Vysis® LSI® BCR/ABL Dual Color, Dual Fusion
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1. Lavado del portaobjetos Procedimiento de lavado r pido NOTA En aquellas muestras compuestas por cortes incluidos en parafina sustituya la soluci n de lavado 0 4X SSC 0 3 NP 40 por la 2X SSC 0 3 NP 40 Preparaci n de las soluciones de lavado e Dispense 70 ml de 0 4X SSC 0 3 NP 40 en un frasco de Coplin y col quelo en un ba o termost tico a 73 1 C durante como m nimo 30 minutos antes de su uso Puede utilizar esta soluci n durante un d a transcurrido este tiempo des chela e Dispense 70 ml de 2X SSC 0 1 NP 40 en un frasco de Coplin Utilicese a temperatura ambiente Puede utilizar esta soluci n durante un d a transcurrido este tiempo des chela NOTA Para mantener la temperatura adecuada en la soluci n de lavado 0 4X SSC 0 3 NP 40 lave cuatro portaobjetos simult neamente Si tiene menos de cuatro a ada portaobjetos vac os que est n a temperatura ambiente hasta que tenga un total de 4 Cronometre despu s de haber sumergido el cuarto portaobjetos 1 Retire el cubreobjetos de uno de los portaobjetos y sumerja ste ltimo inmediatamente en 0 4X SSC 0 3 NP 40 Agite los portaobjetos de 1 a 3 segundos Repita el mismo procedimiento con los dem s portaobjetos 2 S quelos transcurridos 2 minutos NOTA Aseg rese de que la temperatura de las soluciones de lavado sea 73 1 C antes del lavado de otra serie de 4 portaobjetos 3 Sumerja los portaobjetos en 2X SSC 0 1 NP 40 Agite los portaobjetos2. Tel fono 49 6122 580 La patente europea 0 430 402 B1 asignada a la Universidad de California y con autorizaci n exclusiva para Abbott Molecular Inc protege la utilizaci n de Vysis LSI Dual Color Rearrangement Probes o Dual Color Break Apart Probes La patente europea EP 0 444 115 B1 asignada a la Universidad de Yale y con autorizaci n exclusiva para Abbott Molecular Inc protege la utilizaci n de sondas LSI de Vysis CEP LSI WCP y Vysis son marcas comerciales registradas de Abbott Molecular Inc SpectrumGreen SpectrumRed SpectrumOrange SpectrumAqua SpectrumBlue SpectrumGold y HYBrite son marcas comerciales de Abbott Molecular Inc ThermoBrite es una marca comercial de Iris Sample Processing Inc Abbott Molecular Inc al Des Plaines IL 60018 USA www abbottmolecular com Maceta Max Planck Ring 2 65205 Wiesbaden Germany 49 6122 580
3. 1 y 3 segundos 3 Ag telo con el V rtex y centrif guelo de nuevo 4 Coloque los tubos en un ba o termost tico a 73 1 C durante 5 minutos 5 Saque el tubo del ba o termost tico 6 Col quelo en un calentador de portaobjetos a una temperatura entre 45 C y 50 C hasta que aplique la sonda al DNA diana NOTA Si los portaobjetos est n listos cuando haya desnaturalizado la sonda puede aplicarla inmediatamente al DNA diana Hibridaci n de la sonda al rea diana NOTA Prepare una c mara h meda colocando en la pared lateral de un recipiente herm tico una toallita de papel humedecida con agua Col quela en un incubador a 37 C 1 Saque los portaobjetos de la soluci n de etanol al 100 2 Seque el portaobjetos colocando el borde inferior en contacto con papel secante y seque la parte inferior con una toallita de papel 3 Coloque los portaobjetos en un calentador para portaobjetos a 45 C 50 C para evaporar el etanol restante 4 Deposite 10 ul de la mezcla de sondas sobre un rea diana y t pela inmediatamente con el cubreobjetos Repita este proceso para las reas adicionales 5 Selle el cubreobjetos con adhesivo de caucho 6 Coloque el portaobjetos en una c mara h meda precalentada e inc belo a 37 C entre 6 y 16 horas Para conseguir que la intensidad de la se al del ensayo sea suficiente la duraci n de la hibridaci n para la mayor a de las sondas LSI debe ser al menos de entre 12 y 16 horas
4. 100 v v con agua purificada Cuando no las utilice almac nelas a temperatura ambiente Des chelas transcurridos 6 meses Soluci n de lavado 0 4X SSC 0 3 NP 40 para el procedimiento de lavado r pido Mezcle bien 20 ml de 20X SSC pH 5 3 con 950 ml de agua purificada A ada 3 ml de NP 40 Mezcle bien hasta que el NP 40 se haya disuelto completamente Mida el pH y aj stelo a 7 0 7 5 con NaOH A ada agua purificada hasta alcanzar un volumen total de 1 litro Almac nese a temperatura ambiente Deseche la soluci n si sta presenta un aspecto turbio o contaminado o como m ximo transcurridos seis meses Almacenamiento de la sonda LSI DNA La sonda LSI se debe almacenar protegida de la luz a una temperatura inferior o igual a 20 C