Aislamiento e identificación de cepas de Azospirillum sp. en pasto
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1. Selection of Azospirillum isolations with biofertilizer potential Although it was originally suggested that the action mechanism of Azospirillum to promote plant growth was its ability to fix atmospheric nitrogen at present alternative mechanisms have been proposed such as the production of plant growth regulators or phytohormones Carcafio Montiel et al 2006 For such reason the selection of Azospirillum strains was done taking into consideration their nitrogen fixation activity and the production capacity of indolic compounds among which statistical differences were observed for all the evaluated isolations table 4 Nitrogenase activity of the different isolations The strain Sp7 A brasilense recorded the highest value of acetylene reduction with 845 6 nmol C H h mL Regarding the native isolations the strain SRGM2 showed an acetylene reduction activity of 10 72 nmol C H h mL similar to the one reported for the isolations of A lipoferum N7 and A brasilense N8 with a nitrogenase activity of 6 6 and 7 95 nmol C H h mL respectively Mehnaz and Lazarovits 2006 SRGM3 according to its acetylene reduction activity of 44 69 nmol CH h mL was similar to the Azospirillum strains isolated from wild corn Teocintle with nitrogenase activity of up to 46 44 nmol C H h mL Carcafio Montiel et al 2006 On the other hand SRGM4 was more efficient with a value of 123 70 nmol C H h mL similar to the2. Duncan s comparison test at 5 probability was used with the statistical program SAS version 9 1 3 Isolation and phenotypical identification of Azospirillum spp The vials of the higher dilutions with positive growth were selected and replicated in a new semisolid medium From this film the isolation was done in Congo Red agar dishes to select scarlet red colonies Rodriguez Caceres 1982 and in Batata agar to select pink small and structured colonies after a week of incubation at 32 C D bereiner et al 1995 The bacterial cells were observed under a microscope with 1000x magnification and a smear was done in distilled water to describe the shape and movement of the cells The characteristics of spiral mobility growth in Batata and Congo Red agar were compared to the reference strains Azospirillum brasilense Sp7 and Azospirillum lipoferum Y2 Their similarities were estimated through the JACCARD coefficient and were grouped by the analysis between groups to make a dendrogram using the program SPSS 10 0 for Windows Selection of the Azospirillum spp strains with biofertilizer potential The presumptive isolations for the Azospirillum genus were evaluated according to the activity of the nitrogenase enzyme and the production of plant growth promoting indolic substances The strains were replicated in Congo Red agar and cellular suspensions were obtained adjusted to a cell concentration of 1 10 UFC mL 30 mL of 2 DYGS broth were inoc
3. Se tomaron 25uL y se mantuvieron en bafio termostatado durante 15 minutos Despu s se centrifug a 13 000 rpm por min El sobrenadante se descart y el precipitado se resuspendi en 1 mL de agua Milli Q est ril La amplificaci n de la regi n 16S rRNA se realiz en 25uL de una mezcla de reacci n de Buffer 1x MgSO 1 5 mM dNTP 0 2 mM Primer 27F Edwards et al 1989 y 1492R 0 2 mM Weisburg et al 1991 0 25uL de Taq DNA Polimerasa y 1 5uL de DNA molde muestra del aislamiento Las condiciones del termociclador fueron un ciclo inicial de denaturaci n 94 C por 5 min 50 ciclos de denaturaci n 94 C por 30 seg anillaje 66 C por 30 seg y extensi n 72 C por 1 min y tres ciclos de extensi n final 72 C por 10 min Los fragmentos amplificados se observaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 0 8 en TAE acondicionado con 0 5 ng mL de bromuro de etidio para visualizar las bandas resultantes El ADN amplificado se purific utilizando QIAquick PCP Purification Kit Protocol de QIAquick8 Spin Handbook de QUIAGEN se cuantific en un NanoDrop Spectrophotometer ND 1000 y se analiz en el programa ND 1000 V 3 3 0 a una longitud de onda de 260 nm El producto amplificado se secuenci en un equipo ABI PRISM Genetic Analyzer que realiza la secuenciaci n autom tica de fragmentos de DNA marcados con fluorocromos El resultado se analiz a trav s de BLAST Basic Local Alignment Search Tool en www ncbi nlm nih gov
4. muestras analizadas se emple la prueba de comparaci n de Duncan al 5 de probabilidad utilizando el programa estad stico SAS versi n 9 1 3 Aislamiento e identificaci n fenotipica de Azospirillum spp Se seleccionaron los viales de las diluciones m s altas con crecimiento positivo y se replicaron en un nuevo medio semis lido A partir de esta pel cula se hizo el aislamiento en placas de agar Rojo Congo para seleccionar colonias rojo escarlata Rodr guez C ceres 1982 y en agar Batata para seleccionar colonias rosadas peque as y estructuradas despu s de una semana de incubaci n a 32 C D bereiner et al 1995 Las c lulas bacterianas se observaron en microscopio con un aumento de 1000x y se realiz un frotis en agua destilada para describir la forma y el movimiento de las c lulas Las caracter sticas de movilidad en espiral crecimiento en agar Batata y Rojo Congo se compararon con las de las cepas de referencia Azospirillum brasilense Sp7 y Azospirillum lipoferum Y2 Sus semejanzas se estimaron por el coeficiente de JACCARD y se agruparon por el m todo del an lisis entre grupos para realizar un dendrograma utilizando el programa SPSS 10 0 para Windows Selecci n de las cepas de Azospirillum spp con potencial biofertilizante Los aislamientos presuntivos para el g nero Azospirillum se evaluaron seg n la actividad de la enzima nitrogenasa y la producci n de sustancias ind licas promotoras del crecimiento vegetal La
