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Documento PDF - Università degli Studi di Padova

1. gt a c O O m O O O 20mm O A O O O O O O O O Fig 5 20 Elettrodo composto da 11 aghi posti tutti a diverse distanze Le tabelle in Fig 5 21 22 mostrano il riassunto dei parametri impostati nelle tre applicazioni CL_ xls b File Edit Yiew Insert Tools Desktop Window Help PARAMETRI ELETTRODI PARAMETRI ELETTRODI Paziente xxx Age xxx Paziente xxx Age xxx ProbeTo Distance Amp PulseL Pulse E fem 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 ProbeTo Distance Amp PulseL Pulsen E viem 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 OT Be mm NN f m a a fia olw w w Go Go oo 2 3 4 5 6 7 8 9 olowo anlel wne DAA elal alaala w w 0 0 Go GD GD GO GD 1 1 1 2 2 3 3 4 4 5 al 0 Fig 5 21 Tabelle che riassumono i dati con cui stato impostato l elettroporatore durante la a prima applicazione b seconda applicazione 55 CL_3 xls File Edit View Insert Tools Desktop Window Help PARAMETRI ELETTRODI Paziente xxx Age xxx ProbeTo Distance Amp Pulse Pulsen E Mem c 1500 100 8 2000 100 8 666 co 2000 100 a 1000 Fig 5 22 Tabelle che riassumono i dati con cui stato impostato l elettroporatore durante la terza applicazione Le finestre in Fig 5 23 24 mostrano 1 grafici relativi ai tre applicazioni Sono evidenziate le aree in cui il circuito di sicurezza ha blocc
2. 3 3b 18 Fig 3 4 Condensatori piani a dielettrico in serie b dielettrico in parallelo 18 Il modello di condensatore a facce piane un approssimazione in realt gli elettrodi dovrebbero essere considerati come dei cilindri filiformi 3 2 Dipendenza dalla frequenza I materiali rispondono diversamente se esposti a corrente diretta DC o alternata AC Se il materiale puramente resistivo il sistema non dipendente dalla frequenza f la corrente proporzionale alla tensione indipendentemente dalla frequenza Tuttavia in generale 1 materiali hanno elementi capacitivi ed induttivi il rapporto tra tensione e corrente dipende dalla frequenza ed denominato impedenza Z L impedenza una quantit complessa composta da una parte resistiva R parte reale ed una reattanza X parte immaginaria dipendente dalla frequenza 3 4 La resistenza pu essere solo positiva mentre la reattanza pu essere positiva di carattere induttivo o negativa di carattere capacitivo 3 5 _ 3 6 3 7 la frequenza angolare Per la maggior parte dei materiali e sono dipendenti dalla frequenza In Fig 3 5 riportato un esempio del comportamento in frequenza di un tessuto biologico 19 107 10 permittivity W S 0 A AHONPUCS 1 0 1 10 103 105 107 109 wn Frequency Hz Fig 3 5 Tipica dipendenza dalla frequenza di un tessuto biologico 19 19 3 3 Propriet elettriche passive dei
3. STATISTICA RESISTENZA DEI BLOCCHI DI IMPULSI R Max RMin RMe 1 2 3 4 5 6 Ta Dis mm 77 67404 66 60749 71 33845 77 67404 76 73463 74 81111 71 52445 68 69169 66 95001 67 7158 66 60749 30 74 33073 61 23784 67 18261 74 33073 73 32561 69 76482 67 11701 64 72933 64 64509 62 31046 61 23784 30 71 81059 62 71739 66 24481 71 81059 68 6753 67 55478 66 76608 65 14088 64 04799 63 2455 62 71739 27 92 57876 85 95846 88 49834 92 57876 90 27796 89 39077 88 38236 87 78255 86 94838 86 66744 85 95846 27 52 1336 50 58873 50 86826 52 1336 51 28374 51 27251 50 60378 50 55928 50 40641 50 09799 50 58873 25 83 68506 78 87891 80 74417 83 68506 82 71631 81 59759 80 51246 80 19961 79 36741 78 99601 78 87891 20 74 59899 70 83229 72 29037 74 59899 73 55807 72 7563 72 34732 71 65676 71 63009 70 94313 70 83229 20 74 41089 70 32331 71 76811 74 41089 72 67613 71 70257 71 71414 71 28968 71 426 70 60217 70 32331 20 53 13416 50 6209 51 74908 53 13416 52 59999 52 19567 51 78293 51 58678 51 19932 50 87291 50 6209 20 10 68 85182 64 34816 66 50823 68 85182 68 09649 67 42535 66 84415 66 40592 65 26744 64 82649 64 34816 20 Fig 5 10 Tabelle excel create dal software a Statistica resistenza dei singoli impulsi b Statistica resistenza dei blocchi impulsi Blocchi oO fF Wn 48 5 4 3 Confronto tra pi file dati Per comparare pi file ovviamente necessario effettuare degli ulteriori caricamenti di dati 1 quali si effettuano sempre premendo il pulsante Carica
4. 29 4 2 Materiali e metodi Lo studio sperimentale che ha permesso di interpretare 1 dati provenienti dal generatore di impulsi per ECT stato messo a punto in due fasi successive Imponendo prima un carico noto resistenza e capacit e poi un carico incognito tessuto 1 Componenti noti collegati come in figura 4 4 allo scopo di studiare il circuito di misura ed il comportamento della strumentazione 2 Tessuto vegetale omogeneo prima e disomogeneo dopo in cui erano incogniti 1 valori della parte resistiva R e capacitiva C 4 2 1 Componenti elettronici Gli strumenti utilizzati nella parte sperimentale sono e OSCILLOSCOPIO DIGITALE TDS 4200B L oscilloscopio digitale DSO necessario per catturare le forme d onda ai capi dei componenti del circuito di misura Si richiede che abbia tempi di acquisizione dei campioni dell ordine delle centinaia di ns e la possibilit di trasferire le informazioni raccolte ad un computer tramite un collegamento diretto oppure utilizzando una chiave USB Il modello utilizzato il TDS 4200B prodotto da Tektronix con una banda di 100 MHz e GENERATORE DI FUNZIONI NOME Per applicare un segnale che simuli quello utilizzato nei trattamenti di elettroporazione necessario un generatore di funzioni in grado di fornire un onda quadra ad una frequenza di 5 kHz Inoltre per verificare l attendibilit delle misure fatte richiesto che sia in grado di generare anche un onda sinusoidale
5. Questo elaborato ha preso in esame gli impulsi di tensione e di corrente acquisiti dall elettroporatore durante i trattamenti di ECT per poter poi creare uno strumento per l analisi di questi dati Come prima cosa stato studiato un metodo di misura adatto a misurare impedenza di un tessuto biologico tra due elettrodi durante un trattamento ECT per capire come interpretare 1 dati forniti dalla macchina per ECT Successivamente stato implementato un software di analisi che sfrutta questo metodo per ricavare la resistenza dei tessuti trattati dai dati acquisiti il programma associa ad ogni impulso un valore di resistenza che identifica la zona del tessuto trattato tra due elettrodi Il programma consente al personale medico di analizzare e confrontare vari trattamenti singolarmente ed in gruppo in modo da valutarne l efficacia del trattamento attraverso una serie di grafici e la creazione di opportune tabelle excel che contengono le informazioni riguardanti le resistenze ottenute Alla fine presentata l analisi di due trattamenti e vengono commentati 1 risultati ottenuti 61 62 APPENDICE A CODICE MatLab Si riportano 1 principali spezzoni che compongono il codice sviluppato A VARIABILI GLOBALI N PERIODO Strutture globali INFOFILE INFOFILE Filename INFOFILE Pathname EP EP Volt EP Current EP Time PAR PAR ProbeTo PAR ProbeFrom PAR Amp PAR Distance PAR PulseL PAR NPulse PAR Dim RES RES r R
6. 1 indice per scorrere il vettore a ciclo pari al numero di coppie elettrodi tra cui si generano scariche f r a LsPAR 7 Dim controllo che 1 8 resistenza non sia uguale a zero 1f rDis 1 pulseN 0 salva 8 resistenze diverse da zero t rDis 1 pulseN stampa 8 resistenza let plot ey ligt Vis pulseN 427 FL Ae g oX er end end lt evita che si faccia la media di resistenze salvate da precedenti file a all t 1 medio mean a gt Valore medio delle 8 resistenze var std a lt deviazione standard delle 8 resistenze 6 stampa sul grafico superiore il valore medio e la std l a plotiplot amp y medio D nedLorvart 5 _ medio varr gl parte riguardante il secondo grafico lt controlla il numero del file LE ea 6 stampa resistenza in funzione della distanza plot plot b RES J Dls pulseN pulseN max EP j Time PERIODO RES j r pulseN pulseN max EP j Time PERIODO b Ibl a INFOFILE Pilename inizializzazione Label elseif j 2 plot plot by RES J Dis pulseN pulsen max EP j Time PERIODO RES j r pulseN pulseN max EP j Time PERIODO r IHl D INFOFIEE 2 Filename elseif j 3 plot plot _b RES j Dis pulseN pulseN max EP j Time PERIODO RES j r pulseN pulseN max EP j Time PERIODO m IbL CaINEOR LEE 3 Filename elseif j 4 plot plot b RES 7 Dis pulseN pulseN max EP j Time PERIODO RE
7. La sua impedenza di uscita di 50 Q e RESISTENZE E CONDENSATORI Come resistenze di misura si sono utilizzate due resistenze una da 100 Q ed una da 1 KQ Il motivo per cui ne sono presenti due perch in caso di tensioni elevate ci si collega alla resistenza pi piccola in modo da proteggere eventuali strumenti sensibili come ad esempio il DSO Sono inoltre state utilizzate altre resistenze e condensatori di varie grandezze R 1000 10K 0 C 1 100nF in sostituzione del tessuto biologico allo scopo di studiare il circuito di misura e SONDA DI TENSIONE DIFFERENZIALE Sono dei tipi di sonde in grado di ricavare valori di tensione anche in parti di circuito in cui non presente nessun terminale collegato a massa Bisogna tenere conto del fatto che possono attenuare il segnale la sonda utilizzata attenuava il segnale misurato di un fattore 20 e COMPUTER L utilizzo di un computer fondamentale per lo studio dei dati acquisiti inoltre stato usato per lo sviluppo del software di analisi dei dati di cui si discuter nel capitolo successivo Il tipo di computer da utilizzare dipende dai software che si intendono utilizzare se si usano programmi sofisticati es Matlab MathWorks necessario utilizzare computer recenti con tecnologia Pentium 30 e MISURANDO Come gi accennato per il misurando ovvero il tessuto biologico stata utilizzata inizialmente una patata nella quale successivamente stato inserito un gel di Mea
8. UNIVERSITA DEGLI STUDI DI PADOVA Facolt di Ingegneria dell Informazione Dipartimento di Ingegneria Biomedica Tesi di Laurea Software per l analisi dei dati nei trattamenti di elettroporazione Software for data analysis in the treatment of electroporation Relatore Ch mo Prof Fabrizio Dughiero Correlatore Ing Elisabetta Sieni Laureando Diego Corradini Anno Accademico 2011 2012 Indice PREFAZIONE gna T 3 I INTRODUZIONE sui 5 1 1 Definizioni e concetti base ccccccccecccccceccecccccccececsceceesssessesesessssse 5 1 2 Storia dell elettroporaziOne ssssssssssssssooooococseccccessssssssssssssssssoseo 6 LS Elettrochemioterapia sc sssscsscisessccscoososccscessssccseccossicescssossescceossssss 8 bol BlRprabredeicieicieadadelibii 9 2 ILGSISTEMNA CELLULA RR 11 Dake ASPE DaS ana 11 2 2 Membrana Culare cani 12 2 2 1 Trasporto attraverso la membrana plasmatica 13 22 2 POLMZ ale GE Membrane 14 2 3 Modellizzazione elettrica della Cellula ccccccsssccsssccscscceees 14 3 PROPRIET ELETTRICHE DEI TESSUTI BIOLOGICI 17 S L Introduzione licia 17 3 1 1 Tessuto biologico come resistenza 18 3 1 2 Tessuto biologico come condensatore 18 3 2 Dipendenza dalla frequenZa cccccccccssssssscccccsssssssscccccssssccees 19 3 3 Propriet elettriche passive dei tessuti biologici ssssss
9. J 97 28007 84 39294 89 86783 97 28007 93 38741 91 93791 89 89837 89 14604 87 60236 85 2975 84 39294 30 2 113 7884 105 7802 109 4689 113 7884 111 5111 111 1819 110 1173 108 7708 107 7743 106 8269 105 7802 30 3 100 3805 86 73252 91 37919 100 3805 95 60098 93 80137 90 31716 88 70856 87 64526 87 84724 86 73252 30 4 82 39816 81 44796 79 52704 82 39816 80 66208 79 11117 78 05021 77 90789 77 9672 78 67162 81 44796 30 5 72 72574 68 66943 70 45952 72 72574 71 81321 71 40671 70 18235 70 01543 69 65297 69 21037 68 66943 30 Fig 5 17 Tabelle excel rappresentati le statistiche delle resistenze nei blocchi impulsi relative alla a prima applicazione b seconda applicazione Per questo trattamento risulta sicuramente pi utile il confronto tra le sole 8 resistenze dal momento che le sonde degli elettrodi hanno tutte la stessa distanza e le croci apparirebbero sovrapposte rendendo poco leggibile il grafico Si pu notare come se anche gli elettrodi siano sostanzialmente vicini tra loro ci siano valori di resistenza diversi che spaziano in un intervallo compreso tra circa 70 Q e 1300 Come si pu vedere dal grafico superiore di Fig 5 18 la dispersione dei valori di resistenza avviene maggiormente nella prima applicazione ovvero quello formato dagli elettrodi posti nella parte superiore 53 Data Compare File Edit View Insert Tools Desktop Window Help Confronto tra le 8 resistenze di ogni blocco Valore medio Dey Standard camm ON_1
10. b Fig 5 26 Confronto dei valori di resistenza tra le tre applicazioni a grafico inferiore relativo a tutte le resistenze b grafico inferiore relativo alle sole 8 resistenze 59 La Fig 5 27 rappresenta in dettaglio 1 rapporti tra resistenza e distanza degli elettrodi nei tre trattamenti Dalla loro analisi s1 pu affermare che 1 valori del rapporto tra resistenza e distanza tra gli elettrodi sono pi bassi nella parte centrale attorno all elettrodo 1 Inoltre si pu affermare che il circuito di protezione da sovracorrenti scatta in prossimit del valore 2 Q mm Per 1 tratti di tessuto con queste caratteristiche il medico ha dovuto abbassare l ampiezza della tensione o o 2 O Q 2 O Q Q 7 3 Q Q ine dN O lo ein tO Ga x o O O OQ UW O solo 1 ui so 2 o NI if A iN a K 0 O 6 3 o O 4 4 Fig 5 27 Direzioni degli impulsi elettrici e valore del rapporto tra resistenza e distanza Q mm calcolati tra gli elettrodi a prima applicazione b seconda applicazione c terza applicazione 60 CONCLUSIONE L elettroporazione della membrana cellulare favorisce il passaggio di molecole aprendo dei canali nella membrana stessa L apertura di questi canali ottenuta applicando al tessuto biologico un treno di impulsi di onda quadra di opportuna intensit e durata L elettrochemioterapia una terapia che sfrutta l elettroporazione per favorire l assorbimento dei farmaci nelle cellule tumorali
