido presenti nelle due reti fluidodinamiche vengono convogliate verso un pozzetto di recupero nel quale non avverr alcun miscelamento gli sprechi vengono completamente azzerati dal momento che 1 due fluidi possono essere facilmente recuperati e utilizzati per altre applicazioni oppure in fase di ricambio del medium fornito alle cellule 86 Capitolo 2 Medium Q Q Farmaco 0 4 0 4 Concentrazione 0 Concentrazione I 0 750 0 750 0 8 0 8 Concentrazione 0 5 Concentrazione 0 5 0 4 5 8 O 5 8 O 0 9 4 sE 0 1 4 Concentrazione 0 1 Q Q Concentrazione 0 1 0 4 3 2 8 O 4 8 8 O 0
64. affliggono le reti piramidali sono la mancanza di compattezza con la superficie occupata che aumenta con il quadrato del numero di uscite presenti e l elevata influenza che la portata pu avere sulla generazione del gradiente elevate portate implicano insufficiente miscelamento mentre portate eccessivamente ridotte possono innescare indesiderati fenomeni diffusivi tra pacchetti fluidi adiacenti Una alternativa a questa tipologia di dispositivi rappresentata dai metodi di diluizione seriale la superficie occupata incrementa in modo proporzionale con il numero di uscite portando teoricamente ad una maggiore compattezza rispetto alle reti piramidali l impiego di micromixer per un miscelamento ottimale porta tuttavia ad un incremento nelle dimensioni effettive limitando le possibilit di miniaturizzazione Hattori et al 2009 Il dispositivo realizzato da Hattori et al figura 1 37 si inserisce nell ambito delle diluizioni seriali attraverso l utilizzo di microcanali dotati di opportune resistenze in grado di portare alla generazione di profili di concentrazione lineari o logaritmici su tre ordini di grandezza all interno di otto pozzetti di coltura 38 Capitolo 1 FP blind Outlet B Diffusion mixing microchannel Inlet side resistance Outlet side resistance microchannel Connecting microchannel microchannel Figura 1 37 Immagini in microscopia ottica del sistema microfluidico rappresentazione dell int
65. ale di 6 9x6 9x1 5 um e utilizzava un microscopio a fluorescenza ed una camera CCD per rilevare particelle di polistirene con diametro di 300 nm In figura A4 riportato lo schema di un sistema uPIV attuale caratterizzato da una sorgente di illuminazione laser in grado di eccitare particelle fluorescenti con diametro di 200 nm Microfluidic gt L icro ul ic ane device lt lt Immersion fluid Microscope lens 532 nm i Y Epi fluorescent Prism Filter Cube 1 560nm Lens Beam Expander o Intensified CCD Camera Figura A4 Apparato sperimentale di un sistema uPIV Particle Image Velocimetry A Practical Guide 140 Appendice Tra 1 primi studi condotti con uPIV ricordiamo quelli di Meinhart e colleghi del 1999 che misurarono il campo di flusso all interno di microcanali con ampiezza 300 um e profondit 30 um generato da una portata di 50 ul h l apparato sperimentale utilizzato figura A4 era dotato di una lente con ingrandimento 60x e apertura numerica 1 4 immersa in olio Le particelle utilizzate dotate di diametro 200 nm furono scelte in modo da seguire in modo ottimale il flusso e risultavano circa 150 volte pi piccole rispetto alla pi piccola dimensione dei canali La tabella AI consente di confrontare diverse tecniche utilizzate per la valutazione del campo di moto di un fluido nel corso degli ultimi 15 anni con indicazioni sulla risoluzione spaziale e sul tipo di
66. all osso trabecolare ma quella di tipo II ad incrementare notevolmente la possibilit di incorrere in fratture al collo del femore oppure ad omero e tibia prossimali caratterizzati da osso compatto Il meccanismo cellulare alla base dell osteoporosi di tipo II multifattoriale 11 principale parametro da considerare la progressiva carenza di calcio e vitamina D assunti con la dieta quotidiana la diminuzione di appetito che sopraggiunge con l avanzare dell et o ancora come evidenziato da numerose ricerche volte a studiare le principali caratteristiche della societ le sempre maggiori difficolt economiche della popolazione anziana conducono progressivamente ad una dieta sbilanciata e povera di calcio e vitamina D Un secondo aspetto da tenere in considerazione rappresentato dall inattivit fisica la persistente inattivit generata dal dolore causato da una microfrattura osteoporotica ad esempio a livello vertebrale pu portare ad un circolo vizioso con ulteriore perdita ossea incremento nel numero di fratture e nell intensit del dolore percepito Un ulteriore fattore da analizzare per comprendere in modo 14 Capitolo 1 ottimale il fenomeno dell osteoporosi rappresentato dai meccanismi di regolazione ormonale una delle cause principali alla base della patologia costituita dalla netta diminuzione nel livello di estrogeni che sopraggiunge con l et specialmente nelle donne dopo la menopausa L effetto
67. amente in B ad ogni punto di controllo si generano moti convettivi trasversali alla direzione di avanzamento che consentono il perfetto mescolamento di farmaco e buffer Da sottolineare infine un limite della piattaforma microfluidica un imperfetta miscelazione dei due fluidi in corrispondenza di ogni intersezione pu portare ad un accumulo di errori secondo la seguente equazione 1 4 in cui Indica il rapporto di diluizione mentre ex l errore di concentrazione all uscita k esima 54 Capitolo 1 a 3 mixer set of the mixer ETA D i Transw tge flow A I 1 i at n a ere m 3 intatti A 2 Flow direction Figura 1 57 a Rappresentazione schematica del principio di funzionamento del mixer b risultati delle simulazioni numeriche effettuate per la valutazione dei flussi trasversali Kim et al 2008 1 2 3 Conclusioni Dispositivi tecnologici come quelli proposti nelle pagine precedenti sono sempre pi diffusi nei laboratori di biologia molecolare e cellulare si tratta di progetti realizzati all interno di gruppi di ricerca universitari che propongono soluzioni sempre pi innovative e miniaturizzate per effettuare test sperimentali e valutare gli effetti di nuovi farmaci su determinate popolazioni cellulari approfondire le conoscenze sul metabolismo di cellule cancerose caratterizzare il comportamento delle cellule a gradienti di concentrazione di fattori chemotattici realiz
68. ante microscopio ottico Olympus IX71 e videocamera Power View Plus Olympus TSI Inc sono mostrate in figura 3 4 I profili di concentrazione della rodamina sono stati ricavati attraverso un processo di analisi delle immagini Mediante software Paint Shop Pro 9 Jasc Software Inc e Matlab R2009a The Mathworks Inc sono stati estratti 1 livelli di grigio relativi a delle griglie rettangolari alte quanto il canale e larghe dieci pixel in corrispondenza di ingresso ed uscita dei micromixer essi sono stati normalizzati rispetto ai valori di grigio registrati in presenza di sola rodamina o acqua deionizzata nei due microcanali di alimentazione il calcolo della media su dieci pixel fornisce un vettore colonna contenente 1 livelli di grigio medi della linea considerata Channel depth 50um Flow rate 3uL min Channel depth 50um Flow rate 3uL min Channel depth 210um Flow rate 3uL min Channel depth 210um Flow rate 3uL min Channel depth 210um Flow rate 0 3uL min Channel depth 210um Flow rate 0 3uL min Figura 3 4 Immagini relative al processo di miscelazione nei micromixer simulazioni numeriche sinistra e test sperimentali destra ingrandimento 40x I risultati raccolti sono stati confrontati con le simulazioni computazionali 3D condotte mediante software Fluent sulla medesima geometria 1 dati estratti dalle simulazioni numeriche sembrano concordare con un ridotto margine di errore con 1 valori sperimentali come riassun
69. antire la creazione di un profilo sviluppato di velocit seguito dalla biforcazione nel condotto di spillamento e nel ramo di distribuzione successivo Una condizione di portata sotto forma di velocit media stata impostata in ingresso al sistema e all uscita del condotto di spillamento mentre una condizione di pressione stata fissata al termine del ramo di distribuzione collegato come mostrato nello schema riportato in figura 2 22 Condizione di velocit lt ie n ee Condizione A nta j di velocit Condizione di pressione Figura 2 22 Impostazione delle condizioni al contorno del problema 98 Capitolo 2 2 5 2 Propriet termofisiche del farmaco e Densit 1000 Ke m e Viscosit 0 001 Kg m s e Coefficiente di diffusione all interno del medium a 298 K 1x101 m s 2 5 3 Analisi di sensitivit spaziale Prima di procedere con le simulazioni del dispositivo stata eseguita una analisi di sensitivit della griglia di calcolo in termini di numero di elementi sensitivit spaziale l analisi stata condotta con lo scopo di verificare l indipendenza della soluzione dal tipo di griglia spaziale utilizzata Sono state generate quattro differenti griglie composte da un numero crescente di elementi esaedrici testate sul blocco di circuito relativo allo spillamento del livello di concentrazione 0 01 sul ramo di distribuzione del mezzo di coltura il criterio adottato per il confronto sta
70. apie per il trattamento dell osteoporosi sono basate sul tentativo di stimolare l attivit degli osteoblasti ed 1 relativi processi di proliferazione e differenziazione cellulare diversi fattori di regolazione possono contribuire all incremento nella capacit di apposizione di nuova matrice ossea tra cui fibroblast growth factor I FGF I insulin like growth factor I II IGF bone morphogenetic proteins BMPs transforming growth factor P TGFb e platelet derived growth factor PDGF Come sottolineato da Mundy 2000 fattori di crescita quali BMP hanno effetti diretti sulla capacit di differenziazione degli osteoblasti ma incrementano anche la capacit proliferativa di queste cellule grazie ad effetti secondari TGFB ed FGF I hanno effetti diretti sulla proliferazione degli osteoblasti ed incrementano la capacit di apposizione di nuova osteoide grazie alla produzione di altri fattori di crescita tra cuu BMP 2 che essi stimolano I fattori di crescita esposti hanno dimostrato la capacit di accrescere la produzione di nuovo tessuto osseo in vivo tuttavia 1l beneficio che tali molecole apportano sull attivit degli osteoblasti bilanciato da potenziali effetti tossici che queste possono avere su altri tessuti oltre che da svariati effetti collaterali L incremento nella capacit proliferativa indotto nelle cellule di altri tessuti dell individuo pu condurre a forme di neoplasia FGF I causa un abbassamento medio nella pressione ar
71. apito della ripetibilit del processo di fabbricazione e di elevati costi di sviluppo Extreme UV lithography e tecniche basate su raggi X richiedono la realizzazione di nuovi sistemi ottici e o nuove tipologie di maschere mentre array di fasci energetici piuttosto che un singolo fascio sono richiesti per lo sviluppo delle litografie elettroniche e ioniche 1 3 2 Soft lithography Con il termine soft lithography viene indicata una famiglia di tecniche utilizzate per la realizzazione di superfici micro nano strutturate attraverso l impiego di materiali elastomerici tali tecniche comprendono Micro Contact Printing uCP Micro Molding in Capillaries MIMIC e Replica Molding I materiali pi comunemente utilizzati sono gli elastomeri siliconici come 11 polidimetil silossano oltre ai poliuretani lineari a segmenti alle poli immidi e a diverse tipologie di gomme sottoposte a processo di vulcanizzazione Xia et al 1998 In figura 1 62 mostrato uno schema riassuntivo dell intero processo di Replica Molding eseguito utilizzando polidimetilsilossano il prepolimero elastomerico viene disposto su un substrato microstrutturato reticolato mediante l agente di cross link ed infine separato dal master al termine del processo di polimerizzazione la durata del processo di reticolazione a temperatura ambiente di circa 24 ore mentre in stufa l intera reazione si completa in poche ore La microstrutturazione superficiale del master pu essere ottenu
72. are come le ultime due tecnologie presentate siano dotate di pozzetti di coltura disposti in cascata sollevando quindi numerosi interrogativi sull eventuale accumulo di prodotti di scarto nelle microcamere a valle in particolare in condizioni di perfusione continua Cell seeding inlets CGG outlets CGG inlets Glass plate PDMS plate Cell microchamber Figura 1 40 Sistema per colture cellulari integrato con generatore di gradiente di concentrazione Chudy et al 2009 41 Capitolo 1 L utilizzo di dispositivi microfluidici si sta progressivamente affermando nel campo della ricerca di nuovi farmaci ed in particolare nella selezione delle molecole che verranno utilizzate per la sintesi di nuovi composti chimici con potenziale applicabilit in svariate patologie Ye et al 2007 Ye e colleghi hanno sviluppato uno strumento in grado di realizzare analisi multiparametriche sulla risposta cellulare il dispositivo costituito da otto generatori di gradiente piramidali ciascuno con otto diversi livelli di farmaco e da colonne di tre camere di coltura poste in cascata figura 1 41 I processi di diffusione e diluizione del farmaco coltura cellulare alla microscala stimolazione cellulare e marcatura analisi risultano perfettamente integrati fornendo ai biologi la possibilit di automatizzare e ingegnerizzare le prove di coltura e di ricavare in modo semplice importanti parametri di interesse tra cui permeabilit della me
73. ata in figura 2 7 possibile osservare una significativa deviazione del flusso in corrispondenza dei due punti di spillamento a causa della ridotta resistenza fluidodinamica presente nel canale di scarto 1 dati ottenuti mostrano come le portate rilevate nei due condotti di spillamento siano prossime a quelle desiderate e pari a 0 00373 ul min 4 51e 05 2 25e 05 0 00e 00 Figura 2 7 Mappa colorimetrica delle velocit m s in corrispondenza del punto di spillamento Il processo di miscelazione del farmaco stato simulato utilizzando un coefficiente di diffusione pari a 1x101 m s Mezzo di coltura e farmaco sono stati considerati fluidi newtoniani caratterizzati da densit 1000 kg m e viscosit 0 001 kg m s Come mostrato nella mappa colorimetrica in figura 2 8 1 valori di concentrazione di farmaco presenti nei due canali di spillamento risultano pari a 0 0109 e 0 1019 mentre nel canale di scarto utilizzabile per eventuali test aggiuntivi s1 registra un valore di 0 6465 I dati raccolti seppur ricavati da simulazioni l Capitolo 2 bidimensionali sono stati utilizzati per la fabbricazione di un primo dispositivo realizzato presso la fondazione FBK di Trento di cui verranno proposti 1 risultati sperimentali nel capitolo 3 1 00e 00 5 00e 01 0 00e 00 Figura 2 8 Mappa colorimetrica relativa al processo di diffusione del farmaco rosso nel mezzo di coltura blu La necessit di garantire adeg
74. ate La variazione delle portate impostate non influenza la generazione dei profili di concentrazione lineari anche se va sottolineato come un completo processo diffusivo richieda segmenti di spazio sempre maggiori in presenza di flussi molto elevati Mahto et al 2008 e Tirella et al 2008 hanno sviluppato due sistemi per la valutazione della citotossicita di diverse molecole rispettivamente su fibroblasti BALB 3T3 e mioblasti C2C12 di linea il progetto di Mahto e colleghi figura 1 52 prevede la generazione di un profilo sigmoidale di ioni cadmio il sale utilizzato cloruro di cadmio all interno di un unico condotto caratterizzato da due ingressi disposti in configurazione Y con lunghezza 5 mm larghezza 1 mm e profondit 100 um b 70 r T f Ea f ha fa a a2 La ME JA JA 1 4 Normalized Position 4 Normalized Fluoressentce intensa dle a a inlets a bc de f ghi Microfluidic Diffusion vi Diluter pDD 2 Cell Culture c Compartments 4 a5 Outlets E 2 d E Ab si oe Bop de ft ght Compartment Figura 1 52 Schema della rete di distribuzione a intensita di fluorescenza rilevata nel condotto principale con inserimento nei due ingressi di fluoresceina con concentrazioni 0 e 10 uM b camere di coltura c e concentrazione di ioni cadmio nei diversi compartimenti d Mahto et al 2008 SI Capitolo 1 Una rete di dieci microcanali di distribuzione tra
75. ateriale per la realizzazione del dispositivo In fase di progettazione del presente dispositivo la scelta del materiale ricaduta sul polidimetilsilossano poroso che presenta interessanti propriet fisico chimiche oltre ad una elevata biocompatibilit necessaria per la realizzazione dei pozzetti di coltura in cui sono seminate le cellule Le prove di biocompatibilita sono state realizzate presso il laboratorio di biologia molecolare e colture cellulari dell Istituto Ortopedico Galeazzi su diverse tipologie di materiali Le valutazioni di proliferazione vitalit e morfologia di cellule SAOS 2 osteosarcoma sono state effettuate su plastica per colture cellulari controllo PDMS PDMS CNT Carbon Nanotube Composite PDMS poroso PDMS silanizzato COC Cyclo Olefine Copolymer e resina epossidica Gli esperimenti di proliferazione e vitalit sono stati realizzati a differenti istanti di tempo 24 48 72 96 ore dalla semina Le immagini riportate in figura 3 15 sono relative alle prove condotte dopo 96 ore controlli ingrandimenti 100x e 160x al microscopio ottico I test di proliferazione 2 esperimenti effettuati mostrano come la resina epossidica sia il peggiore dei substrati utilizzati in quanto dopo 72 e 96 ore dalla semina la proliferazione delle cellule poste su questo materiale risulta ridotta rispetto a quella del medesimo tipo cellulare seminato sui diversi PDMS e sul COC figura 3 13 121 Capitolo 3 Proliferazione
76. ati in codice Matlab che hanno consentito una valutazione preliminare della diffusione dello stronzio ranelato all interno del mezzo per colture cellulari L analisi dei risultati ha permesso di reindirizzare la progettazione da un sistema di spillamenti successivi ad una differente soluzione progettuale basata sulla miscelazione di portate proporzionali di farmaco e medium in grado di generare le concentrazioni stabilite inizialmente I risultati raccolti hanno infatti evidenziato come un sistema impostato su spillamenti successivi sia incompatibile con le specifiche di progetto in presenza di portate ridotte il requisito di limitati tempi di riempimento tali da garantire la sopravvivenza cellulare non viene rispettato viceversa l impostazione di portate adeguate non consente lo sviluppo di un gradiente di concentrazione ottimale e richiede microcanali con lunghezze particolarmente elevate Un sistema di questo genere inoltre risulta fortemente influenzato dal valore del coefficiente di diffusione da difetti di fabbricazione e da particolari condizioni sperimentali La soluzione progettuale definitiva prevede due differenti reti per l erogazione del farmaco e del mezzo di coltura mediante una pompa a siringa I condotti principali sono disposti sulla circonferenza del dispositivo mentre canali di spillamento opportunamente dimensionati consentono l estrazione di portate proporzionali di fluido che si misceleranno in corrispondenza dei punti di inters
77. ato al pozzetto di scarto di circa ee Figura 2 17 Rappresentazione del terzo punto di spillamento relativo alla concentrazione 0 01 di farmaco 49 2 mm dotato di ampiezza 250 um dal momento che la portata destinata al pozzetto di recupero posto a pressione atmosferica pari a 1 22 8 Q risulta nel tratto considerato una caduta di pressione di circa 3550 Pa che equilibra la perdita di carico presente tra il punto di spillamento ed 1 pozzetti di coltura e pari a 3560 Pa composta da 240 Pa sistema di distribuzione dei nove pozzetti 2850 Pa micromixer 470 Pa canale di spillamento Seguendo un analogo principio di lavoro sono state definite le dimensioni dei microcanali presenti a monte il condotto presente tra il secondo spillamento concentrazione 0 1 ed il terzo spillamento concentrazione 0 01 nel quale scorre una portata pari a 3 2 8 Q stato realizzato con una 93 Capitolo 2 lunghezza di circa 17 6 mm e con una ampiezza di 500 um la lunghezza stata stabilita sulla base di esigenze di organizzazione funzionale del sistema mentre la larghezza stata scelta in modo da evitare significative perdite di carico e allo tempo consentire la fabbricazione di un condotto con rapporto tra le dimensioni caratteristiche pari ad uno dotato quindi di elevata stabilit figura 2 18 Figura 2 18 Disegno CAD del secondo spillamento relativo alla concentrazione 0 1 di farmaco Il canale di spillamento
78. auss cell based che utilizza 11 valore assunto da in corrispondenza del centro di due celle adiacenti h Po T Pe A12 i 2 133 Appendice In alternativa possibile utilizzare la media aritmetica dei valori assunti in corrispondenza dei nodi N della faccia in esame Green Gauss node based maggiore accuratezza rispetto al metodo precedente _ e sei A 13 Nelle simulazioni effettuate stata utilizzata la metodologia least square cell based fig A1 in cui il gradiente della variabile in esame rispetto al centro della cella co pu essere espresso come segue VP Ar Pua G0 A14 in cui Ar rappresenta il vettore congiungente il centro delle celle cg e cj Figura Al Calcolo del gradiente secondo metodologia least square cell based Manuale utente di Ansys Fluent Considerando ogni cella nell intorno di co si ottiene il seguente sistema J JV P o Ag A15 134 Appendice in cui J rappresenta la matrice dei coefficienti dipendente unicamente dalla geometria la decomposizione della matrice J determina la formazione di una matrice di funzioni peso W per ogni cella computazionale tre componenti o fattori di peso per ogni faccia della cella Il gradiente rispetto al centro della cella in esame viene ottenuto moltiplicando 1 fattori di peso per la differenza Ad 1 0 A161 Il metodo precedentemente illustrato indicato nel caso in cui sia richiesta una elevata accura
79. ccare il reclutamento e la differenziazione degli osteoclasti inibendo l erosione dell osso osteoporotico contemporaneamente stimola la proliferazione e la capacit differenziativa degli osteoblasti Figura 1 17 Struttura chimica dello stronzio ranelato Tratto da www wikipedia it Uno studio condotto da Bonnelye e colleghi 2008 su osteoblasti ed osteoclasti murini primari ha evidenziato come un trattamento mediante stronzio ranelato per ventidue giorni sia in grado di incrementare l azione degli osteoblasti indicata da un incremento nella produzione di alcuni marker tra cui la fosfatasi alcalina e parallelamente di ridurre il numero di osteoclasti e di distruggerne l organizzazione dei filamenti di actina uno dei componenti del citoscheletro Ricercatori dell universit di Melbourne hanno analizzato un gruppo di 1489 pazienti di sesso femminile di et superiore agli ottanta anni affetti da osteoporosi la somministrazione di stronzio ranelato per cinque anni ha ridotto il rischio di fratture vertebrali del 31 e di fratture non vertebrali del 27 rispetto a soggetti non trattati dimostrando in tal modo come il farmaco sia in grado di contrastare efficacemente la patologia osteoporotica Seeman et al Bone 2010 18 Capitolo 1 1 1 6 Conclusioni L incremento della vita media pone la necessit di comprendere in modo sempre pi accurato 1 meccanismi alla base delle patologie legate all et avanzata l
80. centrazione lungo A3 media_3 mean OUT3 Media delle concentrazioni nella zona di spillamento ultimo canale C_Ffin3 OUT3 lengthi x3 j Con Cm 3 1 mean 0UT3 length x3 Cs 3 1 mean 0UT3 length x3 hold on surf 0UT3 Visualizzazione del profilo di concentrazione nel microcanale di smiscelamento 3 fino al punto di spillamento LOC centrazioni spillamento 3 149 Bibliografia Bibliografia Abgrall P Gu AM Lab on chip technologies making a microfluidic network and coupling it into a complete microsystem a review J Micromech Microeng 2007 17 R15 R49 Abhyankar VV et al Characterization of a membrane based gradient generator for use in cell signaling studies Lab Chip 2006 6 3 389 393 Abidi SL Detection of diethylnitrosamine in nitrite rich water following treatment with rhodamine flow tracers Water Res 1982 16 199 204 Amarie D Glazier JA Jacobson SC Compact microfluidic structures for generating spatial and temporal gradients Anal Chem 2007 79 9471 9477 Bancroft GN Sikavitsas VI van den Dolder J Sheffield TL Ambrose CG Jansen JA Mikos AG Fluid flow increases mineralized matrix deposition in 3D perfusion culture of marrow stromal osteoblasts in a dose dependent manner PNAS 2002 99 20 12600 12605 Bonnelye E Chabadel A Saltel F Jurdic P Dual effect of strontium ranelate Stimulation of osteoblast differentiation and inhibition of osteocla
81. channel Hydrogel pt fe Ti a da e oO o w Solution reservoir Concentration nh Ped O 1 2 3 4 6 Distance s along channel mm us E s Figura 1 34 Schema tridimensionale del dispositivo a sezione trasversale b vista superiore c e profili di concentrazione ottenibili d Keenan et al 2008 La cavit presente nel secondo strato viene riempita mediante una soluzione di agarosio in grado di gelificare 1 reservoirs vengono successivamente caricati con 1 fluidi necessari causando la formazione del gradiente di concentrazione all interno del gel le biomolecole diffondono gradualmente nei microcanali in cui sono presenti le cellule creando un profilo di concentrazione che dipende semplicemente dal percorso che 1 condotti assumono sotto lo strato di agarosio 35 Capitolo 1 Il Cross Channel Gradient Generator figura 1 35 sviluppato da Paliwal et al 2007 utilizza sottili canali incrociati o test chambers 5 um profondit 200 um lunghezza per collegare fra loro micro canali paralleli 25 um profondit continuamente perfusi con fluidi di source e sink bilanciando la pressione nei canali di source e sink possibile generare gradienti di concentrazione all interno delle fest chambers utilizzabili per studiare la risposta chemotattica di cellule eucariote o batteri mem Fiom Pheromones chambers Piain medium pe he mg through amp fi Ri
82. che prestabilite portate ridotte implicano lunghi tempi di riempimento tali per cui la sopravvivenza cellulare non garantita viceversa l impostazione di portate adeguate rispondenti alle specifiche non consente la generazione di un gradiente di concentrazione ottimale e richiede microcanali caratterizzati da lunghezze particolarmente elevate Un dispositivo basato unicamente su processi diffusivi e su microcanali di spillamento risulta fortemente influenzato dal valore del coefficiente di diffusione da difetti di fabbricazione e da particolari condizioni sperimentali pertanto stata intrapresa un altra via progettuale basata sul miscelamento di portate proporzionali di farmaco e mezzo di coltura Il dispositivo progettato il risultato di calcoli analitici effettuati attraverso una trattazione a parametri concentrati e di simulazioni numeriche che hanno consentito di ottimizzare le dimensioni caratteristiche dei microcanali Considerando che densit viscosit e coefficiente di diffusione di diversi liquidi risultano confrontabili il sistema si dimostra potenzialmente utile per lo screening di numerosi farmaci adattando le ampiezze dei microcanali in base al valori di concentrazione richiesti XI Summary Summary Introduction Microfluidics 1s the science and technology of systems that process and manipulate small amounts of fluids 10 to 10 litres using channels with dimensions of tens to hundreds of micrometres The f
83. cia originando ioni cloro e stronzio Questi ultimi interagendo con le cellule sarebbero responsabili dell effetto curativo osservato sebbene non sia ancora chiaro quale livello di concentrazione sia necessario per un trattamento efficace della patologia Il coefficiente di diffusione del farmaco in acqua trasparente e dunque non identificabile non presente in letteratura si dunque pensato di utilizzare un saggio colorimetrico per la detezione dei cloruri che ne consentisse una stima Il kit Aquanal Sigma Aldrich in grado di interagire con gli ioni cloro presenti in soluzione generando un composto con picco di assorbimento a 455 nm la minima concentrazione di cloro individuabile pari a 10 g ul La siringa contenente il farmaco da testare stata preparata sciogliendo in 5 ml di acqua deionizzata 0 079 g di stronzio cloruro in seguito 200 gocce di kit Aquanal 70071 Professional Chloride Sigma Aldrich sono state aggiunte sotto cappa al preparato e si atteso per un tempo di 3 minuti in modo da completare la reazione chimica in atto Le prove sperimentali sono state eseguite su un microcanale in PDMS con ampiezza 600 um e profondit 210 um la portata impostata stata di 3 ul min Le immagini in figura 3 10 acquisite allo stereo microscopio evidenziano il progressivo processo diffusivo del farmaco in acqua ed il graduale spostamento dell interfaccia presente tra 1 due fluidi considerati Figura 3 10 Diffusione del fa