5. BLAST Blast cgi Resultados y Discusi n Efecto de la poca clim tica y el manejo agron mico del pasto guinea en las poblaciones de Azospirillum Seg n el an lisis de varianza el recuento de la poblaci n de Azospirillum no present diferencias significativas seg n la poca clim tica y el manejo agron mico de la guinea Sin embargo esta poblaci n tendi a ser mayor en la poca de lluvia bajo un manejo agroecol gico del pasto guinea en la E E Motilonia con respecto a la poca de sequ a en las dos localidades lo que demuestra la influencia de los factores ambientales en la poblaci n bacteriana tabla 1 Tabla 1 Poblaci n de Azospirillum en el pasto guinea seg n la poca clim tica Table 1 Azospirillum population in Guinea grass according to the season Finca poca NFb LGI clim tica N mero de c lulas g N mero de c lulas g E E Motilonia Lluvia 6 02 0 11 5 79 0 33 Fernambuco Lluvia 5 58 0 28 5 75 0 21 E E Motilonia Sequ a 5 16 0 72 5 35 0 56 Fernambuco Sequia 4 89 0 31 5 60 0 79 An lisis estad sticos con datos transformados en Log Medias de tres repeticiones Brasil et al 2005 reportaron una disminuci n del n mero de bacterias diazotr ficas en las raices y en el suelo de las gramineas Axonopus purusii Elyonurus muticus y Brachiaria humidicola en la poca seca Por su parte Reis Junior et al 2004 obtuvieron poblaciones de A amazonense de 5 81 unidades log en raices de Brachia
6. Herbaspirillum na produ o de compostos ind licos em pl ntulas de milho e arroz Pesg Agropec Bras 39 10 987 Radwan T E E et al 2005 Aera o e adi o de sais na produ o de cido indol ac tico por bact rias diazotr ficas Pesg Agropec Bras 40 10 997 Reis Junior R B et al 2004 Identifica o de isolados de Azospirillum amazonense associados a Brachiaria spp em diferentes pocas e condi es de cultivo e produ o de fitormonio pela bact ria R Bras Ci Solo 28 103 Rodr guez C ceres E A 1982 Improved medium for isolation of Azospirillum spp Applied and Environmental Microbiology 44 990 Steenhoudt O amp Vanderleyden J 2000 Azospirillum a free living nitrogen fixing bacterium closely associated with grasses genetic biochemical and ecological aspects FEMS Microbiology Reviews 24 487 Weisburg W G et al 1991 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study J Bacteriol 173 697 Recibido el 16 de marzo del 2009 Aceptado el 15 de marzo del 2010 Isolation and identification of Azospirillum sp in Guinea grass Panicum maximum Jacq of the Valle del Cesar Abstract The effect of environmental factors of the Valle del Cesar and the agronomic management of Guinea grass Panicum maximum Jacq on the bacterial population of the Azospirillum genus in semisolid NFb and LGI culture media was evaluated for which an experimental design was used in divided plots with a 2 climatic season
7. aislamientos La cepa Sp7 4 brasilense registr el mayor valor de reducci n de acetileno con 845 6 nmol CH h mL Con respecto a los aislamientos nativos la cepa SRGM2 present una actividad de reducci n de acetileno de 10 72 nmol CH h mL similar a lo reportado por los aislamientos de A lipoferum N7 y A brasilense N8 con una actividad nitrogenasa de 6 6 y 7 95 nmol C H h mL respectivamente Mehnaz y Lazarovits 2006 SRGM3 seg n su actividad reductora de acetileno de 44 69 nmolC H h mL fue similar a las cepas de Azospirillum aisladas de maiz silvestre Teocintle con actividad nitrogenasa hasta de 46 44 nmol C H h mL Carca o Montiel et al 2006 Por su parte SRGM4 fue mas eficiente con un valor de 123 70 nmol CH h mL similar a lo reportado para la cepa 4zospirillum doebereinerae aislada de Miscanthus sinensis cv Giganteus que present un valor de 100 nmol CH h mL para la reducci n de acetileno Eckert et al 2001 Los dem s aislamientos presentaron valores de ARA inferiores a 1 nmol C H h mL similar a las cepas de A brasilense Cd y Az39 con 0 162 y 0 1 nmol C H h mL respectivamente Perrig et al 2007 Aunque se observ una variaci n en la actividad enzim tica de la fijaci n biol gica de nitr geno pudo demostrarse que Azospirillum es un g nero importante asociado a las gram neas tropicales capaz de reducir el nitr geno atmosf rico en amonio bajo condiciones microaerofi
8. for grass roots Brasil et al 2005 as in the case of the pastures that respond with increases in their growth and yield when they are inoculated with Azospirillum spp The secretion of plant growth promoting substances such as auxins gibberellins and cytoquinines by Azospirillum seems to be partially involved in this effect Reis Junior et al Radwan et al 2005 Kuss et al 2007 Taking into consideration that in Colombia there is not any record of the evaluation of populations of this bacterium associated to pastures until now the objective of this work was to begin the study of native Azospirillum strains in Guinea grass in Valle del Cesar as the first step towards the search for isolations with biofertilizer potential Materials and Methods Determination of the effect of the rainy and dry seasons on the Azospirillum populations in Guinea grass Samples were taken from the rhizospheric soil and the whole Guinea grass plant in the rainy season in September 2006 158 6 mm rainfall and 28 1 C temperature and in the dry season in February 2007 0 mm rainfall and 31 C temperature Both selected sites show contrasting conditions regarding soil management At the E S Motilonia agronomic practices are developed such as the incorporation of organic matter to the soil planting planning and rational grazing at the Fernambuco farm overgrazing and intensive laboring of the soil are practiced The rhizospheric soil was obtained by remov