11. e dal tipo di elettrodo usato la scelta ottimale degli elementi del trattamento assicura la miglior elettroporazione del tessuto e varia a seconda dei diversi trattamenti Gli elettrodi vengono posizionati in modo da circondare completamente la zona tumorale Ne esistono di diversi tipo ad esempio per tumori superficiali si fa ricorso ad elettrodi a piattine mentre per tumori a maggiore profondit si ricorre ad elettrodi ad ago In Fig 1 5 sono visualizzati alcuni modelli di elettrodi usati in ECT Fig 1 5 Alcune tipologie di elettrodi usati in ECT L attuale protocollo medico per 1 trattamenti di ECT prevede che il segnale generato sia un onda quadra formata da un treno di quattro o otto impulsi di durata 100 ciascuno e separati da 100 con frequenza pari a 5 kHz 14 Prestazione Cliniporator Ampiezza degli impulsi 100 1000 volts Numero di impulsi 1 20 Lunghezza degli impulsi 100 us Frequenza 1 5000 Hz 10 2 ILSISTEMA CELLULA 2 1 Aspetti base Gli organismi viventi sono sistemi complessi ed il loro funzionamento si basa su una struttura gerarchica che prevede livelli di organizzazione sempre pi sofisticati Fig 2 1 l elemento costitutivo pi semplice di questa organizzazione la cellula La cellula dunque l unit strutturale e funzionale a tutti gli organismi viventi di cui ne possiede tutte le propriet caratteristiche Complessit strutturale Capacit di utilizzare energia Capacit di ri
12. 12 con costante di tempo del circuito Durante la scarica del condensatore 4 13 4 14 La corrente totale circolante 4 8 durante la scarica del condensatore risulta i 4 15 con costante di tempo del circuito Il transitorio ha una durata di circa 4 5 alla fine del quale il condensatore si pu considerare completamente carico 0 scarico e viene raggiunta la condizione di stazionariet Carica Scarica 28 Tessuto b Fig 4 3 a Circuito RC parallelo collegato ad un generatore di tensione b Tensione misurata ai capi del condensatore c Corrente ai capi della resistenza del generatore 4 1 3 Descrizione segnale di ingresso I segnali di ingesso usati durante le prove sono di due tipi 1 Onda quadra Segnale usato per simulare 1l trattamento ECT da cui si vuole ricavare le R e C incognite del tessuto 2 Onda sinusoidale Segnale usato per ottenere degli ulteriori valori del misurando da utilizzare come controprova per confermare l attendibilit delle misure ricavate dall onda quadra Lo studio del segnale molto importante per ottenere la stima di R e C dei tessuti trattati La durata dei tempi di salita e discesa osservabili in Fig 5 2c deve essere tenuta in considerazione quando si va a scegliere ed impostare l oscilloscopio Quest ultimo infatti deve essere in grado di raccogliere un numero sufficiente di campioni per ottenere dei risultati accurati
13. 82 80543 49 47051 50 33432 50 37219 50 0109 49 4523 49 1824 6 67 23818 71 15908 0 57 1414 74 52912 56 31814 66 66177 64 37878 69 72331 54 95242 66 41696 6 0 84 31269 56 02798 69 82174 60 84192 0 82 77918 69 44331 59 19407 6 56 09379 81 96811 48 93781 7 66 61694 70 41813 0 56 46104 73 98944 54 92487 66 34758 65 07485 69 00485 54 78772 65 53761 7 0 83 18436 56 02431 69 70219 60 15876 0 82 75938 69 17217 58 67235 7 56 02409 82 0943 48 84311 3 66 11639 69 80249 0 56 08155 72 71448 53 9415 65 74179 63 23987 68 50341 56 46428 64 71326 g 0 83 33984 55 98945 69 60261 59 82257 0 83 01506 69 06542 58 69709 3 55 58861 81 79353 48 63102 Fig 5 25 Tabelle excel rappresentati le statistiche delle resistenze nei blocchi di impulsi relative alla a prima applicazione b seconda applicazione c terza applicazione Dis mm 30 28 Db Gli da 20 20 20 15 Dis mm 30 28 28 28 28 25 21 21 20 Dis mm 30 25 20 Gli elettrodi sono stati posti a distanze differenti quindi a differenza del trattamento analizzato in precedenza non si pu fare un analisi diretta dei valore di resistenza In questo caso necessario calcolare il rapporto tra la resistenza e la distanza tra gli elettrodi in cui stata ricavata Il risultato ottenuto una grandezza indipendente dalla distanza sulla quale possibile effettuare dei confronti 58
14. Min 55 58861 81 79353 48 63102 R Med 69 55973 72 20032 56 65206 58 28626 75 86538 56 94162 67 76411 65 7391 70 62276 57 45775 66 49752 R Med 0 86 03461 56 24029 70 93115 62 32434 0 85 31073 70 06483 59 46224 R Med STATISTICA RESISTENZA DEI BLOCCHI DI IMPULSI 1 72 17135 74 41241 56 65206 61 19606 76 30434 59 90935 68 19583 67 30601 72 17453 60 9732 65 22734 2 74 54317 74 36153 0 60 72242 79 20147 58 86716 69 94968 68 26455 72 94226 59 99942 68 4948 3 72 02464 73 39175 0 59 3778 77 48729 58 04262 69 36616 67 07386 72 2917 58 64605 67 88119 4 69 66018 72 2997 0 58 15256 76 91256 57 2071 68 24734 65 32141 70 5214 56 0766 67 15996 5 68 10695 71 75744 0 57 15729 75 78434 56 32218 67 60269 65 25351 69 82065 57 76227 66 54908 STATISTICA RESISTENZA DEI BLOCCHI DI IMPULSI 1 0 90 89931 56 62648 72 39933 64 2266 0 89 44152 69 49305 59 77911 2 0 89 92514 56 62608 72 88497 64 78285 0 87 27902 71 95999 61 32826 3 0 85 87905 56 34178 71 79812 64 31996 0 87 6488 71 46483 59 59315 4 0 86 11078 56 23058 70 99957 62 67136 0 84 74524 70 43116 59 99036 5 0 84 62569 56 05567 70 24071 61 77069 0 84 81764 69 48869 58 44351 STATISTICA RESISTENZA DEI BLOCCHI DI IMPULSI 7 3 4 5 56 90317 58 4925 58 07343 57 63339 56 89561 56 42392 82 66658 83 9052 82 9273 83 20651 82 63227
15. Ogni ulteriore file caricato andr a posizionarsi nella successiva text box libera come si pu vedere dalla Fig 5 11 Una volta che si hanno tutti 1 file desiderati si passa ad alla loro analisi premendo in questo caso Confronta dati EP Analysis Software EP Data Analysis Carica File dati K lelettroporazioneldatitGA_vitaeGA_2 xlsx Analizza le Elimina Analizza Analizza Analizza Confronta dati Fig 5 11 Finestra principale dopo il caricamento di un secondo file dati In Fig 5 12 sono rappresentati 1 due grafici che appariranno 1 Grafico superiore nell asse delle ascisse sono presenti 1 nomi dei diversi file caricati mentre l asse delle ordinate riporta il valore del rapporto tra l ottava resistenza di ogni blocco di impulsi con la relativa distanza tra le sonde Le resistenze sono segnate con dei pallini rossi la loro media con un asterisco blu mentre il loro limite superiore ed inferiore di dispersione con dei pallini blu 2 Grafico inferiore l asse delle ascisse indica 1 valori in mm relative alle distanze tra le sonde mentre l asse delle ordinate indica 1 valori di resistenza Per questo grafico si ha la possibilit di visualizzare tutte le resistenze calcolate rappresentate da delle croci Fig 5 12a oppure premendo 8 resistenze solamente le ultime di ogni blocco rappresentate da asterischi Fig 5 12b Le resistenze si differenziano in vase al loro colore che associato al file dal qu
16. Questo genere di impulsi s1 possono venire a creare a causa del sistema di sicurezza dell elettroporatore che in caso di sovracorrenti circolanti tra gli elettrodi blocca il segnale in ingresso lid d Die amp t 12345676 t Fig 5 4 a Impulsi di tensione memorizzati dalla macchina b Valori di resistenza ricavati dall elaborazione dei dati memorizzati dalla macchina 5 Ciascun valore di tensione viene diviso per il corrispondente valore di corrente per ottenere un valore di resistenza 6 Si calcola la media di questi valori di resistenza che considerata ai fini di questa analisi rappresentativa delle resistenze dell impulso 7 Dall insieme delle resistenze calcolate inoltre si estrapola la resistenza minima quella massima e la loro dispersione mediante la deviazione standard 8 Alla fine di ogni blocco ovvero ogni otto impulsi vengono calcolati 1 valori Statistici di resistenza massima minima e media relativi ad esso Il codice dettagliato dell algoritmo consultabile nel punto C dell appendice contente 1l codice Matlab 43 5 4 Manuale utente Il software come spiegato all inizio del capitolo stato concepito con l obiettivo di diventare uno strumento di analisi di dati provenienti da trattamenti di elettroporazione I file sorgente prodotti dall elettroporatore che il programma dovr leggere ed interpretare sono di tipo xml xls xlsx Dalla lettura di questi dati sorgente
17. RES N Dis 2 03 zero zero 1 incremento contatore resistenze nulle else 6 altrimenti si procede con i calcoli 6 statistica resistenza del singolo impulso rMax max rSample l c rMin min rSample l c stengo traccia della resistenza media durante impulso RES N r i rMean mink block Mean resistenza Minima del blocco di impulsi 6 riga di dati che andr salvata sul file excel exC 1 3 1 rMax rMin rMean RES N Dis i DevStd end O condizione per evitare che la rMin segnata possa essere zero in presenza di anche altri valori if minR block gt RES N r i amp amp RES N r i 0 66 mink blocks PES Nyeri end condizione per evitare che la rMax segnata possa essere zero in presenza di anche altri valori LE MaxR block lt BBSIN 1 amp amp RESI L S 0 max block RESI IN F 1 end 6 statistica resistenza per ogni blocco di impulsi se i multiplo di pulseN ovvero quando si arriva all ultimo impulso del blocco 1f mod 1 pulseN 0 o salvataggio massima resistenza del blocco impulsi RES N rMax ceil i pulseN maxR block salvataggio minima resistenza del blocco impulsi RES N rMin ceil i pulseN minR block O Calcolo della media del blocco tenendo conto di eventuali tesistenze mille RES N rMean ceil i pulseN sum RES N r i pulseN l i puLseN zero if isnan RES N rMean ceil i pulseN RES N rMean ceil i
18. Tabella valori di conduttivit di diversi tipi di tessuti usata per 1 calcoli nei modelli numerici per la simulazione di trattamenti ECT 20 27 Tuttavia dati due elettrodi e tessuti con diverse caratteristiche elettriche non semplice valutare la distribuzione di campo elettrico nel tessuto molto pi complesso di calcolare la tensione necessaria tra gli elettrodi Matematicamente il rapporto tensione distanza d un stima del campo elettrico solo nel caso si considerino impulsi in un tessuto omogeneo tra elettrodi piani paralleli la cui superficie grande rispetto alla loro distanza come si pu vedere da Fig 3 10a In Fig 310b rappresentato un elettrodo composto da due righe di aghi in questo caso il campo elettrico al suo interno non pu essere approssimato dal rapporto tensione distanza a b Tissue 240 V cm Fig 3 10 Curve dello stesso campo elettrico in una sezione di tessuto omogeneo perpendicolari agli elettrodi a Campo elettrico pari a U d caso teorico in cui gli impulsi sono generati su elettrodi piani aventi superficie infinita In questo esempio la distanza tra gli elettrodi 4 mm mentre la tensione applicata di 100 V per cui U d 250 V cm b Due righe di aghi sono utilizzate al posto degli elettrodi piani Il campo elettrico all interno della matrice di elettrodi non pu essere approssimato dal rapporto tensione distanza 20 23 3 4 Aumento di conducibilit in seguito a trattamenti di el
19. citoscheletro Doppio foglietto Fosfolipide fosfolipidico Testa idrofilica Code idrofobiche Fig 2 3 Struttura e composizione della membrana cellulare http t wikipedia org wiki File Cell_membrane_detailed_diagram_4_1t svg 2 2 1 Trasporto attraverso la membrana plasmatica La membrana plasmatica regola la trasmissione di sostanze tra la cellula e l ambiente esterno Per la sua capacit di selezionare il flusso in entrata ed in uscita detta selettivamente permeabile I principali meccanismi di trasporto di piccole molecole da una parte all altra della membrana sono Canali ionici sono strutture porose che consentono un flusso di ioni dall esterno all interno della cella o viceversa o un flusso da una cellula all altra gap junctions Queste strutture sono selettive per alcuni tipi di ioni e possono essere aperte o chiuse da alcuni segnali elettrici o chimici Pori acquosi formati da proteine di canale che permettono il passaggio da una parte all altra della membrana Pompe ioniche permettono il trasporto di ioni attraverso la membrana spendendo energia Trasporto Attivo 13 2 2 2 Potenziale di membrana Tutte le cellule viventi possiedono e mantengono una concentrazione di ioni diversa tra l interno della cellula ed 1 liquidi extracellulari Liquidi extracellulari 2 elevata concentrazione di Na e CI Liquidi intracellulari gt elevata concentrazione di K Gli ioni positivi sono presenti