84. coltura siano di dimensioni ridotte limitando quindi il numero di cellule coltivabili e analizzabili in ciascun pozzetto ma allo stesso tempo evitando inutili sprechi Un ulteriore interessante applicazione rappresentata dal microbioreattore realizzato da Lee et al 2006 utilizzato per condurre test su cellule di linea HeLa un sistema di generazione di gradiente basato su due ingressi e su mescolamenti successivi analogo a quelli sviluppati da numerosi altri gruppi di ricerca consente l alimentazione di un sistema di 64 pozzetti di coltura con un volume di 3 nL figura 1 42 lt _ lt SS Ma bu 1 to l a STA ON ae T N Pila ak z E wi Telere Atay L k x x k w LV da TERE iy eS Consentratiom Gradient Soo Generator Figura 1 42 Dispositivo microfluidico per biologia cellulare dotato di 64 camere di coltura e di un sistema di generazione di gradiente di concentrazione la barra presente nel margine inferiore indica 2 mm sinistra Microscopia a scansione elettronica del sistema in PDMS la barra nel margine inferiore indica 1 mm destra Lee et al 2006 L aspetto innovativo costituito dalla strutturazione delle singole camere di coltura caratterizzate da una forma ad anello aperto forma a C che disaccoppia la zona di coltura centrale dai canali di alimentazione esterni il layout della camera pensato secondo gli sviluppatori per imitare la condizione fisiologica dei tessuti
85. cos i pi yl exp 2 i 2 pir2 Pe p 1 saqrt Pe p 1 2 4 i 2 pi 2 x1 end OUT1 OUTIlt alfa Matrice della concentrazione lungo Al media_Sl mean OUT1 N 1 1 1 length yl Media delle concentrazioni nella szona di spillamento for j 1 length x1 if s 1 1 Tr media Sl 1L q9 gt C 1 1 0 01 C L L amp media S1 1 3 lt C 1 1 0 01 C 1 1 Scelta di un intorno del livello di Sconcentrazione Sly L end end end C_finl OUT1 s 1 1 Concentrazioni spillamento 1 6surf OUT1 1 s 1 1 Visualizzazione del profilo di concentrazione nel S6microcanale di miscelamento 1 fino al punto di spillamento toc Calcolo Liz i LO Definizione della costante A for i l N 2 1 A 2 1 A 2 1 1 N 2 1 OUT1 1 8 2 1 1 max OUTL 1 N 2 1 1 s 2 ct 1 1 end Calcolo della soluzione for k 1 M Cor gt 27 1 1 k k 2 3 Ak k 2 sqrt 2 k pL OUT 2 5 2 1 1 0UT1 z41 s 2 Lie eae Z N 27 1 4 end end 144 Appendice for k 1 M OUT2 0OUT2 sqrt 2 Ak k 2 cos k p1 Vv2 exp 2 KS2 gt DL 2 7x2 Pe 2 Leger Pe 21 Z2 4 k 2 pi 2 j end OUT2 0UT2 A 2 1 media_S2 mean OUT2 N 6zona di spillamento for j 1 length x2 if s 2 1 if media 52 1I j gt C 2 L 0 01 C 2 1 amp media S2 L 39 x C 2 1 0 01 C 2 1 Scelta di un intorno del livello di Sconcentrazione SZ end end end C fin2 00T2Z 3 ysS 2 1 j 6 Concentrazioni spil
86. dalla presenza di un reticolo endoplasmatico rugoso e di un apparato di Golgi molto estesi e responsabili da un punto di vista istologico della loro basofilia citoplasmatica Similmente ai fibroblasti le cellule fondamentali del tessuto connettivo propriamente detto gli osteoblasti sono infatti costantemente impegnati nelle fasi di formazione dell osso nella sintesi dei componenti molecolari che andranno a costituire sia le Capitolo 1 fibre che le glicoproteine della matrice Tali composti vengono successivamente espulsi dalle cellule per esocitosi e vengono quindi assemblati nella loro forma definitiva all esterno della cellula tota e ma cl jostecrblast precursori osteoblast creo iti luncalelilad bea matr calcified bone B mat cell procesa in conical DERECH TA Presenza di uno strato di matrice non mineralizzata osteo ide tra la eam um membrana cellulare e la matrice mineralizzata Figura 1 9 Rappresentazione semplificata della morfologia di osteoblasti ed osteociti sinistra e sezione istologica di tessuto osseo con in evidenza uno strato di osteoide presente tra membrana cellulare e matrice gi mineralizzata destra Migliavacca Dispense del corso di Biomeccanica 2008 La matrice ossea precoce prodotta dagli osteoblasti non cristallizzata detta tessuto osteoide figura 1 9 All interno della matrice sono presenti numerose vescicole di secrezione ricche di un enzima caratteristic
87. di flussi non stazionari dal momento che consente di catturare istantaneamente l intero campo di velocit altre tecniche quantitative di visualizzazione in grado di fornire informazioni su importanti parametri fisici dei fluidi quali densit e temperatura sono gi note e ampiamente utilizzate l unione delle potenzialit offerte dalle differenti metodologie consentir nell immediato futuro una pi accurata descrizione sperimentale del comportamento di un fluido e un confronto sempre pi rigoroso con 1 modelli computazionali utilizzati La progettazione e realizzazione di dispositivi microfluidici ha subito una forte accelerazione nel corso degli ultimi anni citometria a flusso piattaforme per l analisi di nuovi farmaci o del comportamento cellulare elettroforesi capillare per la separazione di frammenti di DNA o altre molecole microcamere PCR sono solo alcune delle nuove tecnologie a disposizione dei laboratori di biologia molecolare cellulare I dettagli del moto dei fluidi attraverso reti di microcanali uniti alle molteplici interazioni tra molecole cellule e pareti del dispositivo determinano fenomeni molto complessi e difficili da simulare numericamente L applicazione della tecnologia PIV alla microscala ha condotto cos alla realizzazione dei primi sistemi uPIV dotati di una risoluzione spaziale cos elevata tale da consentire misurazioni su una scala micrometrica Il primo sistema uPIV progettato era dotato di una risoluzione spazi
88. dimostrano dunque come l ossidazione del polidimetilsilossano comporti una conversione dei gruppi OSi CH3 0 in OnSi OH 4n sulla superficie La spiegazione pi probabile del fissaggio irreversibile ottenuto tra 1 due campioni in PDMS prevede quindi la formazione di ponti silossano Si O S1 Il PDMS in grado di legarsi in modo irreversibile a numerose tipologie di materiali tra cui vetro silicio quarzo polietilene polistirene dopo esposizione di entrambi 1 campioni a plasma di ossigeno per 1 minuto nel caso dei polimeri il trattamento al plasma introduce sulla superficie gruppi carbossilici alcolici o chetonici in grado di interagire con 1 gruppi Si OH presenti sul PDMS La metodologia di fissaggio esposta ampiamente utilizzata per la realizzazione di dispositivi microfluidici e si caratterizza per una elevata semplicit se confrontata con altre tecniche che richiedono l applicazione di combinazioni di alte pressioni temperature e differenze di potenziale per periodi prolungati di tempo che possono danneggiare le strutture create 1 3 4 4 Natura dei canali in PDMS ossidato Il trattamento al plasma determina la formazione di gruppi chimici Si OH sulle pareti dei micro canali in presenza di soluzioni acquose neutre o basiche si assiste alla creazione di gruppi SIO a causa del processo di deprotonazione La presenza di pareti cariche determina un significativo beneficio ai dispositivi microfluidici rispetto alla condizione di superfici
89. distribuzione 96 2 5 Simulazioni numeriche dei componenti del sistema iii 97 2 5 1 Generazione della griglia di calcolo e condizioni al contorno del problema 97 2 942 TOPTICTATCTINOJISICHC QE ATINGACO iii lele 99 LISANA d SENS VAS PAAA lE ai 99 LOARA ESCUS LONE ln 99 Capitolo 3 Fest Sperimentali riali A eT noni Oton 110 STO O iaia ttt rect Nin a S 111 DZ COMPONENT ae SEMA PTV lea 111 DP PEP Ora one dela Kodamma WT essre ianareo E O 112 34 Analist sperimentale GEL MICPOMIXON ozorini ria E ETE AE TTT T 113 3 5 Analisi sperimentale del meccanismo di spillamento iii 117 3 6 Calcolo del coefficiente di diffusione dello StrONZIO CLOTUTO iii 119 3 7 Scelta del materiale per la realizzazione del dispositivo iii 121 Capitolo 4 Conclusioni e sviluppi futuri ii 125 AD 128 IT RR RR RO A O 150 Sommario Sommario Introduzione La microfluidica la scienza e tecnologia di sistemi che processano e manipolano ridotte quantit di fluidi da 10 a 105 litri attraverso canali con dimensioni di centinaia di micrometri Le prime applicazioni delle tecnologie microfluidiche si sono concentrate nel campo della microanalisi grazie alla possibilit di utilizzare ridottissime quantit di campioni e reagenti di separare e individuare molecole con elevata risoluzione e sensitivit di controllare nello spazio e nel tempo l
90. dotti rispetto a quanto inizialmente calcolato In tabella A e B sono riportati 1 dati relativi alle dimensioni dei microcanali della rete di distribuzione del farmaco l espressione microcanale di spillamento indica 1 condotti che a partire dal circuito principale si portano verso 1 pozzetti di coltura Lunghezza mm Larghezza um Blocco spillamento 0 01 Microcanale di spillamento 37 2 200 Microcanale di distribuzione 45 8 430 Blocco spillamento 0 1 Microcanale di spillamento 42 9 100 Microcanale di distribuzione 21 9 250 Blocco spillamento 0 5 Microcanale di spillamento 40 1 150 Microcanale di distribuzione 22 4 400 Blocco spillamento 1 Microcanale di spillamento 8 3 100 Microcanale di distribuzione 62 1 800 Tabella A Calcoli analitici relativi alla progettazione della rete di distribuzione del farmaco Lunghezza mm Larghezza um Blocco spillamento 0 01 Microcanale di spillamento 37 200 Microcanale di distribuzione 45 437 Blocco spillamento 0 1 Microcanale di spillamento 42 100 Microcanale di distribuzione 21 27 Blocco spillamento 0 5 Microcanale di spillamento 33 5 6 5 150 200 Microcanale di distribuzione 14 7 400 350 Blocco spillamento 1 Microcanale di spillamento 7 100 Microcanale di distribuzione 62 800 Tabella B Dimensioni caratteristiche dei microcanali nella rete di distribuzione del farmaco a seguito delle simulazioni numeriche IX Sommario In tabella C vengono riportate le dimen
91. e cellule localizzato in prossimit del gradient sink risulta separato dalla camera inferiore da una membrana con pori di 10 um di diametro stato dimostrato 29 Capitolo 1 come granulociti neutrofili fossero in grado di migrare in presenza di un gradiente del peptide batterico formil metionina leucina fenilalanina Il dispositivo si rileva dunque semplice ed efficace adatto allo studio dei meccanismi chemotattici anche se la mancanza di perfusione rende impraticabili esperimenti di colture cellulari data la progressiva diminuzione di nutrienti e l accumulo di prodotti di scarto e l evoluzione del profilo di concentrazione non pu essere controllata una volta caricati 1 fluidi necessari nei relativi pozzetti Decreasing concentration Source Cell Addition Port VM La Unstimulated neutrophils Channel iz F entrance Figura 1 29 Sezione trasversale del Nanopore Gradient Generator sinistra e schema di migrazione delle cellule all interno del dispositivo destra Keenan et al 2008 Un altro dispositivo in grado di generare gradienti di concentrazione tempo varianti rappresentato dal Microvalve Chemotaxis Device Frevert et al 2006 come illustrato in figura 1 30 il gradiente si origina nello strato fluidico presente nella parte superiore mentre una sottile membrana elastomerica consente la separazione da microcanali pneumatici di controllo quando viene generato il vuoto nello strato di controllo la
92. e differenziazione di cellule staminali neuronali la piattaforma sviluppata espone le cellule ad un gradiente di concentrazione di fattori di crescita in flusso continuo minimizzando in tal modo il signaling autocrino e paracrino cio 1 meccanismi di comunicazione intercellulare garantiti da molecole segnale prodotte dalle cellule La proliferazione ed il differenziamento delle cellule staminali in astrociti sono stati monitorati durante l intero periodo di coltura osservando una diretta dipendenza dal profilo di concentrazione di fattori di crescita GF cui le cellule erano sottoposte il legame tra grado di differenziamento cellulare e gradiente di concentrazione stato confermato da analoghi risultati 45 Capitolo I ottenuti sia con prove di coltura all interno di camere di controllo nel dispositivo che in tradizionali piastre multipozzetto Come visibile in figura 1 45 la camera di generazione del gradiente alimentata da tre diversi ingressi la modulazione dei livelli di concentrazione consente di alterare la morfologia del profilo generato a valle Nell esperimento condotto da Chung stato generato un gradiente polinomiale ax b caricando i primi due ingressi con mezzo di coltura ed il terzo con fattori di crescita I risultati raccolti dimostrano come le cellule staminali presentino un ritmo proliferativo direttamente proporzionale alla concentrazione di fattori di crescita e al contrario una capacit di differenziazione in
93. ecie chimiche considerate La realizzazione tecnica dei componenti viene effettuata mediante soft lithography attraverso l utilizzo del polidimetilsilossano PDMS materiale caratterizzato da elevata biocompatibilita e stabilit Il progetto realizzato in collaborazione con il laboratorio di colture cellulari e biologia molecolare dell Istituto Ortopedico Galeazzi di Milano e con il Center for Materials and Microsystems della Fondazione Bruno Kessler FBK di Trento grazie ai finanziamenti della Fondazione Cassa di Risparmio di Trento e Rovereto Caritro Figura I Componenti del dispositivo microfluidico realizzati in PDMS XXIII Capitolo 1 Capitolo I Stato dell arte Nel presente capitolo verranno trattati il tessuto osseo la patologia osteoporotica e le relative terapie farmacologiche inoltre verranno presentati alcuni dispositivi microfluidici utilizzati per la generazione di gradienti di concentrazione corredati da materiali e tecnologie di microfabbricazione Capitolo 1 Introduzione Nel presente capitolo vengono analizzate struttura e composizione del tessuto osseo dopo una breve discussione sulle diverse tipologie di osso presenti nel corpo umano vengono analizzate nel dettaglio le cellule costituenti il tessuto responsabili dei continui fenomeni di rimodellamento e le caratteristiche principali del processo di ossificazione In seguito vengono presentati 1 principali aspetti del metabolismo dell
94. ecifiche generali del dispositivo concordate con 1 biologi dell Istituto Ortopedico Galeazzi hanno previsto la realizzazione di cinque livelli di concentrazione di stronzio ranelato all interno di medium per colture cellulari da indirizzare verso 1 pozzetti di coltura contenenti le popolazioni di osteoblasti Per ogni valore di concentrazione sono stati previsti nove pozzetti di coltura cos da poter realizzare test di vitalit cellulare in sestuplicato e di proliferazione cellulare in triplicato Un Importante requisito stato quello di garantire un tempo ottimale di riempimento delle microcamere assumendo dei pozzetti caratterizzati da un diametro di 6 4 mm e da un volume di 200 ul i biologi hanno sottolineato la necessit di creare un sottile velo di medium in un arco temporale di pochi minuti Dimensioni e possibili geometrie della piattaforma microfluidica sono invece state stabilite dal gruppo di ricerca di Trento tenendo conto dei limiti tecnici nel processo di microfabbricazione le due alternative proposte sono state una struttura circolare con diametro 9 cm ed una quadrata con lato 7 18 cm La progettazione del dispositivo stata inizialmente indirizzata verso un sistema di generazione di gradiente di concentrazione basato su spillamenti successivi due microcanali in cui sono inseriti mezzo di coltura e stronzio ranelato confluiscono in un condotto centrale dal quale vengono spillate delle portate predeterminate con 1 livelli di conc
95. elamente senza vortici e turbolenze in cui il miscelamento generato unicamente dalla diffusione in corrispondenza dell interfaccia creatasi Squires et al 2005 Figura 1 19 Studio dell effetto della temperatura sul comportamento cellulare all interno di un microcanale a cellule sottoposte ad un fluido freddo b e ad uno caldo c Whitesides 2006 21 Capitolo 1 Un interessante aspetto dei fluidi in moto all interno di condotti microscopici rappresentato dal flusso elettro osmotico quando un fluido contenente specie ioniche posto in un microcanale con cariche fisse sulla propria superficie e un potenziale elettrico viene applicato il fluido si muove con un campo di velocit quasi piatto piuttosto che con il classico profilo di velocit parabolico questa propriet si dimostra particolarmente utile per la separazione di specie cariche tra cui quella di frammenti di DNA e per altre applicazioni nel campo della genomica e della proteomica Santiago 2001 Una delle pi diffuse applicazioni delle tecnologie microfluidiche rappresentata dall analisi delle condizioni di cristallizzazione delle proteine pH forza ionica composizione concentrazione possono essere facilmente controllate e modulate per testare numerose condizioni in cui 1 diversi domini di specifiche proteine inizino a cristallizzare Hansen et al 2002 Altre applicazioni di laboratorio ampiamente documentate riguardano la separazione di s
96. eleranno in corrispondenza dei punti di intersezione Per assicurare la miscelazione completa dei due fluidi stato posto un micromixer a valle di ogni punto di intersezione Le concentrazioni 0 ed 1 sono estratte immediatamente a valle degli ingressi La dislocazione dei microcanali risponde ad esigenze di funzionalit e ad un preciso criterio logico e tiene conto dei limitati spazi a disposizione data l elevata compattezza del dispositivo Il principio generale seguito in fase di progettazione stato quello di ottimizzare le resistenze fluidodinamiche delle differenti porzioni di circuito con lo scopo di garantire uguali perdite di carico nei rami in parallelo e portate ottimali Dal momento che le lunghezze dei microcanali risultano quasi totalmente prestabilite a causa delle dimensioni del sistema il rispetto del principio generale stato assicurato grazie ad una ottimizzazione delle larghezze dei condotti e all inserimento di perdite di carico localizzate in grado di equilibrare il sistema di resistenze presente Tutti 1 microcanali sono caratterizzati da una profondit di 500 um La progettazione del dispositivo stata condotta inizialmente mediante un approccio analitico attraverso la realizzazione dell equivalente elettrico del circuito figura F il sistema stato V Sommario suddiviso in una serie di componenti analizzabili separatamente ed stata adottata una trattazione a parametri concentrati per una prima valutaz
97. ell uscita del sistema Infine stata eseguita una prova sperimentale volta all individuazione del coefficiente di diffusione dello stronzio cloruro principio attivo dello stronzio ranelato mediante un saggio colorimetrico VII Sommario Risultati e discussione Il dispositivo progettato comprende una rete di microcanali di distribuzione di mezzo di coltura e farmaco tre micromixer per il sistema di miscelazione e 45 pozzetti di coltura ciascuno dotato di 36 fori con ampiezza 5 um altezza 500 um e profondit 40 um per consentire un omogenea erogazione del fluido alle cellule stata stabilita una portata Q pari a 2x10 m s cos da garantire un rapido riempimento dei pozzetti il tempo stimato per il raggiungimento del volume di 200 ul risulta infatti pari a 36 secondi In figura G viene proposto uno schema della piattaforma microfluidica in cui possibile osservare la distribuzione dei diversi sottosistemi Figura G Disegno completo del dispositivo microfluidico realizzato su una piattaforma circolare con diametro 9 cm VII Sommario I risultati delle simulazioni numeriche evidenziano come le perdite di carico siano in genere leggermente differenti rispetto a quanto previsto dal modello analitico in particolare nei punti di restringimento allargamento dei microcanali o nelle zone in cui sono presenti delle biforcazioni per questo motivo sono state necessarie piccole correzioni nel dimensionamento dei con
98. emer PS Generating fixed concentration arrays in a microfluidic device Sens Actuators B Chem 2003 92 1 2 199 207 Hong J Edel JB deMello AJ Micro and nanofluidic systems for high throughput biological screening Drug Discovery Today 2009 14 134 146 Hung PJ Lee PJ Sabounchi P Lin R Lee LP Continuous perfusion microfluidic cell culture array for high throughput cell based assays Biotechnol Bioeng 2005 89 1 8 Irimia D Geba DA Toner M Universal microfluidic gradient generator Anal Chem 2006 78 10 3472 3477 Jang K Sato K Igawa K Chung U Kitamori T Development of an osteoblast based 3D continuous perfusion microfluidic system for drug screening Anal Bioanal Chem 2008 390 825 832 Jeon NL Dertinger SKW Chiu DT Choi IS Stroock AD Whitesides GM Generation of solution and surface gradients using microfluidics systems Langmuir 2000 16 22 8311 8316 Jeon NL Baskaran H Dertinger SK Whitesides GM Van de Water L Toner M Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin 8 formed in a microfabricated device Nat Biotechnol 2002 20 8 826 830 Kang L Chung BG Langer R Khademhosseini A Microfluidics for drug discovery and development From target selection to product lifecycle management Drug Discovery Today 2008 13 1 2 1 13 Keenan TM Folch A Biomolecular gradients in cell culture systems Lab on a Chip 2008 8 34 57 153 Bibliografia
99. emre ul TUTTO CCL micro Miei 20 1 2 1 Generazione di gradienti di concentrazione molecolari iii 23 I 2 ZADPUCAZIONIMICCONUIdICIO prince 38 EDD CONCIUSION ili 55 k9 Mierofappricazione Materiali sssini ieee s o E A AARE E EEE E SA 56 LEM cibo 56 LIDI aereo 60 LSS ALP OUGAIMCHISTLOSSANO PDPM ordina 61 1 3 4 Microfabbricazione di un dispositivo microfluidico iii 68 Capitolo 2 Progettazione di un dispositivo microfluidico per la generazione di diverse concentrazioni di farmaco ii 72 Del ANTONIO rada dii 73 2 2 Specifiche generall AeLdisposttiV0iisiscicia iaia 73 2 3 Il progetto iniziale dispositivo per la generazione di un gradiente di concentrazione 74 Vee Weel OC CORRA RIO Rea ee Te 75 2 9 2 SUMUIATIONL COMPULAZION GI EET E O AA soa Very baniweent O E T11 2 4 La soluzione progettuale sviluppata dispositivo microfluidico innovativo tesco 54 2 4 1 Progettazione e ottimizzazione del dispositivo iii 84 242 Touva meele todo ella 86 245 PCT TLC di COICO rcs iii aaa 87 Indice 2 4 4 Progettazione della rete di distribuzione ai pozzetti di coltura i 88 LAO PIOSCHALIONCUELMICIOMIDC Riina 90 2 4 6 Progettazione della rete di distribuzione del mezzo di coltura ii 93 2 4 7 Progettazione della rete di distribuzione del farmaco iii 96 2 4 8 Progettazione dei pozzetti di coltura e del sistema di
100. engono dunque ottenute le grandezze C c Co X x W e Y y W Pe rappresenta il numero di P clet equazione 1 2 in cui v costituisce il valor medio del vettore velocit mentre D rappresenta il coefficiente di diffusione della specie chimica considerata Il parametro a costituisce una sorta di offset del problema e rappresenta il rapporto tra la portata Q1 di mezzo di coltura e la portata complessiva in ingresso al sistema Q1 Q2 nel modello considerato le portate attraverso 1 due ingressi sono identiche e di conseguenza a risulta pari ad 1 2 L equazione 2 1 precedentemente riportata viene utilizzata dal software per il calcolo del profilo di concentrazione fino al primo valore di spillamento e si basa su un ingresso a gradino caratterizzato da livelli di concentrazione pari a 0 ed 1 con interfaccia in corrispondenza dell asse di simmetria del canale I successivi profili di concentrazione vengono calcolati utilizzando l equazione 2 2 sotto riportata ricavata da Gorman et al 2008 che prevede in ingresso al sistema un generico profilo di concentrazione della specie chimica x x x x 2 a 5 C x y A V2Y A COS 17x exp A7 y 2 2 1 v1 4n x Pe dove 1 A FG jax 2 3 0 A 2 f x cosmid 2A 76 Capitolo 2 Il modello bidimensionale utilizzato presenta una serie di ipotesi semplificative il flusso all interno del microcanale a sezione rettangolare deve essere laminare in modo da evitare qualsiasi fenomen
101. ente al centro della cella a monte upstream L applicazione di uno schema risolutivo del secondo ordine implica che il valore di ogni variabile sulle facce della cella considerata venga calcolato utilizzando un approccio di ricostruzione lineare multidimensionale In tale approccio possibile raggiungere una accuratezza di ordine superiore mediante una espansione in serie di Taylor della soluzione presente al centro della cella considerata 11 valore assunto in corrispondenza di una faccia viene calcolato mediante la formula gf V As in cui As rappresenta il vettore spostamento dal centro della cella a monte upstream al centro della faccia considerata il gradiente viene calcolato utilizzando il teorema della divergenza In genere quando il flusso non risulta allineato con la griglia creata l applicazione di uno schema del primo ordine introduce un significativo errore di discretizzazione numerica riducendo notevolmente l accuratezza dei risultati 132 Appendice Modalit di risoluzione del problema Il software interpola 1 valori di pressione sulle facce delle singole celle utilizzando coefficienti presenti nell equazione di conservazione della quantit di moto questa procedura si dimostra efficace fino a quando la variazione di pressione tra 1 centri di celle adiacenti ridotta e graduale in presenza di significativi gradienti nel profilo di pressione possono verificarsi sovrastime oppure sottostime nei valori di velocit
102. entrazione desiderati ottenuti unicamente mediante processi ditfusivi figura C HI Sommario drug inlet concentration gradient medium inlet falta ala ae seus Figura C Modello di dispositivo microfluidico basato su spillamenti successivi Assumendo le concentrazioni di farmaco presenti nei due ingressi del sistema pari a 0 ed 1 0 e 10 mM rispettivamente le concentrazioni richieste attraverso 1 quattro spillamenti sono state 0 01 0 1 e 0 5 ed un valore prossimo ad 1 dipendente dalla quantit di farmaco presente nella porzione superiore del condotto principale e non ancora diffusa al termine del processo di miscelamento Il livello 0 stato direttamente ottenuto dall ingresso contenente 1l medium Le analisi sono state condotte mediante l utilizzo di due programmi in Matlab The Mathworks Inc implementando le equazioni proposte negli articoli di Gorman et al 2008 e di Wu et al 2005 Il primo ha consentito di valutare il profilo di concentrazione del farmaco nel microcanale di riferimento una volta impostate le condizioni al contorno mentre il secondo ha permesso di ricavare le distanze di spillamento ottimali tali da garantire un valor medio di concentrazione desiderato da poter indirizzare verso 1 pozzetti per colture cellulari figura D I modelli analitici hanno permesso una valutazione preliminare del processo di miscelamento di medium per colture cellulari e stronzio ranelato Dal momento che
103. er for quantitative analysis of breast cancer cell chemotaxis Biomed Microdevices 2006 8 109 118 Santiago JG Electroosmotic flows in microchannels with finite inertial and pressure forces Anal Chem 2001 73 2353 2365 Seeman E Boonen S Borgstrom F Vellas B Aquino JP Semler J Benhamou CL Kaufman JM Reginster JY Five years treatment with strontium ranelate reduces vertebral and non vertebral fractures and increases the number and quality of remaining life years in women over 80 years of age Bone 2010 46 4 1038 1042 Sordan Dispense del corso di Micro Nano Fabbricazione 2009 156 Bibliografia Squires TM Quake SR Microfluidics fluid physics at the nanoliter scale Rev Mod Phys 2005 77 977 1026 Sugiura S Edahiro JI Kikuchi K Sumaru K Kanamori T Pressure driven perfusion culture microchamber array for a parallel drug cytotoxicity assay Biotechnology and Bioengineering 2008 100 1156 1165 Sutton DJ Kabala ZJ Rhodamine WT as a reactive tracer laboratory study and field consequences Tracers and Modelling in Hydrogeology 2000 262 201 205 Tanzi MC Fondamenti di bioingegneria chimica non solo biomateriali 2006 Pitagora Editrice Bologna Thorsen T Roberts RW Arnold FH Quake SR Dynamic pattern formation in a vesicle generating microfluidic device Phys Rev Lett 2001 86 4163 4166 Tirella A Marano M Vozzi F Ahluwalia A A microfluidic gradient maker for toxicity tes