9. puedan desarrollar este mecanismo de colonizaci n y es por esto que se han encontrado en mayor numero colonizando las raices ubicadas en las capas de mucigel o penetrando las c lulas corticales de la ra z de diferentes plantas Sin embargo las especies de Azospirillum tienen mecanismos especificos para interactuar con las raices y colonizar su interior e incluso ir penetrando el tejido foliar a trav s de la actividad enzimatica celulolitica y pecnitolitica invadiendo los espacios intercelulares e incluso traslocandose a trav s de los vasos vasculares hacia el tallo y las hojas Steenhoudt y Vanderleyden 2000 Caracterizacion fenotipica de los aislamientos obtenidos Se seleccionaron 16 aislamientos del g nero Azospirillum seg n las caracter sticas fenotipicas los cuales se obtuvieron de las muestras de suelo rizosf rico las ra ces y las hojas del pasto cultivado en la E E Motilonia de Corpoica y la finca Fernambuco tabla 3 En la figura 1 se observa el dendrograma seg n la matriz de similitud y un an lisis entre grupos de los 16 aislamientos con las cepas de referencia Sp7 A lipoferum y Y2 A brasilense Se obtuvieron tres grupos con diferentes valores de distancia entre ellos El grupo I present cuatro aislamientos muy cercanos a las cepas Sp7 y Y2 El grupo II mostr cuatro aislamientos pero result distante un 20 del grupo I Por ltimo el n mero III incluy ocho aislamientos y conform un grupo independiente
10. recuento de c lulas en las hojas present el valor de poblaci n m s alto seguido de las raices y el suelo rizosf rico tabla 2 Tabla 2 Poblaci n de Azospirillum asociada al suelo rizosf rico las ra ces y las hojas del pasto guinea en el Valle del Cesar Table 2 Azospirillum population associated to the rhizospheric soil roots and leaves of Guinea grass in the Valle del Cesar Muestra NFb LGI N mero de c lulas g N mero de c lulas g Hojas 5 74141 27 6 079 1 15 Ra ces 5 376 0 60 5 520 1 76 Suelo rizosf rico 5 128 0 85 5 275 0 0 Analisis estadisticos con datos transformados en Log Medias de tres repeticiones Medias seguidas con la misma letra en cada medio evaluado no presentan diferencia significativa entre si por el test de Duncan P lt 0 05 Estos resultados son similares a los reportados por Brasil et a 2005 en tres gramineas quienes observaron un numero mayor de bacterias en las hojas en el medio NFb y valores similares estadisticamente en medio LGI La presencia de las bacterias en todas las estructuras de la planta ha sido descrita en diversas investigaciones pues a pesar de que es considerada una rizobacteria y coloniza principalmente la zona de elongaci n de los pelos radiculares tambi n se ha encontrado en el interior de las ra ces y en la parte a rea de varias especies vegetales Brasil et al 2005 Brasil et al 2006 Kuss 2006 Probablemente todas las especies de Azospirillum
11. report for the strain Azospirillum doebereinerae isolated from Miscanthus sinensis cv Giganteus which showed a value of 100 nmol C oH h mL for acetylene reduction Eckert et al 2001 The other isolations showed ARA values lower than 1 nmol CH ht mL similar to the 4 brasilense strains Cd and Az39 with 0 162 and 0 1 nmol C H h mL respectively Perrig et al 2007 Although a variation was observed in the enzymatic activity of the biological nitrogen fixation it could be proven that Azospirillum is an important genus associated to tropical grasses capable of reducing the atmospheric nitrogen in ammonium under microaerophilic conditions through the activity of the nitrogenase complex which has an iron molybdenum cofactor which is the reduction site of N and of the protein reductase dinitrogenase which transfer electrons from an electron donor to the protein nitrogenase Steenhoudt and Vanderleyden 2000 Production of indolic hormones When the production of indolic compounds was quantified according to the studied isolations the strain RGM1 had a production of 45 18 ug mL of IAA followed by SRGM2 with 43 27 g mL of IAA which represent the highest values and Sp7 4 brasilense which recorded 40 170 ug mL of IAA The isolations SRGM4 RGM3 RGM6 HGF1 and HGF3 produced between 38 12 and 23 15 ug mL of IAA and the strain SRGM3 showed the lowest value 3 46 ug mL of IAA table 4 The production of indolic compounds of S
12. to interact with the roots and colonize their interior and even penetrate progressively the leaf tissue through the cellulolitic and pecnitolitic enzymatic activity invading the intercellular spaces and even being translocated through the vascular vessels towards the stem and leaves Steenhoudt and Vanderleyden 2000 Phenotypical characterization of the obtained isolations Sixteen isolations of the Azospirillum genus were selected according to the phenotypical characteristics which were obtained from the rhizospheric soil root and leaf samples of the pasture cultivated in the E S Motilonia of Corpoica and the Femambuco farm table 3 Figure 1 shows the dendrogram according to the similarity matrix and an analysis between groups of the 16 isolations with the reference strains SP7 A lipoferum and Y2 A brasilense Three groups were obtained with different distance values among them Group I showed four isolations very close to strains Sp7 and Y2 Group II showed four isolations but it was distant in 20 from group I Finally number III included eight isolations and formed an independent group with 25 distance from the first ones I and ID This first grouping allowed selecting eight isolations with a maximum of 20 distance with regards to strain Sp7 and Y2 The selected isolations were HGF3 SRGM4 SRGM3 SGRM2 RGM1 RGM3 RGM6 and HGF1 which were analyzed according to their nitrogen fixing activity and indoleacetic acid synthesis