Descomposici n Los fluor foros se blanquean con facilidad por exposici n a la luz Para limitar los efectos de esta descomposici n maneje las soluciones y los portaobjetos que contengan fluor foros en condiciones de luz reducida Lleve a cabo todos los pasos que no requieran luz periodos de incubaci n lavados etc en la oscuridad Observaciones durante el procedimiento Antes de su uso descongele los reactivos a temperatura ambiente y a continuaci n centrifugue cada tubo entre 2 y 3 segundos con una microcentrifuga de sobremesa Recogida y preparaci n de las muestras para el an lisis La m dula sea y las c lulas de sangre perif rica se deben cultivar recoger fijar y colocar en los po
5. Temp a 37 C y el tiempo de hibridaci n Hyb Time entre 4 horas y toda la noche 4 hours overnight 3 Una vez finalizada la hibridaci n lave los portaobjetos mediante el procedimiento de lavado r pido 4 Deje que los portaobjetos se sequen al aire en la oscuridad 5 Aplique 10 pl de tinci n de contraste al rea diana y t pela con un cubreobjetos DAPI Aqua Green Orange Procedimientos de control de calidad Los controles positivos y negativos se deben analizar con muestras de paciente Limitaciones del procedimiento La interpretaci n de los resultados FISH se debe realizar utilizando controles y t cnicas de an lisis adecuadasf as como tener en cuenta otros datos cl nicos y de diagn stico Resultados esperados Los conjuntos de cromosomas o n cleos en metafase que no presenten la fusi n de los genes BCR ABL mostrar n dos se ales naranjas cromosoma 9 normal y dos verdes cromosoma 22 normal Se espera que las translocaciones simples rec procas sin p rdida significativa de DNA en la regi n centrom rica al punto de ruptura del gen ABL o en la regi n telom rica al punto de ruptura del gen BCR den una se al naranja cromosoma 9 normal una verde cromosoma 22 normal y dos se ales naranja verde o amarillo de fusi n una con cada uno de los cromosomas anormales 9 y 22 En los casos de anormalidades m s complejas incluidos aqu llas que conllevan la deleci n de DNA en la regi n centrom rica al punto d
6. de 1 a 3 segundos Saque los portaobjetos transcurridos de 5 segundos a 1 minuto Visualizaci n de la hibridizaci n 1 Deje que los portaobjetos se sequen al aire en la oscuridad 2 Aplique 10 yl de la tinci n de contraste DAPI ll sobre el rea de hibridaci n del portaobjetos y cubra con un cubreobjetos Visualice los portaobjetos utilizando un conjunto de filtros adecuados en un microscopio para fluorescencia que funcione correctamente Los conjuntos de filtros pticos que se describen a continuaci n le permitir n visualizar los fluor foros utilizados en la hibridaci n Si utiliza este filtro de Se produce la excitaci n y emisi n Vysis simult nea de DAPI Orange Fluor foros DAPI y SpectrumOrange DAPI Green Fluor foros DAPI y SpectrumGreen Fluor foros SpectrumAqua Agua Green Orange SpectrumGreen y SpectrumOrange DAPI Orange Green Fluor foros DAPI SpectrumOrange y SpectrumGreen Fluor foros DAPI SpectrumAqua SpectrumGreen y SpectrumOrange Almacenamiento Los portaobjetos que se hayan almacenado a 20 C y protegidos de la luz se pueden analizar al menos hasta transcurridas tres semanas de la hibridaci n Utilizaci n del proceso de codesnaturalizaci n La codesnaturalizaci n es un proceso que simplifica la t cnica de hibridaci n in situ con fluorescencia FISH al combinar en un s lo paso la desnaturalizaci n de la mezcla de sondas y de la muestra Generalmente la codesnaturalizaci n consiste
7. en el frasco de Coplin sea de 73 1 C antes de sumergir el portaobjetos Aumente la temperatura de desnaturalizaci n a 74 C Aumente el tiempo que el portaobjetos est sumergido en la soluci n de desnaturalizaci n entre 2 y 4 minutos El portaobjetos de la muestra no se ha preparado correctamente para FISH Contacte con el Centro de Asistencia T cnica de Abbott si desea m s informaci n sobre la preparaci n de las muestras para FISH Los portaobjetos de la muestra no se han dejado reposar adecuadamente despu s de dispensar la muestra D jelos durante 24 horas a temperatura ambiente antes de realizar la t cnica FISH Los portaobjetos de la muestra no est n completamente secos antes de su inmersi n en la soluci n de desnaturalizaci n Caliente los portaobjetos con las muestras a una temperatura entre 45 C y 50 C antes de desnaturalizarlos o deshidr telos aclar ndolos en series de un minuto con una soluci n de etanol al 70 85 y 100 Problema Causa probable Soluci n posible Problema Causa probable Soluci n posible La muestra ten a La utilizaci n de muestras La sonda Aplique la sonda bandas GTG con bandeo tripsina desnaturalizada inmediatamente despu s Giemsa para FISH puede no se aplic de haber retirado los requerir ajustes en los inmediatamente a la portaobjetos de la protocolos de hibridaci n muestra soluci n de etanol al o de b
