DIAGNOSTIC AUTOMATION, INC. 23961 Craftsman Road, Suite E/F
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1. un frasco 0 4 mL 480T un frasco 0 800 mL 7 Conjugado de Peroxidasa de R bano picante HRP listo para usarse IgG de cabra anti humana contiene pro DAI N 0 1 como preservativo 96T una botella 16 mL 480T cinco botellas 16 mL cada una 8 Soluci n Substrato Crom geno Tetrametilbenzidina TMB lista para usar 96T una botella 15 mL 480T cinco botellas 16 mL cada una 9 Tamp n de Lavado concentrado 20X diluir 1 parte de concentrado 19 partes de agua deshionizada o destilada Contiene TBS Tween 20 polisorbato 20 y proclina 0 1 como preservativo pH 7 2 0 2 96T una botella 60 mL 480T una botellas 250 mL 10 Soluci n de Parada lista para usarse contiene soluci n H2SO4 1N 96T una botella 15 ml Nota los frascos de suero pueden contener volumen en exceso Los siguientes componentes no son dependientes del n mero de lote y pueden ser usados de manera intercambiable dentro del an lisis DAI ELISA IgG Diluyente de suero IgG Soluci n substrato Crom geno tamp n de lavado y soluci n de parada PRECAUCIONES 1 Los componentes de suero humano usados en la preparaci n de los Controles y Calibradores en este kit han sido evaluados por un m todo aprobado por la FDA que busca la presencia de anticuerpos del virus de inmunodeficiencia humana VIH as como para el ant geno de superficie de la Hepatitis B y fue encontrado negativo Debido a que ning n test puede ofrecer seguridad total qu2. deseado de tiras de pocillo en el marco Permita seis determinaciones de Control Cut off un Control Negativo tres Calibradores Cut off y un Control Positivo Alto por corrida Deber a ser realizado en cada an lisis un reactivo blanco RB Revise el software y los requerimientos del lector para las configuraciones apropiadas de Controles Calibradores Devuelva las tiras sin usar a la bolsa de cierre herm tico con desecantes e indicadores de humedad Selle y congele inmediatamente 1A RB 2A Paciente 2 1B NC 2B Paciente 3 1C Cal 2C Paciente 4 1D Cal 2D Paciente 5 1E Cal 2E Paciente 6 1F HPC 2F Paciente 7 1G LPC 2G Paciente 8 1H Paciente 1 2H Paciente 9 RB Reactivo En Blanco Pozo sin adici n de suero procesado con todos los reactivos Utilizado para el lector en blanco NC Control Negativo Cal Calibrador HPC Control Positivo Alto LPC Control Positivo Bajo 2 Diluir los sueros del test Calibrador cut off Controles positivos negativos altos bajos sueros 1 21 ej 10uL 200 uL en Diluyente de Suero Para diluciones manuales se sugiere dispensar primero el Diluyente del Suero en el tubo de ensayo y luego agregar el suero del paciente 3 Agregar 100mL del calibrador cut off en el diluyente apropiado Controles y sueros de pacientes en pozos individuales Agregar 100mL de Diluyente de Suero al pozo del reactivo en blanco A 1 Revise el software y los requerimientos del lector para las configuraciones apropi
3. limpia 7 No permita que los pozos se sequen durante el an lisis cambie los reactivos inmediatamente despu s de los pasos de lavado 8 Evite la contaminaci n cruzada de los reactivos L vese las manos antes y despu s de manejar reactivos 9 Si los pasos de lavado son realizados manualmente los pozos deben ser lavados tres veces Hasta cinco ciclos de lavado son necesarios si se usa un equipo autom tico de lavado 10 Azida de sodio inhibe la actividad del Conjugado Se deben usar puntas de pipeta limpias para que la azida de sodio no se mezcle con otros reactivos 11 Se ha reportado que la azida de sodio puede reaccionar con el plomo y el cobre en las tuber as paras formar compuestos explosivos Al desechar use suficiente agua para minimizar la acumulaci n de compuestos met licos de azida 12 Nunca pipetee con la boca o permita que los reactivos y muestras de pacientes entren en contacto con la piel 13 S1 una soluci n de hipoclorito de sodio cloro es usada como desinfectante no se exponga al rea de trabajo durante el test por la potencial interferencia con la actividad enzim tica 14 Evite el contacto del cido sulf rico con la piel u ojos Si ocurre el contacto lave inmediatamente el rea con agua 15 Precauci n Los residuos l quidos de pH cido deben ser neutralizados antes de a adir a las soluciones de hipoclorito s dico cloro para evitar la formaci n de gas venenoso 16 S lo para uso de diagn