13. Aislamiento e identificaci n de cepas de Azospirillum sp en pasto guinea Panicum maximum Jacq del Valle del Cesar Isolation and identification of Azospirillum sp in Guinea grass Panicum maximum Jacq of the Valle del Cesar Diana M Cardenas Maria F Garrido Ruth R Bonilla y Vera L Baldani Departamento de Biologia Universidad Francisco de Paula Santander Avenida Gran Colombia No 12E 96 Barrio Colsag Cucuta Colombia E mail dicarcaro hotmail com Corporaci n Colombiana de Investigaci n Agropecuaria CORPOICA Bogot Colombia Laboratorio de Microbiologia de Suelos Corporaci n Colombiana de Investigaci n Agropecuaria CORPOICA Bogota Colombia EMBRAPA Agrobiologia Seropedica Brasil Resumen Se evalu el efecto de factores ambientales del Valle del Cesar y el manejo agron mico del pasto guinea Panicum maximum Jacq sobre la poblaci n bacteriana del g nero Azospirillum en medios de cultivo semis lidos NFb y LGI para lo cual se utiliz un disefio experimental en parcelas divididas con un arreglo factorial de 2 pocas clim ticas lluvia y sequ a x 2 manejos agron micos agroec logico y extractivo x 3 muestras analizadas suelo rizosf rico ra ces y hojas Los resultados no revelaron diferencias estad sticas significativas lo que indica que esta bacteria puede mantener su poblaci n en condiciones de estr s por diferentes mecanismos fisiol gicos A partir de estas muestras se obtuvieron 16
14. IA Reis Junior et al 2004 A brasilense Cd y A lipoferum Br17 productoras de 58 71 y 63 49 ug mL de AIA Radwan et al 2005 y aislamientos de Azospirillum spp de plantas de maiz en M jico con valores de hasta de 49 65 ig mL de AIA Carca o Montiel et al 2006 Algunos estudios han demostrado la variaci n cuantitativa de esta actividad biofertilizante en cada cepa evaluada teniendo en cuenta la diversidad gen tica que presentan en cuanto a su capacidad de utilizar algunas fuentes de C y N la presencia de tript fano como precursor de los compuestos ind licos de sus rutas metab licas y la actividad enzim tica reguladas por diferentes genes que pueden expresarse por las condiciones de su ambiente natural Radwan et al 2004 Carca o Montiel et al 2006 las cuales variaron de acuerdo con la zona muestreada el estrato de la planta y la poca clim tica En muchos reportes Azospirillum es considerado el g nero bacteriano mas importante para el mejoramiento del crecimiento de las plantas o el rendimiento de los cultivos en diferentes pa ses Perrig et al 2007 especialmente por su alta producci n de reguladores de crecimiento vegetal Radwan et al 2004 como las auxinas varias giberelinas y citoquininas Bashan et al citados por Perrig et al 2007 y el cido 3 indolac tico AIA es la principal fitohormona producida por Azospirillum Radwan et al 2004 El AIA es una auxina conocida por estimular respuestas r pida
15. RGM3 is comparable to the ones reported by Perrig et al 2007 who recorded 2 9 ug mL of IAA for the strain Az39 recommended for corn and wheat in Argentina which indicates that this a concentration that allows plant growth promotion taking into consideration that these strains have been evaluated in grasses and selected for their optimum results The other strains showed values between 23 15 and 45 18 g mL of IAA which oscillate between those that have been recorded by different strains of A amazonense isolated from roots of Brachiaria spp in Brazil with 6 13 to 19 27 ug mL of IAA Reis Junior et al 2004 A brasilense Cd and A lipoferum Br17 producing 58 71 and 63 49 ug mL of IAA Radwan et al 2005 and isolations of Azospirillum spp from corn plants in Mexico with values up to 49 65 ug mL of IAA Carca o Montiel et al 2006 Some studies have shown the quantitative variation of this biofertilizer activity in each evaluated strain taking into consideration the genetic diversity they present regarding their ability to use some C and N sources the presence of tryptophan as precursor of the indolic compounds of their metabolic routes and the enzymatic activity regulated by different genes that can be expressed by the conditions of their natural environment Radwan et al 2004 Carca o Montiel et al 2006 which varied according to the sampled zone the plant stratum and the season In many reports Azospirillum is considere
16. afecta severamente su capacidad productiva y compromete la viabilidad econ mica de los sistemas ganaderos Lo anterior es ocasionado entre otros factores por el uso indiscriminado de fertilizantes qu micos principalmente como fuente de N el cual desempe a un papel importante junto con el P y el K para el crecimiento de las plantas Osorio 2007 Cordero et al 2008 La fjaci n biol gica de nitr geno realizada nicamente por bacterias es una alternativa viable ambiental y econ micamente para suplir la inclusi n de fuentes de N de origen sint tico ya que el nitr geno molecular N es la nica reserva inagotable en la biosfera En la rizosfera de los pastos tropicales y subtropicales est n presentes microorganismos fijadores de N diversos estudios han demostrado que existe una alta especificidad de los aislamientos obtenidos de diferentes ra ces de gram neas con respecto a la especie de diazotr fico encontrado es decir que los exudados radicales el pH del suelo y otras caracter sticas de la especie vegetal y del suelo podr an influir en la presencia de algunos g neros fijadores biol gicos Reis Junior et al 2004 Radwan ef al 2005 Estudios de m s de 20 a os indican que las bacterias del g nero Azospirillum tienen una especial afinidad por las ra ces de las gram neas Brasil et al 2005 como es el caso de los pastos que responden con incrementos en su crecimiento y rendimiento cuando son inoculados con Azospirill
17. aislamientos pertenecientes al g nero Azospirillum a los cuales se les evalu su actividad de reducci n de acetileno como indicador de la fijaci n biol gica de nitr geno y su capacidad en la producci n de compuestos ind licos como promotores del crecimiento vegetal Se seleccionaron las cepas SRGM2 SRGM3 y SRGM4 obtenidas de muestras de suelo rizosf rico de pasto guinea de la Estaci n Experimental Motilonia de Corpoica municipio Agust n Codazzi departamento del Cesar Estos aislamientos se caracterizaron molecularmente por el gen 16S rRNA y seg n el an lisis BLAST en la base de datos del GenBank y presentaron 93 de similitud con A lipoferum SRGM2 y SRGM3 y 94 con A brasilense SRGM4 Palabras clave Crecimiento fijaci n del nitr geno Azospirillum sp Abstract The effect of environmental factors of the Valle del Cesar and the agronomic management of Guinea grass Panicum maximum Jacq on the bacterial population of the Azospirillum genus in semisolid NFb and LGI culture media was evaluated for which an experimental design was used in divided plots with a 2 climatic seasons rainy and dry x 2 agronomic managements agroecological and extractive x 3 analyzed samples rhizospheric soil roots and leaves factorial arrangement The results did not reveal significant statistical differences which indicates that this bacterium can maintain its population under stress conditions by different physiological mechanisms From the