20. della capacit incognita del tessuto biologico Verifica dei risultati con onda sinusoidale EA 36 4 3 1 Tessuto omogeneo patata In Fig 4 1 1a visualizzato lo schermo del DSO in cui si possono distinguere le due uscite del circuito di misura in arancione la tensione ai capi della resistenza di misura mentre in azzurro la tensione ai capi degli elettrodi impiantati nel tessuto La Fig 4 11b la foto del tessuto biologico di cui si vuole ricavare l impedenza 1 Calcolo della corrente di maglia Onda quadra 260 mV 100 Q 2 6 MA 2 Calcolo della resistenza incognita del tessuto biologico 10 24 V 3938 Q 3 Calcolo della capacita incognita del tessuto biologico ia 97 52 Q 4 Verifica dei risultati Onda sinusoidale 3701 Q 9 nF I risultati ottenuti s1 possono considerare probabili dato che gli ordini di grandezza corrispondono a quelli presenti in letteratura inoltre la verifica in sinusoidale ha restituito valori simili confermando 1 calcoli Tek spia Trig d M Pos 0 0005 CH2 Accopp Limite Bari a 200MHz 1 2 Inversione CHI S00mY CH 200mY M50 0us CHI Z 4 15mi 13 0tt 11 18 07 4 37665kHz Fig 4 11 a Visualizzazione sul DSO delle uscite del circuito di misura b Misurando tessuto omogeneo patata 37 4 3 2 Tessuto disomogeneo patata agar In Fig 4 12a visualizzato lo schermo del DSO in cui si possono distinguere le due uscite del circuito di misura in aranc
21. il software calcolera 1 valori di resistenza del tessuto durante il trattamento utilizzando l algoritmo esposto nel paragrafo precedente e li salver in appositi fogli excel Il software stato programmato in ambiente Matlab il codice scritto per le principali funzioni consultabile nell Appendice A 5 4 1 Gestione file dati Una volta avviato il software viene visualizzata la finestra iniziale visibile in Fig 5 5 All inizio l unica operazione ammessa il caricamento dei file per procedere a tale operazione necessario cliccare sul pulsante Carica e successivamente selezionare il percorso del file desiderato all interno del computer nella finestra che apparir elencando le risorse presenti nel computer Si possono caricare fino ad un massimo di 4 file E inoltre presente la possibilit di togliere un file caricato dalla lista dei file da analizzare attraverso la pressione del pulsante Elimina EP Analysis Software Caricamento file Carica File dati Analizza Elimina Analizza Analizza Analizza EP Data Analysis Analisi del singolo file Eliminazione file caricati Confronta dati Text box Confronto tra pi file Fig 5 5 Finestra principale al lancio del programma 3 n i i i i zog xml un linguaggio di markup ovvero un insieme di regole che descrivono 1 meccanismi di rappresentazione di un testo che utilizzando convenzioni standardizzate sono utilizzabili
22. in lieve eccesso nel lato esterno della membrana mentre quelli negativi all interno Questo squilibrio produce tra le due parti una differenza di carica elettrica che genera il potenziale di membrana Il potenziale di membrana a riposo si mantiene attorno ai valori medi di circa 70mV tale valore differisce a seconda del tipo di cellula L elettroporazione permette la formazione di pori idrofili che producono una ridistribuzione degli ioni sulla superficie della membrane E quindi possibile aumentare il potenziale di membrana e con esso la probabilit di passaggio di sostanze La tensione transmembranale di una cellula sottoposta ad un capo elettrico esterno 2 1 Se questa tensione supera un certo valore di soglia si avr la formazione di pori acquosi sulla membrana come si pu vedere da Fig 2 4 4 i i LA Utot t Ur Ui t PT a ST n let e a E Fig 2 4 Formazione di pori acquosi sulla membrana una volta raggiunto il valore di soglia della tensione transmembranale 2 3 Modellizzazione elettrica della cellula Il modello elettrico usato da Fricke 17 nel 1920 ancora oggi considerato una buona approssimazione per descrivere le propriet elettriche della cellula fino a diversi MHz In questo modello rappresentato in Fig 2 5 ogni porzione infinitesimale di sostanza intracellulare ed extracellulare modellata come una resistenza ed ogni porzione infinitesimale di membrana modellata come
23. nome file EditText 1 INFOFILE N Filename filename memorizza nome file INFOFILE N Pathname pathname memorizza percorso file O i amp strazione dati o e calcolo resistenza LoadData N Resistenza N elseif isempty b N 2 set handles edit2 string fullfile pathname filename INFOFILE N Filename filename INFOFILE N Pathname pathname LoadData N Resistenza N elseif isempty c N 3 set handles edit3 string fullfile pathname filename INFOFILE N Filename filename INFOFILE N Pathname pathname LoadData N Resistenza N else N 4 set handles edit4 string fullfile pathname filename INFOFILE N Filename filename INFOFILE N Pathname pathname LoadData N Resistenza N end 64 b Scelta operazioni Usando il bottone Analizza si apriranno due finestre quella per la visualizzazione dei grafici dei dati caricati e quella contenente 1 parametri settati della macchina function analizzalBtn Callback hOb ject eventdata handles controllo se stato caricato il file che si vuole analizzare if isempty get handles editl string warndlg Nessun file caricato File Error else 6 visualizzazione grafici relativi a tensione corrente e resistenza PrintGraph 1 CreateTable 1 end Mentre con il tasto Confronta si otterranno i grafici per comparare tutti i file caricati uncle Conrontabtm Callback hob ject e
24. phantom and computer modeling study Radiology vol 236 n 2 pagg 495 502 Ago 2005 76
25. pulseN 0 end 6 alla fine di ogni blocco si riportano i valori a zero zero 0 mink block U maxR block IF end end Q inserimento dei valori di resistenza relativi ai blocchi nella variabile che verr successivamente salvata in un foglio excel for i 1 PAR N Dim excl it 3 i1 RES N rMax i RES N rMin i RES N rMean 1 RES N r 1 8 1 1 RESIN sf 97 G 1 gt RESIN ario RES N 4 6 a 1 gt RESIN er 5 6 GiH1 RES N r 6 8 i 1 RES N r 7 8 i 1 RES N r 8 8 i 1 RES N Dis 8 8 i 1 end passaggi per dare il nome al file excel che verr creato n strfind INFOFILE N Filename INFOFILE N Filename strcat INFOFILE N Filename l n xls creazione file excel sui cui sono salvati i dati ricavati sulle resistenze xlswrite INFOFILE N Filename exc Fogliol xlswrite INFOFILE N Filename excl Foglio2 end 67 D STAMPA GRAFICI Funzione adibita al compito di visualizzare 1 grafici dei dati caricati function PrintGraphi N global RES global PAR dlobal INFOFILE global EP global PERIODO pulseN PAR N NPulse 1 numero di impulsi per blocco TotImp max EP N Time PERIODO numero totale di impulsi t 1 max EP N Time vettore tempo 6 Caricamento della GUI WinGraph guidata openfig WinGraph fig reuse handles h guihandles openfig WinGraph fig reuse O parte riguardante grafico della
26. recentemente generato grande entusiasmo nei campi della biotecnologia e della medicina per 1 numerosi orizzonti che ha aperto Questa tecnica stata osservata per la prima volta intorno al 1750 periodo in cui grandi scienziati fecero scoperte fondamentali per lo sviluppo della bioelettricit Si ricorda che Luigi Galvani 1737 1798 fu il primo a osservare gli effetti dell elettricit sui tessuti biologici Celebre fu il suo l esperimento condotto su di una rana morta nel quale osserv che eccitando con delle scariche elettriche 1 suoi nervi crurali si generavano delle contrazioni sui muscoli delle gambe La prima descrizione scientifica dell elettroporazione si pu trovare nel libro Ricerche sulle cause di particolari fenomeni elettrici scritto dall abate Nollet nel 1754 nel quale si cita la comparsa di macchie rosse sulla pelle sottoposta a campo elettrico sia di uomini sia di animali 2 I primi esperimenti teorici di elettroporazione del doppio strato lipidico sono invece pi recenti e risalgono agli anni 70 del secolo scorso come risultato di questi studi venne realizzata da parte di Neumann e suoi collaboratori la prima pubblicazione in merito all elettroporazione 1982 per il trasferimento di geni in cellule di roditore 3 Successivamente l applicazione del fenomeno dell elettroporazione si diffuse grazie alla costruzione di elettroporatori a campo elettrico variabile nel tempo utilizzati per il trasferimento d
27. resistenza axes h axes3 handle grafico resistenza hold on grid on 6 etichette intervalli asse x grafico resistenza set gca xtick 0 pulseN TotImp 6 etichette intervalli asse y grafico resistenza ser igca vwtioek 0 20 max RES N 4 20 6 range valori grafico resistenza axis 0 TotIimp 0 max RES N r 420 y label R Omega etichetta asse y grafico resistenza xlabel Numero impulso etichetta asse x grafico resistenza stem RES N r r visualizzazione grafico resistenza o parte riguardante grafico resistenza distanza axes h axes4 handle grafico resistenza distanza hold on grid o etichette intervalli asse x grafico resistenza distanza set gca xtick 0 pulseN TotImp etichette intervalli asse y grafico resistenza distanza set geca ytick O0 limax RES N rDis t2 range valori grafico resistenza distanza axis 0 TotImp 0 max RES N rDis 2 ylabel Omega mm etichetta asse y grafico res distanza xlabel Numero impulso etichetta asse x grafico res distanza stem RES N rDis r visualizzazione grafico res distanza o 6 stampa di righe tratteggiate nei grafici delle resistenze per la divisione dei blocchi TotBlocchi TotImp pulseN numero totale di blocchi di impulsi for k l TIouBloechi axes h axes3 plot pulseN k pulseN k O tase CL RES AN r t20 b LineWidth 2 axes h axes4 plot pulseN k pulseN k e
28. ro m T L ee ed od a oo GD oo L Lm jon an r ron Bn 4 S 6 Eal 8 Lal 10 Il lanle wl al EZAN emd t Jo eo ENN Lao 1 00 10 Fig 5 7 Tabella che riassume i dati con 1 quali impostato elettroporatore La seconda finestra Fig 5 8 composta da quattro grafici Partendo da quello che si trova pi in alto mostrano Tensione misurata al capi delle sonde Corrente misurata tra le sonde Resistenza dei singoli impulsi Rapporto tra resistenza e distanza dei singoli impulsi EP Graph Looper f lj im I I im IS _ j i i ii i i 4540 5308 6776 7744 8712 time ee sec ATTO 3872 oars 80 Haga den eee Phe taht visite Steet iin etree eee i Ge aTa VOODOO Oley P00 19 2OODPOOOOOOM 19999090 7 POQOOOOd AF OOoOQOoOOD mm ai ae Fig 5 8 Finestra in cui sono visualizzati 1 grafici di tensione corrente e resistenza del file caricato 46 In Fig 5 9 sono rappresentati 1 comandi della toolbar che consentono un analisi accurata dei grafici Zoom in out ingrandimento rimpicciolimento di determinate zone dei grafici Pan traslazione dei grafici Data Cursor cliccando con il tasto sinistro del mouse sopra un grafico apparir il suo valore assunto in quel determinato punto Pan Zoom In Out
29. su pi supporti 44 Se l operazione di caricamento andata a buon fine apparir sulla prima casella di testo il percorso del file caricato Fig 5 6 EP Analysis Software EP Data Analysis File dati T Analizza Elimina Analizza Analizza Analizza Confronta dati Fig 5 6 Finestra principale dopo il caricamento di un file dati 5 4 2 Analisi dei singoli file dati L utente dopo aver caricato almeno un file dati pu passare all operazione di analisi Per procedere all analisi dei singoli file necessario premere il pulsante Analizza alla destra della text box in cui presente il nome del file che si vuole studiare Questo comando fa aprire due nuove finestre La prima finestra Fig 5 7 contiene una tabella coni 1 parametri con cui stato impostato l elettroporatore ogni sua riga composta dalle seguenti informazioni Elettrodo di partenza della scarica Elettrodo di arrivo della scarica Distanza tra le sonde espressa in millimetri Ampiezza di tensione dell impulso Durata dei singoli impulsi Numero di impulsi con queste caratteristiche Campo elettrico calcolato come rapporto tra ampiezza e distanza espresso in 45 File Edit View Insert Tools Desktop Window Help PARAMETRI ELETTRODI Paziente xxx Age xxx ProbeTo Distance Amp Pulse Pulsen E Viem 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 Go co
30. tessuti biologici Lo studio delle propriet elettriche passive dei tessuti biologici uno strumento di analisi per la ricerca biomedica e per la pratica medica Dal momento che diversi tipi di tessuti presentano diversa conduttivit facile Immaginare che esso possa essere applicato per caratterizzare 1 tessuti La tabella in Fig 3 6 usata nei modelli numerici per le simulazioni di trattamenti eletroporativi da un idea di come ogni tipo di tessuto possa essere identificato da un valore di conducibilit Una classificazione dei tessuti in base ai loro valori di conducibilit sarebbe interessante per la diagnosi dei tumori Purtroppo anche se questa idea nata molto tempo fa solo alcuni significativi risultati sono stati ottenuti fino ad ora 20 I maggiori problemi sono causati dalla valutazione delle caratteristiche elettriche dei tessuti biologici che risulta onerosa e complicata a causa di diversi fattori Disomogeneit del tessuto ogni tessuto biologico non omogeneo Basti pensare alla cellula che formata da una membrana lipidica contenente 1l citoplasma La differenziazione delle cellule e quindi dei tessuti influisce non poco sulla correttezza della misura Anisotropia le caratteristiche di alcuni tessuti dipendono dall orientazione cellulare es fibre muscolari Fattori Fisiologici qualsiasi cambiamento fisiologico nel tessuto comporta cambiamenti nelle propriet dielettriche del tessuto stesso La temper
