Guía de Usuario de Microarray de Agilent
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1. No existe ning n inconveniente en mandar m s cantidad de RNA o m s concentrada Si la cantidad de muestra que se puede obtener es problem tica o hay cualquier duda sobre ella o la concentraci n de la misma ponerse en contacto con la Unidad c Todas las muestras deber n estar correctamente identificadas m nimo de 3 caracteres y acorde a la Hoja de solicitud debidamente cumplimentada que debe acompa ar a las muestras Aror d Calidad de las muestras El an lisis de Calidad de las muestras est incluido en el servicio Al llegar las muestras a la Unidad se proceder a la cuantificaci n de stas as como a la determinaci n de su integridad por medio del Bioanalyzer 2100 Se informar al usuario de las muestras que no pasen un m nimo de calidad exigida junto con una explicaci n y recomendaciones para la obtenci n de muestras adecuadas Si no es posible obtener muestras apropiadas y se abandonara el proyecto se facturar este servicio an lisis de calidad ANDALUSIAN CENTER FOR MOLECULAR OLOGY UNIDAD DE GENOMICA cabimer P Gu a de Usuario de Microarray Agilent N e Todas las muestras deber n estar correctamente identificadas m nimo de 3 caracteres y acorde a la Hoja de solicitud debidamente cumplimentada que debe acompa ar a las muestras Aror gt Recomendaciones para el Dise o del experimento Antes de utilizar el Servicio de Gen mica hay algunos requisitos importantes de los que depende la obtenci n de resulta2. ble color es m s sensible y potente y permite detectar peque os cambios de expresi n g nica pero el dise o experimental es m s complicado principalmente referente al tipo de muestra utilizada como muestra de referencia En general se recomienda utilizar una muestra de referencia biol gicamente cercana a la muestra experimental por lo que los RNAs comerciales no son la mejor opci n aunque puede considerarse su utilizaci n en el caso de hibridar tanto las muestras control como las experimentales con el mismo RNA gt Dise o experimental Para el estudio de los perfiles de expresi n de miRNA se necesitan muestras de RNA total de calidad de las distintas condiciones con los siguientes requisitos a Aislamiento del RNA total Es imprescindible que el usuario obtenga un de un RNA TOTAL de alta calidad y pureza El m todo que da mejores resultados es la extracci n con TRIzol Invitrogen cat 15596 026 seg n recomienda Agilent con una o dos extracciones extras con clorformo antes de la precipitaci n con etanol La purificaci n por Kits de extracci n de RNA de Qiagen son igualmente recomendables fiables y productivas recomendando especialmente el miRNeasy Mini kit Qiagen p n 217004 usando el protocolo de extracci n de RNA total b 250 ng RNA resuspendido en Agua libre de RNAsas La cantidad depender del protocolo de marcaje us ndose en el caso de miRNA no menos de 250 ug RNA total a una concentraci n m nima 50 ng pl
3. cabimer gt Guia de Usuario de tleroarray Agen AND REGENE MEDICINE Ni UNIDAD DE GEN MICA CABIMER Gu a de usuario de microarray Agilent Agilent cuenta con Microarrays predise ados de diversos organismos y para diversas aplicaciones Todos presentan sondas sensibles y selectivas de 60 pb 60 mer sintetizados in situ mediante la tecnolog a SurePrint Adem s la plataforma Agilent permite la s ntesis de cualquier tipo de microarray adaptado a las necesidades particulares de cada proyecto de investigaci n Custom Gene Expression Microarrays El usuario puede dise arse su propio microarray a trav s del software gratuito y v a web eMicroarray5 0 y enviar el dise o a trav s de la web a Agilent para su fabricaci n eArray gt Formatos Microarrays de Agilent En esta plataforma se pueden elegir hasta 4 formatos diferentes de slides 1 x 244K 1 array slide en el porta con una densidad de 244 000 sondas 2 x 105K 2 arrays slide id nticos de 105 000 sondas cada uno 4 x 44K 4 arrays slide id nticos con una densidad de 44 000 sondas 8 x 15K 8 arrays slides id nticos con una densidad de 15 000 sondas High resolution for CGH or Good e of resolution and ChIP on chip Running cost Low costand high throughput Lower costand higher throughput for GE and custom CGH CoC on your custom array Agllent Scanner gt El servicio de Microarrays para la Plataforma de Agilent incluye hb Orientaci n e
