Detección de Salmonella spp. en muestras de producción primaria
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1. Cap tulo 2 PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit Salmonella spp Preparaci n de muestras automatizada mediante PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit c A ada 800 uL de Binding Premix Solution a cada pocillo de Lysis muestra Plate d Cargue la placa en el instrumento cuando se lo indique el MagMAX Express 96 Magnetic Particle Processor Preparar las placas 1 Prepare las placas de procesamiento como se describe en la tabla siguiente A ada de procesamiento reactivos a las placas como se describe en Acci n de MagMAX Express 96 f Tipo de placa Placa MagMAX Acci n Express 96 Tip Plate Standard Coloque un Deep Well Tip Comb de 96 pocillos en una MagMAX Express 96 standard plate Elution Plate Standard A ada 120 uL de Elution Buffer por pocillo Nota Para incluir el control Elution Buffer a ada 120 uL de Elution Buffer a un pocillo vac o adicional de la Elution Plate Wash Plate Deep well A ada 300 uL de Wash Buffer Cat no 4388476 Wash Plate II Deep well A ada 300 uL de Wash Buffer Lysis Sample Plate Deep well A ada 100 uL de muestra de l quido BPW previamente enriquecido del paso 4 del lado filtrado de la s bolsa s de cultivo de muestra enriquecida a la Lysis Sample Plate que contiene 800 uL de Binding Premix Procesar las 1 Seleccione el programa 4428176DWPrepSEOFA en el MagMAX Express 96 muestras en el Magnetic Particle Processor P2. Detecci n de Salmonella spp en muestras de producci n primaria por PCR en Tiempo Real 37 Evitar la contaminaci n y la amplificaci n no espec fica B Ap ndice B Buenas Practicas de PCR e Empiece por las muestras desconocidas y coloque controles al final de la fila o columna e Coloque controles positivos en una de las filas o columnas exteriores si es posible e Tenga en cuenta que los tapones est n dispuestos en tiras de 8 o 12 38 Detecci n de Salmonella spp en muestras de producci n primaria por PCR en Tiempo Real Seguridad ADVERTENCIA SEGURIDAD GENERAL Si este producto se utiliza de alguna forma que no se especifica en la documentaci n del usuario se pueden producir lesiones personales o da os en el instrumento o el dispositivo Aseg rese de que todo aquel que utilice este producto haya recibido instrucciones sobre las pr cticas de seguridad generales para los laboratorios y la informaci n de seguridad facilitada en este documento Antes de utilizar un instrumento o dispositivo lea y comprenda la informaci n de seguridad facilitada en la documentaci n de usuario suministrada por el fabricante del instrumento o dispositivo Antes de manipular productos qu micos lea y comprenda las Hojas de Datos sobre Seguridad y use el equipo de protecci n personal apropiado guantes batas protecci n ocular etc Para obtener las Hojas de Datos sobre Seguridad consulte la secci n Documentaci n y asist
3. gica 42 Detecci n de Salmonella spp en muestras de producci n primaria por PCR en Tiempo Real Documentaci n y asistencia Obtener Hojas de Datos sobre Seguridad Las Hojas de Datos sobre Seguridad est n disponibles en www lifetechnologies com support Nota Para obtener las Hojas de Datos sobre Seguridad de productos qu micos que no distribuye Life Technologies p ngase en contacto con el fabricante del producto qu mico Obtener certificados de an lisis El certificado de an lisis proporciona informaci n detallada sobre el control de calidad y la calificaci n de cada producto Puede accederse a los certificados de an lisis en nuestro sitio web Vaya a www lifetechnologies com support y busque el certificado de an lisis por n mero de lote del producto que aparece impreso en la caja Obtener asistencia Para acceder a los servicios m s recientes y obtener informaci n sobre asistencia para todos los lugares vaya a www lifetechnologies com support o www lifetechnologies com foodsafety En el sitio web puede e Obtener n meros de tel fono y de fax de todo el mundo para contactar con los departamentos de asistencia t cnica y de ventas e Buscar en las preguntas m s frecuentes FAQ e Enviar una pregunta directamente al departamento de asistencia t cnica e Buscar documentos para el usuario Hojas de Datos sobre Seguridad secuencias y mapas vectoriales notas de la aplicaci n formulaciones manuales certi
4. n de Salmonella spp en muestras de producci n primaria por PCR en Tiempo Real Introducci n PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit Salmonella spp El PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit proporciona un m todo sencillo para preparar ADN a partir de muestras ambientales en la etapa de producci n primaria Este kit se ha validado para su uso con muestras ambientales en la etapa de producci n primaria El procedimiento implica lo siguiente e Enriquecimiento de Salmonella spp enriquecimiento primario en caldo de tetrationato caldo TT seguido de diluci n y enriquecimiento secundario en agua de peptona tamponada BPW Buffered Peptone Water e Extracci n automatizada de las muestras mediante el MagMAX Express 96 Magnetic Particle Processor Se admiten las muestras iniciales recomendadas e Fundas para calzado y esponjas de 100 a 150 mL de caldo TT e Hisopos 10 mL de caldo TT e Otras muestras ambientales como heces caldo TT con una proporci n 1 10 por ejemplo 25 g de muestra con 225 mL de caldo TT Contenido del kit PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit Cat nos 4480466 100 reacciones 4428176 300 reacciones Art culo Cantidad o volumen Almacenamiento Lysis Buffer 2 botellas 50 mL botella Temperatura controlada 23 5 C Magnetic Particles 2 tubos 1 5 mL tubo 5 3 C Binding Solution isopropanol 1 botella vacia Temperatura controlada 23 5 C Wash
5. K Lysis Buffer con el sedimento bacteriano resuspendido a un tubo limpio de 1 5 mL El sedimento debe quedar bien disperso en el Lysis Buffer antes de llevar a cabo la transferencia IMPORTANTE La mezcla de Proteinase K Lysis Buffer se tiene que transferir a un tubo limpio Durante la transferencia quedar grasa residual en los laterales del tubo original Evite el contacto con la grasa y transfiera solo la mezcla de Proteinase K Lysis Buffer que contiene el sedimento resuspendido a un tubo limpio Tape el tubo y a continuaci n inc belo a 56 1 C durante 30 minutos aproximadamente para activar la Proteinase K Detecci n de Salmonella spp en muestras de producci n primaria por PCR en Tiempo Real Cap tulo 3 PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit Extra Clean with Proteinase K Salmonella spp 3 Preparaci n de muestras mediante PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit Extra Clean with Proteinase K 11 12 13 14 15 16 Inc belo a 97 2 C durante 10 minutos aproximadamente Deje que se enfr e la muestra durante 2 minutos aproximadamente a temperatura controlada Microcentrifugue el tubo durante 1 minuto a 12000 16000 x g para reducir la condensaci n despu s del paso de calentamiento a 97 2 C A ada 250 uL de Nuclease free Water Mezcle bien IMPORTANTE Use Nuclease free Water Cat no AM9938 El agua esterilizada en autoclave no debe considerarse libre de PCR Microcentrifugue el tubo
6. Verde gradilla 5 3 C Detection Kit 8 tubos 96 reacciones kit doce tiras de 8 tubos D proteger de la luz y la MicroAmp Optical 8 Cap Strips doce tiras de 8 tubos N A humedad Pathogen Detection Pathogen Detection Negative Control 1 tubo 1 5 mL Rojo 5 3 C Negative Control Una exposici n excesiva a la luz puede afectar a las sondas fluorescentes Para proteger las tiras de 8 tubos de la humedad selle la bolsa herm ticamente cada vez que saque una tira de la bolsa Nota Los componentes se pueden enviar por separado en funci n de la configuraci n y las condiciones de almacenamiento Detecci n de Salmonella spp en muestras de producci n primaria por PCR en Tiempo Real 23 Cap tulo 4 MicroSEQ Salmonella spp Detection Kit Materiales no incluidos Materiales no incluidos 24 En la tabla siguiente se incluyen los materiales y el equipo necesarios para usar aunque no est n incluidos el MicroSEQ Salmonella spp Detection Kit A menos que se indique lo contrario todos los materiales est n disponibles en Life Technologies MLS Proveedor principal de productos de laboratorio Major laboratory supplier Instrumentos equipo consumibles y reactivost Art culo Origen Instrumentos Applied Biosystems 7500 Fast Real Time PCR System StepOne Real Time PCR System StepOnePlus Real Time PCR System P ngase en contacto con su representante local de Life Technologie
7. central HH Evite la capa superior que contiene residuos de la muestra Recoja la muestra de la parte central ll Part culas de la columna Detecci n de Salmonella spp en muestras de producci n primaria por PCR en Tiempo Real 21 Soluci n de problemas Cap tulo 3 PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit Extra Clean with Proteinase K Salmonella spp Soluci n de problemas Observaci n Posible causa Acci n recomendada Inhibici n de la PCR indicada mediante la ausencia de detecci n de una reacci n de IPC La retirada del sobrenadante antes de a adir Lysis Buffer no fue suficiente Diluya la muestra 1 5 o 1 10 con Nuclease free Water para diluir los inhibidores de la PCR Si se mantiene la PCR inhibida repita la preparaci n de la muestra El material filtrado de la columna de centrifugaci n se encuentra en la muestra El material filtrado con part culas puede inhibir la PCR Centrifugue la muestra para separar las part culas del material filtrado antes de transferir la muestra a la reacci n de la PCR Matriz asociada a componentes inhibitorios de la PCR Como las heces son heterog neas y variables seg n sus or genes hay una alta probabilidad de que surjan complicaciones Este paso ofrece una soluci n para ayudar a retirar componentes inhibitorios de la PCR Lave previamente el sedimento bacteriano antes de cargar la columna Rapid Spin 1 Transfiera 750