18. an experience certain morphological and biochemical changes to form structures similar to cysts which allow them to survive under adverse physical conditions particularly desiccation Sadasivan and Neyra cited by Joe et al 2009 On the other hand when the Azospirillum spp populations were compared in the rhizospheric soil roots and leaves of Guinea grass in NFb and LGI medium significant differences were recorded P lt 0 05 with regards to these three studied samples The recount of cells in the leaves was observed to show the highest population value followed by the roots and rhizospheric soil table 2 These results are similar to the ones reported by Brasil et al 2005 in three grasses who observed a higher number of bacteria in the leaves in the NFb medium and statistically similar values in LGI medium The presence of bacteria in all the structures of the plant has been described in diverse studies because although it is considered a rhizobacteria and colonizes mainly the elongation zone of the root hairs it has also been found within the roots and the aerial part of several plant species Brasil et al 2005 Brasil et al 2006 Kuss 2006 Probably all Azospirillum species can develop this colonization mechanism and that is why they have been found in higher number colonizing the roots located in the mucigel or penetrating the cortical cells of the root of different plants Yet the Azospirillum species have specific mechanisms
19. con 25 de distancia de los primeros I y II Tabla 3 Aislamientos de Azospirillum asociados a la guinea Table 3 Azospirillum isolations associated to Guinea grass Aislado Origen Aislado Origen SRGM1 Suelo rizosf rico Motilonia lluvia LGI RGM3 Ra ces Motilonia lluvia NFb SRGM2 Suelo rizosf rico Motilonia sequia LGI RGM4 Ra ces Motilonia lluvia NFb SRGM3 Suelo rizosf rico Motilonia sequia LGI RGMS Raices Motilonia lluvia NFb SRGM4 Suelo rizosf rico Motilonia sequia LGI RGM6 Raices Motilonia lluvia NFb SRGMS5 Suelo rizosf rico Motilonia Iluvia LGI HGM1 Hojas y tallos Motilonia Iluvia LGI SRGF1 Suelo rizosf rico Fernambuco sequ a HGF1 Hojas y tallos Fernambuco sequ a NFb LGI RGM1 Ra ces Motilonia lluvia NFb HGF2 Hojas y tallos Fernambuco lluvia LGI RGM2 Raices Motilonia lluvia NFb HGF3 Hojas y tallos Fernambuco lluvia LGI Este primer agrupamiento permiti seleccionar ocho aislamientos con un m ximo de 20 de distancia con respecto a las cepas Sp7 y Y2 Los aislamientos seleccionados fueron HGF3 SRGM4 SRGM3 SRGM2 RGM1 RGM3 RGM6 y HGF1 los cuales se analizaron seg n su actividad fijadora de nitr geno y s ntesis de cido indolac tico Fig 1 Dendrograma de agrupaci n de los 16 aislados seg n sus caracter sticas fenot picas Fig 1 Grouping dendrogram of the 16 isolations according to their phenotypical characteristics Selecci n de aislamientos de Azospirillum con potencial biofe
20. d the most important bacterial genus for crop growth or yield improvement in different countries Perrig et al 2007 especially for its high production of plant growth regulators Radwan et al 2004 such as auxins several gibberellins and cytoquinines Bashan et al cited by Perrig et al 2007 and 3 indoleacetic acid IAA is the main phytohormone produced by Azospirillum Radwan et al 2004 IAA is an auxin known for stimulating fast responses in growth increase of cell elongation cell division and their differentiation Cassan et al 2008 Analysis of the groupings for the selection of the strains with biofertilizer potential The dendrogram of the interaction of the medians of indolic compound production and the nitrogen fixing activity showed two groups separated by more than 25 distance fig 2 The strains Sp7 SRGM3 and SRGM4 formed group 1 with 7 distance among its medians In group II two subgroups were formed where HGF1 HGF3 RGM1 RGM3 and RGM6 showed 2 distance and in turn this same subgroup IIA showed 7 distance from the strain SRGM2 forming subgroup IIB This analysis of hierarchical classification allowed to select the isolations of group I as the strains of higher biofertilizer activity under in vitro conditions For such reason the strains SRGM3 SRGM4 and the strain SRGM2 were selected for their closeness to group I where Sp7 A brasilense was grouped Genetic identification of the Azospirillum spp isola
21. de nitr geno in vitro se utiliz el m todo de reducci n de acetileno Los aislamientos se inocularon en frascos de 10 mL con 3 mL de medio semis lido NFb o LGI y se incubaron durante 24 horas a 32 C Posteriormente se reemplaz el tap n por uno de caucho sell ndolo herm ticamente se sustituy el 10 de su atm sfera por acetileno y se incub durante 1 hora a 32 C El etileno se midi inyectando 1 mL de la atm sfera del frasco de cultivo en un cromat grafo de gases Perkin Elmer con detector de ionizaci n de llama y una columna Poropak N 200 300 mesh de 6 pies y 3 mm de diametro La actividad de reduccion de acetileno para cada aislado se calcul seg n la altura del pico de etileno en el cromatograma extrapolando en la ecuaci n Log Y 0 808 Log X 9 7 R 0 997 obtenida de la regresi n lineal de una curva de calibraci n en concentraciones de etileno de 1 1 10 1 100 1 1000 y 1 10 000 en las mismas condiciones del cromat grafo Corpoica 2006 Se compar la producci n de compuestos ind licos y la fijaci n biol gica de nitr geno y sus similitudes se estimaron seg n la distancia euclidiana Despu s se agruparon por el m todo de las medianas y se representaron gr ficamente en un dendrograma utilizando el programa SPSS 10 0 para Windows Identificaci n de los aislamientos de Azospirillum spp por medio del an lisis del gen 168 rrna Las cepas seleccionadas fueron cultivadas en caldo LB por 14 h a 150 rpm y 30 C
