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REGIONE TOSCANA

1. d Figura 3 14 Nell immagine a e c sono rappresentate due piasire rispettivamente di Pseudomonas e di Kes mentre in b e d in rosso stata evidenziata la re gione d incertezza Inoltre ragionevole pensare che le zone contenenti colonie siano pi ricche di contorni rispetto al background quindi il passo successivo sfruttando l operatore di Sobel stato quello di andare a cercare gli edge sia all interno della regione di incertezza che nella parte rilevata sicuramente come background In questo modo si ottenuto un ulteriore raffinamento del nsultato POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute c d Figura 3 15 Le immagini a e c contengono rispettivamente colonie di Candida e Pseudomonas Nelle immagini b e d inverde sono stati evidenziati gli edge rilevati nella regione di incertezza in rosa gli edge del background in blu il background e in rosso la regione di incertezza priva di edge Ricapitolando nelle piastre vengono identificate 5 regioni 1 Regione contenente sicuramente colonie Coli Kes Faecalis o S Agalactiae 2 Background senza edge 3 Edge del background 4 Regione d incertezza senza edge 5 Edge della regione d incertezza necessario quindi stabilire se le regioni in 4 e
2. 1 0 0 rosso giallo Figura 2 9 Cubo RGB Rosso verde e blu sono al vertici del cubo giacenti sugli assi mentre ciano magenta e giallo sono ai vertici opposti Il nero all origine e il bianco al vertice da essa plu lontano mentre la diagonale che ll congiunge la scala del grigi Un particolare colore rappresentato da un punto sulla superficie o all interno del cubo Nel modello RGB un immagine a colori consiste di tre immagini di intensita indipendenti una per ogni colore primario lo schema classico utilizzato sia nell acquisizione che nella visualizzazione dato che normalmente telecamere scanner monitor producono o utilizzano segnali RGB Il numero dei bit usati per rappresentare ogm pixel nello spazio RGB la profondita del pixel POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Il modello RGB puo risultare poco efficace ai fim dell elaborazione in quanto andando a considerare mdipendentemente le tre componenti RGB cambia la crominanza tinta saturazione di ogni pixel introducendo una distorsione cromatica Inoltre in relazione alla percezione del colore da parte del sistema visivo umano che come noto pi sensibile al verde che al rosso e al blu c da aggiungere che una rappresentazione con uguale distnbuzione dei
3. Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute sviluppi futuri 1 Aspetti microbiologici del processo di screening 1 1 Le Infezioni delle vie urinarie Le Infezioni delle vie urinarie sono molto comuni in particolare nella popolazione femminile Alcune tipologie pi semplici di infezione come la cistite possono spesso essere diagnosticate basandosi esclusivamente sui sintomi mentre per quanto riguarda le tipologie di infezioni nelle quali il paziente non presenta sintomi evidenti necessario andare ad effettuare l urinocoltura per verificare l effettiva presenza di batteri In natura esistono centinaia di specie batteriche suddivise in aerobi microrganismi che crescono in presenza di ossigeno ed anaerobi batteri capaci di crescere in assenza di ossigeno La maggior parte delle infezioni del tratto urinario sono provocate da batteri aerobi il batterio che pi frequentemente causa di infezioni l Escherichia Coli responsabile di circa l 80 dei casi seguito dallo Staphylococcus Saprophyticus con circa il 10 Viceversa per pazienti ospedalizzati l Escherichia Coli responsabile di circa il 50 delle infezioni rilevate le specie Klebsiella Proteus ed Enterobactere Serratia di circa il 40 e l Enterococcus Faecalis e lo Staphylococcus Saprophyticus Aureus delle
4. 11 F Y Shih Jmage Processing and Mathematical Morphology Fundamentals and Applications CRC Press 2009 12 R O Duda P E Hart Use of the Hough transformation to detect lines and curves in pictures 1971 13 D Comanici P Meer Mean Shift A Robust Approach toward Feature Space Analysis 2002 14 A Mecocci Dispense del corso di elaborazione delle immagini Universit degli Studi di Siena A A 2012 13 15 C Distante Dispense del corso di elaborazione delle immagini http www ino it home cosimo ttr 16 F Viola Appunti elaborazione delle immagini http www salug it fabioviola umbo elab_immagini POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute ATTIVITA 3 Studio terreni agarizzati ottimizzazione ATTIVITA 4 Verifica contro semina manuale come riferimento ATTIVITA 5 Sperimentazione interna ed esterna sia su ceppi di collezione che selvaggi L attivit state accorpate svolte e concluse e si articolata nelle seguenti fasi Premessa La ricerca di un terreno diverso per il device robobact stata effettuata al fine di trovare un prodotto che fosse generico per i patogeni urinari che lavorasse bene nel range di T 33 40 C e che ci aiutasse ad aumentare sensibilit e specificit soprattutto della specie Esch
5. 1129 106 i _ 47 208 243 267 236 42 176 191 201 7 ef ot He 107 1066 1085 10 59 1171 1356 1514 a ZER E o o ci 97 724 843 923 901 32 197 216 235 219 banco 06 214 223 229 123 Curva 1 Mf in PBS 1X sterile E stato estratto 1 Mf con una soluzione estraente di HNO sviluppato in ambiente di reazione per reazione tra Sodio Nitrito R e Acido Acetico R2 e soluzione neutralizzante di Ammonio Carbonato R3 prima dell effettuazione del test L estrazione avviene nei seguenti rapporti dei reazione 100ul di sospensione 125 ul di R 125pl di Re 250ul di R3 Dopo aver estratto 1Mf sono state effettuate delle diluizioni scalari in PBS 1X La semina stata effettuata su una curva in parallelo in PBS su agar sangue di coniglio Chorus 1155 Calibratore 1 30 000 antimause 9637 in diluent 2 Sensibilita tra 1016 1045 POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute CANDIDA ATCC 10231 17 09 2010 lotto 001 batt 003 tls posizione batterioteca A8 BULK h4 ch ch8_chi0 ch12 ch10 ch2 102 845 926 948 916 902 164 636 685 693 667 642 calibratore 1 8000 anti rabbit R5506 107 874 953 956 902 900 558 2147 2213 2211 2213 2107 558 2213 2213 2290 2390 2221 2108 10 5 366 1912 2036 2086 1992 1995 115 456 484 497
6. Obiettivo operativo 1 Ricerca e sviluppo di reagenti immunologici per l identificazione veloce di germi presenti in campioni biologici urine tamponi vaginali Attivit realizzate Illustrare le attivit realizzate specificando il ruolo di ciascun partner del progetto ATTIVITA 1 Identificazione e validazione di biomarcatori urinari proteici e peptidici mediante tecnologia proteomica UniSi L attivit propone l individuazione mediante analisi di spettrometria di massa SELDI ToF di marcatori proteici di infezioni da vari agenti patogeni per i quali non attualmente disponibile un test diagnostico per le urine La relazione che segue un sunto della ricerca svolta fino ad oggi ed articolata nelle seguenti fasi a Come primo obbiettivo ci siamo posti di valutare l applicabilit della tecnologia SELDI ToF MS alla ricerca di biomarcatori proteici di infezione batterica nelle urine A tale scopo abbiamo utilizzato urine di pazienti affetti da Legionella pneumophila di serotipo 1 come golden standard di riferimento per verificare l impostazione e le condizioni operative dello strumento SELDI ToF nella ricerca di tali marcatori I campioni utilizzati in questa prima fase sono urine di pazienti con legionellosi a differenti stadi di positivit e o quadro clinico positive per l antigene urinario di L pneumophila urina negativa di donatore sano negative per l antigene urinario di L pneumophila Dal p
7. T lee TERE Dopo la liofilizzazione ho perso 400 digit di segnale a tempo zero e il segnale diminuisce dopo sei giorni Bisogna partire da una concentrazione di campione iniziale pi alta ma il segnale a TO accettabile Gardnerella vaginalis La preparazione del campione stata effettuata con la stessa procedura utilizzata per il calibratore del kit Candida e Streptococco in questo caso per il rapporto di diluizione al fine di ottenere un valore intorno a 1000 1 4 risultati ottenuti con vari tamponi stabilizzanti conservati a 4 C a tempo zero e 15 POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute giorni sono riportati nella tabella sotto Gardnerella v Anche in questo caso i risultati accetabili sono quelli in tampone liofilo e terreno amis a tempo zero Dopo 15 giorni il segnale decresce E stato deciso di procedere alla liofilizzazione Di seguito risultati prima e dopo la liofilizzazione 600 LI 400 300 200 100 Prima dopo E stato osservava una perdita di 232 digit E stato deciso di partire da una concentrazione iniziale di campione pi alta Inoltre bisogna verificare la stabilit nel tempo Conclusione Dai dati ottenuti possibile stabilire che a per la Candida si pu
8. mubee siero i P ti a eanan IF ATI a ila e E fl lated ll DI uo A epee TI PST ibid arr ei Oe pe Os a Tino i en D A Mii mi g e 2 pean E Pi ra sn TEDE kee ORA cow AA x
9. per effetto del quale un pixel sostituito dal valore mediano dei pixel nell intorno Si tratta di un filtro non lineare dato un frammento d immagine come quello in Figura 2 6 ad esempio un filtro mediano 3x3 opera nel seguente modo 35 52 29 115 107138 gt 140 Figura 2 6 Frammento di immagine a cui viene applicato il filtro mediano La mediana M di un insieme di valori tale che meta dei valori sono minon di M e meta dei valori sono maggiori di M Pertanto nell intorno di ogm pixel si devono ordinare 1 valori dei pixel in esso contenuti compreso quello centrale per assegnare il valore mediano al prxel centrale Nell esempio si ha 29 35 38 40 52 57 107 110 115 per cw il valore mediano 52 L effetto del filtro mediano di forzare 1 pixel ad assumere un valore uguale a quello di uno dei pixel circostanti eliminando cos eventuali spike isolati d mtensita POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute che sono quelli con cui spesso si manifesta il rumore Come possiamo vedere dall esempio riportato in Figura 2 7 11 filtro mediano elimina il rumore e mantiene 1 dettagli Figura 2 7 La prima immagine contiene rumore al 10 alla seconda immagine e stato applicato un filtro Blur 5x5 mentre alla terza immagine
10. Figura 3 6 A sinistra la distribuzione dei colori nello spazio a b a destra nello spazio H S A causa dell eliminazione manuale delle colonie dal dataset Background possibile che nelle immagini nmangano alcum pixel con colon non tipici del terreno di coltura che vanno quindi ad alterare la regione identificata in Figura 3 6 Per ovviare al problema stata calcolata la concentrazione di ogni pixel di sfondo presente nel dataset sia nello spazio a b che nello spazio H S Sfruttando questa informazione sono stati quindi eliminati 1 pixel a bassa concentrazione ottenendo cos regioni pi compatte POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute 255 285 240 20 225 235 210 mo 195 195 18 180 165 165 2 159 a 150 135 lt a 135 120 120 105 105 30 90 75 7S 60 60 45 85 4 30 4 5 15 O 15 30 45 60 75 90 105120135150165180195210225 240255 d 15 30 45 60 75 90 105220235 150165180195210225 240255 4 4 Figura 3 7 Distribuzioni dei colori di Figura 3 8 Distribuzioni dei colori di background nello spazio a b dopo background nello spazio H S dopo l eliminazione dei pixel in base alla l eliminazione dei pixel in base alla concentrazione concentrazione Come mostrato in Figura 3 7 nello spazio a b la regione identificat
11. Positive likelihc 4 8 Cl 2 201 to 10 47 Positive likelihood ratio 6 222222222 2 939 to 13 172 Negative likelih O NUMI Negative likelihood ratio 0 078431373 0 012 to 0 523 Diagnostic odds DIV 0 DIV 0 Diagnostic odds ratio 79 33333333 8 733 to 720 724 Commento buona sensibilit e specificit con entrambe i metodi di riferimento ATTIVITA 6 Sperimentazione esterna e_ allestimento del File Tecnico secondo quanto richiesto dalla nromativa europea ISO Prevista nel secondo anno di attivit L allestimento del File Tecnico in corso di completamento essendo quest ultimo correlato all esito della sperimentazione esterna Per argomento in studio sono stati prodotti lotti significati da 25 kit 1kit corrisponde a 36 determinazioni che hanno permesso la realizzazione dei dati sperimentali del TF in fase di completamento e la sperimentazione esterna anch essa in fase di completamento protocolli per le sezioni H e J del tecnica file per i CE sono stati determinati con la collaborazione del Rgolatory Affair della Diesse S p acome pure per i protocolli della sperimentazione esterna per il cui allestimento sono stati stipulati contratti o collegamenti con centri ospedalieri o laboratori di analisi per una verifica sul campo Di seguito alcuni esempi sperimentali e documentali 1 Controllo vrac_ lotto 002 per TF e sperimentazione esterna STREPTOCOCCUS AGALACTIAE ceppo da DIESSE spa 152 222 c lot 01 07 11 03 a n152 17 09
12. PrevFrame i j e Effettuare un threshholding del risultato ottenuto e Applicare un filtro per ridurre l eventuale rumore e Rilevare il movimento se nell immagine cos ottenuta esistono pixel con valore diverso da 0 Questo metodo il pi semplice da realizzare ed utile solo al fine di rilevare la presenza o meno di movimento Per applicazioni pi complesse che prevedono di identificare l oggetto in movimento questo sistema introduce una serie di problematiche quali ad esempio la duplicazione di un oggetto che all interno dell immagine si muove troppo velocemente L Figura 2 5 Frame difference rilevata tra il frame attuale e il frame precedente 2 2 Trasformata di Hough Oltre a controllare che non ci siano oggetti in movimento nella regione di acquisizione necessario verificare l effettiva presenza della piastra di Petri sul supporto prima di catturare l immagine Dato che la piastra di forma circolare stata sfruttata la trasformata di Hough al fine di rilevare le circonferenze presenti all interno dell immagine In computer vision esistono innumerevoli tecniche per l estrazione di feature una di queste la trasformata di Hough 12 che viene utilizzata per individuare oggetti di una determinata forma all interno di un immagine Ideata nella sua forma base agli inizi degli anni 60 da Paul Hough fu in seguito perfezionata in una forma generalizzata e resa popolare nel 1981 da Dana H Ballard docente d
13. interfaccia grafica L obiettivo di questa fase quello di andare a elaborare e salvare l immagine solo quando la piastra ferma sul supporto A questo scopo stato utilizzato un semplice algoritmo di motion detection basato sulla differenza tra frame corrente e frame precedente Innanzitutto viene definita la regione su cul andare a rilevare 11 movimento evidenziata in rosso in Figura 3 3 viene infatti eliminata quella parte dell immagine in cui la presenza di movimento non ritenuta significativa in quanto esterna al supporto POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Figura 3 3 Area di rilevamento piastra Si calcola quindi la differenza fra il frame attuale e il frame precedente in scala di grigio e sul risultato si applica un threshold per impostare a 0 tutti 1 pixel con valore inferiore a una certa soglia Successivamente si applica un filtro morfologico opening con lo scopo di ridurre gli eventuali rumori spike isolati introdotti dalla videocamera Se l immagine nsultante non contiene pixel con valore maggiore di 0 si assume che non vi sla movimento Solo quando il sistema non rileva movimento si procede alla ricerca della regione circolare cornspondente alla piastra Per il rilevamento della piastra
14. iugimi 2 5 2717 13 1589 33B2 0 6 1607 m0 ugimi 0 3 2427 0 2 2048 0 1 1474 0 04 1052 0 02 645 0 01 414 0 005 248 0 002 144 ELISA Sandwich su LPS vedi prova in caratterizzazione LPS ELISA Sandwich su 19K His 0 5 179 19K 0 25 172 ug ml 0 12 198 0 06 126 0 03 120 Fugi 1 25 up nal Condizioni Tamaone Sadio SAd PeRidizione Condiriani Tampone Sodio S Fiduziona ta Fa dn sara li bedi Per ea Acinic P ariadna Adira ji eg Ferlodsio crinio Pa ricadena Lose FSF 1581 TRI Hiki 11 458 1 2008 ti ni 13 ao 1498 sol LEE tara 2016 467 1550 LIE 71 15M KB 208 1400000 ib pa LI da 1574 1379 353 11 MD 1H 1339 3131 216 BA 316 Didi LAU i 1 S i 125 i H7 1206 3349 Ehi LEI 3157 SLES HOES HE ui ie 1400000 2 10 i 3 00 3077 pete 3346 Ae k17 Fi Batteria Intero inattivato C4 Batteria Intero Imattivato e genito T x Condizioni ajig TAi Sidia Cosdifgni pe tedi Sadie id ioe norma li ae Farinsain a Ss ia samll ini Period Acwinin Bh Tinh ca 1 a4 171 1424 155 ine 1447 1500 5 Zi 6 La iani iao 126 1973 A 1269 POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute 17 19 amp 16 5 Anticorpi monoclonali anti 19K selezionati da immunizzazione con 19K GST ricombinante Sottoclasse gG2b ELISA Sandwich
15. ottimale computazionalmente meno complesso Riscrivendo la o otteniamo infatti POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute 5 o X l m S S HPPO 255 X l a S a S 0 Yeol l pa O 201 wa IIa 5 4 ta 5 u pi 728 a l U2 S 201 42 SI 42 5 4 re 5 uP PC e considerando che 5 2 Al pa Sy S EPC 0 0 299 gt luS O 0 i S 1 POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute possiamo ottenere S 0 L m SNP a 5 HCS 255 X l 42 9PPO S uP an S 2 43 i 5 1 qu Joi S g2 5 0 5 Clea S uw q1 S 42 5 1 q2 5 Il primo termine in 2 43 la varianza within group oj 5 definita sopra mentre il secondo termine la varianza tra i gruppi between group che indichiamo con of S Quest ultima la somma pesata del quadrato delle distanze tra la media di ciascun gruppo e la media totale La media totale pu essere scritta come H q S S g2 S ta S 2 44 Semplificando la 2 43 eliminando u e
16. per due giorni La sperimentazione tuttora in corso presso il laboratorio della sezione di Microbiologia della Universit degli Studi di Siena Dipartimento di Biotecnologie Mediche con sede in Siena All 1 Il Laboratorio di Analisi Cliniche dell Azienda Ospedaliera Universitaria Ospedali Riuniti Umberto Ancona e in allestimento da parte di un nostro distributore MEDICLIM presso Laboratori di analisi di nostri clienti Romania Strumenti attrezzature Indicare quali sono stati gli strumenti e le attrezzature utilizzati per la realizzazione delle attivit Strumenti e attrezzature sono gi disponibili presso il capofila e comprendono Stabulario per trattamento e manipolazione animali Cappe a flusso laminare verticale incubatore a CO2 microscopio invertito frigoriferi 2 8 C congelatore 30 C centrifuga refrigerata da banco bagnomaria congelatore 80 C contenitore criobiologico Lavatore e lettore per piastre microtiter spettrofotometro incubatore termostato Incubatore termostatato per colture batteriche microscopio ottico e a fluorescenza Equipaggiamento completo per immunoelettroforesi Sistema cromatografico automatico Ackta Prime Ph metro agitatore magnetico Risorse umane Indicare la percentuale di utilizzo delle risorse umane rispetto a quanto previsto PARTNER 1 Dirigenti 100 Ricercatore 100 Personale Tecnico Qualificato 100 POR CReO FESR 2007 2013 Linea
17. stata utilizzata la trasformata di Hough per evidenziarne 11 contorno circolare In una prima fase l immagine frame corrente del video viene trasformata in scala di grigo viene poi applicato un filtro mediano in modo da eliminare il rumore e allo stesso tempo mantenere 1 dettagli es edge malterati Sull immagine risultante si procede poi alla ricerca delle forme circolari sfruttando la trasformata di Hough se non viene nlevata la presenza di circonferenze oppure se 1l raggio del cerchio rilevato non appartiene al range tipico di una piastra di Petri 175 200 pixel o non rientra nella regione di acquisizione definita precedentemente Figura 3 3 il software continua a mostrare 1l frame attuale catturato dalla telecamera Invece nel caso in cui la trasformata di Hough restituisca un cerchio di dimensioni e posizione adeguate si procede al taglio della regione esterna alla piastra L immagine ottenuta viene salvata POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute in formato PNG e infine mostrata a video Il software continuera a visualizzarla finche verra nlevata la presenza della piastra Figura 3 4 Piastra salvata dopo l elaborazione L immagine della piastra ottenuta tramite acquisizione oppure caricata tramite l apposita funzione d
18. utilizzare un calibratore preparato in tampone liofilo o in terreno amis o DT 20 anche se per quest ultimo il valore di riferimento si dimezza E possibile anche utilizzare un calibratore liofilizzato risospeso in acqua con una stabilit fino a sei giorni b Per lo Streptococco agalactiae si osserva una perdita del segnale a 15 giorni in tampone liofilo liquido per questo consigliabile utilizzare un calibratore liofilizzato e risospeso al momento d uso c Per la Gardnerella vaginalis stato ottenuto un valore accettabile con il tampone liofilo liquido e terreno amis analizzati a tempo zero Il campione stato liofilizzato e verranno in seguito effettuate le prove di stabilit N B Per ciascun antigene i calibratori liofilizzati sono stati conservati met a 4 e meta a temperatura ambiente i calibratori conservati a T A dopo 15 giorni risultano in parte sciolti quindi obbligatoriamente andranno conservati in frigorifero E stato inoltre pensato di liofilizzare con la macchina presente nella sede aziendale in localit Tognazia dato che le prove sono state effettuate con il liofilizzatore della Toscana biomarker che non POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute congela in modo autonomo ma i campioni sono stati congelati in azoto liquido ogni ora
19. Per la verifica microbiologica sono stati utilizzati terreno solido su piastra petri cromogeno chromagar orientation sabouro per Candida agar sangue coniglio per Gardnerella v agar sangue montone e cromogeno streptoB per Streptococco B terreno liquido Eugon Broth Api gt identificazione biochimica Colorazione Gram Lattice Strepto slides Stumento Chorus ciclo chorus 815 circa 2h Di seguito la descrizione di sedute significative nel corso di tale fase SPERIMENTAZIONE IN COLLABORAZIONE CON L OSPEDALE GASLINI DI GENOVA e AZIENDA OSPEDALIERA SENESE Streptococco B POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute standard ospedale standard diesse Reference Reference standard isf standard is Enter the data into this table Enter the data Enter the data into this table into this table positive negative ffestisposif 9 lvestisnegg g g Enterthe Enter the required required confidence confidence interval eg interval eg 95 here Enter the require 95 95 here 95 RESULT RESULT RESULT Sensitivity Sensitivity 0 7037037 Cl 0 5152 to 0 8415 Sensitivity 0 923076923 Cl 0 7586 to 0 9786 Specificity Specificity 0 4390244 Cl 0 2989 to 0 5896 Specificity 0 694444444 Cl 0 5314 to 0 82 Positive likel
20. Technical data 110 120 230 Vac 56 60 Hz conforms as a whole and in its parts with the following standards and their amendments EN 61010 1 Safety requirements for electrical equipment for measurement control and laboratory use Part 1 General requirements EN 61326 1 Electrical Equipment for Measurement Control and Laboratory Use Electromagnetic compatibility requirements Part 1 General requirements POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute EN 61326 2 6 Electrical Equipment for Measurement Control and Laboratory Use Electromagnetic compatibility requirements Part 2 6 In vitro diagnostic IVD medical equipment And therefore meets the minimum requirements of the following Community directives and their amendments Low Voltage Directive 2006 95 EEC Electromagnetic Compatibility Directive 2004 108 EEC Place date of issue Monteriggioni 15 September 2014 Francesco Cocola Signature General Manager EC DECLARATION OF CONFORMITY In accordance with 98 79 EEC regulation regarding In Vitro Medical Diagnostics Devices RIEC CE DIESSE Diagnostica Senese S p A DIESSE DIAGNOSTICA SENESE S p A with head office in Milan Via A Solari 19 sc 6 certifies that the design type of manufacture of the in vitro m
21. Velocit di misura della CO2 presente 2 Dimensioni ridotte 3 Stabilit nel tempo 4 Basso costo Il sensore stato reperito sul mercato ed distribuito dalla General Electric GE Di seguito si riportano le caratteristiche dello stesso T6615 CO Module Compact COL Module Designed to Integrate Into Existing Controls and Equipment The Telaire 16615 dual channel CO Module is designed to meet the volume cost and delivery expectations of Orginal Equipment Manufacturers OEMs The T6615 is a dual channel sensor The two channels can be described as a CO channel that measures gas concentration and a reference channel that measures the sensor signal intensity POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Sensore NDIR Method Dual channel Non Dispersive Infrared NDIR gold plated optics diffusion or flow through sampling 0 to 2000 ppm Measurement Range i n 10 000 vom 0 to 50 000 ppm 2 25 in X 1 365 in X 0 60 in 57 15 mm X 34 67 mm X 15 24 mm 75 ppm or 10 of reading whichever is greater 0 2 FS per C Method Stability over Life of Sensor 10 Years lt 5 of FS or lt 10 reading annual 0 135 of reading per mm Hg lt 2 minutes for 90 step change typical lt 2 minutes operational e 10 minutes maximum accu
22. campioni cos ottenuti sono stati risolti tramite elettroforesi bidimensionale Le mappe proteomiche sono state ottenute utilizzando per la focalizzazione isoelettrica dimensione un gradiente di pH non lineare coprente un intervallo da 3 a 10 e per la SDS PAGE II dimensione un gradiente lineare di acrilamide che permette di separare proteine il cui peso molecolare compreso in un intervallo di 8 200 kDa gel colorati con argento nitrato sono stati sottoposti a scansione mediante densitometria laser POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute In figura 1 e 2 sono riportate le immagini digitalizzate delle mappe proteomiche relative rispettivamente al Pool di urine Positive e al Pool di urine Negative Figura 1 mappa proteomica colorata con argento nitrato ottenuta con il pool di Urine Positive pl pH 250 Mr kDa J MEFE HUMAH har ALPS HUMAN et kDa i r sg UHAN TT a u ity STILI HUMANI Figura 2 mappa proteomica colorata con argento nitrato ottenuta con il pool di Urine Negative Su tali immagini digitalizzate stata condotta un analisi quali quantitativa per mezzo di un software dedicato risultati ottenuti dall analisi d immagine ci permettono di trarre le seguenti conclusioni patter
23. if _ Pa r Legs imags m ir er Loo g I pone a D Ear ose Di z pali di agri twinge cl Gaba rt Baramin j gt reece he a i valva e ee a A hai i gie e Cal ie pa a i ET Ilan E La Lilia iora ci a e Su i Garsbariore di Oe li LA be a pee a E iran ch scale a 7 al a gn Dawane di k p t EI Li Pet See SE AGI Tak Saia Ma a s Le ee e CA LA dia ae che ga i a i i Me Mi si is a eE e a bee di le Lee Oi a Sa LI n Cii Esa di a ETT AM Aife m a a e Micara rias ie DPA iy Aa Pd Sha wa a onal TF tas EGA H Figura 3 1 Struttura del Software Come gia preannunciato nell Introduzione in questa tesi verra descritta la fase di acquisizione dell immagine e successivamente e in maniera pi dettagliata il lavoro che ha portato allo sviluppo del procedimento di identificazione e rimozione del terreno di coltura Inoltre verra illustrato come attraverso questa funzionalit sia stato possibile sviluppare una procedura automatica per l estrazione dei dataset contenenti solo colonie batteriche Le successive fasi di addestramento del classificatore e di riconoscimento e conta delle colonie batteriche oggetto precipuo della tesi di Paolo Andreim verranno qui solo brevemente introdotte e verranno mostrati 1 risultati ottenuti utilizzando un semplice sistema di classificazione POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedur
24. il partner 3 UNIFI l annullamento della voce Spese Generali 04 04 2013 n 1 varianti per partner 1 che hanno riguardato per il partner 1 Diesse Ricerche per il cambio societario 14 05 2013 richiesta proroga 12 mesi 14 05 2013 n 4 varianti per i partner 2 e 3 per il partner 2 UNISI cambio di nome dipartimento e rimodulazione dalla voce altri costi di esercizio a risorse umane e all interno di questa per il partner 3 UNIFI cambio di nome del dipartimento 18 11 2013 n 1 varianti per i partner 3 UNIFI che chiede una rimodulazione delle spese generali che necessitano di essere rendicontate e nelle risorse umane aumenta la voce di spesa dei professori 03 07 2014 n 1 varianti per i partner 3 UNIFI che rimodula da altri costi di esercizio a risorse umane Lista delle riunioni di progetto le date e i luoghi dove sono avvenuti gli incontri Riunioni per coordinamento e monitoraggio delle attivit di ricerca 05 04 11 riunione sulla visione globale del progetto e analisi test preliminari presso il capofila Siena c o TLS 15 06 11 riunione sullo stato dell arte del progetto presso il capofila Siena c o TLS 28 11 11 riunione sullo stato dell arte del progetto presso il capofila Siena c o TLS 16 04 12 riunione sullo stato dell arte del progetto e analisi test preliminari presso il capofila Siena c o TLS 09 05 12 riunione su rendicontazione amministrativa presso partner 2 Siena UniSl J 11
25. rr I 1 easure F Are PRC Are i Ge F Pai c rf Cee oT mr GT fii a i Ce Ci Ta oT i x M hit j aay EE Pa a G aT n 7 GT n GE LI ti Mati p 1 ified as l 1 IL i ISLI gt Giallo Come si pu vedere le tre classi vengono rilevate con ottima accuratezza ci consente quindi di identificare con precisione la presenza di colonie di tipo Coli mentre per quanto riguarda le altre tipologie batteriche gialle e blu garantisce solo di eseguire un pre etichettamento Per andare ad identificare le relative infezioni presenti nelle zone rilevate come contenenti colome di tipo blu e colonie di tipo giallo sono stati addestrati classificatori specializzati che agiscono separatamente nelle due regiom Prendendo in considerazione solo feature cromatiche gli specifici classificatori riescono ad ottenere buoni risultati cl sono tuttavia situazioni particolari in cul non stato sufficiente basarsi solo su informazioni derivanti dal colore in quanto in alcuni casi la presenza contemporanea con sovrapposizione di pi infezioni modifica le tonalit della colora Ad esempio la contemporanea presenza di Faecalis e di Coli modifica il colore delle colonie del primo tipo rendendole cromaticamente molto simili al KES Figura 3 21 POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti t
26. una regione viene calcolata nel seguente modo P f x dx 2 16 R Avendo nel nostro caso n campiom e volendo calcolare la probabilita che k di questi cadano nella regione R sotto la condizione che x x siano variabili aleatorie indipendenti e identicamente distribuite possiamo stimare P con la frequenza relativa P Il sax 2 17 Se inoltre assumiamo che f x sia continua e che la regione R sia talmente piccola da non permettere variazioni di f al suo interno allora possiamo scrivere f e dx fO 2 18 IR dove V il volume racchiuso da R Combinando le 2 16 2 17 e 2 18 sl arriva infine alla seguente stima POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute f x amp 2 19 Ci sono tuttavia alcuni problemi pratici e teorici nell uso delle Parzen Window Infatti per fare in modo che la stima 2 18 sia corretta necessario che V 0 quindi la regione R pu diventare talmente piccola da non avere alcun punto al suo interno k 0 producendo una stima f x 0 che sarebbe inutile Per ovviare a questo inconveniente partizioniamo il feature space in tante regioni R Ra Ra contenenti uno o pi punti In particolare 11 pedice individua 11 numero di campioni che cadono nella rispettiva regione quindi R c
27. 12 12 riunione sullo stato dell arte del progetto presso il capofila Siena c o TLS 09 04 18 riunione sullo stato dell arte del progetto presso il capofila Siena c o TLS 17 10 18 riunione sullo stato dell arte del progetto presso il capofila Siena c o TLS 14 05 14 riunione sullo stato dell arte del progetto e relazione sulle coclusioni presso il capofila Siena c o TLS Eventuali deviazioni rispetto ai risultati attesi e ai punti fondamentali POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute pianificati L unica deviazione importante rispetto a quanto pianificato riguarda gli obiettivi OOS 004 OO5 inerenti ciascuno la realizzazione di uno strumento Gia a partire dal 3 mese stato deciso di anticipare l inizio di tutte le fasi di O03 e 004 e ritardare quelle di OO5 in modo da arrivare ad aver almeno due strumenti funzionanti Preparatore ed Analizzatore piuttosto che tre incompleti Sviluppo del sito web del progetto se disponibile E stato attivato un sito Web del progetto URIMARK all indirizzo www urimark org Il sito in fase di aggiornamento e ampliamento coerente alla conclusione Raccolta dei giustificativi di spesa e di tutta la documentazione necessaria per la rendicontazione Il capofila ha ultimato la raccolta dei gius
