saneamiento de cítricos microinjerto de ápices
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1. Se ha demostrado que los principales pat genos transmisibles por injerto en los c tricos pueden ser eliminados a trav s del microinjerto de pices caulinares in vitro Los pat genos que m s f cilmente se eliminan por esta v a son los viroides causantes de exocortis y cachexia S citri as como los virus causantes de la tristeza de los c tricos infection variegation y vein enation con xito en el 100 de los casos o pr ximo a esa cifra Resultan m s dif ciles de eliminar con esta t cnica los virus que provocan tatter leaf dweet mottle y psorosis entre otros Sin embargo se ha encontrado que si se aumenta hasta 32 C la temperatura a la que se desarrollan los brotes que se emplean en el microinjerto se elevan considerablemente los porcentajes de plantas sanas que se obtienen a partir de plantas enfermas con algunos pat genos por lo que en varios programas de saneamiento se emplea de forma rutinaria la combinaci n del microinjerto con tratamientos de termoterapia Adem s del pat geno de que se trate y de la temperatura a la que se desarrollen los brotes como se se al anteriormente el tama o del pice microinjertado influye en el porcentaje de plantas sanas resultantes de la t cnica de microinjerto Independientemente de los porcentajes que se alcancen en el prendimiento de los microinjertos y el saneamiento lo que se pretende es obtener una fuente de material de propagaci n libre de pat genos a partir de una selecci2. Los recursos gen ticos de c tricos y la biotecnolog a Carta Circular de la RIAC 16 4 8
3. a las que se inactivan los pat genos termosensibles Aunque resulta exitosa para eliminar un n mero considerable de pat genos en material de c tricos infectado la termoterapia presenta como inconvenientes que algunos cultivares son sensibles a las altas temperaturas y que es ineficaz en la eliminaci n de ciertos pat genos como los virus yellow vein y dweet mottle Spiroplasma citri causante de stubborn as como los viroides causantes de exocortis y cachexia de amplia distribuci n e Microinjerto de pices caulinares in vitro El cultivo de pices caulinares in vitro que resulta eficaz para obtener plantas libres de pat genos en numerosas especies vegetales no ha resultado exitoso en los c tricos por no haberse alcanzado regeneraci n de plantas completas a partir de esos pices Como alternativa para lograr plantas de c tricos libres de pat genos se ha desarrollado la t cnica de microinjerto de pices caulinares in vitro Esta t cnica constituye en la actualidad la v a por excelencia para disponer del material de propagaci n certificado que se lleva a las plantaciones comerciales garantizar el estado sanitario de las accesiones de un banco de germoplasma de c tricos para su utilizaci n en los programas de mejoramiento gen tico y conservar adecuadamente estos valiosos recursos fitogen ticos El microinjerto ha demostrado ser eficaz en la eliminaci n de todos los pat genos que se han intentado eliminar por esta v a incl
4. los descendientes nucelares de c tricos no constituyen actualmente una v a segura para el saneamiento de c tricos Por otra parte habr que cambiar las regulaciones en los programas de producci n de material de propagaci n certificado de modo que se incremente el control de las fuentes de rboles proveedores de semillas de los patrones as como las disposiciones internacionales para el movimiento de semillas con la inclusi n de la certificaci n apropiada para ello V AS DE OBTENCI N DE MATERIAL DE PROPAGACI N LIBRE DE PAT GENOS e Selecci n de rboles en campo Es posible encontrar en las plantaciones rboles con buenas caracter sticas hort colas que no presenten enfermedades lo cual requiere ser corroborado mediante diagn stico con las pruebas adecuadas y considerar entonces la factibilidad de tomarlos como fuente de material de propagaci n de determinados clones No obstante resulta dif cil tener xito en esta b squeda Atendiendo a los conocimientos actuales y al desarrollo de t cnicas altamente confiables en la eliminaci n de pat genos conocidos que ofrecen garant as m s amplias como se explica m s adelante no se recomienda esta v a para obtener material sano de c tricos e Termoterapia La termoterapia es el m todo cl sico de obtenci n de plantas libres de pat genos Consiste en someter las plantas infectadas durante per odos comprendidos entre semanas y meses a temperaturas elevadas 38 40 C