22. iluciones hasta 10 en soluci n salina al 0 85 de NaCl Se inocularon 0 1 mL de cada diluci n en tres viales de medio semis lido NFb y LGI para el recuento de Azospirillum spp y Azospirillum amazonense respectivamente D bereiner et al 1995 Las ra ces del pasto se lavaron y se cortaron en fragmentos de 1 cm y se desinfectaron con alcohol de 70 durante 1 min despu s se sumergieron en hipoclorito de sodio al 2 por 2 min y se realizaron dos enjuagues sucesivos en agua est ril Se peso 1 g de estas raices y se maceraron en 9 mL de soluci n salina est ril 0 85 de NaCl Las hojas y los tallos se lavaron con agua destilada y se secaron Se pes 1 g de este material vegetal cortado en fragmentos de 2 cm se desinfectaron con alcohol de 70 y se maceraron en 9 mL de soluci n salina est ril 0 85 de NaCl Se realizaron diluciones seriadas hasta 10 a partir de estos macerados y se inocularon de igual forma que la muestra de suelo rizosf rico Los viales inoculados se incubaron durante 5 dias a 32 C hasta la formaci n de una pelicula subsuperficial como indicador del crecimiento positivo Se cuantific la poblaci n mediante el m todo del Numero Mas Probable para tres tubos aplicando la tabla de McCrady D bereiner et al 1995 Se realizaron tres repeticiones y se hizo un an lisis de varianza seg n el dise o experimental en parcelas divididas con un arreglo factorial de 2 pocas clim ticas x 2 manejos agron micos x 3
23. ing it from the roots from which dilutions up to 10 were made in saline solution at 0 85 of NaCl Of each dilution 0 1 mL were inoculated in three vials of NFb and LGI semisolid medium for the recount of Azospirillum spp and Azospirillum amazonense respectively D bereiner et al 1995 The pasture roots were washed and cut into 1 cm fragments and were disinfected with 70 alcohol for 1 min they were later submerged in sodium hypochlorite at 2 for 2 min and were rinsed twice successively in sterile water One gram of these roots was weighed and they were macerated in 9 mL of sterile saline solution 0 85 NaCl The leaves and stems were washed with distilled water and dried One gram of this plant material was weighed cut in 2 cm fragments they were disinfected with 70 alcohol and macerated in 9 mL sterile saline solution 0 85 NaCl Seriated dilutions were made up to 10 from these macerates and they were inoculated in the same way as the rhizospheric soil sample The inoculated vials were incubated for 5 days at 32 C until the formation of a subsurface film as indicator of positive growth The population was quantified through the Most Likely Number method for three tubes applying McCrady s table D bereiner et al 1995 Three repetitions were made and a variance analysis was done according to the experimental design in divided plots with 2 climatic seasons x 2 agronomic managements x 3 analyzed samples factorial arrangement
24. iology plant interations and agronomic research in Argentina F F Cassan and I Garcia de Salamone Eds Asociacion Argentina de Microbiologia Buenos Aires Argentina p 61 Cordero J et al 2008 La inoculaci n de plantas con Pantoea sp bacteria solubilizadora de fosfatos incrementa la concentracion de P en los tejidos foliares Rev Colomb Biotecnol 10 1 111 Corporaci n Colombiana de Investigaci n Agropecuaria Corpoica 2006 Manual de procedimientos t cnicos Laboratorio de control de calidad de inoculantes Version 02 p 14 Cuesta Mufioz P A et al 2005 Estrategias de manejo de praderas para mejorar la productividad de la ganaderia en las regiones Caribe y Valles Interandinos Manual t cnico Producci n y utilizaci n de recursos forrajeros en sistemas de producci n bovina de las regiones Caribe y Valles interandinos Corpoica Colombia 24 p D bereiner J et al 1995 Como isolar e identificar bact rias diazotr ficas de plantas ao leguminosas EMBRAPA SPI Brazil Eckert B et al 2001 Azospirillum doebereinerae sp nov a nitrogen fixing bacterium associated with the C4 grass Miscanthus International Journal of Systematic and Evolutionary Mcrobiology 51 17 Edwards U et al 1989 Isolation and direct complete nucleotide determination of entire genes Characterization of a gene coding for 16S ribosomal RNA Nucleic Acids Res 17 7843 Gamarra J R 2005 La economia del Cesar despu s del algod n En D
25. its texture varies from loamy to loamy clayey Forage species are cultivated on them among which Guinea grass Panicum maximum Jacq reaches high productivity in dry matter around 12 to 18 t ha Cuesta Mu oz et al 2005 However these soils show physical chemical and biological deterioration which severely affects their productive capacity and compromises the economic viability of livestock production systems The above expressed is caused among other factors by the indiscriminate use of chemical fertilizers mainly as source of N which plays an important role together with P and K for plant growth Osorio 2007 Cordero et al 2008 Biological nitrogen fixation done only by bacteria is an environmentally and economically viable alternative to supply the inclusion of N sources of synthetic origin because molecular nitrogen N is the only inexhaustible reserve in the biosphere In the rhizosphere of tropical and subtropical pastures there are N fixing microorganisms diverse studies have proven that there is high specificity of the isolations obtained from different grass roots with regards to the diazotrophic species found that is root exudates soil pH and other characteristics of the plant species and the soil could influence the presence of some genera of biological fixatives Reis Junior et al 2004 Radwan et al 2005 Studies for more than 20 years indicate that the bacteria from the Azospirillum genus have special affinity