31. trattamento di elettrochemioterapia ad una frequenza di 5 kHz 16 3 PROPRIET ELETTRICHE DEI TESSUTI BIOLOGICI 3 1 Introduzione I tessuti biologici si possono distinguere relativamente alle loro caratteristiche elettriche in due categorie Conduttori cariche libere di muoversi sotto l effetto di un campo elettrico esterno le quali danno origine ad una corrente Considerando un segmento di parallelepipedo di area A e lunghezza d Fig 3 1 1 conduttori si possono caratterizzare con un valore di conduttanza 3 1 Dove la conducibilit indica l abilit di trasportare cariche d Fig 3 1 Conduttore di area A e lunghezza d Dielettrici cariche fisse il campo esterno Ep tende ad orientare 1 dipoli producendo un campo Ep che si oppone ad Eo Considerando due piastre di conduttore di area distanti d tra loro con all interno un dielettrico Fig 3 2 Tali elementi si possono caratterizzare mediante un valore di capacit 3 2 Dove la permittivit caratterizza l abilit del dielettrico ad immagazzinare cariche o a ruotare dipoli Fig 3 2 Dielettrico con piastre di area A distanti d tra loro I tessuti biologici presentano entrambe le caratteristiche e si possono caratterizzare attraverso un valore di permittivit e uno conducibilit 17 3 1 1 Tessuto biologico come resistenza Un tessuto biologico costituito da diversi strati di cellule che hanno propriet elettriche differenti dov
32. una capacit La teoria del circuiti ci permette di combinare tutti gli elementi per formare un semplice circuito equivalente una resistenza che rappresenta il mezzo extracellulare in parallelo con la combinazione di una serie di capacit che rappresenta la membrana e un altra che rappresenta la resistenza del mezzo intracellulare Gli stessi tre elementi del modello possono essere impiegati per rappresentare il comportamento dei tessuti 14 iw y A 22 T ay Ty se ee pi ha mi A Wied hy A e ss a a a PR SEA a n a m a wii boas AAA ON rt ew i ze P HE jaa Ta nada j Tay a s 4 a a J ree Li ii Da vi rep Y i 5 5 S 5 g P AH ey iil PAL Pi di PE we a z o x x x x fs g way tt ect Live ver i H Me 7 Paes m AAt Emi i ie Alig edt tv ae 2 f f t 2 P rm MAT sete ii re Wet el 2 s i WV Fig 2 5 Schematizzazione dei modelli elettrici della cellula e di un tessuto proposti da Fricke 17 I liquidi intracellulari ed extracelullari sono soluzioni ioniche e sono rappresentati da un certo valore di conducibilit La membrana cellulare come abbiamo visto nel paragrafo precedente un sottile film composto da un doppio strato lipidico parzialmente permeabile ai lipidi ed alle molecole d acqua ma quasi impermeabile agli ioni L
33. xls ON_2 xIs File dati 8 resistenze in funzione della distanza mm Resistenze totali Fig 5 18 Confronto dei valori di resistenza tra le due applicazioni Si pu affermare che 1 valori di resistenza sono pi alti negli elettrodi ai lati in confronto a quelli posti al centro La Fig 5 19 rappresenta in dettaglio questi 1 valori Non avendo informazioni sulla conformazione del tumore trattato non si possono trarre conclusioni pi precise 2 i 3 Q O 909 Fi 1119 2Q 899 629 4 HA ag O O Pale 81 Q 68 Q 84 0 k 9 O 3 O 105 Q to Fig 5 19 Direzioni degli impulsi elettrici e valore di resistenze calcolati tra gli elettrodi 54 5 5 2 Liposarcoma Tumore maligno costituito da cellule del tessuto adiposo pit o meno differenziate e atipiche che fa parte dei sarcomi dei tessuti molli Il medico in questo tipo di trattamento utilizza 10 elettrodi ad ago posti a diverse distanze creando una geometria che riportata in Fig 5 20 Applicando impulsi di tensione di ampiezza variabile a seconda della distanza tra gli elettrodi in modo da avere una distribuzione di campo elettrico approssimato come rapporto tra tensione e distanza di 1000 V cm Il medico ha diviso il trattamento in tre applicazioni na 11 scariche tra un primo gruppo di 6 elettrodi linee rosse 9 scariche tra un secondo gruppo di 6 elettrodi linee azzurre 3 3 scariche su 3 percorsi mancanti linee verdi
34. 327 12 68 35021 65 96803 67 11701 30 0 445292 13 66 0161 63 77152 64 72933 30 0 791022 14 71 84403 62 72722 64 64509 30 2 80647 15 66 541 60 97971 62 31046 30 1 636112 16 65 37829 60 21546 61 23784 30 1 484379 17 74 15977 70 06595 71 81059 27 1 135173 18 70 41934 68 00036 68 6753 27 0 600606 19 68 68714 67 0161 67 55478 27 0 524982 20 67 68813 66 37561 66 76608 27 0 398605 21 67 03811 64 22719 65 14088 27 1 061675 22 66 40045 63 06084 64 04799 27 1 057887 23 65 77482 62 21349 63 2455 27 1 283568 24 64 8267 61 66113 62 71739 27 1 051297 25 96 60468 90 96867 92 57876 27 1 981662 26 94 80651 88 77807 90 27796 27 1 608874 27 93 5362 88 21712 89 39077 27 1 744005 28 92 29948 86 57603 88 38236 27 1 651158 29 91 5622 86 04249 87 78255 27 1 55411 30 90 50454 85 51548 86 94838 27 1 540294 31 89 80439 85 51548 86 66744 27 1 194114 32 88 77807 84 99489 85 95846 27 1 083411 33 55 48713 50 8863 52 1336 25 1 426932 34 54 94232 50 40458 51 28374 25 1 371237 35 54 47525 50 40458 51 27251 25 1 339581 36 53 2653 50 12299 50 60378 25 0 803495 37 53 0436 50 12299 50 55928 25 0 793799 Impulsi totali 38 52 17498 50 12299 50 40641 25 0 532662 39 51 67033 49 8414 50 09799 25 0 439703 40 51 75125 49 8414 50 58873 25 0 679305 41 85 49753 82 78903 83 68506 20 0 650105 42 84 22307 82 13851 82 71631 20 0 591143 43 82 78903 80 93992 81 59759 20 0 617837 44 81 57591 79 69722 80 51246 20 0 517633 45 80 93992 79 69722 80 19961 20 0 406461 46 80 31376 78 49212 79
35. 36741 20 0 64907 47 79 69722 78 49212 78 99601 20 0 446156 48 79 09008 78 44039 78 87891 20 0 274626 49 75 63298 73 99823 74 59899 20 0 30775 50 74 54681 72 97481 73 55807 20 0 433932 51 73 49139 71 96314 72 7563 20 0 406038 52 73 49139 71 46775 72 34732 20 0 503303 53 72 46544 70 97913 71 65676 20 0 405319 54 72 46544 70 97913 71 63009 20 0 387475 55 71 96314 70 02167 70 94313 20 0 718335 56 71 96314 70 02167 70 83229 20 0 588574 57 78 49212 71 46775 74 41089 20 2 159558 58 77 90313 70 97913 72 67613 20 2 074429 59 76 75127 70 02167 71 70257 20 1 916861 60 75 63298 70 02167 71 71414 20 1 531186 61 75 63298 69 55256 71 28968 20 1 510935 62 74 01534 70 02167 71 426 20 1 194413 63 73 49139 69 0897 70 60217 20 1 377536 64 72 97481 69 55256 70 32331 20 0 832281 65 53 44127 52 80092 53 13416 20 0 22557 66 53 16759 52 26559 52 59999 20 0 301275 67 52 62855 52 00197 52 19567 20 0 24106 68 52 3631 51 48264 51 78293 20 0 296448 69 52 10032 51 22685 51 58678 20 0 208684 70 51 84016 50 97358 51 19932 20 0 24212 71 51 32756 50 72281 50 87291 20 0 212523 72 51 07505 50 47449 50 6209 20 0 186643 73 70 50458 67 73734 68 85182 20 0 879376 74 69 56618 67 29824 68 09649 20 0 693278 75 68 65243 66 43691 67 42535 20 0 567133 76 68 20449 66 01446 66 84415 20 0 572374 Impulsi del blocco 77 67 32594 66 01446 66 40592 20 0 45662 73 66 43691 64 73592 65 26744 20 0 347111 79 65 59735 64 33199 64 82649 20 0 201924 80 65 18547 63 93307 64 34816 20 0 276425 b
36. 87 resistenze var std a gt deviazione standard delle 8 resistenze 6 stampa sul grafico superiore il valore medio e la std ha plot plot a J medio b j mnediotvar b medlo parte riguardante il secondo grafico lt controlla il numero del file La 1 6 stampa resistenza in funzione della distanza plot plot by RES Pis REs 7 ty TO Ibl a INFOPILE 1 Fil name inizializzazione Label elseif j 2 pilotiplot D RES Dis RES lt r te Ibi b INFOP LER 2 Filename elseif j 3 plotiplot DRES J Dis RESA i am y Ibi CH INPOP LIE 5 Paleneme elseif j 4 pilot pilot bi REST Dis Boat ra Ibl G INFOPTILE 4 Filename na dati per impostare le dimensioni degli assi 6 massima distanza tra gli elettrodi in esame max dist max PAR Distance if max res lt max RES j r lt massima resistenza tra i dati analizzati max res max RES J Fr end D 71 Q selector 1 secondo grafico relativo alle 8 resistenze case 1 title plot b 8 resistenze in funzione della distanza ciclo per prendere in esame ogni file caricato for j 1 N pulseN PAR NPulse 1 numero di impulsi per blocco 6 si impostano ad 1 le distanze che hanno valore 0 altrimenti la rDis produrra dei valori NaN c send RES D18 lt 1 Dis RES 7 Dis Disi r c 1 rDis RES j r Dis S mm resistenza distanza parte riguardante il primo grafico t
37. Analisi dati di diversi trattamenti ccccscscsssssccsssccscccccoees 51 5 5 1 Metastasi da melanoma arto Inferiore c cc ceeeeeeeeeeeeeeeeeeceececceeeeeeeaaaaees SI Ddl Iuposarcoma rurale 55 CONCEUSIONE ica 61 APPENDICE Asus 63 BIBLIOGRA LI enna De vani Rari 75 PREFAZIONE L elettrochemioterapia un innovativa terapia antitumorale basata sull utilizzo di farmaci chemioterapici in concomitanza di impulsi di campo elettrico Questa tecnica utilizza 11 fenomeno dell elettroporazione delle cellule per rendere la membrana cellulare pi permeabile al farmaco in modo da migliorarne l efficacia Lo scopo di questo elaborato di fornire al medico uno strumento per l analisi di questi trattamenti attraverso lo studio dell impedenza dei tessuti trattati Colgo l occasione per ringraziare la Melanoma and Sarcoma Unit Istituto Oncologico Veneto IOV Dpt Of Oncological and Surgical Sciences University of Padova per la concessione dei dati di pazienti sottoposti a trattamenti di elettrochemioterapia Desidero inoltre ringraziare 11 Prof Fabrizio Dughiero per l opportunit concessa e l Ing Elisabetta Sieni per la disponibilit e pazienza con cui mi ha seguito ed aiutato nella stesura di questa tesi Infine un grandissimo grazie alla mia famiglia che da sempre ha creduto e appoggiato le mie scelte non facendomi mai mancare il loro sostegno Padova Novembre 2011 Diego Corradini 1 INTRODUZIONE I
38. Data Cursor Fg Wing ve i ve 4 r Fig 5 9 Toolbar presente nella finestra dei grafici Il bottone Report situato nella parte bassa della finestra ha la funzione di aprire il file excel creato dal software al cui interno sono presenti due fogli di calcolo Il primo foglio Fig 5 10a che riguarda 1 singoli impulsi contiene RMax massima resistenza tra quelle calcolate per ciascun impulso R Min minima resistenza tra quelle calcolate R Med resistenza media ottenuta Dts distanza tra le sonde che hanno generato la scarica Std deviazione standard delle resistenza calcolate Il secondo foglio Fig 5 10b che riguarda 1 blocchi di impulsi contiene R Max massima resistenza tra quelle calcolate del gruppo di 8 impulsi RMin minima resistenza tra quelle calcolate N resistenza media del N esimo impulso di un blocco Dts distanza tra le sonde che hanno generato la scarica 47 STATISTICA RESISTENZA DEI SINGOLI IMPULSI R Max R Min RMed Dis mm Std a 1 79 20137 76 46037 77 67404 30 0 729199 2 77 22396 76 08421 76 73463 30 0 316641 3 75 71174 73 92498 74 81111 30 0 469626 4 72 87024 70 84855 71 52445 30 0 42859 5 71 17768 68 01795 68 69169 30 0 543075 6 71 17962 65 96803 66 95001 30 1 102111 7 70 52739 62 47148 67 7158 30 3 15083 8 69 57115 60 26023 66 60749 30 3 698388 9 76 06226 73 55127 74 33073 30 0 696336 10 73 89179 72 85826 73 32561 30 0 233968 11 71 51069 68 93602 69 76482 30 0 57
39. ES Dis PAT PAT ID PAT Age numero dei file dati caricati periodo del singolo impulso nome del file caricato percorso del file caricato valori tensione estratti dall elettroporatore valori corrente estratti dall elettroporatore valori tempo estratti dall elettroporatore elettrodo partenza dell impulso elettrodo arrivo dell impulso ampiezza impulso distanza tra gli elettrodi periodo di un impulso numero impulsi per blocco num di coppie elettrodi in cui avvengono scariche resistenza V I distanza associata alla resistenza codice identificativo del paziente et del paziente 63 B FINESTRA PRINCIPALE MAIN La finestra principale del programma gestisce e Input dei dati e Scelta operazioni a Input dati Cliccando sul pulsante Carica possibile caricare file xls xlm fino ad un massimo di quattro function caricaBtn Callback hObject eventdata handles global INFOFILE global N lt caricamento dati da file xml xls xlsx ftilename pathname urgettile xml xls j xlax a get handles editl string Carica nome barra EditText 1 b get handles edit2 string Carica nome barra EditText 2 c get handles edit3 string Carica nome barra EditText 3 oO 0 O o if isempty a se EditText 1 vuoto N 1 primo file caricare set handles editl string fullfile pathname filename inserisce
40. LineWidch 2 axes h axes2 plot trenoImp k trenoImp k O max EP N Current 20 gt b LaneWldth 2 end INFOFILE 5 INFOFILE N memorizza dati per caricare il file excel end 69 E CONFRONTO DATI Comparazione delle resistenze di una serie di file dati caricati function CompareData selector global INFOFILE global PAR global RES global N global EP Global PERIODO controlla se la funzione passa un valore selector if nargin 6 se non viene passato nessun valore si crea la nuova finestra o s get 0 ScreenSize settaggio dimensioni finestra s l 50 S 2 50 s 3 s 3 100 s 4 s 4 100 figure Resize off NumberTitle off Name Data Compares Position s selector 0 else altrimenti cancella dati memorizzati nei grafici Che end lt inizializzazione label che conterranno i nomi del file caricati Ipi as LoL D Pi Lbl o 4 IDL d Tt max res 07 resistenza massima o grafico superiore plot a subpplobig Ly hold on grid on grafico inferiore plot b subplotiz 1 2 kold en grid on 6 titoli dei due grafici title plot a Confronto tra le 8 resistenze di ogni blocco title plot D Resistenza in iunsione della distanza 6 etichette assl x e y ylabel plot a 0mega mm xlabel plot a File aati ylabel plot_b Omega xlabel plot b mm pulsanti per la scelta di visualizz