5. n infectada Este resultado puede alcanzarse con un m nimo de plantas microinjertadas que puedan suministrar yemas para propagar la variedad saneada una vez certificada mediante las pruebas de diagn stico que se considere oportuno realizar De esta forma las plantas sanas obtenidas constituyen el punto de partida del programa de producci n de material de propagaci n certificado de c tricos APLICACIONES DE LA T CNICA DE MICROINJERTO La t cnica de microinjerto de pices caulinares in vitro ha demostrado ser la v a m s eficaz para obtener material de propagaci n vegetativo libre de pat genos debido a que con su utilizaci n se pueden eliminar aquellos para los que no resulta eficaz la termoterapia Adem s las plantas obtenidas a trav s de microinjerto muestran caracter sticas morfol gicas id nticas a las de los rboles de origen Asimismo se puede garantizar el estado sanitario de una colecci n de variedades sometiendo al microinjerto a las accesiones que la integran De esta manera se logra la conservaci n adecuada de estos valiosos recursos naturales que a su vez resultan m s tiles para las investigaciones relacionadas con el fitomejoramiento y el intercambio internacional de germoplasma Por otra parte sobre la base del empleo del microinjerto se ha propuesto un m todo a trav s de cultivos in vitro para la introducci n de material de propagaci n vegetativo de c tricos con m nimo riesgo de importar enfermedades o
6. y la destreza manual del operador O Mantenimiento de las plantas microinjertadas Las plantas microinjertadas se cultivan en medio l quido compuesto por las sales minerales MS las vitaminas de White 100 mg L de meso inositol y 75 g L de sacarosa en tubos de ensayo con soporte de papel que se mantienen a 27 C con un r gimen de iluminaci n de 16 horas de luz y 8 de oscuridad Debe resaltarse que tambi n se ha conseguido un desarrollo satisfactorio de los microinjertos en cuartos de cultivo con luz natural o Trasplante de los microinjertos A las 5 8 semanas con al menos dos hojas expandidas las plantas microinjertadas pueden ser llevadas a condiciones ambientales externas Una posibilidad es realizar su trasplante directamente a macetas con un sustrato apropiado en condiciones de humedad y sombreado que favorezcan su desarrollo Otra alternativa es reinjertar sobre patrones vigorosos lo que permite acelerar el desarrollo de los microinjertos para disponer m s r pidamente del material de propagaci n libre de pat genos La labor del microinjerto se complementa necesariamente con las pruebas de diagn stico de pat genos que sea preciso realizar en cada caso para garantizar la calidad sanitaria del material de propagaci n obtenido De hecho al hacerse referencia a una planta sana o libre de pat genos lo que se puede asegurar es que est libre de los pat genos para los que las pruebas de diagn stico realizadas fueron negativas
7. SANEAMIENTO DE C TRICOS MICROINJERTO DE PICES CAULINARES IN VITRO Olga Mas Camacho Instituto de Investigaciones en Fruticultura Tropical La Habana Cuba riacOminaq gov cu INTRODUCCI N Las enfermedades causadas por virus viroides bacterias y fitoplasmas que ocasionan importantes p rdidas econ micas se encuentran ampliamente diseminadas en el mundo como consecuencia de la propagaci n por injerto y de la falta de control sanitario en los rboles tomados como fuente de yemas Aunque existen insectos vectores para algunas de esas enfermedades ha sido sin duda el hombre el principal transmisor de las mismas Esos pat genos presentes en las plantas de c tricos influyen negativamente y de forma determinante en su producci n longevidad vigor y calidad de la fruta adem s de que limitan el uso de varios patrones En la actualidad resulta imprescindible la utilizaci n de material de propagaci n certificado tanto desde el punto de vista gen tico como sanitario Adem s se deben adoptar las medidas necesarias para disminuir en lo posible los da os causados por los pat genos transmisibles por vectores en aras de lograr plantaciones con elevada producci n y de buena calidad PLANTAS DE ORIGEN NUCELAR UN COMENTARIO OBLIGADO La poliembrion a caracter stica de la mayor parte de los c tricos permite obtener plantas nucelares id nticas a la planta madre mediante la germinaci n convencional de semillas Para las variedades p