104. era rete di microcanali a e particolare relativo al processo di miscelamento b Hattori et al 2009 La rete microfluidica costituita da sottili condotti dotati di alta resistenza fluidodinamica per ingressi uscite e connessioni con sezioni comprese tra 160 e 720 um e da canali diffusivi con sezioni comprese tra 3600 e 17000 um realizzati in polidimetilsilossano mediante fotolitografia multistrato e replica molding I profili di concentrazione desiderati possono essere ottenuti progettando in modo ottimale le dimensioni e la geometria dei microcanali resistivi il gradiente di concentrazione lineare ottenuto con un sistema a perfusione continua di una piccola molecola come la calceina si rivelato stabile nel range di portate 0 009 0 23 ul min La microfabbricazione e le tecnologie microfluidiche rappresentano la nuova frontiera nei campi della biosensoristica e della ricerca di nuovi farmaci l elevato controllo dei fluidi la possibilit di progettare geometrie con dimensioni paragonabili a quelle delle cellule la capacit di creare un ambiente tridimensionale simile a quello biologico rappresentano solo alcuni dei vantaggi offerti dai 39 Capitolo 1 nuovi dispositivi Hung et al 2005 Partendo da tali presupposti Hung e colleghi si sono concentrati sulla realizzazione di array per colture cellulari a lungo termine in grado di mantenere un microambiente stabile e di consentire un monitoraggio costante delle cellule
105. eriori ed inferiori costituite da una diafisi centrale composta da tessuto osseo compatto rivestita esternamente dal periostio membrana di connettivo denso ed elastico e contenente una cavit con midollo osseo giallo e da due epifisi terminali composte da tessuto spongioso rivestito da due sottili strati di osso compatto e cartilagine articolare La parete interna della cavit diafisaria rivestita da uno strato di cellule pavimentose detto endostio e Ossa brevi o corte ossa carpali e tarsali composte da una massa spugnosa avvolta da una corteccia compatta e Ossa piatte coste sterno volta cranica scapole costituite da uno strato spongioso compreso tra due tavolati compatti e Ossa irregolari vertebre ossa del cranio ossa facciali Il tessuto osseo pu essere classificato in lamellare e non lamellare il tessuto osseo lamellare quello di gran lunga prevalente nella vita post natale nello scheletro dei mammiferi e possiede elevate potenzialit meccaniche di resistenza a trazione pressione e torsione con il minimo aggravio ponderale grazie alla tendenza della matrice intercellulare a disporsi in lamelle in ogni lamella le fibre di collagene hanno decorso tendenzialmente parallelo e formano con quelle della lamella contigua un angolo di varia ampiezza lamelle contigue sono separate da matrice mineralizzata Capitolo 1 attraversata da fibre di collagene a disposizione irregolare Il tessuto lamellare suddivisibile in
106. esenti nel campione possano interagire con le pareti del microcanale adsorbendosi al PDMS ed attuare strategie di modifica superficiale per contrastare tale problematica Importanti propriet del PDMS sono inoltre rappresentate dall elevata permeabilit ai gas applicazioni nel campo degli ossigenatori dal comportamento elastomerico e dalle specifiche caratteristiche superficiali 1 3 3 1 Nomenclatura e struttura Il PDMS appartiene al gruppo dei silossani la nuova famiglia di materiali fu inizialmente definita silicochetoni ma data la mancanza del legame covalente doppio SO si opt successivamente per il nome silossani e polisilossani la struttura del PDMS costituita dalla ripetizione di unit monomeriche fondamentali caratterizzate dalla presenza del gruppo silossano inorganico e di gruppi metile organici come mostrato in figura 1 63 Inorganic 77 siloxane group Organic methyl group n number of repetitions Figura 1 63 Unita monomerica di polidimetilsilossano 1 3 3 2 Lavorazione del PDMS per applicazioni microfluidiche Il polidimetilsilossano costituito da una componente pi viscosa il pre polimero contenente il platino come catalizzatore e da un agente cross linkante con il quale viene miscelato generalmente in rapporto stechiometrico 10 1 al fine di ottenere la reticolazione delle macromolecole e le propriet meccaniche desiderate Terminata la fase di miscelamento il materiale viene posto su uno
107. esistenze sono studiate per poter assicurare una portata di 5x10 m s nei due spillamenti destinati ai pozzetti di coltura volume totale 1800 ul e tempo di riempimento 60 min 4x107 m s nel condotto da 50 um e 10x10 m s equamente distribuiti nei cinque microcanali da 40 um Per poter ottimizzare 1 tempi di calcolo necessari per il completamento delle simulazioni bidimensionali stato precedentemente testato il tratto di imbocco del dispositivo con il successivo canale di miscelamento fino ad una lunghezza di 8 677 cm in seguito il profilo di velocit e la 82 Capitolo 2 curva di concentrazione del farmaco sono stati estratti ed utilizzati per la realizzazione della simulazione del punto di spillamento la griglia di calcolo utilizzata per questo ultimo tratto ha previsto 41675 quadrilateri con infittimento in corrispondenza delle biforcazioni l uscita dei condotti stata posta a pressione atmosferica mentre alle pareti stata fissata una condizione di no slip In figura 2 9a viene riportata una mappa colorimetrica del profilo di velocit in corrispondenza del punto di spillamento La portata viene distribuita in modo adeguato secondo quanto previsto dai calcoli analitici che avevano condotto alla definizione delle resistenze fluidodinamiche dei micro canali La diffusione del farmaco viene invece proposta in figura 2 9b il valor medio di concentrazione presente nei due canali di interesse risulta rispettivamente di 0
108. esso dalla seguente equazione se Pe 1 2 D in cui v rappresenta la velocit di scorrimento del fluido D il coefficiente di diffusione della specie chimica ed A la dimensione caratteristica del condotto un numero di P clet elevato indica un trasporto prevalentemente convettivo al contrario un valore inferiore all unit denota un trasporto prevalentemente diffusivo E possibile osservare come gli idrogeli eliminino totalmente qualsiasi 34 Capitolo 1 flusso a causa del lungo e tortuoso percorso attraverso la densa matrice polimerica mentre la presenza di fessure pur non essendo in grado di eliminare completamente la convezione garantisce numeri di P clet sotto l unit I generatori che implementano tali soluzioni non richiedono complesse apparecchiature es pompe a siringa computer controllate sono facili da progettare e costruire possono creare stabili gradienti su camere per colture cellulari di lunghezza arbitraria consumano meno reagenti rispetto ai dispositivi Parallel Flow e possono essere utilizzati per generare gradienti sovrapposti di diverse biomolecole il principale svantaggio risiede nella difficolt di produrre complessi profili di concentrazione e nel fatto che necessitano di quantit di reagenti superiori rispetto a quelle dei dispositivi tradizionali Keenan et al 2008 Un modello di dispositivo che utilizza idrogeli stabilizzanti mostrato in figura 1 34 a ei Reservoirs b Fluidic
109. etrica di pressione Pa relativa ai sistemi di distribuzione laterali Nr uscita 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Rica 5 576 5 531 5 542 5 535 5 572 5 528 5 542 5 531 5 576 Tabella 2 3 Distribuzione delle portate volumetriche nei pozzetti di coltura alimentati con medium e farmaco Il valore di portata registrato nei pozzetti di coltura risultato di 5 548 0 0205 10 m s Successivamente stata realizzata la simulazione del sistema di distribuzione del fluido ai pozzetti con concentrazione 0 oppure 1 di farmaco le condizioni al contorno sono state impostate come riportato per il precedente sottosistema mentre la griglia utilizzata stata realizzata con 1600000 elementi esaedrici applicando una condizione di simmetria Il tratto di imbocco necessario per la generazione di un profilo sviluppato di velocit presenta lunghezza 2 mm e la caduta di pressione complessiva registrata di 5160 Pa In figura 2 25 riportata la mappa colorimetrica del profilo di pressione mentre in tabella 2 4 numerazione delle uscite in senso orario a partire dai pozzetti sul margine inferiore possibile osservare la distribuzione delle portate nei nove condotti di uscita la differenza massima rilevata nei flussi stata dello 0 98 Il valore di portata registrato nei pozzetti risultato di 5 543 0 0214 10 m s Nr uscita 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Rice 5 538 5 514 5 563 5 569 5 516 5 550 5 544 5 523 5 566 Tabella 2 4 Distribuzione delle portate volume
110. ezione Il sistema stato sviluppato mediante l utilizzo di una trattazione a parametri concentrati e la realizzazione dell equivalente elettrico del circuito di distribuzione simulazioni computazionali eseguite mediante software Fluent hanno consentito di valutare 1 calcoli effettuati e migliorare progressivamente il sistema I risultati raccolti dalle simulazioni numeriche hanno mostrato piccole differenze rispetto ai calcoli analitici evidenziando tuttavia come anche una 126 Capitolo 4 trattazione semplificata come quella a parametri concentrati sia estremamente utile per sviluppare un progetto di base prima di ricorrere a metodi computazionali particolarmente esigenti in termini di potenza di calcolo richiesta I diversi componenti del sistema sono stati realizzati presso il gruppo di ricerca BioMEMS della Fondazione Bruno Kessler di Trento attraverso l applicazione di tecniche di soft lithography e l utilizzo del polidimetilsilossano PDMS materiale caratterizzato da elevata biocompatibilita e stabilit La realizzazione dei prototipi consente da una parte il miglioramento delle procedure di microfabbricazione e contemporaneamente fornisce la possibilit di effettuare test sperimentali in laboratorio 1 cui risultati possono essere confrontati con quelli delle simulazioni numeriche Le prove sperimentali eseguite mediante tecnologia Micro Particle Image Velocimetry sul micromixer hanno consentito la caratterizzazione dei dispositi
111. ezione resistente dell osso e sui conseguenti valori di sforzo e deformazione nel caso in cui quest ultima si mantenga all interno di un range compreso tra 200 e 2500 yustrain crescita e riassorbimento osseo si equivalgono dando origine ad una condizione di equilibrio dinamico Il processo di rimodellamento previene l accumulo di danni da fatica ed reso possibile da squadre composte da una decina di osteoclasti e da centinaia di osteoblasti denominate BMUs o basic multicellular units 11 riassorbimento prevede la creazione di tunnel o gallerie di circa 200 um di diametro con una velocit di lavoro di 40 um al giorno parallelamente le cellule osteogenetiche si differenziano in osteoblasti che riempiono progressivamente il tunnel con nuova osteoide ad una velocit di 0 5 1 um al giorno figura 1 13 12 Capitolo 1 STASI cellule di mvestime nto ATTIVAZIONE preosteociasti 4 ASSORBIMENTO osteodasti INVERSIONE Figura 1 13 Rappresentazione dei processi di riassorbimento osseo ad opera degli osteoclasti e di nuova apposizione di osteoide regolata dagli osteoblasti e successivamente mineralizzata Redaelli e Montevecchi Biomeccanica Analisi multiscala di tessuti biologici 1 1 5 Malattie metaboliche ossee e tessuto osseo senescente La diminuzione di massa ossea con l avanzare dell et rappresenta un fenomeno inevitabile la condizione in cui la massa di tessuto osseo decrementa fino al raggiungimento di un li
112. figura 1 69 Figura 1 69 Microscopia a scansione elettronica del microcanale creato Duffy et al 1998 1 3 4 3 Ossidazione e fissaggio La rete di microcanali ottenuta mediante fissaggio della replica polimerica con una sottile lastra in PDMS ossidando entrambe le superfici in un reattore al plasma di ossigeno per 1 minuto e portandole a contatto possibile ottenere un perfetto fissaggio senza applicazione di pressioni aggiuntive Per poter comprendere la natura dell intenso legame stabilitosi tra le due superfici ossidate si rendono necessarie alcune considerazioni langolo di contatto dinamico dell acqua su PDMS trattato al plasma di 30 mentre quello su polimero non trattato di ben 108 11 PDMS 69 Capitolo 1 ossidato quindi caratterizzato da una superficie idrofilica Tecniche di spettroscopia ionica SSIMS evidenziano come il sito di attacco del plasma sia rappresentato dagli atomi di silicio e come si originino sulla superficie del campione gruppi chimici Si OH l utilizzo della spettroscopia a raggi X XPS rivela inoltre un sensibile incremento in silicio e ossigeno sulla superficie con diminuzione rispetto a campioni non trattati della presenza di carbonio Tecniche di spettroscopia a raggi infrarossi denotano un significativo contributo relativo ai fenomeni di stretching di gruppi chimici OH ed Si OH a conferma dei risultati ottenuti mediante le tecniche precedentemente citate Evidenze sperimentali
113. figure 1 38 e 1 39 i 7 fo GE cf F E nn N E x N gt USN gas a T 1 PV iz J x rar or mee s DN Ay oncentratio I Perfusion Gradient S Outlet Generator l gt e gt A f ei nn fi NET m f gt fx gt d N N Pr Di a gt r l A A A a N f a St gt amp P at N hi 2 y gt i gt lt H E ee gt do gt gt lt gt gt lt gt a aa aa aN ae AR aa AA li A as Y be G p n j j b Perfusion Inlet PPPLLILITIT d A 4 ni Pa f F 3 3 b Figura 1 38 Array per colture cellulari dotato di sistema di diluizione piramidale e di sistema di perfusione a Gradiente di concentrazione generato dall inserimento di colorante giallo e blu nei due ingressi del sistema di diluizione piramidale colorante rosso utilizzato per il preliminare riempimento dei pozzetti b Hung et al 2005 L array realizzato pu ospitare fino a 100 diversi esperimenti sulle cellule in parallelo il gradiente di concentrazione viene realizzato mediante un sistema di miscelamento piramidale mentre opportuni canali larghi 50 um e profondi 40 um garantiscono l apporto costante di sostanze nutritive e l eliminazione dei prodotti di scarto La singola unit funzionale mostrata nella figura sottostante costituita da una microcamera circolare di 1 mm di diametro e 40 um di profondi
114. gni circostanza inoltre si sottolinea la difficolt nell ottenere 1 livelli di concentrazione 0 1 e 0 5 a seguito dello spillamento iniziale a concentrazione 0 01 modifiche nei valori di portata o nell ampiezza e nella profondit dei condotti non consentono in alcun modo di ottenere 1 risultati desiderati rispettando in pieno le specifiche di progetto A titolo esemplificativo si riporta il risultato di una simulazione condotta imponendo una portata di spillamento di 1 83x10 1 m s con ampiezza e profondit del microcanale di partenza di 600 um I condotti di spillamento sono caratterizzati da ampiezza pari a 150 um mentre il parametro a precedentemente definito corrisponde a 0 5 1 2 0 8 0 6 Spillamento 0 01 0 4 Concentrazione 0 2 0 0 20 40 60 80 100 120 Ampiezza microcanale Figura 2 5 Profilo di concentrazione del farmaco in corrispondenza del punto di spillamento 0 01 Il grafico in figura 2 5 mostra l andamento del profilo di concentrazione in funzione dell ampiezza del condotto normalizzata tra 0 e 100 in corrispondenza dello spillamento 0 01 dopo 1 88 cm 1l processo diffusivo ha consentito la generazione del primo livello di concentrazione desiderato 79 Capitolo 2 risultante dalla media dei valori di concentrazione sui primi 150 um di ampiezza del microcanale rappresentati dalle ascisse comprese tra 75 e 100 lo spillamento del successivo valore 0 1 risulta Impossibile da
115. he ossee ed in particolare dell osteoporosi definita da Floman come una patologia dell eta senescente caratterizzata da una progressiva diminuzione di massa ossea e dall alterazione dell intera architettura ossea figura B Bono et al 2003 Numerose terapie per il trattamento dell osteoporosi sono basate sul tentativo di limitare l attivit degli osteoclasti o di stimolare l attivit degli osteoblasti ed 1 relativi processi di proliferazione e differenziazione cellulare Diversi fattori di regolazione possono contribuire all incremento nella capacit di apposizione di nuova matrice ossea tuttavia il beneficio che tali molecole apportano sull attivit degli osteoblasti bilanciato da potenziali effetti tossici che queste possono avere su altri tessuti oltre che da svariati effetti collaterali Inoltre 1 benefici apportati da diversi farmaci sono ottenibili solo in presenza di concentrazioni adeguate nel microambiente osseo per questo motivo sviluppi futuri di terapie basate su fattori di crescita o altre molecole richiederanno un efficace meccanismo di rilascio cos da garantire il raggiungimento della concentrazione desiderata nel sito di interesse Una classe di molecole in grado di promuovere l attivit degli osteoblasti ed al contempo limitare il riassorbimento osseo ad opera degli osteoclasti rappresentata dai cosiddetti DABA dual action bone agents tra 1 quali presente lo stronzio ranelato oggetto di s
116. he well 1s characterized by a depth of 500 um and by a width of 200 um 36 holes characterized by a width of 5 um a height of 500 um and a depth of 40 um are uniformly placed along the channel and insure an homogeneous rainfall distribution of the culture medium to the cellular population Computational simulations of the flow distributors were carried out imposing an inlet flow of 5 5555x10 m s and a pressure equal to zero on the 36 exits as boundary conditions The device will be realized with a soft lithography technique using polydimethylsiloxane PDMS a polymer that thanks to its surface properties gas permeability inertia stability and high biocompatibility turns out to be particularly suitable to work with cells Medium O 0 Drug 0 4 0 4 0 750 0 750 0 8 0 8 0 4 5 8 5 8 Q 09490 01 90 0 4 3 2 8 Q 4 8 8 Q 0 994 0 01 4 0 4 1 22 8 Q L 4 78 8 Q Figure F Electric equivalent of the circuit XVII Summary Several prototypes of single components of the circuit were fabricated with the aim to optimize the microfabrication process experimental tests carried out using a Micro Particle Image Velocimetry system uPIV TSI Inc confirmed the results of the numerical simulations The experiments were performed using liquid WT Rhodamine Organic Dyestuffs Corporation molecule that excited by a laser source with a wave length of 532 nm produces fluorescence Micromixers with a wrinkled wall channel
117. i cosiddetti lab on chip Un dispositivo microfluidico figura 1 18 generalmente composto da una serie di componenti specifici tra cul un sistema per l introduzione di campioni e reagenti un metodo per la movimentazione e per l eventuale miscelamento dei fluidi all interno dei microcanali presenti sul chip sensori per analisi chimiche ed eventuali sistemi di purificazione nel caso in cui il sistema sia utilizzato per scopi di sintesi Lo sviluppo delle tecniche di soft lithography e l utilizzo del polidimetilsilossano PDMS hanno consentito di realizzare numerosi prototipi e di testare nuove soluzioni progettuali e componenti stato inoltre possibile esplorare le fondamentali differenze nella fluidodinamica all interno di canali macroscopici o di condotti di dimensioni micrometriche Detto Re il numero di Reynolds _v D p u in cui v rappresenta la velocit del fluido D il diametro idraulico del condotto p e uw Re 1 1 rispettivamente densit e viscosit possibile effettuare un osservazione significativa A livello macroscopico 1 fluidi sono in grado di miscelarsi in modo convettivo grazie alla notevole influenza esercitata dall inerzia rispetto alla viscosit alla microscala al contrario nel momento in cui due fluidi sono inseriti all interno di un microcanale basso numero di Reynolds cio ridotto rapporto tra forze inerziali e forze viscose si osserva un moto laminare con pacchetti fluidi che scorrono parall
118. i fabbricazione del substrato su cui viene successivamente depositato 11 PDMS che ne riproduce 1 pi piccoli dettagli con precisione micrometrica l incremento di rugosit superficiale determina un aumento della superficie e di conseguenza un incremento dell area in grado di adsorbire molecole o intrappolare bolle gassose la rugosit superficiale pu determinare alterazioni locali del flusso laminare con insorgenza di fenomeni di microconvezione e generazione di piccoli vortici Adsorbimento q Il polidimetilsilossano non trattato altamente idrofobico in grado di interagire con analiti contenenti gruppi metilici o alchilici attraverso forze di Van der Waals proporzionali al numero di gruppi metile o alla lunghezza delle catene alchiliche presenti da sottolineare infine come il gruppo silossano possa generare legami idrogeno o interazioni dipolo dipolo L utilizzo di canali lunghi e sottili in numerosi dispositivi microfluidici per consentire il completamento di processi di diffusione e miscelamento comporta la presenza di estese superfici di contatto con il campione che 65 Capitolo 1 pu dunque interagire con le pareti dei condotti alcune molecole presenti nel fluido possono legarsi in modo preferenziale con la struttura in PDMS portando ad un effetto di filtraggio indesiderato e ad analizzare un campione in uscita differente rispetto a quello introdotto L adsorbimento pu condurre inoltre a fenomeni di ostruzione de
119. i metodologie di analisi s1 cerc di sviluppare apparecchiature sempre pi compatte e versatili e individuare nuove potenziali applicazioni nel campo della biochimica e della biologia Un fondamentale incentivo alla nascita e sviluppo delle tecnologie microfluidiche giunse dopo la guerra fredda ed in particolare nei primi anni 90 dal settore militare statunitense che necessitava di piccoli dispositivi per il riconoscimento di potenziali minacce chimiche e batteriologiche Altri importanti stimoli per lo sviluppo della microfluidica furono rappresentati dall esplosione della genomica negli anni 80 che richiedeva elevata sensitivit risoluzione e velocit di elaborazione per il sequenziamento del DNA e della microelettronica che grazie alle tecniche di microlitografia aveva consentito la nascita dei chip basati sul silicio e dei sistemi microelettromeccanici MEMS Figura 1 18 Dispositivo microfluidico utilizzato per lo studio di cellule procariote Whitesides 2006 I primi dispositivi sperimentali creati in laboratorio furono realizzati in silicio o in vetro di silice pur non possedendo molti dei requisiti necessari per poter essere utilizzati con cellule e campioni 20 Capitolo 1 biologici primo fra tutti la permeabilit ai gas Whitesides et al 2001 La ricerca costante ha portato alla nascita di nuovi metodi di fabbricazione e di componenti specifici come valvole mixer e pompe fondamentali per la realizzazione de
120. i precisione OHAUS Analytical Plus Il coefficiente di diffusione della rodamina WT in acqua valutato a 298 K stato calcolato sperimentalmente e assunto pari a 7x10 m s 112 Capitolo 3 Figura 3 2 Immagini in fluorescenza relative al processo diffusivo della rodamina in acqua deionizzata portata di 3ul min sinistra e di 20 ul min destra 3 4 Analisi sperimentale dei micromixer Il dispositivo microfluidico progettato ed analizzato nel capitolo 2 paragrafo 2 4 necessita di tre micromixer fondamentali per garantire una corretta miscelazione di farmaco e mezzo di coltura 1 test sperimentali proposti nel presente capitolo sono stati eseguiti su micromixer caratterizzati da un profilo dentato con ampiezza del condotto principale di 200 um profondit pari a 50 um o 210 um e lunghezza 3 mm Come riportato in figura 3 3 1 condotti di miscelazione presentano due ingressi attraverso 1 quali sono inseriti acqua delonizzata e rodamina WT con uguali portate di 0 3 ul min o 3 ul min erogate da una pompa a siringa Harvard PHD 2000 volume siringhe 2 5 ml Le connessioni fluidiche sono garantite da due aghi direttamente inseriti all interno del PDMS con cui realizzato il dispositivo Il coefficiente di diffusione della rodamina stato assunto pari a Tx10 m s Figura 3 3 Immagine relativa ad uno dei micromixer in PDMS testati 113 Capitolo 3 Le immagini relative al processo di miscelazione acquisite medi
121. ic device based on successive extractions Taking the concentration levels of drug in the two inlets of the system equal to 0 and 1 0 and 10 mM respectively the requested concentration levels through the four extraction points were 0 01 0 1 and 0 5 and a value near to 1 which 1s strictly related to the amount of drug in the upper zone of the main channel and not yet diffused after the previous flow withdrawals The concentration level 0 was directly obtained from the inlet containing the medium The analyses were carried out using two scripts written in Matlab The Mathworks Inc code implementing the equations found in the scientific articles written by Gorman et al 2008 and by Wu et al 2005 The first one allowed to evaluate the drug concentration profile in the main microchannel after the definition of the boundary conditions while the second one permitted to obtain the optimal positions of the withdrawal sections to guarantee a desired concentration mean value to be infused to the cell culture wells figure D The analytical models allowed a preliminary evaluation of the mixing process of medium for cell cultures and strontium ranelate Since with this method it was not possible to comply with the established general requirements it was decided to use a different approach for the design of the device Be lOx x 00 y 0 SUS x x x 2 x 2 3 3 x c x y y y NO cosina exp LA y a IT n l n Pe N Pe 4n 7 hdi
122. iene raccolta in corrispondenza dell uscita mentre il resto prosegue verso il successivo punto di intersezione come mostrato nella figura sopra riportata La rete resistiva schematizzata in fase progettuale visibile in figura 1 55 Q Buffer IN da Figura 1 55 Equivalente elettrico del dispositivo Kim et al 2008 53 Capitolo 1 Dopo che le portate sono state determinate necessario individuare le resistenze fluidodinamiche per poter definire le dimensioni dei microcanali da realizzare In figura 1 56 viene riportata un immagine del dispositivo completo in cui sono visibili le connessioni al sistema di alimentazione del farmaco e del buffer Logarithmic dilution chip Linear dilution chip Figura 1 56 Dispositivo microfluidico caricato con colorante giallo e blu la rete di microcanali viene modificata in funzione della diluizione desiderata Kim et al 2008 Una nota particolare merita l innovativo sistema di miscelazione denominato serpentina di Tesla figura 1 57 nel caso in cui i due fluidi non siano perfettamente miscelati prima della successiva intersezione 1 rapporti di diluizione risulterebbero pesantemente influenzati dalle portate e dal coefficiente di diffusione della specie chimica considerata la regione di miscelazione prevede sei coppie di mixer con una lunghezza totale di 43 mm due flussi laminari sono inseriti in corrispondenza del punto A 1 tre flussi generati si incontrano nuov
123. ilevata in corrispondenza della biforcazione stata di circa 11300 Pa figura 2 19 Figura 2 19 Rappresentazione del punto di spillamento con concentrazione 0 5 di farmaco Viene ora riportato il disegno CAD dell ultimo tratto preso in esame situato tra la pompa a siringa ed il punto di spillamento della concentrazione 0 5 di farmaco figura 2 20 il condotto principale caratterizzato da una lunghezza di circa 62 1 mm stato progettato con un ampiezza di ben 800 um cos da evitare elevate cadute di pressione a causa dell elevata portata presente pari a 0 75Q la perdita di carico rilevata in corrispondenza del punto di biforcazione riportato in figura 2 20 risulta quindi prossima ai 13200 Pa per poter assicurare un uguale AP anche nel blocco composto dai nove pozzetti di coltura stato utilizzato un microcanale di circa 8 3 mm con ampiezza 100 um destinato al trasferimento del fluido a concentrazione 0 al sistema di distribuzione Figura 2 20 Disegno CAD del tratto di circuito compreso tra la pompa a siringa ed il punto di spillamento della concentrazione 0 5 di farmaco 95 Capitolo 2 2 4 7 Progettazione della rete di distribuzione del farmaco Come precedentemente trattato stato necessario garantire uguali perdite di carico in corrispondenza dei nodi principali delle due reti di distribuzione di farmaco e medium per colture cellulari I calcoli analitici effettuati hanno consentito il di