4. reactivo en blanco A 1 Evite las burbujas mientras se agrega ya que pueden dar falsos resultados 7 Incubar cada pozo por veinticinco 25 5 minutos a temperatura ambiente 21 a 25 C 8 Repita el lavado como se describe en el paso 5 9 Agregue 100 uL de Soluci n de Crom geno Substrato en cada pozo incluyendo el pozo del reactivo en blanco manteniendo un rango constante de adici n para toda la placa 10 Incubar cada pozo de diez 10 15 minutos a temperatura ambiente 21 to 25 11 Detener la reacci n agregando 100 uL de Soluci n de Parada H2504 IN siguiendo el mismo orden de adici n de substrato incluyendo el pozo del reactivo en blanco Golpear suavemente la placa por los bordes para mezclar el contenido de los pozos La placa puede ser mantenida por hasta una 1 hora despu s de agregar la Soluci n de Parada antes de leer 12 El color desarrollado debe ser le do en un lector de placas de ELISA equipado con un filtro de 450nm Si se esta usando longitud de onda dual configure al filtro de referencia de 600 650 nm El instrumento deber a ser llevado a cero El reactivo blanco debe dar una absorbancia menor de 0 150 a 450 nm Si el reactivo blanco es gt 0 150 la prueba debe ser repetida Blanquee el lector con el pozo en blanco y luego lea la placa completa Deseche las placas utilizadas una vez realizada la lectura CONTROL DE CALIDAD Para que el an lisis sea considerado v lido deben cumplirse las siguien
5. stico in vitro MATERIALES REQUERIDOS PERO NO SUMINISTRADOS 1 Cilindro graduado 100 mL 2 Matraz 1L 3 Temporizador 0 a 60 minutos 4 Micropipetas capaces de dispensar con exactitud 10 200 mL vol menes menos del 3 CV 5 Agua deshionizada o destilada 6 Toallas de papel 7 Botella de lavado equipo semi automatizado o automatizado de lavado 8 Lector de microplacas de longitud de onda individual o doble con filtro de 450 nm Si la longitud de onda dual es usada configure el filtro de referencia a 600 650 nm Lea el manual del operador o contacte al fabricante del instrumento para establecer las especificaciones de linealidad del lector 9 Tubos de ensayo para la diluci n del suero 10 Recipiente para desechos y desinfectante ej 0 5 hipoclorito de sodio Nota usar solamente cristaler a limpia y seca ALMACENAMIENTO Y DURACI N DE LOS REACTIVOS 1 Almacene los kits que no han sido abiertos a 2 y 8 C El kit del test puede ser usado hasta la fecha de expiraci n del mismo V ase la etiqueta del empaque para obtener la fecha de expiraci n 2 Las placas de microanalisis no abiertas deben ser almacenadas entre 2 y 8 C Las tiras sin usar deben ser regresadas inmediatamente a una bolsa con cierre herm tico con desecante e indicadores de humedad y colocadas de vueltas en almacenamiento a 2 y 8 C 3 Almacene el Conjugado HRP entre 2 y 8 C 4 Almacene el Calibrador los Controles Positivo
6. 003 Fecha de Revision 29 03 06