8. otros tipos de leucemias La consecuencia de la t 9 22 LSI ASS ABL es la formaci n de un gen quim rico BCR ABL regi n BCR breakpoint cluster region oncog n v rico 1 de la leucemia murina de Abelson en el cromosoma 22 derivado cromosoma Ph Este gen quim rico produce una enzima tirosina cinasa que es esencialmente activa comparada con la cinasa de ABL normal que est estrictamente regulada La fusi n de los genes BCR ABL ocurre sin que se detecte por cinogen tica un cromosoma Ph debido a reordenaciones m s complejas en un 5 a un 10 de los pacientes con LMC 3 Descripci n de la sonda La sonda SpectrumOrange ABL de aproximadamente 650 kb se extiende desde un punto centrom rico al gen de la arginosuccinato sintasa ASS a un punto telom rico al gen ABL localizado en el cromosoma 9 La sonda SpectrumGreen BCR se extiende a lo largo de una distancia gen mica de aproximadamente 1 5 mb que comienza dentro de los segmentos variables del locus IGL del cromosoma 22 y termina a aproximadamente 900 kb de la regi n telom rica del gen BCR En esta sonda no existe una regi n telom rica al gen BCR de aproximadamente 300 kb Ambas sondas BCR y ABL abarcan los puntos de ruptura cromos micos t picos de la translocaci n t 9 22 para sus genes respectivos gen ABL gen ASS 65 kb 7225 kb a F Ex n 1b m Ex n la m Ex n 2 Regi n centrom rica Regi n 22q11 2 Regi n telom rica Segmentos IGLV Rea
9. que la tinci n de contraste no se utilice transcurrida la fecha de caducidad BIBLIOGRAF A 1 Bloomfield CD Goldman Al Alimena G et al Chromosomal abnormalities identify high risk and low risk patients with acute lymphoblastic leukemia Blood 1986 67 415 20 2 Lugo TG Pendergast AM Muller AJ et al Tyrosine kinase activity and transformation potency of bcr abl Oncogene Products Science 1990 247 1079 82 3 Chase A Huntley BJ Cross NC Cytogenetics of chronic myeloid leukemia Best Prac Res Clin Haematol 2001 14 3 553 71 4 Dewald GW Interphase FISH studies of Chronic Myeloid Leukemia In Fan YS ed Methods in Molecular Biology Vol 204 Molecular Cytogenetics Protocols and Applications Totowa NJ Humana Press Inc 2002 311 42 5 Primo D Tabernero MD Rasillo A et al Patterns of BCR ABL gene rearrangements by interphase fluorescence in situ hybridization FISH in BCR ABL leukemias incidence and underlying genetic abnormalities Leukemia 2003 17 1124 29 6 Wiktor AE Van Dyke DL Stupca PJ et al Preclinical validation of fluorescence in situ hybridization assays for clinical practice Genet Med 2006 8 16 23 Asistencia t cnica Si requiere asistencia t cnica p ngase en contacto con el Centro de Asistencia T cnica de Abbott o consulte la p gina web de Abbott Molecular en http llwww abbottmolecular com Direcci n del representante autorizado ABBOTT Max Planck Ring 2 65205 Wiesbaden Alemania
10. tenga un volumen de 3 pul 2 Centrifugue el tubo entre 1 y 3 segundos 3 Ag telo con el V rtex y centrif guelo de nuevo 4 Deposite 10 ul de la mezcla de sondas sobre el portaobjetos y t pelo inmediatamente con el cubreobjetos 5 Selle el cubreobjetos con adhesivo de caucho Elecci n de los par metros del sistema de desnaturalizaci n hibridaci n Las instrucciones que se describen a continuaci n son espec ficas del HYBrite Denaturation Hybridization System Si desea m s informaci n sobre la utilizaci n de este instrumento consulte la Gu a del usuario del sistema HYBrite Tambi n es posible la utilizaci n del sistema ThermoBrite Denaturation Hybridization System ya que sus caracter sticas t rmicas son comparables a las del sistema HYBrite Cuando utilice el sistema ThermoBrite el control m s ajustado 1 C har necesario el ajuste de las condiciones de desnaturalizaci n e hibridaci n Si desea informaci n m s detallada consulte el apartado Consejos diagn stico y soluci n de problemas de este prospecto 1 Para las muestras de linfocitos y de m dula sea cultivadas ajuste la temperatura de desnaturalizaci n Melt Temp a 73 C y el tiempo de desnaturalizaci n Melt Time a 1 minuto Para las muestras incluidas en parafina ajuste la temperatura de desnaturalizaci n Melt Temp a 73 C y el tiempo de desnaturalizaci n Melt Time a 5 minutos 2 Fije la temperatura de hibridaci n Hyb