124. in osteociti il tessuto spugnoso originato risulta alamellare e presenta fibre di collagene intrecciate mentre il manicotto connettivale che si crea durante questa fase costituir il periostio La contemporanea azione di osteoblasti ed osteoclasti determina l avvio del processo di rimaneggiamento che consente la comparsa del nuovo tessuto lamellare spugnoso oppure compatto 1 1 3 2 Ossificazione endocondrale L ossificazione endocondrale detta anche indiretta si origina a partire da un precedente abbozzo cartilagineo che viene riassorbito e sostituito dal tessuto osseo Nelle ossa lunghe la prima ossificazione avviene nella diafisi dopo una fase di proliferazione 1 condrociti riassorbono la matrice e aumentano di volume nella matrice si diffondono sali di calcio collagene X e vascular endothelial growth factors VEGF nonch osteoclasti che degradano 1 condrociti rendendo la cartilagine invasa da osteoblasti e vasi del periostio il tessuto spugnoso non viene riassorbito e la sua componente vascolare costituisce 11 midollo Il manicotto osseo crea tessuto osseo compatto lamellare che progressivamente si estende a scapito della cartilagine il processo prosegue con 1l graduale ritiro della cartilagine e con l aumento di tessuto osseo compatto con allungamento di diafisi ed epifisi nelle ossa lunghe fino al raggiungimento di una condizione di equilibrio Al termine dell et di sviluppo la cartilagine permane unicamente a livello dei piatti
125. ine del secondo o delle frazioni di secondo sui moderni computer Caratteristiche generali del sistema PIV Misura non invasiva del campo di velocit In contrasto con altre tecniche di misura delle velocit di flusso che utilizzano sonde invasive in grado di alterare le propriet del moto la tecnologia PIV utilizza metodi ottici non invasivi ci consente di acquisire informazioni accurate anche in presenza di alte velocit o in prossimit delle pareti dei condotti dove la presenza di sonde pu alterare il comportamento fluidodinamico Misura indiretta della velocit La velocit degli elementi fluidi misurata in modo indiretto a partire dal calcolo delle velocit delle particelle fluorescenti presenti all interno del flusso proprio come nella tecnica laser doppler velocimetry La tecnologia PIV consente di registrare immagini di ampie sezioni del campo di flusso in molteplici applicazioni che utilizzano liquidi o gas al contrario la maggior parte delle tecniche attualmente a disposizione consente la misurazione puntuale della velocit sebbene con una elevata risoluzione temporale la tecnologia PIV caratterizzata da un ottima risoluzione spaziale mentre la risoluzione temporale non ancora paragonabile a quella delle applicazioni tradizionali a causa di limitazioni tecniche Velocity lag La necessit di utilizzare particelle per la misura delle velocit richiede un controllo accurato per ogni singola prova speri
126. ione dell energia Le equazioni vengono completate dalle condizioni al contorno e dalle condizioni iniziali del problema Equazione di continuit Il principio di conservazione della massa pu essere espresso come segue la variazione di massa in un volume infinitesimo considerata nell unit di tempo eguaglia la differenza tra 1 flussi di massa entranti ed uscenti O cP V pv 0 A1 Ot dove p rappresenta la densit del fluido mentre v il campo di velocit Bilancio della quantit di moto Il secondo principio della dinamica esprime la conservazione della quantit di moto e pu essere enunciato come segue la variazione nell unit di tempo della quantit di moto del fluido contenuto nel volume di controllo Tt sommata al flusso netto di quantit di moto attraverso la superficie o uguaglia la risultante delle forze esterne agenti sull elemento di fluido contenuto nel volume stesso 128 Appendice O mau v Ue ee a aa A2 Ot OX OX dove p rappresenta la densit del fluido u la viscosit dinamica mentre v e p indicano rispettivamente il campo di velocit e la pressione del fluido A 2 Modello di diffusione e leggi di Fick Coefficienti di diffusione di massa adeguati devono essere impostati nel modello ogni volta in cui vengano risolte equazioni di trasporto di specie chimiche tali coefficienti sono utilizzati per il calcolo del flusso di diffusione come espresso dalle leggi di Fick Le
127. ione delle perdite di carico distribuite in ogni singolo tratto Simulazioni computazionali mediante il software commerciale Fluent Ansys Inc Canonsburg PA USA sono state effettuate con lo scopo di valutare la bonta dei calcoli analitici e migliorare progressivamente la soluzione Sia per 1 calcoli analitici che per le simulazioni computazionali il dominio stato suddiviso in una serie di sottodomini e sono state imposte adeguate condizioni al contorno di pressione e portata Il sistema di distribuzione alle cellule del fluido ha previsto la realizzazione di un microcanale circolare disposto sulla circonferenza del pozzetto di coltura in prossimit della sommit il condotto posto 7 mm al di sopra del fondo del pozzetto caratterizzato da una profondit di 500 um e da una ampiezza di 200 um 36 fori dotati di ampiezza 5 um altezza 500 um e profondit 40 um sono disposti con passo uniforme lungo il canale e assicurano una omogenea distribuzione a pioggia del mezzo di coltura alla popolazione cellulare Simulazioni computazionali del sistema di distribuzione ai pozzetti di coltura sono state effettuate imponendo come condizioni al contorno una portata in ingresso di 5 5555x10 m s ed una pressione nulla in corrispondenza dei 36 fori di uscita Il dispositivo verr realizzato con la tecnica della soft lithography in polidimetilsilossano PDMS polimero che grazie alle sue propriet di superficie alla permeabilit ai gas alla propria iner
128. irst applications of microfluidic technologies have been in microanalysis thanks to the possibility of using small quantities of sample and reagents carrying out separations and detections of molecules with high resolution and sensitivity controlling in space and time the concentrations of chemical species and obtaining significant results in short times with low costs Whitesides 2006 Constant research has taken to the development of equipments more and more compact and versatile and has allowed to find new potential applications in the field of biochemistry and molecular and cellular biology A microfluidic device figure A is generally composed of a series of specific components a method of introducing reagents and samples methods for moving and mixing the fluids into the microchannels on the chip detectors for chemical analysis and components for purification of products for systems used in synthesis Figure A Microfluidic device used to study microbial populations Whitesides 2006 XII Summary The development of soft lithography and the use of polydimethylsiloxane PDMS have made possible to realize several prototypes and to test new planning solutions and components PDMS thanks to optical transparency gas permeability and high biocompatibility represents an useful material for the creation of microchambers in which 1s possible to grow cells to analyze their behaviour and to study their cytoskeleton An interesting re
129. isfare la legge di Kirchhoff delle tensioni A causa delle specifiche dimensionali stabilite l ottimizzazione stata condotta principalmente inserendo in alcuni punti delle strozzature per incrementare l entit delle perdite di carico I condotti hanno ampiezza non inferiore a 50 um dovuta alla risoluzione del processo di microfabbricazione al fine di non introdurre difetti significativi Tutti 1 microcanali sono caratterizzati inoltre da una profondit di 500 um 85 Capitolo 2 La progettazione del dispositivo microfluidico stata condotta inizialmente mediante un approccio analitico attraverso la realizzazione dell equivalente elettrico del circuito il sistema stato suddiviso in una serie di componenti analizzabili separatamente ed stata adottata una trattazione a parametri concentrati per modellizzare le perdite di carico distribuite e localizzate in ogni singolo tratto Simulazioni computazionali sono state effettuate con lo scopo di valutare la bont dei calcoli analitici e migliorare progressivamente la soluzione 2 4 2 Equivalente elettrico del circuito Il dispositivo microfluidico stato modellizzato mediante una rete elettrica puramente resistiva di cui viene proposto uno schema in figura 2 12 detta Q la portata erogata da ognuna delle due pompe a siringa di alimentazione il sistema deve assicurare per ciascuno dei cinque blocchi composti da nove pozzetti di coltura una portata pari a Q 4 considerando quindi che
130. ivo dopo aggiunta delle molecole fluorescenti un piano denominato light sheet all interno del flusso viene illuminato due volte in un ridotto intervallo di tempo dalla sorgente laser l intervallo temporale compreso tra 1 due impulsi laser dipende da diversi parametri tra cui la velocit media del flusso nei 136 Appendice microcanali la radiazione diffusa dalle particelle attraversa un sistema ottico costituito da una lente di alta qualit e viene registrata in uno o due fotogrammi separati uno scanner consente la digitalizzazione delle acquisizioni che vengono direttamente trasferite nella memoria di un PC Le acquisizioni PIV sono suddivise in una serie di piccole superfici denominate interrogation areas il vettore di spostamento delle molecole fluorescenti determinato per ognuna delle microaree attraverso l utilizzo di funzioni di auto correlazione e cross correlazione si assume che tutte le particelle presenti all interno di una interrogation area si siano mosse in modo omogeneo tra 1 due istanti di eccitazione laser la proiezione del vettore velocit nel piano light sheet precedentemente definito calcolata tenendo in considerazione il ritardo temporale tra 1 due impulsi Il processo viene ripetuto per ognuna delle interrogation areas in cui suddivisa l acquisizione e l intero processo di elaborazione considerando la presenza di migliaia di vettori velocit istantanea ha una durata dell ord
131. l microcanale con modifica delle propriet del flusso numerose molecole fluorescenti utilizzate in diversi esperimenti e molteplici proteine risultano facilmente adsorbibili sulla superficie in polidimetilsilossano dei canali in cui sono inserite Modifiche di superficie sono in grado di ridurre l adsorbimento di molecole sulle pareti dei condotti pur essendo spesso costose e difficili da applicare Modifiche di superficie Diversi trattamenti consentono di rivestire le pareti interne dei microcanali in PDMS dei dispositivi microfluidici con lo scopo di prevenire legami indesiderati tra questi ricordiamo l esposizione a sorgenti di energia come plasma di ossigeno o luce ultravioletta l utilizzo di surfattanti carichi film sottili di polielettroliti modifiche covalenti come silanizzazioni deposizione chimica da fase vapore bilayer fosfolipidici 1 trattamenti applicati al PDMS non si rivelano stabili nel tempo di conseguenza l utilizzo di dispositivi modificati dovrebbe essere limitato a pochi cicli 1 3 3 5 Conclusioni Il PDMS ormai ampiamente utilizzato per la fabbricazione di piattaforme microfluidiche figura 1 67 grazie alla sua elevata lavorabilit e ai suoi costi moderati la sfida del futuro consister nel generare superfici modificate stabili nel tempo in grado di garantire prestazioni ottimali ai singoli dispositivi senza l insorgenza di fenomeni di adsorbimento che potrebbero inficiare 1 risultati ottenuti Il PDMS p
132. l momento che gi stato raggiunto un livello di concentrazione pari a 0 22 sull ampiezza del condotto corrispondente alla seconda estrazione X Analizzando 1 risultati ottenuti si pensato di intraprendere una via alternativa basata sulla progettazione di un dispositivo ibrido 1 livelli di concentrazione 0 ed 1 sono direttamente estratti dai canali di ingresso prima che confluiscano nel condotto principale la concentrazione 0 5 ottenuta tramite miscelazione diretta di uguali portate di farmaco e mezzo di coltura Il processo diffusivo sfruttato unicamente per ottenere 1 livelli di concentrazione 0 01 e 0 1 La rimanente quantit di medium e farmaco caratterizzata da un livello di concentrazione superiore a 0 5 pu essere utilizzata per condurre ulteriori test su altri campioni cellulari evitando in tal modo qualsiasi spreco In figura 2 6 mostrato uno schema del dispositivo disegnato sulla base delle nuove specifiche di progetto il sistema realizzato su una struttura in PDMS di forma quadrata di lato 7 18 cme prevede la disposizione di 45 pozzetti di coltura Figura 2 6 Prototipo del dispositivo ibrido in cui il processo diffusivo responsabile della generazione dei soli livelli di concentrazione 0 01 e 0 1 AI fine di valutare le lunghezze di spillamento per ottenere le concentrazioni di farmaco pari a 0 01 e 0 1 sono stati realizzati modelli computazionali bidimensionali con il codice Flue
133. la cella computazionale la modalit con cui le equazioni vengono linearizzate pu essere implicita oppure esplicita Nella formulazione implicita il valore incognito assunto all interno di ogni cella da una determinata variabile calcolato utilizzando una relazione che includa sia valori noti che incogniti della variabile in celle adiacenti nella formulazione esplicita al contrario il valore incognito di una variabile all interno di una cella computazionale calcolato utilizzando esclusivamente una relazione che includa solo coefficienti gi noti Schema risolutivo Fluent utilizza una tecnica basata sulla definizione di volumi di controllo per convertire il sistema di equazioni integrali in equazioni algebriche che possano essere risolte numericamente il software calcola 1 valori assunti da ogni singola variabile al centro di ogni cella questi ultimi vengono utilizzati per ricavare mediante interpolazione i valori su ogni faccia della cella della variabile considerata Il processo di interpolazione pu essere effettuato utilizzando uno schema risolutivo del primo o del secondo ordine quando desiderata una accuratezza del primo ordine 1 valori delle variabili sulle facce vengono determinati assumendo che le quantit al centro di ogni cella rappresentino il valor medio della variabile nel momento in cui viene selezionato uno schema del primo ordine il valore assunto da una variabile su una faccia viene impostato uguale al valore pres
134. la presenza dei canali di distribuzione sulla superficie inferiore del piano intermedio e della rete di distribuzione sulla superficie superiore del piano di base 1 canali di detection e le microcamere di coltivazione sono disposti sul livello superiore del dispositivo I canali di distribuzione presentano una lunghezza compresa tra 1 e 9 mm mentre la profondit risulta di 21 0 5 um il mantenimento di una profondit uniforme risulta di importanza fondamentale per la generazione del corretto profilo di concentrazione la profondit dei canali di detection compresa tra 160 e 170 um mentre 1 canali di ingresso presentano una profondit di 60 um le microcamere di coltura sono caratterizzate da un diametro di 2 5 mm I test colorimetrici sono stati effettuati con una soluzione acquosa di blu metilene con concentrazione 1 mM come evidente dalla figura 1 48 che si riferisce al punto di controllo possibile osservare la dipendenza del processo diffusivo dalla portata impostata sulla pompa a siringa in presenza di basse portate il segnale risulta uniforme lungo tutta la larghezza del canale al contrario con portate elevate riscontrabile un segnale non omogeneo a causa dell alterazione della cinetica di diffusione a ame i tt t0 2 uL min 200 uL min Flow rate uL min Blue signal intensity a u O 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 y um Figura 1 48 Intensit del segnale registrato nel canale 5 al variare della porta
135. la resistenza dei due condotti semicircolari ed Rex la resistenza della struttura ad anello sinistra Microscopia ottica del pozzetto di coltura destra Lee et al 2006 L apertura di soli 2 um al di sotto dell anello evita la fuoriuscita delle cellule presenti nella camera in quanto di dimensioni notevolmente inferiori rispetto al diametro medio di una comune cellula eucariote il sistema di resistenze il rapporto tra Rc ed Rr Indipendente dalla portata come dimostrato sperimentalmente pu essere modificato alterando la geometria della camera il rapporto tra le resistenze consente dunque la modulazione di importanti parametri quali velocit sforzi di taglio numero di P clet turnover del mezzo di coltura La novit proposta da Lee risiede dunque nella possibilit di simulare 1 fenomeni di trasporto presenti in vivo la camera di coltura centrale rappresenta le unit tessutali mentre la diffusione attraverso gli spazi interstiziali rappresentata dal moto delle molecole di soluto attraverso il sottile canale presente sotto l anello Il dispositivo realizzato in PDMS materiale molto utilizzato per la costruzione di dispositivi microfluidici che includono uno spazio di coltura data l elevata biocompatibilita la permeabilit ai gas e la trasparenza ottica Un altro interessante dispositivo sviluppato a scopo di ricerca quello proposto da Chung et al 2005 pensato per l ottimizzazione del processo di proliferazione
136. lamento z nolda On ss rf 0UT2 3 1 8s 2 1 Visualazzazione del profilo di concentrazione nel microcanale di miscelamento 2 fino al punto di spillamento toc Matrice della concentrazione lungo A2 2 1 1 length y2 Media delle concentrazioni nella e Calcolo L134 1 LG Definizione della costante A for i 1 N 3 1 A 3 1 A 3 1 1 N 3 1 OUT2 i s 3 1 1 max OUT2 1 N 3 1 1 s 3 1 1 end Calcolo della soluzione for k 1 M for z 1 N 3 1 1 Ak k 3 Ak k 3 sqrt 2 k pi 0UT2 z s 3 1 1 OUT2 z 1 s 3 n ct iyi Sin k pi Z N 3 1 end end for k 1 M OUTS OUTSTSOrt 2 Ak k 3 COs k p1 73 exp DAKOTA 2 eof Pelo 1 FSeqre Pe s 1 254 2 gt p1 2 j end OUT3 OUT3 A 3 1 Matrice della concentrazione lungo A3 media_S3 mean OUT3 N 3 1 1 length y3 Media delle concentrazioni nella 6zona di spillamento tor J length x3 if s 3 1 if media_S3 1 gt C 3 1 0 01 C 3 1 amp media_S3 1 j lt C 3 1 0 01 C 3 1 Scelta di un intorno del livello di Sconcentrazione Sio end end end C_fin3 0UT3 s 3 1 Concentrazioni spillamento 3 shold on ssurf OUT3 1 s 3 1 Visualizzazione del profilo di concentrazione nel microcanale di miscelamento 3 fino al punto di spillamento toc Calcolo 1 4 1 IG Definizione della costante A ct 145 Appendice for 1 1 N 4 1 A 4 1 A 4 1 1 N 4 1 OUT3 i s 4 1 1 max OUT3 1 N
137. llulari 0c 2e 8 Portata desiderata alle cellule m 3 s o Dimensionamento del microcanale wIN 600e 6 Width Al m d 210e 6 Depth m 1 microcanali hanno tutti la stessa profondit Parametri relativi ai due ingressi AO 00b 1 2 0c Z Portata nel microcanale AO mezzo m 3 s 00a 00b Portata nel microcanale AO farmaco m 3 s gamma Q0b Q0a alfa 1 1 gamma Parametro utilizzato per il calcolo del profilo di Sconcentrazione 01 00a 00b Portata nel microcanale Al m 3 s Vettori per la risoluzione dell algoritmo w zeros Z 1 Larghezze dei microcanali in cui avviene la diffusione m l zeros Z 1 Lunghezze dei microcanali in cui avviene la diffusione m v zeros Z 1 Velocit m s Pe zeros Z 1 Numeri di P clet nei microcanali in cui avviene diffusione N zeros Z 1 Livelli di concentrazione in ingresso al canale Ap T zeros Z 1 Rapporto lunghezza larghezza dei microcanali 0 0 Inserimento manuale delle lunghezze dei microcanali di miscelamento 1 1 1 1le 3 I1 2 1 26 73 1 3 1 4e 3 for p 1 2 w p 1 wIN Z 1 p Z Definizione larghezza canali a partire da wIN Ne Gorell tata oe ea dere ee v p 1 01 Z p 1 Z w p 1 d Velocit in Ap m s e p 1 v p 1 w p 1 D Numero di P clet N p 1 int32 101 Z 1 p Z 2 p end N 1 1 101 La formula precedente non funziona per N 1 1 Parametri per approssimazione numerica g 0 01 Intervall
138. maging Lab Chip 2009 9 1882 1889 Zaari N Rajagopalan P Kim SK Engler AJ Wong JY Photopolymerization in microfluidic gradient generators microscale control of substrate compliance to manipulate cell response Adv Mater 2004 16 23 24 2133 Zhou Y Wang Y Mukherjee T Lin Q Generation of complex concentration profiles by partial diffusive mixing in multi stream laminar flow Lab Chip 2009 9 1439 1448 159
139. mbrana citoplasmatica dimensioni del nucleo cellulare potenziale transmembrana mitocondriale e stato di ossidoriduzione intracellulare a seguito del trattamento mediante farmaci anti cancro in grado di indurre l apoptosi delle cellule tumorali La piattaforma in grado di consentire la rapida estrazione di molteplici informazioni sul metabolismo cellulare in risposta a diversi farmaci e differenti concentrazioni e allo stesso tempo limitare gli sprechi di campioni e mezzo di coltura MU Drug Medium Medium 7 Drug Medium input jij PFEP FIr pee Concentration gradient generator CGG Cell culture chamber i Common reservoir a b Figura 1 41 Schema generale del dispositivo a e dettaglio relativo ad una singola unit strutturale b Ye et al 2007 42 Capitolo 1 Come mostrato in figura 1 41b il sistema di generazione di gradiente piramidale collegato alle camere di coltura con dimensioni caratteristiche 1000 um x 400 um da canali lunghi 2000 um e larghi 75 um in modo da evitare che durante la fase di caricamento da un reservoir le cellule possano entrare all interno della rete microfluidica 1 processi diffusivi all interno dei microcanali consentono di generare un profilo di concentrazione lineare La diluizione piramidale viene ritenuta un valido strumento per la generazione di profili lineari sebbene comporti numerosi step di miscelamento da sottolineare come le camere di
140. me espresso dalla seguente equazione t 1 5 con k costante dello spinner in genere variabile tra 80 e 100 p percentuale di resist solido w velocit di rotazione dello spinner espressa in rpm 1000 resist dispenser photoresist excess resist flies off during rotation wafer lo be coated vacuum chuck di pe Figura 1 59 Sistema di deposizione del resist sul substrato Del Zoppo Dispense del corso di Nanomateriali 2008 57 Capitolo I Il processo di trasferimento del pattern sul substrato riassunto in figura 1 58 le tappe fondamentali in cui pu essere suddiviso il processo sono la pulitura del wafer l applicazione del fotoresist una fase di soft baking per il fissaggio di quest ultimo al substrato l allineamento della maschera l esposizione alla sorgente luminosa la fase di sviluppo wet dry etching ed un processo conclusivo di hard baking Il processo fotolitografico caratterizzato da tre possibili configurazioni del sistema figura 1 60 e Configurazione contact in cui la maschera aderisce perfettamente al substrato rivestito mediante il resist la principale problematica rappresentata dal progressivo danneggiamento della maschera e dalla deposizione sulla sua superficie di prodotti di scarto provenienti dal resist con conseguenti difficolt di trasferimento del pattern desiderato sul substrato e Configurazione proximity 1 problemi relativi alla maschera sono eliminati anche
141. membrana si flette portando in tal modo a contatto 1 liquidi presenti nello strato fluidico superiore 30 Capitolo 1 a Layers Fluidic Membrane Control a f A b Uf Y Fluid Isolation Valves Nz Figura 1 30 Microvalve Chemotaxis Device sezione trasversale del dispositivo a vista superiore in cui possibile osservare la generazione di un gradiente di concentrazione di colorante rosso b microscopia a contrasto di fase di neutrofili umani sottoposti ad un gradiente di concentrazione di CXCL 8 con relative traiettorie colorate c Keenan et al 2008 La terza classe di dispositivi microfluidici caratterizzata dalla possibilit di generare gradienti di concentrazione tempo invarianti su un area adibita a colture cellulari fornendo informazioni dettagliate e quantitative su come la distribuzione di biomolecole segnale possa influenzare 1l comportamento delle cellule in vitro Il primo sottogruppo di dispositivi denominato Parallel Flow Gradient Generator sfrutta la mancanza di miscelamento convettivo tra pacchetti fluidi adiacenti in condizioni di moto laminare il mescolamento avviene per sola diffusione in direzione perpendicolare a quella del flusso per cui 1 gradienti chimici generati dipendono esclusivamente dalla composizione e dalla portata dei rispettivi flussi oltre che dal relativo tempo di contatto si sottolinea come 1 gradienti di concentrazione risultino costanti fino al momento in cui portate e
142. mensionamento dei diversi microcanali caratterizzati da una profondit di 500 um 1 cui valori sono di seguito riportati in modo schematico in tabella 2 1 Lunghezza mm Larghezza um Blocco spillamento 0 01 Microcanale di spillamento 37 2 200 Microcanale di distribuzione 45 8 430 Blocco spillamento 0 1 Microcanale di spillamento 42 9 100 Microcanale di distribuzione 21 9 250 Blocco spillamento 0 5 Microcanale di spillamento 40 1 150 Microcanale di distribuzione 22 4 400 Blocco spillamento 1 Microcanale di spillamento 8 3 100 Microcanale di distribuzione 62 1 800 Tabella 2 1 Calcoli analitici relativi alla progettazione della rete di distribuzione del farmaco 2 4 8 Progettazione dei pozzetti di coltura e del sistema di distribuzione Il sistema di distribuzione alle cellule del fluido figura 2 21 prevede la realizzazione di un microcanale circolare disposto sulla circonferenza del pozzetto di coltura in prossimit della sommit il condotto posto 7 mm al di sopra del fondo del pozzetto caratterizzato da una profondit di 500 um e da una ampiezza di 200um 36 fori dotati di ampiezza 5 um altezza 500 um 96 Capitolo 2 e profondit 40 um sono disposti con passo uniforme lungo il canale e assicurano una omogenea distribuzione a pioggia del mezzo di coltura alla popolazione cellulare Come noto la distribuzione delle portate risulta pi uniforme in presenza di fori con diametro particolarmente ridotto un secondo
143. menta lievemente l azione degli osteoblasti venendo quindi spesso utilizzata per il trattamento dell osteoporosi Le terapie per pazienti osteoporotici possono includere la somministrazione di vitamina D calcio e magnesio oppure l assunzione di ormoni tra cui somatotropina STH per le donne e testosterone o nandrolone decanoato per 1 soggetti maschili 17 Capitolo 1 In alcuni casi possibile procedere con diuretici tiazidici in grado di aumentare il riassorbimento renale di calcio o attraverso somministrazione di farmaci osteoformativi tra cui ormone paratiroideo o teriparatide forti stimolatori della formazione ossea nei casi di grave osteoporosi o di insuccesso delle altre terapie esistenti Le terapie farmacologiche presentate sono in grado di curare solo parzialmente la patologia osteoporotica in quanto l azione di ciascuna di esse limitata alla stimolazione della capacit proliferativa degli osteoblasti e della relativa attivit di deposizione di matrice ossea oppure alla limitazione dell azione degli osteoclasti Una classe di molecole in grado di promuovere entrambi gli effetti dei farmaci precedentemente analizzati rappresentata dai cosiddetti DABA dual action bone agents tra 1 quali presente lo stronzio ranelato figura 1 17 L utilizzo di stronzio ranelato rappresenta un innovativo trattamento della patologia osteoporotica in quanto incrementa la produzione ossea di osteoprotegerina proteina in grado di blo