28. 146 4 535 5 076 0 006 0 704 CM10 10k 13437 167 32 925 7 905 14 326 0 766 0 741 gt 0 0001 11746 706 37 788 84 264 91 506 4 462 4 505 gt 0 0001 CM10 20k 11902 289 52 053 20 170 32 313 2 946 3 134 gt 0 0001 11661 800 69 008 187 325 130 538 85 735 22 652 0 003 CM10 35k 20990 494 24 925 27 080 25 797 1 138 0 656 gt 0 0001 21031 677 32 578 44 276 43 183 3 285 3 425 gt 0 0001 i 6 1 CM10 55k 33596 2414362 719 13 148 6 450 4 209 1 684 gt 0 000 34896 7 764185 704 10 024 4 097 2 8 5 2 488 gt 0 0001 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 58 8 663 5 481 19 3 2 21 54 1 139 2 432 gt 0 000 IMAC30 10k 10689 534 8 355 12 459 12 293 0 29140 455 gt 0 0001 0 943 11 51 13 4 493 72 111479 979 2 80843 070 gt 0 0001 0 863 11795 644416 734 135 514 131 415 9 566410 191 gt 0 0001 0 863 IMAC30 20k 11961 409412 486 34 264 31 289 3 06142 722 gt 0 0001 0 85 IMAC30 35k 11684 085 30 185 358 178 254 787 107 057 36 468 gt 0 0001 0 8 Tabella 1 potenziali biomarcatori proteici urinari di infezione da L pneumophila 820 925 812 714 883 837 917 933 812 3 2 Tali picchi rappresentano il gruppo di potenziali biomarcatori proteici urinari di infezione da L pneumophila da sottoporre a validazione valutandone sia la specificit che la sensibilit c Durante la fase abbiamo iniziato la validazione dei picchi selezionati durante la fase precedente saggiando la validit di tale marcatore
29. 2010 lotto 001 batt 004 tls posizione B1 in Batterioteca nd ch 3 940 997 2989 997 9997 920 9997 Of 1163 ra 1086 07 207 iM 263 vy 191 19 166 90 779 63 852 1 15 5 107 n4 chb p2 897 d 750 397 9997 267 1949 l 318 di 445 5 167 je 20i il 186 34 589 4 le chi del 693 2989 9997 9997 1398 1290 345 233 cho 1055 009 2989 2290 378 526 19 237 201 695 171 185 chit 1026 732 9997 9997 9997 1610 1458 386 333 250 190 203 1040 i164 133 chi0 1172 987 9997 2691 418 580 eil 262 214 185 199 POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute BULK ch12 chf2 ch2 1070 l Tr 2989 _2710 9997 9866 aps 1647 1591 n su a 320 3 1046 Strepto Ab00120y Ab shige 342 299 3 Dai 237 191 etal 220 ude 1060 100 calibratore 1197 4439 Callbratore 121 ol Eee VRAC ch12 ch12 2 1227 1172 a AP 9997 9799 9799 2991 2900 1633 431 305 i sree te or T l Strepto e a e 209 809 761 761 calibrator 187 143 _ eT oe 8000 6000 4000 2000 La oo oo MD Curva 1Mf in Eugon Broth 1X Sono state effettuate diluizioni seriali E stato seminato il punto 5 su terreno aga
30. Agalactiae con test set contenente piastre in cui presente pi di una tipologia di infezione I tal i menti analizza 1 I menti classificati rr nt 1 5 m 1 La ificatai in mod rr 1599 28 214 la L iled Accuracy E La P Rat FP Fate Precision aca ld I dA Sure ce ROC Area FEC rea Cla at op et i Pe i ml di ake om 5 Ly Lol 5 ed _ 231 ali a p a os p gt Ly 5 O 343 Pali Weighted Ava D 718 J 138 0 723 D 718 0 680 0 589 0 791 0 620 Tu n Matrix a las sifiecl 24 44 KE Fi GET i 1 a ZO Jos 2 igalactiai a Classificatore Proteus Pseudomonas e 8 Aureus Numero totale dei segmenti analizzati 3215 Or t Az F I I rit Pa f Pra pert a E Ti cl t 014 25 31898 De ta ac Lu x ass E t BES P ni a f a H fat PRI 7 i 7 7 iad 7 Gi E F oO F r pra Fi D i 2 l kd TFE 67 z I Pi ie i i i fy dla ell IF r Li i r na i DID Weighted j ral r Pal r 14 a e 84 2 Confusion itri 1 cla ified a i540 ah i A Frote 2279 547 SC E 1 S Aureus 350 a6 314 ie 2 Pseudomonaz POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Dai risultati st deduce che per il riconoscimento delle infezioni Kes Faecalis e S Agalactiae nel casi in cui non vi siano sovrapposizioni di colonie diverse le prestazioni otte
31. Binax Bi nao Binax 3382 17 19 16 5 Binax 17 19 16 5 17 19 500 1362 3303 2789 179 3590 3687 250 1156 2928 2713 172 3438 3653 120 864 3237 2471 198 3362 3714 60 Fail 3001 Lok 126 3372 3423 30 498 3113 1463 120 3743 3567 15 3373 3487 n5 4235 3649 3 8 2191 3126 1 9 1338 2408 0 9 791 1481 05 422 834 0 23 249 520 0 12 220 429 0 06 172 329 0 04 120 206 Bianco 99 139 Blotting Lane 1 Standard Lane 2 Batterio Intero Lane 3 Batterio Intero Inattivato Lane 4 Batterio Intero Inattivato e Digerito con Proteinasi K Lane 5 LPS arricchito supernatante Lane 6 Pellet Ab 1 33B2 10ug ml Ab II A 5153 anti mouse Lane 1 Standard Lane 2 Batteria Intern Lane 3 Batterio Intero Inattivato Lane 4 Batterio Intero Inattivato e Digerito con Proteinasi K Lane 3 LPS arricchito supernatante Lane 6 Pellet Ab 1 17 19 10ug ml Ab IP A 5153 anti mouse POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute ELISA studio di competizione tra cloni 17 19 POD 1 40000 2186 due cloni non competono tro lora STUDIO DELLE URINE Binax 3382 17 19 0 5 ml Urina Negativa 5C01 Binax 33p 0 5 ml Urina Negativa T202 0 3 ml Urina Negativa Yoga 0 5 ml Urina Negativa CD13 6603 2539 78l 0 5 ml Urina Positiva 3851 valore posi
32. E test CHORUS prototipo 4 Ea 2 D tm ti 18 1 0 1 0 01 0 001 Lo studio proseguir cercando di riportare la sensibilit del nostro test con quella Oxoid comparando la fase solida Mab catturante il tracciante e il sistema di rilevazione POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute CANDIDA ALBICANS PROVA SANDWICH SU PATINA ESTRATTA Pab 001 s in FS eE 20y del 25 11 08 Incubazione 45 5 45 a 37 C Sviluppo 15 con Sub Pod Stop e lettura a 450 620nm CONSEGNATA CURVA DA LAB BATTERIOLOGIA TESTATA CON TEST LATTICE C O_ 2 DILUIZIONE Log Letta OD patina di partenza a 600nm 1 Campione gt OD 450 620 Coating Zoy Conta batterica Pab 1 2 dil TO 1 10 1 20 1 40 1 80 1 160 10 dil 103 2 C O Lat 3102 3054 3260 2351 3350 3033 2821 3274 3162 3225 3124 3300 2999 756 3266 3117 2992 2953 2131 1321 425 3104 1609 1470 STA 447 320 329 3043 943 612 ADS 241 178 214 23851 319 188s 136 159 2998 256 183 132 f 2364 6 107 o W ia Vin IN JO ju fd jw i 9 Oo OF OF OO 0 ATTIVITA 3 Sperimentazione Interna Per ciascun kit descritto nell attivit 2 stata eseguita la valutazione interna per la sensibilit espressa come UFC ml per i batterici e Candida come EB ml per Chlamidia e specifici
33. In vitro diagnostic IVD medical equipment And therefore meets the minimum requirements of the following Community directives and their amendments Low Voltage Directive 2006 95 EEC Electromagnetic Compatibility Directive 2004 108 EEC Place date of issue Monteriggioni 15 September 2014 Francesco Cocola Signature 9 General Manager 2 stesura manuali di service manuali di service per l assistenza tecnica sono stati redatti Indicare quali sono stati gli strumenti e le attrezzature utilizzati per la realizzazione delle attivit Strumenti e attrezzature sono gi disponibili presso il capofila e comprendono 1 Strumentazione per lo sviluppo di prototipi meccanici e relativo software 2 Strumenti del laboratorio di microbiologia es cappa biohazard autoclave vetreria congelatori ecc 3 Le prove per le Certificazione CE sono state eseguite direttamente presso i Laboratori di ANALYTICAL CE TA CE a SCANDICCI Firenze Risorse umane Indicare la percentuale di utilizzo delle risorse umane rispetto a quanto previsto PARTNER 1 POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Ricercatore 100 Personale Tecnico Qualificato 100 Co Co Pro come da variante approvata del 23 05 2012 100 Subcontratti Contratto di con
34. Linux Mac OS X Embedded Linux Windows CE Mobile Symbian e presto anche Maemo I linguaggi di programmazione pi comunemente Impiegati sono C e Python Sono oltre dispombili diversi binding per altri linguaggi I principali moduli messi a disposizione da Qt sono 1 seguenti POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute e QtCore modulo fondamentale non ha funzioni grafiche o Container liste hash set o QObject base dell object model di Qt o Event loop e QOtGui widget model view Qgraphics View e QtNetwork astrazione di protocolli di rete come http e QtSql accesso database QtScript binding di oggetti Qt in Javascript e QtDeclarative libreria per costruire UI per dispositivi mobili a partire da un linguaggio declarative QML e JavaScript e QUXML QtOpenGl OtSvse 3 2 Libreria OpenCV OpenCV Open Source Computer Vision Library una librera open source rilasciata sotto licenza BSD che include centinaia di algoritmi di computer vision La libreria realizzata in C come la sua API primaria anche se esistono interfacce per altri linguaggi di programmazione quali C Python Java e MATLAB Il framework OpenCV nasce da una iniziativa dell Intel Infatti mentre 1 tecmci lavoravano ai miglioramenti delle CPU per applicazioni inte
35. a punto di un Elisa a sandwich cloni sono stati caratterizzati per specificit reattivit antigenica e assenza di competizione pi idonei sono stati espansi in ascite e le IgG purificate per affinit su Proteina A e successivamente studiati nello sviluppo dei kit Cloni individuati per HSV1 44 2 isotipo IgG1 selezionato come catturante 17 3 isotipo IgG1 specifico selezionato come tracciante HSV2 38 B6 isotipo IgG1 selezionato come tracciante 16 13 isotipo IgG2b selezionato come catturante Seguir lo sviluppo del kit manuale Per C trachomatis sono state eseguite fusioni a partire da milze di Balb c immunizzati con antigeni corrispondenti a LGV2 E B Elementary Body inattivati e E B estratti In entrambi i casi sono stati selezionati cloni idonei come catturanti LGV 40 47 D6 16 e come tracciante LGV 47 14 e C6 3 Dopo caratterizzazione per specificit sensibilit isotipizzazione e immunoreattivit in Immuno Blotting I B i cloni di interesse sono stati espansi in vivo ed in seguito adattati all espansione in vitro per ulteriori lotti di produzione Tutti i cloni prodotti sono stati purificati per affinit su Proteina A e i selezionati come traccianti sono stati coniugati con l enzima HRP Dopo purificazione e coniugazione i cloni sono stati testati in Elisa utilizzando ciascuno sia come catturante insolubilizzazione in fase solida che come tracciante in un sandwich che utilizzava come
36. antigene E B dopo trattamento con estraente pi efficienti sono risultati i cloni esposti sopra Successivamente alla fase di validazione dei potenziali biomarcatori selezionati tramite spettrometria di massa SELDI ToF relazione intermedia abbiamo deciso di applicare altre tecniche proteomiche come l elettroforesi bidimensionale computerizzata cos da POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute poter sfruttare la complementarit dei due approcci In breve i campioni sono stati preparati come descritto di seguito Circa 8 5 mL del pool di urine positive sono stati concentrati Vivaspin cut off 3 kDa fino ad 1 mL e arricchiti nel loro contenuto proteico con ProteoMiner BIORAD La stessa procedura stata applicata al pool di campioni di urine negative campioni cos ottenuti sono stati risolti tramite elettroforesi bidimensionale Le mappe proteomiche sono state ottenute utilizzando per la focalizzazione isoelettrica dimensione un gradiente di pH non lineare coprente un intervallo da 3 a 10 e per la SDS PAGE Il dimensione un gradiente lineare di acrilamide che permette di separare proteine il cui peso molecolare compreso in un intervallo di 8 200 kDa gel colorati con argento nitrato sono stati sottoposti a scansione mediante densitometria la
37. comunemente utilizzate 1_ Semina per incorporamento il terreno viene preparato e raggiunta la temperatura di 45 50 viene versato nelle piastre si preleva 1 ml del campione e si distribuisce la sospensione microbica in modo omogeneo sul terreno effettuando delicati movimenti rotatori orizzontali e verticali della piastra 2 Semina per spatolamento superficiale il terreno viene preparato 24 ore prima affinch possa asciugarsi quindi viene versato nelle piastre di Petri e lasciato solidificare si preleva 0 1 ml di campione e con l aiuto di una spatola a L viene distribuito in modo uniforme su tutta la superficie Questa tipologia di semina viene eseguita quando si ha la necessit di evidenziare la morfologia delle colonie 3_Semina in doppio strato viene diluita una sospensione di 1 ml di campione nel terreno ancora non solidificato dopo la solidificazione vengono seminati altri 8 ml Questo sistema viene utilizzato quando si devono analizzare microrganismi anaerobi facoltativi 4 Semina per infissione il terreno non viene fatto solidificare del tutto con un ago di platino viene prelevata una minima quantit di campione e viene iniettata nel terreno Questa tecnica pu essere utilizzata sia in provetta che in piastra 5_Semina in alto strato il terreno viene sciolto in provette e viene fatto raffreddare fino alla temperatura di 50 il campione viene prelevato tramite una pipetta e viene lasciato cadere immergendo lo st
38. di considerare come elemento strutturante la matrice bmn Questo significa che 1l vicinato di un pixel costituito dal due pixel vicini nella direzione orizzontale La dilatazione di x m n mediante l elemento strutturante b m n formsce in uscita il valore 1 se facendo scorrere b m n su x m n nel vicinato del pixel in esame presente almeno un 1 In questo caso si ottiene in uscita la seguente Immagine Si noti che per ottenere anche 1 valori al bordi l immagine stata estesa con valori nulli zero padding Se l elemento strutturante fosse stato l uscita sarebbe stata coincidente con l immagine in ingresso x m n perch la forma scelta per la struttura identica a quella presente nell immagine L erosione invece fornisce il valore 0 se nel vicinato presente almeno uno 0 in tal caso l estensione al bordi fatta con tutti 1 Formalmente A B z B NA 0 2 8 Se consideriamo sempre la stessa sezione d immagine x m n e l elemento strutturante b m n allora facile riconoscere che in uscita avremo un immagine costituita da soli elementi nulli Se invece si fa riferrmento alla seguente sezione d immagine POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Le operaziom di dilatazione ed erosione spesso son
39. di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Co Co Pro come da variante approvata del 23 05 2012 100 Subcontratti Risultati raggiunti Descrivere i risultati raggiunti e punti cardine milestones di sviluppo nell attuazione delle attivit Descrivere in maniera puntuale le eventuali difformit fra i risultati attesi e i risultati conseguiti scientificamente e tecnicamente e proporre le conseguenti azioni correttive risultati raggiunti per questo obiettivo operativo sono tutti quelli precedentemente indicati come attesi ovvero 1 Selezione e individuazione di anticorpi monoclonali e o policlonali ad alta affinit e specificit per i biomarcatori 2 Verifica della loro funzionalit in un sistema ELISA dopo insolubilizzazione coniugazione con enzimi 3 Verifica di fattibilit e sviluppo di kit industrializzabili 4 Verifica di efficienza dei kit nella diagnosi diretta di infezione Come da paragrafo precedente si evince la capacit di produrre kit diagnostici in grado di passare alla successiva fase di applicazione automatica dei metodi 5 Verifica di applicazione del metodo in automazione Inizio previsto nel primo anno ma leggermente posticipato poich dipende dai risultati della sperimentazione interna della versione manuale del kit La sperimentazione interna i
40. di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute della CO2 presente in un campione determinando falsi livelli aspecifici Il polistirolo materiale tra l altro meno costoso non sembra essere affetto da questo tipo di problema Facilit di rottura finale per imbibire l ansa di semina del seminatore automatico a fine ciclo Questa caratteristica giustifica la scelta di uno stampo gi preesistente studiato proprio per questa specifica Qui stata valutata la possibilit di modificare lo spessore del materiale per non incorrere in problemi di estrema fragilit che potrebbero comprometterne il normale uso e trasporto Superficie utile per l applicazione di un codice a barre univoco che comunque permanga anche dopo la rottura finale del contenitore stesso Questa caratteristica giustifica la scelta di uno stampo gi preesistente studiato proprio per questa specifica anche se rende di non facile realizzazione una etichetta con codice a barre abbastanza piccola Possibilit di essere chiusa con tappi di gomma Questa caratteristica giustifica la scelta di uno stampo gi preesistente studiato proprio per questa specifica sia il metacrilato che il polistirolo soddisfano questa esigenza Tenuta a moderate pressioni interne di gas Questa caratteristica giustifica la scelta di uno stampo gi preesistente studiato proprio pe
41. di seguito i risultati effettuati con il Maldi Toff laboratorio microbiologia ospedale di Siena sulla colonia isolata dal campione 8 a confronto con il ceppo di POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Streptococco proveniente dalla batterioteca tls Pr gt VITEK MS da rivedere Da rivedere Rivisto Tutti Data setup Tutti i i di ri Operatore Tutti Nome postazione Criteri di ricerca Operatore Nome postazione Data setup z Ricerca Tutti Tutti Da A Numero degli isolati 8 Lista dei risultati da rivedere m sal i s j e ilo di Stato Stato Nome Valore di ini Live is ta 5 cei ID Paziente pII 5 ID Campione A organismo confidenza hs confidenza revisione pe Tutti Tutti Tutti 1 1 Gueptscooma 999 bd Da rivedere In attesa x i agalactiae 7 CAN IONS B _ i la 1 2 Strepiococcue 99 9 Da rivedere In attesa Choir C C AE S agalactiae 4 7 1 3 98 5 Da rivedere In attesa i lactiae CAME O AS ens sa e a pme p agalactiae i 7 E CAMP icdS6 N A agalactiae ci i CAM hood R f 1 6 i lt lt ave 1 7 Streptococcus 99 9 hd Da rivedere In attesa gt j agalactiae 8 Gtrepiococcue 99 9 Da rivedere In attesa 1 aga
42. discapito di specie non appartenenti al gruppo delle Enterobatteriacee Lo studio continuer con l aggiunta di agar e la valutazione della crescita batterica sulla superficie dello stesso c PROVE TERRNO LIQUIDO E SOLIDO CON AGGIUNTA MUG 4metil umbelliferil B D glucuronide un substrato fluorogenico utilizzato largamente nella preparazione di terreni utilizzati soprattutto per lil controllo delle acque potabili e nel settore alimentare Il MUG viene idrollizzato dall enzima glucuronidasi con il rilascio del composto fluorescente 4 metilumbelliferone visibile con la lampada di Wood L Escherichia coli e il maggior produttore di questo enzima Il tempo di comparsa della fluorescente variabile da 1h a 16h ed strettamente legato alla concentrazione batterica In media i campioni sono riconoscibili in 4h Il dato fondamentale che deriva nell usare questo composto che la POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute sua reattivit pi rapida del gas derivante dalla fermentazione del lattosio Le nostre prove sono state fatte aggiungendo il reattivo sia al terreno liquido LB Eugon Broth e sia ai terreni solidi Mac Conkey agar Il risultato stato sorprendente su 10 isolati clinici di Escherichia coli tutti e 10 hanno risposto in maniera inequi
43. e stato applicato un filtro mediano 2 3 2 Filtro Morfologico S puo usare la morfologia matematica per rappresentare e descrivere le forme degli oggetti presenti in un immagine 11 In tal caso il valore di ogni pixel dell immagine in uscita determinato mediante un confronto del pixel corrispondente dell immagine in ingresso con1 suol vicini Scegliendo opportunamente la dimensione e la forma del vicinato possibile costruire operazioni morfologiche che sono sensibili a specifiche strutture geometriche Il vicinato pu essere definito dalle posizioni che 1 pixel hanno rispetto a quello da elaborare mediante un elemento strutturante L elemento strutturante di solito rappresentato da una forma usata per esaminare le proprieta di interesse di un immagine POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Figura 2 8 Esempi di elementi strutturanti In modo simile a quanto accade per il filtraggio bidimensionale l elemento strutturante rappresenta la maschera con cul modificare 1 pixel in questo caso pero attraverso operazioni di logica booleana I filti morfologici trattano le immagini come insiemi di punti x y LIT ine quindi VI 1 11ns121 Un immagine quindi vista come un insieme RE mentre il filtro morfologico una funzione c
44. informazione descritte nel seguito portano a termine 1l processo di classificazione con risultati molto promettenti POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Il software messo a punto quindi dopo aver rimosso il terreno di coltura e dopo aver usato Mean Shift segmentation per separare le zone della piastra con colorazione simile sfrutta 1 seguenti 3 classificatori per ottenere una prima suddivisione delle colonie in base al colore e Classificatore di Escherichia Coli e Classificatore di colonie con colorazione blu Gruppo KES Enterococcus Faecalis Streptococcus Agalactiae e Classificatore di colonie con colorazione gialla Pseudomonas Proteus Staphylococcus Aureus Per tutti e tre 1 classificaton stata usata una Support Vector Machine one class Vs All con kernel RBF Radial Basis Function Classificatore di colonie blu POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Classificatore di colonie gialle Numero totale dei segmenti analizzati 20341 Sementi classificati I ament 204 Segmenti classificati in modo errato Bo 0 3164 4 Petailed Accuracy By Class
45. it 0 altumenti Quindi il numero di campioni k pu essere calcolato come rh mo Sol aa i i Sostituendolo nell equazione 2 20 si ottiene infine TE n Ly 1 x Xi ly 1 x Xi j ip ii Re der 2 24 in aaa hy l n 729 hn l aoe i 1 L equazione 2 24 esprime una stima di f che indichiamo con fa come media di funzioni di x e di campioni x Infatti il kernel rappresenta una funzione finestra usata per interpolare la distribuzione del dati ossia clascun campione contribuisce alla stima di f in accordo alla distanza da x Il profilo del kernel deve soddisfare K x cgak I xIl 2 25 dove cy q una costante che serve per assicurare che K x integri a 1 e in cui K pu essere ad esempio un Kernel Gaussiano o di Epanechmkov Riscnvendo la 2 24 usando l equazione 2 25 otteniamo infine POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute f z Y El 2 26 i 1 Poiche siamo interessati a ricercare le mode della distnbuzione f andremo a valutare dove il gradiente Vf Vf a Si yo x k 155 i 2 27 1 si annulla Definendo la funzione g x k x possiamo riscrivere la 2 27 nel seguente modo mn vi ELS x x 9 4 i 1 ca 3 ep Sze 7 ane h T 1 i 1 9 I
46. l attivit di coordinamento e di monitoraggio delle fasi di ricerca all interno del proprio gruppo Periodicamente vengono indette delle riunioni per la verifica dello stato di avanzamento e per apportare eventuali varianti alle fasi progettuali Il Capofila coordina le attivit legate alla rendicontazione del progetto di tutto il gruppo ATS Attivita svolte dal comitato tecnico scientifico di progetto se previsto Non prevista la costituzione di un comitato tecnico scientifico Varianti progettuali se ci sono state con riferimento alla composizione del partenariato alla rimodulazione dei costi al crono programma all anagrafica aziendale alla fornitura del servizio di ricerca Alla data della fine del progetto sono state presentate in totale n 7 varianti progettuali in data 23 05 2012 n 2 varianti per i partner 1 e 2 che hanno riguardato per il partner 1 Diesse Ricerche una rimodulazione dei costi del personale all interno della voce stessa tra le POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute varie figure previste e per il partner 2 UNISI il cambio del nome del Dipartimento 24 09 2012 n 2 varianti per i partner 1 e 3 che hanno riguardato per il partner 1 Diesse Ricerche una rimodulazione dei costi dei terreni spostata nelle consulenze e per
47. ogni 12 min TEMPO 120 MIN lettura anidride carbonica FINALE risultato ATTIVITA 3 Realizzazione di un incubatore Questa attivit stata completamente eseguita e conclusa Questa attivit bench completata ha richiesto notevoli sforzi progettuali a causa della complessit e delle caratteristiche attese dall incubatore in oggetto Per poter essere applicato su uno strumento automatico requisiti richiesti consistevano in 1 Velocit di warm up 2 Sistema di ventilazione interno tale da garantire una perfetta omogeneit di calore nell ambiente POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute 3 Ridotta dispersione di calore durante l introduzione ed estrazione di campioni 4 Sistema di accesso multiplo per poter inserire pochi campioni alla volta E stato realizzato quanto segue 1 Velocit di warm up 15 20 minuti per raggiungere una temperatura di 39 C 2 Sistema di ventilazione interno tale da garantire una perfetta omogeneit di calore nell ambiente sistema costituito da una serie di ventole distribuite nella parte alta e laterale della camera termostatica 3 Ridotta dispersione di calore durante l introduzione ed estrazione di campioni sistema per accesso su linee separate di 10 rack ciascuno contenente fini a 16 campioni L
48. opposto In generale i segnali registrati sui 2 anticorpi anti 19K sono risultati pi alti tuttavia per ogni campione stato osservato un segnale dovuto anche all interazione con l anticorpo anti LPS figura xx di conseguenza non stato possibile stabilire quale fosse l analita d interesse presente nel campione biologico Inoltre solo due urine classificate come negative SC01 e TZ02 e una come positiva 6603 hanno dato risultati in accordo con la classificazione fornita POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Binding 60 50 40 gt Hanti LOK 17 19 30 Manti LOK 16 5 anti LEG 33B 2 20 10 i SCO TZ02 VC03 CD13 3851 6603 FIOL 407 83 407 95 409 88 campioni g Figura xx valori di binding espressi in Unit di Risonanza RU riferiti all interazione tra 10 campioni di urina e tre anticorpi immobilizzati Per stabilire se la mancata sinificativit dei risultati ottenuti possa dipendere da un orientamento non ottimale degli anticorpi sul chip stato deciso di utilizzare gli stessi anticorpi coniugati con biotina in modo da sfruttare l interazione con la streptavidina gia presente su appositi chip e da ottenere un orientamento univoco e teoricamente ottimale della porzione variabile di ogni anticorpo A tal fi
49. organismi di ricerca in materia di salute Per non ricorrere a un diagramma tridimensionale inoltre possibile normalizzare le tinte facendo in modo che la loro somma sia sempre pari a uno Se X Y e Z sono i tre valori che identificano un colore poniamo sz X Y4V4Z Y Y XsY 2Z E Z _ X Y Z Z da cui risulta che x y z sempre uguale ad 1 per qualsiasi valore originario di X Y e Z Da questo si ricava tra l altro che z 1l x y 2 12 ed dunque possibile utilizzare due sole coordinate cromatiche x e y ad esempio per identificare un colore essendo la terza z in questo caso ricavabile sottraendo le altre due dall unita Il vantaggio evidente normalizzando 1 colori col meccanismo della somma costante uguale a 1 possibile utilizzare un grafico bidimensionale per catalogare qualitativamente e non quantitativamente tutte le tinte reali Ovvero si tracciano tutti 1 colori possibili la cw intensit totale costante e pan ad uno tutte le altre tinte sono ottenute semplicemente indicando oltre al valon x e y il loro grado di luminosita espresso ad esmpio in forma percentuale POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Figura 2 10 Diagramma di cromaticit XYZ 2 4 3 Lab In molti casi in cu necessario
50. plasmacellule il secondo con immunizzazioni mirate al prelievo dei linfonodi poplitei Lo screening sierologico fatto sui peptidi coniugati con BSA ha dato esito positivo rendendo le cellule estratte da milza o linfonodi materiale idoneo alla tecnica di fusione cellulare per la selezione di anticorpi monoclonali specifici POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute ATTIVITA 4 Immobilizzazione dei peptidi sintetici su chip per lo sviluppo di nuovi sistemi diagnostici ad elevata specificit e sensibilit UnSi UniFl e Diesse Ricerche Anche questa attivit dovr svolgersi nel secondo anno sulla base dei risultati ottenuti dall attivit 2 ma si ritenuto opportuno svolgere un attivit preliminare valutando le modalit di immobilizzazione covalente di opportune proteine modello e dei rispettivi anticorpi monoclonali su chip del biosensore ottico BiaCore che permette di verificare facilmente l efficacia dell immobilizzazione con misure dirette di interazione antigene anticorpo In tale contesto tre diversi anticorpi monoclonali specifici per proteine antigeniche di interesse in quanto metaboliti urinari sono stati immobilizzati per cattura ad alta affinit sulla superficie del chip del biosensore ed opportuni campioni sono stati utilizzati per verifica
51. presenza solo grazie agli highlight presenti nell immagine Gli stessi biologi al momento dell identificazione della Candida sono soliti aiutarsi inclinando la plastra in varie angolazioni per riconoscerne la presenza in base al nflessi che si determinano e alla conformazione tridimensionale della colonia quindi evidente che le informazioni disponibili utilizzando immagini scattate in una posizione fissa sul supporto sono molto limitanti perch non permettono di distinguere la componente di profondit dell immagine La feature principale che stata usata per riconoscere potenziali infezioni da Candida rappresentata dagli edge Essi infatti si trovano in zone localmente non uniformi all interno del background il che costituisce un indice della presenza di elementi non appartenenti al terreno di coltura Le possibili infezioni da Candida vengono quindi ricercate solo nella regione 3 cioe quella in cw sono stati nlevati edge all interno della regione di background Come verra illustrato in seguito nel paragrafo relativo alla classificazione delle colome per la Candida stato progettata una procedura di riconoscimento a s stante che prendera in analisi solo la regione 3 mentre per l identiicazione delle altre tipologie di infezione questa regione non verra POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiun
52. procedimento ha reso la rimozione del background nelle colonie tipo Coli Faecalis Kes e 5 Agalactiae pi preciso in quanto escludendo a priori la presenza di colonie gialle tutti 1 pixel che in queste piastre sarebbero caduti nelle regioni di incertezza cosa che accade spesso con 1 bordi delle colonie ad esempio di Coli sono stati invece immediatamente etichettati come sfondo ed eliminati Un ulteriore miglioramento stato ottenuto calcolando l istogramma sul canale H in HSV sia della regione etichettata come background che della regione infetta Succede infatti talvolta che regioni di sfondo vicine ad una colonia tendano ad avere un colore pi simile a quello della colonia stessa rispetto al resto del background il che pu determinare un errata associazione di questi punti Tuttavia confrontando 1 valori di H dei pixel con quelli dei picchi degli istogrammi calcolati sono stati mantenuti all interno della classe colonie solamente 1 pixel pi vicini al picco relativo alla regione infetta della piastra Cio consente di migliorare ulteriormente le prestazioni del modulo di rimozione del background eliminando parti di terreno dubbie nei pressi di una colonia Allo stesso tempo tempo nella maggior parte del casi permette di conservare solo le infezioni predominanti nel caso in cui all interno della piastra sia presente pi di una tipologia batterica Le modifiche introdotte sono utilizzabili sono in fase di creazione d
53. prototipo strumentale Sono state effettuate delle sperimentazioni si interne che esterne come indicato nella tabella riassuntiva Dove n Campioni conservante Internal 2500 no Borate Careggi Florence 2500 Borate Novi Ligure 1 500 no Borate Novi Ligure 2 2000 Borate Cesena 10000 Borate Come si vede sono state verificate diverse condizioni compreso il tipo di conservante POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute con il quale il campione urinario arriva in laboratorio Presso il Laboratorio Centralizzato di Pievesestina Cesena il sistema stato anche valutato nel suo comportamento in relazione all elevato numero di test Tutte le prove hanno dato esito positivo ed hanno avuto un giudizio positivo da parte degli utilizzatori La novit assoluta del sistema consiste di determinare il risultato analitico utilizzando un Cut OFF Dinamico LA positivit di un campione non viene valutata semplicemente dai valori di CO2 prodotto ma tiene conto di alcuni dati sensibili del paziente come es Sesso et reparto di provenienza tipo di materiale biologico e o prelievo es mitto intermedio o catetere Tutto questo significa che a parit di segnale relativo alla produzione di CO2 il sistema prima di decidere circa la positivit di un campione
54. quali sono gli strumenti e le attrezzature utilizzati per la disseminazione dei risultati del progetto POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Per la disseminazione dei risultati sono stati utilizzati principalmente tre strumenti informativi Il primo stato quello di collaborazione scientifica con la facolt di Ingegneria dell Universit degli Studi di Siena Il secondo dal gruppo marketing di Diesse Diagnostica Senese Spa la societ che distribuir sul mercato i prodotti risultati da questo progetto di ricerca In particolare Diesse Diagnostica Senese Spa ha intrapreso una campagna informativa sul mercato attraverso la preparazione di brochure e incontri preliminari con potenziali clienti che porteranno alla commercializzazione ufficiale a partire dal il prossimo Gennaio 2015 Il terzo un sito Web in fase di ampliamento www urimark org Risorse umane Specificare le professionalit e i rispettivi tempi mesi uomo che sono stati necessari alla realizzazione delle attivit Indicare la percentuale di utilizzo delle risorse umane rispetto a quanto previsto Per la disseminazione il capofila partner 1 del progetto ha impiegato un esperto di sviluppo sistemi diagnostici che ha seguito i rapporti con la Facolt di Ingegneria dell Un