8. despu s de taparlos en el paso final IMPORTANTE Use una nueva punta de pipeta para cada muestra Resuspenda pipeteando con cuidado arriba y abajo con la punta de pipeta situada en el fondo del tubo para minimizar la formaci n de aerosol y la contaminaci n cruzada o si hay un agitador disponible agite los tubos tapados hasta que se disuelva el sedimento Nota A ada 30 uL de muestra de PrepSEQ Rapid Spin Kit o 30 uL de muestra de PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit a cada microesfera del ensayo El PrepSEQ Rapid Spin Kit proporciona 300 uL de muestra y el PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit proporciona 100 uL de muestra Use 30 uL de Pathogen Detection Negative Control por reacci n de control negativo Si usa otros m todos de preparaci n de muestras y hay menos de 30 uL de muestra disponible ajuste el volumen de la muestra con agua hasta alcanzar los 30 uL para cada tipo de reacci n IMPORTANTE Tape los tubos sellando cada uno con los tapones pticos transparentes dispuestos en tiras suministrados en el kit No use tapones ni tubos de colores para las reacciones del kit Los tapones o tubos de colores pueden afectar a las lecturas de se ales de los colorantes durante la PCR en tiempo real Detecci n de Salmonella spp en muestras de producci n primaria por PCR en Tiempo Real Preparar los tubos para 7500 Fast StepOne y StepOnePlus Systems Procesar las reacciones Capitulo 4 MicroSEQ Salmo
9. durante 90 30 segundos a 12000 16000 x g para hacer bajar las part culas derivadas de la columna de centrifugaci n que pueden interferir con la amplificaci n El ADN microbiano est en la fase acuosa Nota Las muestras se pueden almacenar a 543 C durante una noche o a menos de 18 C durante un plazo de tiempo prolongado Antes de procesar la PCR deben centrifugarse las muestras almacenadas durante 1 minuto aproximadamente a velocidad m xima para sedimentar las part culas de la columna Proceda con la PCR o almacene el tubo a una temperatura inferior a 18 C IMPORTANTE Use 30 uL de sobrenadante para la PCR en el ensayo liofilizado Para obtener instrucciones detalladas consulte el protocolo de MicroSEQ Salmonella spp Detection Kit consulte MicroSEQ Salmonella spp Detection Kit en la pagina 23 IMPORTANTE Si se produce la inhibici n de la PCR seg n lo indica la ausencia de amplificaci n para el objetivo o el IPC diluya la muestra con agua Se recomienda a adir 5 uL de muestra y 25 uL de agua al ensayo liofilizado para superar la inhibici n Consulte Soluci n de problemas en la p gina 22 para obtener informaci n detallada Para las muestras con un alto contenido en grasa se puede formar una capa superior con residuos encima de la muestra de ADN Para evitar la capa superior y el sedimento J A inferior recoja la muestra para PCR de la parte transparente
10. trabajo separadas un equipo especial y suministros para Preparaci n y elaboraci n de la muestra Amplificaci n y an lisis de los productos No lleve los productos amplificados al rea de preparaci n de la reacci n Abra y cierre todos los tubos de muestras con cuidado Evite salpicar o rociar las muestras Mantenga las reacciones y los componentes tapados tanto tiempo como sea posible Utilice una pipeta de desplazamiento positivo o puntas de pipeta de barrera resistentes a los aerosoles Limpie las mesas de trabajo del laboratorio y el equipo peri dicamente con una soluci n con lej a al 10 o DNAZap Solutions Cat no AM9890 IMPORTANTE Para evitar que se produzcan falsos positivos por contaminaci n cruzada Prepare y cierre todos los tubos de control negativo y tubos de muestras desconocidas antes de pipetear el control positivo No abra los tubos tras la amplificaci n Use diferentes conjuntos de pipetadores al pipetear muestras de control negativo desconocidas y de control positivo Sugerencias sobre i la disposici n de la placa Establezca una fila de separaci n entre los diferentes objetivos si hay suficiente espacio disponible Coloque al menos un pocillo entre las muestras y los controles desconocidos si es posible Establezca un pocillo de separaci n entre los controles negativos y positivos si es posible Coloque juntos los replicados de una muestra para el mismo objetivo
11. 0079 Homogeneizador mezclador de laboratorio Stomacher 400 Seward Cat no 0400 001 AJ o equivalente Agitador MLS Consumibles Guantes desechables MLS Puntas de micropipeta resistentes a los aerosoles MLS Pipetadores MLS e Desplazamiento positivo e Desplazamiento de aire e Varios canales MagMAX Express 96 Deep Well Tip Combs Cat no 4388487 MagMAX Express 96 Deep Well Plates Cat no 4388476 MagMAX Express 96 Standard Plates Cat no 4388475 Bolsas para filtros Whirl Pak 15 2 cm x 22 9 cm 6 x 9 0 68 kg 24 oz 250 paq bolsas Stomacher con malla Nasco Cat no BO1348WA o equivalente Bolsas para filtros Whirl Pak 15 2 cm x 22 9 cm 6 x 9 0 68 kg 24 oz bolsas Stomacher sin malla Nasco Cat no BO1297WA o equivalente Detecci n de Salmonella spp en muestras de producci n primaria por PCR en Tiempo Real Cap tulo 2 PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit Salmonella spp Enriquecimiento previo de muestras de producci n primaria Equipo consumibles y reactivos Art culo Origen Tubos de microcentrifugado libre de PCR MLS de 1 5 mL Tubos est riles de 15 o 50 mL MLS Reactivos Caldo de enriquecimiento de agua de peptona MLS tamponada BPW Buffered Peptone Water Caldo de tetrationato TT MLS Nuclease free Water Cat no AM9938 Etanol al 95 MLS Isopropanol al 100 e Fish
12. 6579 2002 E Microbiology of food and animal feeding stuffs Horizontal method for the detection of Salmonella spp ISO 6887 parts 1 through 4 Microbiology of food and animal feeding stuffs Preparation of test samples initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination ISO 7218 2007 Microbiology of food and animal feeding stuffs General requirements and guidance for microbiological examinations ISO 16140 2003 Microbiology of food and animal feeding stuffs Protocol for the validation of alternative methods NF EN ISO 6579 2002 Amd 1 2007 Microbiology of food and animal feeding stuffs Horizontal method for the detection of Salmonella spp Detection of Salmonella spp in animal faeces and in environmental samples from the primary production stage NF U47 100 norma francesa sobre el aislamiento y la identificaci n de Salmonella spp en el medioambiente y en muestras de productos animales Recherche par l isolement et l identification de tout s rovar ou de s rovar s sp cifi s de salmonelles dans l environnement des productions animales Detecci n mediante siembra en estr as de todos los serotipos de Salmonella en muestras de producci n primaria Detecci n de Salmonella spp en muestras de producci n primaria por PCR en Tiempo Real 45 Referencias 46 Detecci n de Salmonella spp en muestras de producci n primaria por PCR en Tiempo Real For support visit www lifetechnologies c
13. 7WA o equivalente Reactivos Agua de peptona tamponada BPW Buffered MLS Peptone Water Caldo de tetrationato TT MLS Nuclease free Water Cat no AM9938 Detecci n de Salmonella spp en muestras de producci n primaria por PCR en Tiempo Real Cap tulo 3 PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit Extra Clean with Proteinase K Salmonella spp Enriquecimiento previo de muestras de producci n primaria Enriquecimiento previo de muestras de producci n primaria Antes de empezar Homogeneizaci n y enriquecimiento primario Enriquecimiento secundario Preparaci n de los reactivos para la preparaci n de las muestras Establezca la temperatura de un calentador de bloques en 97 C y la de un segundo calentador de bloques en 56 C Etiquete los tubos de microcentrifugado de 1 5 mL Para procesar varias muestras le recomendamos que prepare una mezcla Proteinase K Lysis Buffer mezcle previamente 5 uL de Proteinase K 20 mg mL con 50 uL de Lysis Buffer para cada muestra use un recipiente limpio del tama o adecuado para realizar la mezcla Multiplique los vol menes por el n mero de muestras m s un 10 de excedente Mezcle bien para dispersar la Proteinase K en el Lysis Buffer selo inmediatamente o almac nelo con hielo hasta que est listo para su uso Combine la muestra con caldo de tetrationato caldo TT con una proporci n 1 9 en una bolsa para filtro Stomacher Nasco WhirlPak Cat no B014
14. 88WA o equivalente por ejemplo combine 25 gramos de muestra con 225 mL de caldo TT Homogeneice la muestra en un mezclador de laboratorio Stomacher 400 o equivalente durante 1 minuto aproximadamente a velocidad normal Incube a 37 1 C durante 16 20 horas en condiciones est ticas Diluya la muestra enriquecida con agua de peptona tamponada BPW Buffered Peptone Water con una proporci n 1 9 por ejemplo 1 mL de muestra con 9 mL de BPW en un recipiente adecuado Incube la muestra a 37 1 C durante 5 1 horas en condiciones est ticas Mezcle brevemente la muestra para asegurarse de que las bacterias est n en la soluci n por ejemplo agite durante unos 5 segundos Proceda a preparar la muestra Nota Se recomienda que se retengan las muestras de BPW para confirmar presuntos positivos Preparaci n de muestras mediante PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit Extra Clean with Proteinase K IMPORTANTE Use una t cnica as ptica adecuada al manipular las muestras para impedir una contaminaci n cruzada 1 2 Inserte una columna de centrifugaci n en un tubo etiquetado Cargue 750 uL de muestra enriquecida en la columna de centrifugaci n y tape la columna Detecci n de Salmonella spp en muestras de producci n primaria por PCR en Tiempo Real 19 20 Cap tulo 3 PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit Extra Clean with Proteinase K Salmonella spp Preparaci n de muestras mediante PrepSEQ Rapid Sp