144. mentale del comportamento che queste assumeranno all interno 137 Appendice del flusso in genere molecole di piccole dimensioni sono in grado di seguire in modo migliore il moto del fluido utilizzato Illuminazione In molteplici applicazioni che coinvolgono fluidi gassosi una sorgente luminosa ad elevata potenza richiesta per l illuminazione delle piccole particelle cos da esporre in modo ottimale 1 sensori ottici alla radiazione diffusa la necessit di utilizzare molecole di grosse dimensioni a causa della superiore capacit di scattering risulta in contrasto con il requisito di piccole particelle in grado di seguire in modo fedele il moto del fluido ogni singola prova eseguita in laboratorio richiede quindi la definizione di un compromesso a causa del trade off presente In presenza di fluidi liquidi possibile utilizzare particelle di dimensioni superiori rispetto ad altre applicazioni la superiore capacit di scattering consente di utilizzare sorgenti luminose con potenza di picco limitata Durata dell impulso laser La durata dell impulso laser deve essere sufficientemente breve in modo da congelare il moto delle particelle ed al contempo evitare fenomeni di blurring delle immagini no streaks In genere la durata di ogni impulso di circa 5 ns Ritardo temporale tra i due impulsi Il ritardo temporale tra 1 due impulsi forniti dalla sorgente laser deve essere sufficientemente lungo da consentire l
145. mentre per il caso bidimensionale la relazione diviene A6 dp Fe Fo Ea QD F J i J m Ot Or Oy L espressione in forma del tutto generale in due o pi dimensioni pu essere scritta utilizzando l operatore gradiente WV 06 pyzy an Ot Se il coefficiente di diffusione non costante e risulta dipendente dalle coordinate e o dalla concentrazione la seconda legge di Fick diviene 3p y A8 ii I Nel caso in cui sia costante nel tempo si ottiene l equazione di Laplace le cui soluzioni sono delle leggi armoniche l equazione sar dunque nella forma V 6 0 49 130 Appendice Dipendenza dalla temperatura del coefficiente di diffusione Il coefficiente di diffusione a differenti temperature spesso esprimibile con margini di errore generalmente accettabili dalla relazione D D E La l A10 R T dove D il coefficiente di diffusione Do rappresenta il coefficiente massimo di diffusione a temperatura infinita Ea l energia di attivazione del processo diffusivo T rappresenta la temperatura assoluta misurata in gradi Kelvin R la costante universale dei gas Un equazione in questa forma conosciuta come equazione di Arrhenius 131 Appendice A 3 Caratteristiche del software commerciale Fluent Formulazione del problema Le equazioni non lineari impostate dall utente vengono linearizzate dal software portando alla generazione di un sistema lineare in ogni singo
146. microcanali subiscono delle deformazioni a causa delle pressioni generate per il moto del fluido 1l grado di deformazione determinato dalla pressione sulle pareti dal grado di reticolazione del polimero ma anche dallo spessore del microcanale Le propriet elastomeriche del PDMS dovrebbero essere tenute in considerazione in applicazioni in cui un flusso costante essenziale o in presenza di elevati rapporti tra larghezza e profondit dei microcanali in quanto la struttura potrebbe essere soggetta a rischio di collassamento Il PDMS infine particolarmente indicato per la realizzazione di valvole pneumatiche e pompe con possibilit di aumentare notevolmente la compattezza dei dispositivi creati 1 3 3 4 Propriet di superficie del PDMS Angolo di contatto Una delle principali propriet di superficie rappresentata dall angolo di contatto che definisce il grado di idrofilicit idrofobicit e che di conseguenza influenza le capacit di adsorbimento del materiale rivelandosi cruciale nei dispositivi che si basano su fenomeni elettrofluidodinamici molteplici trattamenti di modifica superficiale consentono di alterare il valore dell angolo di contatto l esposizione a plasma di ossigeno determina una diminuzione dell angolo di contatto dell acqua da 108 a 30 sebbene tale decremento sia instabile e di breve durata all aria aperta Rugosit superficiale La rugosit superficiale strettamente collegata al processo d
147. modo l impiego di queste tecnologie La sempre pi elevata presenza di personale specifico nei laboratori di ricerca e la decentralizzazione degli strumenti di fabbricazione potranno contribuire nell immediato futuro a ridurre la soglia di diffusione rendendo tali dispositivi di uso comune Keenan et al 2008 37 Capitolo I 1 2 2 Applicazioni microfluidiche Nel campo della biologia le colture cellulari rappresentano un importante metodo sperimentale per la scoperta di nuovi farmaci e terapie questi saggi sono generalmente condotti mediante piastre multi pozzetto richiedendo un notevole dispendio di tempo da parte dei tecnici di laboratorio e portando molto spesso alla generazione di errori a causa dell uso di micropipette e altri dosatori manuali I dispositivi microfluidici sono potenzialmente in grado di risolvere questi problemi generando svariate tipologie di profili di concentrazione di diverse specie chimiche in modo semiautomatico I requisiti che una rete microfluidica deve rispettare sono la possibilit di mantenere un gradiente di concentrazione per tempi significativi una elevata compattezza stabilit in presenza di differenti portate e la possibilit di generare 1 profili di concentrazione richiesti Una delle principali tipologie di dispositivi rappresentata dalle reti piramidali in cui 1 fluidi vengono ripetutamente suddivisi e miscelati fino all ottenimento delle concentrazioni desiderate Alcuni problemi che
148. mulazioni preventivamente effettuate sui micromixer trascurando 1 calcoli analitici realizzati su questi componenti 91 Capitolo 2 Figura 2 16 Disegno completo del dispositivo microfluidico realizzato su una piattaforma circolare con diametro 9 cm 92 Capitolo 2 2 4 6 Progettazione della rete di distribuzione del mezzo di coltura Il circuito destinato alla ripartizione del mezzo di coltura riportato nella porzione sinistra del disegno CAD figura 2 16 stato suddiviso in quattro differenti sezioni analizzabili separatamente e successivamente simulate mediante CFD La progettazione partita dalla porzione pi a valle del circuito in corrispondenza del terzo punto di spillamento concentrazione farmaco 0 01 ed ha riguardato da una parte il microcanale destinato al pozzetto di recupero e dall altra il condotto fino all imbocco del micromixer figura 2 17 Come trattato nel paragrafo Progettazione e ottimizzazione del dispositivo stato necessario assicurare uguali perdite di carico nei due settori con ripartizione delle portate basata sul rapporto tra le resistenze fluidodinamiche dei condotti Considerando un canale di spillamento di lunghezza 39 5 mm pressoch fissata date le dimensioni complessive del dispositivo e di ampiezza 800 um sufficientemente ampio tale da evitare significative perdite di carico data l elevata portata fornita attraverso di esso stato stabilito di realizzare un condotto destin
149. nale circolare profondo 500 um disposto sulla circonferenza del pozzetto di coltura in cui sono presenti 36 fori equispaziati con dimensioni caratteristiche 5 um e 40 um Le simulazioni sono state effettuate considerando un condotto di ingresso dotato di ampiezza 200 um e imponendo come condizioni al contorno una portata di 5 5555x10 m s in arrivo al sistema ed una pressione nulla in corrispondenza delle 36 uscite La griglia di calcolo stata realizzata con 1320000 elementi esaedrici imponendo una condizione di simmetria In figura 2 32 viene riportata una mappa colorimetrica relativa alla distribuzione delle velocit nel sistema con particolare attenzione al foro di uscita del fluido 107 Capitolo 2 9 22e 02 4 6e 02 0 00e 00 Figura 2 32 Mappa colorimetrica di velocit m s relativa al sistema di distribuzione ai pozzetti di coltura con ingrandimento relativo al foro di uscita del fluido I dati relativi alla distribuzione delle portate volumetriche nei fori di uscita del microcanale circolare sono visibili in tabella 2 7 Puscita 1 in cui si registra la portata massima quella prospiciente il condotto di ingresso mentre il foro numero 19 posto in posizione diametralmente opposta come mostrato nella mappa colorimetrica precedente 1 punti di uscita da 2 a 18 sono posti sulla semicirconferenza inferiore mentre 1 fori da 2a fino a 18a appartengono alla semicirconferenza superiore La massima differenza di portata eroga
150. ndo un coefficiente di diffusione pari a 101 m s I passi seguiti nella definizione e nella soluzione del problema sono di seguito riassunti e Creazione della geometria del modello mediante software commerciali di disegno meccanico Rhinoceros Robert McNeel amp Associates e Generazione della griglia di calcolo mediante un codice commerciale Gambit Ansys Inc Canonsburg PA USA e Importazione della griglia e verifica della sua correttezza e Definizione delle equazioni da risolvere e Impostazione delle propriet dei materiali utilizzati e delle condizioni al contorno del problema e Ottimizzazione dei parametri di controllo della soluzione e Inizializzazione del campo di flusso e calcolo della soluzione 77 Capitolo 2 e Analisi dei dati raccolti ed eventuale revisione della griglia impostata o del modello fisico e numerico utilizzato Il modello fisico implementato in Fluent prevede la risoluzione delle equazioni di conservazione della massa e della quantit di moto per il fluido in presenza di fenomeni diffusivi viene risolta una specifica equazione di conservazione della specie chimica presente Le equazioni di conservazione il modello di diffusione e le leggi di Fick sono trattati in Appendice I parametri del modello sono stati impostati come di seguito illustrato Formulazione implicit Formulazione velocit absolute Solutore pressure based Discretizzazione momentum second order upwind Discretizzazio
151. ne della diffusione del farmaco second order upwind Pressure velocity coupling SIMPLE Opzioni gradiente least squares cell based La precisione richiesta nelle simulazioni per poter monitorare il processo di diffusione del farmaco figura 2 4 ha reso necessaria l applicazione di uno schema risolutivo del secondo ordine differenze significative sono state evidenziate rispetto ai risultati ottenuti mediante utilizzo di uno schema del primo ordine Figura 2 4 Simulazioni relative alla diffusione del farmaco rosso all interno del medium per colture cellulari blu 78 Capitolo 2 Considerando la necessit di garantire il riempimento dei 45 pozzetti di coltura previsti il livello inizialmente impostato di portata spillata stato pari a 1 83x10 m s la portata attraverso 1 due ingressi stata dunque fissata a 3 66x10 m s I risultati raccolti dalle numerose simulazioni effettuate hanno mostrato come un progetto basato su spillamenti successivi sia incompatibile con le specifiche precedentemente definite in presenza di portate ridotte il requisito di limitati tempi di riempimento tali da garantire la sopravvivenza cellulare non viene rispettato viceversa l impostazione di portate adeguate rispondenti alle specifiche ad esempio una portata spillata pari a 2x10 m s non consente lo sviluppo di un gradiente di concentrazione ottimale e richiede microcanali caratterizzati da lunghezze particolarmente elevate In o
152. nother approach based on the mixing of proportional flows of medium for cell cultures and drug was followed The designed device is the result of analytical calculations which exploit a lumped parameters approach and of numerical simulations that allowed the optimization of the characteristic dimensions of the microchannels Considering that density viscosity and diffusion coefficient of numerous liquids are comparable the system proves potentially useful for the screening of several drugs by adapting the widths of the microchannels with respect to the requested concentration values XXII Obiettivo della Tesi Obiettivo della Tesi Il presente lavoro nasce con l obiettivo di sviluppare un innovativo sistema microfluidico in grado di esporre una popolazione cellulare a diversi livelli di concentrazione di farmaco l applicazione considerata riguarda l ottimizzazione terapeutica per il trattamento dell osteoporosi in quanto consentir di correlare differenti concentrazioni di stronzio ranelato farmaco utilizzato per il trattamento di tale patologia con gli effetti riscontrati sul metabolismo cellulare La progettazione si avvale di modelli analitici e computazionali mentre l efficacia dei prototipi realizzati viene testata sperimentalmente avvalendosi di tecniche di microscopia a fluorescenza e della tecnologia Micro Particle Image Velocimetry con lo scopo di valutare il grado di miscelazione ed 1 livelli di concentrazione delle sp
153. nt Sulla base di 80 Capitolo 2 dati presenti in letteratura Hattori et al 2009 stata impostata una portata di 0 015 ul min per ognuno dei due ingressi del sistema Risultati ottimali sono stati ottenuti in presenza di microcanale centrale caratterizzato da ampiezza 530 um e profondit 50 um con ingressi dotati di ampiezza 260 um Come mostrato in figura 2 7 il primo punto di spillamento localizzato dopo 800 um mentre il successivo dopo ulteriori 250 um Le resistenze fluidodinamiche sono studiate per garantire le portate desiderate in ognuna delle tre linee portata spillata pari a 0 004 ul min 1 microcanali di spillamento sono caratterizzati da ampiezza 120 um e lunghezza 10 mm mentre 1l condotto destinato al pozzetto di scarto presenta ampiezza 250 um e lunghezza 14 9 mm La griglia di calcolo generata caratterizzata da 568232 elementi quadrilatero con infittimento in corrispondenza dei punti critici del dominio ovvero dove il condotto principale presenta delle biforcazioni La portata volumetrica stabilita in base ai dati presenti in letteratura stata garantita attraverso l imposizione di una condizione di velocit di 1 923x10 m s profilo piatto in ogni ingresso mentre in corrispondenza delle uscite del sistema stata adottata una condizione di pressione atmosferica Infine una condizione di no slip stata assunta alle pareti dei microcanali Il profilo di velocit visibile nella mappa colorimetrica riport
154. nte un chemoattrattore reagiscono migrando attraverso la membrana Keenan et al 2008 Significativi limiti della Boyden Chamber sono costituiti dall impossibilit di correlare specifiche risposte cellulari con particolari caratteristiche del gradiente quali pendenza sviluppo temporale e livelli di concentrazione della molecola in esame e dalla mancanza di una visione diretta delle cellule le cellule migrate devono essere fissate e colorate a posteriori Nel 1977 venne sviluppato il primo metodo in grado di fornire una visualizzazione diretta del comportamento cellulare in presenza di un gradiente di concentrazione il dispositivo noto come Zigmond Chamber figura 1 24 consiste di due canali paralleli incisi in una lastra di vetro separati da uno spaziatore glass ridge le cellule sono seminate su un vetrino che viene capovolto e posizionato sui canali lasciando un sottile gap di 3 10 um rispetto allo spaziatore in vetro Glass Coverslip Figura 1 24 Struttura di una Zigmond Chamber a e sezione trasversale del dispositivo b Keenan et al 2008 L aggiunta di 100 ul di mezzo di coltura nel sink channel e di 100 ul di soluzione contenente la biomolecola nel source channel determina la formazione di un gradiente in corrispondenza del gap cambiamenti nei processi di crescita e differenziamento cellulare ed eventuali migrazioni possono essere facilmente visualizzate mediante un microscopio Il gradiente di concentrazione ripr
155. o di miscelamento dovuto ad effetti convettivi 1 due fluidi inseriti devono presentare 1 medesimi valori di densit e viscosit ed in particolare il rapporto tra profondit e ampiezza del condotto deve essere Inferiore all unita per poter condurre a risultati ottimali Da sottolineare infine l utilizzo di valori medi di velocit e non dell effettivo campo vettoriale con conseguente generazione di un errore intrinseco nel calcolo della soluzione del problema in particolare l errore commesso risulta significativo in prossimit della parete proprio dove avviene lo spillamento 2 3 2 Simulazioni computazionali Le analisi preliminari condotte utilizzando 11 modello analitico sono state affiancate da simulazioni computazionali realizzate mediante 1l codice commerciale Fluent Ansys Inc Canonsburg PA USA comunemente utilizzato per la modellizzazione di molteplici fenomeni termofluidodinamici tra cui flussi di fluidi comprimibili o incomprimibili newtoniani o non newtoniani laminari o turbolenti in regime stazionario o tempo variante all interno di condotti bidimensionali o tridimensionali Le simulazioni effettuate hanno avuto come obiettivo la valutazione della diffusione dello stronzio ranelato all interno di medium per colture cellulari in un condotto a sezione rettangolare con canali di spillamento La soluzione del problema stata calcolata inizialmente in un dominio bidimensionale in condizioni di regime stazionario considera
156. o la fosfatasi alcalina e di ioni Ca e PO queste vescicole costituiscono 1 primi nuclei di mineralizzazione della matrice L osteoblasto contiene al suo interno delle granulazioni PAS positive dette Matrix Vescicoles o globuli calcificanti provvisti di membrana e ritenuti l agente che da il via al processo di mineralizzazione Tra le varie proteine secrete dall osteoblasto troviamo anche la procollagenasi enzima che deposto nella matrice verr trasformato nella sua forma attiva la collagenasi che sar impiegata dagli osteoclasti nella demolizione delle fibre di collagene L attivazione della procollagenasi a carico degli stessi osteoclasti che tramite una serie di proteine arrivano a disporre della collagenasi matura Una volta completata la sintesi della matrice ed avvenuta la sua calcificazione gli osteoblasti si sistemano in cavit ellissoidali non mineralizzate scavate nella matrice stessa definite lacune ossee In questa fase prendono il nome di osteociti e pur rimanendo cellule vitali entrano in uno stato di quiescenza pertanto gli osteociti rappresentano analogamente ai fibrociti un successivo stadio funzionale di una stessa cellula caratterizzati da un apparato del Golgi e da un reticolo endoplasmatico granulare poco sviluppati Tipici di queste cellule sono 1 lunghi prolungamenti citoplasmatici che decorrono all interno di microgallerie definite canalicoli ossei con cui la cellula attinge alle sostanze nutritizie al microsco
157. o di miscelamento indipendentemente dalle condizioni di flusso Distribution channel Confluent point Figura 1 46 Principio di generazione del gradiente di concentrazione dette a e b le lunghezze dei canali di distribuzione il rapporto di miscelazione b a Yamada et al 2006 a Cultivation x Detection Inlet 1 point Distribution channels Inlet branch channel Confluent points Confluent pont Figura 1 47 a Schema generale del dispositivo b ingrandimento del detection point c ingrandimento del punto di confluenza d ingrandimento della camera di coltura Yamada et al 2006 47 Capitolo 1 Utilizzando un equivalente elettrico tenendo conto del fatto che la viscosit dei due fluidi identica che le portate erogate dalle due pompe a siringa sono equivalenti ed infine che la larghezza e la profondit dei canali sono uguali nei due sistemi distributivi possibile concludere che la resistenza di ogni microcanale sia dipendente unicamente dalla lunghezza il rapporto di miscelamento dei due liquidi in corrispondenza del punto di confluenza quindi inversamente proporzionale al rapporto tra le lunghezze dei canali di miscelamento figura 1 46 Come visibile dall immagine in figura 1 47 sono stati inseriti nove micropozzetti di coltura a valle dei punti di confluenza la validazione del dispositivo stata effettuata mediante test colorimetrici La realizzazione tecnica prevede
158. o per creazione vettori M 1000 Infinito della sommatoria s zeros Z 1 Indice della matrice in cui si trova il primo valore da spillare Cic xl 0 q T 1 1 Vettore adimensionalizzato per lunghezza canale x WO tea fel le area ne a Ko O0s071 3 1 j y1 0 q 1 Vettore adimensionalizzato per larghezza canale yam Urga Yo 0g OUT1 zeros length y1 length x1 Matrice delle uscite soluzioni OUT2 zeros length y2 length x2 OUT3 zeros length y3 length x3 147 Appendice Calcoli per ottenere Cp ed lp A zeros Z 1 Costante da aggiungere ad OUT Ak zeros M Z Parametro da utilizzare per il calcolo di OUT EGC o Calcolo Cll 1 ae for i l M OUTI OUT1l 7 pi sin a falfa pa i cos I pi yl exp DRI OI 2 Pep 1 eSeqre Pe py 0 2441 2 rpi 2 x se end OUT1 0OUTl alfa Matrice della concentrazione lungo Al C_fin1 0UT1 length x1 Concentrazioni spillamento 1 media_l mean OUT1 Cm 1 1 mean OUT1 1 N 1 1 1 length x1l Vettore della media delle 6concentrazioni sulla larghezza di microcanale che continua il miscelamento Cs 1 1 mean OUT1 N 1 1 1 1 128 length xl1 Vettore della media delle S6concentrazioni sulla larghezza di microcanale che viene spillata surf O0UT1 Visualizzazione del profilo di concentrazione nel microcanale di s6miscelamento 1 fino al punto di spillamento toc Calcolo C 2 1 Co Definizione della costante A for i
159. o tenendo conto del fatto che 1 sistemi devono garantire un perfetto mescolamento delle due specie chimiche evitando che 1 nove pozzetti a valle siano riforniti con livelli di concentrazione disomogenei necessario Inoltre che 1 mixer siano compatti a causa del limitato spazio a disposizione Infine come sottolineato nel lavoro di tesi di Nason F e Romanelli E Approccio combinato sperimentale e computazionale per l analisi di micromixer passivi integrabili su lab on a chip il numero di Reynolds dovrebbe essere elevato Re 100 cos da attivare un processo di miscelamento efficace le portate inizialmente impostate sono state pensate anche in funzione di tale specifica Il modello di micromixer adottato prevede un profilo a dente di sega con sfasamento nullo tra creste e valli con profondit 500 um e sezione di passaggio pari al 20 100 um x 500 um di quella del condotto di uscita I tre sistemi di miscelazione proposti per l ottenimento delle concentrazioni 0 01 0 1 e 0 5 prevedono microcanali di ingresso di dimensioni differenti come Verr in seguito trattato ma sono caratterizzati da un tratto di uscita di lunghezza comune 1 734 mm 90 Capitolo 2 necessario per assicurare la generazione di un profilo sviluppato prima della ripartizione nei nove pozzetti di coltura I singoli segmenti del mixer presentano una lunghezza di 265 um mentre langolo tra due porzioni consecutive di 81 8 di ol 1 80 Figura 2 15
160. oducibile e matematicamente prevedibile anche se il tempo di vita limitato ad 1h le propriet del gradiente sono determinate esclusivamente dalle caratteristiche geometriche del dispositivo e dal coefficiente di diffusione della specie considerata e l evaporazione influenza sensibilmente le prove sperimentali 26 Capitolo 1 Un dispositivo molto simile ma affetto in misura minore dai problemi di evaporazione la Dunn Chamber figura 1 25 le camere di sink e source sono realizzate con anelli concentrici che possono essere riempiti con le appropriate soluzioni prima del posizionamento della lastra di vetro superiore seminata con le cellule senza l interfaccia aria liquido che determina 1 problemi di evaporazione del precedente metodo vantaggi e svantaggi sono quasi identici a quelli offerti dalla Zigmond Chamber a Coverslip Outer well Inner well Bridge Filling slit Coverslip i N WW Q jo sixy Figura 1 25 Struttura di una Dunn Chamber a e sezione trasversale del dispositivo b Keenan et al 2008 Esperimenti in vitro mediante 1 metodi tradizionali precedentemente illustrati hanno permesso di determinare le biomolecole capaci di indurre l attivazione di meccanismi chemotattici in alcuni tipi cellulari La necessit di comprendere l influenza che 1 gradienti di concentrazione possono avere sulla risposta cellulare e le modalit con cui un gradiente chimico sia in grado di modificare la
161. olazioni cellulari sottoposte alle differenti condizioni sperimentali Forma e dimensioni del dispositivo sono state stabilite dal gruppo di ricerca di Trento tenendo conto della tecnica di fabbricazione adottata Le due alternative proposte sono state una struttura circolare con diametro 9 cm ed una quadrata con lato 7 18 cm 2 3 Il progetto iniziale dispositivo per la generazione di un gradiente di concentrazione La progettazione del dispositivo stata inizialmente indirizzata verso un sistema di generazione di gradiente di concentrazione basato su spillamenti successivi due microcanali in cui sono inseriti medium per colture cellulari e stronzio ranelato confluiscono in un condotto centrale dal quale vengono spillate delle portate predeterminate con 1 livelli di concentrazione desiderati ottenuti unicamente mediante processi diffusivi figura 2 2 La soluzione adottata stata impostata su un sistema di generazione di gradiente di concentrazione del farmaco dotato di quattro spillamenti successivi per l ottenimento dei valori di concentrazione 0 01 0 1 0 5 e di un valore prossimo ad 1 dipendente dalla quantit di farmaco presente nella porzione superiore del condotto principale e non ancora diffusa Il livello 0 stato direttamente ottenuto dall ingresso contenente il medium Un prototipo della piattaforma microfluidica realizzato per ottimizzare la distribuzione dei diversi componenti mostrato in figura 2 1 il sistema prevede la di
162. omposto dai tre pozzetti centrali e due formati dai tre pozzetti laterali La progettazione del blocco centrale ha previsto la realizzazione di due condotti laterali con inclinazione 55 lunghezza 3 8 mm e ampiezza 500 um e di un canale centrale caratterizzato da una lunghezza di 3 2 mm e da una ampiezza di 500 um con restringimento graduale a 250 um calcoli effettuati tenendo conto delle perdite distribuite del progressivo restringimento e della suddivisione del flusso hanno evidenziato una caduta di pressione nei tre rami confrontabile e prossima ad 11 75 Pa Seguendo il medesimo principio 1 due sottosistemi laterali sono stati progettati con un canale centrale di lunghezza 3 3 mm ed ampiezza variabile tra 500 e 370 um e con canali laterali caratterizzati da ampiezza 500 um e lunghezze di 4 8 e 4 mm rispettivamente Le perdite di carico registrate sono prossime a 14 Pa La distribuzione delle portate alle sottounit costituite da tre pozzetti avviene attraverso due condotti laterali di circa 16 mm dotati di ampiezza variabile tra 350 e 500 um e mediante un microcanale destinato al blocco centrale caratterizzato da una lunghezza di 1 mm e da una ampiezza di 130 um la rete progettata determina una perdita complessiva nei tre sottosistemi di distribuzione di circa 240 Pa Il sistema di distribuzione stato successivamente valutato mediante simulazioni effettuate con il codice di calcolo Fluent a seguito delle quali come esposto nel relativo paragrafo
163. oncentration level 1 Extraction microchannel 7 100 Distribution microchannel 62 800 Table B Characteristic dimensions of the microchannels in the distribution network of the drug after numerical simulations XX Summary As an example in figure H a concentration map related to the mixing process into the mixer used to get the concentration level 0 1 1s showed The results of the experimental tests were subsequently compared with those of the 3D computational simulations performed with Fluent on the same geometry a good agreement was obtained as summarized in table D where the standard deviation of the concentration of rhodamine at the outlet is presented Medium inlet width Drug inlet width Medium flow un pae ake Drug flow rate Micromixer 0 5 200 200 Q 8 Q 8 Micromixer 0 1 300 100 0 9 4 Q 0 1 4 Q Micromixer 0 01 800 200 0 99 4 Q 0 01 4 Q Table C Characteristic dimensions and flow rates of the three mixing systems 1 00e 00 5 00e 01 0 00e 00 Figure H Concentration map for the mixer used to obtain the concentration level 0 1 Experimental data CFD data h 50um Q 3 pl min 0 3958 0 4285 h 210um Q 3 ul min 0 1759 0 2403 h 210um Q 0 3 ul min 0 0106 0 0534 Table D Standard deviation about the concentration of rhodamine at the exit point of the mixers comparison between experimental and computational data Finally experimental tests executed with a colorimetric assay for the detection of chlo