55. raggio Ogni punto xi yi appartenente allo spazio immagine pu essere trasformato in una superficie nello spazio dei parametri a b r secondo l equazione x A gi by r 2 4 POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute La superficie nello spazio tridimensionale dei parametri associata a un punto P dell immagine un cono circolare con vertice in P Se si fissa un raggio r F SI ottiene una circonferenza di centro P e raggio pari a F che rappresenta il luogo dei centri dei cerchi passanti per il punto dato ed aventi raggio pari al valore fissato LA b ff K LP y x P24 PS PRI gt lt P3 Ne i Pi se E r f P4 Pa 7 Fi a F Spazio Immagine Spozio del Parametri Dy P r T Spazio dei Parametri a b r Figura 2 4 A sinistra rappresentato lo spazio dei parametri a b r al centro lo spazio immagine in cui rappresentata la circonferenza in esame a destra la rappresentazione dello spazio dei parametri con raggio r fissato Nell implementazione della trasformata di Hough per 1 cerchi lo spazio dei parametri deve essere quantizzato e rappresentato tramite un accumulatore tridimensionale L accumulatore pu essere visto come una successione di layer che rappresentano 1 valori discreti del raggio Nel proce
56. ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute TEST DI PRECISIONE ch2 ch4 ch ch8 chio ch12 ch12 ch2 CAMPIONE 39 150 211 240 261 269 bianco eugon broth 34 101 130 153 164 163 129 estratto 39 435 661 760 825 865 41 503 772 907 994 1033 47 546 827 973 1076 1111 45 481 724 841 922 950 estratto il punto 2 sin 43 511 816 969 1087 1153 ue sie della cuna a partire p 45 493 746 893 994 1028 i da 1Mf incubata a 44 469 734 883 986 1037 37 per 2h 38 478 746 873 969 1023 40 407 638 768 860 905 46 582 905 1082 1197 1259 47 139 176 206 214 201 bianco PBS 41 162 219 244 247 242 201 estratto 45 385 535 575 583 570 53 415 567 627 642 615 50 420 580 640 655 628 55 416 567 638 657 622 o ere 52 463 636 698 711 684 575 5 estratta la diluizione 46 365 512 548 557 549 1 5 di 1Mf 45 471 651 698 704 688 54 446 610 685 700 667 58 451 619 694 716 676 45 367 512 561 573 554 Abs 0 08 a 650nm Commento CV accettabile Dato che utilizzando calibratori sono stati ottenuiti dei valori di CV a limite di cut off o troppo elevati Gardnerella stato deciso di cambiare la preparazione dei calibratori 3 Verifica di funzionalit CALIBRATORI Candida Preparazione calibratore E stata raccolta la patina batterica e risospesa 3 volte in PBS sterile dopo centrifugazione 3000g per 10 min Una volta ottenuta una concentrazione pari a 1Mf stato estratta la so
57. rimanenti Una classificazione delle infezioni in base alla loro uro patogenicita 1 e stata proposta dall ECLM European Confederation of Laboratory Medicine che ha individuato tre gruppi principali di infezioni PATOGENI CONVENZIONALI PRIMARI Escherichia Coli batterio Gram negativo la temperatura ideale del batterio di 37 ovvero quella del corpo umano questo tipo di infezione pi comune nella donna e causa frequente stimolo ad urinare urina torbida febbre e dolori ai reni 1 Uro patogenicit capacit di un microrganismo di apportare danni all apparato urinario subordinata alla situazione clinica del paziente 2 Colorazione di Gram metodo colorimetrico utilizzato per contraddistinguere chimicamente e strutturalmente la parete cellulare dei batteri batteri vengono colorati con cristal violetto e in seguito decolorati con solventi organici infine vengono controcolorati con safranina o fucsina basica batteri che mantengono il colore violetto vengono definiti Gram positivi quelli che invece vengono decolorati e assumono un colore rosso sono definiti Gram negativi 9 O Staphylococcus Saprophyticus un tipo di batterio anaerobico facoltativo POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute 3 Gram positivo e di for
58. rispettivamente a 11661 800 e 20990 494 m z con questo protocollo sono stati confermati come L pneumophila specifici CM10 55k dei tre i picchi precedentemente selezionati quello 21031 677 m z stato confermato come L pneumophila specifico Gli altri due picchi rispettivamente a 33596 241 m z e 34896 776 m z sono risultati essere marcatori aspecifici di infezione batterica in quanto rivelati anche nei campioni di urine positive per il M tubercolosis IMAC30 10k tutti e tre i picchi precedentemente selezionati rispettivamente a 5878 663 m z 10689 534 m z e 11751 713 m z sono stati confermati come L pneumophila specifici IMAC30 20k sono stati confermati i picchi a 11795 644 m z e 11961 409 m z e sono risultati essere specifici per L pneumophila IMAC30 35k questo protocollo ha portato alla validazione del spicco a 11684 085 m z specifico per L pneumophila Per ciascuno dei picchi selezionati sono stati aggiornati i parametri statistici normalmente utilizzati per valutare la capacit diagnostica di un potenziale biomarcatore il p value e la curva ROC Un attenta analisi dei grafici relativi alla distribuzione delle intensit di segnale di ciascun picco conferma il fatto che nessuno dei biomarcatori da noi selezionati riesce da solo a discriminare la totalit dei campioni di urina L pneumophila positivi da quelli di urina da pazienti positivi all infezione da Mycobactrerium tubercolosis e da quelli di urina dei control
59. sensibilit Unisi Unifi e Diesse Obiettivo Produzione valutazione e selezione degli _ anticorpi monoclonali e o policlonali idonei Operativo 2 all impiego in test Elisa Realizzazione dei kit diagnostici su piastra Elisa Sperimentazione interna Automazione dei test su strumento Chorus Sperimentazione interna dei kit in automazione su strumento Chorus POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Sperimentazione esterna e allestimento del file tecnico secondo quanto richiesto dalla normativa europea Iso Obiettivo inert DI Operativo 3 Adattabilit alle varie tipologie di contenitori in ingresso Me enne ett ty ty Studio contenitori e terreni da infialare e test biochimici di base e NUIT Validazione sterilit ed eventuale carry over pi report e manualistica Obiettivo Studio sensoristica per la deiezione del g fenomeno di crescita Operativo 4 Software di controllo per il monitoraggio degli eventi in funzione del tipo di sensore da utilizzare Sviluppo dei terreni adatti alla nuova procedura e dei terreni con varie associazioni di antibiotici Sperimentazione interna ed esterna sia su ceppi di collezione che selvaggi report e manualistica Obiettivo Operativo 5 Verifica contro semina manu
60. sostituendo q con 1 q S si ha infine o 08 5 4 5 1 2 45 qa Sll 5 42 5 Dal momento che la varianza totale non dipende dalla soglia S la soglia che minimizza oi quella che massimizza la between group variance o S o3 S q1 9 1 qi S llea S p2 5 2 46 Vi una stretta relazione tra il valore di soglia calcolato tra un istante ed 1l successivo separare il background dalle tipologie di infezione che si presentano con colorazione gialla POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute 3 Realizzazione di un sistema automatico per la conta batterica In questo capitolo vengono illustrate le fasi implementative del software per il riconoscimento automatico delle infezioni unnare da urinocoltura su piastra di Petri e per la relativa conta batterica 3 1 Qt Creator Qt l ambiente di sviluppo software di Nokia basato su un insieme di librerie multipiattaforma e multipurpose le librerie di Qt spaziano dalla gestione delle GUI fino a quelle per l accesso a database passando per network ammazioni e multithread Giunto ormai alla versione 5 3 1 originariamente era stato sviluppato dalla Norvegese Trolltech acquistata poi da Nokia nel 2008 permette lo sviluppo di applicazioni per MS Windows UNIX
61. tiene conto di tutti gli altri parametri sopra descritti in base ad uno score di rischio assegnato Questo ne determina una CARATTERISTICA UNIVOCA RISPETTO A TUTTI GLI ALTRI SISTEMI DI SCREENING PRESENTI SUL MERCATO SOLO A TITOLO DI ES SI RIPORTANO GLI ALGORITMI DI CUT OFF DINAMICO ES DI ALGORITMI UTILIZZATI IN PRESENZA DI BORATO COME CONSERVANTE POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute c1 T0 gt 600 and T1 gt T0 and T2 gt T1 INC SEM ASSENTE V M M cn1 T1 T0 gt 1000 POS ASSENTE V M M cPAR T0 lt 1000 and T0 gt T1 and T1 gt T2 AMA ASSENTE R M M cPAR1 T0 gt T1 and T1 gt T2 AMA ASSENTE R M M c2 T0 lt 900 and T1 gt 1000 and T2 100 T0 gt 120 and T1 100 T0 gt 135 LIEVE SEM ASSENTE G M M c3 T1 gt 2000 and T2 gt 2000 and T2 100 T1 gt 90 LIEVE SEM ASSENTE G M M c4 T2 100 T0 gt 140 and T1 100 TO gt 180 INC SEM ASSENTE G M M c5 T1 gt 2000 and T2 gt 2000 and T2 gt TO LIEVE SEM ASSENTE G M M c6 T1 gt 1900 and T1 lt 2000 and TO gt 1400 and TO lt 1500 and T2 gt 1400 and T2 lt 1500 limite ASSENTE G M M c7 T1 gt 1900 and T1 lt 2000 and TO gt 1300 and TO lt 1400 and T2 gt 1500 and T2 lt 1700 limite ASSENTE G M M c8 T0 lt
62. tipici della Candida si pu applicare la maschera in Figura 3 9 Con le informazioni a disposizione al momento quello appena suggerito rimane l unico modo utilizzabile per risolvere questo problema Appare ovvio per che non essendo stato applicato alcun metodo per perfezionare la ricerca della Candida 1 dataset cos prodotto non potra che risultare equivalente a quello creato manualmente cosa che influir molto sulle prestazioni del classificatore per questo tipo di infezione Per concludere la procedura cos sviluppata consente di estrarre in modo automatico 1 dataset contenenti esclusivamente 1 pixel relativi alle colonie batteriche Le immagmi cos ottenute verranno pol sfruttate per estrarre le feature necessarie alla fase di addestramento del classificatori 3 8 Classificazione e conta delle colonie batteriche POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute In questo paragrafo verra introdotto brevemente il lavoro svolto in relazione alla classificazione ed alla conta delle colonie batteriche oggetto precipuo della tesi di Paolo Andreim mostrando alcuni risultati preliminari Le immagini utilizzate riguardano piastre di Petri con terreno cromogeno Unselect 4 relativamente alle quali le principali infezioni distinguibili sfruttando la
63. utilizzata la seguente formula yo ee m 0 1n d 1 1 dove corrisponde al numero di colonie contate ny ed n rappresentano il numero di piastre utilizzate rispettivamente per la prima e per la seconda diluizione e d il fattore di diluizione Il numero di microrganismi presenti viene espresso in UFC g Unit Formanti Colonie per 1 terreni solidi e UFC ml per 1 terreni liquidi Figura 1 3 Esempi di conta batterica Valori inferiori a 10 e 4 sono solitamente indice di contaminazione mentre valori maggiori o uguali a 10 e 5 indicano una probabile infezione Mentre la procedura di semina gi stata efficacemente automatizzata il processo di identificazione e conta prevede a tutt oggi l intervento manuale di un esperto umano L operazione di analisi della piastra deve essere effettuata in un ambiente sterile cappa mentre la trascrizione dei risultati viene eseguita all esterno della cappa L operazione risulta quindi essere molto laboriosa a causa della necessit del passaggio continuo tra ambiente sterile e ambiente non protetto Automatizzare il POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute processo di riconoscimento pu essere perci molto vantaggioso non solo in termini di tempi e costi ma anche per facilitare il compito dell operatore rid
64. 0 C a bagnomaria Erano poi aggiunti 2 2 ml di Proteinasi K alla concentrazione di 2 5 mg ml in lising buffer Segue incubazione a 60 C per 1 h a bagnomaria Abbiamo raccolto la sospensione e l abbiamo suddivisa in due boli piccoli con tappo a vite stata fatta prima una centrifuga di 3 a 20 000 rpm dopo di ch visto che il pellet si separava difficilmente stata fatta uma nuova centrifuga di 10 sempre a 20 000 rpm Abbiamo quindi recuperato Il supernatante 6 5 ml contenente I LPS ma comunque conservato anche pellet Elettroforesi Lane 1 standard Lane 2 LPS Lane 3 Pellet Lane 4 Batterio Intero Lane 5 Batterio Intero Inattivato Lane 6 Batterio inattivato e Diperito con Proteinasi E Lane 7 standard Banda corrispondente al LPS ELISA sandwich su BINAX Binax 33B2 17 19 16 5 Fase Solida Binax 3362 16 5 17 19 Coniu ato 1500 000 3217 3334 124 152 1 100 000 es 2196 140 141 1 200 000 1526 1278 117 151 LPS 1400 000 B48 669 124 150 1 800 000 504 387 117 133 1 1 600 000 335 259 121 150 1 3 200 000 249 POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute 33B2 Anticorpo monoclonale di sottoclasse IgGl ELISA Indiretta e Sandwich su Legionella Estratto leg estratto 3362
65. 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute da noi utilizzata come messo in evidenza dall assenza di bande nella lastra L anticorpo Pab L pneumophila 19K possiede il pattern immunoreattivo pi ricco formato da 4 bande antigeni proteici ai seguenti valori peso molecolare banda a 55 kDa banda b 40kDa banda c 20 kDa banda d 13 kDa L anticorpo LEG 33B 2 non riconosce nessun antigene L anticorpo LEG 132B 75 possiede un pattern immunoreattivo costituito da 2 bande b 40kDa e c 20 kDa entrambe riconosciute anche dall anticorpo Pab L pneumophila 19K Successivamente abbiamo analizzato mediante SDS PAGE e WB altri campioni di urine e anticorpi Questi campioni erano stati precedentemente analizzati dai ricercatori della DIESSE Ricerche per indagare un problema di sensibilit specificit di un kit ELISA in fase di sviluppo per la diagnosi dell infezione da Legionella pneumophila nelle urine di pazienti nostro compito stato quello di ripetere gli esperimenti utilizzando sistemi di rivelazione pi sensibili a nostra disposizione quali la colorazione argentica Silver Staining e la rivelazione mediante ECL per l analisi WB Il campione proteico utilizzato come antigene stato preparato presso i laboratori di ricerca del
66. 400 IRIRASSENTE R M M c9 T0 gt 1200 and T0 lt 3000 and T1 gt T0 and T2 100 T0 lt 120 and T1 100 T0 gt 120 LIEVE SEM ASSENTE G M M end ES DI ALGORITMI SENZA CONSERVANTE algo1 10 gt 3000 ATTIVO negative G F M algo2 11 100 T0 gt 200 ATTIVO ASSENTE V F M algo3 12 100 T0 gt 200 ATTIVO ASSENTE V F M algo4 T2 100 T0 gt 180 LIEVE ASSENTE B F M algo5 T10 11 1T2 gt 2650 DUBBIO ASSENTE B M M algo6 10 11 12 lt 1700 RIP ASSENT E R M M end ANN Strumenti attrezzature Indicare quali sono stati gli strumenti e le attrezzature utilizzati per la realizzazione delle attivit Strumenti e attrezzature sono gi disponibili presso il capofila e comprendono 1 Strumentazione per lo sviluppo di prototipi meccanici e relativo software 2 Strumenti del laboratorio di microbiologia es cappa biohazard autoclave vetreria POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute congelatori ecc 3 Strumenti ed attrezzature dei laboratori esterni di sperimentazione Risorse umane Indicare la percentuale di utilizzo delle risorse umane rispetto a quanto previsto PARTNER 1 Ricercatore 100 Personale Tecnico Qualificato 100 Co Co Pro come da variante approvata del 23 05 2012 100 Subcontratti Contratto d
67. 497 460 118 444 470 471 461 426 450 1 10 117 444 497 511 496 465 126 739 818 834 810 184 56 1067 1152 1170 1147 1121 982 calibratore 1 8000 anti rabbit R5506 18 1000 1072 1086 1062 1041 36 190 200 205 206 172 39 190 205 208 205 168 176 2 4x1043 49 202 224 227 222 187 50 207 222 227 227 189 38 183 203 209 203 166 180 3 2x 1042 42 202 211 219 224 184 55 211 226 233 231 196 19 166 174 178 181 144 163 Bianco PBS 1Xestratto 34 162 188 193 174 150 93 1105 1220 1249 1199 1191 44 1052 1171 1204 1159 1146 1160 calibratore 1 8000 anti rabbit R5506 54 1052 1165 1197 1140 1142 o i Pi R VRAK 106 1015 1044 1013 1042 h4 ch ch8 chio chi2 chi0 ch2 BULK VRAC lotto 003 s lotto 005 40y 75 1054 1164 1190 1150 1115 512 2085 2145 2211 2210 2127 2127 168 367 410 425 408 383 1 A 53 205 231 238 230 203 2 A 09 131 149 156 146 116 3 3x10 3 73 935 1031 1050 1020 1004 ui Gi dado ives 1000 dia 1243 1124 alate 1 8000 anti rabbit R5506 67 222 251 261 248 222 na 17 162 173 176 177 142 Curva 1Mf in PBS 1X Sono state effettuate diluizioni seriali E stato seminato il punto 3 su terreno agar sabouraud Sono stati estratti tutti i punti della curva con una soluzione estraente di HNO sviluppato in ambiente di reazione per reazione tra Sodio Nitrito R1 e Acido Acetico R2 e soluzione neutralizzante di Amm
68. 5 contengano colonie oppure terreno Pur non potendo calcolare 1 valori globali tipici delle colonie gialle stato rilevato sperimentalmente che in una stessa piastra 1 valori del canale H in HSV sono molto differenti tra pixel appartenenti al background e pixel appartenenti alle colonie gialle Sono state quindi analizzate separatamente le due regioni di incertezza utilizzando la seguente procedura applicata in sequenza prima alla regione 4 e poi alla 5 POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute La regione di dubbio per come stata estratta potenzialmente pu contenere due distribuzioni background e colome gialle per separarle stato utilizzato 11 metodo di Otsu sul canale H Vengono quindi ottenuti due cluster che indicheremo come regiom 6 e 7 Per determinare se quest ultima divisione plausibile calcoliamo l istogramma in H delle due regioni indicando con Zs Z 1 valon di H in cun 1 due istogramim assumono valore massimo Affinch la soglia ottenuta con il metodo di Otsu T sia ammissibile deve verificarsi che Pi lt T lt Z sef dy 3 1 7 lt In lt Zg sels lt fs Inoltre la valle compresa fra 1 due picchi deve essere sufficientemente profonda Tn lt 32 min h Z h Z gt 3 2 dove h x il valore dell istogra
69. 9 10 PARTNER 2 357 228 05 PARTNER 3 424 535 12 In caso di variante progettuale autorizzata si deve fare riferimento al nuovo piano finanziario e al nuovo cronoprogramma approvato POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Obiettivo operativo 2 Realizzazione di un kit per ogni patogeno e sue applicazioni su strumentazioni automatiche Attivit realizzate Illustrare le attivit realizzate specificando il ruolo di ciascun partner del progetto Tutte le attivit di questo obiettivo sono di competenza del solo partner capofila Diesse Ricerche Srl ATTIVITA 1 Produzione valutazione e selezione degli anticorpi monoclonali e o policlonali idonei all impiego in test ELISA Questa attivit propone per ogni patogeno in studio la produzione di reagenti anticorpi poli e o monoclonali a massima specificit e sensibilit seguendo protocolli di trattamento basati su esperienze acquisite o riscontrate in letteratura e antigeni di immunizzazione differentemente selezionati batteri inattivati frazioni antigeniche polisaccaridiche e o proteiche antigeni ricombinanti in base alla patologia tipologia di infezione e biomarcatore cercato Per semplificazione si suddivide per tipologia 1 Infezioni direttamente correlate al sis
70. Lj Ly ij 1 bGj 1 Lia LUL LLD 1 0 1 J 1 2 1 E 0 0 0 0 1 0 1IL1 2 1 2 35 con 1 relativi kernel POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute 2 7 Thresholding con il metodo di Otsu In computer vision e image processing il metodo di Otsu 15 usato per realizzare il clustering dell mmagine basato sul thresholding dell istogramma dell immagine stessa in scala di grigi Assumendo quindi che l immagine contenga due classi di pixel che seguono un istogramma bimodale si cerca di determinare la migliore soglia S che separi le due classi Il metodo di Otsu si basa sull approssimazione dell istogramma dell immagine usando la media pesata di due densita di probabilit con distribuzione normale Dall istogramma dell immagine A si deriva l istogramma normalizzato dato da H 1 p D conl 0 255 2 36 izo H i che rappresenta la probabilit di occorrenza di ogni livello di grigio l Per ogni valore scelto della soglia S sono individuati due gruppi di pixel rispettivamente della prima e della seconda classe 1 cui istogrammm dei livelli di grigio sono approssimati con due distribuziom normali N 41 01 ed N 42 02 Divinbuzione Onpginale Soglia Chtimale Sfondo Ugpetto Figura 2 18 Determinazione della sogli
71. POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute RELAZIONE TECNICO SCIENTIFICA FINALE Realizzazione di sistemi ad elevata automazione per il monitoraggio di malattie infettive mediante dosaggio di marcatori urinari Acronmo URIMARK Presentato da DIESSE RICERCHE S r l Capofila DIESSE Ricerche S r l Partner 1 Capofila Partner Universita degli Studi di Siena Partner 2 Titolo del Progetto Universita degli Studi di Firenze Partner 3 Matsia Descrizione sintetica del progetto Utilizzando tecnologie avanzate in termini di automazione da un lato e molecolari dall altro vogliamo ottenere risposte di diagnostica urinaria pi veloci e complete Il campione biologico prelevato per indagini microbiologiche potr essere sottoposto ad analisi aggiuntive per la caratterizzazione dei patogeni presenti Questo rappresenta un importante valore aggiunto poich in una stessa seduta analitica potrebbero emergere informazioni fino ad oggi non disponibili consentendo una diagnosi innovativa e precoce nelle urine infatti possono essere individuati marcatori di patologie non ancora riscontrabili a livello sierologico La forte multidisciplinarit dei partners garantisce la sostenibilit tecnico scientifica del progetto La Diesse Ricerche
72. R 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Coordinamento gestione e rendicontazione Si prega di utilizzare questa sezione per riassumere le attivit relative alla gestione amministrazione e rendicontazione del progetto e al coordinamento del partenariato Attivit realizzate Descrivere le attivit di coordinamento gestione e rendicontazione realizzate riguardo principalmente a Costituzione e gestione del partenariato e stipula dell ATS ATI ATS costituita tra i tre partners il 31 03 2011 con mandato speciale con rappresentanza ed obbligo di rendicontazione conferito al partner 1 soggetto capofila Elaborazione ed approvazione di work plan e relativa tempistica Riunione organizzativa per approvazione work plan effettuata il 05 04 2011 partners hanno approvato il Work plan contenuto nella domanda di approvazione del progetto e sul quale hanno gi iniziato prove esplorative Definizione dei responsabili delle attivit delle diverse attivit I responsabili delle attivit coincidono con i referenti scientifici di ciascun partner indicati nell allegato B1 all atto della presentazione della domanda ogni partner responsabile per le attivit di ricerca svolte al suo interno Coordinamento e monitoraggio delle diverse fasi di attivit Ogni partner svolge
73. R CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute tamponi il reperimento di tali campioni ha presentato varie difficolt data l invasivit del prelievo La valutazione delle performance stata eseguita confrontando risultati di ciascun campione su Chorus con quelli dell Ospedale di provenienza reference method confronto con metodiche microbiologiche standard gold standard come l uso di terreni cromogeni e o identificazione biochimica oltre ad una analisi al microscopi e colorazione di GRAM a quando disponibile test di agglutinazione al lattice Per il kit C thrachomatis visto la difficolt del reperimento dei campioni e la complessit della metodica abbiamo deciso di verificarre clinicamente il test presso un laboratorio di analisi ospedaliero interessato tramite il nostro distributore Mediclim in Romania All 1 La sperimentazione interna ha incluso la collaborazione con l Ospedale Gaslini di Genova Dott Bandettini e con l Azienza Ospedaliera Universitaria Senese laboratorio di microbiologia Dott Cusi Tali sperimentazioni sono finalizzate alla verifica dell efficacia dei KIT sviluppati per la ricerca di antigeni quali Streptococco agalactiae Candida albicans e Gardnerella vaginalis in tamponi vaginali di pazienti afferenti ai laboratori prima citati
74. Srl una spin off dell azienda Diesse Diagnostica Senese Spa che da 25 anni opera nella diagnostica delle malattie infettive presente sul mercato mondiale con strumentazione e kit di propria progettazione e realizzazione con competenze in chimica immunologia biologia molecolare elettronica robotica L Universit di Siena si propone nell individuazione mediante piattaforme proteomiche di marcatori di infezioni da vari agenti patogeni per quali non sono disponibili test urinari La tecnologia SELDI ToF un approccio innovativo POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute veloce e versatile per l identificazione misurazione di biomarcatori associati a patologie e consente l analisi di molecole difficili da identificare con metodi classici Tuttavia questa metodologia non stata finora applicata alla ricerca di biomarcatori di infezione batterica nelle urine quando invece la caratterizzazione del repertorio proteico urinario la base per la ricerca di marcatori da cui sviluppare nuovi sistemi diagnostici con sensibilit specificit semplicit di utilizzo e a basso costo L Universit di Firenze si propone nella mappatura degli antigeni peptidici dei nuovi biomarcatori identificati con l approccio proteomico tramite la sintesi di una serie di peptidi c
75. a molto pi compatta sia rispetto al RGB che all HSV lo spazio di colon Lab infatti costruito proprio con l obiettivo di riprodurre al meglio le differenze percepite dall occhio umano percettivamente uniforme Usando questo modello in fase di identificazione 1 nsultati sono stati nettamente migliori ma ancora non soddisfacenti Purtroppo infatti alcum colori tipici del terreno risultano essere anche tipici di alcune colonie In particolare questo succede con le infezioni di Candida e Pseudomonas ma pi in generale con tutte e tre le tipologie di infezioni che si manifestano con una colorazione gialla Sia per la Candida che per le colome cromaticamente gialle stato quindi chiaro come 1l problema derivasse da una sovrapposizione del colori del background con quelli tipici di queste infezioni Prima di tutto sfruttando il dataset Giallo e il dataset Candida POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute si provato a rappresentare nello spazio a b 1 valori dei pixel delle due tipologie Dato che come nel caso del background anche questi due dataset sono stati costruiti estraendo a mano le regioni di Interesse stato necessario applicare un taglio del pixel in base alla concentrazione per evitare di rappresentare colori introdotti accid
76. a 37 C con una telecamera che le riprendesse in maniera tale da cogliere il tempo reale di cambio colore La prova non ha dato il colore pubblicizzato dal fornitore Solo la prima provetta quindi 10 ha dato una leggera colorazione verde giallo del terreno il blu dell indolo come descritto in Fig 1 Abbiamo inoltre effettuato un video di 24h in quanto ci aspettavamo una risposta su tutte le provette POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Fig 1 A seguito stata fatta una prova partendo da una soluzione di acqua microfiltrata e aggiunto vari ceppi di Escherichia coli e altre enterobatteriacee C e stata una intensa risposta colorimetrica per i vari ceppi di Escherichia coli mentre altre specie es Streptococcus fecalis sono state inibite Fig 2 In verde ceppi di E coli e in giallo il Kes Tale studio al momento stato abbandonato a causa della selettivit del terreno solo ad alcune specie urinarie b PROVE TERRNO CON AGGIUNTA DI X GAL E X GAL LATTOSIO Lo studio bibliografico portato avanti ci ha fatto escludere l uso del reattivo di Kovac poich corrosivo ed esplosivo condizione non compatibile con le nostre necessit Abbiamo utilizzato il reattivo solido utilizzato nei cromogeni ma ha mostrato in 2 diversi esperimenti la non c
77. a della regione background 2 e del picco della regione analizzata regioni 6 e 7 separatamente o assieme 4 Se 1 picchi sull asse H sono sufficientemente distanti fra loro si calcola una soglia di separazione con il metodo di Otsu e la si usa per decidere se 1 pixel della regione di incertezza appartengano al background o alle colome gialle 5 Se i picchi non sono sufficientemente distanti la regione analizzata carattenzzata da valori di H che non si discostano molto da quelli gia etichettati come terreno e quindi possono essere identificati come tall 3 6 5 Rilevamento di infezione da Candida POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute La Candida ha una colorazione tipica che si sovrappone completamente a quella del terreno di coltura Figura 3 10 dato che tuttavia non vi una siemificativa sovrapposizione con 1 colori delle colonie gialle Figura 3 12 per isolarla dallo sfondo stato deciso di analizzare solo le regioni che nel precedente paragrafo sono state etichettate come regioni 2 e 3 nspettivamente background senza edge e edge del background La vanazione della Candida rispetto al terreno visivamente meno percettibile rispetto a quella rilevabile con le altre tipologie di infezione spesso infatti si im grado di rilevarne la
78. a di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute attpigongigi Si inseriscono gli agitatori per provette Saiid alice Robobact Telecamera Lettore Barcode ATTIVITA 2 Sviluppo software di elaborazione Lo sviluppo del software cosi come richiesto dall attivit precedente stato per il momento realizzato per il riconoscimento di colonie nate su piastra a seguito di semina manuale e non automatica Questo per facilitare e velocizzare l ottenimento di strumenti da applicare in piccole valutazioni interne POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute ESCHERICHIA COLI ENTEROCOCCUS FAECALIS CANDIDA I PSEUDOMONAS AERUGINOSA STAPHYLOCOCCUS AUREUS PROTEUS MIRABILIS es di libreria immagini su piastra es elaborazione Questa attivit stata ripresa e conclusa svolgendo un progetto abbastanza complesso e articolato come riportato di seguito POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Durante un prima fase stat
79. a negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute 3 4 Interfaccia grafica Utilizzando QtCreator stata creata una semplice interfaccia grafica che permette di effettuare l acquisizione tramite webcam oppure di caricare un immagine precedentemente salvata Dovendo lavorare con infezioni battenche e non potendo avere a disposizione campioni acquisiti in tempo reale durante l intera fase di sviluppo del software stato utile inserire la funzionalita di load al fine di poter lavorare con un dataset di immagini precedentemente acquisite Inoltre stata inserita la possibilit di selezionare un nuovo insieme di immagini dal quale estrarre 1 dataset delle vane tipologie di infezione e successivamente maddestrare 1l classificatore delle colonie batteriche su nuovi dati Mamina Shop Load image Dataset Extraction Training bidel Figura 3 2 Interfaccia Grafica POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute 3 5 Acquisizione video e rilevazione della piastra Per prima cosa il software mette a fuoco l immagine catturata dalla webcam e ne setta alcune propriet dimensione 800x600 Vengono poi catturati 1 singoli frame dallo stream video e visualizzati nell
80. a ottimale POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute La soglia S scelta con un livello di grigio corrispondente alla minima probabilit p s tra 1 piechi delle due distribuzioni normali e conseguentemente si ha una segmentazione con 1l minimo errore ossia si ha 11 numero mimmo di pixel non appartenenti all oggetto oppure allo sfondo Ogni valore di soglia S determina due vananze una per 1 livelli di grigio minori di S ed una per quelli maggiore di 5 Il metodo di thresholding ottimale introdotto da Otsu cerca la soglia andando a mnumzzare la somma pesata delle vananze within group tra 1 due gruppi usando come pesi le probabilit del rispettivi gruppi Ciascun gruppo dovrebbe avere una distribuzione ummodale a forma di campana approssimabile ad una Gaussiana una distaibuta attorno ad una media pi bassa e una attorno ad una media pi alta Questo implica che vi una relazione di omogeneita dei livelli di grigio appartenenti ad ogni raggruppamento Si puo usare la varianza come misura di omogeneit un raggruppamento con alta omogeneit avra una varianza bassa e viceversa a una bassa omogenelta corrispondera una varianza alta Per calcolare la soglia di segmentazione per 1 due gruppi necessario garantire una varlanza tra gruppi minima o in altern
81. accesso di ciascun rack avviene attraverso l apertura verticale di singole saracinesche di accesso in modo da evitare dispersioni esterne di calore 4 Sistema di accesso multiplo per poter inserire pochi campioni alla volta vedi punto 3 Vista di rack contenenti provette con slitte di accesso al termostato nella parte posteriore dello strumento E stata inoltre progettata e realizzata una scheda di controllo per la termostatazione ATTIVITA 4 Software di controllo per il monitoraggio degli eventi in funzione del tipo di sensore da utilizzare Questa attivit stata completamente eseguita e conclusa Studio e realizzazione di algoritmi di elaborazioni dei segnali provenienti dai sensori POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute esempio di grafico acquisizione livelli di CO2 da sensore ATTIVITA 5 Sviluppo di terreni adatti alla nuova procedura e di terreni con varie associazioni di antibiotici Al momento vengono utilizzati terreni di commercio anche se doppio concentrati EUGON BROTH 2X Becton Dickinson ATTIVITA 6 Sperimentazione interna ed esterna sia su ceppi di collezione che selvaggi report e manualistica Sebbene non prevista questa fase gi iniziata attraverso una valutazione interna ed esterna del