11. SI proceda de acuerdo con el m todo general LSI para determinar el protocolo de calidad del reactivo Preparaci n de la muestra NOTA Deje que los frascos de Coplin que contienen la soluci n desnaturalizante alcancen la temperatura ambiente Antes de su uso coloque los frascos en un ba o termost tico a 73 1 C durante aproximadamente 30 minutos para que alcancen la temperatura adecuada 1 Aseg rese de que la temperatura de la soluci n desnaturalizante sea de 73 1 C 2 Sumerja los portaobjetos en la soluci n desnaturalizante durante 5 minutos NOTA No introduzca simult neamente m s de cuatro portaobjetos por cada frasco de Coplin 3 Deshidrate los portaobjetos durante 1 minuto en etanol al 70 a continuaci n 1 minuto en etanol al 85 y por ltimo 1 minuto en etanol al 100 NOTA Mantenga los portaobjetos sumergidos en la soluci n de etanol al 100 hasta que pueda secar todos los portaobjetos y aplicar la mezcla de sondas Preparaci n de la mezcla de sondas 1 Por cada rea diana a ada en un tubo de microcentr fuga los siguientes componentes a temperatura ambiente 7 ul de tamp n de hibridaci n LSI WCP 1 ul de sonda 2 ul de agua purificada NOTA Si desea hibridar un m ximo de 3 sondas simult neamente cada una marcada de un fluor foro diferente a ada un microlitro de cada sonda A ada agua purificada hasta conseguir que la mezcla tenga un volumen de tres microlitros 2 Centrifugue el tubo entre
12. Vysis LSI BCR ABL ES Dual Color Dual Fusion Translocation Probe Set Es 20 Ensayos BCR ABL Dual Color Dual Fusion Translocation REF 08L 10 001 B8L103 56 7361 R1 Clave de los s mbolos utilizados REF N mero de referencia LOT N mero de lote IVD Para uso en diagn stico Fecha de caducidad in vitro 0 Almac nese a una Consulte las instrucciones E Abbott temperatura inferior o igual de uso a 20 C i EC REP Representante autorizado wal Fabricante legal 2006 Abbott Printed in Germany Vysis LSI BCR ABL Dual Color Dual Fusion Translocation Probe Set Agosto 2006 Finalidad de uso Esta sonda para la hibridaci n in situ con fluorescencia FISH se utiliza para la detecci n de la translocaci n cromos mica t 9 22 q34 q11 2 y las variantes complejas u ocultas de la translocaci n t 9 22 que resultan en la fusi n de los genes BCR ABL Se puede utilizar con cromosomas Regi n centrom rica Regi n 9q34 Regi n telom rica en metafase o n cleos en interfase Resumen y explicaci n del ensayo El cromosoma Filadelfia Ph que es el resultado de la translocaci n rec proca t 9 22 q34 q11 2 es la caracter stica distintiva de casi todos los casos de leucemia mieloide cr nica LMC Tambi n se ha observado en algunos casos de leucemia linfobl stica aguda en adultos y en ni os en los que se ha asociado con un pron stico malo El cromosoma Ph no 650 kb suele aparecer en
13. al difusa moteada Repita la hibridaci n realizando una de las acciones siguientes e Reduzca 2 C la temperatura de desnaturalizaci n e Reduzca el tiempo de desnaturalizaci n NOTA Vaya reduciendo la temperatura o el tiempo de desnaturalizaci n hasta que la intensidad de la se al sea aceptable e Lave utilizando 0 4X SSC 0 3 NP 40 entre 73 C y 76 C Problema Soluci n posible La morfolog a de la Repita el ensayo con una muestra nueva metafase es de realizando una de las acciones siguientes poca calidad e Reduzca 2 C la temperatura de desnaturalizaci n e Reduzca el tiempo de desnaturalizaci n NOTA Vaya reduciendo la temperatura o el tiempo de desnaturalizaci n hasta que la intensidad de la se al sea aceptable e Pretrate los portaobjetos 1 Prepare una soluci n de 2X SSC paraformaldeh do al 1 2 Sumerja el portaobjetos en 2X SSC paraformaldehido al 1 durante 1 minuto 3 Sumerja varias veces los portaobjetos en agua purificada 4 Deshidr telos aclar ndolos en series de un minuto con una soluci n de etanol al 70 85 y 100 5 Deje secar los portaobjetos al aire y contin e con la preparaci n del portaobjetos para la codesnaturalizaci n e Si persiste la morfolog a de poca calidad modifique la utilizaci n del instrumento HYBrite 1 Prepare 280 ul de formamida al 70 soluci n de desnaturalizaci n 2X SSC 196 ul de formamida 28 ul de 2X SSC 56 ul de agua purificada 2 Ejec