164. ono la manipolazione dei fluidi e l estensione di tali manipolazioni a piccoli volumi con un preciso controllo dinamico delle concentrazioni unito alla possibilit di esplorare nuovi fenomeni che avvengono alla microscala consentir probabilmente l affermazione della microfluidica nel panorama scientifico Whitesides 2006 1 2 1 Generazione di gradienti di concentrazione molecolari I gradienti di concentrazione biomolecolari rappresentano un importante meccanismo di segnale per guidare 1 processi di crescita migrazione e differenziamento cellulare all interno di un ambiente tridimensionale e dinamico come quello dei tessuti biologici Nel corso dello sviluppo embrionale gruppi selezionati di cellule producono molecole segnale proteiche che diffondono nell ambiente extracellulare la matrice extracellulare rappresenta dunque un ambiente dinamico in costante mutamento in cui si generano gradienti multipli di specifiche molecole in grado di evolversi nello spazio tempo I gradienti di concentrazione rivestono un importante ruolo nella risposta infiammatoria nei processi di guarigione delle ferite e nello sviluppo di masse tumorali durante 1 processi di reazione 23 Capitolo 1 immunitaria 1 gradienti biomolecolari giocano un ruolo essenziale fornendo alle cellule della linea linfocitaria al macrofagi ed ai granulociti importanti indicazioni per promuovere una rapida migrazione verso il sito di infezione numerose molecole proteiche ri
165. orrispondenza dei punti di intersezione Le concentrazioni 0 ed sono estratte immediatamente a valle delle pompe mentre le rimanenti tre concentrazioni sono ottenute attraverso l utilizzo di tre micromixer disposti nei punti di incrocio dei due circuiti La sostanziale differenza tra questa soluzione e quella proposta nel paragrafo 2 3 84 Capitolo 2 risiede nel fatto che le concentrazioni di farmaco desiderate vengono ottenute indipendentemente dalla cinetica di diffusione del farmaco stesso ci garantisce una maggior versatilit e quindi la possibilit di effettuare test con qualsiasi tipo di farmaco figura 2 11 Il dispositivo composto da una rete di microcanali mixer per la miscelazione di farmaco e mezzo di coltura e sistemi di distribuzione alle cellule E stata adottata una piattaforma circolare con diametro 9 cm Per quanto riguarda la tecnica di fabbricazione utilizzata si rimanda al paragrafo 1 3 DRUG INLET MEDIUM INLET Figura 2 11 Rappresentazione schematica del dispositivo microfluidico AI fine di ottenere un riempimento omogeneo dei pozzetti cellulari stato necessario ottimizzare le resistenze fluidodinamiche delle differenti porzioni di circuito con lo scopo di garantire uguali perdite di carico nei rami in parallelo e portate ottimali In corrispondenza di ogni punto di spillamento inoltre le perdite di carico presenti nelle due differenti reti fluidodinamiche devono essere identiche per sodd
166. osizione dei separatori inseriti possibile generare profili di concentrazione esponenziali polinomiali del quinto ordine radici cubiche e probabilmente di molteplici altre forme ampliando le tipologie di prove sperimentali realizzabili sulle cellule 33 Capitolo 1 c E J E uf AA se BB a cc a f DD e T Ril 5 ii sa E all pre W ki Zs nai f E bi si a Hof meal Normalized detance Figura 1 33 Microscopia a scansione elettronica del dispositivo a immagini in fluorescenza della distribuzione di FITC b e relativi profili di concentrazione rilevati in corrispondenza delle linee tratteggiate c Keenan et al 2008 La seconda sottoclasse di dispositivi denominata Flow Resistive Gradient Generator utilizza elementi resistivi posti tra la sorgente di biomolecole e 1 fluidi per minimizzare o eliminare la convezione che potrebbe alterare o danneggiare il gradiente di concentrazione il trasporto diffusivo dominante risultando in un profilo di concentrazione stabile tra source e sink reservoirs Le due principali strategie in grado di minimizzare gli effetti convettivi sono rappresentate dalla connessione tra source e sink mediante una camera riempita con idrogeli o dalla possibilit di utilizzare sottili fessure e microcanali Il numero di P clet Pe identifica il rapporto tra un termine di trasporto convettivo ed uno di tipo diffusivo e viene espr
167. osto su Lab on a chip Kim et al 2008 riprende in modo molto evidente il principio della generazione di gradienti di concentrazione lineari o logaritmici mediante ottimizzazione delle portate di due fluidi convergenti in precisi punti di controllo i rapporti di diluizione risultano quasi indipendenti dai flussi impostati sulla pompa a siringa e dal coefficiente di 52 Capitolo 1 diffusione delle molecole considerate Questa tipologia di piattaforme microfluidiche si dimostra compatta e versatile grazie alla possibilit di modificare in modo semplice ed intuitivo 1 livelli di concentrazione di un farmaco attraverso la sola manipolazione delle resistenze fluidodinamiche del circuito rappresentato mediante una rete resistiva l elevata scalabilit del sistema figura 1 54 rende dunque tale approccio molto interessante per ulteriori sviluppi futuri nel campo della microfluidica e della biologia cellulare molecolare eer ilet lix region Mixing region Mizin ord i Acer T diiutioga Mixer Pa dia Mixer 3 Ca I C C Figura 1 54 Schema del sistema microfluidico Kim et al 2008 La concentrazione ad ogni step determinata dalla portata di due fluidi un buffer ed una generica drug in corrispondenza di punti di giunzione specifici dopo che la specie chimica da diluire Qp entrata in contatto con il buffer Qs la soluzione procede all interno di una regione di miscelazione una parte della soluzione v
168. otico considerando soltanto il fattore et 13 Capitolo I Changes in Bone Mass with Age 1000 Fracture Threshold BONE MASS grams of calcium Ol S O 0 20 40 60 80 100 AGE years Figura 1 14 Cambiamenti nella massa ossea in relazione all et del soggetto dopo un picco raggiunto all inizio dell et adulta si assiste ad un progressivo decadimento in particolare nei soggetti femminili dopo la menopausa la soglia di frattura teorica ma sottolinea come la diminuzione di massa ossea incrementi il rischio di fratture in modo significativo Mundy 2000 Fattori di carattere genetico rivestono un ruolo fondamentale nel livello di massa ossea raggiunta numerosi studi condotti da diversi gruppi di ricerca Morrison et al 1994 Garnero et al 1996 sono focalizzati sulla necessit di chiarire il funzionamento del gene del recettore cellulare della vitamina D del collagene di tipo I delle interleuchine 6 e dei transforming growth factors 6 con lo scopo di individuare l importanza relativa di ciascuno di essi nel livello di massa ossea raggiunta da ogni individuo Mundy 2000 Le due principali tipologie di osteoporosi hanno effetti differenti sul tipo di perdita ossea l osteoporosi di tipo I sembra colpire maggiormente l osso trabecolare mentre quella di tipo II ha effetti sia sull osso corticale che su quello spongioso entrambe le tipologie di osteoporosi incrementano il rischio di fratture
169. particelle utilizzate l avvento dei sistemi uPIV ha portato ad un significativo miglioramento delle prestazioni consentendo di superare limiti ritenuti fino a pochi anni prima insormontabili Technique LDA Optical Doppler tomography ODT Optical How using video MIcroscopy Optical flow using A ray imaging Uncaged uorescent dyes Particle streak velocimetry PIV Super resolution PIV pPIV Ply PIV Author Tieu et al 1 995 Chen et al 1997 Hitt et al 1996 Lanzillotto et al 1946 Paul et al 1997 Brody et al 1946 Urushihara et al 1 443 Keane et al 1 9495 Santiago et al 1948 Meinhart et al 1999 Vester weel et al 2004 Plow Tracer prn oxo x 10 1 7 um ox 15 pol vetyrene beack Sum blood 20 x 20 x 20 celle 1 20 um 20 40 emulsi n droplets Molecular 100 x 20 x 20 Dye 0 4 premi ew 10 polystyrene beack l yam oil 280 x 28580 x 200 droplets Lum ail 50 x 50 x 200 droplets JUU mm 69 x 69 x 1 6 pol vetyrene particles 200 nm 50 x Li x 28 polvstvrene particles 500 nm 05x05 x 2 0 polystyrene particles Spatial Resolution Observatio r 4 5 fringes limits velocity resolution Can image through highly scattering mecha In vivo study of blood flow Can image without optical access Resolution limited by molecular diffusion Particle streak velocimetry Turbulent flows Particle track ing velocimetry Hele
170. pecie chimiche accoppiata alla spettroscopia di massa Ramsey et al 1997 lo sviluppo e la sintesi di nuovi farmaci Dittrich et al 2006 analisi biochimiche Whitesides et al 2003 la manipolazione di campioni costituiti da singole cellule o molecole Wheeler et al 2003 la generazione controllata di bolle Ganan Calvo et al 2001 o gocce di liquidi Thorsen et al 2001 all interno di un flusso continuo La biologia cellulare rappresenta un campo di ricerca in cui la microfluidica pu apportare significative innovazioni le cellule eucariote presentano un diametro medio compreso tra 10 e 100 um che ben si adatta alle dimensioni dei pi innovativi dispositivi microfluidici figure 1 19 e 1 20 il PDMS grazie alla trasparenza ottica all elevata permeabilit ai gas e all ottima risposta evidenziata nei test di citotossicit costituisce un materiale adatto per la creazione di microcamere in cui coltivare cellule ed osservarne il comportamento calcolare le forze esercitate sul substrato al quale sono adese studiarne 11 citoscheletro Hung et al 2005 Figura 1 20 Semplice ed economico dispositivo microfluidico utilizzato in immunocitochimica nel dettaglio sono mostrate valvole controllabili manualmente dall operatore Whitesides 2006 ZZ Capitolo 1 La microfluidica ancora agli albori ed il suo impatto sulla scienza non ancora stato rivoluzionario le principali problematiche risiedono nella capacit
171. pio elettronico si pu osservare che tra la matrice calcificata e la membrana plasmatica presente uno spazio occupato da glicoproteine e liquido interstiziale I canalicoli possono anche intersecarsi cosicch non solo pi osteociti sono in contatto tra loro ma anche 1l liquido interstiziale giunge a cellule poste lontano dalla sorgente nutritizia Gli 8 Capitolo 1 osteociti non rappresentano solo un mero alter ego degli osteoblasti questi ultimi possono essere controllati dai primi mediante opportuni segnali qualora vi sia bisogno di deporre matrice ossea Inoltre gli osteociti possedendo recettori di membrana per l ormone paratiroideo PTH controllano anche l azione degli osteoclasti questi rappresentano una tipologia di cellule plurmucleata di grosse dimensioni 20 100 um derivante dalla fusione di diversi monociti e situata all interno di fossette dette lacune di Howship deputata a produrre e secernere enzimi che agiscono degradando la matrice calcificata permettendo 1l riassorbimento dell osso figura 1 10 Questi enzimi entrano in gioco sia nei processi di crescita durante 1 quali necessaria la sostituzione del tessuto osseo immaturo non lamellare in tessuto osseo lamellare adulto sia per permettere le successive rimodellazioni dell osso mE pr it ky F i ila G e J j sti rat bt Ane y tali mA A da 4 i t hen Figura 1 10 Sezione istologica rappresentante osteoclasti all in
172. poral and spatial concentration gradients using microfluidic devices Lab Chip 2004 4 164 167 154 Bibliografia Lin F Nguyen CMC Wang SJ Saadi W Gross SP Jeon NL Neutrophil migration in opposing chemoattractant gradients using microfluidic chemotaxis devices Annals of Biomedical Engineering 2005 33 475 482 Liu D Wang L Zhong R Li B Ye N Liu X Lin B Parallel microfluidic networks for studying cellular response to chemical modulation Journal of Biotechnology 2007 131 286 292 Liu L Cao W Wu J Wen W Chang DC Sheng P Design and integration of an all in one biomicrofluidic chip Biomicrofluidics 2008 2 034103 1 034103 8 Mahto SK Yoon TH Shin H Rhee SW Multicompartmented microfluidic device for characterization of dose dependent cadmium cytotoxicity in BALB 3T3 fibroblast cells Biomed Microdevices 2009 11 401 411 Manuale utente di Ansys Fluent 12 0 2009 Ansys Inc Canonsburg PA USA Mao H Cremer PS Manson MD A sensitive versatile microfluidic assay for bacterial chemotaxis Proc Natl Acad Sci USA 2003 100 9 5449 5454 Meinhart CD Wereley ST Santiago JG PIV measurements of a microchannel flow Exp Fluids 1999 27 414 419 Migliavacca F Dispense del corso di Biomeccanica 2008 Morra M Occhiello E Marola R Garbassi F Humphrey P Johnson D On the aging of oxygen plasma treated polydimethylsiloxane surfaces J Colloid Interface Sci 1990 137 11 24 Morrison
173. propriet di non fluorescenza le principali caratteristiche che rendono questo materiale indicato per la realizzazione di dispositivi microfluidici o di singoli componenti figure 1 64 e 1 65 sono il comportamento elastomerico la permeabilit al gas e le propriet di superficie Permeabilit La permeabilit rappresentata dal prodotto tra coefficiente di diffusione e coefficiente di solubilit di un determinato soluto ad una precisa temperatura la permeabilit dei silossani significativamente pi elevata di quella di altri materiali elastomerici l innalzamento della temperatura determina un incremento del coefficiente di diffusione ma una diminuzione del 63 Capitolo I coefficiente di solubilit con risultante decremento del valore di permeabilit Sebbene la permeabilit sia vantaggiosa in alcune applicazioni come nella realizzazione di membrane per separazione di gas graft sintetici per il trattamento di grandi ustionati lenti a contatto morbide ossigenatori nei dispositivi microfluidici essa potrebbe influenzare 1 risultati sperimentali a causa di fenomeni di evaporazione o di cambio di pH a causa della diffusione di CO2 l evaporazione rappresenta una significativa minaccia per le applicazioni in cui sono coinvolti ridotti volumi di campione questa pu essere sensibilmente ridotta presaturando il PDMS con un liquido o incrementando la quantit di agente reticolante utilizzato in fase di polimerizzazione viene
174. rato in figura 1 66 pu essere annullato attraverso il lavaggio della superficie in una soluzione acquosa all 1 di sodiododecilsolfato SDS seguito da un risciacquo in eptano Delamarche et al 1997 67 Capitolo 1 1 3 4 Microfabbricazione di un dispositivo microfluidico Viene ora riportato a titolo esemplificativo l intero processo di fabbricazione di un semplice dispositivo microfluidico le tappe principali figura 1 68 sono analoghe a quelle seguite per la realizzazione di numerosi sistemi riportati nel paragrafo 1 2 2 A Fabricate master by rapid prototyping B Place posts to define reservoirs Ly C Cast prepolymer and cure Remove PDMS replica from master E Oxidize PDM replica and flat in plasma and seal replica e 8 fiat L_ Figura 1 68 Schema relativo alla microfabbricazione di un dispositivo microfluidico Duffy et al 1998 1 3 4 1 Rapid prototyping del master Il disegno del dispositivo e della rete di microcanali viene realizzato mediante software CAD cui segue la fabbricazione della maschera che verr utilizzata nel processo di fotolitografia come riportato da Duffy e colleghi 1998 utilizzato un substrato in silicio rivestito con uno strato di positive resist deposizione mediante spin coating 5000 rpm per 20 s dello spessore di 55 um definizione della profondit dei condotti su cui possibile definire particolari con limite di risoluzione 2
175. relative ai test sperimentali eseguiti su micromixer con canale ricurvo figura 3 5 con del semplice colorante alimentare E124 le acquisizioni sono state realizzate mediante stereo microscopio Nikon e videocamera Nikon SMZS800 I micromixer analizzati presentano una geometria differente rispetto a quelli utilizzati nel dispositivo progettato nel presente lavoro di tesi e sono stati realizzati dal gruppo di ricerca BioMEMS della fondazione FBK unicamente come prototipi al fine di valutare ed ottimizzare il processo di microfabbricazione 1 test sperimentali eseguiti presso il Politecnico di Milano sono stati effettuati prima di procedere con la progettazione del dispositivo microfluidico 115 Capitolo 3 Figura 3 5 Immagine ottenuta mediante stereo microscopio del micromixer Come mostrato in figura 3 6 e 3 7 possibile osservare il diverso posizionamento dell interfaccia presente tra colorante ed acqua deionizzata al variare della portata impostata sulla pompa a siringa in presenza di portate di 10 20 ul min il processo diffusivo risulta fortemente limitato se confrontato con la prova eseguita imponendo una portata di 3 ul min Figura 3 6 Diffusione del colorante in acqua deionizzata con portate di 3 ul min sinistra e 10 ul min destra 116 Capitolo 3 Figura 3 7 Variazione del grado di miscelazione di colorante e acqua deionizzata in presenza di portate di 3 ul min sinistra e 20 ul min destra
176. resenta tuttavia una serie di problematiche tecniche la cui risoluzione sar fondamentale per poter ottimizzare 1 processi di microfabbricazione basati sulla soft lithography e riduzione in volume prossima all 1 a seguito del processo di reticolazione e possibilit di rigonfiamento in presenza di solventi organici apolari fra cui esano e toluene e elasticit e l espansione termica limitano la possibilit di ottenere accuratezza estremamente elevata su superfici particolarmente estese 1 processi di nanofabbricazione risultano quindi problematici e limitazioni nel parametro aspect ratio rapporto tra altezza e larghezza delle strutture create in presenza di aspect ratio eccessivamente elevati o particolarmente ridotti le 66 Capitolo 1 microstrutture in PDMS possono deformarsi o distorcersi come evidenziato in figura 1 66 Delamarche et al 1997 hanno sottolineato come il parametro aspect ratio debba essere compreso tra 0 2 e 2 per ridurre al minimo la probabilit di generazione di difetti ae Id be ry 1 0 99lo Deformation of PDMS Sagging Figura 1 66 Principali problematiche legate al parametro aspect ratio nel PDMS Xia et al 1998 Figura 1 67 Esempi di dispositivi microfluidici realizzati interamente in PDMS microscopie ottiche ottenute con ingrandimento 40x Attualmente sono in fase di studio diverse tecniche per ridurre le problematiche individuate il fenomeno di pairing most
177. rides allowed to identify the diffusion coefficient of strontium chloride approximately equal to 3x10 m s A value of 1x107 m s was set for the numerical simulations in order to guarantee a safety limit to the mixing process into the micromixers XXI Summary The flow distributors simulations highlighted a mean flow rate through everyone of the 36 holes of 1 5431x10 m s with a standard deviation of 0 0225x10 m s indicating an homogeneous distribution of the flow to the culture shaft Conclusions The design of a device able to generate several concentrations of drug initially set on a mechanism of successive extraction points was directed to a system based on the mixing of proportional flows of medium for cell culture and drug able to generate the established concentrations of strontium ranelate The recorded data from the several simulations showed that a project based on subsequent withdrawals is incompatible with the fixed requirements small flow rates imply long filling times therefore the cellular survival is not assured on the other side adequate flows with respect to the requirements don t make possible the development of an optimal concentration gradient and need very long microchannels A device exclusively based on diffusive processes and extraction microchannels is strongly influenced by the value of the diffusion coefficient by fabrication defects and by particular experimental conditions for these reasons a
178. riferimento drug inlet concentration gradient medium inlet ERA syeys Figura 2 2 Modello di dispositivo microfluidico basato su spillamenti successivi Il codice calcola le portate in ingresso al dispositivo di farmaco e mezzo di coltura il valor medio dei vettori velocit in ogni singolo tratto ed il numero di P clet equazione 1 2 Tali parametri sono utilizzati per la definizione dei livelli di concentrazione di farmaco valutati punto per punto grazie alla definizione di una griglia di discretizzazione del dominio e per 11 calcolo delle distanze alle quali effettuare gli spillamenti destinati alle colture cellulari In figura 2 3 viene riportato uno schema del modello bidimensionale implementato mediante codice Matlab per il calcolo del profilo di concentrazione del farmaco a seguito del processo diffusivo corredato dalla relativa equazione Wu et al 2005 direttamente ricavata dalle leggi di Fick 75 Capitolo 2 de cy 0 Bc Ax x o0 y 0 y 1 a ae 2 sin nan In n c x y y YEAR cos nay Jexp x a 2 1 IT n n Pe N Pe 4n 7 n 1 2 3 Figura 2 3 Modello analitico utilizzato per il calcolo del profilo di concentrazione del farmaco Wu et al 2005 Le grandezze caratterizzate dal simbolo rappresentano parametri adimensionali assumendo Co come concentrazione di riferimento e l ampiezza del condotto W come dimensione caratteristica del problema v
179. rmaco colorato mediante kit Aquanal in acqua deionizzata ingrandimenti 20x relativi all ingresso del sistema sinistra e al punto di uscita destra 119 Capitolo 3 Le immagini acquisite con videocamera Nikon SMZS800 sono state analizzate mediante software Paint Shop Pro 9 e Matlab R2009a con lo scopo di estrarre 1 profili di concentrazione del farmaco all interno del microcanale 1 dati sono stati raccolti a distanze di 1 mm e 2 mm dal punto di confluenza dei condotti di ingresso 1 livelli di grigio di ogni pixel sono stati normalizzati rispetto al valori registrati in corrispondenza dei due ingressi del sistema Parallelamente utilizzando 1l programma scritto in codice Matlab presentato nel capitolo 2 in grado di calcolare il profilo di concentrazione di una data specie chimica dati in ingresso portate diffusivit e dimensioni caratteristiche del microcanale sono state estratte le curve analitiche di distribuzione del farmaco al variare del coefficiente di diffusione come mostrato nei grafici allegati in figura 3 11 e 3 12 il confronto tra le curve sperimentali e analitiche indica un coefficiente di diffusione dello stronzio 9 2 cloruro prossimo a 3x10 m s 1 2 0 8 0 6 0 4 0 2 Concentrazione 0 20 40 60 80 100 120 140 Ampiezza microcanale D 1e 9 D 8e 9 D 5e 9 Experimental data Figura 3 11 Profilo di concentrazione dello stronzio cloruro in acqua deionizzata
180. rumento di stampa per il trasferimento di micro pattern il recente sviluppo dei sistemi BioMEMS biosistemi microelettromeccanici ha comportato un notevole incremento nell utilizzo del PDMS per la fabbricazione di dispositivi per PCR polymerase chain reaction microarray technology per la valutazione dell espressione genica di popolazioni cellulari e per l analisi di mutazioni genetiche capillary electrophoresis e per la realizzazione di molteplici altre piattaforme tecnologiche Il settore della microfluidica caratterizzato dalla costante presenza del polidimetilsilossano nei sistemi analitici microfluidici il PDMS rappresenta il materiale con cui sono realizzati 1 microcanali il fluido di interesse viene pompato all interno dei condotti in modo elettrocinetico o attraverso differenze di pressione e analizzato all uscita del circuito I dispositivi microfluidici utilizzano volumi estremamente ridotti di campioni e si basano in genere su processi diffusivi per garantire il miscelamento dei reagenti di 61 Capitolo 1 interesse di conseguenza 1 canali sono estremamente lunghi e sottili ed il rapporto superficie volume significativamente elevato nel momento in cui il microcanale vuoto viene riempito con il fluido di interesse 1 siti idrofobici presenti sulla superficie del PDMS interagiscono con il campione modificando potenzialmente il contenuto del fluido stesso per evitare tale problema necessario conoscere quali molecole pr
181. se iniziano a presentarsi fenomeni di diffrazione in campo vicino o diffrazione di Fresnel e Configurazione projection un sistema di lenti viene interposto tra maschera e substrato la capacit di trasferire in modo ottimale 11 substrato dipende dalla qualit del sistema ottico fenomeni di diffrazione in campo lontano o diffrazione di Fraunhofer limitano la risoluzione del sistema Light source Light source Light source lt D E Condenser lens gt ea Mask es ass Resist w_E ms Wafer o Water Objective Qu lens gt i CD Critical Dimension Resolution Figura 1 60 Configurazioni del sistema nella fotolitografia Sordan Dispense del corso di Micro Nano Fabbricazione 2009 58 Capitolo I Il limite di risoluzione W delle tecniche litografiche di tipo contact e proximity dipendente dalla lunghezza d onda della radiazione utilizzata lunghezza d onda generalmente compresa tra 193 nm e 245 nm e dalla distanza g tra maschera e fotoresist come evidente dalla seguente espressione Wun A 8 1 6 Il limite di risoluzione delle tecniche basate su un approccio projection espresso dal criterio di Rayleigh R 1 7 in cui rappresenta la lunghezza d onda della radiazione utilizzata NA l apertura numerica della lente dipendente a sua volta dall indice di rifrazione del mezzo interposto e dal semiangolo a del cono di luce che entra nella lente e K
182. search field 1s represented by the study of bone metabolic diseases and particularly of osteoporosis defined by Floman as an age related disease characterized by a progressive decrease in bone mass and by the modification of the entire bone architecture figure B Bono et al 2003 Numerous therapies for the treatment of osteoporosis are based on the attempt to limit osteoclasts activity or to stimulate osteoblasts activity and the related processes of cellular proliferation and differentiation Several regulatory factors can promote the capability to deposit new bone matrix nevertheless the benefit that such molecules give on osteoblasts activity is balanced by potential toxic effects that they can take on other tissues and by several collateral effects Moreover the benefits given by several drugs are obtainable only with adequate concentrations in the bone microenvironment for this reason future developments of therapies based on growth factors or other molecules will demand an effective release mechanism so that it will be possible to reach the desired concentration in the site of interest A group of molecules able to promote osteoblasts activity and at the same time limit bone resorption by osteoclasts is represented by the so called DABA dual action bone agents among which there is strontium ranelate object of study of several recent researches ys de LI f si i cay i ae a q a ALI x an x Ml ie e e Me vi a 9 48
183. sensibilit cellulare ad un secondo gradiente hanno portato allo sviluppo di dispositivi avanzati in grado di produrre uno o pi gradienti contemporaneamente con un andamento spazio temporale controllabile dall operatore Keenan et al 2008 1 2 1 2 Tecnologie microfluidiche per la generazione di gradienti di concentrazione I dispositivi microfluidici presentano vantaggi pratici se confrontati con 1 dispositivi tradizionali possibile incrementare la velocit degli esperimenti riducendone al contempo 1 costi l utilizzo di volumi ridotti limita gli sprechi di costosi reagenti mentre la natura parallela dei processi di microfabbricazione consente di creare dispositivi dotati delle medesime caratteristiche Dispositivi microfluidici sono stati utilizzati per infettare cellule con concentrazioni note di virus Walker et al 2004 per generare gradienti di sforzi meccanici Zaari et al 2004 di biomolecole proteiche 27 Capitolo 1 adesive in grado di mediare 1 processi di adesione cellulare ad un substrato Burdick et al 2004 e di specie chimiche in grado di indurre la migrazione chemotattica di batteri Mao et al 2003 e cellule eucariote Jeon et al 2002 Una delle strategie pi semplici per creare gradienti di concentrazione l adsorbimento selettivo di biomolecole di interesse sul substrato di coltura delle cellule figure 1 26 e 1 27 la stabilit del gradiente dipende dalla reazione di attacco al substrato dell