15. Buffer Concentrate 2 botellas 26 mL botella Temperatura controlada 23 5 C Elution Buffer 1 botella 25 mL Temperatura controlada 23 5 C Proteinase K PK Buffer 1 botella 50 mL Temperatura controlada 23 5 C Proteinase K 20 mg mL 1 botella 1 25 mL Inferior a 18 C El kit de 300 reacciones Cat no 4428176 contiene el triple de cantidad volumen mostrado en la tabla Nota Los componentes se pueden enviar por separado en funci n de la configuraci n solicitada y las condiciones de almacenamiento Detecci n de Salmonella spp en muestras de producci n primaria por PCR en Tiempo Real 11 Cap tulo 2 PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit Salmonella spp Materiales no incluidos Materiales no incluidos 12 En la tabla siguiente se incluyen los materiales y el equipo necesarios para usar aunque no est n incluidos el PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit for Food Testing A menos que se indique lo contrario todos los materiales est n disponibles en Life Technologies MLS Proveedor principal de productos de laboratorio Major laboratory supplier Equipo consumibles y reactivos Art culo Origen Equipo 96 Well Magnetic Ring Stand Cat no AM10050 Calentador de bloques o ba o de agua 37 50 C MLS Centr fuga de placas Eppendorf 5804 o equivalente MagMAX Express 96 Deep Well Magnetic Particle Processor Cat no 440
16. GU A DE USUARIO applied biosystems by Kafe technologies Deteccion de Salmonella spp en muestras de produccion primaria por PCR en tiempo real Aislamiento de ADN automatizado o mediante columna de centrifugaci n para uso con PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit Extra Clean with Proteinase K MicroSEQ Salmonella spp Detection Kit Publication Number 100024642 Revision A NF VALIDATION EN ISO 16140 ABI 29 02 09 10 ALTERNATIVE ANALYTICAL METHODS FOR AGRIBUSINESS www afnor validation com Para analizar muestras ambientales y de alimentos solamente ld technologies La informaci n contenida en esta gu a est sujeta a cambios sin previo aviso DISCLAIMER LIFE TECHNOLOGIES CORPORATION AND OR ITS AFFILIATE S DISCLAIM ALL WARRANTIES WITH RESPECT TO THIS DOCUMENT EXPRESSED OR IMPLIED INCLUDING BUT NOT LIMITED TO THOSE OF MERCHANTABILITY FITNESS FOR A PARTICULAR PURPOSE OR NON INFRINGEMENT TO THE EXTENT ALLOWED BY LAW IN NO EVENT SHALL LIFE TECHNOLOGIES AND OR ITS AFFILIATE S BE LIABLE WHETHER IN CONTRACT TORT WARRANTY OR UNDER ANY STATUTE OR ON ANY OTHER BASIS FOR SPECIAL INCIDENTAL INDIRECT PUNITIVE MULTIPLE OR CONSEQUENTIAL DAMAGES IN CONNECTION WITH OR ARISING FROM THIS DOCUMENT INCLUDING BUT NOT LIMITED TO THE USE THEREOF LIMITED USE LABEL LICENSE No 492 Environmental Testing Quality Control Quality Assurance Testing Food and Agricultu
17. a una columna 2 Abra el documento del archivo de proceso correspondiente a la placa de reacci n creada en Crear un documento de archivo de proceso en la p gina 25 Detecci n de Salmonella spp en muestras de producci n primaria por PCR en Tiempo Real Cap tulo 4 MicroSEQ Salmonella spp Detection Kit Ver los resultados 3 Inicie el proceso IMPORTANTE Para evitar que se produzcan falsos positivos debido a material amplificado en su rea de trabajo no abra los tubos despu s de la amplificaci n Ver los resultados Introducci n Proceso general sin RapidFinder Express Software Recursos para ver los resultados El modo de visualizaci n de los resultados depender del instrumento que use Consulte la gu a de usuario adecuada de su instrumento de PCR en tiempo real o del RapidFinder Express Software Online Help para obtener instrucciones sobre c mo analizar los datos y ver los resultados IMPORTANTE Si usa RapidFinder Express Software consulte las instrucciones que aparecen en el apartado Viewing Results de la RapidFinder Express Software Online Help Pub No 4401842 El proceso general para ver los resultados desde los MicroSEQ Pathogen Detection Kits implica lo siguiente e Visualizaci n de las gr ficas de amplificaci n de todas las reacciones e Definici n de valores de umbral y l nea de base e Comprobaci n de la se al de colorante FAM espec fica del obj
18. agnetic Particles vuelvan a quedarse suspendidas Antes de su uso incube siempre el tubo Magnetic Particles a 3741 C durante 10 minutos aproximadamente y a continuaci n ag telo para que vuelvan a quedarse suspendidas por completo Si despu s de 10 minutos el precipitado de color blanco no se disuelve completamente se recomienda prolongar el per odo de incubaci n aumentar las temperaturas 50 C y agitar el tubo para garantizar una resuspensi n completa de las part culas Nota Las Magnetic Particles son el reactivo limitador del PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit Aseg rese de que haya una cantidad suficiente de Magnetic Particles para el n mero de muestras que se van a procesar se necesitan 25 uL de microesferas magn ticas por muestra 5 Binding Premix Solution a Mezcle previamente 450 uL de PK Buffer con 325 uL de Binding Buffer y 25 uL de Magnetic Particles por muestra en un recipiente adecuado Nota Cuando prepare la Binding Premix Solution para varias muestras multiplique los vol menes por el n mero de muestras incluidos los controles m s un 10 adicional para la variaci n de muestreos Nota Use la Binding Premix Solution en el plazo de 1 hora tras su preparaci n Gu rdelo a una temperatura controlada b Para mezclarlo bien ag telo durante 5 segundos aproximadamente hasta que finalice la resuspensi n 14 Detecci n de Salmonella spp en muestras de producci n primaria por PCR en Tiempo Real
19. as 34 Detecci n de Salmonella spp en muestras de producci n primaria por PCR en Tiempo Real A StepOne y StepOnePlus Systems Procesar las reacciones de 8 tubos en StepOne System AR StepOne fs caution HoT 1 Coloque el MicroAmp Fast 48 Well Tray Cat no 4375282 en el bloque de placas de StepOne System 2 Cargue las tiras de 8 tubos en posici n horizontal Por ejemplo en la fila C cargue una tira de 8 tubos en las columnas 1 a 8 Se recomienda una tira de 8 tubos como m nimo No es necesario equilibrar las tiras de tubos en la bandeja 3 Abra el documento del archivo de proceso correspondiente a la placa de reacci n creada en Crear un documento de archivo de proceso en la p gina 25 4 Inicie el proceso IMPORTANTE Para evitar que se produzcan falsos positivos debido a material amplificado en su rea de trabajo no abra los tubos despu s de la amplificaci n Detecci n de Salmonella spp en muestras de producci n primaria por PCR en Tiempo Real 35 Ap ndice A StepOne y StepOnePlus Systems Procesar las reacciones de 8 tubos en StepOnePlus System Procesar las reacciones de 8 tubos en StepOnePlus System StepOnePlus 2 88 Be on BR lafe CAUTION HOT ACA 1 Coloque el MicroAmp 96 Well Tray for Veriflex Blocks Cat no 4379983 en el bloque de placas de StepOnePlus System 2 Cargue las tiras de 8 tubos en posici n vertical Por ejem
20. cas descritas en los m todos normalizados por CEN ISO o NF U47 100 El paso de confirmaci n debe empezar a partir del caldo de enriquecimiento BPW Realizando un segundo paso de enriquecimiento en el caldo de peptona de soja de Rappaport Vassiliadis RVS Rappaport Vassiliadis Soya Peptone 0 1 mL de BPW en 10 mL de caldo RVS incube a 41 5 1 C durante 24 3 h y realice una siembra en estr as en el agar XLD xilosa lisina desoxicolato u otra placa de agar selectiva A continuaci n realice una prueba Latex a las colonias caracter sticas observadas o cree una galer a bioqu mica de las colonias purificadas caracter sticas de la Salmonella Cualquier otro m todo con la certificaci n NF Validation que se base en un principio diferente al m todo MicroSEQ Salmonella spp Es necesario que se aplique todo el protocolo completo del segundo m todo validado lo que significa que todos los pasos anteriores al paso de confirmaci n deben ser comunes a ambos m todos En caso de que se obtengan resultados discordantes positivos con el m todo alternativo no confirmados por uno de los medios descritos anteriormente el laboratorio debe seguir los pasos necesarios para garantizar la validez del resultado obtenido Detecci n de Salmonella spp en muestras de producci n primaria por PCR en Tiempo Real Cap tulo 4 MicroSEQ Salmonella spp Detection Kit Soluci n de problemas Soluci n de problemas Observaci n Posibl
21. ci n de la PCR Para preparar la reacci n en cadena de la polimerasa PCR debe crear un documento de archivo de proceso y preparar las microesferas y muestras del ensayo El procedimiento exacto depende de si va a usar o no RapidFinder Express Software Life Technologies recomienda utilizar el 7500 Fast Real Time PCR System con RapidFinder Express Software consulte StepOne y StepOnePlus Systems en la p gina 35 para obtener informaci n acerca del procesamiento de reacciones usando otros instrumentos Este protocolo describe el procedimiento que no usa RapidFinder Express Software Recomendamos que se utilice RapidFinder Express Software para obtener instrucciones detalladas en l nea destinadas a configurar los ensayos y realizar un an lisis de datos automatizado despu s IMPORTANTE Si usa RapidFinder Express Software consulte las instrucciones que aparecen en los apartados Create or Edit Run File y Pipette Samples de la RapidFinder Express Software Online Help Pub no 4401842 Crear un documento de archivo de proceso 1 Enel Sequence Detection System Software cree un documento de archivo de proceso En la lista desplegable Assay seleccione Absolute Quantification Standard Curve Para obtener informaci n acerca de la creaci n de un documento de archivo de proceso consulte la documentaci n proporcionada con su instrumento 2 Con el Quencher Dye establecido como none o Non Fluoresc