82. acquisiti o ottenuti inseriti nella piattaforma in licenza da fonti esterne a ARTEA prezzi di mercato i costi dei servizi di consulenza e di servizi equivalenti utilizzati esclusivamente al fini dell attivit di ricerca Spese generali supplementari 626 000 00 693 530 44 Tutti giustificativi derivanti direttamente dal richiesti sono stati progetto di ricerca inseriti nella piattaforma ARTEA Eventuali altri costi di 350 068 00 385 956 77 Tutti i giustificativi esercizio richiesti sono stati O inseriti nella piattaforma POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute ARTEA TOTALE 3 416 088 00 3 726 668 19 i e Commento costi sostenuti rispecchiano un avanzamento del progetto considerando che il 100 delle spese ammissibili stato raggiunto nel secondo periodo del progetto POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute 4 OBIETTIVI OPERATIVI E RISULTATI OTTENUTI Elencare gli obiettivi operativi e per ciascuno di essi rispetto al periodo di riferimento compilare una tabella come quella sotto riportata fornendo le informazioni richieste
83. ale come riferimento Sperimentazione interna ed esterna sia su ceppi di collezione che selvaggi POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute 6 RILEVAZIONE PROIEZIONI E RISULTATI INDICATORI DOCUMENTO DI ATTUAZIONE REGIONALE Indicatori di realizzazione Tori Indicatore di RESINE Valore Obiettivo operativo Unita di Misura al medio periodo Consolidare la capacit Numero di imprese regionale in R amp S finalizzato condotte da donne al trasferimento tecnologico Presenti nel partenariato N e sostegno ai processi di di progetto innovazione Indicatori di risultato Obiettivo specifico Indicatore di risultato Unit di Misura medio periodo Domande di brevetto inerenti il mercato nazionale Consolidare la competitivit all eke del aoma produttivo Indicatore di risultato Unit di Misura ae sie regionale promuovendo la a fine progetto ricerca il trasferimento tecnologico e rafforzando ea sana a processi di innovazione e rasati l imprenditorialit N presentate ad un anno dalla chiusura del progetto di cui presentate N all EPO Andr inserito il valore 1 se l impresa condotta da donne mentre andr inserito il valore zero nel caso contrario Le imprese saranno considerate a conduzione femminile quando nel caso di d
84. alibrazione della videocamera algontmi 3D Features2d nconoscitore di features salienti Objdetect nconoscimento di oggetti facce occhi persone automobili etc Highgui interfaccia per l acquisizione video codec per immagini e video etc Gpu algoritmi che supportano l accelerazione tramite GPU POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute 3 3 Struttura del software Le principali funzionalita del software sviluppato sono le seguenti Interfaccia grafica e acquisizione video Rilevamento di movimenti Identificazione piastra e salvataggio immagine Identificazione e mmozione terreno di coltura Estrazione automatica del dataset di colonie Addestramento classificatore Riconoscimento colonie e conta batterica Verifica e salvataggio del nsultati POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Aus Lione cre PEEN CAN 3 F Tr Petri FA i Fa a F ta Fi tr Ban a og da ar Fi Taa EE a a e a e eed Fi de a Fi j m EF Fi ui es ee Fi 7 TA ital pet pr F rare p
85. allo studio ed acquisizione di metodiche per la realizzazione di vaccini glicoconiugati nei quali antigeni polisaccaridici capsulari sono coniugati con proteine che fungono da carrier e che inducono immunit cellulo mediata e memoria immunologica Parallelamente si prosegue alla verifica di fattibilit di kit di identificazione con i Mab selezionati le cui caratterizzazioni sono riportati di seguito POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute CARATTERIZZAZIONE ANTIGENI E ANTICORPI 19K Proteina 19K coniugata con l istidina Per l immunizzazione stata utilizzata la proteina 19K coniugata con la GST la proteina 19 His stata utilizzata per tutti i test di screening e di specificit LPS ESTRAZIONE Crescita batteri gt 48 72h Sono stati raccolti e sospesi in acqua Leggere Asm circa 1 0 abbiamo raccolto 8 piastre e le abbiamo diluite in 22 ml di H 0 Diluizione 1 15 con H 0 Sospensione totale 330 ml Sono stati messi 165 ml di questa soluzione in 2 boli da 400 ml con tappo a vite e centrifugati per 2 a 4 000 rpm Il pellet era raccolto in un unico bolo e solubilizzato in 11 ml di lising butter LISIT JEF 2 SDS 4 2 mercaptoetanolo 10 glicerolo 1M Tris pH 6 8 0 05 blu di bromofenolo Segue incubazione di 10 a 10
86. ando al rosso a 360 Per saturazione si intende l intensita e la purezza della singola tonalit S varia da 0 sull asse V a 1 sulla superficie della piramide La luminosit V infine un indicazione della brillantezza del colore e anch essa varia tra 0 vertice della piramide corrispondente al nero e 1 base della piramide corrispondente al bianco La scala dei grigi si trova quindi sull asse V 2 5 Mean Shift Segmentation Mean Shift una tecnica di clustering non parametrica ovvero non fa alcuna assunzione circa la forma della distribuzione dei dati in analisi E stato quindi utile sfruttare questa tecnica per creare segmentare l immagine in analisi in base al colore del pixel POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Ipotizzando di lavorare con una distribuzione multivariata caso reale vogliamo andare a identificare 1 prototipi del possibili cluster Considenamo quindi di avere a disposizione un dataset contenente 1 punti x per i 1 n appartenenti a uno spazio d dimensionale Rt Per prima cosa necessario stimare la densit di probabilit per poter poi individuare le mode presenti Per la stima della densit di probabilita non parametrica useremo la tecnica Parzen Window La probabilit che un vettore x cada in
87. apposte regioni in rosso in Figura 3 10 e 3 11 insieme ad altre informazioni locali possibile separare 1l background da queste tipologie di colonie Dato che la regione rappresentante la Candida non si sovrappone in maniera nlevante con quella tipica del Giallo Figura 3 12 stato inoltre possibile sviluppare due procedure separate per l identificazione delle due tipologie di infezione O 15 30 45 60 75 90 105120135 150165180195210225 240255 Figura 3 12 Sovrapposizione fra Candida verde e colonie gialle giallo 3 6 3 Identificazione del background Per identificare il terreno di coltura come prima fase stato applicato l algoritmo di clustermg Mean Shift in modo da raggruppare 1 pixel in segmenti in base alle loro componenti cromatiche e alla loro disposizione spaziale Successivamente dopo aver convertito l immagine in Lab s1 controlla se 1 segmenti estratti da Mean Shift 1l colore risultante corrisponde alla moda della distribuzione appartengono alla regione identificata dalla maschera in Figura 3 7 In tal caso 1 pixel vengono identificati come potenziali pixel di background Come gia detto usando solo questo tipo di informazione non si riesce a distinguere correttamente il terreno n dalle colonie Gialle n dalla Candida Figura 3 13 POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale cong
88. artner 1 In caso di variante progettuale autorizzata si deve fare riferimento al nuovo piano finanziario e al nuovo cronoprogramma approvato POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute 5 AGGIORNAMENTO DEL CRONOPROGRAMMA Si prega di riprogrammare le attivit all interno del cronoprogramma in funzione dei risultati raggiunti nel periodo di riferimento per disporre di una visione aggiornata di quest ultimo Quello sotto riportato un format che pu essere adeguato alle singole esigenze Mesi Attivit 7 1 aaa Milestones 7 001 Ricerca e 1 ldentificazione sviluppo di reagenti 2 Mappatura i mea a Immunologici ver LEE LE DERES 4 lmmobilizzazione peptidi OO 2 1 Produzione Realizzazione dei anticorpi mono e kit e loro policlonali applicazioni 2 Realizzazione kit automatiche diagnostici piastra Elisa 3 Sperimentazione Interna 4 Automazione su Chorus 5 Sperimentazione interna con Chorus 6 Sperimentazione esterna e file tecnico 1 Studio contenitore OO 3 Realizzazione preparatore 2 Adattabilita campioni 3 Meccanica strumento 4 Studio contenitori e terreni 5 Associazione univoca 6 Sterilit manualistica 1 Studio sensoristica 2 Tempistica ciclo 00 4 Realizzazione strumento sc
89. ates Valore atteso Obiettivo specifico Indicatore di impatto Unita di Misura a fine progetto a a ricerca di cui donne Numero di posti di lavoro creati nella ricerca in fase di cantiere Consolidare la competitivit di cui donne A del sistema produttivo UL L lavoro creati nella 1 regionale promuovendo la ricerca il trasferimento Numero di posti di tecnologico e rafforzando lavoro creati nella processi di innovazione e ricerca in fase di Je i TP 1 l imprenditorialit gestione as To as ae A A A A A di cui donne A A A Numero di posti di lavoro creati da aiuti agli investimenti delle imprese beneficiarie Posti di lavoro creati complessivamente nella ricerca dati dalla sommatoria dei posti di lavoro creati in fase di cantiere e in fase di gestione Deve essere inserito il numero di addetti alla R amp S occupati in via temporanea per la realizzazione del progetto di ricerca L indicatore va espresso in ULA che costituisce la quantit di lavoro prestata nell anno da un occupato a tempo pieno Ad esempio due occupati che lavorano un anno ciascuno met giornata rappresenteranno una ULA si Vanno inseriti i posti di lavoro non temporanei creati dal progetto dedicati allo svolgimento di attivit di R amp S L indicatore va espresso in ULA 11 ops MINT j Vanno inseriti i nuovi posti di lavoro permanenti che si creano nell impresa alla conclusione del progett
90. ativa massimizzare la differenza tra le medie del due gruppi Indichiamo con g i 5 la somma pesata delle varianze dei gruppi ovvero la within group variance Sia of S la varianza del gruppo con livelli di grigio inferiori ad S e of S quella relativa al gruppo avente livelli di grigio superiori ad S In corrispondenza di una soglia S la probabilit che un pixel appartenga al primo gruppo oppure al secondo data da a PO O pM 1 a S 2 37 i 0 i 5 1 POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Con u S e S indichiamo rispettivamente le medie del primo e del secondo gruppo generate dalla soglia S di seguito definite lp l 8 a2 BO 2 38 q2 5 Possiamo quindi calcolare le vananze rS l a S pd qi S p 2 39 imssali 7 H2 S p 1 q2 5 che dipendono solo dalla soglia S La varianza within group gx 5 definita come o3 S q1 S o2 S 42 5 08 5 2 40 La migliore soglia puo essere ottenuta mediante un metodo di ricerca sequenziale attraverso tutti i possibili valori di S che minimizzano g j S Vi una relazione tra la varianza o4 S e quella totale o indipendente da S e definita da 255 c x 2 n D 2 41 i 0 dove p 720 Ip 1 La relazione tra le due varianze rende il calcolo della soglia
91. attraverso la produzione di una tossina la streptolisina Stenotrophomonas Maltophilia batterio Gram negativo molto diffuso nella flora batterica dell uomo nelle acque e nel suolo Spesso causa di infezioni gravi nei reparti di terapia intensiva Batterio anaerobico facoltativo batterio che cresce sia in presenza che in assenza di ossigeno Spp che comprende ogni tipo di specie di quel batterio POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Denitrificazione capacit dei batteri di convertire i composti di azoto solubili in azoto gassoso Infine esiste un quarto gruppo di batteri in cui sono compresi microrganismi contaminanti come difteroidi e lattobacilli 1 2 Analisi dei campioni di urina Per rilevare ed analizzare il tipo di infezione occorre effettuare l urinocoltura sottoponendo i campioni di urina a condizioni che ne favoriscano la proliferazione batterica A tale scopo vengono usati terreni di coltura che hanno il compito di ricreare artificialmente l ambiente favorevole allo sviluppo e alla crescita dei batteri Un terreno nutritivo deve contenere un bilanciamento di sostanze organiche e inorganiche necessarie alla crescita terreni di coltura vengono utilizzati per molteplici applicazioni quali ad esempio il conteggio e l isolamento dei m
92. barattolo al quale viene applicata una etichetta barcode per l identificazione del paziente e poich il preparatore trasferisce una aliquota di questa in una provetta per l analizzatore necessario che quest ultima sia dotata di un codice a barre univoco per permettere l associazione univoca tra barcode paziente e barcode provetta analizzatore i l l l provetta barattolo l Provetta Completa di tappo e codice a barre univoco N Questa procedura stata applicata utilizzando strumenti software gi descritti in un brevetto DIESSE chiamato IdSystem ATTIVITA 6 Validazione sterilit ed eventuale carry over piu report e manualistica Questa attivit eseguita e completamente conclusa VALIDAZIONE STERILITA Da numerose prove eseguite emerso che nel preparatore c assenza di inquinamento VERIFICA CARRY OVER Da prove eseguite risultano assenti significativi fenomeni di Carry Over Analizzando i cicli analitici dei Laboratori degli ospedali di Novi Ligure che di Pievesestina FC si dimostra chiaramente che nono sussiste un carry over funzionale nel senso che il nostro sistema diagnostico in grado di distinguere un campione leggi paziente positivo leggi ammalato da un negativo leggi sano REPORT E MANUALISTICA Il preparatore viene al momento fornito di 1_ Prima versione di manuale utente QUICK START POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegn
93. cedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Bibliografia 1 M Polsineli M De Felice A Galiz7i E Gall G Mastromel P Mazza G Viale Microbiologia Bollati Bonnghien 1993 2 A Camporese L esame microbiologico dell urina Riv Med Lab JLM Vol 3 N 1 2002 3 Bio Rad Laboratories UnSelect TM 4 Clinical Microbiology Bacteriology http did it contenuti biorad UnSelect pdf 4 Bio Rad Laboratories UriSelect TM 4 Isolation and counting of urinary pathogens http www techmicrobio eu documentation fabncants Biorad o20diagn ostics o20pasteur pdf 55800 pdf 5 B T Cenci Goga La coltivazione dei batteri http unipg it cencigog batten pdf 6 D A Forsyth J Ponce Computer Vision A Modern Approach Prentice Hall 2 Ed 2011 POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute 7 R Szeliski Computer Vision Algorithms and Applications Springer 2011 8 M Shah Fundamentals of Computer Vision http www cs ucf edu courses cap641 1 book pdf 9 J C Russ The Image Processing Handbook CRC Press Sixth Edition 2011 10 T Acharya A K Ray Image Processing Principles and Applications Wiley 2005
94. ciascun partner ha gia effettuato antecedentemente alla costituzione dell ATS riunioni periodiche 15 0 11 28 11 11 16 04 12 e 9 05 12 tutte eccetto l ultima presso partner 1 capofila presentata variante in data 23 05 2012 n 2 varianti per partner 1 e 2 che hanno riguardato per il partner 1 Diesse Ricerche una rimodulazione dei costi del personale all interno della voce stessa tra le varie figure previste e per il partner 2 UNISI il cambio del nome del Dipartimento Avvio della raccolta dei giustificativi di spesa e di tutta la documentazione necessaria per la rendicontazione da parte del capofila Riguardo alle attivit relative alla gestione amministrazione e rendicontazione del progetto e al coordinamento del partenariato sono emerse delle difformit che che hanno richiesto delle varianti per i partner 1 2 e 3 che riguarderanno rimodulazioni del budget superiori al 20 Costi sostenuti Inserire i costi sostenuti da ciascun partner per lo svolgimento dell obiettivo operativo di coordinamento gestione e rendicontazione PARTNER 1 34 702 07 PARTNER 2 68 597 04 In caso di variante progettuale autorizzata si deve fare riferimento al nuovo piano finanziario e al nuovo cronoprogramma approvato POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di
95. colorazione delle colonie sono le seguenti e Escherichia Coli Figura 3 20 fa e Enterococcus Faecalis Figura 3 20 b e Gruppo KES Figura 3 20 c e Streptococcus Agalactiae Figura 3 20 d e Proteus Figura 3 20 e e Pseudomonas Figura 3 20 f e Staphylococcus Aureus Figura 3 20 g e Candida Figura 3 20 h b POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Figura 3 20 Piastre di Petri delle tipologie di infezioni classificate Identificare le diverse tipologie di colonie batteriche non stato un compito banale sia perch come si pu vedere in Figura 3 20 vi sono pi tipologie di infezioni che si manifestano con colorazioni simili sia per la frequente contemporanea presenza di pi infezioni che pu provocare modiche nella tonalit dei colori delle singole colonie creando quindi ulteriori difficolta in fase di classificazione LI E stato pertanto messo a punto un procedimento a pi fasi Per prima cosa si suddividono le classi di infezione in gruppi con colorazione simile per facilitarne la distinguibilita e permettere una preclassificazione delle colonie Sfruttando questa prima classificazione sono poi stati usati classificatori specializzati che basandosi sia su feature cromatiche che su altre tipologie di
96. con Kernel KBI 3 3 dove y 0 5 e il valore di costo C 50 Il primo classificatore andra a lavorare nella regione che stata pre etichettata come contenente colome blu e dovra riconoscere le tre tipologie di infezione che s manifestano con questa colorazione Kes Faecalis e S Agalactiae mentre il secondo stato addestrato per riconoscere le colonie con colorazione gialla Proteus Pseudomonas e S Aureus Classificatore Kes Faecalis e S Agalactiae con test set contenente solo piaster in cui presente una sola tipologia di infezione Numero totale dei segmenti analizzati 9405 Segmenti classificati correttamente 8702 92 52533 5 Segmenti classificati in modo errato 703 7 4747 amp Detailed Accuracy By Class TP Rate FP Rate Precision Recall F Measure MEC BOC Area PRC Area Class 0 963 0 014 O 983 O 963 O 973 O 951 O 976 O 965 0 O 930 0 O72 O 913 O 830 O 922 O 857 O 930 0 882 1 O 756 O O31 O 750 O 756 0 159 O 722 0 863 0 595 2 Weighted Avg 0 925 O 042 O 926 O 925 O 926 O 884 O 943 0 887 Contusion Matrix Al p Classified as 3957 146 a O KES 45 3976 2751 b 1 Faecalis 26 226 779 cm 2 8 Agalactiae POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Classificatore Kes Faecalis e
97. contro una popolazione di campioni pi ampia e pi eterogenea al fine di restringere il numero dei picchi e portare avanti solo quelli con il maggior valore predittivo pi robusti Abbiamo ampliato la casistica a nostra disposizione analizzando fino ad oggi un totale di 22 campioni di urine da pazienti infettati da L pneumophila ed altrettanti campioni di urine da pazienti sani utilizzate come controllo Inoltre abbiamo analizzato 6 campioni di urine da POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute pazienti positivi all infezione da Mycobactrerium tubercolosis TBC al fine di definire quali tra picchi da noi selezionati fossero presenti in maniera esclusiva nelle urine positive alla L pneumophila e quindi reali potenziali biomarcatori di tale infezione oppure se la loro presenza fosse una semplice conseguenza di una generica infezione batterica a carico del sistema respiratorio L analisi degli spettri di massa ottenuti e suddivisi secondo il protocollo di acquisizione ha portato ai seguenti risultati CM10 10k i picchi a 4351 281 m z e a 13437 167 m z sono stati confermati e validati come L pneumophila specifici CM10 20k solo il picco a 11746 706 m z stato confermato come L pneumophila specifico CM10 35k entrambi i picchi precedentemente selezionati
98. cuo a 360 La realizzazione di due strumenti ha portato alla crescita numerica del personale scientifico dedicato al progetto E stato istituito un laboratorio di ricerca e sviluppo meccanico POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute 3 VALUTAZIONE DI CONGRUIT DELLE SPESE E DEL LORO AVANZAMENTO IN RELAZIONE ALLO STATO DI AVANZAMENTO DEL PROGETTO Ai fini della valutazione di congruit delle spese e del loro avanzamento indicare costi sostenuti e quelli effettivamente inseriti nella piattaforma Artea per la rendicontazione ed esporre un commento in relazione allo stato di avanzamento del progetto Costi richiesti dal Costi sostenuti Documenti di spesa progetto inseriti nella piattaforma ARTEA per la rendicontazione Spese di personale 2 2 8 020 00 2 472 074 97 Tutti giustificativi richiesti sono stati inseriti nella piattaforma Costi degli strumenti e delle 0 00 0 00 attrezzature nella misura e per il periodo in cui sono utilizzati per il progetto di ricerca acquisto prodotti ad alta tecnologia Costi dei fabbricati e dei terreni 0 00 0 00 Costi della ricerca contrattuale 162 000 00 175 106 01 giustificativi delle competenze tecniche e richiesti sono stati dei brevetti
99. dati sul tre canali sicuramente inefficiente Per le elaboraziom che implicano il miglioramento della qualita di un immagine nsultano sicuramente pi efficaci 1 modelli del colore in cui la componente di intensit spesso denominata luminanza separata da quelle di crommnanza 2 4 2 XYZ I colon primar associati allo spazio XYZ sono virtuali in quanto non possono essere rappresentati in natura dal momento che contengono valori negativi nel loro spettro Possiamo distinguere tre caratteristiche del colore e Luminosita intensit del colore e Tonalit 1l colore dominante percepito e Saturazione la purezza del colore o la quantita di luce bianca mischiata al colore dominante I tre colori primari immaginari sono stati denominati X Y e Z X corrisponde a un rosso violaceo ipersaturo contraddistinto da due picchi nello spettro cromatico Y e Z comspondono a tinte spettrali sempre irrealisticamente ipersature Inoltre la tinta Y corrispondente al verde ipersaturo ha un andamento proporzionale alla nostra sensibilita alla luminosit delle tinte Scelti 1 tre priman tramite 1 quali possibile ottenere per sintesi additiva qualsiasi tinta reale si definisce uno spazio tridimensionale di cui essi costituiscono gli assi POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e
100. dazione di dieci picchi proteici in grado di discriminate in modo statisticamente significativo pazienti infettati da L pneumophila dai controlli sani Sette picchi proteici sono stati parzialmente validati come biomarcatori urinari dell infezione da L pneumophila Tali picchi vanno a costituire una signature proteica in grado di discriminare tra pazienti infettati e non con sensibilit oltre il 95 e specificit del 100 Utilizzando le urine TBC positive come gruppo di controllo ci ha permesso di scartare 2 dei 10 potenziali biomarcatori in quanto sono risultati essere a comune tra le due infezioni Tuttavia l analisi comparativa non ha portato alla luce nessun picco proteico presente esclusivamente nelle urine TBC e quindi nessun potenziale marcatore specifico per l infezione da Mycobactrerium tubercolosis Successivamente alla fase di validazione dei potenziali biomarcatori selezionati tramite spettrometria di massa SELDI ToF relazione intermedia abbiamo deciso di applicare altre tecniche proteomiche come l elettroforesi bidimensionale computerizzata cos da poter sfruttare la complementarit dei due approcci In breve i campioni sono stati preparati come descritto di seguito Circa 8 5 mL del pool di urine positive sono stati concentrati Vivaspin cut off 3 kDa fino ad 1 mL e arricchiti nel loro contenuto proteico con ProteoMiner BIORAD La stessa procedura stata applicata al pool di campioni di urine negative
101. dentro ogni campione per evitare carry over 5_ presenza di un sistema di sfiato per evitare contropressioni dovute alla successiva fase di dispensazione dell aliquota di campione in provetta chiusa contenente terreno POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute 6_ compatibilit con la fase di sanitizzazione con soluzioni disinfettanti tra un campione urinario ed il successivo per evitare carry over Esempio di provette e piercing Figura 1 Provetta vuota Figura 2 Campione biologico _ foro foro foro Figura 5 Campione in Figura 4 Campione in quantit massima quantit minima POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Parte superiore gola Porta cannula condotto di aspirazione cannula Figura 12 Parte superiore dell ago in trasparenza Figura 13 Particolare Figura 7 Ago aspirazione dispensazione campioni ATTIVITA 3 Meccanica dello strumento Dopo aver messo a punto i materiali di base relativi all attivit precedente 2 si proceduto alla progettazione e realizzazione della meccanica dello strument
102. di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute antigene ricombinante nei nostri laboratori di biologia molecolare Abbiamo utilizzato questi antigeni separatamente per immunizzare topi Balb c Un altro lotto di topi stato immunizzati con un estratto antigeni da patina batterica opportunamente trattato per un arricchimento in antigeni solubili tra cui la 19K Le fusioni eseguite hanno permesso l individuazione di un numero significativo di Mab specifici per la 19K Tra questi sono stati selezionati cloni 17 19 e 16 5 caratterizzati per specificit reattivit con altre specie batteriche immunoreattivit test Elisa e B su batteri interi LPS estratto 19K ricombinante isotipo lIgG2b e competitivit reciproca Per LPS la maggior parte di Mab selezionati sono risultati di classe IgM e solo 1 clone di classe IgG1 Questi risultati sono plausibili considerando il tipo di risposta umorale indotta da antigeni polisaccaridici tipicamente T indipendente con risposta umorale principalmente rappresentata da anticorpi IgM La scarsa immunogenicita di LPS e la necessit di avere Mab non solo specifici ma ad alta affinit quindi Ab di classe IgG per LPS che rappresenta l antigene pi rappresentato ci induce ad aprire uno studio non previsto nella pianificazione di questo progetto che corrisponde
103. dimento di voting viene quindi scandito l intervallo discreto dei raggi e per ogni punto vengono incrementate le celle attraversate dalla circonferenza centrata nel punto ed avente raggio pani al valore corrente del raggio Ipoteticamente la trasformata pu essere applicata a qualsiasi equazione parametrica ma la limitazione pi grande e dovuta all elevata complessita computazionale che cresce con l aumentare del numero di parametri Se non si usano particolari accorgimenti o Informazioni conosciute utilizzare equazioni con un numero di parametri superiore a quattro pu diventare particolarmente critico dal punto di vista computazionale poich necessario un array a molte dimensioni con conseguente utilizzo eccessivo di memoria POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute 2 3 Filtri Per provare ad eliminare dalle immagini l eventuale rumore sale e pepe oppure gli spike isolati introdotti dal sistema di acquisizione stato necessario applicare alcuni filtri 2 3 1 Filtro Mediano Se l obiettivo del filtraggio la riduzione del rumore ma non il blurring cio se si desidera una immagine meno rumorosa ma che mantenga 1 dettagli 1 filtri di media non danno risultati soddisfacenti 51 pu ricorrere quindi al filtro mediano 10 cap 6 4 6
104. e condizioni di luce differenti inoltre sono state fornite altre 33 immagini di piastre fotografate una sola volta Il totale delle immagini a disposizione quindi 269 Avere piu foto di una stessa piastra stato utile perch seppur contenendo le stesse colonie nel diversi scatti le condizioni ambientali erano sempre diverse Al fine di valutare le reali prestazioni del modello si deciso di suddividere il dataset nel seguente modo e Training set 72 immagini e Validation set 164 1mmagim foto in posizioni differenti delle 72 usate in fase di training e Test set 33 immagini piastre catturate in una sola posizione e quindi mai viste in addestramento Contranamente a quanto avviene normalmente 11 training set di dimensioni inferiori al validation set durante la fase di progettazione del modulo di classificazione POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute tuttavia 1 dataset verranno estratti automaticamente sfruttando la procedura descritta nel paragrafi successivi e sostanzialmente verranno scambiati Avendo infatti a disposizione un unico dataset di dimensioni piuttosto limitate eviteremo di addestrare e testare 11 modello per il rilevamento del background sulle stesse immagini Oltre a quello dei background sta
105. e sperimentazione interna ed esterna in COrso Denominato PlusFinder Analizzatore Il prodotto stato ufficialmente presentato al mercato italiano da Diesse Diagnostica Senese Spa in occasione del XLI congresso AMCLI a Rimini Novembre 2012 2013 2014 Presentata anche alla mostra Internazionale della medicina denominata MEDICA che si svolge in Germania nov 2013 e 2014 codice vendita 94800 POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Costi sostenuti Indicare i costi sostenuti da ciascun partner per lo svolgimento dell obiettivo operativo PARTNER 1 530 082 90 In caso di variante progettuale autorizzata si deve fare riferimento al nuovo piano finanziario e al nuovo cronoprogramma approvato POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Obiettivo operativo 5 Realizzazione di uno strumento per isolamento ed identificazione in campioni microbiologici Attivit realizzate Illustrare le attivit realizzate specificando il ruolo di ciascun partner del progetto Tutte le attivit di questo obiettivo sono di competenza del solo partner capofi
106. ean Shift e in d la sua densit e le mode trovate 2 6 Edge Detection Filtro di Sobel I contorni edge in Inglese sono associati a caratteristiche locali delle immagini e contengono informazioni importanti per operazioni quali la segmentazione la descrizione degli oggetti 11 template matching 1l tracking etc Gli edge 7 cap 4 2 1 altro non sono che pixel che si trovano al confine di due regioni che hanno intensit pi in generale caratteristiche visive differenti Quindi la nlevazione di questo tipo di feature stata molto importante al fine di verificare la presenza di colonie batteriche all interno delle piastre di Petri POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute In una dimensione la transizione da un livello di grigio ad un altro evidenzia un picco nella denvata raggiungendo 1l massimo nel punto di flesso Ne consegue quindi che 1l modo pi semplice per rilevare un edge effettuare un operazione di thresholding sulla derivata Figura 2 16 Procedura di rilevazione edge 1D Tuttavia la rilevazione degli edge influenzata non soltanto dall intensit ma anche dalla direzione verticale onzzontale o diagonale del contorno Usando POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale S
107. edical diagnostics device described hereafter and the version distributed on the market conforms to the 98 79 EEC directive relevant to the In Vitro Medical Diagnostics Devices IVD through the accomplishment to the Annex III except section 6 and the essential requirements of Annex This certificate will lose its validity in the event of unauthorised modifications are made to the unit incorrect use of the instrument technical interventions performed by unauthorized personnel installation of non original spare parts Product Automatic instrument for preparation of the screening test of bacteriuria Type PLUS FINDER PREPARATOR Technical data 110 120 230 Vac 56 60 Hz conforms as a whole and in its parts with the following standards and their amendments POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute EN 61010 1 Safety requirements for electrical equipment for measurement control and laboratory use Part 1 General requirements EN 61326 1 Electrical Equipment for Measurement Control and Laboratory Use Electromagnetic compatibility requirements Part 1 General requirements EN 61326 2 6 Electrical Equipment for Measurement Control and Laboratory Use Electromagnetic compatibility requirements Part 2 6
108. ei dataset mentre in fase di classificazione questi accorgimenti non possono essere sfruttati in quanto la classe di appartenenza delle colonie non nota a prion POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute a b re d Figura 3 19 Nelle immagini a e c il background stato estratto con il metodo standard mentre nelle immagini b e d il riconoscimento del terreno stato raffinato per la creazione utilizzandola conoscenza a priori sulle colonie POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Visto che la procedura descritta permette di isolare efficacemente le colonie batteriche dal terreno di coltura pu essere usata anche in maniera inversa per creare dataset per 1 terreni di coltura pi precisi di quelli estratti manualmente Per quanto riguarda invece la creazione del dataset contenente le colonie di Candida la procedura non efficiente intatti come gia visto nei precedenti paragrafi sfruttando questo metodo la Candida mmane indistinta all interno della regione contenente gli edge del terreno Per estrarre automaticamente da queste regioni solo 1 pixel