14. andeo Si desea 100 Aseg rese de que m s informaci n sobre la soluci n de etanol se el bandeo p ngase en ha evaporado antes de contacto con el Centro aplicar la sonda de Asistencia T cnica de Saque el tubo que Abbott contiene la mezcla O utilice un portaobjetos de sondas del ba o con muestras reci n termost tico a 73 1 C y preparados col quelo inmediatamente No se ha a adido la Prepare una nueva mezcla en el calentador para sonda de sondas Deje que la portaobjetos a una sonda se descongele temperatura entre 45 C y completamente Mezcle 50 C Mantenga el tubo con un agitador tipo V rtex en el calentador para o pipetee los reactivos portaobjetos mientras que quiera mezclar y pipetea la sonda en el centrifugue brevemente portaobjetos Pipetee la sonda Procese s lamente tantos lentamente portaobjetos como pueda La sonda el tamp n Mezcle con un agitador y aseg rese de mantener de hibridaci n o la tipo V rtex o pipetee la temperatura y la mezcla de sondas no los reactivos que quiera duraci n descritas en el se mezclaron bien mezclar y centrifugue proceso del ensayo antes de su uso brevemente Se al d bil o La mezcla de Tape el rea diana Las sondas no Utilice los vol menes inexistente sondas se ha secado con el cubreobjetos se han diluido correctamente para la hibridaci n indicados en el procedimiento del ensayo para mantener el cociente de la mezcla de sondas 7 ul de tamp n de hibridaci n 1 ul d
15. con adhesivo de caucho Aumente el tiempo de hibridaci n Problema Causa probable Soluci n posible Problema Causa probable Soluci n posible Las condiciones o Aseg rese de que las Se al poco Las sondas no Aseg rese de que la las soluciones soluciones de lavado espec fica se han diluido mezcla de sondas se haya de lavado no son correctas se hayan preparado de acuerdo con lo descrito en el prospecto Aseg rese de que la temperatura de las soluciones de lavado correspondan a las descritas en el procedimiento de lavado Aseg rese de que los term metros y los pehach metros se hayan calibrado correctamente Retire los cubreobjetos antes de sumergir los portaobjetos en la soluci n de lavado Las sondas o los portaobjetos de las muestras se han almacenado incorrectamente Almacene la sonda sin diluir a una temperatura igual o inferior a 20 C y protegida de la luz Almacene los portaobjetos sin hibridar con desecante a una temperatura inferior o igual a 20 C para un per odo prolongado de tiempo o a temperatura ambiente para per odos cortos Almacene los portaobjetos hibridados protegidos de la luz a una temperatura inferior o igual a 20 C hasta un m ximo de 3 semanas Se ha utilizado una tinci n de contraste equivocada La tinci n de contraste es excesivamente brillante correctamente A menudo es posible que haya excesiva cantidad de sonda preparado de acuerd
16. ctivos 1 Vysis LSI BCR ABL Dual Color Dual Fusion Translocation Probe Set conjunto de sondas de translocaci n bicolor de doble fusi n Vysis LSI BCR ABL N mero de referencia 30 191032 1 frasco 20 pl 675 ng pl Sonda de DNA marcada con fluor foro y DNA bloqueante en tamp n Tris EDTA 2 Vysis LSI WCP Hybridization Buffer tamp n de hibridaci n Vysis LSI WCP9 N mero de referencia 30 804826 1 frasco 150 ul Sulfato de dextrano formamida SSC pH 7 0 Existen fichas de datos de seguridad de todos los reactivos suministrados con estos equipos disponibles en el Servicio de Asistencia T cnica de Abbott Cient fica Almacenamiento 20 C El conjunto de sondas Vysis LSI BCR ABL y el tamp n de hibridaci n Vysis LSI WCP se deben almacenar a una temperatura inferior o igual a 20 C y protegidos de la luz Advertencias y precauciones Para uso exclusivo en diagn stico in vitro El tamp n de hibridaci n Vysis LSI WCP ha sido clasificado seg n las directivas de la Comunidad Europea CE como T xico T e Irritante Xi A continuaci n se indican las frases relativas a los riesgos R y medidas de seguridad S T Xi y R41 Riesgo de lesiones oculares graves R61 Riesgo durante el embarazo de efectos adversos para el feto S45 En caso de accidente o malestar acuda inmediatamente al m dico si es posible mu strele la etiqueta S53 Ev tese la exposici n rec bense instrucciones