22. da mediante PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit 14 Preparar los materiales del kit PrepSEQ 0 20 0c ccc eee eee ees 14 Preparar las placas de procesamiento de MagMAX Express 96 00 ccc eee eeae 15 Procesar las muestras en el instrumento MagMAX Express 96 000 ccc eee eeae 15 Soluci n de problemas e crcl ave oe eee ee oes eaten iad the as 16 M CAPITULO 3 PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit Extra Clean with Proteinase K Salmonella spp 00eeeeees 17 Introduccion 3 2 cee 2G eats atid dae er Sathorn i hed batterers ee eatin ia dt ance 17 Contenido debkit ati A ee Bhs Pk ee oe he th ce oe 17 Materiales no inel ldoS ies Se a kt ee ce kde Leg AA AN a 18 Detecci n de Salmonella spp en muestras de producci n primaria por PCR en Tiempo Real 3 Contenido Enriquecimiento previo de muestras de producci n primaria 0 c cece eee eee 19 Antes de empezar o 19 Homogeneizaci n y enriquecimiento primario 0 c ccc eee eee eens 19 Enriquecimiento secundario 0020 e cee eee ee ee ee ee eee eee eens 19 Preparaci n de muestras mediante PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit Extra Clean with Proteinase K 200 ccc eee eee eee eee eens 19 Soluci n de problemas ere ide bs Pt la aa 22 CAP TULO 4 MicroSEQ Salmonella spp Detection Kit 23 INtPOMUCCION cnica a A Ae dea 23 Contenido del Kit eee lea dad 23 Materiales no incl
23. e causa Acci n No se ha detectado ninguna se al espec fica del IPC o del objetivo en pocillos desconocidos Se ha producido la inhibici n de la PCR Diluya la muestra 1 5 o 1 10 con Nuclease free Water para diluir los inhibidores de la PCR y repetir el ensayo Si se mantiene la PCR inhibida repita la preparaci n de la muestra Para obtener m s informaci n consulte la secci n Soluci n de problemas del PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit Protocol en la p gina 16 PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit Protocol en la pagina 22 No se ha detectado ninguna senal especifica del objetivo en los pocillos de control positivo Se ha producido un error de pipeteado no se ha a adido un control positivo Repita el ensayo Aseg rese de pipetear el control positivo en todos los pocillos de control positivo No se ha detectado ning n IPC pero se ha detectado una se al espec fica del objetivo Existe un elevado n mero de copias del ADN objetivo en las muestras lo que causa la amplificaci n preferencial del ADN espec fico del objetivo No es necesario llevar a cabo ninguna acci n No se ha detectado ninguna se al espec fica del objetivo en los pocillos de control negativo Se ha producido una contaminaci n por arrastre Repita el ensayo usando partes al cuotas frescas de todos los reactivos y limpie el equipo de pipeteado Si el control negativo sigue mostrando qu
24. e hay contaminaci n repita el ensayo con un nuevo kit Si el control negativo sigue mostrando que hay contaminaci n p ngase en contacto con el departamento de asistencia t cnica de Applied Biosystems Se ha detectado una se al espec fica del objetivo en los pocillos de control negativo pero no se ha detectado una se al de IPC Se ha producido una contaminaci n por arrastre y uno de los casos siguientes e Existe un elevado n mero de copias del ADN objetivo en las muestras lo que causa la amplificaci n preferencial del ADN espec fico del objetivo e Se ha producido un problema con la amplificaci n del IPC Examine los elementos desconocidos para determinar si hay una se al de IPC Si hay una se al de IPC en los pocillos desconocidos entonces la amplificaci n del IPC no es un problema Repita el ensayo usando partes al cuotas frescas de todos los reactivos y limpie el equipo de pipeteado No se ha detectado ninguna se al de IPC pero se ha detectado una se al espec fica del objetivo en los pocillos de control positivo Existe un elevado n mero de copias del ADN objetivo en las muestras lo que causa la amplificaci n preferencial del ADN espec fico del objetivo No es necesario llevar a cabo ninguna acci n Detecci n de Salmonella spp en muestras de producci n primaria por PCR en Tiempo Real 33 Cap tulo 4 MicroSEQ Salmonella spp Detection Kit Soluci n de problem
25. e preparaci n de muestras siguientes PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit Extra Clean with Proteinase K e MicroSEQ Salmonella spp Detection Kit e Applied Biosystems 7500 Fast Real Time PCR Instrument RapidFinder Express Software M todo de referencia Matriz Se usaron dos m todos de referencia durante el Muestras ambientales fundas para estudio de validaci n calzado aves de corral y cerdos heces e NF EN ISO 6579 2002 Amd 1 2007 aves de corral y cerdos basura agua Microbiology of food and animal feeding stuffs Para consumo animal y esponjados Horizontal method for the detection of Salmonella spp Detection of Salmonella spp in animal faeces and in environmental samples from the primary production stage Microbiolog a de los alimentos para consumo humano y alimentaci n animal M todo horizontal para la detecci n de Salmonella spp Detecci n de Salmonella spp en heces de animales y en muestras ambientales en la etapa de producci n primaria e NF U47 100 norma francesa sobre el aislamiento y la identificaci n de Salmonella spp en el medioambiente y en muestras de productos animales Recherche par l isolement et l identification de tout s rovar ou de s rovar s sp cifi s de salmonelles dans Uenvironnement des productions animales detecci n mediante siembra en estr as de todos los serotipos de Salmonella en muestras de prod
26. e usuario Detecci n de Salmonella spp en muestras de producci n primaria por PCR en Tiempo Real Descripci n Destinatarios Vida til Especificidad Detecci n de Salmonella spp en muestras de producci n primaria por PCR en Tiempo Real Introducci n IMPORTANTE Antes de usar los productos descritos en esta gu a lea y entienda la informaci n presentada en el ap ndice Seguridad de este documento Hemos desarrollado un flujo de trabajo de preparaci n de muestras para detectar Salmonella spp en muestras de producci n primaria El flujo de trabajo incluye el enriquecimiento la preparaci n de la muestra y la detecci n mediante PCR en tiempo real Los siguientes m todos de preparaci n de muestras est n disponibles para su uso en la detecci n de Salmonella spp en muestras de producci n primaria despu s del enriquecimiento e M todo basado en microesferas magn ticas consulte PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit Salmonella spp en la p gina 11 e M todo basado en columnas de centrifugaci n consulte PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit Extra Clean with Proteinase K Salmonella spp en la p gina 17 Ambos m todos comparten un proceso de enriquecimiento en dos pasos antes de la P P purificaci n de la muestra Los destinatarios del MicroSEQ Salmonella spp Detection Kit son analistas de microbiolog a que tienen que realizar pruebas para detectar Salmonella spp e
27. ecomendada La inhibici n de la PCR Las Magnetic Particles estaban en No altere las Magnetic Particles durante la se indica mediante la la Elution Plate transferencia de ADN eluido al ensayo liofilizado ausencia de detecci n de Opcional una reacci n de IPC f Centrifuguela placa a 4000 x g durante 30 segundos aproximadamente para sedimentar las Magnetic Particles al fondo de la placa o Coloque la Elution Plate en el 96 well magnetic ring stand Cat no AM10050 durante la transferencia de muestras a un ensayo liofilizado La Elution Plate contiene residuos Evite que queden residuos durante la transferencia de de part culas que no se han ADN eluido al ensayo liofilizado eliminado totalmente de la 06 pcional muestra del alimento Gire la placa a 4000 x g durante 30 segundos aproximadamente para sedimentar el residuo del alimento al fondo de la placa 16 Detecci n de Salmonella spp en muestras de producci n primaria por PCR en Tiempo Real 3 Introducci n PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit Extra Clean with Proteinase K Salmonella spp PrepSEQ9 Rapid Spin Sample Preparation Kit Extra Clean with Proteinase K proporciona un m todo sencillo para preparar ADN de muestras ambientales en la etapa de producci n primaria para 100 reacciones El PrepSEQ Kit se ha validado para su uso con muestras ambientales en la etapa de producci n primaria El procedimiento del kit implica lo s