41. O max 1 RES N 7 Die a2 fee b LineWidth 2 end 68 o 6 parte riguardante grafico della tensione axes h axesl handle grafico tensione hold on grid on 6 etichette intervalli asse x grafico tensione set gca xtick 0 PERIODO pulseN max EP N Time 6 etichette intervalli asse y grafico tensione set GCa WELsE 0250 mag BP N VoltEkZ50 6 range valori grafico tensione axis 0 max EP N Time 0 max EP N Volt 250 ylabel Volt V etichetta asse y grafico tensione xlabel time micro sec etichetta asse y grafico tensione BEN Volt plot t EP N Volt r visualizzazione grafico tensione O parte riguardante grafico della corrente axes h axes2 hold on grid on 6 etichette intervalli asse x grafico corrente set gca xtick 0 PERIODO pulseN max EP N Time 6 etichette intervalli asse y grafico corrente set gca ytick 0 10 max EP N Current 20 6 range valori grafico corrente axis 0 max EP N Time 0 max EP N Current 20 ylabel Current A etichetta asse y grafico corrente xlabel time micro sec etichetta asse x grafico corrente plot t EP N Current r visualizzazione grafico corrente 6 stampa di righe tratteggiate nei grafici della tensione e corrente per la divisione dei blocchi trenoImp PERIODO pulseN numero di impulsi di ogni blocco Lor k l tT1orBlocchi axes h axesl plot trenoImp k trenoImp k O max EP N VOoLt i Z00 b
42. S j r pulseN pulseN max BP 7 Time PERIODO g ll G INFORLLE 4 Falenane end dati per impostare le dimensioni degli assi 6 massima distanza tra gli elettrodi in esame max dist max PAR Distance a if max res lt max RES r lt massima resistenza tra i dati analizzati max res max RES r end end end legende dei due grafici legendih a Valore medio Dev Standard legene 10 a LD wy bl cplol d 6 range assi del grafici xmin xmax ymin ymax axis plot a O gt 0 6J axis plow by max dist 20 max dist 5 320 max resi 20 7 6 Intervallo degli assi Set plot ap EELCK Orlos set Plot ay WF 108 030 5 8 Set plot D JEC ViL550 seliplot by stick 0210 150 inserimento dei nomi dei file caricati come etichette dell asse x set plot a atrekbabel 1DL aglbl b Ibl c IDl dzy end 73 74 BIBLIOGRAFIA 1 Elettrochemioterapia una valida soluzione per le metastasi cutanee e sub cutanee http www igea it news php id 63 2 J A Nollet Ricerche sopra le cause particolari de fenomeni elettrici e sopra gli effetti nocivi o vantaggiosi che se ne puo attendere del signor abate Nollet presso Giambatista Pasquali 1750 3 E Neumann M Schaefer Ridder Y Wang e P H Hofschneider Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields The EMBO Journal vol 1 n 7 pagg 841 845 1982 4 L M Mir Pao
43. a del blocco impulsi O distanze tra elettrodi in ordine decrescente distanze ordinate sort PAR N Distance descend O 6 ciclo lettura dei singoli impulsi for i liTotIimp c 0 contatore campioni validi percentuale di valori attorno al maxV che si vogliono considerare percentuale 1 100 tensione massima nell impulso maxV periodo max EP N Volt 1 PERIODO 1 1 PERIODO 1 6 ciclo lettura dei campioni all interno di un impulso Por l1 PRRIODO 1 6 massimo discostamento da maxV accettato range maxV periodo percentuale 6 verifica che il valore dei volt sia compreso nel range stabilito if EP N Volt PERIODO 1 gt maxV periodo range 6 campioni racchiusi nel range 6 derivata discreta delle tensioni derivata EP N Volt PERIODO i 7 EP N Volt PERIODO 1 7 7 1 if derivata 0 c ctl incremento contatore campioni validi rSample c EP N Volt PERIODO 1 EP N Current PERIODO i j calcolo della resistenza end end end resistenza media singolo impulso deviazione standard singolo impulso rMean mean rSample l c DevStd std rSample l c o o O rapporto tra resistenza e distanza RES N Dis i distanze ordinate ceil 1 pulseN 6 verlfica che sia stati raccolti un numero sufficiente di campioni o che la rMean ottenuta sia gt di zero 1 c lt 20 rMean lt 0 s Impulso non adeguato RECN 2 aL 0 exc 14 3 2 41 0 0 0
44. a del tumore Trattamento effettuabile in una singola seduta e se necessario pu essere ripetuto Possibile impiego concomitante di altre terapie ad es radioterapia e terapia genica Piccole dosi di farmaci che in condizioni ordinarie non porterebbero ad alcun effetto Rispetto del tessuto sano e della funzionalit d organo Minimi effetti collaterali 9 10 11 In uno studio relativo a tumori sulla pelle di varie istologie stata dimostrata un ottima efficienza di questo trattamento la percentuale di cellule tumorali scomparse in seguito ad una sola applicazione del trattamento si avvicina al 90 del totale delle cellule malate 12 Questi significativi risultati hanno portato la Comunit Europea a finanziare e promuovere un ampio studio clinico al fine di definire le Procedure Operative Standard per l ElettroChemioTerapia in Europa ESOPE 13 1 3 1 Elettroporatore L elettroporatore il dispositvo utilizzato per elettroporare 1 tessuti Le sue parti principali sono Generatore di impulsi Elettrodi L elettroporatore mostrato in Fig 1 4 il Cliniporator prodotto dall azienda italiana IGEA E l unico elettroporatore studiato per essere usato nella pratica clinica dell elettrochemioterapia Fig 1 4 Cliniporator www igea it L efficacia dell elettroporazione dipende dal tipo di impulso durata ampiezza e forma impostabile attraverso il generatore di impulsi
45. a sua conducibilit quindi molto bassa e si pu considerare come un buon dielettrico Pertanto la struttura struttura formata dal mezzo extracellulare il doppio strato lipidico e 11 mezzo intracellulare un sistema conduttore isolante conduttore che si comporta come una capacit Nei modelli di Fig 2 6a rappresentato 11 comportamento della corrente in funzione della frequenza per basse frequenze la corrente non penetra all interno della cellula mentre correnti ad alta frequenza possono fluirvi liberamente Per questo motivo l impedenza del tessuto sar superiore alle frequenze piu basse cio IZI Re rispetto alle frequenze pi alte IZI Re Ri Per le frequenze intermedie si manifesta un comportamento di transizione in genere nella banda da circa 10 kHz a 1 MHz 15 low high 1E42 1E 3 IE 4 1E45 1E 6 1E 7 frequency frequency frequency Hz currents currents Fig 2 6 a Rappresentazione grafica del passaggio a basse ed a alte frequenze di correnti attraverso una sospensone di cellule o un tessuto b Grafico ideale dell impedenza in funzione della frequenza in un tessuto vivente La frequenza utilizzata nell ECT 5 kHz dal grafico dell impedenza in funzione della frequenza di Fig 2 6b risulta quindi che il modello elettrico della cellula durante il trattamento pu essere approssimato ad un parallelo della resistenza R con la capacit Fig 2 7 Fig 2 7 Modello elettrico del tessuto sottoposto ad un
46. ale sono state ricavate 49 Data Compare b Fig 5 12 Finestra del confronto tra pi dati a Grafico inferiore relativo a tutte le resistenze b Grafico inferiore relativo alle sole 8 resistenze 50 5 5 Analisi dati di diversi trattamenti Il software stato sperimentato per analizzare 1 seguenti dati raccolti da pazienti trattati con l elettrochemioterapia 1 Metastasi da melanoma in un arto inferiore 2 Liposarcoma 5 5 1 Metastasi da melanoma arto inferiore Il melanoma un tumore maligno che origina dal melanocita cellula della cute che preposta alla sintesi della melanina Il medico in questo tipo di trattamento ha utilizzati 7 elettrodi ad ago posti alla stessa distanza di 30 mm formando un esagono con un elettrodo al centro Questa geometria riportata in Fig 5 13 Applicando impulsi di tensione a 3000 V in modo da avere una distribuzione di campo elettrico approssimato come rapporto tra tensione e distanza di 1000 V cm Il medico ha diviso il trattamento in due applicazioni 1 7 scariche tra gli elettrodi della parte superiore linee rosse 2 5 scariche tra gli elettrodi della parte inferiore linee azzurre 2 3 j 2 i a b O 1 Pa ee La 30 mm 5 PP 4 O O FX o So o ai 7 O Za ht lJ Fig 5 13 Disposizione dei 7 elettrodi ad ago posti tutti alla distanza di 30 mm a Le linee rosse rappresentano le scariche della prima applicazione mentre quelle az
47. are tutte o solo le 8 resistenze nel grafico inferiore urcontrol styvle pushbuotercon Sering 9 100 30 CallBack CompareData 1 ulcontrol Style pushbutton String Resistenze totali Position 200 20 100 30 CallBack CompareData 0 e resistenze Position 50 20 70 O in base al valore del selettore il grafico inferiore sar relativo a tutte o solamente all s resistenza dei file switch selector selector 0 secondo grafico relativo a tutte le resistenze case 0 ciclo per prendere in esame ogni file caricato for J 1 N pulseN PAR J NPulse 1 numero di impulsi per blocco vel O LD O end 6 si impostano ad 1 le distanze che hanno valore 0 altrimenti la rDis produrra dei valori NaN Le CC Land RES 1 Das lt j Dis RES J Dis Deste 17 rDis RES j r Dis S mm resistenza distanza parte riguardante il primo grafico t 1 indice per scorrere il vettore a ciclo pari al numero di coppie elettrodi tra cui si generano scariche ror 1 l1 PAR J lt Dim controllo che 1 8 resistenza non sia uguale a zero 1f rDis i pulseN 0 salva 8 resistenze diverse da zero it Dis 1 pulseN stampa 8 resistenza PLOU PLOU a Jys EDISAL PUlLSeN E7 L trl Ae ol end end lt evita che si calcoli la media di resistenze salvate da precedenti file a al l t 1 medio mean a valore medio delle
48. ato 1 treni di impulsi di tensione EP Graph Tenia nere ACT R ui td ij N Ewa we bso ge a y ge ekian oe ee oat cee ee ee ee eee i L I I I L I8 I II j i in j b i 4940 5908 6776 7744 8712 9690 10648 time micro sec i ti 3972 4540 5308 9690 10648 ae micro di poet too PPP RO camm i mee Fig 5 23 Finestre dei grafici relativi alla prima applicazione 56 Volt V hm DIL i 3972 time sec i L ua igi I aa CARATI Tm Toi CEE Ee i CEE 1 si ri 1936 3972 time micro a Curpeat FAT PPPPPPPD 1 1 9 gt 3G CA ae ee N MINORI i O YEOOOOo Ji DYVODOOD i b PVO TODO 5 530 004 Amm 5 Numero impulso Current A amm Numero impulso Fig 5 24 Finestre dei grafici relativi alla a seconda applicazione b terza applicazione 57 O y aur wn p k o Ne womon nw fF wn O wa 3 R Max 74 54317 74 41241 56 65206 61 19606 79 20147 59 90935 69 94968 68 26455 72 94226 60 9732 68 4948 R Max 0 90 89931 56 62648 72 88497 64 78285 0 89 44152 71 95999 61 32826 R Max 58 4925 83 9052 50 37219 R Min 66 11639 69 80249 56 65206 56 08155 72 71448 53 9415 65 74179 63 23987 68 50341 56 46428 64 71326 R Min 0 83 33984 55 98945 69 60261 59 82257 0 83 01506 69 06542 58 69709 R
49. atura influisce ad esempio sulla mobilit degli ioni come conseguenza del cambiamento di viscosit del fluido extracellulare La variazione di molecole d acqua immagazzinate nel tessuto la presenza di grasso sono fattori che influiscono invece sulla conducibilit Polarizzazione dell elettrodo ogni misura come noto affetta da errore Nel misurare le propriet elettriche di un tessuto 11 problema che emerge sta nel fatto che le cariche molecolari presenti nel tessuto tendono a riorganizzarsi all interfaccia dell elettrodo compromettendo cos la misurazione questo effetto tanto maggiore quanto maggiore la conducibilit del tessuto da analizzare Pertanto per effettuare una misurazione pi accurata si ricorre a diverse tecniche e aspettando un certo intervallo di tempo dopo aver inserito l elettrodo nel tessuto prima di effettuare la rilevazione in modo da attendere la stabilizzazione del processo di polarizzazione tipicamente trenta minuti 19 Le propriet elettriche passive sono determinate dall osservazione della risposta elettrica dei tessuti Risulter che il tessuto pu essere rappresentato mediante resistenze e condensatori Alcuni tessuti biologici mostrano propriet elettriche attive poich sono in grado di generare correnti e tensioni ad es i nervi 21 20 Electric Conductivities of the Tissues Used in the Model of the Mouse With Subcutaneous Tumor Tissue Conductivity y S m Skin 0 04 Fa
50. cnica relative alle serie e ai paralleli di resistenze si pu semplificare il circuito iniziale con uno pi semplice R2 gt gt R1 gt R3 resistenza di tutte le pareti cellulari di un blocco di 1 cm x 1 cm resistenza membrana cellulare capacit membrana cellulare resistenza citoplasma ates Fig 4 1 Schematizzazione elettrica della cellula di patata proposta da Hayden 26 Si pu notare come l approssimazione del circuito elettrico della patata coincida con il circuito elettrico della cellula umana fornita da Fricke come riportato nel paragrafo 2 3 23 Sempre nello stesso articolo presente il grafico in Fig 4 2 che mostra l evolversi dell impedenza della patata in funzione della frequenza 5 50 _ eg By CS A 4 40 z 3 30 A z 6 3 2 20 ji II 10 N O N oa A n pene ee De 0 pr 10 10 108 104 105 10 Frequency amp amp Fig 4 2 Impedenza di un tessuto graficato in funzione della frequenza logaritmica I Patata isometrica dato sperimentale A dato calcolato II Erba medica dato sperimentale A dato calcolato 26 La frequenza da valutare quella utilizzata nel ECT cio 5 kHz Da questo valore di resistenza nel caso della patata si ottengono come dati sperimentali da utilizzare come verifica per le prove che verranno effettuate 1 seguenti valori di resistenza e capacit 26 4 1 2 Circuito RC parallelo Dal pr