26. licas a trav s de la actividad del complejo nitrogenasa la cual contiene un cofactor hierro molibdeno que es el sitio de reducci n de N y de la prote na reductasa dinitrogenasa que transfiere electrones desde un donador de electrones hasta la prote na nitrogenasa Steenhoudt y Vanderleyden 2000 Producci n de hormonas ind licas Cuando se cuantific la producci n de compuestos ind licos por los aislamientos estudiados se encontr que la cepa RGMI tuvo una producci n de 45 18 ug mL de AIA seguida por SRGM2 con 43 27 ug mL de AIA los cuales representan los mayores valores y Sp7 A brasilense que registr 40 170 pg mL de AIA Los aislamientos SRGM4 RGM3 RGM6 HGF1 y HGF3 produjeron entre 38 12 y 23 15 ug mL de AIA y la cepa SRGM3 present el menor valor 3 46 pg mL de AIA tabla 4 La producci n de compuestos ind licos de SRGM3 es comparable con las reportadas por Perrig et al 2007 quienes registraron 2 9 g mL de AIA por la cepa Az39 recomendada para maiz y trigo en Argentina lo cual indica que esta es una concentraci n que permite la promoci n del crecimiento de las plantas teniendo en cuenta que estas cepas han sido evaluadas en gram neas y seleccionadas por sus ptimos resultados Las demas cepas presentaron valores entre 23 15 y 45 18 ug mL de AIA los cuales oscilan entre aquellos que han registrado diferentes cepas de 4 amazonense aisladas de ra ces de Brachiaria spp en Brasil con 6 13 a 19 27 ug mL de A
27. mic management of Guinea grass However this population tended to be higher in the rainy season under an agroecological management of Guinea grass at the E S Motilonia as compared to the dry season in the two localities which shows the influence of environmental factors on the bacterial population table 1 Brasil et al 2005 reported a decrease of the number of diazotrophic bacteria in the root and soil of the grasses Axonopus purusii Elyonurus muticus and Brachiaria humidicola in the dry season On the other hand Reis Junior et al 2004 obtained A amazonense populations of 5 81 log units in roots of Brachiaria spp in the winter statistically different from 3 67 log units in the dry season in a tropical zone with dry season in winter Yet when they evaluated the A amazonense population in a tropical zone without dry season they did not found significant differences Although a decrease in the Azospirillum spp population in the dry season was observed these bacteria can survive due to their physiological characteristics because they show high capacity to change their metabolic activity when the soil environmental conditions vary mainly the availability of water carbon and nitrogen and oxygen tension Thus the Azospirillum species can use ammonium nitrate nitrite aminoacids and molecular nitrogen as nitrogen source Steenhoudt and Vanderleyden 2000 and under unfavorable conditions such as drought and nutrient limitation they c
28. n of the 16S rRNA region was done in 25 uL of a Buffer reaction mixture 1x MgSO 1 5 mM dNTP 0 2 mM Primer 27F Edwards et al 1989 and 1492R 0 2 mM Weisburg et al 1991 0 25 uL of Taq DNA Polimerase and 1 5 uL of DNA mold isolation sample The conditions of the thermocycler were an initial cycle of denaturation 94 C for 5 min 50 denaturation cycles 94 C for 30 sec ringing 66 C for 30 sec and extension 72 C for 1 min and three cycles of final extension 72 C for 10 min The amplified fragments were observed by means of agarose gel electrophoresis at 0 8 in TAE conditioned with 0 5 ug mL of ethidium bromide to visualize the resulting strips The amplified DNA was purified using QIAquick PCP Purification Kit Protocol of QIAquick Spin Handbook of QUIAGEN it was quantified in a NanoDrop Spectrophotometer ND 1000 and it was analyzed in the program ND 10 00 V 3 3 0 at a wavelength of 260 nm The amplified product was sequenced in an ABI PRISM Genetic Analyzer which makes the automatic sequentiation of DNA fragments marked with fluorochromes The result was analyzed through BLAST Basic Local Alignment Search Tool in www ncbi nim nih gov BLAST Blast cgi Results and Discussion Effect of the season and agronomic management of Guinea grass on Azospirillum populations According to the variance analysis the recount of the Azospirillum population did not show significant differences according to the season and the agrono
29. ocumentos de trabajo sobre economia regional No 59 Banco de la Republica Centro de Estudios Regionales CEER Cartagena Colombia 116 p Joe M M et al 2009 Co aggregation in Azospirillum brasilense MTCC 125 with other PGPR strains Effect of physical and chemical factors and stress endurance ability Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers 40 491 Kuss A V 2006 Fixa o de nitrog nio por bacterias diazotr ficas em cultivares de arroz irrigado Tese de Doutorado Programa de P s Gradua o em Ci ncia do Solo Universidade Federal de Santa Maria Centro de Ci ncias Rurais Brazil Kuss A V et al 2007 Fixa o de nitrog nio e produ o de cido indolac tico in vitro por bact rias diazotr ficas endof ticas Pesg Agropec Br s 42 10 1459 Mehnaz S amp Lazarovits G 2006 Inoculation effects of Pseudomonas putida Gluconacetobacter azotocaptans and Azospirillum lipoferum on corn plant growth under greenhouse conditions Microbial Ecology 51 326 Osorio N W 2007 A review on beneficial effects of rhizosphere bacteria on soil nutrient availability and plant nutrient uptake Rev Fac Nal Agr Medellin 60 1 3621 Perrig D et al 2007 Plant growth promoting compounds produced by two agronomically important strains of Azospirillum brasilense and implications for inoculant formulation Appl Microbiol Biotechnol 75 5 955 Radwan T E E et al 2004 Efeito da inocula o de Azospirillum e