8. astidiosa in Sweet Orange Fruit and Seeds and its Transmission to Seedlings Phytopathology 93 8 953 958 Mas O A R os B Morales M Mirabal A Campos y M Gonz lez 1991 Metodolog a para la introducci n de material de propagaci n vegetativo de c tricos a trav s de cultivos in vitro Comunicaci n breve Centro Agr cola 18 3 75 78 Mas O R P rez A R os y M C P rez 1994 Introducci n en Cuba de variedades de c tricos utilizando t cnicas de cultivo in vitro Comunicaci n breve Levante Agr cola XXX 328 223 Navarro L 1991 Citrus Shoot tip Grafting and its Applications a Review Proc Int Soc Citriculture 1 452 456 Navarro L C N Roistacher and T Murashige 1975 Improvement of Shoot tip Grafting in vitro for Virus free Citrus J Amer Soc Hort Sci 100 5 pp 471 479 Navarro L J A Pina J Ju rez J F Ballester Olmos J M Arregui C Ortega A Navarro N Dur n Vila J Guerri P Moreno M Cambra A Medina and S Zaragoza 2002 The Citrus Variety Improvement Program in Spain in the Period 1975 2001 Proc 15 Conf IOCV pp 306 315 Navarro L y J Ju rez 2001 Aplicaciones de la biotecnolog a en los c tricos y otros cultivos Fruticultura Profesional n mero 118 mayo junio pp 19 32 Navarro L L Civerolo J Ju rez and S M Garnsey 1991 Improving Therapy Methods for Citrus Germplasm Exchange Proc 11 Conf IOCV pp 400 408 Ollitrault P y O M s 2000
9. ficie y se enjuagan varias veces con agua destilada est ril Las semillas se siembran en tubos de ensayo con medio de germinaci n compuesto por las sales minerales de Murashige y Skoog MS solidificado con agar donde permanecen en oscuridad constante a 27 30 C alrededor de dos semanas hasta que las pl ntulas alcanzan su desarrollo ptimo para su uso en el microinjerto O Preparaci n del pice Los pices caulinares para el microinjerto pueden obtenerse de diversas fuentes de brotes de los rboles enfermos seleccionados directamente en rboles que se encuentren en activa brotaci n vegetativa a partir de plantas de las selecciones de inter s injertadas que se mantienen en bolsas o macetas en las que puede inducirse la brotaci n de sus yemas defoli ndolas totalmente dos semanas antes de la fecha del microinjerto y a partir de v stagos cultivados in vitro Se utilizan brotes de entre 2 y 3 cm para evitar pices degenerados o en estado de abscisi n A cada brote se le eliminan las hojas mayores y se separa la parte terminal con una longitud de 1 cm Posteriormente se realiza la esterilizaci n de superficie por inmersi n en una soluci n de hipoclorito de sodio al 0 25 m s 0 1 de Tween 20 durante cinco minutos y se enjuaga repetidas veces con agua destilada est ril En condiciones as pticas y con el auxilio de un microscopio estereosc pico se eliminan las hojas restantes con excepci n de los tres primordios foliares m
10. oliembri nicas sin semillas y las variedades monoembri nicas se desarrollaron los cultivos jn vitro de vulos y de nucelas respectivamente mediante los cuales se pueden lograr descendientes nucelares id nticos a la planta madre Sobre esta base independientemente de los inconvenientes de la presencia de caracteres juveniles en estos descendientes durante a os se ha considerado la obtenci n de plantas de origen nucelar como una alternativa para lograr c tricos libres de pat genos atendiendo a que hasta fecha relativamente reciente no exist an claras y probadas evidencias de transmisi n de pat genos a trav s de las semillas de los frutos de un rbol enfermo Sin embargo a la luz de los conocimientos actuales hay que reformular esta consideraci n pues existen informes de investigaciones que han demostrado la transmisi n de pat genos de c tricos a trav s de las semillas Se ha probado que Xylella fastidiosa causante de la clorosis variegada de los c tricos CVC puede infectar y colonizar tejidos de los frutos de naranjo dulce y puede transmitirse de las semillas a las plantas que se originan de ellas Tambi n se ha demostrado la transmisi n del virus del moteado de la hoja de los c tricos CBLV a trav s de semillas de citrange Troyer Poncirus trifoliata L Raf x Citrus sinensis L Osb kumquat Nagami Fortunella margarita Lour Swingle y naranjo agrio Citrus aurantium L Estos resultados indican que