7. CE A AUTOMATION INC 23961 Craftsman Road Suite E F Calabasas CA 91302 Tel 818 591 3030 Fax 818 591 8383 onestep rapidtest com technicalsupport rapidtest com www rapidtest com VD XA V ase la etiqueta externa 2 C 8 C y 296 tests REF 8042 1 Mycoplasma Pneumonia IgG TMB ELISA No Catalogo 8042 1 V ase la etiqueta externa 2 C 8 C 2 96 tests REF 8042 1 PRINCIPIO El Analisis Inmunoabsorbente Ligado a Enzimas ELISA se basa en la habilidad de los materiales biol gicos ejem ant genos para fijarse a superficies pl sticas como el poliestireno fase s lida Cuando los ant genos se unen a la fase s lida entran en contacto con el suero del paciente anticuerpo especifico al ant geno si est presente se unir al ant geno en la fase s lida formando complejos espec ficos de antigeno anticuerpo El exceso de anticuerpo es removido por lavados Seguido por la adici n de conjugado de globulina de cabra anti humana con peroxidasa de r bano picante el cual se une luego a los complejos ant geno anticuerpo El exceso de conjugado es removido con un lavado seguido por la adici n de substrato cromog nico de tetrametilbenzidina TMB Si el anticuerpo espec fico para el ant geno est presente en el suero del paciente se desarrolla un color azul Cuando la reacci n enzim tica es detenida con H2504 1N el contenido de los pozos se vuelve amarillo El color el cual es proporcional a la concentraci n
8. a etiqueta del frasco del calibrador 2 El valor ISR para cada muestra del pacientes es calculando dividiendo la absorbancia de la muestra por el valor del calibrador obtenido en el Paso 1 Resultados Interpretaci n lt 0 90 Negativo Ausencia de anticuerpos detectables por la prueba ey ee de ELISA Estas personas se presume que no esta infectada y son susceptibles a la infecci n primaria Las muestras deben ser reexaminadas Ver N mero 3 a continuaci n Positivo Indica la presencia de anticuerpos detectables por el test ELISA Indicativa de infecci n actual o anterior El individuo puede estar en riesgo de transmitir infecciones pero no necesariamente es contagiosa en la actualidad LIMITACIONES 1 Se le recomienda al usuario de este kit leer cuidadosamente y entender el inserto del empaque Es necesaria estricta adherencia al protocolo para obtener resultados confiables En particular el muestreo correcto y pipeteo del reactivo junto con un lavado y coordinaci n de los pasos de incubaci n cuidadoso son esenciales para lograr resultados precisos 2 Este kit est dise ado para medir el anticuerpo IgG en las muestras de pacientes Resultados positivos en neonatos deben ser interpretados con precauci n debido a que IgG maternal es transmitido de forma pasiva de la madre al feto antes del nacimiento Los an lisis de IgM son generalmente indicadores mas utiles de infecci n en ni os de menos de 6 meses de edad 3 Las
9. adas de reactivos en blanco 4 Incubar cada pozo a temperatura ambiente 21 a 25 C por veinte 20 2 minutos 5 Aspirar o sacudir el l quido de los pozos Si se est usando un equipo de lavado autom tico o semi autom tico agregar 250 300 uL de Tamp n de Lavado Diluido a cada pozo Aspirar o sacudir y voltee la placa sobre papel absorbente para remover todo el l quido Repita el procedimiento de lavado dos veces para un total de tres 3 lavados para equipos semi autom ticos o manuales o cuatro 4 veces para un total de cinco 5 lavados para equipo autom tico Luego del lavado final seque la placa sobre papel absorbente para eliminar todo el l quido de los pozos NOTA IMPORTANTE En cuanto a los pasos 5 y 8 Un lavado insuficiente o excesivo provocar variaciones en el an lisis que afectar n la validez de los resultados Por lo tanto para mejores resultados se recomienda el uso de un equipo semi automatizado o automatizado configurado para dispensar un volumen que llenar completamente el pozo 250 300 mL Puede ser necesario un total de hasta cinco 5 lavados con el equipo automatizado Por favor contact al DAI si existen preguntas en cuanto al equipo de lavado autom tico Remover completamente el Tamp n de Lavado luego del ltimo lavado es cr tico para el desempe o preciso del test Tambi n aseg rese de que no queden burbujas en los pozos 6 Agregue 100 uL de Conjugado en cada pozo incluyendo el pozo de