17. e ruptura del gen ABL o telom rica al punto de ruptura del gen BCR se pueden observar otros patrones de la se al 45 Los an lisis de FISH en metafase pueden ser de gran ayuda en la interpretaci n de los resultados especialmente en los casos de patrones de FISH en interfase at picos 5 La interpretaci n de los resultados FISH se debe realizar utilizando controles y t cnicas de an lisis adecuadas 8 as como tener en cuenta otros datos cl nicos y de diagn stico Soluci n de problemas de los resultados obtenidos en un ensayo de codesnaturalizaci n La morfolog a de los cromosomas durante la hibridaci n con codesnaturalizaci n puede diferir de las muestras que se desnaturalizan y deshidratan antes de aplicar la sonda Problema Soluci n posible Hibridaci n Repita el ensayo con una muestra nueva cruzada realizando una de las acciones siguientes e Aumente 2 C la temperatura de la soluci n de lavado 0 4X SSC 0 3 NP 40 Vaya aumentando la temperatura hasta que la intensidad de la se al sea aceptable e Reduzca 2 C la temperatura de desnaturalizaci n El aspecto de la sonda es turbio Repita el ensayo con una muestra nueva realizando una de las acciones siguientes e Aumente el tiempo de hibridaci n e Aumente la temperatura de desnaturalizaci n Vaya aumentando la temperatura hasta que la morfolog a sea aceptable e Lave el portaobjetos utilizando 0 4X SSC 0 3 NP 40 a una temperatura entre 70 C y 73 C Se
18. e sonda 2 ul de agua purificada Aseg rese de que la pipeta est calibrada Deje que el tamp n de hibridaci n se descongele completamente y alcance la temperatura ambiente antes de utilizarlo A continuaci n pipet elo lentamente La sonda no se ha desnaturalizado correctamente NOTA No afecta a las sondas que se suministran en tamp n de hibridaci n y est n desnaturalizadas Aseg rese de que la temperatura del ba o termost tico utilizado para desnaturalizar la mezcla de sondas sea 73 1 C Desnaturalice la mezcla de sondas durante 5 minutos excesivamente en el portaobjetos de la muestra inmediatamente despu s de aplicar la mezcla de sondas Cuando lave la hibridaci n retire el cubreobjetos de un portaobjetos y sumerja el portaobjetos en la soluci n de lavado antes de retirar el cubreobjetos del siguiente portaobjetos Durante la hibridaci n se han formado burbujas debajo del cubreobjetos Deposite el cubreobjetos tocando primero la superficie de la mezcla de sondas Coloque cuidadosamente el portaobjetos con el cubreobjetos hacia abajo sobre papel secante y elimine cuidadosamente las burbujas aplicando una ligera presi n Condiciones de hibridaci n inadecuadas Aseg rese de que se cumplan el tiempo y la duraci n establecidos para la hibridaci n Aseg rese de que la temperatura del incubador sea de 37 C Selle bien y completamente el cubreobjetos
19. en colocar los portaobjetos de las muestras con las sondas y los cubreobjetos sobre una placa caliente o en el estante de una estufa o de un incubador que est a la temperatura de desnaturalizaci n Transcurridos entre 2 y 10 minutos los portaobjetos se retiran de la superficie caliente y se colocan en un incubador a la temperatura de hibridaci n Las condiciones documentadas para la codesnaturalizaci n especifican un amplio intervalo de temperaturas y duraci n que hacen necesaria la optimaci n de las condiciones de las aplicaciones y de los tipos de muestras espec ficos Los par metros aqu descritos son para su uso con el Vysis HYBrite Denaturization Hybridization System sistema de desnaturalizaci n hibridaci n En funci n de la muestra ser n necesarios procesos adicionales de optimaci n El aspecto de una hibridaci n que utiliza la codesnaturalizaci n puede variar con respecto a una hibridaci n en la que la muestra diana se desnaturaliza y se deshidrata antes de aplicar la sonda Preparaci n de un portaobjetos para la codesnaturalizaci n 1 Por cada rea diana a ada en un tubo de microcentr fuga los siguientes componentes a temperatura ambiente 7 ul de tamp n de hibridaci n LSI WCP 1 ul de sonda 2 ul de agua purificada NOTA Si desea hibridar un m ximo de 3 sondas simult neamente cada una provista de un fluor foro diferente a ada 1 ul de cada sonda A ada agua purificada hasta conseguir que la mezcla
20. especiales antes del uso Preparaci n de los reactivos NOTA Mida a temperatura ambiente el pH de las soluciones que as lo indiquen Si no se indica lo contrario utilice un pehach metro con un electrodo de vidrio Soluci n de lavado 20X SSC Mezcle bien 132 g de 20X SSC en 400 ml de agua purificada Mida el pH y aj stelo a 5 3 con HCI A ada agua purificada hasta alcanzar un volumen total de 500 ml Almac nese a temperatura ambiente Deseche la soluci n si sta presenta un aspecto turbio o contaminado o como m ximo transcurridos seis meses Soluci n de lavado 2X SSC 0 1 NP 40 Mezcle bien 100 ml de 20X SSC pH 5 3 con 850 ml de agua purificada A ada 1 ml de NP 40 Mezcle bien hasta que el NP 40 se haya disuelto completamente Mida el pH y aj stelo a 7 0 0 2 con NaOH A ada agua purificada hasta alcanzar un volumen total de 1 litro Almac nese a temperatura ambiente Deseche la soluci n si sta presenta un aspecto turbio o contaminado o como m ximo transcurridos seis meses Soluci n desnaturalizante formamida al 70 2X SSC Mezcle bien 49 ml de formamida 7 ml de 20X SSC pH 5 3 y 14 ml de agua purificada en un frasco de Coplin de vidrio Verifique que el pH se encuentra entre 7 0 y 8 0 utilizando tiras reactivas Cuando no la utilice almac nela en un recipiente cerrado entre 2 C y 8 C Des chela despu s de transcurridos 7 d as Soluciones de etanol 70 85 100 Prepare diluciones de etanol al