28. encia de este documento Detecci n de Salmonella spp en muestras de producci n primaria por PCR en Tiempo Real 39 E Ap ndice C Seguridad Seguridad quimica Seguridad quimica ADVERTENCIA MANIPULACI N GENERAL DE PRODUCTOS QU MICOS Para minimizar los peligros aseg rese de que el personal del laboratorio lea y ponga en pr ctica las directrices generales sobre seguridad acerca del uso la conservaci n y la eliminaci n de productos qu micos suministradas a continuaci n y consulte las Hojas de Datos sobre Seguridad pertinentes para conocer las precauciones e instrucciones espec ficas Lea y comprenda las Hojas de Datos sobre Seguridad que proporciona el fabricante de los productos qu micos antes de almacenar manipular o trabajar con cualquier producto qu mico o material peligroso Para obtener las Hojas de Datos sobre Seguridad consulte la secci n Documentaci n y asistencia de este documento Minimice el contacto con productos qu micos Utilice un equipo adecuado de protecci n personal durante la manipulaci n de productos qu micos por ejemplo equipo de protecci n para los ojos guantes o vestimenta protectora Minimice la inhalaci n de productos qu micos No deje abiertos los recipientes de productos qu micos Utilicelos nicamente con la ventilaci n adecuada por ejemplo una campana extractora de humo Compruebe peri dicamente la ausencia de fugas o derrames Si se produce una fuga o un d
29. ent cree o seleccione los detectores de colorante FAM y VICO 3 Asocie los detectores FAM y VICO a cada reacci n Nota El colorante FAM se usa para detectar el objetivo mientras que el colorante VIC sirve para detectar el control positivo interno IPC 4 Establezca las condiciones de termociclado seg n se indica en la tabla siguiente Para obtener m s informaci n consulte la 7300 7500 7500 Fast Real Time PCR System Absolute Quantitation Using Standard Curve Getting Started Guide Pub no 4347825 o la StepOne and StepOnePlus Real Time PCR Systems Presence Absence Experiments Getting Started Guide Pub no 4376787 Para instrumentos 7500 Fast Paso Activaci n enzim tica PCR HOLD Cycle 40 cycles Desnaturalizaci n Puesta al rojo vivo extension Temp 95 C 95 C 60 C Tiempo 2 min 3s 30 s Detecci n de Salmonella spp en muestras de producci n primaria por PCR en Tiempo Real 25 Cap tulo 4 MicroSEQ Salmonella spp Detection Kit Preparaci n para la PCR Para instrumentos StepOne y StepOnePlus no incluidos en estudios de validaci n AOAC o AFNOR Paso Activaci n enzim tica PCR HOLD Cycle 40 cycles Desnaturalizaci n Puesta al rojo vivo extensi n Temp 95 C 95 C 60 C Tiempo 2 min 1s 20s 5 Establezca Sample Volume en 30 uL 6 Seleccione el modo de ejecuci n adecuado para su sistema seg n la tabla siguien
30. epSEQ Nucleic Acid Extraction Kit Preparaci n de muestras automatizada mediante PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit IMPORTANTE Use una t cnica as ptica adecuada al manipular las muestras para impedir una contaminaci n cruzada Preparar los 1 Establezca la temperatura del calentador de bloques en 37 C materiales del kit PrepSEQ 2 Binding Solution isopropanol afiada aproximadamente 35 mL de isopropanol al 100 a la botella Binding Solution vac a Etiquete la botella para indicar que se ha a adido isopropanol 3 Wash Buffer a ada 74 mL de etanol al 95 a una botella Wash Buffer Concentrate mezcle bien y a continuaci n etiquete la botella para indicar que se ha a adido etanol 4 Magnetic Particles incube el tubo Magnetic Particles a 37 1 C durante 8 2 minutos y a continuaci n ag telo durante 10 segundos aproximadamente mant ngalo a una temperatura controlada 23 5 C hasta que est listo para su uso Si despu s de la incubaci n inicial el precipitado de color blanco no se disuelve completamente puede prolongarse el per odo de incubaci n y aumentarse las temperaturas hasta 50 C para conseguir el objetivo de disolver el precipitado IMPORTANTE A veces se forma un precipitado de color blanco en el tubo Magnetic Particles Los experimentos de extracci n demuestran que la formaci n de precipitado no afecta al rendimiento siempre y cuando dicho precipitado se disuelva antes de su uso y las M
31. er Chemical Cat no A464 1 e Sigma Aldrich Cat no 190764 1L e O equivalente Enriquecimiento previo de muestras de producci n primaria Homogeneizaci ny 1 enriquecimiento primario 2 3 Enriquecimiento 1 secundario 2 3 4 Combine la muestra con caldo de tetrationato caldo TT con una proporci n 1 9 en una bolsa para filtro Stomacher Nasco WhirlPak Cat no B01488WA o equivalente por ejemplo combine 25 gramos de muestra con 225 mL de caldo TT Homogeneice la muestra en un mezclador de laboratorio Stomacher 400 o equivalente durante 1 minuto aproximadamente a velocidad normal Incube a 37 1 C durante 16 20 horas en condiciones est ticas Diluya la muestra enriquecida con agua de peptona tamponada BPW Buffered Peptone Water con una proporci n 1 9 por ejemplo 1 mL de muestra con 9 mL de BPW en un recipiente adecuado Incube la muestra a 37 1 C durante 5 1 horas en condiciones est ticas Mezcle brevemente la muestra para asegurarse de que las bacterias est n en la soluci n por ejemplo agite durante unos 5 segundos Proceda a preparar la muestra Nota Se recomienda que se retengan las muestras de BPW para confirmar presuntos positivos Almacene las muestras en fr o a 543 C Detecci n de Salmonella spp en muestras de producci n primaria por PCR en Tiempo Real 13 2 Cap tulo 2 PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit Salmonella spp Preparaci n de muestras automatizada mediante Pr
32. errame siga los procedimientos de limpieza del fabricante tal y como se recomienda en la Hoja de Datos sobre Seguridad Manipule los residuos qu micos bajo una campana extractora de humo Aseg rese de que se utilizan los contenedores de residuos primarios y secundarios Los contenedores primarios contienen los residuos inmediatos Los contenedores secundarios contienen cualquier derrame o fuga del contenedor primario Ambos contenedores deben ser compatibles con el material de residuo y deben cumplir los requisitos federales estatales y locales sobre el almacenamiento en contenedores Despu s de vaciar el recipiente de residuos ci rrelo bien con el tap n suministrado Identifique mediante an lisis si es necesario los residuos generados por las aplicaciones los reactivos y los sustratos utilizados en su laboratorio Aseg rese de que los residuos se almacenan transfieren transportan y eliminan de acuerdo con todas las normativas locales estatales provinciales o nacionales IMPORTANTE Los materiales radiactivos o que impliquen un peligro biol gico pueden requerir una manipulaci n especial pudi ndose aplicar limitaciones en materia de eliminaci n 40 Detecci n de Salmonella spp en muestras de producci n primaria por PCR en Tiempo Real Ap ndice C Seguridad C Seguridad biol gica Seguridad biol gica ADVERTENCIA RIESGO BIOL GICO Las muestras biol gicas como por ejemplo tejidos fluidos corporales agente
33. etivo y una se al de colorante VICO IPC de cada muestra En la tabla siguiente hay una gu a b sica para interpretar los resultados Se al de Se al de Resultado colorante FAM colorante VICO objetivo IPC Positivo Negativo Consulte Soluci n de problemas en la p gina 33 Para obtener m s informaci n acerca del an lisis de los datos consulte e La gu a de usuario del instrumento adecuado e RapidFinder Express Software Online Help Pub no 4401842 Recomendamos que no se use el mismo m todo para cribar las muestras y confirmar los resultados Cuando use el MicroSEQ Pathogen Detection System para cribar las muestras se recomienda aplicar m todos de cultivo y bioqu mica para confirmar el resultado Consulte la muestra de BPW enriquecida Enriquecimiento secundario en la p gina 13 y siga el ISO 6579 2002 E un protocolo aprobado para confirmar las pruebas de cultivos consulte Referencias en la p gina 45 Detecci n de Salmonella spp en muestras de producci n primaria por PCR en Tiempo Real 31 Confirmaci n de los resultados 32 Cap tulo 4 MicroSEQ Salmonella spp Detection Kit Ver los resultados En el contexto de NF Validation todas las muestras identificadas como positivas por el m todo MicroSEQ Salmonella spp se deben confirmar a partir del caldo de enriquecimiento BPW mediante una de las pruebas siguientes e Seg n las pruebas cl si
34. ficados de an lisis citas y otros documentos de apoyo del producto e Obtener informaci n acerca de los cursos de formaci n para el cliente e Descargar actualizaciones y parches de software Detecci n de Salmonella spp en muestras de producci n primaria por PCR en Tiempo Real 43 Documentaci n y asistencia Asistencia sobre seguridad alimentaria Asistencia sobre seguridad alimentaria Sitio web www lifetechnologies com foodsafety Direcci n electr nica del servicio de asistencia foodsafety lifetech com N mero de tel fono dentro de Norteam rica 1 800 500 6885 N mero de tel fono fuera de Norteam rica Vaya a www lifetechnologies com contactus html y seleccione el pa s adecuado en el men desplegable Garant a limitada del producto Life Technologies Corporation o sus filiales garantizan sus productos conforme a lo expuesto en los t rminos y condiciones generales de venta de Life Technologies que se encuentran en el sitio web de Life Technologies en www lifetechnologies com termsandconditions Si tiene alguna pregunta p ngase en contacto con Life Technologies en www lifetechnologies com support 44 Detecci n de Salmonella spp en muestras de producci n primaria por PCR en Tiempo Real Referencias Association of Analytical Communities AOAC www aoac org 2010 Accessed November 2010 Association Fran aise pour la Normalisation AFNOR www afnor validation com 2010 Accessed November 2010 ISO