184. sferisce 11 mezzo di coltura arricchito dagli ioni metallici a 50 camere di coltura con dimensioni 500x500 um e profondit 100 um i pozzetti sono disposti in serie a gruppi di cinque ed al loro interno le cellule sperimentano uno sforzo di taglio di soli 0 1 dyn cm significativamente inferiore rispetto al valore critico in grado di inibire il processo di adesione Il gruppo di Tirella ha progettato una piattaforma in grado di generare un profilo di concentrazione sigmoidale utilizzando un sistema di diluizione piramidale basato sul modello realizzato originariamente da Whitesides e colleghi Takayama et al 1999 la piattaforma mostrata in figura 1 53 prevede una serie di mescolamenti successivi fino alla generazione di sei canali entranti in un unica camera di coltura con dimensioni caratteristiche 14 6 mm e 20 mm 1 canali di distribuzione presentano una larghezza di 1 6 mm ed una profondit di 250 um Tirella e colleghi osservano come la possibilit di realizzare profili di concentrazione con notevole pendenza sia legata all impostazione di portate elevate che possono tuttavia generare sforzi di taglio eccessivi sulle cellule con compromissione dell adesione o della funzionalit delle stesse Surface Concentration molim 1 Max 1 0 Y axis axis Figura 1 53 Schema del dispositivo e modello di miscelazione realizzato mediante COMSOL COMSOL AB Stockholm Sweden Tirella et al 2008 Un recente dispositivo prop
185. si e relativo substrato RBG a miscelatore sviluppato da Holden et al 2003 b dispositivo utilizzato per infettare una popolazione cellulare con un gradiente di concentrazione di baculovirus da Walker et al 2004 c e sistema utilizzato per lo studio della chemotassi batterica d Keenan et al 2008 32 Capitolo 1 Il Premixer Gradient Generator Jeon et al 2000 si basa sulla possibilit di suddividere e ricombinare in modo ottimale 1 flussi in ingresso attraverso un mixer posto a monte del microcanale consentendo in tal modo di generare profili di concentrazione pi complessi rispetto al modello precedentemente descritto tuttavia la presenza della rete piramidale di miscelamento comporta un sensibile incremento del volume di priming del dispositivo oltre che del tempo necessario per qualsiasi modifica dinamica del gradiente figura 1 32 a Coverslip inlets PDMS Gradient across channel Neutrophils Coverslip gt n n z n c nd 0 100 200 300 0 100 200 300 400 500 0 100 200 300 Channel width um Figura 1 32 Schema del dispositivo a e profili di concentrazione ottenibili mediante modifiche della rete di miscelazione b Keenan et al 2008 Il modello Universal Gradient Generator figura 1 33 sviluppato da Irimia et al 2006 utilizza una serie di barriere fisiche per controllare la diffusione di specie chimiche tra pacchetti fluidi adiacenti modificando la p
186. siapatite cos da ridurre il contenuto di calcio presente nel sangue omeostasi del calcio Oltre alle variazioni continue della calcemia esistono numerosi meccanismi ormonali che stimolano o inibiscono l attivit di osteoblasti ed osteoclasti diverse condizioni genetiche patologiche e di 11 Capitolo I stile di vita influiscono notevolmente sulla loro regolazione La figura 1 11 illustra in modo semplificato il flusso e la trasformazione di materiali maggiormente coinvolti nella continua rigenerazione ossea Nell infanzia e in giovent gli osteoblasti lavorano in misura maggiore rispetto agli osteoclasti per cui il tessuto osseo cresce intorno ai trent anni la massima massa ossea stata raggiunta e progressivamente prendono il sopravvento gli osteoclasti con la propria funzione di scomposizione infine durante la senescenza la massa ossea diminuisce a causa della superiore forza applicata SEZIONE attivit degli osteoclasti Rimod resistente russarbimento erescila oo eH osseo nat is af aya E lt E 1 pane l a imiy Crescita riissorbmento Figura 1 12 Schema relativo all omeostasi meccanica dell osso Migliavacca Dispense del corso di Biomeccanica 2008 Lo schema riportato in figura 1 12 mostra 1 punti salienti della cosiddetta omeostasi meccanica crescita ossea con apposizione di nuova matrice e riassorbimento sono regolati sulla base dei carichi applicati sulla s
187. sioni caratteristiche dei micromixer Le simulazioni computazionali effettuate sui micromixer hanno evidenziato un ottimale livello di miscelazione con una distribuzione omogenea di farmaco all interno del mezzo di coltura in corrispondenza del punto di uscita A titolo di esempio in figura H viene mostrata una mappa di concentrazione relativa al processo di miscelazione all interno del mixer utilizzato per l ottenimento del livello di concentrazione 0 1 I risultati dei test sperimentali effettuati sono stati confrontati con quelli relativi alle simulazioni computazionali 3D condotte mediante Fluent sulla medesima geometria 1 dati estratti dalle simulazioni numeriche sembrano concordare con un ridotto margine di errore con 1 valori sperimentali come riassunto in tabella D in cui viene riportata la deviazione standard sulla concentrazione di rodamina in uscita al sistema Larghezza Larghezza ingresso ingresso farmaco Portata mezzo ee mezzo um lanl farmaco Micromixer 0 5 200 200 Q 8 Q 8 Micromixer 0 1 300 100 0 9 4 Q 0 1 4 Q Micromixer 0 01 800 200 0 99 4 Q 0 01 4 Q Tabella C Dimensioni e portate relative ai tre sistemi di miscelazione NI Figura H Mappa di concentrazione relativa al processo di miscelazione all interno del mixer utilizzato per l ottenimento del livello di concentrazione 0 1 1 00e 00 5 00e 01 0 00e 00 Sperimentale CFD h 50um Q 3 ul min 0 3958 0 4285 h 210um Q 3 ul min 0 1759 0 24
188. sition m Figura 2 10 Profilo di concentrazione del farmaco in funzione dell ampiezza del microcanale 600 um in corrispondenza del punto di spillamento 2 4 La soluzione progettuale sviluppata dispositivo microfluidico innovativo Nel paragrafo precedente stata mostrata la progettazione di due possibili soluzioni per la realizzazione di un dispositivo in grado di generare un gradiente di concentrazione di farmaco su una popolazione cellulare un sistema basato unicamente sul processo diffusivo e sull inserimento di microcanali di spillamento ha evidenziato la presenza di numerose problematiche progettuali dovute principalmente alla difficolt di ottimizzare le portate desiderate 1 tempi di riempimento dei pozzetti di coltura ed 1 livelli di concentrazione del farmaco Nei seguenti paragrafi viene proposta una soluzione basata sulla miscelazione di portate proporzionali di mezzo di coltura e farmaco in grado di generare le concentrazioni richieste e allo stesso tempo erogare portate che permettano un rapido riempimento dei pozzetti 2 4 1 Progettazione e ottimizzazione del dispositivo Il sistema microfluidico prevede due differenti reti per l erogazione del farmaco e del mezzo di coltura mediante due pompe a siringa 1 condotti principali sono disposti sulla circonferenza del dispositivo in PDMS mentre canali di spillamento adeguatamente progettati consentono l estrazione di portate proporzionali di fluido che si misceleranno in c
189. so L utilizzo di bifosfonati figura 1 16 tra cui etidronato pamidronato alendronato e risedronato sembra invece essere in grado di limitare l azione degli osteoclasti senza effetti significativi sull attivit degli osteoblasti R O O I o P__C_P_0 cy R cy 2 Figura 1 16 Struttura chimica di un bifosfonato possibile osservare i due gruppi fosfato e le due catene laterali R ed R La catena laterale lunga R determina le propriet chimiche la modalit di azione e la potenza del farmaco mentre la catena corta R responsabile delle propriet chimiche e della farmacocinetica del composto In particolare 1 bifosfonati possono essere suddivisi in azotati e non azotati a seconda della presenza di un atomo di azoto nella formula di struttura 1 bifosfonati non azotati vengono metabolizzati in un composto che in grado di competere con l adenosina trifosfato responsabile del metabolismo energetico della cellula a seguito di tale processo l osteoclasto procede verso uno stato di esaurimento energetico e conseguente apoptosi I bifosfonati contenenti azoto sono in grado di interferire con la trasmissione dei segnali cellulari richiesti per la proliferazione degli osteoclasti comportando alterazioni morfologiche nelle cellule ed infine apoptosi La calcitonina polipeptide normalmente sintetizzato dalle cellule C parafollicolari della tiroide blocca l attivit di riassorbimento osseo degli osteoclasti ed incre
190. spillamento del livello 0 di concentrazione la griglia di calcolo stata realizzata con 1560000 celle esaedriche mentre come condizioni al contorno sono state imposte una portata Q pari a 0 0000002 m s in ingresso una portata pari a Q 4 in corrispondenza del ramo di spillamento ed una pressione di 11241 Pa nel condotto di distribuzione 11 microcanale destinato al trasferimento del mezzo di coltura ai pozzetti stato modificato rispetto ai calcoli analitici date le elevate perdite di carico generate ed 1l conseguente squilibrio del sistema la lunghezza del condotto in esame passata da 3 3 a 7 3 mm mantenendo una larghezza di 100 um Le cadute di pressione rilevate nei due rami di circuito dalla zona di spillamento ai punti posti a pressione atmosferica sono quindi risultate di 13229 Pa e 13177 Pa con un errore dello 0 39 In figura 2 31 mostrato il particolare del punto di spillamento con la notevole perdita di carico registrata necessaria per l equilibrio generale della rete di distribuzione del mezzo di coltura 1 42e 04 9 40e 03 4 40e 03 Figura 2 31 Mappa colorimetrica di pressione Pa relativa al punto di spillamento della concentrazione di farmaco 0 Simulazioni numeriche della rete di distribuzione del farmaco Analogamente a quanto trattato nel precedente paragrafo sono state realizzate le simulazioni numeriche relative alla rete di distribuzione del farmaco L equilibrio del sistema ha imposto la realizzazione
191. sposizione della rete di microcanali e dei pozzetti di coltura in una struttura circolare di diametro pari a 12 cm D A M A 4 oe ee i Figura 2 1 Prototipo iniziale della piattaforma microfluidica 74 Capitolo 2 2 3 1 Modello analitico Le analisi sono state condotte mediante l utilizzo di due software scritti in codice Matlab The Mathworks Inc riportati in Appendice realizzati in un precedente progetto di tesi e ottimizzati per le specifiche esigenze del presente lavoro a partire dalle equazioni riportate negli articoli di Gorman et al 2008 e di Wu et al 2005 Il primo consente di valutare il profilo di concentrazione del farmaco nel microcanale di riferimento mentre il secondo permette di ricavare le distanze di spillamento ottimali tali da garantire un valor medio di concentrazione desiderato una volta impostate le condizioni al contorno Queste dipendono da alcuni parametri che l utente deve inserire e Coefficiente di diffusione della specie chimica considerata e Numero di canali di spillamento presenti nel dispositivo e Portata desiderata in ognuno dei microcanali di spillamento e Valori medi dei livelli di concentrazione di farmaco richiesti in ogni pozzetto e Larghezza e profondit del condotto principale di
192. st formation and resorption in vitro Bone 2008 42 129 138 Bono CM Einhorn TA Overview of osteoporosis pathophysiology and determinants of bone strength Eur Spine J 2003 12 Suppl 2 S90 S96 Burdick JA Khademhosseini A Langer R Fabrication of gradient hydrogels using a microfluidics photopolymerization process Langmuir 2004 20 13 5153 5156 Campbell K Groisman A Generation of complex concentration profiles in microchannels in a logarithmically small number of steps Lab Chip 2007 7 264 272 150 Bibliografia Chudy M Grabowska I Ciosek P Filipowicz Szymanska A Stadnik D Wyzkiewicz I Jedrych E Juchniewicz M Skolimowski M Ziolkowska K Kwapiszewski R Miniaturized tools and devices for bioanalytical applications an overview Anal Bioanal Chem 2009 395 647 668 Chung BG Flanagan LA Rhee SW Schwartz PH Lee AP Monuki ES Jeon NL Human neural stem cell growth and differentiation in a gradient generating microfluidic device Lab Chip 2005 5 401 406 Chung BG Lin F Jeon NL A microfluidic multi injector for gradient generation Lab Chip 2006 6 764 768 Delamarche E Schmid H Biebuyck HA Michel B Stability of molded microstructures in polydimethylsiloxane Adv Mater 1997 9 741 746 Delamarche E Bernard A Schmid H Bietsch A Michel B Biebuyck H Microfluidic networks for chemical patterning of substrate design and applications to bioassays J Am Chem Soc 1998 120
193. stampo realizzato in genere in silicio oppure in SU e sottoposto a processo di degassamento cui segue una fase di riscaldamento della durata di diverse ore Il PDMS viene successivamente fissato ad un substrato attraverso un legame reversibile interazioni di Van der Waals PDMS PDMS o PDMS vetro di silice o irreversibile mediante un trattamento al plasma il fissaggio attraverso 62 Capitolo 1 legame reversibile estremamente rapido avviene a temperatura ambiente ma non sopporta pressioni particolarmente elevate gt 30 kPa il legame irreversibile pu essere realizzato con molteplici materiali tra cui vetro di silice quarzo polistirene polietilene ma non con poli immidi polimetilmetacrilato o policarbonato il fissaggio attraverso legami irreversibili in grado di tollerare carichi superiori ai 200 kPa Figura 1 64 Micromixer realizzato in PDMS 1 3 3 3 Propriet del PDMS Il polidimetilsilossano un elastomero caratterizzato da buona stabilit termica bassa tensione superficiale e trasparenza sotto 1 280 nm l indice di rifrazione vale 1 43 mentre la temperatura di transizione vetrosa pari a 125 C la conduttivit termica di 0 18 W m K sebbene stabile alle alte temperature nel mondo naturale 11 polimero degrada completamente ed abbastanza velocemente senza causare problemi di carattere ambientale Dal punto di vista biomedico il PDMS apprezzato per la propria inerzia stabilit flessibilit e
194. stomizzate a delimitare spazi intercomunicanti denominati cavit midollari in quanto occupati da midollo osseo oltre che da vasi sanguigni e terminazioni nervose figura 1 7 Figura 1 6 Tessuto osseo spongioso sinistra e schema relativo all orientazione delle strutture trabecolari destra Migliavacca Dispense del corso di Biomeccanica 2008 Capitolo 1 Qaticial miersii arma Lae niong imbecuia of nisi born Figura 1 7 Struttura di una trabecola e cavit midollari Migliavacca Dispense del corso di Biomeccanica 2008 Come visibile in figura 1 7 lamelle contigue sono connesse da matrice mineralizzata attraversata da fibre di collagene a disposizione irregolare una sezione istologica di tessuto spongioso evidenzia la mancanza di osteoni e la presenza di trabecole che circondano midollo osseo rosso figura 1 8 Figura 1 8 Sezione istologica di tessuto trabecolare Migliavacca Dispense del corso di Biomeccanica 2008 1 1 2 Cellule ossee Le cellule fondamentali del tessuto osseo responsabili della sintesi dei componenti della matrice non mineralizzata osteoide sono gli osteoblasti si tratta di cellule con morfologia approssimativamente cubica che derivano dalla differenziazione delle cellule osteoprogenitrici ossia cellule staminali che rappresentano una prima differenziazione delle cellule mesenchimali Gli osteoblasti come la maggior parte delle cellule secernenti sono caratterizzati
195. su differenti tipi di supporto La fabbricazione dei prototipi stata condotta mediante tecniche fotolitografiche dal gruppo di ricerca BioMEMS presso 1 laboratori FBK 1 prototipi realizzati sono stati quindi testati sperimentalmente presso il LaBS con l utilizzo di tecniche di microscopia a fluorescenza e di un sistema Micro Particle Image Velocimetry uPIV 2 2 Specifiche generali del dispositivo Le specifiche generali del dispositivo concordate con 1 biologi dell Istituto Ortopedico Galeazzi hanno previsto la definizione di cinque livelli di concentrazione di stronzio ranelato assumendo le concentrazioni di farmaco presenti nei due ingressi del sistema pari a O ed 1 0 e 10 mM rispettivamente le concentrazioni richieste sono state pari a 0 0 01 0 1 0 5 ed 1 Per ogni valore di concentrazione sono stati previsti nove pozzetti di coltura per un totale di 45 pozzetti cos da poter effettuare test di vitalit cellulare in sestuplicato e di proliferazione cellulare in triplicato sulle colture di osteoblasti I ricercatori dell Istituto Ortopedico Galeazzi hanno sottolineato l importanza di creare un sottile velo di medium per il nutrimento delle cellule poste all interno di pozzetti 73 Capitolo 2 caratterizzati da un diametro di 6 4 mm e da un volume di 200 ul in un arco temporale di pochi minuti Inoltre la disposizione dei pozzetti deve essere funzionale cos da poter assicurare un immediato riconoscimento delle pop
196. sultano coinvolte nella formazione di gradienti in grado di incrementare la motilit e le capacit chemotattiche di cellule tumorali e di amplificare 1 processi di angiogenesi La necessit di comprendere tali fenomeni ha portato alla progettazione di dispositivi che siano in grado di esporre le cellule a gradienti chimici in vitro metodi tradizionali in grado di generare gradienti di concentrazione sono stati fondamentali per acquisire conoscenze di base da parte degli scienziati ma non sono in grado di indagarne la natura quantitativa o combinatoria a causa dell incapacit di generare profili di concentrazione precisi e controllabili nello spazio e nel tempo Gradienti di concentrazione generati con metodi tradizionali spesso evolvono in modo imprevedibile ed incontrollabile nello spazio e nel tempo e sono difficilmente caratterizzabili quantitativamente 1 gradienti si creano e si dissipano in tempi brevi limitando fortemente le tipologie cellulari utilizzabili e gli aspetti scientifici analizzabili La tecnologia microfluidica dotata di un elevato livello di controllo e di automazione su una scala microscopica rappresenta un importante strategia per controllare il flusso necessario per la generazione di gradienti quantificabili e riproducibili in grado di influenzare il comportamento cellulare Keenan et al 2008 1 2 1 1 Metodi tradizionali per la generazione di gradienti di concentrazione Sistemi a base di idrogeli di collagene fibrin
197. t dotata di quattro ingressi con un sistema di distribuzione radiale mediante canali di perfusione del mezzo di coltura profondi 2 um e larghi 5 um L array microfluidico pu essere utilizzato per l analisi dell influenza che diversi componenti del mezzo di coltura valori di pH indice di perfusione possono avere sull espressione genica delle cellule e di quanto la variazione di portata possa modulare 1 processi di duplicazione alte portate implicano elevati sforzi di taglio basse portate possono condurre ad un trasferimento di massa troppo esiguo La possibilit di inserire biosensori enzimatici per monitorare il metabolismo cellulare e la presenza di valvole in grado di regolare in modo ottimale 1 flussi potrebbero incrementare sensibilmente le potenzialit del dispositivo 40 Capitolo 1 Loading 7 Perfusion inlet Sy Cell Culture TI Perfusion Chamber Channels b Figura 1 39 Microscopie elettroniche relative alla singola camera di coltura a e ai canali di perfusione radiale presenti sulla circonferenza della stessa b Hung et al 2005 Un ulteriore esempio di dispositivo presente in letteratura dotato di un sistema di miscelamento piramidale quello proposto da Chudy et al 2009 con il quale possibile generare profili di concentrazione lineari figura 1 40 la rete dotata di 25 pozzetti di coltura e di un sistema attraverso il quale possibile inserire le cellule Da sottoline
198. ta quella rilevata tra le uscite 1 e 19 e corrisponde al 4 8 confermando una ottimale distribuzione del fluido alla popolazione cellulare La portata volumetrica media registrata risultata di 1 543 1x10 m s con una deviazione standard di 0 0225x10 m s 108 Uscita 1 Uscita 2 Uscita 2a Uscita 3 Uscita 3a Uscita 4 Uscita 4a Uscita 5 Uscita 5a Uscita 6 Uscita 6a Uscita 7 Uscita 7a Uscita 8 Uscita 8a Uscita 9 Uscita 9a Uscita 10 Uscita 10a Uscita 11 Uscita Ila Uscita 12 Uscita 12a Uscita 13 Uscita 13a Uscita 14 Uscita 14a Uscita 15 Uscita 15a Uscita 16 Uscita 16a Uscita 17 Uscita 17a Uscita 18 Uscita 18a Uscita 19 109 Capitolo 2 Portata 10 m s 1 596 1 585 1 584 1 577 1 577 1 570 1 569 1 563 1 562 1 557 1 556 1 551 1 550 1 546 1 545 1 541 1 540 1 537 1 536 1 533 1 532 1 530 1 529 1 527 1 526 1 525 1 524 1 523 1 322 1 521 1 521 1 520 1 520 1 519 1 519 1 519 Tabella 2 7 Ripartizione delle portate volumetriche nelle diverse uscite del sistema di distribuzione alle cellule Capitolo 3 Capitolo 3 Test sperimentali 110 Capitolo 3 3 1 Introduzione Nel presente capitolo vengono esposti 1 risultati raccolti nei test sperimentali eseguiti presso il Laboratorio di Meccanica delle Strutture Biologiche del Politecnico di Milano le prove sperimentali sono state eseguite mediante il sistema Micro Particle Image Velocimetry uPIV TSI Inc per una
199. ta a e relativi grafici b Yamada et al 2006 48 Capitolo 1 Il principio teorico presentato da Yamada et al riproposto con alcune significative variazioni da Walker e colleghi 2007 a partire da due ingressi vengono realizzate nove linee di diluizione che consentono di generare un profilo di concentrazione lineare nel range di portate 0 5 16 ul min come nel dispositivo precedentemente illustrato la resistenza dei microcanali viene controllata variando il parametro lunghezza consentendo in tal modo una modulazione delle portate volumetriche Figura 1 49 Schema elettrico del circuito le resistenze del sistema sono calcolate a partire da R fino ad Ry ad ogni iterazione la rete resistiva a valle viene collassata in una resistenza equivalente Eg Walker et al 2007 In figura 1 49 mostrato l equivalente elettrico del circuito in cui a partire dalla resistenza R possibile risalire progressivamente alla resistenza Ry ad ogni iterazione la rete progettata a valle viene collassata in una resistenza equivalente Eg Note le resistenze Rg possibile procedere con il calcolo delle lunghezze secondo la relazione di Poiseuille ottimizzata per condotti a sezione rettangolare si noti come le resistenze Ry poste tra 1 canali di distribuzione siano mantenute costanti Terminata la progettazione di una rete sufficiente creare un sistema speculare da posizionare su un livello superiore connesso al precedente mediante p
200. ta con diverse tecniche tra cui fotolitografia litografia a fascio elettronico o fasci laser Interessante osservare come ogni master possa essere utilizzato per la fabbricazione di oltre 50 campioni elastomerici 60 Capitolo I Fabrication and silanization of master 4 SiO Sia Na metals aa F E ene F N A AAA SAR SARA RONDA da rs wat ee 3 sa KA sa x rara a he ee ae ee set i a a pe ae ae et CAA AA RNA Aa A A EE A tg te n to Hi LA LA a LI e ri dtt na A vs VA us ra wen tal nh cu Curing and releasing of PDMS POMS i lol lg le A Figura 1 62 Rappresentazione schematica del processo di Replica Molding Xia et al 1998 Il PDMS costituisce 11 materiale in assoluto pi utilizzato nell ambito della soft lithography data la capacit di aderire in modo ottimale al substrato e di replicarne fedelmente le caratteristiche superficiali oltre alla possibilit di essere facilmente rilasciato senza danneggiamenti della strutturazione creata 1 3 3 Il Polidimetilsilossano PDMS Il Polidimetilsilossano anche noto come PDMS ha assunto nel corso degli anni un importanza crescente in vari settori numerose applicazioni biomediche e di microingegneria comprendono componenti realizzati con questo materiale il cui mercato in continua espansione Uno dei primi campi di applicazione del PDMS in cui le potenzialit del materiale sono state pienamente sfruttate stato quello della soft lithography come st
201. tata mezzo mezzo um a farmaco nr elementi Micromixer 0 5 200 200 Q 8 Q 8 2000000 Micromixer 0 1 300 100 0 9 4 Q 0 1 4 Q 2000000 Micromixer 0 01 800 200 0 99 4 Q 0 01 4 Q 2860000 Tabella 2 5 Dimensioni portate e mesh relative ai tre sistemi di miscelazione Le cadute di pressione nel solo tratto di miscelazione risultano di 2850 Pa mixer 0 01 2750 Pa mixer 0 1 e 3250 Pa mixer 0 5 come evidente 1 valori rilevati risultano inferiori rispetto ai 102 Capitolo 2 calcoli analitici di circa 650 700 Pa si ritiene che ci sia dovuto alla limitata sezione di passaggio di soli 100 um x 500 um considerata in fase di progettazione che determina una sovrastima nelle perdite di carico del componente in esame pria Figura 2 26 Mappe colorimetriche relative al processo di miscelazione all interno del mixer utilizzato per l ottenimento del livello di concentrazione 0 1 sopra e 0 5 sotto 1 00e 00 5 00e 01 0 00e 00 1 00e 00 5 00e 01 0 00e 00 La miscelazione risulta ottimale in ognuno dei tre casi in esame con una distribuzione omogenea di farmaco all interno del mezzo di coltura in corrispondenza del condotto di uscita come riportato nelle mappe colorimetriche presentate in figura 2 26 In figura 2 27 viene proposta un immagine relativa al campo di velocit all interno di uno dei micromixer in cui possibile osservare l alterazione della fluidodinamica nell area di miscelazione
202. te ultime vengono riempite con una soluzione della molecola di interesse e posizionate ad una certa distanza dalle cellule mediante un manipolatore meccanico ed un microscopio la soluzione viene espulsa in modo pneumatico oppure per semplice diffusione passiva determinando un gradiente di concentrazione radiale figura 1 22 Figura 1 22 Sistema di micropipette contenenti molecole segnale montate su micromanipolatori intorno ad una piastra di Petri Keenan et al 2008 Uno storico dispositivo in grado di portare alla generazione di gradienti di concentrazione rappresentato dalla Boyden Chamber 1962 un chemoattrattore viene posizionato nella parte inferiore di un pozzetto di coltura un secondo pozzetto dotato di membrana porosa viene seminato con cellule e posizionato nel primo in modo da promuovere la diffusione della biomolecola di interesse nel compartimento superiore il gradiente creato induce le cellule seminate sulla parte superiore della membrana porosa a migrare nella camera inferiore figura 1 23 Il metodo consente una valutazione quantitativa della migrazione cellulare indotta anche se in pratica le possibilit di controllo del gradiente sono limitate date la sua variabilit nello spazio e nel tempo 25 Capitolo 1 Upper Compartment Insert Porous Membrane Lower Compartment Figura 1 23 Saggio basato sulla Boyden Chamber le cellule seminate su una membrana porosa posizionata in un pozzetto contene
203. teriosa del 20 IGF I determina fenomeni di ipoglicemia Un ulteriore aspetto da considerare quello per cui 1 benefici apportati dai fattori di crescita precedentemente analizzati sono ottenibili solo in presenza di concentrazioni adeguate nel microambiente osseo il rilascio di tali molecole a livello sistemico non genera effetti significativi sul metabolismo osseo per questo motivo sviluppi futuri di terapie basate su fattori di crescita richiederanno un efficace meccanismo di rilascio cos da garantire il raggiungimento della concentrazione desiderata nel sito di interesse Altre strategie utilizzabili per il trattamento dell osteoporosi includono la possibilit di combinare fattori di crescita e proteine specifiche in grado di limitare gli effetti potenzialmente tossici che 16 Capitolo 1 questi possono avere su alcuni tessuti inoltre possibile l associazione con bifosfonati in grado di riconoscere la superficie ossea consentendo la veicolazione dei fattori di crescita in corrispondenza del sito di interesse Il trattamento dell osteoporosi pu inoltre essere effettuato mediante fluoruri in grado di incrementare la capacit degli osteoblasti di apposizione di nuova matrice ossea sebbene numerosi studi siano ancora in corso per provarne l efficacia l attivit dei fluoruri sembra maggiore sull osso trabecolare rispetto a quello corticale e non mancano etfetti collaterali quali difetti nella mineralizzazione dell os