21. l preparaci n las muestras a los prospecto portaobjetos Aseg rese de que el pH Reduzca la temperatura y la temperatura de las del calentador para soluciones de lavado sean portaobjetos durante la correctos preparaci n de la muestra Retire los cubreobjetos Aumente el tiempo de Repita el procedimiento de secado a temperatura lavado ambiente a una noche Fondo del Las soluciones Aseg rese de que las como m nimo y a portaobjetos de lavado se han soluciones de lavado que continuaci n deje los portaobjetos como m nimo 24 horas a temperatura ambiente No caliente los portaobjetos a altas temperaturas La muestra est sobre desnaturalizada Aseg rese de que la soluci n de desnaturalizaci n se prepar de acuerdo con lo descrito en el prospecto Aseg rese de que la temperatura de la soluci n de desnaturalizaci n sea de 73 1 C antes de demasiado intenso utilizado durante demasiado tiempo o se han almacenado incorrectamente contengan formamida se almacenen a 4 C Des chelas transcurridos 7 d as o despu s de un uso muy frecuente Deseche todas las otras soluciones de lavado transcurrido 1 d a Aseg rese de que el pH de las soluciones de lavado de formamida sea pH 7 0 8 0 La hibridaci n se ha observado con filtros de paso de banda ancha Cambie a filtros con ancho de banda estrecha o multibanda para reducir la luz de fondo sumergir el portaobjetos Reduzca la tem
22. nto las se ales luminosas pueden parecer m s d biles Utilice el filtro correcto para visualizar el fluor foro de la sonda Si desea m s informaci n p ngase en contacto con el Centro de Asistencia T cnica de Abbott La configuraci n o los objetivos del microscopio no son adecuados para visualizar los resultados FISH o los filtros del microscopio est n da ados P ngase en contacto con el fabricante del microscopio La tinci n aparece d bil los portaobjetos con las muestras no se han deshidratado antes de aplicarles la tinci n o hay gotas de aceite en la tinci n Retire los cubreobjetos Sumerja los portaobjetos durante 5 minutos en 2X SSC 0 1 NP 40 a temperatura ambiente y deshidr telos aclar ndolos en series de un minuto con una soluci n de etanol al 70 85 y 100 D jelos secar al aire y vuelva a aplicar la tinci n de contraste Concentraci n incorrecta de tinci n de contraste NOTA La concentraci n de la tinci n de contraste DAPI es 8 veces superior a la de la tinci n de contraste DAPI II Si la tinci n es excesivamente brillante dil yala con Antifade Solution n mero de referencia 06J29 010 antes de aplicarla La tinci n de contraste ha caducado o ha estado expuesta a la luz durante per odos prolongados de tiempo Almacene la tinci n protegida de la luz a una temperatura inferior o igual a 20 C durante el uso Aseg rese de
23. o con lo descrito en el prospecto en el ensayo Condiciones Aseg rese de que la de hibridaci n temperatura del incubador inadecuadas sea de 37 C Aseg rese de que se haya a adido la cantidad correcta de tamp n de hibridaci n a la mezcla de la sonda Temperatura de lavado demasiado baja Mantenga la temperatura de lavado de las soluciones de lavado colocando un m ximo de cuatro portaobjetos en un frasco de Coplin cada vez y comprobando que la temperatura sea correcta antes de lavar otra serie de portaobjetos Las condiciones restrictivas astringencia de la soluci n de lavado son demasiado d biles Aseg rese de que las soluciones de lavado se prepararon de acuerdo con lo descrito en el prospecto NOTA Cuanto menor sea la concentraci n de sales SSC y mayor la concentraci n de formamida y NP 40 mayor ser la condici n restrictiva astringencia del lavado Retire los cubreobjetos Sumerja los portaobjetos durante 5 minutos en 2X SSC 0 1 NP 40 a temperatura ambiente y deshidr telos aclar ndolos en series de un minuto con una soluci n de etanol al 70 85 y 100 D jelos secar al aire y vuelva a aplicar la tinci n de contraste Tinci n de contraste brillante o d bil La hibridaci n se ha observado con un conjunto de filtros inapropiado Los conjuntos de filtros multibanda proporcionan menos luz que los filtros de paso de banda simple y por ta