35. iguiente e Enriquecimiento de Salmonella spp enriquecimiento primario en caldo de tetrationato caldo TT seguido de diluci n y enriquecimiento secundario en agua de peptona tamponada BPW Buffered Peptone Water e Preparaci n de muestras mediante columnas de centrifugaci n Se admiten las muestras iniciales recomendadas e Fundas para calzado y esponjas de 100 a 150 mL de caldo TT e Hisopos 10 mL de caldo TT e Otras muestras ambientales como heces caldo TT con una proporci n 1 10 por ejemplo 25 g de muestra con 225 mL de caldo TT Nota Para preparar muestras a partir de muestras enriquecidas de producci n primaria recomendamos un volumen de muestra de 750 uL cargada en la columna de centrifugaci n Contenido del kit PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit Extra Clean with Proteinase K Cat no 4426715 contiene reactivos para 100 preparaciones de muestras Articulo Cantidad o volumen Almacenamiento Columnas de centrifugaci n 100 Temperatura controlada Tubos de microcentrifugado 1 5 mL 2 x 100 2343 C Lysis Buffer 1 botella 5 mL 54 3 C Proteinase K 20 mg mL 1 tubo 1 25 mL Inferior a 18 C Nota Los componentes se pueden enviar por separado en funci n de la configuraci n solicitada y las condiciones de almacenamiento Detecci n de Salmonella spp en muestras de producci n primaria por PCR en Tiempo Real 17 Cap tulo 3 PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit E
36. in Sample Preparation Kit Extra Clean with Proteinase K 10 Cargue el tubo con su columna de centrifugacion en la microcentrifuga Oriente la bisagra del tapon del tubo hacia el interior del rotor vea la figura siguiente de la derecha De lo contrario la bisagra del tap n obstaculizar la instalaci n de la tapadera del rotor Posici n incorrecta del tap n del tubo Posici n correcta del tap n del tubo Microcentrifugue el tubo durante 3 minutos a 12000 16000 x g Saque el tubo de la microcentrifuga y a continuaci n deseche la columna de centrifugaci n usada Aspire el sobrenadante y a continuaci n des chelo IMPORTANTE Retire toda la cantidad de sobrenadante que sea posible incluido el exceso de l quido de los laterales del tubo Retire las gotas girando el pipetador en el interior del tubo y empujando el sobrenadante para retirarlo mediante aspiraci n A ada 55 uL de mezcla de Proteinase K Lysis Buffer 50 uL de Lysis Buffer 5 uL def Proteinase K por muestra al sedimento Nota Consulte Antes de empezar en la p gina 19 para obtener instrucciones sobre c mo preparar una mezcla de Proteinase K Lysis Buffer al procesar varias muestras IMPORTANTE Almacene la mezcla de Proteinase K Lysis Buffer con hielo hasta que est lista para su uso Resuspenda pipeteando arriba y abajo o agite hasta que el sedimento quede bien disperso la mezcla de Lysis Buffer Transfiera la mezcla de Proteinase
37. ivo interno IPC Internal Positive Control control de todos los pocillos de reacciones que siempre deben producir amplificaci n Si no es as hay un problema con la amplificaci n Se indica la presencia de un inhibidor en las muestras desconocidas si la se al de IPC se reduce de manera significativa Control negativo mezcla de reacciones sin secuencia objetivo Indica contaminaci n si se produce una amplificaci n o bien un problema de amplificaci n si la se al de IPC se reduce o no est Se proporciona el Pathogen Detection Negative Control en el kit como control negativo Se necesita un control negativo como m nimo para cada ensayo objetivo Reacci n en cadena de la polimerasa PCR Polymerase Chain Reaction tecnolog a que se usa para amplificar o aumentar la cantidad de una secuencia de ADN Control positivo control que establece la amplificaci n esperada de un objetivo La ausencia de se al objetivo en un pocillo de control positivo indica un error de pipeteado o un problema con la amplificaci n El investigador proporciona un control positivo y es recomendable pero no obligatorio para cada proceso Detecci n de Salmonella spp en muestras de producci n primaria por PCR en Tiempo Real 9 1 Capitulo 1 Introducci n Flujo de trabajo Flujo de trabajo Cebador o Primer segmento de ADN que complementa la secuencia de ADN objetivo o la secuencia de ADN del IPC Se necesita para iniciar la amplificaci n Sonda seg
38. mento de ADN que complementa la secuencia de ADN objetivo o la secuencia de ADN del IPC La sonda se etiqueta con un colorante reportero Cuando la sonda se une al objetivo o el IPC durante el paso de la amplificaci n se emite una fluorescencia El Sequence Detection System SDS o el Real Time PCR System detecta la fluorescencia indicando la presencia de la secuencia de ADN objetivo o del IPC Objetivo bacteria que se est analizando Muestra desconocida muestra de ADN de una sustancia alimenticia que se analiza para detectar la presencia de uno o m s pat genos alimentarios A continuaci n se muestra un flujo de trabajo de preparaci n de muestras para el m todo basado en microesferas magn ticas consulte la p gina 11 as como el m todo basado en columnas de centrifugaci n consulte la p gina 17 Combinar muestra con caldo TT en una proporci n 1 9 p ej 25 g o 25 mL de muestra 225 mL caldo TT 10 Enriquecer muestras a 37 C durante 16 20 horas Diluir muestra enriquecida con BPW en una proporci n 1 9 1 mL de muestra 9 mL de BPW Enriquecer muestras a 37 C durante 4 6 horas 1 nn PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit PrepSEQ Rapid Spin Extra Clean Kit automatizado en MagMAX Express 96 with Proteinase K Real time PCR Usar el MicroSEQ Salmonella spp Detection kit con el 7500 Fast Instrument Detecci
39. n muestras ambientales y de alimentos El MicroSEQ Salmonella spp Detection Kit no est destinado a ning n uso con fines terap uticos o diagn sticos en animales o seres humanos Consulte la fecha de caducidad que aparece en la etiqueta de la caja del envase El MicroSEQ Salmonella spp Detection Kit puede detectar todas las especies de Salmonella enterica analizadas y no ha detectado ninguna especie que no sea Salmonella El m todo no permite detectar Salmonella bongori 1 Cap tulo 1 Introducci n NF Validation mediante certificaci n AFNOR NF Validation mediante certificacion AFNOR VALIDATION EN ISO 16140 ABI 29 02 09 10 ALTERNATIVE ANALYTICAL METHODS FOR AGRIBUSINESS www afnor validation com PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit Extra Clean with Proteinase K y MicroSEQ Salmonella spp Detection Kit forman parte del flujo de trabajo de NF Validation para recuperar el ADN de Salmonella spp a partir de caldos de cultivo de muestras ambientales que se suelen encontrar en la fase de producci n primaria La certificaci n usa el est ndar ISO 16140 para validar m todos alternativos m todos anal ticos alternativos para el sector agr cola Certificado por NF Validation www afnor validation com Este kit se compar y se constat que era equivalente al m todo de referencia ISO 6579 El flujo de trabajo validado incluye lo siguiente e Uno de los kits d
40. nella spp Detection Kit Nota Las microesferas del ensayo contienen todos los componentes necesarios y para cada reacci n Las tiras de 8 tubos con las microesferas del ensayo suministradas son compatibles con 7500 Fast StepOne y StepOnePlus Systems Para obtener informaci n acerca del uso de StepOne y StepOnePlus Systems consulte Ap ndice A en la p gina 35 1 Para las tiras de 8 tubos con siete reacciones o menos a ada m s tubos vac os seg n sea necesario para que cada tira tenga un conjunto completo de 8 tubos Nota Las tiras de 8 tubos distribuyen uniformemente la carga de sujeci n que se aplica a las tiras de tubos de muestras durante el procesamiento y por tanto se minimizar el riesgo de ca da de los tubos A ada tubos vac os seg n sea necesario hasta formar una tira completa de 8 tubos en una columna vea la figura de la p gina siguiente 2 Tape los tubos sellando cada uno con los tapones pticos transparentes dispuestos en tiras suministrados en el kit Tape los tubos con los tapones para tiras mediante el MicroAmp 96 Well Base Cat no N8010531 y la MicroAmp Cap Installing Tool Cat no 4330015 para evitar que los tubos se caigan se doblen o queden mal alineados Confirme que las tiras est n rectas y que cada tubo est alineado con el tubo adyacente 3 Aseg rese de que las reacciones queden bien mezcladas IMPORTANTE La mezcla se puede llevar a cabo pipeteando con c
41. oloque las muestras y los controles en hielo o en un bloque fr o Descongele totalmente IMPORTANTE Los reactivos se deben descongelar en hielo o en un bloque fr o Retire la condensaci n despu s de descongelar las muestras y antes de abrirlas para evitar la contaminaci n cruzada a Para las muestras de PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit centrifugue la placa a 1000 2000 x g durante 90 30 segundos b Para las muestras de PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit microcentrifugue los tubos a 12000 16000 x g durante 90 30 segundos para hacer bajar las part culas derivadas de la columna de centrifugaci n que pueden interferir con la amplificaci n El ADN microbiano est en la fase acuosa c Para el Pathogen Detection Negative Control y el control o los controles positivos de los tubos de microcentrifugado agite y a continuaci n centrifugue los tubos Nota El investigador proporciona muestras desconocidas y muestras de controles positivos El kit incluye un control negativo Pathogen Detection Negative Control A ada 30 uL de la muestra preparada anteriormente a cada microesfera del ensayo Dispense todas las muestras desconocidas primero y despu s el control o los controles negativos y el control o los controles positivos Las microesferas se disuelven en un plazo de 1 a 5 segundos Para realizar la mezcla aspire suavemente y dispense varias veces Tambi n se pueden agitar los tubos de ensayo
42. om support or email techsupport lifetech com www lifetechnologies com 8 July 2014 technologies