51. e dai dati di tensione e corrente dei valori di resistenza che possono caratterizzare la zona di tessuto trattato In particolare le fasi di analisi dei dati sono le seguenti 1 Si divide il segnale in modo da valutare singolarmente ogni impulso 2 Per ogni impulso si ricava il massimo della tensione presente la quale viene moltiplicata per un adeguato valore percentuale in modo da ottenere un range di valori ammissibile Il range di tensione visibile in Fig 5 3 racchiude tutti 1 campioni compresi tra il massimo valore di tensione e la linea blu orizzontale Questo intervallo racchiude 1 campioni per cui il grafico della tensione tende ad essere costante Fig 5 3 Parti alte di impulsi di tensione le linee blu orizzontali delimitano l intervallo di valori che verranno utilizzati per calcolare la resistenza 42 3 Siconsiderano validi 1 campioni che hanno la derivata discreta della tensione nulla 4 Si controlla che il segnale analizza siano almeno 20 campioni validi In caso contrario l impulso non adeguato e la misura non potr essere attendibile si pone la resistenza a zero e si passa all impulso successivo punto 2 Un esempio mostrato in Fig 5 4 nel quale si vede un treno di impulsi di tensione formato da solo sette Impulsi di cui l ultimo costituito da solo un picco di pochi su quest ultimo l algoritmo non trova il numero minimo di campioni impostato e pone la resistenza corrispondente a tale impulso a zero
52. e il segnale della tensione ai capi di l ovale rappresenta la parte costante del grafico da cui si prende la tensione Du 4 16 Fig 4 6 Grafico della tensione ai capi della resistenza di misura in cui evidenziata la parte costante che sara utilizzata nei calcoli La corrente ottenuta la corrente che passa esclusivamente sulla del modello di tessuto dato che il condensatore completamente carico 2 Resistenza del tessuto Usando la sonda differenziale possibile ricavare la tensione al capi degli elettrodi Anche in questo caso si prender il valore di tensione nei tratti costanti del grafico costanti evidenziato in Fig 4 7 bisogna tener conto del fattore di attenuazione in questo caso 20 gt 7 4 17 ba Fig 4 7 Grafico della tensione ai capi degli elettrodi in cui evidenziata la parte costante che sar utilizzata nei calcoli Dividendo questo valore per la corrente di maglia 4 16 si ottiene il valore della resistenza del tessuto cercata 4 18 33 3 Capacit del tessuto Si pu ricavare analizzando il transitorio di scarica oppure quello di carica Considerando la scarica 4 13 si ottiene Va 4 19 V Vy x 0 368 ti ti Cso Fig 4 8 Calcolo della costante di tempo durante la scarica di un condensatore Il valore di tensione trovato dalla formula 4 19 viene poi ricercato nel grafico di l utilizzo del computer permette di effettuare questa operazione in
53. e reversibile o irreversibile In Fig 1 1 sono rappresentate le applicazioni relative ai tipi di EP reversible electroporation fi Applications permeable el ee viable os as High voltage pulses membran I sl rl gene Li 100z E 23000 Vem and short P I vivo gene trans RA duration 100 ps to 100 ms S trai XY electrochemotherapy B STENTA p aci Fa Pra Pa da k N very eee O ialbai Il Il eee T _ gt permeable a as rapine gt necrosis ee imbalance E a Pa RI a n irreversible electroporation IRE Poni ve N disturbed permeable cell _ gt apoptosis membrane homeostasis i St a Applications non thermal tissue ablation a non thermal sterilization Fig 1 1 Tipi di elettroporazione e relative applicazioni http sites google com site antoniivorra home electroporation In campo medico l EP irreversibile ha trovato impiego come procedura chirurgica minimamente invasiva per l ablazione dei tessuti indesiderati con importanti vantaggi rispetto alle tecniche di ablazione termica L EP reversibile dei tessuti viventi la base per diverse applicazioni terapeutiche in ambito clinico come introduzione di geni nelle cellule e l introduzione di farmaci anti tumorali nelle cellule quest ultimo trattamento prende il nome di elettrochemioterapia ECT 1 2 Storia dell elettroporazione L elettroporazione ha
54. ecedente paragrafo si visto come il modello elettrico di una patata si pu ricondurre come nel caso della cellula umana ad una resistenza R in parallelo con una capacit C Ai capi di questo bipolo sar collegato un generatore di onde quadre che andr a simulare il segnale di elettroporazione Le impedenze di una resistenza e una capacit sono rispettivamente 4 1 4 2 Si consideri Fig 4 3a impedenza del circuito pari a 4 3 Per lo studio di circuiti in parallelo conviene usare per un altra grandezza l ammettenza Y che non altro che 1l reciproco dell impedenza amp 4 4 La parte reale G detta conduttanza mentre la parte immaginaria B detta suscettanza Si procede ora allo studio del circuito in Fig 4 3 4 5 Le correnti ai due rami sono date da n 4 6 4 7 In cui la tensione erogata dal generatore la corrente che passa sulla resistenza la corrente che passa nel condensatore La corrente totale la somma 1 legge di Kirchhoff delle due correnti sopra citata 4 8 I grafici presenti in Fig 4 3 rappresentano b la tensione ai capi del condensatore C c la corrente che attraversa la resistenza del generatore Gli andamenti temporali di tensione e correnti sono Durante la carica del condensatore 4 9 27 7 4 10 411 La corrente totale circolante 4 8 durante la carica del condensatore risulta A RR 4
55. eee 20 3 3 1 Valutazione campo elettrico nel tessuti 21 3 3 2 Campo elettrico di soglia dei tessuti DIOIOGICI LL 22 3 4 Aumento di conducibilit in seguito a trattamenti di eIettFOpOrazione anta 24 4 ESPERIMENTO PER IL CALCOLO DELL IMPEDENZA DI TESSUTIBIOLOGIC La aa 25 dl introduzione aaa 25 Aled Simulazione tess to DIOIOSICO sprna 29 Adee Cieuto RC Prale lO er ZI 4 1 3 Descrizione segnale di ineressOs ccvacixcs aside maninawiled wie 29 4 2 Materiale metodi ss gici a kiss eines 30 AD COMPONSOECIEHTONOL z ida 30 4 2 2 Realizzazione ircuito di MISUTA ziali or 31 4 2 3 Procedura per ricavare la sintesi di impedenza 33 4 39 RSU 36 AS Tessuto omogeneo PUMI arco E 37 4 3 2 Tessuto disomogeneo patata agar ii 38 4 3 3 Tessuto disomogeneo patata agar patata 39 4 4 CONCIUISIOM sssi asea oa nues 40 5 PROGETTAZIONE DI UN SOFTWARE PER L ANALISI DEI DATI DI TRATTAMENTI ELETTROPORATIVL ssssssssees 41 Del introduzione simpa 41 5 2 Sconale MUMNBLESSO sacssscesssvsncsccreneccsaesstecerssuecesseeinesessosseesiesseocevsenees 41 5 3 Algoritmo per il calcolo della resistenza cccssccssssssccees 42 Sit Manuale UCI esos gia as aSa 44 Fil ESON E eee ee ce rea E A 44 34 2 Analisi deriso Medati assina a EEEE 45 54 3 Confronto tra pi Tile dall aria iasan a aa 49 5 5
56. ell impedenza del carico considerando tessuti biologici omogenei e disomogenei I materiali sono stati disposti su un contenitore di lunghezza 3 cm larghezza 1 5 cm e profondit 2 cm gli elettrodi usati sono ad ago con diametro pari ad 1 5 mm Sono stati Impianti ad una profondit di circa 1 5 cm e posti distanti 2 cm uno dall altro In Fig 4 10 sono rappresentate come sono state realizzate le tre prove e in che modo sono stati disposti gli elettrodi Il confronto con 1 dati presi dalla letteratura pu essere utile solamente come confronto dell ordine di grandezza a causa delle differenze tra le due esperienze Diverso tipo e geometria di posizionamento degli elettrodi Contenitore differente Tipi di patata e loro conservazione differente 3 cm a Patata 5 1 5 cm d 1 5 mm 1 5 cm 1 5 cm CE A i LI LI Patata Agar 1 5 cm lcm lcm lcm 1 i Fig 4 10 Le immagini mostrano il contenuto del contenitore visto dall alto a Prova tessuto omogeneo solo patata b Prova tessuto disomogeneo met patata met agar c Prova tessuto disomogeneo 2 3 patata 1 3 agar d Dimensioni e posizionamento degli elettrodi nelle tre prove b c La tensione erogata dal generatore sempre di 10 V sia nel caso di onda quadra che di onda sinusoidale Per ciascuna delle 3 prove si riportano 1 seguenti dati Calcolo della corrente di maglia Calcolo della resistenza incognita del tessuto biologico Calcolo
57. er base 20 0 g l D Glucose 0 75 g l Starch 0 75 g l Sodium sulfite 1 2 g l Ammonium ferric citrate 11 0 g l Agar 11 0 g l Final pH 7 6 0 2 at 25 C Utilizzata per la coltivazione di microorganismi anaerobi 31 Rg AW 2 vo sonda Differenziale E aa MMM a Generatore di funzioni Modello tessuto RI 1000 resistenza di misura grandi tensione R2 1 K resistenza di misura piccole tensioni Rg 500 resistenza di uscita gen di funzioni Rt resistenza mcognita del tessuto Ct Capacit incognita del tessuto Fig 4 4 Rappresentazione del circuito di misura collegato ad i vari dispositivi elettronici necessari per l acquisizione dei dati Fig 4 5 Foto del circuito di misura e dei dispositivi utilizzati in laboratorio 32 4 2 3 Procedura per ricavare la sintesi di impedenza Di seguito sono elencati 1 passi del metodo utilizzato per ricavare l impedenza a partire dai dati ottenuti con il circuito di misura di Fig 4 4 1 Corrente di maglia Il primo passo consiste nel determinare la corrente di maglia cio la corrente che circola nel circuito una volta che il condensatore C carico La si determina leggendo 11 valore della tensione dalla sonda di tensione collegata ai capi di Come valore della tensione si utilizza quello presente nei tratti in cui il grafico visualizzato sul DSO del CHI costante e lo si divide per la resistenza di misura nota In Fig 4 6 visibil
58. ettroporazione Come gi detto l elettroporazione ha lo scopo di aprire dei pori nella membrana cellulare per favorire il passaggio di molecole Dopo l applicazione di impulsi di campo elettrico di adeguata intensit s1 nota che avviene un aumento della permeabilit della membrana cellulare che ha come conseguenza un aumento della conducibilit elettrica La principale causa di questo incremento legato al flusso di ioni che per diffusione iniziano a muoversi attraverso 1 pori che si vengono a creare sulla membrana L aumento di conducibilit inizia a manifestarsi al superamento della soglia di campo elettrico per cui la cellula inizia a permeabilizzarsi quindi fondamentale il suo studio per determinare se l elettroporazione avviene Si osservato che dopo l applicazione di un impulso elettrico avviene un aumento temporaneo della conducibilit la quale ritorna al valore iniziale quando non sono pi applicati stimoli esterni La fase in cui la cellula cerca di riportarsi nelle condizionali iniziali detta di recovery che termina con la chiusura dei pori che si erano creati sulla membrana in seguito all impulso elettrico Per frequenze di impulsi alte oppure per campi elettrici elevati la fase di recovery non riesce a raggiungere il valore iniziale tra un impulso e l altro 25 Questo si ripercuote in un aumento ad ogni impulso della conducibilit totale come si vede in Fig 3 11 in cui la conducibilit al secondo
59. glia Il valore di soglia del campo elettrico una caratteristica intrinseca dei tessuti non ha Importanza che tipo di elettrodo in uso o se 1 tessuti coinvolti sono omogenei o disomogenei 20 Ad esempio il campo elettrico di soglia compreso tra 1 300 e 500 V cm nei tumori 22 vicino al 450 V cm nei muscoli scheletrici 23 compreso tra 1 330 e 370 V cm nel tessuto epatico 14 Oltre a questa soglia di raggiungimento della permeabilizzazione della membrana cellulare se ne puo considerare una seconda il cui superameno produce un elettroporazione irreversibile che porta alla necrosi cellulare Dal grafico di Fig 3 8 che rappresenta 1 tipi di elettroporazione in funzione di intensita di campo elettrico e lunghezza dell impulso si pu notare la presenza delle due soglie di campo elettrico Electric Field No Effect Mininum Membrane Breakdown Voltage f j i No Effect Pulse Length Relaxation Time of Cell Fig 3 8 Tipi di EP in base all intensit di campo elettrico e della lunghezza dell impulso 24 La tabella in Fig 3 9 contiene 1 valori delle due soglie di campo elettrico di alcuni tipi di tessuto utilizzati per 1 calcoli nei modelli numerici per la simulazione di trattamenti ECT Tissue Properties Used in the Numericai Model Tissue O Sfm o S m E Vicm E V cm Tumor 0 2 0 7 400 900 Vital organ 0 15 0 5 250 600 Healthy tissue 0 15 0 5 250 600 Fig 3 9
60. i molecole attraverso il doppio strato lipidico e per aumentare l assorbimento di agenti chemioterapici all interno delle cellule malate La prima esperienza clinica per il trattamento di tumori cutanei e sub cutanei tramite elettrochemioterapia stata eseguita nei primi anni 90 dal dr L M Mir 4 Un riassunto con le tappe fondamentali della storia dell EP si pu osservare in Fig 1 2 1754 Il fenomeno dell elettroporazione viene osservato per la prima volta Abate Nollet in seguito all applicazione di impulsi elettrici not la comparsa di macchie rosse sulle zone della pelle trattate 2 1957 Sta mpfli osserv che l applicazione di una tensione esterna a livello della membrana cellulare causa la formazione reversibile di pori in corrispondenza del doppio strato lipidico dopo il raggiungimento di un certo valore di soglia 5 1961 Prime applicazione industriali dell elettroporazione irreversibile per la sterilizzazione degli alimenti 1978 Pastushenko e altri studiosi affermarono che la rottura di una membrana lipidica a doppio strato mediante applicazione di un campo elettrico esterno correlata alla comparsa di pori superficiali 6 1981 Weaver e Mintzer scoprirono che la tensione transmembranale indotta aumentava la produzione di pori 7 _1982 Neumann realizza la prima pubblicazione in merito all elettroporazione sul trasferimento di geni in cellule di roditore 3 199 Mir ed alt