11. plagas con resultados satisfactorios Este m todo ha sido utilizado con xito en varios pa ses Es importante se alar que mediante el microinjerto ha sido posible separar distintos pat genos y cepas diferentes de un pat geno presentes en una misma planta lo cual resulta de inter s para investigaciones relacionadas con la virolog a de los c tricos Por ltimo debe resaltarse que la t cnica de microinjerto desarrollada para el saneamiento de c tricos ha tenido aplicaci n en otras especies le osas de frutales Considerando todas las ventajas del microinjerto de pices caulinares in vitro sobre otras v as para la obtenci n de material de propagaci n libre de pat genos y teniendo en cuenta los importantes resultados que tanto en el saneamiento como en la introducci n de variedades se han alcanzado en diversos pa ses citr colas se recomienda el empleo de esta t cnica como base de los programas de saneamiento dentro de los sistemas de producci n de material de propagaci n certificado de c tricos que urge desarrollar en todos aquellos pa ses donde la propagaci n a n no se realiza sobre la base de una garant a sanitaria BIBLIOGRAF A e Guerri J J A Pina M C Vives L Navarro and P Moreno 2004 Seed Transmission of Citrus leaf botch virus Implications in Quarantine and Certification Programs Plant Disease 88 8 906 Li W B W D Pria Jr P M Lacava X Qin and J S Hartung 2003 Presence of Xylella f
12. s j venes O Microinjerto Trabajando en condiciones de esterilidad la pl ntula patr n se extrae del tubo de ensayo se decapita dejando aproximadamente 1 5 cm del epicotilo se acorta la ra z hasta 4 6 cm y se eliminan los cotiledones junto con sus yemas axilares Aunque se han ensayado diversas formas de injerto se utiliza mayormente la incisi n T invertida con dimensiones de 1 mm en el extremo del epicotilo decapitado Con el empleo de instrumentos de microdisecci n se aisla el pice caulinar menor de 0 2 mm compuesto por el meristemo apical m s los dos o tres subyacentes primordios foliares y se coloca con la superficie de corte basal en contacto con la superficie cortical horizontal de la incisi n T invertida practicada en el patr n Los cortes para la preparaci n del patr n y el aislamiento del pice deben ser tan perfectos como sea factible y las operaciones del microinjerto deben efectuarse con la m xima rapidez posible para evitar la desecaci n de los tejidos Se ha demostrado que aunque se logra mayor prendimiento del microinjerto con el empleo de pices caulinares mayores existe una relaci n inversa entre el tama o de estos y el porcentaje de plantas sanas obtenidas Adem s del tama o del pice otros factores influyen decisivamente en el prendimiento del microinjerto como son el patr n escogido la variedad del pice microinjertado la utilizaci n de patrones etiolados la edad de las pl ntulas patr n
13. uyendo aquellos para los que la termoterapia no es exitosa adem s de que las plantas sanas obtenidas por microinjerto presentan caracter sticas id nticas a la planta madre El procedimiento descrito por Navarro y col 1975 para el microinjerto de pices caulinares in vitro consta de las etapas que a continuaci n se relacionan o Preparaci n del patr n Es necesario disponer de patrones logrados por germinaci n de semillas in vitro Las semillas que se utilicen deben proceder de rboles libres de pat genos al menos de aquellos que se transmiten por semillas Te ricamente cualquier patr n que sea compatible con la variedad que sobre l se injerte puede ser usado para el microinjerto A pesar de que el patr n m s utilizado ha sido el citrange Troyer Poncirus trifoliata L Raf X Citrus sinensis L Osb se han empleado Poncirus trifoliata limonero Rugoso Citrus jambhiri Lush cidro Etrog Citrus medica L y Citrus macrophylla Wester entre otros La utilizaci n de estos patrones se debe a diversas causas como son la facilidad que ofrecen los trifoliados en la identificaci n de los rebrotes del patr n para ser eliminados la compatibilidad a la que se hac a referencia y los resultados del empleo de patrones m s vigorosos Se eliminan manualmente los tegumentos de las semillas se tratan por inmersi n en una soluci n de hipoclorito de sodio al 0 7 durante diez minutos para la esterilizaci n de su super
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