43. plo cargue las tiras de 8 tubos en las columnas 1 y 2 de las filas A a H en ambas columnas La carga m nima recomendada es de dos tiras de 8 tubos 16 tubos y se deben colocar en columnas adyacentes por ejemplo en las columnas 1 y 2 No es necesario equilibrar las tiras de tubos en la bandeja 3 Abra el documento del archivo de proceso correspondiente a la placa de reacci n creada en Crear un documento de archivo de proceso en la p gina 25 4 Inicie el proceso IMPORTANTE Para evitar que se produzcan falsos positivos debido a material amplificado en su rea de trabajo no abra los tubos despu s de la amplificaci n 36 Detecci n de Salmonella spp en muestras de producci n primaria por PCR en Tiempo Real Buenas Practicas de PCR Evitar la contaminaci n y la amplificaci n no espec fica Introducci n Los ensayos de PCR requieren pr cticas de laboratorio especiales para evitar amplificaciones de falsos positivos El nivel elevado de rendimiento y repetici n de estos ensayos puede ocasionar la amplificaci n de una nica mol cula de ADN Buenas practicas Cuando se preparan muestras para la amplificaci n de PCR RT PCR de laboratorio para PCR Use guantes limpios y una bata de laboratorio limpia no usados previamente durante la manipulaci n de productos amplificados o usados durante la preparaci n de la muestra C mbiese de guantes siempre que sospeche que est n contaminados Mantenga reas de
44. ra PCR 0 0 c eee eee eee 37 Sugerencias sobre la disposici n de la placa ooocooooccccococorrrcrr eens 37 AP NDICE C Seguridad 0 0c cc cec cece eee e eee eeeeees 39 Seguridad QUIMICA See a Coe tear See Dae PE ee RAEI 40 Seguridad biol gicos coat So eset tide tats di Sieh ath wees daa lia bd 41 Detecci n de Salmonella spp en muestras de producci n primaria por PCR en Tiempo Real Contenido Documentaci n y asistencia o oocococcccconnnnconn eee eee 43 Obtener Hojas de Datos sobre Seguridad oooocococccococeconr rr 43 Obtener certificados de an lisis ooooococcccoccccocrr nr 43 Obtenerasistendia cm A a a O ee eRe 43 Asistencia sobre seguridad alimentaria oooococoooooocorcrr ee ees 44 Garant a limitada del producto 2 0 6 cece cnet tenn beet enn n eens 44 Referencias ecseke diate dales oval 45 Detecci n de Salmonella spp en muestras de producci n primaria por PCR en Tiempo Real 5 Acerca de esta gu a Historial de revisiones de la gu a del usuario en ingl s Revisi n Fecha Descripci n B May 2014 e Texto sobre la certificaci n NF Validation actualizado para cumplir los requisitos m s recientes e Plantilla actualizada con actualizaciones asociadas a la informaci n sobre la licencia de etiquetado de uso limitado informaci n sobre la garant a la declaraci n sobre marca comercial y las declaraciones de seguridad A November 2012 Nueva gu a d
45. ral Testing Notice to Purchaser The purchase of this product conveys to the purchaser the limited non transferable right to use the purchased amount of the product la to perform internal research for the sole benefit of the purchaser and b for environmental testing quality control quality assurance testing food and agricultural testing including reporting results of purchaser s activities in environmental testing quality control quality assurance testing food and agricultural testing for a fee or other commercial consideration No other right is hereby granted expressly by implication or by estoppel This product is for environmental testing quality control quality assurance testing food and agricultural testing and research purposes only The purchase of this product does not grant the purchaser any additional rights including without limitation the right to transfer or resell the product in any form or the right to use the product as a therapeutic agent or diagnostics test component For information on obtaining additional rights please contact outlicensing dlifetech com or Out Licensing Life Technologies 5791 Van Allen Way Carlsbad California 92008 TRADEMARKS All trademarks are the property of Thermo Fisher Scientific and its subsidiaries unless otherwise specified NF Validation is a registered trademark of Association Francaise de Normalisation AFNOR Stomacher is a registered trademark of Seward Limited Whirl Pak is a regi
46. ras de producci n primaria por PCR en Tiempo Real 29 4 Cap tulo 4 MicroSEQ Salmonella spp Detection Kit Procesar las reacciones Procesar las reacciones de 8 tubos en el 7500 Fast System solamente sin RapidFinder Express Software 30 Para las tiras de 8 tubos del 7500 Fast System Se recomienda utilizar el 7500 Fast Precision Plate Holder para MicroAmp Tube Strips Cat no 4403809 Cuando use las tiras de 8 tubos de MicroAmp si no se usan la columna 1 situada en el extremo izquierdo y la columna 12 situada en el extremo derecho inserte dos tiras de 8 tubos vac os y totalmente tapados en estas columnas Nota Las tiras de 8 tubos vac os y tapados distribuyen uniformemente la carga de sujeci n que se aplica a las tiras de tubos de muestras durante el procesamiento y por tanto se minimizar el riesgo de ca da de los tubos 1 Inserte con cuidado dos o m s tiras de 8 tubos con muestras empezando desde el centro del reposaplacas y desplaz ndose hacia fuera Esta disposici n minimiza la posibilidad de que las tiras de tubos se doblen o queden mal alineadas Nota Se puede procesar un m nimo de dos y un m ximo de doce tiras de 8 tubos a la vez Si hay un n mero impar de muestras en los tubos de la tira tendr que incluir una tira de 8 tubos vac os y tapados para equilibrar la carga IMPORTANTE Use siempre un total de 8 tubos por columna Puede que sea necesario a adir tubos nuevos y vac os
47. s Equipo Microcentrifuga de sobremesa Eppendorf 5415D o equivalente Calentador de bloques MLS Cubo de hielo MLS Centr fuga de placas Eppendorf 5804 o equivalente Agitador MLS 7500 Fast Precision Plate Holder for MicroAmp Tube Strips para usar con 7500 Fast Real Time PCR System Cat no 4403809 MicroAmp Fast 48 Well Tray para usar con StepOne Real Time PCR System Cat no 4375282 MicroAmp 96 Well Tray for Veriflex Blocks para usar con StepOnePlus Real Time PCR System Cat no 4379983 MicroAmp 96 Well Base Cat no N8010531 Pipetadores MLS e Desplazamiento positivo e Desplazamiento de aire e Varios canales Consumibles Puntas de pipeta resistentes a los aerosoles MLS Guantes desechables MLS MicroAmp Multi removal Tool Cat no 4313950 MicroAmp Fast 8 Tube Strip 0 1 mL Cat no 4358293 MicroAmp Optical 8 Cap Strip 300 tiras Cat no 4323032 Reactivos Nuclease free water Cat no AM9938 Los materiales incluidos aqu se han validado para su uso con este kit Los resultados pueden variar si se usan productos sustitutos de otros proveedores 8 Incluido en el kit b sico Detecci n de Salmonella spp en muestras de producci n primaria por PCR en Tiempo Real Cap tulo 4 MicroSEQ Salmonella spp Detection Kit 4 Preparaci n para la PCR Preparaci n para la PCR Prepara
48. s infecciosos y sangre humana o de otros animales pueden transmitir enfermedades infecciosas Todo el trabajo se debe realizar en instalaciones que dispongan del equipamiento adecuado y con el equipo de seguridad apropiado por ejemplo dispositivos de contenci n f sica El equipo de seguridad puede incluir tambi n art culos para protecci n personal como guantes abrigos batas protectores de zapatos botas respiradores protectores faciales protecci n para los ojos o gafas de seguridad Los trabajadores deben recibir formaci n de acuerdo con los requisitos de la instituci n o empresa y los requisitos legales aplicables antes de trabajar con materiales potencialmente infecciosos Siga todas las normativas locales estatales provinciales o nacionales aplicables Las referencias siguientes proporcionan directrices generales sobre la manipulaci n de muestras biol gicas en un entorno de laboratorio U S Department of Health and Human Services Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories BMBL 5th Edition HHS Publication No CDC 21 1112 Revised December 2009 found at www cdc gov biosafety publications bmbl5 BMBL pdf World Health Organization Laboratory Biosafety Manual 3rd Edition WHO CDS CSR LYO 2004 11 found at www who int csr resources publications biosafety Biosafety7 pdf Detecci n de Salmonella spp en muestras de producci n primaria por PCR en Tiempo Real 41 E Ap ndice C Seguridad Seguridad biol
49. stered trademark of Aristotle Corporation Translated from the English Pub no 4476867 Rev B 2014 Thermo Fisher Scientific Inc All rights reserved Contenido Acerca de esta Gulia sarcot rica 6 Historial de revisiones de la gu a del usuario en ingl s 6 eee eee o 6 M CAP TULO 1 Introducci n o ooccccccncccccccccnnnnncanccnos 7 Descripcion uta td a od trol 7 Destinatario Sues e ie ace dl aloe era sio tus dea SA a pe ad oe a e a 7 Vida Util aii A awe he sie tae Hise 7 Especificidad A Dt SOO Seal a Ste etd 7 NF Validation mediante certificaci n AFNOR 0 0 0 c ccc cence ence nee ne eens 8 Fecha de Caducidad 000 c eee e tee eeeeeeees 9 Condiciones Operativas sect eg ad phe bd wane REE e eee ee ees 9 AM o tee state et RENN nt Are MORAN ee ce Ate mh 9 Definiciones de los t rminos noia ny ernie leech shies wba ae aimed 9 Plujoidetraba e ect di ead pl ae ean eee a 10 CAPITULO 2 PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit Salmonella SOP sins A wars aad ek via ok 11 Introducci n ista ridad eke A eed geet ee gs el 11 Contenido del kit ciaci n ci ede SEG ea eee eee eee eee Peale ee 11 MaterialeSinodnClndos toas idilio ada do 12 Enriquecimiento previo de muestras de producci n primaria 0oooocococcoooccoccco ro 13 Homogeneizaci n y enriquecimiento primario 6 cece rnrn rnrn 13 Enriquecimiento secundario cece e eee e etna 13 Preparaci n de muestras automatiza