61. impulso raggiunge un valore pi alto rispetto al 1 in corrispondenza di campi elettrici sopra gli 800 V cm 0 26 E 1 6kV cm O24 E 1 2kV em 0 22 Eg70 8kV em E 70 4kV em gy 0207 Ww D 0 18 ys m 0 16 6 0 14 7 0 12 So 1 2 3 4 5 6 7 8 N Fig 3 11 Misura della conduttivit durante un treno di otto impulsi di periodo 100 us in cellule soggette a differenti campi elettrici 25 24 4 ESPERIMENTO PER IL CALCOLO DELL IMPEDENZA DI TESSUTI BIOLOGICI 4 1 Introduzione La seguente esperienza stata svolta con l obiettivo di studiare un metodo di misura adatto a misurare l impedenza di un tessuto biologico tra due elettrodi durante un trattamento elettroporativo 4 1 1 Simulazione tessuto biologico Lo scopo principale dell esperimento di trovare un metodo per determinare l impedenza di un tessuto biologico perci per motivi di semplicit si scelto di utilizzare un tessuto biologico vegetale in questo caso una patata Le caratteristiche biologiche dei tessuti vegetali s1 possono ricondurre a quelle dei tessuti umani in entrambi infatti la composizione principale costituita da acqua al cui interno sono disciolti sali minerali Dal punto di vista elettrico la cellula della patata pu essere rappresentata dal modello elettrico mostrato in Fig 4 1 proposto da Hayden 26 L articolo di Hayden fornisce l ordine di grandezza delle resistenze presenti nel modello attraverso le formule di elettrote
62. inare l impedenza di tessuti biologici durante trattamenti di elettroporazione da considerarsi accettabile 40 5 PROGETTAZIONE DI UN SOFTWARE PER D ANALISI DEI DATI DI TRATTAMENTI ELETTROPORATIVI 5 1 Introduzione Lo scopo con cui stato implementato il seguente software stato quello di fornire al medico uno strumento di aiuto nell analisi dei dati raccolti da trattamenti di ECT L esperienza condotta in laboratorio sulla valutazione dell impedenza di tessuti biologici percorsi da un segnale di onda quadra esposta nel capitolo 4 ha fornito un metodo per ricavare i valori di resistenza e capacit del tessuto durante l ECT Dall analisi di questi dati il medico potr ricavare informazioni tra cui Efficacia del trattamento Classificazione dei tessuti trattati 5 2 Segnale in ingresso Nei dati dei trattamenti raccolti il segnale di tensione generato dall elettroporatore quello relativo al generico protocollo medico per ECT visibile in Fig 5 1 cio un onda quadra di tensione formata da otto impulsi ciascuno di periodo di 200 con frequenza di 5kHz V To a lt _ 0 100 200 t us Fig 5 1 Impulsi di tensione generati dall elettroporatore L elettroporatore per uso clinico in grado di memorizzare il segnale di tensione e la corrispondente corrente che attraversa le sonde dell elettrodo Occorre notare che per motivi di spazio di memoria vengono memorizzati dalla macchina solamen
63. ione la tensione ai capi della resistenza di misura mentre in azzurro la tensione ai capi degli elettrodi impiantati nel tessuto La Fig 4 12b la foto del tessuto biologico di cui si vuole ricavare l impedenza 1 Calcolo della corrente di maglia Onda quadra 480 mV 100 Q 4 8 MA 2 Calcolo della resistenza incognita del tessuto biologico 1 52 V 1567 Q 3 Calcolo della capacit incognita del tessuto biologico 2 9 V 4 Verifica dei risultati Onda sinusoidale po I risultati ottenuti si possono considerare probabili dato che gli ordini di grandezza corrispondono a quelli presenti in letteratura inoltre la verifica in sinusoidale ha restituito valori simili confermando 1 calcoli La resistenza risulta essere minore di quella ottenuta nella prova con solo la patata tale risultato confermato dai valori sperimentali di conducibilit dei due materiali Patata 27 Agar 28 ig Trio d HM Pos 00008 CH2 Tek IL ETid Accopp DC fg gt Limite Banda I OFF x 1 a S00MH po I Tensione I i Loi Inversione CHI 500m CH2 200m M 50 0 us CHI 4 15m EEA 181 4 33555kHz Fig 4 12 a Visualizzazione sul DSO delle uscite del circuito di misura b Misurando tessuto disomogeneo met patata met agar 38 4 3 3 Tessuto disomogeneo patata agar patata In Fig 4 13a visualizzato lo schermo del DSO in cui si possono distinguere le d
64. irst clinical phase I II trial Cancer vol 72 n 12 pagg 3694 3700 Dic 1993 12 R Heller et al Treatment of cutaneous and subcutaneous tumors with electrochemotherapy using intralesional bleomycin Cancer vol 83 n 1 pagg 148 157 Lug 1998 13 L Mir Standard operating procedures of theelectrochemotherapy Instructions for the use of bleomycinor cisplatin administered either systemically or locallyand electric pulses delivered by the CliniporatorTM bymeans of invasive or non invasive electrodes 14 L M Mir Therapeutic perspectives of in vivo cell electropermeabilization Bioelectrochemistry Amsterdam Netherlands vol 53 n 1 pagg 1 10 Gen 2001 15 C Di Bello La cellula e 1 suoi componenti in Biomateriali 16 Di Bello Tessuti biologici in Biomateriali 17 H Fricke A Mathematical Treatment of the Electric Conductivity and Capacity of Disperse Systems I The Electric Conductivity of a Suspension of Homogeneous Spheroids Physical Review vol 24 n 5 pagg 575 587 Nov 1924 18 M Guarnieri e A Stella Condensatore in Principi ed applicazioni di elettrotecnica 75 19 D Miklav i e N PavSelj Electric Properties of Tissues and their Changes During Electroporation presented at the International SCIENTIFIC WORKSHOP and POSTGRADUATE COURSE November 15 21 2009 Proceedings of the Electroporation based Technologies and Treatments 20 G Pakho
65. letti e Belehradek Electrochemotherapy a novel antitumour treatment first clinical trial 5 Stampfli Reversible electrical breakdown of the excitable membrane of a Ranvier node 6 V F Pastushenko Y A Chizmadzhev e V B Arakelyan Electric breakdown of bilayer lipid membranes II Calculation of the membrane lifetime in the steady state diffusion approximation Journal of Electroanalytical Chemistry and Interfacial Electrochemistry vol 104 n 0 pagg 53 62 1979 7 J C Weaver e R A Mintzer Decreased bilayer stability due to transmembrane potentials Physics Letters A vol 86 pagg 57 59 Ott 1981 8 R Nuccitelli et al Nanosecond pulsed electric fields cause melanomas to self destruct Biochemical and biophysical research communications vol 343 n 2 pagg 351 360 Mag 2006 9 G Sersa D Miklavcic M Cemazar Z Rudolf G Pucihar e M Snoj Electrochemotherapy in treatment of tumours European Journal of Surgical Oncology The Journal of the European Society of Surgical Oncology and the British Association of Surgical Oncology vol 34 n 2 pagg 232 240 Feb 2008 10 R Heller et al Phase I II trial for the treatment of cutaneous and subcutaneous tumors using electrochemotherapy Cancer vol 77 n 5 pagg 964 971 Mar 1996 11 M Belehradek C Domenge B Luboinski S Orlowski J Belehradek Jr e L M Mir Electrochemotherapy a new antitumor treatment F
66. modo pi semplice ed efficace rispetto che a leggerlo direttamente dal DSO Una volta trovato si osserva 1l tempo corrispondente che viene indicato con Con invece si fa riferimento all ultimo istante di tempo prima della scarica Dalla loro differenza si ricava la costante di tempo caratteristica del circuito 4 20 nel caso di un circuito RC parallelo pari a indica la resistenza equivalente di due resistenze poste in parallelo tra loro 4 21 Per cui la capacit incognita del tessuto risulta essere 4 Verifica dei risultati Per l attendibilit dei risultati si prendono in considerazione inizialmente 1 dati provenienti dalla letteratura i quali servono a fornirci un unit di grandezza dei misurandi Successivamente come accennato in precedenza si user come segnale d ingresso un onda sinusoidale con l obiettivo di ottenere degli ulteriori risultati da utilizzare come verifica Una volta impostato il generatore di funzioni in modo da generare tale onda si misura lo sfasamento tra tensione ai capi del tessuto e la tensione ai capi della resistenza di misura 34 4 22 4 23 Ricavato lo sfasamento a si procede al calcolo dell inverso dell impedenza l ammettenza del circuito parallelo 4 24 La parte resistenza e la capacita possono essere ricavate dalla parte reale ed immaginaria 4 25 35 4 3 Risultati Le prove seguenti sono state realizzate per capire il comportamento d
67. mov e D Miklav i Modeling electric field distribution In vivo in advanced electroporation techniques in biology and medicine 21 A Ivorra Bioimpedance monitoring for physicians 22 J Belehradek Jr S Orlowski L H Ramirez G Pron B Poddevin e L M Mir Electropermeabilization of cells in tissues assessed by the qualitative and quantitative electroloading of bleomycin Biochimica Et Biophysica Acta vol 1190 n 1 pagg 155 163 Feb 1994 23 J Gehl et al In vivo electroporation of skeletal muscle threshold efficacy and relation to electric field distribution Biochimica Et Biophysica Acta vol 1428 n 2 3 pagg 233 240 Ago 1999 24 S Kee Generators and Applicators in Clinical aspects of electroporation 25 M Pavlin et al Effect of Cell Electroporation on the Conductivity of a Cell Suspension Biophysical Journal vol 88 pagg 4378 4390 Giu 2005 26 R I HAYDEN C A MOYSE F W CALDER D P CRAWFORD e D S FENSOM Electrical Impedance Studies on Potato and Alfalfa Tissue Journal of Experimental Botany vol 20 n 2 pagg 177 200 Mag 1969 27 P Pongviratchai e J W Park Electrical Conductivity and Physical Properties of Surimi Potato Starch under Ohmic Heating Journal of Food Science vol 72 pag E503 E507 Nov 2007 28 S A Solazzo et al Radiofrequency ablation importance of background tissue electrical conductivity an agar
68. mpulso mamm Numero impulso Fig 5 15 Finestre dei grafici relativi alla a prima applicazione b seconda applicazione 52 Nel grafico delle correnti di Fig 5 16 evidenziato un blocco di impulsi in cui si riesce ad apprezzare il fenomeno elettroporativo con l aumento di corrente ad ogni impulso SUCCESSIVO Current A Fig 5 16 Effetto elettroporativo Ime micro sec In Fig 5 17 sono riportati 1 fogli excel creati dal software e che mostrano parametri di R calcolati per entrambe le applicazioni STATISTICA RESISTENZA DEI BLOCCHI DI IMPULSI il riassunto dei R Max R Min R Med i ka 2 3 4 5 6 F 8 Dis mm 1 103 17 90 17278 94 83134 103 17 97 23088 93 0233 96 6295 93 68159 92 1394 92 60327 90 17278 30 2 131 2208 120 2908 125 5975 131 2208 130 962 127 6817 126 1093 123 8575 122 688 121 9699 120 2908 30 3 122 3085 111 2553 115 9748 122 3085 120 7193 118 3193 116 326 114 584 112 7986 111 4878 111 2553 30 4 91 21943 81 83573 85 79151 91 21943 89 02475 87 50621 85 79142 84 48433 83 67683 82 79341 81 83573 30 5 67 27342 62 11355 64 13196 67 27342 65 94018 64 87094 64 39021 63 3489 62 73475 62 38374 62 11355 30 6 83 43333 72 60517 77 60414 83 43333 81 91205 79 31548 77 88692 76 76535 75 10428 73 81049 72 60517 30 7 96 99472 89 82755 93 14172 96 99472 95 83216 94 0198 93 25094 92 6876 91 73382 90 78717 89 82755 30 b STATISTICA RESISTENZA DEI BLOCCHI DI IMPULSI R Max R Min R Med T 2 3 4 5 6 E 8 Dis mm
69. n Italia ogni anno molte persone si ammalano di tumore si parla di circa 280 000 persone di cui 152 000 muoiono a causa di un tumore maligno La probabilit di ammalarsi nel corso della vita stimata intorno al 32 6 per gli uomini e 22 9 per le donne La maggior parte dei tumori maligni inoltre pu produrre anche metastasi cutanee che secondo recenti studi si presentano nel 3 10 dei casi Oltre ai pi diffusi tumori cutanei melanomi ed epiteliomi alcune tipologie di tumore maligno soprattutto in fase avanzata hanno un elevata probabilit di generare metastasi cutanee Le terapie tradizionali quali la chirurgia la radioterapia la chemioterapia l ipertermia mediante perfusione la criochirurgia a volte non riescono ad aggredire in modo efficace le metastasi cutanee soprattutto se localizzate in zone delicate quali testa e collo zone genitali e anali In queste situazioni una nuova terapia chiamata elettrochemioterapia che sfrutta il fenomeno di elettropermeabilizzazione delle cellule pu aiutare il medico a controllare la malattia e a migliorare la qualit di vita del paziente oncologico 1 1 1 Definizionie concetti base L elettroporazione EP aumenta la permeabilit della membrana cellulare agli ioni e ad alcune macromolecole e si ottiene esponendo la cellula ad un treno di impulsi di campo elettrico di elevata intensit 1000 V cm e breve durata 100us A seconda dell intensit del campo elettrico 1 EP pu esser