109. entalmente ma non effettivamente appartenenti alle colome D gt s i 180 260 225 225 id 210 195 195 180 180 165 165 2 159 2 159 135 siii 135 si 150 120 105 105 SI aj Ps 75 60 60 di 85 30 si 30 si 15 15 n T T T T T T T T T E E E sft fe F E 0 LE E T i fT T T Li E E T 1 015 3045 5 mA l0165150195210225240755 O 15 30 4 OS 90105120135 150 16518019571025 4055 Pi a Figura 3 9 Distribuzione dei colori nello spazio a b delle colonie gialle a sinistra e della Candida a destra Sovrapponendo questi valori Figura 3 9 con quelli ottenuti per 11 background Figura 3 7 si pu notare che per la Candida la sovrapposizione con il background totale mentre per 1l Giallo non cos 255 155 240 240 235 25 210 710 195 195 180 180 165 165 a 159 2 150 l 135 d 135 120 120 105 105 59 99 15 Th 60 60 5 45 30 30 15 15 D 15 30 45 60 75 90105120133 150163 180195210225 240255 D 15 30 45 60 75 90105120135 150165180195210225 240355 i POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Figura 3 10 Sovrapposizione rosso fra Figura 3 11 Sovrapposizione rosso tra Candida e background blu background blu e le colonie gialle giallo Utilizzando queste regioni sovr
110. enti del laboratorio di microbiologia es cappa biohazard autoclave vetreria congelatori ecc Risorse umane Indicare la percentuale di utilizzo delle risorse umane rispetto a quanto previsto PARTNER 1 Ricercatore 100 Personale Tecnico Qualificato 100 Co Co Pro come da variante approvata del 23 05 2012 100 Subcontratti Risultati raggiunti Descrivere risultati raggiunti e i punti cardine milestones di sviluppo nell attuazione delle attivit Descrivere in maniera puntuale le eventuali difformit fra i risultati attesi e i risultati conseguiti scientificamente e tecnicamente e proporre le conseguenti azioni correttive AI momento sono disponibili le basi teoriche degli algoritmi di identificazione automatica POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute delle colonie che si sviluppano su terreni cromogeni inoltre disponibile un software utilizzabile per prove su piastre seminate manualmente risultati ottenuti sono congruenti Costi sostenuti Indicare i costi sostenuti da ciascun partner per lo svolgimento dell obiettivo operativo PARTNER 1 471 184 80 In caso di variante progettuale autorizzata si deve fare riferimento al nuovo piano finanziario e al nuovo cronoprogramma approvato POR CReO FES
111. er ogni punto dello spazio immagine necessario tracciare la curva ad esso associata all interno dell accumulatore Ci viene fatto valutando l equazione che definisce la mappatura dallo spazio Immagine sullo spazio dei parametri ed incrementando ogni cella dell array accumulatore per il quale tale equazione soddisfatta Questo processo viene anche detto voting Ogni cella dell array accumulatore conterr un valore che rappresenta il numero di voti che pari al numero di curve che attraversano la cella Perci le celle che avranno il valore pi elevato corrisponderanno ai punti nello spazio dei parametri in cui si intersecano numerose curve POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute 01 0 27 03040 4040 Mi 0102030405040 708029 IO Spazio dei parametri Array accumulatore Figura 2 3 Rappresentazione dello spazio dei parametri all interno dell array accumulatore Se invece si volessero individuare contorni circolari all interno delle immagini si pu utilizzare una versione estesa della trasformata di Hough per la rilevazione di circonferenze Si consideri la seguente parametrizzazione che permette di descrivere circonferenze nel piano x a y_b r 2 3 dove a e b rappresentano il centro della circonferenza mentre r il
112. erichia coli 90 dei casi La prima serie di prove stata fatta aggiungendo dei reattivi a terreni liquidi La seconda serie a seguire sarebbe stata quella dell aggiunta di varie concentrazioni di agar a PROVE TERRENO CON AGGIUNTA DI H20 CHROM L aquaCHROM un sistema analitico la cui peculiarit l identificazione colorimetrica in blu di Escherichia coli in acqua probabile che tale prodotto presenti X gal abbreviato anche in BCIG per bromo cloro indolil galattopiranoside un composto organico consistente in una molecola di galattosio legata ad un indolo sostituito ampiamente utilizzato in biologia molecolare L X gal viene scisso dalla B galattosidasi producendo galattosio e 5 bromo 4 cloro 3 idrossindolo Quest ultimo quindi ossidato in 5 5 dibromo 4 4 dicloro indaco un composto blu insolubile Quindi se dell X gal ed un induttore della B galattosidasi molto utilizzato l IPTG sono aggiunti ad un terreno a base di agarosio in una piastra di coltura le colonie batteriche con un gene lacZ funzionale possono essere distinte dalle altre Colonie di Escherichia coli sono quasi sempre B galattosidasi positive e quindi rispondono in maniera positiva alla presenza di questo substrato N La prova stata strutturata facendo una diluizione seriale a cui stato introdotto tale composto 10 volte pi concentrate rispetto all indicazione del fornitore Le provette cos pronte sono state poste in un incubatore
113. erna dei tappi di gomma delle provette per assenza in commercio 004 Riprogettazione interna delle provette cambiando composizione da metacrilato a polistirolo per problemi di sterilizzazione 005 Conclusa 3 Dare indicazione alla data della valutazione in itinere della capacit potenziale sussistente di creare prodotti processi e servizi innovativi messa a punto uso di nuovi modelli metodologie risoluzione di problemi tecnologici scientifici ecc max 500 caratteri 001 e 002 L utilizzazione di queste tecnologie per la creazione e produzione di nuovi kit diagnostici rimasta valida e inalterata 003 e 004 E stato realizzato un prodotto vendibile ad alto contenuto tecnologico POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute 005 Rimasta inalterata la possibilit di usufruire un prodotto vendibile ad alto contenuto tecnologico 4 Elencare eventuali pubblicazioni scientifiche o altre forme di divulgazione dei risultati domande di brevetto presentate network costituiti o ai quali il raggruppamento o i singoli partner si sono associati in funzione del progetto max 500 caratteri Parte dei risultati ottenuti sono stati divulgati attraverso la compilazione di tre Tesi di Laurea Specialistica in Ingegneria informatica presso L universit deg
114. fezioni batteriche nelle urine a partire dal golden standard Legionella pneumophila Da questo punto di vista il sistema perfettamente coincidente con i risultati attesi 2 Scoperta validazione e identificazione di nuovi marcatori urinari per la diagnosi dell infezione da Legionella pneumophila per l implementazione dei kit diagnostici gi presenti sul mercato Da questo punto di vista il sistema perfettamente coincidente con i risultati attesi 3 Scoperta validazione e identificazione di marcatori proteici per altre infezioni batteriche es Streptococcus Pneumoniae Mycoplasma spp Chlamydia spp Mycobacterium Tuberculosis nelle urine di pazienti Sono iniziati degli studi preliminari su Mycobacterium Tubercolosis che hanno evidenziato una differenza tra alcuni biomarcatori di L pneumophila ma che al contrario non fanno dei rimanenti degli specifici per TBC 4 Mappa epitopica peptidica delle proteine individuate e identificazione di antigeni peptidici Completamente realizzata per Chlamydia Trachomatis 5 Produzione di immunogeni peptidici e di anticorpi monoclonali diretti contro essi In corso di sviluppo POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute 6 Produzione di un sistema diagnostico per infezioni batteriche di tipo spot te
115. he coprano le loro intere sequenze al fine di sviluppare anticorpi altamente specifici per lidentificazione automatica dei biomarcatori stessi nell urina 1 VALUTAZIONE TECNICA IN ITINERE DEL PROGETTO SCHEDA RIASSUNTIVA Parte Stato di avanzamento del progetto 1 Descrivere lo stato di avanzamento del progetto max 1500 caratteri 001 Sviluppo e messa a punto di protocolli sperimentali per l analisi SELDI ToF MS di campioni di urine da pazienti infettati da L pneumophila selezione e validazione di potenziali biomarcatori proteici urinari selezionati e validati dieci picchi proteici in grado di discriminate in modo statisticamente significativo i pazienti infettati da L pneumophila dai controlli sani sensibilit oltre il 95 e specificit del 100 Per ottenere reagenti immunologici stata scelta la Chlamydia Trachomatis come agente infettivo patogeno ed stata poi sintetizzata una libreria di peptidi per essere utilizzati nella immunizzazione di topi per ottenere anticorpi altamente selettivi 002 Realizzazione di kit diagnostici in piastra per C Albicans S Agalactiae G Vaginalis e C Trachomatis 0083 e 004 Realizzati due strumenti prototipo funzionanti Preparatore e Analizzatore con tutte le caratteristiche richieste 005 Iniziate prove studio e sviluppo di algoritmi di elaborazioni di immagine su colonie sviluppate a seguito di semina manuale e automatica ed ingegnerizzato nuovo strume
116. he trasforma un insieme di punti in un altro insieme di punti fre Defimamo la traslazione di un immagine A per mezzo di un punto z 2 2 come POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute A b z b A 2 5 Definiamo inoltre la riflessione di un immagine A come A b be A 2 6 Valgono infine tutte le operazioni insiemistiche classiche Possiamo adesso definire due operaziom morfologiche fondamentali che sono la dilatazione e l erosione la dilatazione aggiunge pixel ai contorni di un oggetto mentre l erosione li mmuove Il numero di pixel aggiunti o rimossi dipende dalla forma e dalla dimensione dell elemento strutturante In modo pi formale la dilatazione di A con B elemento strutturante si defimsce come A B z B NA 2 7 ovvero la dilatazione di A con B l insieme di tutte le traslazioni tali che B e A si sovrappongano almeno per un elemento Questa operazione rende pi spessi gli oggetti presenti in un immagine binaria Supponiamo per esempio di avere la seguente sezione d immagine POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute e
117. i I buoni risultati ottenuti con l identificazione e la mmozione del terreno di coltura consentono di sfruttare il sistema sviluppato per andare a estrarre dalle immagim solo le regioni contenenti colonie Essendo interessati a creare un dataset per ogm tipologia di infezione la procedura sopra descritta stata leggermente modificata e affinata Potendo infatti in questo caso conoscere a priori la tipologia della colonia presente nella piastra stato possibile sfruttare questa conoscenza per rendere l estrazione del terreno ancor pi precisa Per prima cosa a partire dal dataset completo a disposizione sono state inserite le immagini relative ad ognuna delle classi batteriche in directory separate Per ogni classe in particolare stato creato un training set un validation set ed un test set La conoscenza della tipologia batterica presente in una determinata immagine ha permesso POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute di applicare la procedura di riconoscimento delle colonie gialle solo alle tre tipologie battenche che si manifestano con quella colorazione mentre negli altri casi 1 riconoscimento dello sfondo stato eseguito semplicemente confrontando 1 valori prodotti da Mean Shift con quelli della maschera di background Figura 3 7 Questo
118. i antigeni batterici presenti nelle urine dei pazienti caratteristica essenziale per lo sviluppo di dispositivi diagnostici che utilizzano le urine come campioni da analizzare risultati ottenuti da questo tipo di analisi dovranno essere tuttavia integrati e confrontati con i dati provenienti dall analisi SELDI Tof allo scopo di ricercare la coppia le coppie di antigene urinario anticorpo che mostrano le migliori performance diagnostiche Circa 8 5 mL del pool di urine positive sono stati concentrati Vivaspin cut off 3 kDa fino ad 1 mL e arricchiti nel loro contenuto proteico con ProteoMiner BIORAD Quindi 20 microgrammi lane di campione sono stati risolti tramite SDS PAGE e successivamente elettrotrasferiti su membrana di nitrocellulosa Quattro repliche identiche dalla stessa membrana sono state sottoposte al seguente protocollo sperimentale I Saturazione delle membrane di nitrocellulosa II Incubazione delle membrane con anticorpi primari A questo scopo sono stati utilizzati quattro diversi anticorpi primari prodotti da DIESSE immunizzando dei topi con antigeni diversi di Legionella pneumophila 1_LEG 33B 43 2 Pab L pneumophila 19K 3_LEG 33B 2 POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute 4 LEG 132B 75 III Incubazione delle membrane con antic
119. i consulenza con Everex Srl Risultati raggiunti Descrivere i risultati raggiunti e i punti cardine milestones di sviluppo nell attuazione delle attivit Descrivere in maniera puntuale le eventuali difformit fra i risultati attesi e i risultati conseguiti scientificamente e tecnicamente e proporre le conseguenti azioni correttive risultati raggiunti per questo obiettivo operativo sono quelli precedentemente indicati come attesi ovvero 1 Strumento dotato di un sensore in grado di monitorare il fenomeno di crescita batterica 2 Realizzazione meccanica di componenti in grado di eseguire il test secondo la produttivit oraria stabilita 3 Realizzazione di un incubatore capace di raggiungere la temperature adeguata all interno della provetta tale da garantire la crescita ottimale dei microorganismi POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute 4 Software di controllo per il monitoraggio degli eventi in funzione del tipo di sensore da utilizzare 5 Scelta di un unico terreno tale da garantire la crescita di tutte le specie batteriche 6 Messa a punto di varie composizioni di terreno per quanto riguarda la scelta di antibiotici per l esecuzione dell antibiogramma la fase ancora in corso 7 La validazione del sistema mediant
120. i di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute 2_ Nel caso dei barattoli c e un lettore di codice a barre mobile che legge il codice di ciascun campione dall alto essendo esso applicato sul coperchio del contenitore I rack adattore per provetta urina esempio di barattolo per urina i rack adattore per barattolo urina c Prelievo aliquota di campione Terzo aspetto fondamentale della compatibilit multiformato del campione in ingresso il prelievo di una aliquota di campione La prima strada valutata stata quella di aprire e richiudere automaticamente ogni contenitore ma la multivariet degli stessi rendeva complicata la soluzione meccanica sia dal punto di vista progettuale che il successivo aggravio di costi sullo strumento finale La soluzione scelta stata quella di prelevare una aliquota di campione mediante un microforo piercing praticato sul tappo del contenitore sia esso in gomma o plastica da un apposito ago di acciaio stato quindi progettato un ago di acciaio con le seguenti caratteristiche 1_ punta e resistenza adatta a perforare qualsiasi tipo di tappo o coperchio presente sui flaconi 2_ punta molto fine per ridurre al massimo il diametro del foro 3_ ampio serbatoio in modo da accettare fino ad 1 5 ml di campione 4_ possibilit di collegamento ad un sensore di livello capacitivo per evitare l immersione completa dell ago stesso
121. i donne ow oo del sistema produttivo UL L A A A A A A A A Numero di posti di lavoro creati da aiuti agli investimenti delle imprese beneficiarie Posti di lavoro creati complessivamente nella ricerca dati dalla sommatoria dei posti di lavoro creati in fase di cantiere e in fase di gestione Deve essere inserito il numero di addetti alla R amp S occupati in via temporanea per la realizzazione del progetto di ricerca L indicatore va espresso in ULA che costituisce la quantit di lavoro prestata nell anno da un occupato a tempo pieno Ad esempio due occupati che lavorano un anno ciascuno met giornata rappresenteranno una ULA gt Vanno inseriti i posti di lavoro non temporanei creati dal progetto dedicati allo svolgimento di attivit di R amp S L indicatore va espresso in ULA 7 bA Ea n la s Ly L La za bs x s Vanno inseriti i nuovi posti di lavoro permanenti che si creano nell impresa al medio periodo dedicati allo svolgimento di attivit non riclassificabili come ricerca e sviluppo in senso stretto ad esempio area amministrativa produttiva commerciale segreteria L indicatore va espresso in ULA POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Indicatori di Impatto valore atteso a fine progetto wae a fee ae
122. i informatica dell Universit del Texas POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute La trasformata di Hough necessita di un passo di preprocessing finalizzato all Edge Detection es Canny Edge Detection L immagine cos ottenuta sar rappresentata in scala di grigi dove i pixel bianchi rappresentano gli edge ovvero contorni degli oggetti presenti L obiettivo dell applicazione della trasformata di Hough quello di identificare quali di questi contorni rappresentino una linea retta se pi pixel di edge sono allineati anche se non connessi tra loro viene infatti individuata una linea all interno dell immagine Per rappresentare una linea retta servono due parametri un coefficiente angolare m e una ordinata all origine C Considerato un singolo punto questo appartiene a infinite rette della forma al variare di m e c Dobbiamo quindi stabilire quali coppie m c siano in grado di individuare al meglio gli allimeamenti di pixel Fissato un punto x y l equazione y mx c andra a rappresentare una sola retta nello spazio m c corrispondente alle infinite rette che passano per x y Nello spazio parametrico vengono quindi rappresentate tante rette quanti sono 1 pixel di edge Se due di queste rette s intersecano 1 punti corrispondenti dell immag
123. i load viene quindi mandata in ingresso al modulo successivo 3 6 Identificazione e rimozione del terreno di coltura La rimozione del terreno di coltura presente all interno delle piastre consente di isolare le colonie batteriche questo semplifica sia la fase di classificazione e conta batterica che quella di estrazione automatica del dataset da usare per l addestramento del classificatori Per imparare a riconoscere 1l terreno sara necessario costruirne un modello a partire da un insieme di immagini di riferimento contenenti solo background A questo scopo 1n prima Istanza s1 proceduto alla rimozione delle colome In questa fase non essendo ancora in grado di identificare automaticamente n le colonie n il terreno stato necessario eseguire la procedura manualmente POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute 3 6 1 Estrazione manuale dei dataset Il dataset di immagini stato fornito dalla Diesse Ricerche che sfruttando le funzionalit di acquisizione descritte nel precedente paragrafo ha fotografato piastre di Petri su cui erano stat precedentemente seminati campioni di urina utilizzando la tecnica dello striscio sul terreno di coltura Uriselect 4 Il dataset composto da 236 immagmi raccolte scattando in media 3 4 foto di 72 piastre in posizioni
124. i per produzione di anticorpi monoclonali al alta affinit per lo sviluppo di kit diagnostici ad elevata specificit UniFi e Diesse Ricerche Nel corso dell attivit 2 sono stati mappati epitopi peptidici della proteina MOMP di Chlamydia Trachomatis In particolare utilizzando il software ProtScale abbiamo individuato delle sequenze peptidiche a carattere idrofilo che nella struttura della proteina protrudono verso l ambiente esterno e quindi potrebbero avere propriet antigeniche ed essere riconosciute da anticorpi Tali sequenze sono IVSLQLNKMKSRKSCGI FG2 conservata in tutti serotipi di C Trachomatis analizzati ARENPAYGRHMQDA FG3A e ARPNPAYGKHMQDA FG3B parzialmente conservate Inoltre abbiamo considerato il peptide ATTVFDVTTLDPTIAG FG1 appartenente al dominio IV della proteina MOMP e gi descritto in letteratura come POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute immunogeno peptidi sopra descritti sono stati sintetizzati utilizzando una strategia di sintesi peptidica in fase solida SPPS Solid Phase Peptide Synthesis purificati per estrazione in fase solida SPE e successiva cromatografia HPLC in fase inversa e caratterizzati analiticamente tramite HPLC analitica accoppiata a spettrometria di massa peptidi cos ottenuti sono stat
125. i utilizzati in saggi ELISA competitivi e indiretti Successivamente sono stati sintetizzati ulteriori tre peptidi sintetici corrispondenti alle sequenze FG1 FG3A e FG3B sopra riportate con l aggiunta di un residuo di cisteina in posizione N terminale allo scopo di produrre coniugati con opportune proteine carrier da utilizzare come immunogeni per l ottenimento di anticorpi monoclonali Il peptide FG2 contiene un residuo di Cys nella sequenza nativa e quindi non stato necessario modificarlo Le proteine carrier prescelte sono la Keyhole Limpet Hemocyanin KLH e l Albumina del Siero Bovino BSA i relativi coniugati sono stati utilizzati per le immunizzazioni e per lo screening dei sieri immuni rispettivamente Per le coniugazioni si utilizzato il protocollo basato su maleimmide in modo da legare specificamente la funzione tiolica dei residui di cisteina dei peptidi con i gruppi amminici in catena laterale di residui di lisina sulle proteine carrier Tutti i coniugati sono stati purificati per gel filtration e caratterizzati per HPLC MS Il laboratorio Toscana Biomarkers ha fornito 4 peptidi corrispondenti a sequenze appartenenti al dominio IV della proteina di membrana immunodominante MOMP ciascuno coniugato con KLH Per ciascuno dei peptidi coniugati sono stati seguiti due protocolli di immunizzazione su gruppi di topi Balb c femmine il primo con iniezioni i p dell antigene ed utilizzazione della milza come organo fornitore di
126. ia di massa SELDI alla ricerca di differenze che potessero giustificare il diverso comportamento dei due gruppi nei saggi ELISA Per questo confronto abbiamo utilizzato il campione 2869b Urina Positiva ed il campione 14660 Urina Falsa Negativa L analisi comparativa degli spettri SELDI ToF ottenuti utilizzando ProteinChip IMAC30 Cu non ha evidenziato alcuna differenza significativa nel profilo proteico dei due campioni Alcune differenze quali quantitative sono invece emerse dal confronto degli spettri SELDI ToF ottenuti utilizzando ProteinChip CM10 scambio cationico In figura 9 sono poste a confronto tre diverse regioni di m z degli spettri SELDI ToF ottenuti POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute 14660Urina Falsa Negativa 14660Urina Falsa Negativa 3 2869b Urina Positiva 2869b Urina Positiva arbitrary units 14660 Urina Falsa Negativa 14660Urina Falsa Negativa 2869b Urina Positiva 2869b Urina Positiva 14660Urina Falsa Negativa zn 14660Urina Falsa Negativa 2869b Urina Positiva 2869b Urina Positiva m Z Figura 9 Analisi degli spettri SELDI ToF rettangoli colorati evidenziano i profili proteici diversi in specifiche regioni m z ATTIVITA 3 Utilizzo dei peptidi sintetic
127. iale Sigma PUR A LYZER con taglio da 3500 Da in modo da rimuovere i sali contenuti nei campioni che potrebbero interferire con la matrice del chip Le urine sono state successivamente diluite 5 volte in Running Buffer e iniettate sul chip segnali ottenuti sono risultati bassi sugli anticorpi anti 19K e assenti sull anticorpo anti LPS risultati ottenuti sono non riproducibili e poco significativi non quindi possibile distinguere tra urine negative e urine positive Per verificare che non ci siano state perdite degli analiti durante il processo di trattamento del campione e che non ci siano problemi dovuti alla composizione fisiologica del campione di urina sono state eseguite prove di dialisi di concentrazioni note di proteina 19K e sono state aggiunte le stesse quantit note di proteina a un campione di urina negativa dializzata Da queste prove emerso che il processo di dialisi provoca una perdita non significativa di proteina e che la stessa proteina all interno di un campione di urina dializzata fornisce segnali che sono circa la met rispetto a quando diluita in Running Buffer Per tentare di rivelare l interazione tra LPS e rispettivo anticorpo il campione di LPS stato concentrato per centrifugazione con filtri da 3000 Da risospeso in PBS o in Running Buffer e iniettato sul chip a varie diluizioni ma in nessun caso sono stati registrati segnali strumentali Strumenti attrezzature Indicare quali sono stati gli strume
128. icondurre il problema del riconoscimento come negativi di campioni invece positivi da parte del kit in fase di sviluppo al diverso corredo antigenico posseduto dei campioni di urina e alla mancanza di selettori specifici per ciascuna differenza 4 Utilizzo di peptidi sintetici per screening di anticorpi in campioni di urina siero e produzione di anticorpi monoclonali ad alta affinit per lo sviluppo dei kit diagnostici ad elevata specificit Ottenimento di quattro peptidi sintetici individuati come possibili epitopi della proteine MOMP di Chlamydia Trachomatis POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Ottenimento di coniugati dei peptidi di cui sopra modificati con cisteina e legati tramite maleimmide a proteine carrier KLH e BSA per ottenere immunogeni 5 Immobilizzazione di antigeni e anticorpi su chip di un biosensore ottico per lo sviluppo di nuovi sistemi diagnostici ad elevata specificit e sensibilit Ottenimento di un chip per biosensore ottico BiaCore portante tre diversi anticorpi monoclonali anti proteina K19 e anti LPS e valutazione delle sue prestazioni per il riconoscimento di antigeni in campioni di urina Costi sostenuti Indicare i costi sostenuti da ciascun partner per lo svolgimento dell obiettivo operativo PARTNER 1 647 97
129. icrorganismi la produzione e la valutazione di preparati farmacologicamente attivi etc In base alla loro costituzione chimica i terreni di coltura si suddividono in 1 terreni minimi consentono la crescita della maggior parte dei tipi di batteri in quanto il fattore che limita lo sviluppo aggiunto in quantit minime 2 terreni comuni sono utilizzati per la coltivazione di batteri che non hanno particolari esigenze nutritive 3 terreni sintetici sono prodotti utilizzando quantit specifiche di costituenti organici e inorganici adatti ad una singola specie di batterio 4 terreni complessi sono terreni ricchi di substrati organici di cui non si conoscono le quantit precise terreni possono anche distinguersi in base alle tipologie batteriche che consentono di isolare e rilevare 5 terreni di arricchimento consentono la sopravvivenza di una sola specie batterica quindi arricchiscono un unica popolazione inibendo la crescita delle altre 6 terreni differenziali permettono di riconoscere le singole specie batteriche grazie alla presenza di indicatori delle reazioni che avvengono nello stesso terreno a terreni liquidi consentono un rilevamento pi sensibile rispetto ai terreni solidi riducendo notevolmente i tempi di coltura batterica b terreni allo stato solido sono utilizzati in contenitori di vetro o di plastica di forma cilindrica chiamati piastre o capsule di Petri Figura 1 1 Il terreno solido viene prepara
130. identificate delle sequenze peptidiche contenenti i putativi antigeni Per l identificazione di sequenze peptidiche contenenti epitopi sono stati inizialmente applicati metodi di calcolo che permettono di identificare porzioni della proteina che possono contenere POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute i siti di legame degli anticorpi tramite opportuni algoritmi predittivi Inoltre stata disegnata e sintetizzata una libreria di peptidi di sovrapposti basati sul IV dominio variabile della proteina di membrana MOMP che rappresenta una delle principali proteine della Chlamydia stata infine sintetizzata una libreria di peptidi da essere utilizzati per immunizzazione di topi cos da ottenere anticorpi altamente selettivi per i diversi serotipi di Chlamydia Trachomatis In questa fase di lavoro abbiamo testato l immunoreattivit di quattro anticorpi prodotti da DIESSE per mezzo di Western Blotting WB monodimensionale SDS PAGE utilizzando come antigene il contenuto proteico di urine di pazienti affetti da legionellosi L analisi WB si basa sulla specificit della reazione antigene anticorpo e consente di identificare antigeni specifici in una miscela complessa di proteine Questo tipo di analisi permette di selezionare l anticorpo in grado di riconoscere gl
131. ihoc Positive likelihoc 1 2544283 Cl 0 871 to 1 807 Positive likeli 3 020979021 Cl 1 824 to 5 005 Negative likelihc Negative likelihc 0 6748971 Cl 0 343 to 1 327 Negative like 0 110769231 Cl 0 029 to 0 427 Diagnostic odds 1 Diagnosticoddst 1 8586957 CI 0 663 to 5 211 Diagnostic od 27 27272727 Cl 5 466 to 136 083 Commento buona sensibilit dei risultati ottenuti con il metodo diesse confronto chorus identificazione interna Non abbiamo riscontrato una buona corrispondenza dei risultati chorus rispetto a quelli ospedalieri ci puo dipendere dal fatto che la risposta ospedaliera operatore dipendente N oppure il nostro metodo risulta eccessivamente sensibile questo stato dimostrato dall attenta analisi di un campione refertato come campione ospedaliero negativo Quanto detto compatibile con il campione n 8 risultato ospedaliero negativo campione su chorus positivo Colonia streptococco B isolata ed analizzata su chorus positiva 28 11 13 CAMPIONE ch2 ch4 ch ch8 chi0 ch12 41 83 113 141 136 144 103 48 304 464 566 606 639 591 40 160 238 289 302 318 278 43 99 139 172 169 178 135 43 85 119 154 145 152 109 4 49 242 364 442 470 491 n 4 patina mista 45 77 107 138 131 138 n 8 n 8 patina mista 40 119 173 215 216 227 n 8 colonia isolata 62 375 575 711 752 787 44 87 120 147 145 152 44 407 616 751 808 845 39 91 127 155 157 163 test con ZIM A e B non hanno reagito bene Si Riportano
132. imensioni esterne come altezza lunghezza e profondit identiche quello che cambia il numero e la dimensione degli alloggiamenti dei contenitori all interno di ciascun rack In questo modo si possono introdurre a piacere sia provette che barattoli utilizzando il rack specifico che tra l altro dotato di un codice a barre specifico per permettere al preparatore di capire quale tipologia deve essere lavorata Sono stai quindi realizzati rack porta provette da 80 posizioni e rack per barattoli da 12 posizioni b Metodologia di riconoscimento del codice a barre paziente Il preparatore deve poter leggere il codice a barre del campione urinario per tre motivi fondamentali 1 _ eseguire una procedura di check in ovvero comunicare al server centrale del laboratorio l effettivo arrivo del campione in laboratorio 2_ accoppiare Il codice del paziente a quello della provetta di analisi per non perdere la tracciabilit 3_ accoppiare Il campione alle coordinate che identificano la sua esatta posizione nel rack che lo contiene Anche in questo caso per evitare adattamenti meccanici si optato per 1_ Introduzione di un braccio robotico che in presenza di provette le estrae dal rack le posiziona davanti ad un lettore di codici a barre le mette in rotazione sino all acquisizione del codice stesso per poi riposizionarle nel rack POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progett
133. imprese e organismi di ricerca in materia di salute Fig 8 stato aliquotato del terreno solido in pozzett per micro saggi Dopo solidificazione stata seminata una curva batterica Scopo dellespenmento Valutare visivamente la non crescita determinando cosi la carica POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Fig 9 stata dispensata una goccia di sospensione batCtenca senza esseri strisciata anche in questo caso il nostro obiettivo era quello di isolare la goccia in cul non sarebbe cresciuto niente POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute i l essere ee n A az 7 E mi Fa ee Nn _ i ee a P os ST Fin i ag usar E st x Ji x F i rr a ma 1 Uri n ra n Me Fig 10 Questi sono pozzetti per cellule ll volume di terreno introdotto in questi pozzetti pan a 5ml Nel penultimo e ultimo pozzetto possibile effettuare la conta Da tutti questi esperimenti preliminari stato possibile apprezzare come l uso di superfici solide troppo piccole va a discapito della qualita della crescita batterica che g
134. ine risulteranno allineati sulla retta con coefficienti m c Le rette corrispondenti ad un alto numero di intersezioni nello spazio parametrico rappresentano le linee di interesse ali y mx c Ad a K mi Figura 2 1 Rappresentazione nello spazio x y e nello spazio dei parametr m c POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute La trasformata di Hough descritta in questa forma non tuttavia implementabile su un calcolatore Infatti per le linee verticali il coefficiente angolare m tende all infinito e quindi diviene non rappresentabile in aritmetica finita Si ricorre quindi a una versione della trasformata detta forma normale dove le rette vengono rappresentate come xcos ysin r 2 2 I parametri e r sono rispettivamente l angolo rispetto all asse x e la distanza della retta dall origine Quantizzando e utilizzando come spazio parametrico r si risolve quindi il problema della rappresentazione finita dei dati Figura 2 2 Rappresentazione dello spazio dei parametri in coordinate polari Per l implementazione pratica della trasformata di Hough necessario quantizzare adeguatamente lo spazio dei parametri e successivamente rappresentarli in un array di memoria anche detto array accumulatore accumulator array P