24. peratura de desnaturalizaci n a 72 C Reduzca el tiempo que el portaobjetos est sumergido en la soluci n de desnaturalizaci n entre 1 y 3 minutos Se al d bil o inexistente Los portaobjetos de la muestra no est n completamente secos antes de su inmersi n en la soluci n de desnaturalizaci n Caliente los portaobjetos con las muestras a una temperatura entre 45 C y 50 C antes de desnaturalizarlos o deshidr telos aclar ndolos en series de un minuto con una soluci n de etanol al 70 85 y 100 Los portaobjetos estaban reci n preparados antes de la desnaturalizaci n Deje los portaobjetos como m nimo durante 24 horas a temperatura ambiente Fondo del portaobjetos demasiado intenso Los portaobjetos de vidrio est n sucios antes de la preparaci n de la muestra Sum rjalos en etanol y s quelos utilizando papel sin pelusas antes dispensarlos Residuo celular en la preparaci n de la muestra Lave 3 veces el sedimento con fijador reci n preparado y repita el procesamiento de dispensaci n de muestra sobre el portaobjetos Las extensiones de metafase est n envejecidas por calentamiento o contienen citoplasma Aumente el tiempo que el portaobjetos est sumergido en la soluci n de desnaturalizaci n a 10 minutos El portaobjetos de la muestra no se ha desnaturalizado adecuadamente Aseg rese de que la temperatura de desnaturalizaci n
25. rtaobjetos para microscopio seg n los procedimientos habituales de citogen tica Procedimiento Materiales necesarios e Vysis LSI BCR ABL Dual Color Dual Fusion Translocation Probe Set e Vysis LSI WCP Hybridization Buffer Materiales necesarios pero no suministrados HCI 12N para el ajuste del pH de las soluciones de lavado NaOH 1N para el ajuste del pH de las soluciones de lavado Frascos de Coplin de vidrio Term metro calibrado Pinzas Probeta graduada de 1 000 ml Agitador magn tico Etanol Microcentrifuga Puntas de pipeta 1 a 10 pl Micropipetas 1 a 10 yl Pehach metro Portaobjetos de vidrio para microscopio limpios Agua purificada Cron metro Mezclador V rtex Ba o termost tico 37 C y 72 C Microscopio de fluorescencia Incubador a 37 C 20X SSC NP 40 Formamida ultra pura Tinci n de contraste DAPI II Calentador para portaobjetos Prepare tres frascos de Coplin A ada 70 ml de etanol al 100 en un frasco 70 ml de etanol al 85 en el segundo y 70 ml de etanol al 70 en el tercero Utilicese a temperatura ambiente Des chelos transcurridos 7 d as o si muestran diluci n excesiva o evaporaci n Para asegurar buenos resultados verifique que los reactivos se preparen y se usen a las temperaturas descritas en este prospecto Mida las temperaturas de las soluciones dentro de los frascos de Coplin con un term metro calibrado Cuando realice una hibridaci n que combine las sondas CEP y L
26. ute un programa a una temperatura de mantenimiento HYBrite Hold Temp de 73 C 3 A ada 10 ul de formamida al 70 soluci n de desnaturalizaci n 2X SSC en cada rea diana y t pela con el cubreobjetos 4 Cuando el HYBrite alcance 73 C coloque los portaobjetos sobre la superficie de calentamiento Cierre la cubierta 5 Retire los portaobjetos transcurridos 3 minutos 6 Retire los cubreobjetos 7 Contin e con el paso de deshidrataci n descrito en el apartado Preparaci n de la muestra para el procedimiento del ensayo no sometido a codesnaturalizaci n Consejos diagn stico y soluci n de problemas Cuando vaya a visualizar los resultados de un ensayo FISH aseg rese de que el microscopio est adecuadamente alineado y funcionando correctamente En la siguiente tabla se enumeran aquellos resultados que se desv an de lo que se considera un resultado ptimo al utilizar las sondas LSI Asimismo se incluyen las posibles causas y las sugerencias para mejorar el rendimiento del ensayo Problema Causa probable Soluci n posible Problema Causa probable Soluci n posible Morfolog a del Los portaobjetos de Aumente la temperatura El portaobjetos Aseg rese de que las cromosoma la muestra se han del ba o termost tico no se ha lavado soluciones de lavado se distorsionada secado demasiado aumenta la humedad correctamente tras la prepararon de acuerdo r pido durante la cuando dispense hibridaci n con lo descrito en e
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