10. de anticuerpo en el suero puede leerse en un espectrofot metro adecuado o en un lector de placas de pocillos ELISA MATERIALES SUMINISTRADOS Cada kit contiene los siguientes componentes en suficiente cantidad para realizar el n mero de tests indicados en la etiqueta del empaque 1 Placa de microan lisis cubierta de ant geno 96 pozos 12 tiras 1x8 configuradas 96T una placa 480T cinco placas 2 Diluyente de Suero listo para usarse Contiene proclina 0 1 como preservativo pH 7 5 0 2 96T una botella 30 mL 480T dos botellas 60 mL cada una 3 Calibrador Cutoff Suero humano Azida de Sodio 0 1 y penicilina estreptomicina 0 01 agregado como preservativo con factores espec ficos del kit impresos en la etiqueta del frasco 96T un frasco 0 4 mL 480T un frasco 0 800 mL 4 Control Positivo Alto suero humano Azida de sodio 0 1 y penicilina estreptomicina 0 01 agregado como preservativo con el rango establecido impreso en la etiqueta del frasco 96T un frasco 0 4 mL 480T un frasco 0 800 mL 5 Control Positivo Bajo suero humano Azida de sodio 0 1 y penicilina estreptomicina 0 01 agregado como preservativo con el rango establecido impreso en la etiqueta del frasco 96T un frasco 0 4 mL 480T un frasco 0 800 mL 6 Control Negativo suero humano Azida de sodio 0 1 y penicilina estreptomicina 0 01 agregado como preservativo con el rango establecido impreso en la etiqueta del frasco 96T
11. e tanto el VIH como la Hepatitis B u otros agentes infecciosos est n ausentes las muestras y los reactivos basados con componentes humanos deber an ser manejados como si fuesen capaces de transmitir agentes infecciosos Nota El Centro para el Control de Enfermedades y el Centro para Dispositivos y Salud Radiol gica recomiendan que los agentes potencialmente infecciosos sean manejados con un Nivel 2 de Seguridad Biol gica 2 Los componentes en este kit han sido evaluados para control de calidad como una unidad de Lote Maestro No mezcle los componentes de diferentes n meros de lotes excepto el Substrato Cromog nico y el Tamp n de Lavado El diluyente de suero suministrado con el kit IgG puede s lo ser usado con otros kits IgG y el Diluyente de Suero suministrado con kit IgM puede s lo ser usado con otros kits IgM No mezcles los componentes con los de otros fabricantes 3 No use reactivos que hayan pasado la fecha de expiraci n marcada en la etiqueta del empaque 4 Todos los Reactivos deben estar a temperatura ambiente 21 a 25 C antes de realizar el an lisis Tome solamente el volumen de reactivos que sean necesarios No vierta los reactivos de nuevo en los frascos ya que pueden contaminarse 5 Antes de abrir los frascos de Controles y Calibradores golpear con firmeza sobre la mesa de trabajo para asegurar que todo el l quido est en la parte inferior del vial 6 Usar solamente agua destilada o deshionizada y cristaler a
12. eratura ambiente TIEMPO TOTAL DE INCUBACI N 80 minutos 450nm REFERENCIAS l Falk R J and Jennet J C 1988 Anti neutrophil cytoplasmic autoantibodies with specificity for myeloperoxidase in patients with systemic vasculitis and idiopathic necrotizing and crescentic glomerolonephritis New England J Med 318 1651 7 2 Kallenbarg C G M et al 1991 Autoimmunity to lysoomal enzymes new clues to vasculitis and glomerulonephritis Immunol Today 12 61 4 3 Falk R J et al 1990 Clinical Course of Anti Neutrophil Cytoplasmic Autoantibody associated Glomerolonephritis and Systematic Vasculitis Am Intern Med 113 656 63 4 Nolle B et al 1989 Anticytoplasmic Autoantibodies Their Immunodiagnostic Value in Wegener Granulomatosis Am Intern Med 111 28 40 5 Niles J L et al 1989 Wegener s Granulomatosis Autoantigen is a Novel Neutrophil Serine Proteinase Blood 74 1888 93 6 Gallicchio M C and Savige J S 1991 Detection of Antimyeloperoxidase and anti elastase antibodies in vasculitides and infections Clin Exp Immunol 84 232 7 7 Hagen E C et al 1993 Antineutrophil Cytoplasmic Autoantibodies A review of the Antigens Involved the Assays and the Clinical and Possible Pathogenic Consequences Blood 81 1996 2002 8 CDC NIH Guidelines Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 2nd Edition 1993 9 Procedures for the Collection of Diagnostic Blood Specimens by Venipuncture App