135. ione e identificazione di Mab anti antigene urinario Lo pneumococco la principale causa di polmoniti acquisite in comunit con mortalit significativamente alta in neonati e anziani Un metodo di diagnosi rapido e affidabile la ricerca di antigeni polisaccaridici nelle urine dei pazienti utile strumento in quanto pu permettere al clinico di ottimizzare la terapia antimicrobica con buoni risultati clinici principali antigeni polisaccaridici dello Pneumococco sono l antigene capsulare che determina 90 sierotipi ed induce una immunit protettiva e l antigene polisaccaridico della parete batterica o polisaccaride C Cps che a comune a tutti i sierotipi Oltre agli antigeni capsulari abbiamo ritenuto il Cps di particolare interesse per selezionare anticorpi in grado di riconoscere antigeni urinari comuni a tutti i sierotipi Le considerazioni fatte per l antigene urinario di Legionella pneumophila sulla immunogenicit dei polisaccaridi sono riconducibili anche agli antigeni dello pneumococco per i quali sar seguita la stessa strategia di studio di glicoconiugati Il progetto iniziato con l immunizzazione di 2 gruppi di 4 Balb c ciascuno con Pneumovax vaccino polisaccaridico non coniugato dei principali 23 sierotipi patogeni Sono stati seguiti 2 trattamenti differenti nelle dosi e nel loro numero 100ugr totali topo in 5 settimane 140 ugr totali topo in 15 settimane Ulteriori schemi di immunizzazione saranno fatti con p
136. itta individuale il titolare una donna nel caso di societ di persone e di cooperative almeno il 60 dei soci rappresentato da donne nel caso di societ di capitali almeno i 2 3 delle quote sono detenute da donne e l organo di amministrazione composto da donne per almeno i 2 3 Nel caso di progetti realizzati da imprese in forma aggregata l indicatore assumer valore 1 quando nel raggruppamento vi sia almeno una impresa che ricade nella casistica sopra richiamata Andr inserito il numero di domande di brevetto presentate all Ufficio Italiano Brevetti UIB Andr inserito il numero di domande di brevetto presentate all Ufficio Italiano Brevetti UIB POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Indicatori di Impatto valore al medio periodo hi a i Le snai Valore al Obiettivo specifico Indicatore di impatto Unita di Misura e lavoro creati nella 6 58 5 08 0 5 ricerca di cui donne Numero di posti di lavoro creati nella ricerca in fase di cantiere regionale promuovendo la ricerca il trasferimento Numero di posti di tecnologico e rafforzando i lavoro creati nella processi di innovazione e ricerca in fase di l imprenditorialit gestione a o mnj o ae y di cui donne Consolidare la competitivit di cu
137. iunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute c d Figura 3 13 Le immagini a e c rappresentano rispettivamente due piastre contenenti Pseudomonas e Candida mentre in b e d sono state colorate in blu le parti rilevate come terreno di coltura POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute 3 6 4 Rilevamento delle colonie gialle Per nlevare la presenza di colonie con colorazione gialla in una prima fase sono stati raggruppati tutti 1 valori del pixel calcolati con Mean Shift appartenenti alla regione di sovrapposizione Figura 3 11 e sono stati etichettati come regione di incertezza All interno di questa zona stato necessario sfruttare informazione locale e non pi globale in quanto lo stesso colore che in alcune piastre caratterizza lo sfondo in altre tipico delle colonie Gialle Cio accade sia a causa di condizioni di luce differenti sia in base alle diverse tipologie di colome sviluppatesi sulla piastra che possono blandamente influire sulla colorazione dal terreno circostante a b POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute
138. iversit degli Studi di Siena L attivit consistita nel seguire la compilazione delle tesi e nel tenere due seminari durante il corso di bioinformatica E stato inoltre supportato il marketing di Diagnostica Senese Spa quale futuro distributore dei prodotti inerenti tale progetto per la stesura di materiale informativo e viaggi per contatti preliminari con potenziali clienti L attivit che si svolta in circa 5 mesi ha richiesto 1 mese uomo pari al 0 5 delle risorse umane Ricercatore Illustrare quali risultati di disseminazione sono stati raggiunti Al momento risultati ottenuti dalla disseminazione sono individuati in 1_ Tre tesi di Laurea in Ingegneria Informatica presso L Universit degli Studi di Siena e l avvio con questa di rapporti scientifico tecnologici di alto livello POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute 2_ Creazione di un grande interesse e attesa sul mercato italiano per l uscita delle piattaforme analitiche corredate di reagenti innovativi Costi sostenuti Inserire i costi sostenuti da ciascun partner per lo svolgimento dell obiettivo operativo disseminazione dei risultati del progetto Per questo obiettivo operativo il costo sostenuto stato 1 mese uomo categoria Ricercatori del totale a carico del capofila p
139. ivi a patogeni del tratto urinario e non es Legionella Realizzazione di librerie di peptidi per l immunizzazione e l ottenimento di POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute anticorpi da impiegare nello sviluppo di kit diagnostici Attualmente disponibili librerie per C Trachomatis 002 Disponibili anticorpi per kit ELISA C Albicans S Agalactiae G Vaginalis e C Trachomatis sperimentazione interna in corso 003 Realizzato un preparatore automatico Plus Finder Preparator per la manipolazione dei campioni urinari per la fase analitica di screening 004 Realizzato un analizzatore Plus Finder Analayzer per lo screening rapido delle batteriurie 005 Ingegnerizzato un seminatore automatico Plus Finder Robobact 2 Dare indicazione delle criticit impreviste sorte durante la realizzazione del progetto delle soluzioni strategiche individuate applicate del mantenimento del grado di innovativit del progetto delle eventuali ricadute sul piano finanziario max 500 caratteri 001 Difficile reperimento campioni d urina per patogeni rari TBC Ricerca di collaborazioni per studio specificit biomarcatori 002 Difficile recupero di tamponi vaginali Accordo con Centro Diagnostico Senese per reperimento 003 Riprogettazione int
140. l primo termine proporzionale alla stima della densit f in x mentre il secondo il vettore del mean shift m x Condizione sufficiente per la convergenza dell algoritmo data dal seguente teorema Se il kernel K ha un profilo convesso e monotonamente decrescente le sequenze di nuovi centri del kernel y ee Edi rispettivi valori della funzione densit f y di _1_convergono La sequenza f y Oh monotonamente crescente POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Figura 2 13 Ricerca della moda con Mean Shifi In Figura 2 13 si pu vedere come funziona la ricerca della moda in Mean Shift dato un insieme di punti si selezionano del punti qualsiasi dal dataset 11 Mean Shift inizia a stimare la posizione successiva nella direzione in cui f aumenta fino ad amivare al valore in cui 1l gradiente si annulla Quindi la procedura di Mean Shift si pu riassumere come segue 1 Siano dati i campioni da cui calcolare le mode x peri 1 n 2 repeat 3 Woia random x Seleziona casualmente un punto iniziale dal dataset 4 repeat 5 Calcola 1l successivo valore centrale del kernel pn Yoid i A Ynew 3 2 yl oxy Yola Xi p h 6 if IY new B Yota ll lt then 7 break POR CReO FESR 2007 2013 Linea di interve
141. l termine della procedura verranno visualizzati i risultati che in caso non fossero corretti potranno essere modificati L oggetto cos sviluppato offre notevoli vantaggi a l intervento del biologo richiesto solo in caso di errore il che consente di velocizzare la procedura b si evita un continuo passaggio tra ambiente sterile e ambiente non protetto c al termine delle analisi i risultati Immagine tipologia di infezione e conta batterica vengono memorizzati rendendoli cos disponibili per future consultazioni L organizzazione del presente lavoro riportata di seguito Nella FASE 1 vengono introdotti gli aspetti microbiologici alla base del processo che si intende automatizzare Vengono descritti principali batteri causa delle infezioni delle vie urinarie i terreni disponibili e le varie tecniche utilizzate in fase di semina Nel FASE 2 vengono invece presentati i principali strumenti di elaborazione delle immagini utilizzati nello sviluppo del progetto software mentre la fase 3 descrive dettagli implementativi il funzionamento dei diversi moduli software e le scelte progettuali che hanno portato al loro sviluppo Il codice stato realizzato in linguaggio C sviluppato in ambiente QtCreator su Ubuntu 14 04 a 64 bit Per la parte di elaborazione delle immagini stata utilizzata la libreria OpenCV Infine il Capitolo 4 trae alcune conclusioni sul lavoro svolto e ne descrive i possibili POR CReO FESR 2007 2013
142. la DIESSE nel seguente modo un pool di urine positive al test per l infezione da Legionella composto da urine risultate positive sia al kit diagnostico in fase di sviluppo che ad un kit diagnostico commerciale utilizzato come test di riferimento stato elettroeluito mediante Mini Prep Cel Le 10 frazioni ottenute campioni A L sono state concentrate tramite sistema Centricon e separate in SDS PAGE utilizzando gel precast Criterion XT 12 Dopo SDS PAGE il gel stato sottoposto a colorazione argentica Silver Staining figura 4 oppure elettrotrasferito su membrana di nitrocellulosa e successivamente testate in WB M A B C D E F GH IL p e i i oo 250 100 75 50 37 20 ve 15 _ 10 Figura 4 Immagine digitalizzata del gel monodimensionale delle frazioni POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute A L di urina positiva dopo colorazione argentica Quattro repliche identiche dalla stessa membrane sono state sottoposte al seguente protocollo sperimentale I Saturazione della membrana di nitrocellulosa II Incubazione delle membrane con anticorpi primari Le membrane saturate sono state incubate con 4 diversi anticorpi primari prodotti da DIESSE 1 _PAB Urina positiva anticorpo policlonale prodo
143. la Diesse Ricerche Srl ATTIVITA 1 Studio di un sistema di riconoscimento colonie su semina effettuata da strumento automatico Sono state acquisite delle immagini su dei device seminati con lo strumento Robobact commercializzato da Diesse Diagnostica Senese e su queste sono state avviate delle prove preliminari per l applicazione di algoritmi di elaborazione di immagini atti ad evidenziare delle caratteristiche feature di ogni tipo di colonia batterica sviluppata Lo scopo utilizzare queste feature per creare un dataset finalizzato all addestramento di reti neurali per il riconoscimento delle colonie seminatore automatico Diesse Chromagar h es colonie sviluppate dopo semina automatica POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute L attivit iniziata secondo le previsioni si conclusa con l ingegnerizzazione del seminatore automatico con la capacit di eseguire una identificazione e conta presuntiva della colonie seminate su device dedicato di Diesse Questo strumento stato ingegnerizzato partendo dal layout del Plus Finder Analizzatore modificando alcune parti meccaniche interne consentendo di i mantenere Il desing uguale Quindi Partenza dalla Struttura Plus Finder Analizzatore POR CReO FESR 2007 2013 Line
144. la gestione protetta della propriet intellettuale al fine della realizzazione di strumenti diagnostici 2 Il contributo fornito da ciascun Partner del progetto in relazione agli obiettivi della proposta max 800 caratteri Il partner 2 coinvolto nell OO1 e sta mettendo a disposizione le proprie competenze nel settore della biologia molecolare e della proteomica per la caratterizzazione dei nuovi biomarcatori di agenti infettivi Il partner 3 anch esso coinvolto nell 001 collabora per la maturata esperienza nella individuazione e successiva sintesi di peptidi utilizzabili per metodiche di immunizzazione 3 L impatto della proposta sulle nuove assunzioni di personale di RS amp l nuovi addetti alla ricerca e sviluppo n 6 di cui donne n 5 laureati competenti formati n 7 di cui donne n 6 scienziati in fase di training n 2 di cui donne n 1 personale con maggiore qualificazione n 7 di cui donne n 6 POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Commento max 500 caratteri risultati del primo anno mostrano un inaspettata capacit produttiva tecnico scientifica con la conclusione di quasi due strumenti su tre previsti La collaborazione tra Capofila e Partners soddisfacente con scambio di informazioni intenso e profi
145. lactiae Entrambe le colonie sono state identificate come Streptococco agalactiae dato confermato dall api vedi sotto ceppo di collezione OTTIMA IDENTIFICAZIONE API 20 STREP Wr 0 3423014 CONFERMARE COM TEST SIEROLOGICI sor sn iac om Colonia isolata da campione 8 OTTIMA IDENTIFICAZIONE LLER AFI 20 STREP W O lot CONFERMARE CON TEST SIEROLOGICI x y i T taxon seguent i T st Conclusione il campione 8 positivo per streptococco B Sar molto importante chiarire la sensibilit di risposta ospedaliera ed effettuare una sperimentazione esterna Campioni per la ricerca di Candida albicans POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute ospedale standard Reference Reference standard is standard is positive negative ospedale diesse Reference Reference standard is standard is positive negative Testis positive 14 6 Enter the data into this table Enter the data into this table 12 T 2 Test is negative 35 31 15 4 Enter the requir 95 Enter the required confidence il 95 RESULT RESULT Sensitivity 1 Cl 0 6457 to 1 Sensitivity 0 933333333 0 7018 to 0 9881 Specificity 0 791666667 CI 0 5953 to 0 9076 Specificity 0 85 0 7093 to 0 9294
146. lastre cio il pattern di immunoriconoscimento di ciascun anticorpo nei confronti della sorgente antigenica utilizzata ha prodotti i risultati riassunti in tabella 1 Tabella 1 Analisi qualitativa dei pattern di immunoriconoscimento La presenza di bande immunoreattive nei blot analizzati riportata come valori di M Da Urina positiva POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute PAB Urina 21 20 32 56 40 99 42 32 45 65 falsa 1 4 5 4 4 negativa PAB Urina negativa LEG 33B 2 L anticorpo PAB Urina positiva riconosce una banda a circa 64 000 Da in tutte le frazioni analizzate Inoltre lo stesso anticorpo riconosce bande a vari pesi molecolari in quasi tutte le frazioni di urina tranne che nella prima e nell ultima lane frazioni A L L anticorpo PAB Urina falsa negativa ha un pattern antigenico parzialmente sovrapponibile all anticorpo precedente sebbene manchi in tutte le frazioni la banda a 64 000 Da nelle frazioni A E ed L mancano bande immunoreattive Gli anticorpi PAB Urina negativa e LEG 33B 2 non riconoscono nessun antigene Per definire meglio le differenze tra Urina Positiva ed Urina Falsa Negativa abbiamo deciso di analizzare il profilo proteico totale ottenuto mediante spettrometr
147. li sani negativi Abbiamo deciso quindi di studiare i picchi da noi selezionati applicando tecniche di analisi statistica multivariata come la Principal Component Analysis PCA per determinare se l uso POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute combinato di tutti picchi o parte di essi riesca a segregare i tre gruppi in maniera soddisfacente Sono stati analizzati numerosi set di dati originati da combinazioni diverse dei dati relativi alle intensit di due o pi picchi selezionati con entrambe le superfici utilizzate CM10 e IMAC30 Cu Tre set di dati hanno prodotto i migliori risultati ed i grafici relativi sono riportati in figura 1 Il primo set figura 1 A composto da quattro picchi 4351 281 13437 167 11746 706 e 20990 494 m z precedentemente selezionati con il ProteinChip CM10 Il secondo set figura 1 B composto da tre picchi 5878 663 10689 534 e 11795 644 m z precedentemente selezionati con il ProteinChip IMAC30 Cu Il terzo set figura 1 C analizzato invece il risultato della combinazione dei due precedenti set Dall osservazione dei grafici riportati in figura 1 possiamo osservare che il primo ed il secondo set di dati sono riusciti riescono a classificare in maniera univoca il 75 e l 86 5 dei campioni analizzati come positi
148. li Studi di Siena Sempre presso la facolt di Ingegneria sono stati tenuti due seminari nel corso di studio di Bioinformatica Il marketing di Diesse Diagnostica Senese Spa ha gi prodotto un depliant pubblicitario per i due strumenti oggetto di 003 e 004 Sono state depositate domande di brevetto in molti paesi al mondo Il sistema stato presentato a mostre sia sul territorio nazionale che all estero Il progetto stato anche premiato dalla Regione Toscana come 1 dei 7 progetti di eccellenza POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute 2 VALUTAZIONE DELLE ATTIVIT SVOLTE DAL PARTENARIATO BENEFICIARIO Alla luce dell esperienza maturata dal gruppo di lavoro nello sviluppo del progetto indicare 1 Il contributo fornito dal Capofila in relazione agli obiettivi della proposta max 800 caratteri Il capofila il coordinatore ed il responsabile di tutte le attivit di rendicontazione e gestione del progetto come da ATS sottoscritta AI fine del raggiungimento degli obiettivi previsti il capofila coordina gli interventi dei partner di ricerca finalizzati al risultato in quanto unico presente in tutti i cinque obiettivi operativi Il capofila fornisce al partenariato input mirati alla ricerca finalizzata alla produzione aziendale e al
149. ma sferica Cresce facilmente nei terreni di coltura producendo un pigmento che va dal bianco al giallo la specie Saprophyticus spesso causa delle infezioni dell apparato urinario nelle donne giovani PATOGENI CONVENZIONALI SECONDARI Enterococcus spp batterio Gram positivo implicato in patologie come endocarditi e infezioni del tratto urinario Proteus spp appartiene alla classe degli Enterobatteri una delle caratteristiche principali di questo batterio l elevata mobilit che gli conferisce una morfologia di colonia ad anelli concentrici su terreni solidi Pseudomonas Aeruginosa vive nel suolo dove svolge la denitrificazioned Si presenta prevalentemente nei pazienti ospedalizzati debilitati e nei pazienti con HIV Pu causare infezioni agli apparati urinario e respiratorio dell uomo staphylococcus Aureus batterio anaerobico facoltativo che presenta una pigmentazione gialla e produce una tossina responsabile di varie malattie come meningiti artriti e polmoniti o KES Klebsiella spp Enterobacter spp Serratia spp gruppo di patogeni aggressivi che acquisiscono geni per la farmaco resistenza PATOGENI CONDIZIONALI Miceti lievitiformi Candida albicans responsabili della maggior parte delle candidosi le infezioni da Candida possono colpire singolarmente ogni organo o apparato Streptococcus batterio Gram positivo anaerobico facoltativo di forma sferica capace di distruggere i globuli rossi
150. me in esame successivamente pixel precedentemente rilevati possono essere raggruppati in regioni omogenee logicamente connesse blob metodi pi semplici per l identificazione dei pixel in movimento si basano sulla differenza tra frame successivi frame difference oppure effettuano il confronto dell immagine attuale con un background Nel secondo caso l immagine corrente di una sequenza POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute viene confrontata con un background di riferimento contenente informazione sulla scena in assenza di oggetti in movimento Questa tecnica si fonda sul presupposto che vi sia un background e soprattutto che possa essere mantenuto aggiornato per riflettere i cambiamenti a breve e a lungo termine Nel caso di algoritmi basati su frame difference invece si considerano solo le differenze presenti tra i valori di luminosit dei pixel corrispondenti nelle due immagini successive di una sequenza cos da evidenziare come pixel in movimento quelli che nell immagine differenza assumono un valore di luminosit diverso da 0 In quest ultimo caso le principali fasi di elaborazione sono le seguenti e Salvare una copia del frame attuale e del frame precedente in scala di grigi e Calcolare la differenza fra 1 due frame D i j CurrFrame i j
151. mente ATTIVITA 2 Adattabilit alle varie tipologie di contenitori in ingresso N Una caratteristica Importante del preparatore quella di poter accettare tutti i possibili contenitori di campioni che afferiscono al laboratorio Il campione urinario pu essere contenuto in una provetta o in un barattolo considerando che a seconda di ogni tipologia ci sono sottocategorie di formati Poich lo scopo principale del preparatore quello di evitare che l operatore manipoli il campione biologico per renderlo disponibile alle successive fasi analitiche importante che la stazione POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute automatica che agisce per suo conto sia in grado di accettare ogni tipo di flacone in ingresso Nello sviluppo di questa attivit sono state vagliate diverse ipotesi alcune delle quali studiate su simulazioni Questa attivit stata completamente eseguita e conclusa Riassumendo si deciso di studiare e realizzare un modello che abbia le seguenti caratteristiche a Accettazione di contenitori multiformato La miglior soluzione per permettere allo strumento di accettare una pluralit di contenitori diversi senza per questo apportare modifiche o adattamenti meccanici quella di utilizzare dei rack porta campioni che abbiano d
152. misurare la distanza tra due colori sarebbe utile avere uno spazio colore percettivamente uniforme in cui cio la distanza percepita tra due colori sia proporzionale alla distanza euclidea tra le coordinate colorimetriche Lo spazio colore XYZ non percettivamente uniforme L idea alla base dello spazio Lab consiste nel distorcere lo spazio XYZ con una funzione non lineare al fine di renderlo percettivamente uniforme Lo spazio colore Lab composto da luminosit o POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute componente della luce L e da due componenti cromatiche la componente a che varia da verde a rosso e la componente b che varia da blu a giallo Y L 116 gt 16 f Y W a soo fr a 1 r 219 v zole dove Xw Yw Zw sono le coordinate del punto corrispondente al bianco e f t vale 3 6 olg OR ad B41 Le n 2 14 108 116 CL LVITTLENTI Bianco a Te oo b POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Figura 2 11 Diagramma di cromaticita Lab Proprieta e J vanada0Oa 100 e Aji grigi corrisponde a 0 e b 0 e La dista
153. mma in x e 9 una soglia che consente di verificare che il valore dell istogramma nei picchi sia siemficativamente maggiore del valore dell istosramma nella valle h z POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Se le condizioni precedenti sono soddisfatte e se Z e Z sono sufficientemente distanti allora le regiom 6 e 7 vengono trattate separatamente altrimenti assumiamo che la regione non sla separabile Il passo successivo consiste nel cercare di stabilire se la regione in analisi contiene colome gialle oppure background Consideriamo come nfenmento 11 background senza edge regione 2 calcoliamo 11 picco dell Istogramma in questa regione e il picco nella regione da analizzare 6 e 7 insieme o separatamente a seconda dei risultati ottenuti precedentemente Se sull asse H 1 picchi sono sufficientemente distanti allora assumiamo che la regione possa contenere delle colonie gialle Calcoliamo quindi utilizzando di nuovo il metodo di Otsu la soglia che separa il background regione 2 dalla regione in analisi Confrontando 1 valori del pixel con la soglia trovata si pu decidere se essi appartengano o meno al terreno Se invece 1 valori dei picchi sull asse H risultano essere troppo vicim si assume che la regione in analisi appartenga al terren
154. n leggero ritardo a causa della difficolt di applicarla sui tamponi vaginali che sono difficilmente reperibili Attualmente il problema risolto avendo preso accordi con un Laboratorio Analisi esterno per la fornitura dei tamponi stessi L applicazione dei kit in automazione quindi spostata al secondo anno in base al nuovo cronoprogramma Costi sostenuti Indicare i costi sostenuti da ciascun partner per lo svolgimento dell obiettivo operativo PARTNER 1 POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute 1 030 716 76 In caso di variante progettuale autorizzata si deve fare riferimento al nuovo piano finanziario e al nuovo cronoprogramma approvato POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Obiettivo operativo 3 Realizzazione di un preparatore automatico per il campione urinario destinato allo screening microbiologico Attivit realizzate Illustrare le attivit realizzate specificando il ruolo di ciascun partner del progetto Tutte le attivit di questo obiettivo sono di competenza del solo partner capofila Diesse Ricerche Srl ATTIVITA 1 Studio del conte
155. n proteici dei due pool analizzati differiscono notevolmente sia dal punto di vista qualitativo che quantitativo In particolare il pool delle urine positive presenta un contenuto proteico maggiore sia a livello quantitativo contenuto proteico totale che qualitativo numero di specie proteiche all interno del pool Questi risultati confermano quanto gi osservato nelle analisi precedenti condotte per mezzo di una diversa tecnologia SELDI ToF MS utilizzando singolarmente i campioni di urine positive e POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute negative Gli spot che rappresentano le differenze qualitative pi marcate tra i due campioni in esame cerchiati in rosso in Figura 1 hanno valori di peso molecolare del tutto congruenti con quelli dei potenziali biomarcatori di infezione da Legionella da noi selezionati e validati per mezzo dell analisi SELDI ToF MS ATTIVITA 2 Mappatura degli antigeni peptidici dei biomarcatori proteici identificati UniFi Basandosi sull esperienza acquisita negli anni dall Universit di Firenze stato effettuato uno studio sistematico per l identificazione di proteine e di sequenze che siano altamente specifiche per il riconoscimento anticorpale L identificazione e di epitopi ovvero i siti di legame per gli anticorpi
156. ne su tre canali della superficie di un chip rivestito di streptavidina sono stati immobilizzati gli anticorpi per cattura ad alta affinit attivando la superficie con NaOH 50mM NaCl 1M e iniettando gli anticorpi a concentrazione 5 ug ml in Running Buffer Il livello di immobilizzazione risultato paragonabile per gli anticorpi anti 19K circa 3700 RU e inferiore per l anticorpo anti LPS circa 2200RU La funzionalit del chip stata testata iniettando diverse concentrazioni della proteina 19K 5 10 20 40 ug ml le risposte sono sempre state valutate come differenza tra il segnale registrato sui canali attivi e quello ottenuto sul canale di riferimento in cui stato immobilizzato per cattura ad alta affinit POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute un anticorpo non legato al progetto anti TG valori di binding sono risultati proporzionali alla concentrazione di proteina testata solo sul canale contenente l anticorpo anti 19K 17 19 nel caso del canale contenente l anticorpo anti 19K 16 5 i segnali sono risultati pi bassi con differenze non significative tra le diverse concentrazioni con l anticorpo anti LPS non stata rivelata alcuna interazione Per gli studi di binding i 10 campioni di urina sono stati dializzati utilizzando il kit commerc
157. neumococco inattivato antigene Cps purificato CWPS Multi Statens Serum Instutute e coniugato con proteina carrier e vaccino umano glicoconiugato ATTIVITA 2 Realizzazione dei kit diagnostici su piastra ELISA Per C albicans riallineato positivamente il kit alla sensibilit del prototipo 2008 con materiali e metodi simili ad eccezione della fase solida FS stabilizzata chimicamente con postcoating Effettuate prove di ottimizzazione tamponi estraenti patina batterica per maggiore sensibilit In corso di verifica stabilit curva di sensibilit in base logaritmica per controlli di produzione rappresentata per ogni punto da un estratto di una sospensione batterica a pfu ml note Ottimizzazione di un estratto per produzione del calibratore e siero di controllo per POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute l allineamento del kit in automazione su Chorus Per S agalactiae ripristinato il kit prototipo con gli stessi materiali e metodi ad eccezione della FS statizzata con postcoating In corso la preparazione di un nuovo lotto di antisiero in coniglio possibilmente a maggior titolo per una migliore sensibilit Per G vaginalis ripristinato il kit prototipo con FS stabilizzata con postcoating In corso la preparazione di un nuo
158. ni al giorno o 100 campioni per due giorni La scelta stata di utilizzare sacche da flebo da 250 ml che vengono infialate con terreno sterilizzate ed etichettate Poi tramite un attacco speciale demoninato Luer Lock vengono applicate al gruppo dispensatore il terreno del preparatore Poich il preparatore utilizza del disinfettante ALCOSAN VT 10 sia durante il ciclo onde evitare fenomeni di carry over sia a fine ciclo per la sanitizzazione finale sono sati scelti h Sacca per sanitizzazione finale da sostituire a quella del terreno tanica per sanitizzazione in ciclo Il tipo di terreno utilizzato consiste in un brodo eugonico doppio concentrato EUGON BROTH 2X perch ha la caratteristica di fornire un ambiente di crescita compatibile con tutti i germi che si possono trovare nelle urine in caso di infezione Ovviamente su questo terreno sono stati eseguiti tutti i test biochimici di base ed in aggiunta predisposti dei controlli sulla sterilit fertilit e scadenza del prodotto una volta infialato POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute ATTIVITA 5 Associazione univoca del campione Questa attivit stata completamente eseguita e conclusa Il campione di urina da analizzare arriva in un contenitore provetta e o
159. nitore per esame Il contenitore in studio in questa attivit costituito da una provetta vuota chiusa sterile e dotata di un codice a barre univoco Tale contenitore deve accogliere una aliquota di terreno di crescita ed una aliquota di campione da esaminare procedura eseguita da un preparatore automatico oggetto di questo obiettivo operativo successivamente deve essere utilizzato per lo screening procedura eseguita da un analizzatore oggetto dell obiettivo operativo 4 ed infine inserito in un seminatore automatico per l isolamento ed identificazione oggetto dell obiettivo operativo 5 Questa attivit stata completamente eseguita e conclusa e la ricerca si articolata nelle fasi di a Partenza da uno stampo pilota di una provetta gi in commercio distribuita da Diesse Diagnostica Senese Spa per l uso nello strumento Robobact La ragione di questo risiede nel fatto che una provetta cos realizzata pu supportare dal punto di vista delle dimensioni fisiche e della forma tutte le caratteristiche richieste sopra elencate b Studio di diversi materiali come a es metacrilato e polistirolo in funzione della loro compatibilit alle fasi di Sterilizzazione con raggi beta e o gamma A tal proposito per esempio emerso che il metacrilato se sottoposto ad irradiazione con raggi gamma pu determinare l emissione di un monomero che pu alterare la misura POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso
160. nsive ad esempio ray tracing in tempo reale e proiezione 3D vennero a conoscenza del fatto che in molte universita in particolare al MIT Media Lab era stata sviluppata una infrastruttura per la computer vision 1l cui codice veniva passato da studente a studente Venne quindi deciso di implementare a partire da questo codice un framework per la computer vision per 1 processori Intel Il progetto fu avviato con la collaborazione di un team Intel russo POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute nel 1999 La prima release ufficiale di OpenCV risale invece al 2006 Nel 2011 stata rilasciata la versione 2 2 0 che per la prima volta estendeva 1l supporto anche ad Android Al momento della scrittura di questa tesi l ultima versione rilasciata la 2 4 9 OpenCV ha una struttura modulare 1 cul principali moduli sono Core definisce le strutture dati primame es Mat e le funzioni di base utilizzate da tutti gli altri moduli Imgproc modello di image processing che include filtri lineari e non lineari trasformazioni geometriche conversione tra spazi colore istogrammz e altro Video modulo di analisi video che include motion detection sottrazione del background e algoritmi di tracciamento degli oggetti Calib3d algoritmi geometrici di base c