4. dos fiables y reproducibles dado la gran inversi n de tiempo y dinero en estos experimentos e Cu l es el objetivo de dicho experimento es decir qu respuestas son las que buscamos e Establecer los controles m s apropiados para las muestras a estudiar e Definir n de r plicas por cada condici n experimental para promediar los resultados y que stos sean estad sticamente significativos Como m nimo son necesarias 3 4 En caso de que el usuario solicite un n mero inferior de r plicas la Unidad NO realizar el an lisis estad stico dado que no procede e En el caso de estudios de expresi n para disminuir la variabilidad de cada individuo es recomendable hacer mezclas pooles de las muestras Para cualquier duda puede ponerse en contacto con el Servicio de Gen mica a trav s de las siguientes direcciones de correo electr nico Eloisa Andujar M nica P rez Andr s Aguilera o en el tel fono 954 467 828 gt Env o de muestras Las muestras de RNA DNA una vez purificadas y en las concentraciones indicadas en los apartados anteriores se enviar n congeladas en nieve carb nica en tubos EppendorfO de 1 5 mL en Agua libre de RNAsas junto con una copia original impresa del Formulario de Solicitud cumplimentado correctamente Aror Si por alg n motivo ajeno a la Unidad una vez realizada la solicitud el usuario cancelara la misma el material fungible correspondiente le ser facturado La direcci n a la cual
5. n la planificaci n del dise o experimental a realizar 2 Control de calidad de las muestras con el Bioanalyzer 2100 3 Marcaje de muestras experimentales de RNA para posterior hibridaci n y lavado Reactivos Agilent 4 Escaneado con el esc ner de Axon GenePix 4100A An lisis de imagen y cuantificaci n de datos de fluorescencia con el Software GenePix Pro 6 0 5 An lisis estad stico de resultados por LIMMA Linear Models for Microarray Analysis en Ro GEPAS cabimer Z Oua ae 22 UNIDAD DE GEN MICA ANDALUSIAN CENTER FOR MOLECULAR SIOLOGY AND REGENERATIVE MEDICINE gt Dise o experimental Seg n las necesidades experimentales comentadas por el usuario ser an las siguientes Respecto al tipo de marcaje la plataforma de Agilent permite elegir entre dos tipos i marcaje de dos colores Cy 5 Cy 3 en el que la muestra experimental se marca con un fluorocromo y la muestra de referencia o control se marca con otro y ambas muestras se hibridan en el mismo microarray ii marcaje de un color Cy 3 en el que todas las muestras se marcan con el fluorocromo Cy 3 y se hibridan el experimental y el control en distintos microarrays del mismo portaobjetos Ambas t cnicas presentan ventajas y desventajas en el caso de marcaje de un color el dise o experimental es m s sencillo y es el m todo recomendado en caso de proyectos abiertos ya que es posible incluir nuevas muestras en el proyecto en el futuro La t cnica de marcaje de do
6. ntre el valor de expresi n de un gen en un experimento con el de otro experimento ya sea r plica u otra condici n experimental distinta Tambi n se muestra en esta hoja el s mbolo del gen correspondiente as como la descripci n b Tras los datos normalizados de cada r plica se mostrar n una serie de par metros y algoritmos que corresponden al An lisis Estad stico realizado por LIMMA Linear Model for Microarray Analysis entre los que se incluyen Nivel de cambio de expresi n Grado de confianza etc Esto permitir al usuario establecer cortes significativos para poder seleccionar grupos de genes diferencialmente expresados Esta informaci n se ofrece en un plazo m ximo de 15 d as desde el comienzo del an lisis Para proyectos de m s de 20 muestras consultar con la Unidad gt Tarifas Dado la complejidad de los experimentos marcajes y tipos de arrays as como la presentaci n de los mismos consultar con la Unidad para conocer los precios de cada proyecto
7. pueden ser remitidas es Unidad de Gen mica Centro Andaluz de Biolog a Molecular y Medicina Regenerativa Cabimer Avda Am rico Vespucio s n Parque Tecnol gico Cartuja 93 41 092 SEVILLA Horario de recepci n de muestras 9 00 h a 17 00 h El env o de las muestras debe ser comunicado previamente por tel fono 954 467828 o por e mail eloisa andujar Vcabimer es monica perezOcabimer es Por su parte la Unidad de Gen mica comunicar v a e mail la recepci n de las mismas as como cualquier problema que pueda surgir tras los controles de calidad realizados sobre stas UNIDAD DE GEN MICA ANDALUSIAN CENTER FOR MOLECULAR SIOLOGY AND REGENERATIVE MEDICINE cabimer P Gu a de Usuario de Microarray Agilent N gt Entrega de los Resultados Una vez terminado el experimento y obtenidos los datos de su an lisis GPR los resultados se le enviar n al usuario v a e mail junto con un informe final En el caso de Estudios de expresi n se les enviar los ficheros GPR que contienen toda la informaci n de cada microarray y un documento Excel en el que se incluyen los datos normalizados por el estad stico correspondiente as como an lisis comparativo apropiado Este documento Excel incluye varias Hojas que contienen concretamente la siguiente informaci n a La primera hoja incluye los datos normalizados por RMA Robust Microarray Average que da valores num ricos en log2 pero que permite la comparaci n directa e
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