50. te Sistema Modo de ejecuci n 7500 Fast Fast 7500 StepOne Fast StepOnePlus Fast La Figura 1 muestra un ejemplo de la ficha Instrument del 7500 Fast System SDS Software 26 Detecci n de Salmonella spp en muestras de producci n primaria por PCR en Tiempo Real Cap tulo 4 MicroSEQ Salmonella spp Detection Kit 4 Preparaci n para la PCR Figura 1 Ficha Instrument del 7500 Fast System SDS Software con el modo de ejecuci n establecido en Fast 7500 217500 Fast System SDS Software Platel Standard Curve a Fot7500 O Stage 2 Step 2 60 0 0 30 E Preparar las microesferas del ensayo 1 Abra la bolsa de almacenamiento que contiene las microesferas del ensayo realice un corte por la marca situada en la esquina superior de la bolsa de almacenamiento por encima de la tira de cierre herm tico Ziplock IMPORTANTE No extraiga el desecante de la bolsa de almacenamiento 2 Retire la cantidad adecuada de tubos individuales o tiras de 8 tubos un tubo por cada reacci n que piense procesar 3 Coloque los tubos en hielo o en un bloque fr o 4 Selle la bolsa de almacenamiento mediante la tira de cierre herm tico Ziplock y a continuaci n gu rdela a una temperatura de 5 3 C Detecci n de Salmonella spp en muestras de producci n primaria por PCR en Tiempo Real 27 28 Cap tulo 4 MicroSEQ Salmonella spp Detection Kit Preparaci n para la PCR Preparar las muestras y los controles C
51. uL de muestra a un tubo de microcentrifugado limpio 2 Centrifugue a 12000 16000 x g durante 3 min 3 Deseche el sobrenadante 4 Resuspenda el sedimento en 650 uL de agua destilada est ril 5 Cargue la muestra resuspendida en la columna Rapid Spin El sedimento bacteriano se separa del tubo por lo que resulta dif cil evitar el sedimento durante la aspiraci n La muestra no se supervis antes de aspirar el sobrenadante lo que hizo que se disipara el sedimento bacteriano Vuelva a centrifugar el sobrenadante y ret relo inmediatamente despu s de la centrifugaci n El tama o del sedimento bacteriano es muy reducido y dif cil de ver Retire el sobrenadante con cuidado dejando hasta 50 uL de dicho sobrenadante para evitar la aspiraci n del sedimento 22 Detecci n de Salmonella spp en muestras de producci n primaria por PCR en Tiempo Real YA MicroSEQ Salmonella spp Detection Kit Introducci n El MicroSEQ9 Salmonella spp Real Time PCR Detection Kit se ha validado para su uso con muestras de producci n primaria Contenido del kit El MicroSEQ Salmonella spp Detection Kit Cat no 4403930 contiene reactivos para 96 reacciones Los componentes del kit y sus condiciones de almacenamiento se muestran en la tabla siguiente oak Color del Almacena Nombre Descripcion tap n miento MicroSEQ Salmonella spp Salmonella spp Assay Beads 96 tubos en tiras de
52. ucci n primaria Detecci n de Salmonella spp en muestras de producci n primaria por PCR en Tiempo Real Cap tulo 1 Introducci n 1 Condiciones operativas Observaciones y recomendaciones generales Cumplir las pr cticas ptimas de laboratorio GLP Good Laboratory Practices consulte el est ndar EN ISO 7218 Recomendamos que se sigan los est ndares ISO 6579 e ISO 6887 para la preparaci n de suspensiones maestras En el contexto de la certificaci n NF Validation no se han analizado muestras de m s de 25 gramos Fecha de caducidad Para obtener m s informaci n acerca de la fecha de caducidad de la certificaci n NF Validation consulte el certificado ABI 29 02 09 10 disponible en www afnor validation com o en la secci n Product Literature de la p gina del producto en www lifetechnologies com Condiciones operativas Altitud Applied Biosystems 7500 Fast Real Time PCR System solo se usa en interiores y en altitudes que no superen los 2000 m sobre el nivel del mar Requisitos de temperatura y humedad Condici n Intervalo aceptable Temperatura 15 a 30 C Cambio m ximo inferior a 15 C cada 24 horas Humedad 20 a 80 de humedad relativa sin condensaci n Definiciones de los t rminos Este protocolo utiliza las siguientes convenciones Amplificaci n proceso de realizar copias y por tanto aumentar la cantidad de una secuencia de ADN espec fica Control posit
53. uidado arriba y abajo Mantenga la punta de la pipeta en el fondo del tubo para minimizar la formaci n de aerosol y la contaminaci n cruzada o si hay un agitador disponible uselo para mezclar los componentes del tubo de ensayo 4 Aseg rese de que los reactivos est n en el fondo de los tubos Si hay una centr fuga con adaptador de placas disponible sela para centrifugar el contenido de los tubos a 2000 x g durante unos 20 segundos Procesar las reacciones Antes de empezar El procesamiento de tubos o de una placa implica el uso de un Applied Biosystems Sequence Detection System SDS o un Real Time PCR System para el an lisis de muestras El procedimiento exacto depende de si va a usar o no RapidFinder Express Software Este protocolo describe el procedimiento que no usa RapidFinder Express Software Recomendamos que se utilice RapidFinder Express Software para obtener instrucciones detalladas en l nea destinadas a configurar los ensayos y realizar un an lisis automatizado de los datos despu s IMPORTANTE Si usa RapidFinder Express Software consulte las instrucciones que aparecen en el apartado Start Instrument Run de la RapidFinder Express Software Online Help Pub no 4401842 Aseg rese de que el instrumento est bien instalado y calibrado Para obtener informaci n sobre la calibraci n consulte la documentaci n proporcionada con su instrumento Detecci n de Salmonella spp en muest
54. uidoS ooocococccoco eee e eee e eee eeeees 24 Preparaci n paralla POUR citen ds ni Sed Pane nek he donne tut We eee heme 25 Preparaci n dela PCR ita ieee fant yin tere A ae ea Tt ied RY 25 Preparar los tubos para 7500 Fast StepOne y StepOnePlus Systems 29 Procesdr las reacciones e a A A e a 29 Antes de empeZar os 2 00 eg A de bee ce te eee ei 29 Procesar las reacciones de 8 tubos en el 7500 Fast System solamente sin RapidFinder Express Software 0 0 00 ccc ccc c cence nee ne ence een anes 30 Verlos resultados os s 2 obs eed oP eddie EE deed Meek reed Pace dean ve bodeae RER 31 Introducci n tati oa Ade eae eli dei E 31 Proceso general sin RapidFinder Express Software 0 ccc cece cece e ene e eas 31 Recursos para ver los resultados nuna nunnu cece ee ee eee e eee 31 Confirmaci n de los resultados nunnan unnan ccc een eee teen nett eens 32 Sol ci n de problemas a at a does a a ed ne eral A 33 AP NDICE A StepOne y StepOnePlus Systems 35 Procesar las reacciones de 8 tubos en StepOne System 0 ccc ccc cece eens 35 Procesar las reacciones de 8 tubos en StepOnePlus System 0 00 cece cee eens 36 AP NDICE B Buenas Practicas de PCR eceeseeeeeees 37 Evitar la contaminaci n y la amplificaci n no espec fica oooooooooccoooooorrrro ee 37 Introducci n ds a a a eh Be 37 Buenas practicas de laboratorio pa
55. ulse Start instrumento 2 Cargue las placas en el instrumento MagMAX Express 96 de acuerdo con la Mag MAX lectura Verifique la orientaci n de cada placa A1 a Al Express 96 Placa Acci n Tip Plate Cargue la Tip Plate y a continuaci n pulse Start Elution Plate Cargue la Elution Plate preparada y a continuaci n pulse Start Wash Plate II Cargue la Wash Plate Il preparada y a continuaci n pulse Start Wash Plate Cargue la Wash Plate preparada y a continuaci n pulse Start Lysis Sample Plate Cargue la Lysis Sample Plate preparada y a continuaci n pulse Start Nota No hay ning n paso m s de interacci n manual con el proceso automatizado hasta que el proceso haya finalizado el proceso de purificaci n Detecci n de Salmonella spp en muestras de producci n primaria por PCR en Tiempo Real 15 Cap tulo 2 PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit Salmonella spp Soluci n de problemas 3 Cuando haya terminado el proceso de preparaci n de la muestra aparecer el mensaje Enjoy your DNA en la pantalla Extraiga la Elution Plate Nota La Elution Plate contiene el ADN purificado PUNTO DE PARADA Proceda con el proceso de PCR en tiempo real de MicroSEQ Salmonella spp como se indica o selle la Elution Plate con una pel cula adhesiva transparente y gu rdela a 543 C una noche o a menos de 18 C a largo plazo Soluci n de problemas Observaci n Posible causa Acci n r
56. xtra Clean with Proteinase K Salmonella spp Materiales no incluidos Materiales no incluidos En la tabla siguiente se incluyen los materiales y el equipo necesarios para usar aunque no est n incluidos el PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit Extra Clean with Proteinase K A menos que se indique lo contrario todos los materiales est n disponibles en Life Technologies MLS Proveedor principal de productos de laboratorio Major laboratory supplier Equipo consumibles y reactivos Art culo Origen Equipo Calentador de bloques 97 C MLS Calentador de bloques 56 C MLS Gradilla para tubos de 1 5 mL MLS Microcentr fuga de sobremesa Eppendorf 5415 D o equivalente Homogeneizador mezclador de laboratorio Stomacher 400 Seward Cat no 0400 001 AJ o equivalente Pipetadores MLS e Desplazamiento positivo e Desplazamiento de aire Agitador MLS Consumibles Guantes desechables MLS Puntas de pipeta resistentes a los aerosoles MLS Bolsas para filtros Whirl Pak 25 4 cm x 38 1 cm 10 x 15 2 6 kg 92 oz bolsas Stomacher con malla Nasco Cat no BO1488WA o equivalente Bolsas para filtros Whirl Pak 15 2 cm x 22 9 cm 6 x 9 0 68 kg 24 oz 250 paq bolsas Stomacher con malla Nasco Cat no BO1348WA o equivalente Bolsas Whirl Pak 15 2 cm x 22 9 cm 6 x 9 0 68 kg 24 oz bolsas Stomacher sin malla Nasco Cat no BO129
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