204. terno di una lacuna di Howship Migliavacca Dispense del corso di Biomeccanica 2008 1 1 3 Ossificazione Con il termine ossificazione si intende la formazione del tessuto osseo che l ultimo a comparire nell embrione secondo e terzo mese di gravidanza L osteogenesi segue due differenti processi che differiscono solo per le fasi iniziali detti ossificazione intermembranosa ed endocondrale 1 1 3 1 Ossificazione intermembranosa L ossificazione intermembranosa detta anche diretta comincia in seno al mesenchima o a partire dal tessuto fibrillare denso e rappresenta l ossificazione tipica del cranio e di alcune zone facciali Nel mesenchima si ha una crescita vascolare che porta ad un aumento della fibrillogenesi produzione di fibrille della matrice e della proliferazione cellulare progressivamente si assiste alla formazione del blastema mesenchimale al cui interno si differenziano 1 preosteoblasti che successivamente divengono osteoblasti deputati alla produzione di una matrice primitiva Il 9 Capitolo 1 processo prosegue con la formazione delle prime esili trabecole composte prevalentemente da collagene e glicoproteine ed al cui interno una parte del connettivo derivato dal mesenchima si differenzia in midollo la matrice presente priva di minerali e viene denominata tessuto preosseo Gli osteoblasti iniziano la produzione di nuova osteoide nella quale rimangono progressivamente bloccati procedendo alla differenziazione
205. tessuto osseo compatto o corticale figura 1 1 e tessuto osseo spongioso o trabecolare Il tessuto non lamellare presente nei mammiferi costituito da fibre di collagene intrecciate con disposizione casuale costituisce le ossa fetali e viene progressivamente sostituito da tessuto lamellare durante lo sviluppo post natale pu persistere nell adulto a livello delle suture in corrispondenza delle sedi in cui il periostio aderisce strettamente all osso a livello delle inserzioni legamentose o tendinee in prossimit delle superfici articolari temporaneamente dopo una frattura e in parte a livello del cemento del dente possiede minore resistenza meccanica rispetto al tessuto lamellare ed attraversato da cavit anastomizzate denominate spazi di Havers contenenti vasi terminazioni nervose e midollo osseo Come descritto precedentemente il tessuto lamellare pu essere di tipo compatto o spongioso il tessuto compatto costituisce la porzione centrale delle ossa lunghe diafis1 e lo strato superficiale delle epifisi porzioni terminali delle ossa lunghe e delle ossa brevi oltre ai due tavolati tipici delle ossa piatte l unit funzionale dell osso compatto rappresentata dall osteone o sistema concentrico di Havers figura 1 2 l osteone caratterizzato da forma cilindrica e da una altezza compresa tra 0 9 e 1 2 mm attraversato nel senso della lunghezza dal canale di Havers 1l cui calibro varia tra 20 e 110 um le lamelle dell
206. tezza della soluzione del problema ed stato quindi utilizzato nel corso delle simulazioni effettuate nel presente lavoro di tesi 135 Appendice A 4 Particle Image Velocimetry PIV Componenti del sistema Il Particle Image Velocimetry PIV un metodo ottico di visualizzazione dei flussi utilizzato per ricavare misure di velocit istantanea e per estrarre informazioni su altri importanti parametri tra cui il coefficiente di diffusione di una determinata specie chimica all interno di un fluido Il setup sperimentale di un sistema di particle image velocimetry o PIV costituito da molteplici componenti particelle o sostanze fluorescenti devono essere inserite all interno della rete di micro canali da analizzare e necessitano di due eccitazioni da parte di una sorgente laser in un brevissimo intervallo temporale la luce diffusa scattering dalle particelle viene registrata in un singolo fotogramma o in una sequenza di fotogrammi un complesso sistema di post processing elabora infine 1 dati ottenuti consentendo l estrazione delle informazioni desiderate Light sheet Flow with tracer particlesl i e First light pulse at t o Second light pulse at t Imaging optics Flow direction Image plane Figura A2 Schema dei componenti del sistema PIV Particle Image Velocimetry A Practical Guide In figura A2 riportato uno schema dei principali sottosistemi che costituiscono il disposit
207. ting of bupivacaine and lidocaine Toxicology in vitro 2008 22 8 1957 1964 Walker GM Ozers MS Beebe DJ Cell infection within a microfluidic device using virus gradients Sens Actuators B Chem 2004 98 2 3 347 355 Walker GM Monteiro Riviere N Rouse J O Neill AT A linear dilution microfluidic device for cytotoxicity assays Lab Chip 2007 7 226 232 Wang SJ Saadi W Lin F Nguyen CMC Jeon NL Differential effects of EGF gradient profiles on MDA MB 231 breast cancer cell chemotaxis Experimental Cell Research 2004 300 180 189 Wang Z Kim MC Marquez M Thorsen T High density microfluidic arrays for cell cytotoxicity analysis Lab Chip 2007 7 740 745 Weibel DB Whitesides GM Applications of microfluidics in chemical biology Current Opinion in Chemical Biology 2006 10 584 591 157 Bibliografia Wheeler AR Throndset WR Whelan RJ Leach AM Zare RN Liao YH Farrell K Manger ID Daridon A Microfluidic device for single cell analysis Anal Chem 2003 75 3581 3586 Whitesides GM Stroock AD Flexible methods for microfluidics Phys Today 2001 54 42 48 Whitesides GM Sia SK Microfluidic devices fabricated in poly dimethylsiloxane for biological studies Electrophoresis 2003 24 3563 3576 Whitesides GM The origins and the future of microfluidics Nature 2006 442 368 373 Wong AP Perez Castillejos R Love JC Whitesides GM Partitioning microfluidic channels with hydrogel to cons
208. to in tabella 3 1 Il valore di deviazione standard sulla concentrazione di rodamina calcolato in uscita al mixer con profondit 50 um in presenza di una portata di 3 ul min risultato di 0 4285 a fronte di un dato sperimentale di 0 3958 114 Capitolo 3 Analogamente la deviazione standard registrata in uscita al micromixer con profondit 210 um stata di 0 1759 con portata di 3 ul min e di 0 0106 con portata di 0 3 ul min mentre le simulazioni computazionali hanno evidenziato valori di 0 2403 e 0 0534 Sperimentale CFD h 50um Q 3 ul min 0 3958 0 4285 h 210um O 3 ul min 0 1759 0 2403 h 210um O 0 3 ul min 0 0106 0 0534 Tabella 3 1 Deviazione standard sulla concentrazione di rodamina in uscita ai mixer confronto sperimentale computazionale Sia 1 dati sperimentali che le simulazioni computazionali evidenziano come a parita di portata la miscelazione diffusivo convettiva risulti migliore in presenza di superiori valori di profondit del micromixer inoltre possibile osservare un superiore grado di mescolamento con una portata di 0 3 ul min rispetto ai dati raccolti con una portata di un ordine di grandezza superiore Il processo diffusivo trasversale al moto di avanzamento del fluido nel condotto risulta favorito in presenza di ampie sezioni e ridotte portate le quali determinano una velocit di scorrimento inferiore ed una superiore capacit diffusiva Vengono ora proposte alcune immagini ingrandimento 20x
209. to la caduta di pressione valutata tra ingresso e pozzetto di recupero terminale sono stati calcolati gli errori percentuali rispetto alla griglia pi fitta 3000000 elementi Come mostrato in tabella 2 2 il test condotto con 1800000 elementi ha evidenziato un errore percentuale dello 0 54 valutando l errore commesso e la pesantezza computazionale delle simulazioni si stabilito di utilizzare tale modello di discretizzazione anche per le restanti analisi della rete di distribuzione Mesh n elementi Errore sul AP Test 1 1100000 0 87 Test 2 1800000 0 54 Test 3 2400000 0 28 Test 4 3000000 0 Tabella 2 2 Analisi di sensitivit spaziale 2 5 4 Risultati e discussione Di seguito vengono riportati 1 risultati ottenuti dalle simulazioni numeriche essi vengono illustrati in termini di valori medi di pressione registrati nei differenti punti del circuito e di mappe colorimetriche di velocit pressione e diffusione delle specie chimiche presenti 99 Capitolo 2 Simulazione della rete di distribuzione ai pozzetti di coltura La rete di distribuzione ai pozzetti di coltura alimentati con concentrazioni di farmaco 0 01 0 1 e 0 5 progettata analiticamente secondo quanto riportato nel paragrafo 2 4 4 stata simulata imponendo una condizione di pressione atmosferica in uscita ai nove microcanali ed una portata pari a Q 4 in ingresso I calcoli sono stati effettuati su una griglia di calcolo composta da 1375000 elementi
210. to optimize the fluidic resistances of the different parts of the circuit so as to guarantee equal pressure drops in the parallel branches and optimal flows Because of the lengths of the microchannels are almost completely determined due to the dimensions of the system the respect of the general principle was insured by an optimization of the widths of the ducts and by the use of localized pressure drops able to balance the system of resistances All the microchannels are characterized by a depth of 500 um In the beginning the planning of the microfluidic device was made using an analytical approach designing the electric equivalent of the circuit figure F the system was divided in a series of components individually analyzable and a lumped parameters approach was adopted to get a first XVI Summary evaluation of the pressure drops in every single area Computational simulations with the commercial software Fluent Ansys Inc Canonsburg PA USA were carried out to evaluate the reliability of the analytical results and to increasingly improve the solution Both for analytical calculations and computational simulations the domain was splitted in a series of subdomains and adequate boundary conditions of pressure and flow were imposed The distribution system of the flow to the cells requested the fabrication of a circular microchannel placed on the circumference of the culture well near to the top the duct placed 7 mm over the bottom of t
211. tore di resistenza assume valori compresi tra 0 3 e 0 7 in funzione dell inclinazione dei condotti secondo lo stesso principio descritto per 1 punti di biforcazione 2 4 4 Progettazione della rete di distribuzione ai pozzetti di coltura I pozzetti di coltura utilizzati nel presente dispositivo sono caratterizzati da un diametro di 6 4 mm e da un volume di 200 ul le portate delle due pompe a siringa sono state impostate a 0 0000002 m s cos da garantire un rapido riempimento di ogni singolo pozzetto Il tempo stimato per il raggiungimento del volume di 200 ul risultato pari a 36 secondi come esposto nel paragrafo 2 4 8 relativo alla progettazione del sistema di distribuzione alle cellule del fluido l erogazione avviene a pioggia mediante 36 fori al fine di limitare le sollecitazioni meccaniche sulle cellule presenti nel pozzetto Os p Figura 2 13 Rete di distribuzione della miscela di farmaco e medium ai pozzetti di coltura 88 Capitolo 2 In figura 2 13 proposto lo schema della rete di distribuzione ai nove pozzetti di coltura lunghezze e larghezze dei condotti sono progettate rispettando 1 vincoli di spazio e la necessit di garantire uguali portate 5 5555x10 m s ad ogni popolazione cellulare Tale sistema di distribuzione utilizzato per ognuno dei tre livelli di concentrazione basati sul miscelamento di medium e farmaco L unita strutturale riportata in figura 2 13 costituita da tre sottosistemi un blocco c
212. triche nei pozzetti di coltura alimentati con medium o farmaco 101 Capitolo 2 5 94e 03 3 01e 03 4 70e 01 Figura 2 25 Mappa colorimetrica del profilo di pressione Pa nel sistema di distribuzione di medium o farmaco Come per il precedente sistema di distribuzione 1 calcoli analitici si sono rilevati corretti rendendo necessarie solo piccole correzioni in corrispondenza delle zone di raccordo e dei punti di restringimento allargamento le perdite di carico concentrate risultano infatti essere solo stimate e solo una simulazione numerica consente la loro corretta valutazione Simulazioni numeriche dei micromixer Le simulazioni computazionali dei micromixer sono state effettuate utilizzando delle griglie di calcolo particolarmente fitte per poter valutare in modo estremamente accurato il processo di miscelamento convettivo diffusivo Le condizioni al contorno impostate sono state un valor medio di velocit nei due rami di ingresso ed il valore di pressione calcolato all imbocco della rete di distribuzione ai pozzetti di coltura in uscita Ogni sistema presenta un tratto di uscita di 1 734 mm necessario per garantire il ripristino di un profilo di velocit sviluppato a seguito dell alterazione introdotta nel sistema di miscelazione mentre 1 due microcanali di ingresso presentano ampiezze variabili nei tre casi considerati come riportato in tabella 2 5 Larghezza ingresso Larghezza Portata Mesh ingresso farmaco Por
213. truct tunable 3 D cellular microenvironments Biomaterials 2008 29 1853 1861 Wu Z Nguyen NT Convective diffusive transport in parallel lamination micromixers Microfluid Nanofluid 2005 1 208 217 Xia Y Whitesides GM Soft Lithography Annu Rev Mater Sci 1998 28 153 184 Yager P Edwards T Fu E Helton K Nelson K Tam MR Weigl BH Microfluidic diagnostic technologies for global public health Nature 2006 442 412 418 Yamada M Hirano T Yasuda M Seki M A microfluidic flow distributor generating stepwise concentrations for high throughput biochemical processing Lab Chip 2006 6 179 184 Ye N Qin J Shi W Liu X Lin B Cell based high content screening using an integrated microfluidic device Lab Chip 2007 7 1696 1704 You L Temiyasathit S Tao E Prinz F Jacobs CR 3D microfluidic approach to mechanical stimulation of osteocyte processes Cellular and Molecular Bioengineering 2008 1 1 103 107 Yusuf HA Baldock SJ Barber RW Fielden PR Goddard NJ Treves Brown BJ Novel microsystems for concentration gradient generation through computer optimization with validation using optical instrumentation Microelectronic Engineering 2008 85 1265 1268 158 Bibliografia Yusuf HA Baldock SJ Barber RW Fielden PR Goddard NJ Mohr S Treves Brown BJ Optimization and analysis of microreactor designs for microfluidic gradient generation using a purpose built optical detection system for entire chip i
214. ttica presente sul microscopio in dotazione al laboratorio che non consentiva una ottimale visione dei pozzetti 124 Capitolo 4 Capitolo 4 Conclusioni e sviluppi futuri 125 Capitolo 4 Il presente lavoro di tesi nasce dall esigenza di realizzare un dispositivo microfluidico versatile e compatto che consenta la miscelazione di medium per colture cellulari e farmaco cos da generare diversi livelli di concentrazione a cui esporre una popolazione cellulare esso riguarda l ottimizzazione terapeutica per il trattamento dell osteoporosi in quanto consentir ai biologi di valutare gli effetti di differenti concentrazioni di stronzio ranelato farmaco utilizzato per la cura di tale patologia sul metabolismo cellulare Le potenzialit di un sistema di questo tipo spaziano dalla ridotta quantit di reagenti e campioni da utilizzare con notevole abbattimento dei costi fino alla automatizzazione delle pratiche di laboratorio e alla conseguente riduzione degli errori manuali introdotti dagli operatori oltre che dei tempi necessari per l organizzazione delle prove di coltura cellulare Il progetto realizzato in collaborazione con il laboratorio di colture cellulari e biologia molecolare dell Istituto Ortopedico Galeazzi di Milano e con il Center for Materials and Microsystems della Fondazione Bruno Kessler FBK di Trento grazie ai finanziamenti della Fondazione Caritro La progettazione si avvalsa di modelli analitici realizz
215. ttivo di biomolecole all interno di canali microfluidici b e relativi profili di concentrazione c Keenan et al 2008 Semplici gradienti di concentrazione molecolari possono essere ottenuti anche attraverso l impiego di stampi elastomerici che consentono di trasferire proteine su un substrato per colture cellulari figura 1 28 il profilo di concentrazione viene determinato dalle dimensioni e dalla periodicit del pattern e non risulta in alcun modo influenzato dalla cinetica di adsorbimento Figura 1 28 Fibroblasti murini di linea L929 adesi su un pattern di fibronectina Immagine tratta dalla relazione d esame del corso Laboratorio di biocompatibilit colture cellulari e micro nano strutture 2009 La seconda classe di generatori di gradiente di concentrazione microfluidici rappresentata da dispositivi in grado di promuovere per sola diffusione la generazione di profili di concentrazione in continua evoluzione nello spazio e nel tempo caratterizzati da un tempo di vita alquanto limitato Il dispositivo sviluppato da Abhyankar et al 2006 noto come Nanopore Gradient Generator utilizza membrane dotate di pori nanometrici come mostrato in figura 1 29 possibile osservare tre strati l ingresso per la sorgente di biomolecole separato dalla camera di generazione del gradiente posizionata nello strato inferiore mediante una membrana porosa in poliestere con pori di 200 nm di diametro il punto di inserimento dell
216. tudio di numerose recenti ricerche Sine 5 F Nt S Da 2 QU SERRE IRE CADI I OAs E p i hog 4 ha i 2 al b ri 4 a ite pa FAT e ay s pi a I F 5 a pi 23 T Va 5 4 We ai ser ep Oe E Li Lil E LI i 4 i A TE 5 MN Fi fi aste F Figura B Confronto tra osso fisiologico sinistra ed osteoporotico destra da cui possibile osservare una notevole differenza in termini di interconnessioni e densit ossea Bono et al 2003 II Sommario Obiettivo Obiettivo del presente lavoro la progettazione di un innovativo sistema microfluidico che consenta di valutare l efficacia di un farmaco antiosteoporotico su popolazioni cellulari In particolare il fine ultimo la possibilit di correlare la concentrazione del farmaco con gli effetti riscontrati sul metabolismo cellulare Il dispositivo prevede l esposizione di colture cellulari a cinque diversi livelli di concentrazione del farmaco lo stronzio ranelato mediante una rete microfluidica per la distribuzione dei fluidi alle cellule Il progetto stato realizzato in collaborazione con il laboratorio di colture cellulari e biologia molecolare dell Istituto Ortopedico Galeazzi di Milano e con il Center for Materials and Microsystems della Fondazione Bruno Kessler FBK di Trento grazie ad un finanziamento ottenuto dalla Fondazione Cassa di Risparmio di Trento e Rovereto Caritro Materiali e metodi Le sp
217. uati tempi di riempimento compatibili con una coltura cellulare ha richiesto l impostazione di portate significativamente pi elevate 1 risultati migliori sebbene non ottimali rispetto alla richiesta di garantire 1 livelli di concentrazione 0 01 e 0 1 sono stati ottenuti con portate nei due ingressi di 12x10 m s L ampiezza del microcanale deputato all iniezione del farmaco stata fissata a 236 um mentre quella relativa al condotto per l inserimento del mezzo di coltura a 354 um la profondit stata impostata a circa 600 um Il tratto iniziale necessario per la parziale diffusione del farmaco risultato di 8 8 cm Rispetto al progetto precedentemente esposto stata modificata l area di spillamento cos da poter ottenere nei due condotti di interesse le portate desiderate con 1 corretti livelli di concentrazione sono stati quindi realizzati otto microcanali caratterizzati da differenti resistenze fluidodinamiche figura 2 9 e Un condotto per lo spillamento del livello 0 01 di lunghezza 3 4 mm ed ampiezza 100 um e Un microcanale per lo spillamento del livello 0 1 di lunghezza 820 um con ampiezza 60 um e Un condotto di lunghezza 615 um ed ampiezza 50 um affiancato da cinque microcanali di lunghezza 650 um con ampiezza 40 um disposti simmetricamente rispetto ai primi due deputati a limitare l alterazione della fluidodinamica locale e quindi 1 livelli di concentrazione di farmaco nei due microcanali di interesse Le r
218. unti di confluenza come mostrato in figura 1 50 49 Capitolo 1 A es od o b 0 5mm Figura 1 50 Dispositivo assemblato caricato con coloranti blu e giallo a gradiente di concentrazione ottenuto b Walker et al 2007 Le resistenze dei microcanali di distribuzione risultano ottimizzate affinch la portata complessiva sia sempre unitaria da sottolineare infine come a valle dei punti di confluenza le resistenze fluidodinamiche siano progettate per evitare alterazioni nelle portate impostate Tutti 1 canali presentano profondit di 100 um e larghezza di 300 um e terminano in un unica camera di coltura ogni linea di diluizione ha a disposizione una superficie di circa 4 5 mm Di i direction Figura 1 51 Immagine in fluorescenza del canale di diluizione 0 5 e relativi grafici Walker et al 2007 50 Capitolo 1 X La validazione del dispositivo stata effettuata inserendo fluoresceina ed acqua distillata alla portata di 1 ul min nei due ingressi in figura 1 51 mostrata un immagine in fluorescenza relativa alla diluizione 0 5 che evidenzia il progressivo processo diffusivo da notare come la piattaforma sia in grado di generare profili di concentrazione lineari anche se 1 dati sperimentali si discostano dai modelli teorici in corrispondenza dei pi ridotti valori di concentrazione probabilmente a causa di imperfezioni costruttive che alterano le resistenze e di conseguenza le port
219. valutato dopo 1 mm dal punto di confluenza dei due canali di ingresso curva sperimentale e modelli analitici 130 dati estratti sui 600 um di ampiezza del condotto 1 2 3 0 8 0 6 0 4 0 2 0 0 50 100 150 Ampiezza microcanale Concentrazione D 3e 9 Experimental data Figura 3 12 Profilo di concentrazione dello stronzio cloruro in acqua deionizzata valutato dopo 2 mm dal punto di confluenza dei due canali di ingresso curva sperimentale e modello analitico 130 dati estratti sui 600 um di ampiezza del condotto 120 Capitolo 3 Il valore di diffusivit estratto sperimentalmente risulta confrontabile con il dato ricavabile in prima approssimazione mediante la relazione di Stokes Einstein Kyl Oran D 3 1 dove Kg rappresenta la costante di Boltzmann T la temperatura assoluta r il raggio atomico della specie chimica ed n la viscosit del mezzo considerato Il coefficiente di diffusione in acqua che presenta una viscosit di 0 001 Kg m s alla temperatura di 298 Kelvin risulta di 1x10 m s per lo stronzio raggio atomico 215 pm e di 2x10 m s per il cloro raggio atomico 100 pm Le simulazioni computazionali eseguite per la progettazione del dispositivo microfluidico sono state condotte adottando un coefficiente di diffusione pari ad 1x10 m s con lo scopo di garantire un certo margine di sicurezza al processo di miscelamento nei micromixer 3 7 Scelta del m
220. vello critico al di sotto del quale il rischio di fratture estremamente elevato definita osteoporosi essa generata da uno squilibrio tra apposizione di nuova matrice ossea e riassorbimento di tessuto e secondo Floman pu essere definita come una patologia dell et senescente caratterizzata da una progressiva diminuzione di massa e dall alterazione dell intera architettura ossea Bono et al 2003 L osteoporosi primaria legata all invecchiamento stata classificata come osteoporosi di tipo II o osteoporosi senile l osteoporosi di tipo I invece quella associata all inizio della menopausa e viene quindi anche definita osteoporosi post menopausa altre cause di osteoporosi possono essere l utilizzo prolungato di corticosteroidi o endocrinopatie Bono et al 2003 Il picco di massa ossea raggiunto nella maggior parte delle persone tra 1 sedici ed 1 venticinque anni di et maggiore la massa ossea raggiunta durante l et dello sviluppo e inferiore sar il rischio di essere soggetti ad osteoporosi durante il resto della vita la perdita di massa ossea figura 1 14 avviene con una rapidit pari allo 0 3 per anno negli uomini e allo 0 5 nelle donne con un incremento fino al 5 6 nei primi cinque anni dall inizio della menopausa dato che statisticamente la speranza di vita delle donne superiore rispetto a quella degli uomini l innalzamento della vita media pone 1 soggetti femminili a maggior rischio osteopor
221. vi e la validazione dei risultati numerici ottenuti Il sistema progettato caratterizzato da un elevata compattezza che ne consente un facile trasporto e utilizzo nei laboratori di colture cellulari Un ulteriore aspetto significativo rappresentato dalla semplicit di utilizzo del sistema che consente anche a personale non specializzato di operare con estrema facilit Infine considerando che densit viscosit e coefficiente di diffusione di numerosi liquidi risultano controntabili il sistema si dimostra potenzialmente utile per la generazione di diversi livelli di concentrazione di altre specie chimiche in base alle specifiche esigenze 127 Appendice Appendice A 1 Equazioni di conservazione della massa e della quantit di moto Il modello fisico implementato in Fluent prevede la risoluzione delle equazioni di conservazione della massa e della quantit di moto per il fluido in presenza di fenomeni diffusivi viene risolta una specifica equazione di conservazione della specie chimica presente Il modello di diffusione e le leggi di Fick sono trattati nel paragrafo A 2 Le equazioni di Navier Stokes sono la formalizzazione matematica di tre principi fisici ai quali 1 fluidi imposta la condizione di continuo deformabile sono sottoposti e principio di conservazione della massa equazione di continuit e secondo principio della dinamica bilancio della quantita di moto e primo principio della termodinamica conservaz
222. zare tessuti ingegnerizzati tali dispositivi non sono ancora presenti a livello commerciale ma il loro impiego risulta sempre pi diffuso portando progressivamente all abbattimento della cosiddetta soglia di diffusione L universo delle tecnologie microfluidiche in fase di grandiosa espansione e come sottolineato da Yager et al su Nature 2006 ragionevole immaginare che entro 1 prossimi dieci anni esso entrer ufficialmente nell ambito delle tecnologie utilizzate quotidianamente a scopo diagnostico e terapeutico nei centri di ricerca e di cura 55 Capitolo 1 1 3 Microfabbricazione e materiali Nei seguenti paragrafi vengono trattate le principali caratteristiche del processo di litografia utilizzato per la realizzazione di numerosi dispositivi microfluidici in particolare vengono discusse la tecnica di replica molding che consente la realizzazione di superfici polimeriche micro strutturate e le principali propriet del materiale pi diffuso per la fabbricazione di microcanali il polidimetilsilossano PDMS 1 3 1 La microlitografia Le tecnologie di microfabbricazione costituiscono uno strumento fondamentale nei settori della microelettronica della sensoristica dei sistemi microelettromeccanici e microanalitici la fotolitografia rappresenta una delle tecnologie pi potenti nell ambito della microfabbricazione e la maggior parte del circuiti integrati sono realizzati attraverso questo strumento 1 cleaning
223. zia e stabilit e all elevata biocompatibilita si rivela particolarmente adatto per lavorare con le cellule Medium 0 O Farmaco 0 4 0 4 0 750 0 750 0 8 0 8 0 4 5 8 Q 5 8 Q 09490 0 140 0 4 3 2 8 Q 4 8 8 Q 0 994 0 01 4 0 4 1 22 8 Q L 4 78 8 Q Figura F Equivalente elettrico del circuito VI Sommario Numerosi prototipi di singoli componenti del circuito sono stati realizzati con lo scopo di ottimizzare il processo di microfabbricazione test sperimentali effettuati mediante sistema Micro Particle Image Velocimetry uPIV TSI Inc hanno consentito di validare 1 risultati delle simulazioni computazionali eseguite al calcolatore Gli esperimenti sono stati condotti mediante Rodamina WT liquida Organic Dyestuffs Corporation molecola che eccitata da una sorgente laser ad una lunghezza d onda di 532 nm genera fluorescenza Il processo di miscelazione stato valutato mediante prove eseguite su micromixer caratterizzati da un profilo dentato con ampiezza del condotto di ingresso 200 um profondit pari a 50 um o 210 um e lunghezza 3 mm I condotti principali dei micromixer presentano due ingressi attraverso 1 quali sono inseriti acqua deionizzata e rodamina WT erogate da una pompa a siringa Le prove sono state condotte a due differenti portate pari a 0 3 ul min e 3 ul min I risultati sono stati ottenuti ed analizzati in termini di deviazione standard sulla concentrazione di rodamina in corrispondenza d

Capitolo 1 - POLITesi - Politecnico di Milano

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