161. nti e le attrezzature utilizzati per la realizzazione delle attivit Strumenti e attrezzature sono gi disponibili presso i partecipanti e comprendono Piattaforma Proteomica gi in possesso del partecipante UniSi composta da spettrometro di Massa SELDI ToF equipaggiamento completo per l Elettroforesi Bidimensionale computerizzata MALDI ToF Calligrapher spottatore automatico gi in possesso del partecipante UniSi POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Strumenti di analisi statistica e bioinformatica Sintetizzatore di peptidi automatico multiplo ed apparecchio per la sintesi peptidica mediata da microonde per le sequenze difficili disponibili presso UniFi Sistemi automatici di flash chromatography HPLC semipreparativi e sistem cromatografici UPLC MS per la purificazione e caratterizzazione analitica dei peptidi sintetici disponibili presso UniFi Sintetizzatore di peptidi automatico multiplo ed apparecchio per la sintesi peptidica mediata da microonde per le sequenze difficili disponibili presso UniFi Sistemi automatici di flash chromatography HPLC semipreparativi e sistemi cromatografici UPLC MS per la purificazione e caratterizzazione analitica dei peptidi sintetici disponibili presso UniFi Biosensore o
162. nto POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute 2 Dare indicazione della conformit temporale e tecnica dell avanzamento del progetto in relazione alla proposta originale descrivendo gli eventi che hanno condizionato lo svolgimento dell attivit progettuale e motivandone l eventuale non conformit a quanto prospettato in fase progettuale iniziale max 500 caratteri 001 Attivit Conclusa 3 secondo cronoprogramma 4 anticipata al 10 mese 002 Attivit Concluse 3 ritardata per difficolt nel reperimento di campioni 5 e 6 secondo cronoprogramma 0038 Attivit Concluse 6 avviata in anticipo 004 Attivit Concluse 6 avviata In anticipo OO5 Attivit Concluse 3 Dare indicazione della fattibilit degli obiettivi di progetto rimanenti max 800 caratteri In base ai risultati ottenuti nel corso del primo anno la fattibilit di tutti e cinque gli obiettivi 001 002 008 004 005 stata confermata nei tempi previsti dal nuovo cronoprogramma Parte Il Analisi sulla possibilit del progetto di conseguire i risultati attesi 1 Descrivere i risultati del progetto raggiunti max 800 caratteri 001 Messa a punto una serie di metodologie mediante la proteomica per l identificazione di biomarcatori relat
163. nto 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute 8 else 9 Yold Ynew 10 end if ll until lYnew Youall lt E 12 until sono stati visitati tutti 1 campioni x Sfruttando quindi Mean Shift si pu segmentare un immagine a colori usando informazione congiunta tra colore e posizione dei pixel nell immagine In particolare l informazione del pixel x x y che indicato come dominio spaziale concatenata con quella di colore x che spesso una terna appartenente ad uno spazio colore qualsiasi L algontmo Mean Shift quindi applicato al dominio 5D Porche v1 possono essere differenze di scala tra 11 dominio di colore e quello spaziale 11 kernel risultante modificato in maniera opportuna Wx ll l s in cui vengono usati due raggi differenti h e h per controllare il comportamento del filtro composto Inoltre si puo inserire un ulteriore parametro M che permette di eliminare regioni che hanno un numero di pixel inferiore a M POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute d Figura 2 14 Immagine 400x276 in a e corrispondenti punti nello spazio Luv b In c il risultato del clustering con il M
164. nute sono molto buone sono invece peggiori nelle situazioni in cui la presenza contemporanea di piu colonie ne modifica la tonalit di colore Per quanto riguarda l identificazione delle colome di Proteus Pseudomonas e S Aureus 1 risultati sono Invece peggiori ma soggetti a siemficativi miglioramenti avendo a disposizione un dataset di immagini pi vasto 11 numero di immagini al momento disponibili di queste tre tipologie molto scarso E stato infine addestrato un modello per l identificazione della Candida che riconosce tale tipologia di infezione andando ad analizzare 1 pixel appartenenti alla regione preventivamente riconosciuta come background contenente edge Al termine della procedura di classificazione viene infine eseguita la conta batterica Dove possibile vengono contate le singole colome blob per ogni tipologia di infezione rilevata sulla piastra di Petri nei casi in cm le colonie non siano distinewbili viene invece calcolata una stima in base alle dimensioni della zona infetta Il programma sviluppato una volta eseguita la classificazione e la conta mostra i risultati attraverso l interfaccia grafica e consente all operatore di correggerli manualmente in caso di errore del software Terminata questa fase di controllo 1 nsultati vengono salvati insieme all immagine della piastra rendendoli dispombili per future consultazioni POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di pro
165. nza percepita tra due colori data dalla loro distanza euclidea AE Jf Lz L1 az a b bi 2 15 Per convenzione due colori appaiono indistinguibili quando AF lt 1 Vantaggi e Consente di rappresentare quasi ogni colore visibile perch una trasformazione dello spazio XYZ e E device independent cio le coordinate rappresentano le propriet fisiche del colore e Ilrumore di quantizzazione poco visibile Limitazioni e Lacodficada e b esclude alcuni colon visibili e La codifica inefficiente molti valor non corrispondono a colon visibili 2 4 4 HSV HSV Hue tonalit Saturation saturazione Value brillantezza basato sulla separazione tra la componente di luminanza e le componenti di crominanza Nel modello HSV il solido di riferimento una piramide a base esagonale o circolare rovesciata con il vertice nell origine V 0 econ la base posta sul piano V 1 POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute verde giallo bianco ciano blu magenta Figura 2 12 Piramide HSV Dei tre parametri H la misura dell angolo rispetto all asse verticale che vana convenzionalmente dal rosso primario a 0 passando per il verde primario a 120 e il blu primario a 240 e quindi torn
166. o dedicati allo svolgimento di attivit non riclassificabili come ricerca e sviluppo in senso stretto ad esempio area amministrativa produttiva commerciale segreteria L indicatore va espresso in ULA POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Letto approvato e sottoscritto dal Rappresentante legale dell Impresa Capofila Data Firma del Rappresentante legale Dott i Ao daria p Allega documento di identit in corso di validit del Rappresentante legale dell impresa capofila POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute if sn ri SLA me hi a i Mi i Il j COOR mi kenteti Se pn ceomimiaiab iinet x p E la mari pine ms i fr ae Ae asd dines eg dl Soom ie ooo 371938 gt if x Sei ia topo a aahidi iaaa ARMOR es ene La i i nd lapidi Ry is ik at ve tan dees rh ORCL eat ah i I Cet CO TOCCA riren LI r p 7 AT CT i ee NIT Yim 9 on ad Eee i La ala Par Samra ccc ol ia be ra eS i aP A ir a nici cic himar isee J Segri particolati ie de m A N Mea T i inproziadaldio
167. o in quanto la distanza in H tra la regione analizzata e cio che stato classificato sicuramente come sfondo non da ritenersi significativa Come possiamo vedere in Figura 3 17 a sinistra l istogramma rosso appartiene a una regione contenete colome gialle ed evidente che 1 due picchi sono ben distinti mentre nell immagine a destra 1 due picchi sono praticamente sovrapposti ed infatti questo il caso in cui la regione in analisi anch essa appartenente al background Figura 3 17 In blu Vistogramma del canale H del background e in rosso Vistogramma della regione in analisi POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Brevemente il procedimento descritto pu essere riassunto nei seguenti passi l Calcolo di una soglia con 1l metodo di Otsu sul canale H della regione analizzata 1 1 Calcolo degli istogramm delle due regioni ottenute utilizzando la soglia calcolata al passo 1 1 2 Verifica tramite le equazioni 3 1 e 3 2 che la separazione cos ottenuta sla significativa I Se la separazione ritenuta significativa e 1 picchi sono sufficientemente distanti sull asse H si esaminano separatamente le due regioni ottenute 6 e 7 altrimenti s1 assume che costituiscano un unica regione 3 Calcolo del picco dell istogramm
168. o a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute 2_ Schede tecniche reagenti e consumabili provette 3_ Schede tecniche relative alla descrizione del sistema e delle norme di buona fabbricazione utilizzate La fase non completata perch sono in corso 1_ Prove perla certificazione CE IL sistema plus Finder inteso come Analizzatore e Preparatore stato sottoposto a Certiificazione CE come visibile dai documenti allegati EC DECLARATION OF CONFORMITY In accordance with 98 79 EEC regulation regarding In Vitro Medical Diagnostics Devices RIFGGE DIESSE Diagnostica Senese S p A DIESSE DIAGNOSTICA SENESE S p A with head office in Milan Via A Solari 19 sc 6 certifies that the design type of manufacture of the in vitro medical diagnostics device described hereafter and the version distributed on the market conforms to the 98 79 EEC directive relevant to the In Vitro Medical Diagnostics Devices IVD through the accomplishment to the Annex III except section 6 and the essential requirements of Annex l This certificate will lose its validity in the event of unauthorised modifications are made to the unit incorrect use of the instrument technical interventions performed by unauthorized personnel installation of non original spare parts Product Automatic instrument for screening test of bacteriuria Type PLUS FINDER ANALYZER
169. o combinate nell image processing 1n particolare se si fa seguire la dilatazione all erosione si parla di apertura opening A B AOB DB 2 9 mentre invertendo l ordine delle operazioni si ottiene la chiusura closing A B A B OB 2 10 2 4 Spazi colore Scopo di un modello del colore di consentire la rappresentazione dei colori con modalit standardizzate Questi modelli fanno normalmente nferimento a un sistema di coordinate 3 D Gli spazi colore 9 cap J pag 42 pi utilizzati in image processing sono orientati o all hardware di acquisizione RGB delle immagim o alla loro trasmissione YUV YIQ YDbDr alla compressione YCbCr ed all elaborazione od analisi mediante trattamento del colore RGB HSV LUV POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute 2 4 1 RGB Nel modello o sistema o spazio RGB probabilmente il pi noto ogm colore definito mediante le intensita del tre prrman rosso verde e blu che lo compongono Il modello basato su un sistema di coordinate cartesiane in cu il sottospazio di niferimento un cubo di lato umitario tutti 1 valori s intendono normalizzati in modo da ricadere nell intervallo 0 1 re ee r1 g gG a ciano magenta 0 1 0 verde Fa G Pai 2 scala dei grigi
170. o preparatore Questa attivit stata completamente eseguita e conclusa e la ricerca si articolata nelle fasi di a Studio di un rack porta provette per successiva analisi compatibile con lo strumento analizzatore oggetto dell obiettivo operativo 4 b Studio del buffer di carico dei porta provette per successiva analisi compatibile con lo strumento analizzatore RACK IN c Studio del buffer di scarico dei porta provette per successiva analisi compatibile con lo strumento analizzatore oggetto RACK OUT c Studio del trasferitore dei porta provette dal buffer di carico a quello di scarico e Studio del buffer di carico dei campioni urinari SAMPLE IN f Studio del buffer di carico dei campioni urinari SAMPLE OUT g Studio del gruppo per infialamento terreno ATTIVITA 4 Studio dei contenitori e terreni da infialare e test biochimici di base Questa attivit stata completamente eseguita e conclusa POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Poich lo strumento preparatore deve infialare in provette vuote e sterili sia una aliquota di campione urinario che di terreno di crescita sono state studiate varie possibilit e variet di contenitori per contenere un volume di terreno di coltura tale da permettere la preparazione di circa 200 campio
171. o sviluppato un modello teorico di software per l elaborazione delle immagini molto piu performante rispetto a quello fino ad ora studiato SI poi proceduto alla realizzazione di un piccolo prototipo per acquisire le immagini da elaborare Introduzione Negli ultimi anni alcuni ambiti di ricerca tipici dell Ingegneria Informatica quali la Computer Vision e la Bioinformatica hanno sollevato grande interesse ed hanno conosciuto un notevole sviluppo Sempre pi spesso infatti vengono utilizzati gli strumenti propri dell informatica ed in particolare dell Intelligenza Artificiale sia per affrontare problematiche tipiche della Biologia Molecolare che per progettare e sviluppare strumenti biomedici utili nel settore della diagnostica di laboratorio L obiettivo di questa tesi quello di realizzare un sistema automatico per effettuare lo screening delle infezioni del tratto urinario il progetto stato svolto presso l azienda Diesse Ricerche s r l di Siena Non esiste ancora nessuno strumento che permetta di eseguire la fase di riconoscimento e di conta delle colonie batteriche Il sistema sviluppato i sfrutta un semplice dispositivo di acquisizione webcam collegato ad un computer Il software prevede un interfaccia grafica che permette di avviare l acquisizione delle immagini e di mostrare a video il risultato dell elaborazione Lo scopo del progetto al momento quello di fornire un supporto per il biologo quindi a
172. occe troppo piccole non sono contabili mentre una goccia di 10yl rappresenta un giusto compromesso visivo e di spazi occupabill stato quindi predisposto un lavoro di prototipizz azione di un nuovo device stato quindi predisposto un lavoro di prototipizzazione di un nuovo device Il pimo progetto comprendeva un device con dei setti laterali in maniera tale da dividere fisicamente terreni Questa idea non stata portata avanti in quanto l ansa durante la semina poteva toccare il setto e rovinare il terreno Nel secondo progetto si pensato di cambiare la modalit di semina Invece che per strisciamento simulando il lavoro dell operatore si pensato di depositare delle gocce calibrate con l uso di pompe estremamente precise e punte disposable Anche questa POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute seconda idea stata trascurata per via dei costi di tale ingegnerizzazione ATTIVITA 6 Report e manualistica Vedi Manuali Plus Finder Strumenti attrezzature Indicare quali sono stati gli strumenti e le attrezzature utilizzati per la realizzazione delle attivit Strumenti e attrezzature sono gi disponibili presso il capofila e comprendono 1 Strumentazione per lo sviluppo di prototipi meccanici e relativo software 2 Strum
173. olorazione di una concentrazione batterica superiore a 10 L unico POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute reattivo che degna attenzione e ulteriori prove sicuramente il reattivo X Gal Degli agenti patogeni ubiquitari delle vie urinarie l unico Batterio che mostra una notevole sensibilit ad un azione catabolica di questo composto l Escherichia coli la cui azione aumenta in presenza di lattosio Tale colorante indolico stato aggiunto ad una formulazione liquida in concentrazione variabile con e senza lattosio E stata a questo punto scelta la concentrazione che ha mostrato una risposta degna di studio Sono stati presi diversi ceppi di collezione e preparati in diluizione logaritmica 10 10 Per valutare anche il tempo di colorazione stato effettuato un video di 24h per valutare il tempo necessario per la risposta colorimetrica 16h A seguire stata fatta una prova su 50 campioni ospedalieri per valutarne anche la specificit ajalna aa a annaa m I n e pm i K 5 s e 4 _ 2 Fig 3 Serie di campioni urinari con differenti specie batteriche La colorazione blu verde marrone scuro non sempre dovuta alla presenza di Escherichia coli come ci aspettavamo evidentemente bisogna aggiungere agenti selettivi a
174. one al fine di ottenere un valore intorno a 1000 1 4 risultati ottenuti con vari tamponi stabilizzanti sono riportati nella tabella sotto e sono confrontati con risultati ottenuti dopo 4 giorni POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute amp N lt 4 a Anche in questo caso migliori risultati sono stati ottenuti con il tampone liofilo E stata effettuata la stabilita a 1 7 15 giorni del calibratore nel tampone liofilo liquido conservato a 4 C i risultati sono riportati nella tabella sotto stabilit in tampone liofilo liquido 4C 1000 800 600 m stabilit in tampone 400 C eee Di liofilo liquido 4C 200 0 TO T4gg T ge Tl15geg E stato osservato un decremento del segnale con una perdita di 244 digit E stato deciso di procedere con la liofilizzazione sono stati preparati 20 boccini di vetro da 1 ml di campione sono stati conservati 10boccini a T A e 10 a 4 C Nella tabella di seguito sono riportati i risultati del campione liofilizzazto e risospeso in 1 ml di acqua a tempo 0 e dopo 1 e 6 giorni conservato a temperatura ambiente calibratore liofilo risospeso in 1ml H20 800 600 4 400 4 f E calibratore liofilo 200 4 Di risospeso in 1ml H20 o 4 a TO
175. onio Carbonato R3 prima dell effettuazione del test L estrazione avviene nei seguenti rapporti dei reazione 100ul di sospensione 125 ul di Ry 125ul di Rs 250ul di R3 Chorus 1155 Calibratore 1 8000 antirabbit R5506 in diluent 2 Sensibilit tra 1015 1044 vrac 1044 1043 bulk lotto 003 s lotto 005 40y POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute 2 PROVA DI PRECISIONE La prova di precisione stata effettuata ripetendo 6 volte il calibratore di ciascun kit calibratori sono stati preparati utilizzando anticorpi diluiti in diluent2 al fine di ottenere un valore intorno a 1000 digit di seguito i risultati 1 30000 gardnerella ni tracciante004 21 22 2 i 6 29 antimause 9637 15y coating004 20y candida 1 8000 tracciante 960 33 139 14 47 antirabbit 003 15y R5506 coating005 40y 913 999 i 779 857 76400 strepto traccia a i 94717 136 14 34 antirabbit Mi 885 974 R5506 coating001 779 857 20y 1049 1165 Commento il valore del coefficiente di variazione troppo elevato quindi stata ripetuta la prova sui kit per Candida e Streptococco su un campione con un valore intorno a 1000 di seguito i risultati ottenuti POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di
176. onterr un solo dato R ne conterra due e cos via Indichiamo poi con VW 11 volume relativo a Ra e sia K il numero di campioni che stanno in R e f x la stima n esima di f x k fn Va Affinch f x gt f x devono essere verificate tre condizioni n x 2 20 lim V 0 tia o lim k tra Go k a It lim 0 noc TI La prima condizione ci assicura che P V convergera a f x la seconda condizione ci assicura che il rapporto frequenziale della 2 20 convergera a P per f x 0 e la terza condizione necessaria per la convergenza di fa x Nella Parzen Window per ottenere regioni che soddisfino le precedenti condizioni si calcola il volume come POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute funzione del numero di campioni V 1 vn Considerando che nello spazio delle features IR il volume V che racchiude la regione R caratterizzato da un ipercubo di lato h avremmo quindi W h 2 21 Il numero k di campioni che cadono nell ipercubo dato dalla seguente funzione 1 UL 10 p u f1 EE Q 0 altrimenti io tH I Yee che rappresenta una window function definita sull ipercubo di lato unitario e centrato nell origine Se un campione x cade nell ipercubo centrato in x allora
177. orpo secondario Le membrane sono state incubate con una soluzione di Anti IgG Mouse Peroxidase Conjugate un anticorpo in grado di riconoscere e legarsi selettivamente agli anticorpi primari IV Rivelazione delle bande immunoreattive mediante chemioluminescenza metodo ECL In figura 3 riportata l immagine digitalizzata della lastra immunoreattiva In rosso sono messe in evidenza le bande immunoreattive ciascuna corrispondente ad un diverso antigene proteico contenuto nelle urine di pazienti affetti da legionellosi riconosciuto da ciascun siero kDa 3 Figura 3 Analisi dell immunoreattivit dei quattro anticorpi prodotti da DIESSE per mezzo di Western Blotting WB monodimensionale SDS PAGE utilizzando come antigene il contenuto proteico di urine di pazienti affetti da legionellosi In rosso sono evidenziate le bande immunoreattive ciascuna corrispondente ad un diverso antigene proteico contenuto nelle urine di pazienti affetti da legionellosi riconosciuto da ciascun siero L analisi qualitativa delle bande immunoreattive presenti sulla lastra ha permesso di evidenziare il pattern di immunoriconoscimento di ciascun anticorpo nei confronti della sorgente antigenica utilizzata nel nostro caso le proteine contenute nelle urine di pazienti affetti da legionellosi risultati da noi prodotti mostrano che L anticorpo LEG 33B 43 non riconosce nessun antigene all interno della sorgente antigenica POR CReO FESR 2007
178. ortamento andando a visualizzare come sono distribuiti 1 pixel che caratterizzano il terreno all interno del cubo RGB POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute 153 204 gt B Figura 3 5 Distribuzione dei colori di background all interno del cubo RGB Come si pu vedere in Figura 3 5 in RGB non possibile andare a rilevare esattamente una regione o pi regioni in quanto 1 colon tipici dello sfondo non sono ben raggruppati seppure quindi per l occhio umano questi colori sembrino molto simili nello spazio RGB nsultano carattenzzati da una variabilit molto elevata Basandosi su quest ultima osservazione abbiamo provato a rappresentare 1 valori dei pixel di background negli spazi di colore HSV e Lab tralasciando la componente di luminosit componente L in Lab e componente V in HSV Le regioni cos ottenute sono rappresentate in Figura 3 6 POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute 39 75 hi 45 30 30 15 Ea i sr rr 015 30 45 75 90 105120135 150165180195210225 240255 O 15 30 45 60 5 90 10512013 150165 180193210225 230255 a
179. ostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute l operatore gradiente siamo quindi in grado di rilevare il contorno qualunque sia la sua direzione 6I x y _x_ Ox Vi x y 5I x y 2 30 5 La direzione del gradiente ci restituisce la direzione in cw la funzione ha la massima variazione mentre l ampiezza ci fornisce il valore assoluto della derivata lungo quella direzione Volendo calcolare 11 modulo del gradiente a partire dalle derivate parziali J I sufficiente calcolare JI If Nella Figura 2 17 descritto 11 metodo di nlevazione degli edge attraverso 1l thresholding del gradiente dove l angolo indica la direzione del contorno an I e atan Laie 2 2 PE de 0 22 atan2 Figura 2 17 Sogliatura del gradiente E possibile approssimare il gradiente usando uno dei seguenti metodi che possiamo pensare come correlazioni fra l immagine e 1 seguenti kernel con evidenziate le origini POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute e Backward Difference ey _ L i f Ip IGj 1 2 31 I x d yas I i j H i Li e Forward Difference y I i j I ijj 1 ij 2 32 I x
180. presenti sulle proteine pu essere utile sia nella ricerca e nello sviluppo di nuovi farmaci o vaccini sia nel campo della diagnostica Un metodo efficace per la caratterizzazione di epitopi basato sulla scansione di peptidi sintetici metodica chiamata pepscan analysis Questa tecnica utilizza una libreria di sequenze peptidiche costituita da segmenti sovrapposti della proteina target per saggiare la loro capacit di legare gli anticorpi di interesse tramite opportune metodiche ad es saggi immunoezimatici su piastra ELISA Il metodo rapido piuttosto economico e particolarmente adatto per l identificazione di epitopi riconosciuti su una particolare proteina bersaglio da parte di diversi anticorpi In questo modo inoltre possibile effettuare la mappatura di epitopi conformazionali combinando sequenze peptidiche non adiacenti presenti in zone differenti della proteina bersaglio ed imponendo la rigidit conformazionale sulla struttura cos ottenuta peptidi vincolati conformazionalmente Lo studio della sequenza la prima tappa fondamentale per l identificazione di epitopi che possono essere selettivamente riconosciuti da anticorpi In questa prima fase stata studiata come target primario la Chlamydia Trachomatis batterio patogeno per l uomo Al fine di produrre anticorpi selettivi per questa specie rispetto alle altre forme di Chlamydia sono state selezionate le proteine di interesse e all interno di esse sono state
181. r questa specifica sia il metacrilato che il polistirolo soddisfano questa esigenza c Studio e realizzazione di un tappo in gomma in funzione della compatibilit alle fasi di Sterilizzazione con raggi beta e o gamma Pluri perforabilita da parte del preparatore ed analizzatore senza compromissione della tenuta alla fuoriuscita di gas Non permanenza di liquido per tensione superficiale la di sotto del tappo stesso in caso di capovolgimento della provetta Tappo vista Laterale Tappo vista Superiore POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Inferiore me Provetta Completa di tappo e codice a barre univoco NOTA stato anche studiato un tappo per l immissione manuale del solo campione b a vista laterale vista superiore vista inferiore dll rovetta per infialamento manuale con tappo apribile e codice a barre univoco Come si vedr di seguito per i laboratori di analisi dove non giustificato il costo di un preparatore automatico a causa del ridotto numero di esami il giorno si pensato di fornire provette gi contenenti terreno e dotate di un particolare tappo in gomma che permette l infialamento manuale di una aliquota di campione urinario attraverso un piccolo setto che si richiude automatica
182. r sangue di montone la curva stata incubata a 37 C per 2h e sono stati estratti tutti i punti della curva con una soluzione estraente di HNOz sviluppato in ambiente di reazione per reazione tra Sodio Nitrito R e Acido Acetico R2 e soluzione neutralizzante di Ammonio Carbonato R3 prima dell effettuazione del test L estrazione avviene nei seguenti rapporti dei reazione 100ul di sospensione 125 ul di Ry 125ul di Re 250ul di R3 Chorus 1155 Calibratore 1 6400 antirabbit R5506 in diluent2 Sensibilit tra 1016 1045 POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute GARDNERELLA VAGINALIS ATCC 49145 106 C lotto 006 posizione E10 Batterioteca TLS BULK h4 ch ch8 chio chf2 ch12 ch2 10 746 899 1003 1030 971 Cabo BULK VRAC 36 498 600 668 686 646 2901 2514 388 2989 2989 9997 2989 2901 655 869 2901 10 7 689 2989 2989 9997 9997 9893 240 223 70 574 669 739 737 5 219 261 290 a 757 pre 004 s 20y 004 15y biolegend 62 220 244 261 268 228 1 109 128 141 132 ete 03 793 925 1017 1075 a stor 14 482 573 632 663 622 19 151 173 184 179 VRAC h4 ch ch8 cht0 ch12 chi22 sile 12 607 734 821 838 783 IE 1901 faao _N M 639 772 858 867 818 514 9997 2989 9997 E 9906 Hre N 31 483 581 647 608 106 55 860 1007 1111
183. ra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Figura 3 21 Nella piastra a sinistra le colonie di Faecalis sono sovrapposte a colonie di Coli nella piastra a destra sono presenti solo colonie di KES Per provare ad identificare le infezioni nei casi non standard in cu le colonie non si esprimono con il loro colore classico stato necessario sviluppare un ulteriore procedura che sfrutta maggiori informazioni come la presenza contemporanea di piu infezioni le dimensione delle colonie ad esempio 11 KES genera una colonia con dimensione pi grande rispetto al Faecalis come visibile in Figura 3 22 a e b la presenza di un alone marrone attorno alle colonie di Proteus Figura 3 22 c etc POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute a b Figura 3 22 La piastra a contiene colonie di KES la b di Faecalis mentre nell immagine c sono visibili le colonie di Proteus con il relativo alone Di seguito alcuni POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute risulta ottenuti uhhzzando due support Vector Machine multiclasse
184. ra negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Costi sostenuti Indicare i costi sostenuti da ciascun partner per lo svolgimento dell obiettivo operativo PARTNER 1 265 041 45 In caso di variante progettuale autorizzata si deve fare riferimento al nuovo piano finanziario e al nuovo cronoprogramma approvato POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Obiettivo operativo 4 Realizzazione di uno strumento per lo screening microbiologico delle urine e anche per il successivo antibiogramma Attivit realizzate Illustrare le attivit realizzate specificando il ruolo di ciascun partner del progetto Tutte le attivit di questo obiettivo sono di competenza del solo partner capofila Diesse Ricerche Srl ATTIVITA 1 Studio sensoristica per la detenzione del fenomeno di crescita Questa attivit stata completamente eseguita e conclusa L attivit si e concentrata sulla ricerca di mercato di sensori in grado di rilevare e misurare la quantit di CO2 anidride carbonica che si sviluppa in una coltura batterica a seguito dell attivit metabolica connessa alla crescita dei batteri stessi Le caratteristiche del sensore consistevano in 1
185. racy 32 F to 122 F 0 C to 50 C 0 to 95 RH non condensing 40 F to 158 F 40 C to 60 C Non Condensating Scheda sensori ATTIVITA 2 Studio tempistica del ciclo Questa attivita e stata completamente eseguita e conclusa Una volta individuato il principio base da applicare e prima di passare alla progettazione POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute e realizzazione di un primo prototipo sono sati fatti studi simulazioni e primi test del sensore per capire la tempistica auspicabile e compatibile per uno screening rapido delle batteriurie Un aspetto Importante e decisivo stato quello di evitare risposte falso negative ovvero di refertare come sano un campione infetto risultati sono stati di fissare preliminarmente per ogni campione un tempo massimo di 2 ore di analisi prevedendo un ciclo teorico di questo tipo TEMPO 0 agitazione campione per 3 min lettura anidride carbonica basale insufflazione di aria fresca nella provetta di coltura incubazione per 50 60 min in termostato a 38 C con miscelazione ogni 12 min TEMPO 50 60 min lettura anidride carbonica per eventuale sviluppo insufflazione di aria fresca nella provetta di coltura incubazione per 50 60 min in termostato a 38 C con miscelazione
186. re l efficacia del legame Su tre canali della superficie di un chip CM5 costituito da una matrice di destrano carbossimetilato sono stati covalentemente immobilizzati tramite amine coupling tre diversi anticorpi monoclonali 17 19 e 16 5 e diretti contro la proteina K19 e 33B 2 diretto contro LPS La formazione del legame ammidico tra un gruppo amminico primario degli anticorpi e un gruppo carbossilico della superficie del chip stata ottenuta attivando la superficie con due iniezioni di EDC 0 4M NHS 0 1M 50 50 iniettando gli anticorpi 5ug ml nel miglior buffer precedentemente selezionato e bloccando i siti liberi sulla superficie del chip con etanolammina 1M a pH 8 5 Per ogni anticorpo stato raggiunto un sufficiente e comparabile livello di immobilizzazione 6100 6700 RU ideale per eseguire studi di binding con lo stesso campione che passa contemporaneamente sui tre ligandi immobilizzati Il canale 1 stato utilizzato come riferimento ed quindi stato attivato con EDC NHS e bloccato con etanolammina tutti i segnali registrati durante le analisi sono stati ottenuti come differenza tra il valore ottenuto sui canali attivi meno quello ottenuto sul canale di riferimento La funzionalit del chip stata testata iniettando su tutti i canali la proteina 19K a varie concentrazioni 500 250 125 62 5 ug ml in Running Buffer 0 1M HEPES 1 5M NaCl 30mM EDTA 0 5 v v p20 Come riportato in figura x il segnale massimo di binding
187. reening 3 Incubatore 4 Software controllo eventi 5 Studio terreni e antibiotici POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute 6 Sperimentazione e manualistica OO 5 1 Riconoscimento Realizzazione colonie semina strumento per automatica isolamento e 2 Software di identificazione elaborazione 3 Studio terreni agarizzati 4 Verifica con semina manuale 5 Sperimenta int e est wom II LL I IO Gestione Gestione rerdtcomasione essenze f J T I es a Disseminazione ain PREE Obiettivo Identificazione e validazione di e biomarcatori urinari proteici e peptidici Operativo 1 mediante tecnologia proteomica Caratterizzazione biochimica di anticorpi anti Legionella pneumophila mono e policlonali UniS1 Caratterizzazione biochimica di anticorpi anti Legionell pneumophila mono e policlonali UniSi Mappatura degli antigeni peptidici dei biomarcatori proteici identificati UNIFI Utilizzo di peptidi sintetici per screening di anticorpi in campioni di urina e produzione di anticorpi monoclonali ad alta affinit per lo sviluppo dei kit diagnostici ad elevata specificit UNIFI e DIESSE Immobilizzazione di antigeni e anticorpi su chip biosensore ottico per lo sviluppo di nuovi sistemi diagnostici ad elevata specificit e