13. muestras recogidas muy temprano en el curso de una infecci n pueden no tener niveles detectables de IgG En tales casos se recomienda realizar un an lisis IgM o tomar una segunda muestra de suero de 14 a 21 d as despu s de ser analizados en paralelo con la muestra original para determinar la seroconversi n 4 Las muestras que siguen siendo dudosas tras repetir la prueba debe ser analizado de nuevo por un m todo alternativo por ejemplo un an lisis de inmunofluorescencia IFA Si los resultados siguen siendo equ vocos luego de repetir la prueba entonces se deben tomar muestras adicionales 5 Los resultados de la determinaci n de anticuerpos en una sola muestra no deber an ser usados para diagn stico de infecciones recientes Muestras pares aguda y de convalecencia deben ser recolectadas y evaluadas concurrentemente para buscar seroconversi n o un aumento significativo en el nivel del anticuerpo 6 Los valores obtenidos de este an lisis estan destinado a ser s lo una ayuda para el diagn stico Cada medico debe interpretar los resultados a la luz de la historia del paciente descubrimientos f sicos y otros procedimientos de diagn sticos Suero Diluido Agregar a los pocillos 100 pL 30 minutos a temperatura ambiente 30 minutos a temperatura ambiente Agregar 100ul de Conjugado Agregar 1001 de Soluci n TMB 15 minutos a temperatura ambiente Agregar 1001 de Parada H20 504 1H f 5 minutos a temp
14. r que las muestras pasen por ciclos de descongelamiento y congelamiento y as degradar el anticuerpo Muestras que sean almacenadas de manera no apropiada o sean objeto de m ltiples congelamientos y descongelamientos pueden dar resultados falsos 4 Si se han de recolectar sueros en pareja se deben tomar muestras agudas tan pronto como sea posible luego del inicio de los s ntomas y luego de siete d as despu s del inicio La segunda muestra debe ser recolectada de 14 a 21 d as luego de que la muestra aguda fue tomada Ambas muestras deben ser evaluadas por duplicado en la misma placa para comprobar un aumento significativo S1 la primera muestra fue obtenida muy tarde durante el curso de la infecci n no se detectar un aumento significativo PREPARACI N PARA EL AN LISIS 1 Todos los reactivos deben ser removidos de la refrigeraci n y deben ser llevados a temperatura ambiente antes de usar 21 y 28 C Devuelva todos los reactivos a la refrigeraci n r pidamente despu s del uso 2 Todas las muestras y controles deben ser mezcladas usar mezclador vortex antes de usarse 3 Diluya 60 ml de tamp n de lavado de 20x Tipo 1 en 1 2 L con agua destilada y o deshionizada H20 Mezcle bien PROCEDIMIENTO GENERAL Nota Para evaluar sueros por duplicado ambas muestras de suero deben ser evaluadas por duplicado y hechas en la misma placa Se recomienda que los pares de suero sean realizados en pozos adyacentes l Coloque el n mero