70. prodursi Reattivita all ambiente esterno Essere vivente dotato di strutture ben distinte con propri caratteri morfologici e funzionali Organismo Insieme di pi organi le cui singole funzioni si sommano dando origine ad una funzione pi generale Apparato Struttura differenziata costituita da cellule e tessuti deputata a una o pi funzioni specifiche nell organismo Organo Insieme di pi cellule correlate dal punto di vista morfologico e funzionale Tessuto Unit morfologica e fisiologica fondamentale degli esseri viventi dei quali possiede tutte le propriet Cellula Fig 2 1 Struttura gerarchica degli esseri viventi 15 Le forme pi semplici di organizzazione cellulare sono rappresentate dai batteri e da alcune alghe unicellulari detti procarioti Il livello successivo occupato dagli organismi eucarotici che possono essere sia unicellulari sia pluricellulari come accade per gli organismi pi evoluti La cellula eucariota Fig 2 2 presenta un livello di organizzazione molto pi elevato rispetto a quello della cellula procariote La presenza di una membrana nucleare rappresenta l elemento distintivo 11 Citoplasma Centrioli Lisosoma Vescicola Mitocondri Nucleolo Nucleo Ribosomi Reticolo fendoplasmatico rugoso Reticolo endoplasmatico Apparato liscio del Golgi Citoscheletro Fig 2 2 La cellula eucariota http it wikipedia org wiki File Strutt
71. ri studiosi dimostrarono che determinate molecole citotossiche potevano essere introdotte all interno delle cellule mediante l applicazione di impulsi elettrici 4 2006 Nuccitelli utilizza l elettroporazione irreversibile come tecnica ablativa di tessuti in ambito medico 8 Fig 1 2 Linea temporale che percorre le tappe principali della storia dell elettroporazione 1 3 Elettrochemioterapia L ECT una chemioterapia adiuvata dall applicazione di impulsi elettrici nella zona tumorale per facilitare l assorbimento dei farmaci in particolare la bleomicina e il cisplatino da parte delle cellule tumorali Mediante elettroporazione quindi si aumenta l assorbimento dei medicinali che in condizioni normali attraversano solo in piccola parte la membrana plasmatica La schematizzazione in Fig 1 3 raffigura 1 principale step del trattamento generatore di impulsi pu 7 aumento della on elettrici il farmaco viene abilit richiusura Ai permeabilita iniettato della membrana della membrana in prossimit Rettori lisina azione citotossica f della cellula g del farmaco nel citosol Electrodes fey lif yh PANN fu j r i e ui A Sa applicazione di impulsi elettrici iniezione intratumorale o intravenosa del farmaco Fig 1 3 Meccanismo di azione dell elettrochemiotarapia 9 DP ECT offre numerosi vantaggi rispetto alle terapie tradizionali Efficacia indipendente dall istologi
72. t 0 046 Muscle Vi 0 225 Yyy 0 225 Yor 9 9 Bone 0 025 Connective tissue 0 025 Intestine 0 55 Kidneys 1 01 Liver 0 333 Lungs 0 07 Heart a m 0 2 Yyy 0 2 Vez a 0 9 Tumor 0 125 Fig 3 6 Tabella valori di conduttivita di diversi tipi di tessuti usata per 1 calcoli nei modelli numerici per la simulazione di trattamenti ECT 3 3 1 Valutazione campo elettrico nei tessuti Si consideri la Fig 3 7 in cui rappresentato il campo elettrico generato da una differenza di potenziale Vapplicata a due piastre distanti d tra loro il quale vale _ 3 3 Nel caso dell elettroporazione bisogna tenere in considerazione delle diverse costanti dielettriche relative che variano con la frequenza e da tessuto a tessuto Si supponga che il campione da elettroporare sia composto da n strati con costante dielettrica differente 1l campo n che si viene a creare all interno dello strato n esimo sar 3 4 Q Q Ea Ep Ec Ea Eb Ec Fig 3 7 Distribuzione del campo elettrico all interno di un materiale costituito di diversi strati con costanti dielettriche differenti 21 3 3 2 Campo elettrico di soglia dei tessuti biologici La permeabilizzazione della membrana cellulare associata al raggiungimento del potenziale di soglia transmembranale 2 1 indotto campo elettrico esterno Quindi affinch la membrana risulti elettroporata l intensit del campo elettrico applicato deve essere maggiore di un certo valore di so
73. t Liver Agar al 2 4 2 2 Realizzazione circuito di misura Il circuito rappresentato in Fig 4 4 e in Fig 4 5 per determinare l impedenza incognita stato montato utilizzando dei componenti commerciali Oltre alle strumentazioni elettroniche elencate nel paragrafo precedente sono stati necessari un circuito su cul collegare le varie parti elettriche due elettrodi due sonde di tensione per collegare il circuito all oscilloscopio digitale Di seguito sono elencati 1 passaggi per la sua realizzazione 1 Inserire in un contenitore il tessuto che si vuole studiare ed impiantarvi gli elettrodi alla profondit ed alla distanza scelta 2 Collegare le due resistenze di misura in serie tra loro e successivamente ad uno degli elettrodi impiantati nel tessuto 3 Collegare il generatore di funzioni ai capi liberi delle serie di resistenze e degli elettrodi 4 Collegare una sonda di tensione ai capi della resistenza di misura scelta e allacciarla al canale del DSO CHI 5 Collegare una sonda differenziale di tensione ai capi degli elettrodi e allacciarla al canale del DSO CH2 6 Impostare il generatore di funzioni in modo da generare un treno di impulsi di onde quadre con la frequenza prestabilita 7 Settare il DSO in modo da visualizzare 1 due canali e da acquisire il pi alto numero di campioni possibile per entrambi 1 segnali in modo da ottenere dei risultati pi accurati Meat Liver Agar Fluka Composition Meat Liv
74. te 1 100 relativi alla parte alta dell impulso ed 1 successivi 20 L ampiezza dell impulso generato legata alla distanza degli elettrodi Cio pi distanti sono gli elettrodi pi alta la tensione fornita Bisogna mettere in evidenza che il treno di impulsi generato ordinato in modo tale da iniziare con le tensioni pi alte per poi decrescere fino a quelle pi basse come si pu vedere in Fig 5 2a in cui riportata la tensione di due gruppi di otto impulsi per elettrodi posti a diversa distanza Purtroppo 1 dati raccolti sono campionati uno ogni 1 con questa risoluzione non possibile ricavare un valore attendibile della capacit del tessuto 41 0 FA e t 0 100 120 t us Fig 5 2 Segnali memorizzati dalla macchina durante un trattamento a Treno impulsi di tensione avente diverse ampiezze b Treno impulsi di corrente c Tensione durante un impulso si possono apprezzare i tempi di salita e discesa linee rosse verticali 5 3 Algoritmo per il calcolo della resistenza L algoritmo che permette di ottenere 1 valori di resistenza il cuore del software I dati registrati dalla macchina per ECT per uso clinico dopo un trattamento sono 1 valori campionati di Tempo Tensione Corrente Nel capitolo 4 stato esposto il metodo per ricavare un parametro di resistenza da tessuti biologici durante un trattamento elettroporativo Questo metodo utilizzato dall algoritmo di calcolo per estrarr
75. ue uscite del circuito di misura in arancione la tensione ai capi della resistenza di misura mentre in azzurro la tensione ai capi degli elettrodi impiantati nel tessuto La Fig 4 13b la foto del tessuto biologico di cui si vuole ricavare l impedenza 1 Calcolo della corrente di maglia Onda quadra 480 mV 100 Q 4 8 MA 2 Calcolo della resistenza incognita del tessuto biologico 7 68 V 1600 Q 3 Calcolo della capacita incognita del tessuto biologico 2 96 V 97 52 Q 18 nF 4 Verifica dei risultati Onda sinusoidale 1098 Q I risultati ottenuti si possono considerare probabili dato si avvicinano a quelli ottenuti nella prova precedente Inoltre la verifica in sinusoidale ha restituito valori simili confermando 1 calcoli Tek ie Trig d M Pos 0000s CH2 C I Laren alii I l 2 Tensione I OA Inversione CHI 500m CH2 200m M 50 05 CHI 4 15m i 13 0tt 11 18 35 4 37 302kHz i Accopp Limite Banda a 200MHz nl ha Fig 4 13 a Visualizzazione sul DSO delle uscite del circuito di misura b Misurando tessuto disomogeneo 2 3 patata 1 3 agar 4 4 Conclusioni I valori ricavati di resistenza e capacit ottenuti dalle prove svolte in laboratorio si possono considerare accettabili dato che sono simili ai valori presi dalla letteratura e dalle controprove svolte utilizzando come segnale in ingresso un onda sinusoidale Per questo motivo il metodo di calcolo studiato per determ
76. ura_della_cellula_animale svg Le cellule simili sotto l aspetto morfologico e funzionale si associano tra loro a formare 1 diversi tessuti biologici I tessuti biologici possono essere considerati come materiali compositi costituiti da un numero variabile di cellule legate ad una sostanza denominata matrice extracellulare Il numero delle cellule la loro tipologia e le modalit di associazione assieme al rapporti quantitativi tra 1 diversi componenti della matrice extracellulare determinano la struttura e le propriet dei diversi tessuti 16 2 2 Membrana cellulare Le membrane cellulari sono strutture dinamiche e complesse che regolano in modo estremamente selettivo il traffico di molecole tra l esterno e l interno della cellula e viceversa Esse sono al tempo stesso resistenti flessibili ed autosigillanti quest ultima propriet consente alla membrana di autoripararsi qualora in essa si produca un foro ad esempio per via meccanica con un ago Le membrane possono essere considerate essenzialmente come sistemi bidimensionali composti da un doppio strato lipidico di fosfolipidi in cui sono immerse proteine organuli canali ionici e pompe ioniche Fig 2 3 12 Cellula Fluido extracellulare Nucleo Citoplasma Membrana cellulare Carboidrato Glicoproteina Canale proteico Colesterolo Glicolpide Proteina periferica Proteina integrale Filarnent del Proteine integrali
77. ute alla conformazione delle cellule un esempio la loro geometria differenziazione cellulare 11 contenuto d acqua lo stato fisiologico e molto altro E necessario tener conto di questa non isotropia che si riflette sulle propriet elettriche di ogni singolo strato in cui possiamo suddividere il campione di tessuto che si sta analizzando Infatti possiamo rappresentare il sistema tessuto come composto da diversi strati di materiale omogeneo ad ognuno dei quali sar associato un valore di conducibilit o alternativamente resistivita Si ottiene quindi che il tessuto si pu rappresentare come una serie di resistenze una per ciascuno strato Applicando una differenza di potenziale ai capi del sistema ai capi di ogni strato resistenza questa d d p sar proporzionale al suo valore come mostrato in Fig 3 3 In particolare nel tessuto si osserver una maggiore d d p nello strato in cui la resistivita ha il valore maggiore R2 U2 R1 Ul U1_R1 U2 R2 Fig 3 3 Partitore di corrente 3 1 2 Tessuto biologico come condensatore Il sistema tessuto biologico elettrodi che si viene a formare durante 1 trattamenti di ECT pu essere approssimato come un condensatore Essendo composto da diversi strati cellulari con costanti dielettriche 1 2 nsi deve tenere conto della capacit totale Nel caso tessuti sovrapposti Fig 3 4a ovvero in serie 3 3a Nel caso tessuti affiancati Fig 3 4b ovvero in parallelo
78. ventdata handles lt Controllo se sono gia stati caricati file if 1sempty get handles editl string warndlg Nessun file caricato File Error else guidata hObject handles 6 comparazione tra tutti i file caricati CompareData end C CALCOLO RESISTENZA E il cuore del software in esso vengono ricavati 1 valori di resistenza dei file caricati con le relative statistiche infine 1 dati ottenuti vengono salvati su un file xls function Resistenza N global RES global PAR global EP global INFOFILE global PERIODO O pulseN PAR N NPulse 1 numero di impulsi per blocco TotImp max EP N Time PERIODO numero totale degli impulsi inizializzazione struttura RES RES N r zeros l TotImp RES N Dis zeros 1 TotImp 6 inizializzazione delle prime righe delle due tabelle excel exc 1 STATISTICA RESISTENZA DEI SINGOLI IMPULSI exc 3 i 1 R Max R Min R Med Die mm Std j excl l STATISTICA RESISTENZA DEI BLOCCHI DI TPU oF er e Fi tt wp E RE SEE FL excl 3 3 R Max R Min R Mad 71 t2 7S 4 7 76 det 7 2 E mm 6 inizializzazione variabile utilizzata per memorizzare temporaneamente i campioni che verranno acquisiti da un impulso 65 roample zeros PERIODO 1 zero 0 contatore resistenze nulle mink Plock 0 Minima esistenza del blocco impulsi maxR block 0 massima resistenz
79. zurre sono relative all applicazione successiva b Ordine con cui sono state impostate le scariche Le tabelle in Fig 5 14 mostrano il riassunto dei parametri impostati in entrambe le applicazioni ON_1 xIs is ON_2 xls File Edit View Insert Tools Desktop Window Help File Edit Yiew Insert Tools Desktop Window Help PARAMETRI ELETTRODI PARAMETRI ELETTRODI Paziente 00003915 Age 78 Paziente 00003915 Age 76 ProbeTo Distance Amp PulseL Pulsen E vicem ProbeTo Distance Amp PulseL Pulse E icm 3000 O 1000 dij 3 00 1000 3000 1000 1000 3000 1000 1000 3000 1000 1000 3000 1000 1000 3000 1000 3000 1000 Fig5 14 Tabelle che riassumono i dati con cui stato impostato l elettroporatore durante la a prima applicazione b seconda applicazione SI Le finestre in Fig 5 15 mostrano i grafici resistenza distanza relativi alle due applicazioni a EP Graph tensione corrente resistenza i SL aunn ARI Bio a Be ee TIC if ee E ae ee PR RUE Lai IU LR CECE ti amp 4 1 2904 3872 time micro sec 1S a SS ea ES a S 0 2904 3872 time micro sec mamm 24 Numero impulso 5 H g J J ALI e Bim CREE i Le PT AREE TITTET la LTI O D E ogei it Sy aaan 1 999 0 9 O YOOOQoOod 40 Current A n w res 969 1936 2904 time micro sec i TNE Ciocca aaa YOO 6 9 6 6 4 Numero i

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