188. registrato al termine dell iniezione risultato proporzionale alla concentrazione di proteina iniettata sui due canali contenenti gli anticorpi anti 19K ma stato osservato un binding inaspettato anche sul canale contenente l anticorpo anti LPS La prova di funzionalit del chip proseguita iniettando un campione di LPS che risultato poco solubile nel Running Buffer richiesto per gli studi Biacore ed stato quindi testato alle POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute diluizioni di 1 500 000 e 1 250 000 nessun segnale di interazione stato ottenuto con questo campione Binding 50 44 RU Manti 19K 17 19 Manti 19E 16 5 antl LEG 3368 2 Li d 62 5 125 0 250 0 500 0 conc ug ml Figura x valori di binding espressi in Unita di Risonanza RU riferiti all interazione tra la proteina 19K e i tre anticorpi immobilizzati Sono stati successivamente effettuati studi di binding con 10 campioni di urine gi classificate come positive negative allo scopo di capire se la positivit del campioni fosse dovuta alla presenza di uno o pi metaboliti derivanti dalla proteina 19K o da LPS Gli studi sono stati condotti diluendo i campioni in Running Buffer 1 25 e rigenerando ogni volta la superficie del chip con iniezioni di tamponi a pH
189. ricerca in materia di salute Disseminazione dei risultati del progetto Si prega di fornire una sintesi riguardo alle attivit di diffusione dei risultati del progetto Attivit realizzate Illustrare le attivit che sono state realizzate relative alla disseminazione dei risultati del progetto Alcuni risultati prodotti dalle fasi di studio e realizzazione del progetto sono stati resi pubblici in diverse forme N 3 tesi di laurea magistrale in Ingegneria Informatica contenenti aspetti software meccanici ed elettronici dei due strumenti relativi a 003 e 004 N 3 seminari presso la Facolt di Ingegneria al corso di Bioinformatica sulle tecniche utilizzate nel progetto per l analisi delle urine Domande di deposito BREVETTI nella maggior parte dei paesi di mondo Preparazione da parte del Marketing di Diesse Diagnostica Senese Spa che distribuir in futuro il sistema di un depliant informativo sugli strumenti di 003 e 004 che verr poi utilizzato nelle presentazione ufficiale al mercato italiano in occasione del XLI congresso AMCLI a Rimini dal Novembre 2012 2013 2014 MEDICA Germania NOVEMBRE 2013 2014 TOSCANA TECNOLOGICA LUGLIO 2014 FIRENZE Sn Pls Sider RBIS UST ea BI Pes CREBORATOR pt rom ee ni PUS ae oo economico j 2 us Pgo ANALYZER SICUrO i TI arn Mi sorer ee nan hee one oe i ME E Lust FSclie _ aw rue pete a Le et mi fiera aaa a Lic Strumenti attrezzature Indicare
190. rumento all interno del terreno La semina in alto strato viene eseguita quando si vogliono ricreare condizioni di anaerobiosi per microrganismi anaerobi 6_Tecnica dello striscio il campione viene prelevato utilizzando un ansa calibrata POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute per distribuirlo sul terreno effettuando strisciamenti delicati su tutta la superficie come mostrato in Figura 1 2 Questa tecnica utilizzata quando si vogliono differenziare le singole colonie F Figura 1 2 Tecnica dello striscio Per ottenere una buona coltura occorre scegliere opportunamente la temperatura e le concentrazioni di anidride carbonica e di ossigeno Per osservare le colonie batteriche occorre lasciare in incubazione la piastra per circa 1824 ore ad una temperatura di 37 la piastra viene capovolta per evitare che la condensa generata cada sul terreno batteri crescono formando colonie isolate ed possibile distinguerne il tipo in base alla forma alla grandezza alla superficie liscia rugosa o brillante o in base al margini e all opacit Tuttavia la caratteristica che pi facilmente permette di distinguere le diverse specie batteriche la cromogenesi ovvero il colore del pigmento rilasciato Per eseguire la conta batterica in piastra viene
191. sentano la doppia attivit enzimatica della B galattosidasi e della B glucosidasi formano delle colonie di colore blu violaceo se inoltre queste colonie risultano essere di grandi dimensioni 2 0 3 0mm molto probabile trovarsi in presenza di un batterio appartenente al gruppo K E S Klebsiella Enterobacter Serratia Molto raramente alcuni ceppi appartenenti al gruppo K E S presentano una modesta attivit B galattosidasi in questi casi le colonie assumono una colorazione intermedia tra Il blu violaceo e il blu turchese 2 Tecniche di Elaborazione delle Immagini Nel presente capitolo vengono brevemente illustrate le diverse tecniche di computer vision che sono state adottate per estrarre dalle immagini delle piastre di Petri acquisite via webcam le informazioni necessarie a rilevare la presenza ed il tipo di colonie batteriche ed effettuarne la conta 2 1 Motion Detection L applicazione sviluppata deve catturare l immagine solo quando la piastra di Petri stata posizionata correttamente sul supporto A tal fine stato utile rilevare il movimento in modo da evitare il salvataggio delle foto durante le operazioni di inserimento e rimozione della piastra Il motion detection consiste nella ricerca di un insieme di oggetti in movimento all interno di una scena Il modulo che effettua il rilevamento del movimento motion detection prevede una fase di preprocessing in cui vengono acquisiti pixel in movimento nel fra
192. ser In figura 1 e 2 sono riportate le Immagini digitalizzate delle mappe proteomiche relative rispettivamente al Pool di urine Positive e al Pool di urine Negative pi pH 250 Mr kDa Figura 1 mappa proteomica colorata con argento nitrato ottenuta con Il pool di Urine Positive z pl pH har Eee kDa F Wiii Pl tol E POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Figura 2 mappa proteomica colorata con argento nitrato ottenuta con il pool di Urine Negative Su tali immagini digitalizzate stata condotta un analisi quali quantitativa per mezzo di un software dedicato risultati ottenuti dall analisi d immagine ci permettono di trarre le seguenti conclusioni pattern proteici dei due pool analizzati differiscono notevolmente sia dal punto di vista qualitativo che quantitativo In particolare il pool delle urine positive presenta un contenuto proteico maggiore sia a livello quantitativo contenuto proteico totale che qualitativo numero di specie proteiche all interno del pool Questi risultati confermano quanto gia osservato nelle analisi precedenti condotte per mezzo di una diversa tecnologia SELDI ToF MS utilizzando singolarmente i campioni di urine positive e negative Gli spot che rappresentano le differen
193. spensione batterica con R1R2R8 in rapporto 1 6 L estratto stato diluito 1 5 in PBS ed stato ottenuto su chorus un valore pari a 416 digit Dato che il valore che si voleva ottenere sarebbe dovuto essere intorno a 1000 stato deciso di diluire l estratto 1 2 in vari tamponi stabilizzanti quali diluent 2 new born DT20 Tampone liofilo Terreno amis ottenendo i seguenti risultati POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute CANDIDA 1400 1200 1000 S00 BS CANDIDA 400 Hall O e new DTZO T liof T amis born Commento Con il tampone liofilo e il terreno amis stato ottenuto il valore desiderato Di seguito la tabella di valori a confronto dopo 4 giorni campioni conservati a 4 C se x AP Il valore desiderato viene mantenuto dopo 4 giorni con il tampone liofilo e terreno amis E stato deciso di liofilizzare il calibratore fatto in tampone di liofilizzazione e continuare la prova di stabilit su tutti gli altri calibratori E stata posta particolare attenzione sul calibratore diluito in Tampone liofilo e conservato a 4 C Come riportato nella tabella di seguito la stabilit viene mantenuta fino a 15giorni stabilit tampone liofilo liquido 4C 2000 1500 1000 E
194. st peptide protein array Nell ambito di ogni singolo biomarcatore e seguendo protocolli appropriati all immunogeno ciascun coniugato peptide carrier verr utilizzato per immunizzare gruppi individuali di topi Balb c per la ricerca e selezione di anticorpi monoclonali specifici utilizzando la tecnica degli ibridomi e o per la produzione di anticorpi policlonali ottenuti con la tecnica del fluido ascitico Previsto nel secondo anno di attivit 13 24 mesi 1 Identificazione e validazione di biomarcatori urinari proteici e peptidici mediante tecnologia proteomica Caratterizzazione del contenuto proteico urinario mediante una tecnica proteomica alternativa e complementare a quelle adottate nelle fasi precedenti lelettroforesi bidimensionale e conferma dei risultati ottenuti tramite spettrometria di massa 2 Caratterizzazione biochimica di anticorpi anti Legionella pneumophila mono e policlonali UniSi Caratterizzazione immunologica di quattro anticorpi specifici per Legionella pneumophila tra questi due hanno dimostrato di possedere immunoreattivit specifica nei confronti delle urine raccolte da pazienti infettati e quindi potenzialmente utilizzabili in kit diagnostici PAB L pneumophila 19K e LEG 132B 75 Valutazione della diversa risposta di alcuni campioni di urine raccolti da pazienti affetti da legionellosi e testati con due diversi kit diagnostici uno commerciale ed uno in fase di sviluppo In particolare stato possibile r
195. stabilit tampone liofilo liquido 4C 500 0 Agg T7gg T1Sgg Sono stati liofilizzati 10ml del calibratore praparato nel tampone di liofilizzazione e i restanti 10 ml sono stati mantenuti come tali e conservati a 4 C La liofilizzazione stata effuattuata in boccettini di vetro contenenti 1 ml di soluzione ciascuno ottenendo cos 10 boccettini dei quali 5 sono stati conservati a T A e 5 a 4 C POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Nella tabella di seguito sono riportati i risultati del controllo risospeso in 1 ml di acqua a tempo 0 e dopo 6 giorni conservato a temperatura ambiente stabilit tampone liofilizzato risospeso in 1ml H2O E stabilit tampone liofilizzato risospeso in 1ml H20 Dato che il valore del calibratore a TO risulta troppo elevato stato deciso di rifare la prova partendo dallo stesso campione ma diluito 1 2 in PBS stabilit tampone liofilizzato risospeso in 1ml 2000 1500 E stabilita tampone 1000 liofilizzato risaspeso in 1ml 200 H201 2 i Tlgg T6gg I valori sono accettabili sia dopo 1 giorno che dopo 6 giorni Streptococcus agalactiae La preparazione del campione stata effettuata con la stessa procedura utilizzata per il calibratore del kit Candida in questo caso per il rapporto di diluizi
196. sulenza con FVM Risultati raggiunti Descrivere i risultati raggiunti e punti cardine milestones di sviluppo nell attuazione delle attivit Descrivere in maniera puntuale le eventuali difformit fra i risultati attesi e i risultati conseguiti scientificamente e tecnicamente e proporre le conseguenti azioni correttive risultati raggiunti per questo obiettivo operativo sono tutti quelli precedentemente indicati come attesi ovvero 1 Strumento in grado di accettare una variet di contenitori di urine in ingresso 2 3 4 Provetta unica per le successive analisi 5 Assenza di Carry Over momento decisivo Contenitore sterile per il bulk di terreno con circuito infilatore disponibile Sistema di sanitizzazione 6 Assenza di inquinamento momento decisivo 7 8 Sistema antierrore di identificazione codice campione Produttivit non inferiore allo strumento dello screening Non ci sono state difformit tra i risultati attesi e quelli ottenuti L obiettivo ha inoltre permesso la realizzazione di un vero e proprio prodotto commerciale denominato PlusFinder Preparatore Il prodotto stato ufficialmente presentato al mercato italiano da Diesse Diagnostica Senese Spa in occasione del XLI congresso AMCLI a Rimini nel Novembre 2012 2013 e 2014 e alla mostra Internazionel Medica Germania nel Novembre 2013 e 2014 codice vendita 94804 POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedu
197. t verificandone la reattivit su ceppi da collezione dei principali patogeni urogenitali Gram e Gram La valutazione su tampone in corso di organizzazione ATTIVITA 4 Automazione dei test su strumento CHORUS Per ciascun argomento il kit stato trasferito in automazione su Chorus ottimizzando vari componenti FS tracciante tempi di reazione ecc su una curva di calibrazione interna mediamente a 4 punti rappresentativi per la sensibilit del test Obiettivo di tale attivit era di ottenere in automazione a parit di specificit una sensibilit gt a quella del metodo manuale Questa attivit stata realizzata utilizzando campioni da collezione opportunamente diluiti ed estratti ATTIVITA 5 Sperimentazione interna dei kit in automazione su strumento CHORUS Per ciascun argomento stato prodotto almeno un lotto sperimentale 001 con materiali metodi e strumentazione del reparto di produzione finale dei kit vari componenti il kit FS tracciante diluenti calibratori ecc sono stati prodotti ed allineati nei termini stabiliti nella attivit 4 Una volta superato il controllo vrac device definitivo in termini di sensibilit e specificit su una curva di calibrazione interna e ceppi da collezione il lotto stato utilizzato per una sperimentazione n house che ha richiesto la collaborazione di Strutture ospedaliere come fornitori di tamponi urogenitali o campioni di urine Nel caso di PO
198. tema urogenitale urine e tamponi Per i patogeni urinari Escherichia coli Enterococcus faecalis Proteus mirabilis sono immunizzati topi Balb c in parte sacrificati come fornitori di milze iperimmuni per la ricerca e selezione di Mab monoclonal antibodies tramite la tecnica di fusione cellulare mieloma plasmacellula o come produttori di Pab policlonal antibodies ottenuti con la tecnica del fluido ascitico Per ciascun antigene stato riscontrato un titolo anticorpale significativo Per entrambi i patogeni S agalactiae e G vaginalis stato prodotto un antisiero policlonale in topo a partire da una patina batterica inattivata Parallelamente con lo stesso antigene sono stati immunizzati topi tra i quali stato possibile selezionare due donatori di materiale splenico per la preparazione di anticorpi monoclonali POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Gli antisieri sono stati titolati con metodo Elisa indiretto Quelli a titolo pi alto sono stati purificati per affinit su Proteina A e le IgG dopo titolazione sono state in parte coniugate con Perossidasi di Rafano HRP Per ricerca e sierotipizzazioni di infezione da HSV7 e HSV2 da tamponi genitali sono stati selezionati da una precedente ricerca alcuni cloni risultati idonei per la messa
199. ti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute mal presa in considerazione Figura 3 18 In rosa gli edge rilevati all interno del background 3 6 6 Risultati sperimentali Per valutare la procedura di identificazione e rimozione del terreno di coltura le prestazioni del sistema sviluppato sono state verificate sul test set composto da 33 immagini mai utilizzate in fase di addestramento I risultati ottenuti sono 1 seguenti e Totale pixel di background analizzati 1091413 e Pixel riconosciuti come background 1068445 e Pixel non riconosciuti come background 22968 e Accuratezza 97 9 POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Come si pu vedere dal risultati le prestazioni del sistema sono molto buone Utilizzando questo modulo abbiamo quindi sviluppato un metodo per l estrazione automatica dei dataset di immagini da utilizzare nelle successive fasi di elaborazione vedi paragrafo 3 7 Inoltre l estrazione del background utile come fase di preprocessing per facilitare le successive fasi di classificazione e conta batterica 3 7 Estrazione automatica dei dataset delle colonie Prima di passare alla fase di identificazione delle infezioni necessario creare 1 dataset che verranno utilizzati per l addestramento dei classificator
200. ti da L pneumophila dalle urine dei relativi controlli sani In totale abbiamo analizzato 28 campioni cos suddivisi 14 campioni positivi cio urine raccolte da pazienti infettati da L pneumophila e sottoposte a analisi sierologica per confermare a valutare il grado di positivit all infezione 14 controlli negativi cio urine raccolte da volontari sani che non presentavano al momento del campionamento alcuna alterazione clinica tali urine sono state comunque testate per via sierologica per confermare la loro negativit all infezione da L pneumophila Dopo l acquisizione gli spettri sono stati processati e confrontati inoltre i dati sperimentali sono stati valutati utilizzando parametri statistici uni variati quali il p value bassi valori di p indicano la presenza di differenze significative di espressione tra gruppi analizzati e la curva ROC indica la capacit discriminante di un potenziale biomarcatore tanto pi questo valore si avvicina ad 1 maggiore tale capacit Nella tabella sottostante sono riportati picchi di interesse suddivisi in base al diverso protocollo di acquisizione ed identificati con il valore m z POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Protocollo di Intensit SD Ho m z SD P value ROC 4351 281 9 258 11 525 10
201. tificativi di spesa e di tutta la documentazione necessaria per la propria rendicontazione e degli altri soggetti partner ai fini dell inserimento nel sito di ARTEA in vista del SAL gli originali sono catalogati e archiviati secondo le modalit necessarie alla conservazione dei medesimi ai fini di audit esterne fino al 31 12 2020 Redazione dei documenti richiesti e reportistica di natura tecnico finanziaria La redazione dei documenti richiesti e la reportistica di natura tecnico finanziaria stata verificata dal capofila ed inserita nel sito di ARTEA per il SALDO Risorse umane Indicare la percentuale di utilizzo delle risorse umane rispetto a quanto previsto PARTNER 1 100 00 PARTNER 2 100 00 PARTNER 3 100 00 Risultati raggiunti Descrivere i risultati raggiunti e punti cardine milestones nell attuazione delle attivit di project management Descrivere in maniera puntuale qui di seguito le eventuali difformit POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute fra i risultati attesi e i risultati conseguiti scientificamente e tecnicamente e proporre le conseguenti azioni correttive Costituzione ATS tra i partners il 31 03 2011 riunione iniziale 05 04 2001 per valutare le operativit del progetto e delle prove esplorative che
202. tivo in Binax negativo alto per FIO1 659 173 95 Diesse 407 83 3991 2110 2837 0 5 ml Urina Positiva 6603 407 95 2015 344 88 0 2 ml Urina Positiva FIO valore positivo basso in Binax negativo 409 88 1480 385 139 sp a sr 407 83 voz 128 172 144 T Som le 0 5 ml Urina Positiva 407 95 valore positivo in Binax risultato dubbio 001 166 157 125 a cut off per Diesse Tz02 175 170 85 0 5 ml Urina Positiva 409 88 valore positive in Binax risultato du bbio CD13 120 101 TI a cut off per Diesse Controllo urine a diluizione Binax 3382 17 19 16 5 Binax 33B2 16 5 17 19 _ Intero 982 444 104 19 URINA 1 2 667 291 93 148 i 1 4 409 219 05 137 1 8 287 212 132 180 i i6 224 _ 189 intero 3148 1626 1762 2560 URINA 1 2 3220 1724 1239 1997 4 1 4 2B78 1261 749 1166 1 8 2147 BG 445 697 L 1 16 1478 549 intero 1427 708 266 355 URINA 1 2 909 460 1 4 246 5 1 4 508 271 107 129 1 8 370 206 101 122 1 16 277 sit z Intero 1036 216 93 URINA 1 2 fie 191 a 105 6 1 4 550 175 a7 113 1 8 620 149 95 100 1 16 274 33 n i 1 8 3393 807 Gea URINA 1 16 3120 383 494 407 83 1 32 2818 245 297 1 54 2075 POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Biomarcatore urinario per diagnosi di infezione da Streptococco pneumoniae Obiettivo produz
203. to anche necessario estrarre un dataset contenente immagini di infezioni di tipo Candida e un dataset con all interno immagini delle tre tipologie di colonie che si caratterizzano per una colorazione gialla e Dataset Background dal training set sono state evidenziate manualmente le regioni rappresentanti lo sfondo usate pol per estrarre 1 dati necessari alla costruzione del modello di riferimento I vari modelli sono stati provati sul Validation set e infine testati sul test set e Dataset Giallo dalle 72 immagini del traimng set sono state prese in considerazione solo le 14 contenenti colonie che si manifestano in una tonalit di giallo Pseudomonas Staphylococcus Aureus Proteus Per ogni immagine stata estratta manualmente la regione contenente le colome e Dataset Candida dalle 72 immagim del training set sono state prese in considerazione solo le 13 contenenti colonie di Candida Per ogni immagine stata estratta manualmente la regione contenente le colome 3 6 2 Modello del Background In prima analisi l idea pi semplice stata quella di costruire un modello statistico calcolando sul training set media e varianza delle componenti cromatiche del pixel di terreno e utilizzandole per definire una regione sfera o cubo che lo rappresentasse Usando questo modello per rilevare il terreno nelle immagini del validation set 1 risultati prodotti si sono rivelati insoddisfacenti Si pu capire il motivo di tale comp
204. to disciogliendo tutte le sostanze ad una temperatura di 150 e lasciandole in ebollizione per un ora Nel momento in cui il terreno pronto deve essere sterilizzato prima di poterlo impiegare come mezzo di coltura se la sterilizzazione non viene eseguita subito si rischia che la crescita di contaminanti possa alterarne la qualit POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Figura 1 1 Terreni solidi il colore dipende dalle sostanze utilizzate per produrli Una volta pronto il terreno solido pu essere utilizzato per seminare un campione di urina terreni solidi maggiormente impiegati sono o terreni all uovo sono realizzati utilizzando uova fresche fecola di patate sale e glicerolo vengono fatti solidificare per coagulazione al calore Possono essere conservati in frigorifero per mesi ma non consentono lo sviluppo precoce delle colonie o terreni a base di agar per realizzarli sono utilizzati sali vitamine acido oleico albumina catalasi glicerolo e destrosio Le colonie batteriche crescono velocemente e data la trasparenza del terreno possono essere osservate al microscopio La semina deve essere eseguita osservando tutte le precauzioni necessarie a non contaminare il mezzo di coltura Di seguito sono riportate alcune tra le tecniche pi
205. ttico BIACORE T100 basato sul fenomeno della Risonanza Plasmonica di Superficie SPR per la rivelazione dell interazione tra un ligando immobilizzato e un analita in soluzione disponibile presso UniFi Risorse umane Indicare la percentuale di utilizzo delle risorse umane rispetto a quanto previsto PARTNER 1 Dirigenti 100 Ricercatore 100 Personale Tecnico Qualificato 100 Co Co Pro come da variante approvata 23 05 2012 100 PARTNER 2 Dirigenti 100 Personale Amministrativo 100 Tecnici laureati 100 Assegnisti Collaboratori 100 PARTNER 3 Dirigenti 100 Assegnisti Collaboratori 100 Subcontratti POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Non necessari Risultati raggiunti Descrivere risultati raggiunti e i punti cardine milestones di sviluppo nell attuazione delle attivit Descrivere in maniera puntuale le eventuali difformit fra i risultati attesi e i risultati conseguiti scientificamente e tecnicamente e proporre le conseguenti azioni correttive risultati raggiunti per questo obiettivo operativo sono tutti quelli precedentemente indicati come attesi ovvero 1 Verifica e messa a punto dei protocolli sperimentali per l applicazione della tecnologia SELDI ToF MS alla ricerca di biomarcatori proteici di in
206. tto immunizzando i topi con urina positiva secondo sia il kit commerciale che il sistema in fase di sviluppo 2 _PAB Urina falsa negativa anticorpo policlonale prodotto immunizzando i topi con urina positiva secondo il kit commerciale ma non riconosciuta come tale dal sistema in fase di sviluppo 3_ PAB Urina negativa anticorpo policlonale prodotto immunizzando i topi con urina negativa 4 LEG 33B 2 III Incubazione delle membrane con anticorpo secondario Le membrane sono state incubate con una soluzione di Anti IgG Mouse Peroxidase Conjugate un anticorpo in grado di riconoscere e legarsi selettivamente agli anticorpi primari IV Rivelazione degli spot immunoreattivi mediante chemioluminescenza metodo ECL Nelle figure 5 8 sono riportate le immagini digitalizzate delle lastre immunoreaittive POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute M A B C D E F G H I L e N b N N w u vo a a a N do Figura 5 Western Blot ottenuto conPAB Urina positiva Figura 6 Western Blot ottenuto con PAB Urina falsa negativa M A B C D E F G H I L Figura 7 Western Blot ottenuto con PAB Urina negativa Figura 8 Western Blot ottenuto con LEG 33B 2 L analisi qualitativa delle bande immunoreattive presenti sulle
207. ucendone il carico di lavoro e quindi la probabilit di errore 1 3 Uriselect 4 Uriselect 4 un terreno gelatinoso non selettivo composto da una base nutritiva ricca contenente quattro peptoni che assicura la coltura di tutti i germi urinari Questo terreno contiene due substrati cromogeni per il rilevamento degli enzimi batterici B galattossidasi e 8 glucosidasi contiene inoltre triptofano per l evidenziazione dell attivit della triptofanasi produzione d indolo e della triptofanodesaminasi TDA Questo terreno consente di identificare direttamente tramite l evidenziazione di attivit enzimatiche i batteri pi comunemente responsabili delle infezioni urinarie L E coli viene individuato mettendo in evidenza l attivit di due enzimi la B galattosidasi e la triptofanasi La scissione tramite B galattosidasi del primo substrato cromogeno contenuto in questo terreno provoca la colorazione delle colonie che virano al rosa L attivit della TDA provoca una colorazione marronearancio che caratteristica dei batteri appartenenti al gruppo Proteus Providencia Morganella Gli enterococchi vengono rilevati in base alla presenza di una B glucosidasi esculinasi la scissione tramite questo enzima del secondo substrato cromogeno contenuto nel terreno induce nelle colonie una colorazione blu turchese Inoltre le colonie che formano gli enterococchi sono di piccole dimensioni 0 5 1 5mm Le specie batteriche che pre
208. ue L 1 1 Ii e Central Difference i h j KLj 1 I ij 1 2 33 51 x ear 4 I i 1 j I i 1 j 1 0 I Pe 0 0 LI POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Nella realta 1 contorni non sono netti ma sono attetti da rumore che causa picchi spurl che possono complicare notevolmente l operazione di nlevamento degli edge Servono dunque operatori robusti al rumore che siano in grado di filtrare le componenti causate da esso Una tecnica per eliminare 1 rumore pu essere quella di realizzare lo smoothing dell immagine prima di rilevarne 1 contorni Tale operazione ha per l effetto di introdurre una sfocatura che rende pi difficile la rilevazione accurata degli edge Il problema puo tuttavia essere evitato eseguendo lo smoothing e il calcolo delle derivate in un unico passo In letteratura esistono vari operatori che consentono di effettuare questa operazione uno dei quali l operatore di Sobel che approssima il gradiente utilizzando la central difference pesando maggiormente il pixel centrale per aumentare Pisotropicita proprieta d indipendenza dalla direzione Utilizzando il filtro di Sobel si definisce dunque B UGJ DUG 16 1 0 2 34 Lj ij ai 1 j 2I i j I i 1 j da cui
209. unto di vista sperimentale abbiamo seguito il protocollo di preparazione del campione raccomandato dal produttore Abbiamo scelto ProteinChip con tre diverse superfici POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute cromatografiche CM10 scambio cationico Q10 scambio anionico IMAC30 Cu interazione proteine cationi metallici L acquisizione degli spettri di massa stata fatta utilizzando 4 protocolli diversi differenziati per la focus mass e laser energy in modo da determinare preferenzialmente specie proteiche a basso LMW FM 10000 Da LE 2000 nJ medio MMW_I FM 20000 Da LE 2500 nJ MMW_II FM 35000 Da LE 3000 nJ ed alto peso molecolare HMW FM 55000 Da LE 3500 nJ e ripetendo ogni protocollo su ciascuna superficie Da queste analisi preliminari abbiamo selezionato i Proteinchip pi adatti per il nostro tipo di studio e cio i CM10 e IMAC30 Cu poich il maggior numero di differenze qualitative stato riscontrato con questi due tipi di selettori b Abbiamo applicato le condizioni sperimentali messe a punto nella prima fase dell attivit ad un pi ampio numero di campioni di urine positive per l infezione da L pneumophila allo scopo di individuare e selezionare un gruppo di picchi proteici in grado di differenziare la urine da pazienti affet
210. vi all infezione da L pneumophila Come da aspettative risultati migliori sono stati ottenuti analizzando il terzo set di dati in questo caso l uso simultaneo e combinato dei sette picchi ci ha permesso di classificare in maniera selettiva il 95 5 dei campioni di urine diagnosticate come positive all infezione da L pneumophila ed il 100 delle urine negative m Negativi m Negativi e TBC e TBC Legionellosi Legionellosi D D ro ro o o 8 8 8 8 D dp dp First component First Component m Negativi e TBC Legionellosi Second Component POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute Risultati raggiunti Descrivere risultati raggiunti e i punti cardine milestones di sviluppo nell attuazione delle attivit Descrivere in maniera puntuale le eventuali difformit fra i risultati attesi e i risultati conseguiti scientificamente e tecnicamente e proporre le conseguenti azioni correttive Sviluppo e massa a punto di protocolli sperimentali per l analisi SELDI ToF MS di campioni di urine da pazienti infettati da L pneumophila ma estendibile anche ad altri tipi di infezioni batteriche per le selezione e validazione di potenziali biomarcatori proteici urinari Selezione e vali
211. vo lotto di policlonale in topo tramite la tecnica dell ascite Test manuale Candida albicans tie GBS Chlamydia trachomatis con Mab selezionati stato sviluppato un test a sandwich la cui sensibilit stata testata su di una curva preparata a partire da E B in comparazione con la sensibilit riscontrata sulla stessa curva con il kit Oxoid immunoenzimatico preso come riferimento POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute data l alta sensibilit riportata e comparabile ai metodi molecolari disponibili SCHEDA DI CONFRONTO KIT PROTOTIPO DIESSE KIT OXOID IDEIA CURVA DI CONTROLLO Cellule Chlamydia trachomatis ceppo Diesse sospensione in PBS alla concentrazione proteica di 20 ug ml Diluita la sospensione in tampone estraente DIESSE alle conc finali di 1 0 1 0 01 0 001 ug ml test OXOID IDEIA PCE Chlamydia cod K603211 2 CONC ug ml INDEX sensibilit 0 01 ug ml 0 06 NEG test CHORUS prototipo CONC ug ml INDEX 01 0 9 B L sensibilit 0 1 ug m 00 06 NEG 0 0 7 NEG 12 10 8 test OXOID IDEIA PCE 6 Chlamydia cod K603211 2
212. vocabile al test emettendo nell ultravioletto AE EPS Fig 6 Diverse intensit di risposta alla lampada di wood con differenti ceppi di E coli Lo studio potr proseguire solo dopo uno studio nell automazione del riconoscimento della fluorescenza da parte di un dispositivo ottico in presenza di luce ultravioletta POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra imprese e organismi di ricerca in materia di salute d PROVE PER VARIAZIONE DEVICE ROBOBACT Nel 2012 e 2013 sono state effettuate delle prove esplorative per valutare la possibilit di utilizzare lo strumento seminatore Robobact non solo per isolare le specie presenti nei campioni biologici ma anche per effettuare un identificazione presuntiva delle specie e la successiva conta Fig 7 Questa immagine rappresenta il risultato di un esperimento In ogni provetta pozzetto erano stati posti 0 5ml di terreno cromogeno Volevamo valutare se l aggiunta di un campione con risposta cromogena nota fosse presente nell interfaccia tra I terreno solido e il terreno liquido Risultato Il terreno solido si staccato dal fondo e inoltre non ha reagito secondo le proprie specifiche POR CReO FESR 2007 2013 Linea di intervento 1 1 c Avviso di procedura negoziale Sostegno a progetti di ricerca industriale e sviluppo sperimentale congiunti tra
213. ze qualitative pi marcate tra i due campioni in esame cerchiati in rosso in Figura 1 hanno valori di peso molecolare del tutto congruenti con quelli dei potenziali biomarcatori di infezione da Legionella da noi selezionati e validati per mezzo dell analisi SELDI ToF MS 2 Infezioni indirettamente correlate al sistema urinario dosaggio di marcatori urinari Biomarcatori urinari per diagnosi di infezione da Legionella pneumophila Obiettivo dello studio la selezione di Mab specifici per antigeni urinari solubili conseguenti ad infezione da Legionella pneumophila serotipo 1 la specie pi frequentemente coinvolta in casi umani La legionellosi una malattia infettiva grave e a volte a letalit elevata per cui necessaria una diagnosi rapida per una terapia efficace Il metodo di diagnosi pi usato la ricerca di antigeni solubili nelle urine che possono risultare positive dopo solo 24 ore dall infezione per contro la sierologia di scarso aiuto poich la siero conversione avviene tardivamente con significato di retro diagnosi La lipoproteina 19kDa comune a tutte le specie ed antigeni lipopolisaccaridici di parete sono i principali antigeni urinari Abbiamo estratto l LPS dal batterio intero seguendo protocolli presenti in letteratura e controllandone la validit antigenica sul kit commerciale di riferimento gold standard kit Binax L antigene proteico 19K stato prodotto come POR CReO FESR 2007 2013 Linea

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