15. roved Standard NCCLS Publication H3 A National Committee for Clinical Laboratory Standards Villanova PA 10 Engvall E and P Perlman 1971 Enzyme Linked Immunosorbent Assay ELISA Quantitative Assay of Immunoglobulin G Immunochemistry 8 871 874 11 Engvall E and P Perlman 1971 Enzyme Linked Immunosorbent Assay ELISA Peeters H ed In Protides of the Biological Fluids Proceedings of the Nineteenth Colloquium Brugge Oxford Pergamon Press pp 553 556 12 Engvall E K Jonsson and P Perlman 1971 Enzyme Linked Immunosorbent Assay II Quantitative Assay of Protein Antigen Immunoglobulin G By Means of Enzyme Labelled Antigen and Antibody Coated tubes Biochem Biophys Acta 251 427 434 13 Van Weeman B K and A H W M Schuurs 1971 Immunoassay Using Antigen Enzyme Conjugates FEBS Letter 15 232 235 14 NCCLS 1991 National Committee for Clinical Laboratory Standard Internal Quality Control Testing Principles amp Definition NCCLS Publication C24 A 15 http www cap org html ftpdirectory checklist html 1998 Laboratory General CAP College of American Pathology Checklist April 1998 Pp 28 32 16 NCCLS 1997 National Committee for Clinical Laboratory Standard Preparation and testing of Reagent Water in the Clinical Laboratory NCCLS Publication C3 A3 DIAGNOSTIC AUTOMATION INC 23961 Craftsman Road Suite E F Calabasas CA 91302 Tel 818 591 3030 Fax 818 591 8383 ISO 13485 2
16. s y Negativos entre 2 y 8 C 5 Almacene el Diluyente de Suero y 20X de Tamp n de Lavado entre 2 y 8 C 6 Almacene el Substrato de Crom geno entre 2 y 8 C 7 Almacene el Tamp n de Lavado1X diluyente a temperatura ambiente 21 a 25 C por hasta 5 d as o 1 semana entre 2 y 8 C Nota Si la temperatura de conservaci n se mantiene constante los reactivos y el sustrato permanecer n estables hasta la fecha de vencimiento del kit Se tomaron precauciones en la fabricaci n de este producto para proteger los reactivos de contaminaci n y agentes bactereoest ticos han sido agregados a los reactivos l quidos Se debe tener cuidado para proteger los reactivos en este kit de la contaminaci n RECOLECI N DE MUESTRAS 1 Maneje el suero y la sangre como si fuesen capaces de transmitir agentes infecciosos 2 El rendimiento ptimo de los kits de ELISA DAI depende de la utilizaci n de muestras de suero nuevas claras no hemolizado no lip mico no ict rico Un volumen m nimo de 50 ml de suero es recomendado en caso de que se requiera repetir la prueba Las muestras deber an ser recolectadas as pticamente La separaci n temprana del coagulo minimiza la hem lisis en el suero 3 Almacene el suero entre 2 y 8 C si la prueba se llevara a cabo en dos d as Si las muestras van a ser guardadas por periodos m s largos almacene a 20 C o a temperaturas m s fr as No use un congelador de escarcha porque pueden origina
17. tes condiciones 1 Calibrador y los controles deben procesarse con cada prueba 2 Reactivo en Blanco cuando es le do en contra del reactivo en blanco al aire debe ser de lt 0 150 Absorbancia A a 450 nm 3 El Control Negativo debe ser de lt 0 250 A a 450 nm cuando es le do contra el reactivo blanco al aire 4 Cada Calibrador debe ser de gt 0 250 Absorbancia a 450 nm cuando es le do contra el reactivo blanco al aire 5 El Control Positivo debe ser de gt 0 500 Absorbancia a 450 nm cuando es le do en contra el reactivo blanco 6 DAI recomienda que un Control Positivo de reactividad conocida sea incluido en cada an lisis que se ejecute como parte del programa del usuario el control de calidad 7 Los valores del ISR o Immune Status Ration Raci n de Estado Inmune para el control positivo y negativo debe estar en el rango respectivo de acuerdo a las etiquetas impresas en los frascos Si los valores de los controles no est n dentro de los valores respectivos el test debe ser considerado inv lido y debe ser repetido 8 Si los citeriores previamente mencionados no se cumplen en la repetici n de la prueba contacte el DAI Technical Service Servicio T cnico del DAI INTERPRETACI N DE LOS RESULTADOS 1 Multiplique la absorbancia media de los calibradores por el factor asignado Este es el valor del calibrador El factor es espec fico del Lote Maestro y est registrado en la lista de embalaje del kit y en l
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