30. r su similitud con el g nero en estudio Se seleccionaron tres cepas promisorias para ser utilizadas como biofertilizante por su alta fijaci n de nitr geno y producci n de cido indolacetico se identificaron molecularmente y se encontraron semejanzas con 4 lipoferum y A brasilense seg n la base de datos del GenBank Agradecimientos Al Laboratorio de Microbiologia de Suelos y a la Estaci n Experimental Motilonia de CORPOICA por su colaboraci n y apoyo econ mico a trav s del proyecto financiado por el Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural de la Rep blica de Colombia la Federaci n Colombiana de Ganaderos FEDEGAN y la Gobernaci n del Departamento del Cesar Referencias bibliogr ficas Brasil M S et al 2005 Ocorrencia e diversidade de bact rias diazotr ficas associadas a gram neas forrageiras do pantanal sul matogrossense R Bras Ci Solo 29 179 Brasil M S et al 2006 Efeitos da inocula o de bact rias diazotr ficas em gram neas forrageiras do Pantanal Bolsista de P s Graduacao da UFRRJ em Serop dica RJ Carcafio Montiel M G et al 2006 Actividad nitrogenasa producci n de fitohormonas sider foros y antibiosis en cepas de Azospirillum y Klebsiella aisladas de maiz y teocintle Terra Latinoamericana 24 4 493 Cassan R et al 2008 Producci n de fitohormonas por Azospirillum sp Aspectos fisiol gicos y tecnol gicos de la promocion del crecimiento vegetal In Azospirillum sp Cell phys
31. rds the stopper was replaced by a rubber one sealing it hermetically 10 of its atmosphere was substituted by acetylene and it was incubated during 1 hour at 32 C The ethylene was measured injecting mL of the atmosphere of the culture flask in a Perkin Elmer gas chromatograph with flame ionization detector and a Poropak column N 200 300 mesh of 6 feet and 3 mm diameter The acetylene reduction activity for each isolate was calculated according to the height of the ethylene peak in the chromatogram extrapolating in the equation Log Y 0 808 Log X 9 7 R 0 997 obtained from the lineal regression of a calibration curve in ethylene concentrations of 1 1 10 1 10 1 1000 and 1 10 000 under the same conditions as the chromatograph Corpoica 2006 The production of indolic compounds and the biological nitrogen fixation were compared and their similarities were estimated according to the Euclidian distance Afterwards they were grouped by the median method and graphically represented in a dendrogram using the program SPSS 10 0 for Windows Identification of the Azosporillum spp isolations by analyzing the gen 16S rrna The selected strains were cultivated in LB broth for 14 hours at 150 rpm and 30 C 25 uL were taken and kept in thermostated bath during 15 minutes Afterwards it was centrifuged at 13 000 rpm for 1 min The supernatant was discarded and the precipitate was re suspended in 1 mL of sterile Milli Q water The amplificatio
32. ria spp en invierno estadisticamente diferente a 3 67 unidades log en la poca seca en una zona tropical con estaci n seca en el invierno Sin embargo cuando evaluaron la poblaci n de 4 amazonense en una zona tropical sin estaci n seca no encontraron diferencias significativas Aunque se evidenci una disminuci n en la poblaci n de Azospirillum spp en la poca de sequia estas bacterias pueden sobrevivir debido a sus caracter sticas fisiol gicas ya que presentan una alta capacidad para cambiar su actividad metab lica cuando var an las condiciones ambientales en el suelo principalmente la disponibilidad de agua carbono y nitr geno y la tensi n de ox geno De esta forma las especies de Azospirillum pueden utilizar amonio nitrato nitrito amino cidos y nitr geno molecular como fuente de nitr geno Steenhoudt y Vanderleyden 2000 y en condiciones desfavorables como la sequ a y limitaci n de nutrientes pueden experimentar ciertos cambios morfol gicos y bioqu micos para formar estructuras similares a quistes que les permiten sobrevivir en condiciones f sicas adversas particularmente la desecaci n Sadasivan y Neyra citados por Joe et al 2009 Por otro lado cuando se compararon las poblaciones de Azospirillum spp en el suelo rizosf rico las ra ces y las hojas del pasto guinea en medio NFb y LGI se registraron diferencias significativas P lt 0 05 con respecto a estas tres muestras estudiadas Se observ que el
33. rtilizante Aunque originalmente se sugiri que el mecanismo de acci n de Azospirillum para promover el crecimiento de las plantas era su habilidad para fijar el nitr geno atmosf rico en la actualidad se han propuesto mecanismos alternativos como la producci n de reguladores de crecimiento vegetal o fitohormonas Carca o Montiel et al 2006 Por esta raz n la selecci n de cepas de Azospirillum se realiz teniendo en cuenta su actividad fijadora de nitr geno y la capacidad de producci n de compuestos ind licos entre las cuales se observaron diferencias estad sticas para todos los aislamientos evaluados tabla 4 Tabla 4 Actividad nitrogenasa y producci n de sustancias ind licas por los aislamientos de Azospirillum sp Table 4 Nitrogenase activity and production of indolic substances by the Azospirillum sp Isolations Cepa nmol C H h mL uM AIA ug mL Sp7 M845 6 2 238 45 4 1 40 17 0 87 SRGM4 123 70 5 132 15 6 02 23 15 0 97 SRGM3 44 69 3 19 73 3 3 46 0 41 SRGM2 10 72 1 247 00 2 03 43 27 0 71 HGF1 0 50 0 03 203 06 6 2 35 57 1 56 RGM1 0 20 0 02 257 9147 01 45 18 1 67 RGM3 0 13 0 04 155 79 6 08 27 29 1 19 RGM6 0 11 0 03 200 04 4 33 05 2 88 HGF3 0 04 0 02 217 60 7 38 12 1 58 1 Medias de tres repeticiones Medias seguidas con diferente letras no presentan diferencia significativa entre s por el test de Duncan P lt 0 05 Actividad nitrogenasa de los diferentes
34. s en el crecimiento el incremento en la elongaci n celular la division celular y su diferenciaci n Cassan et al 2008 An lisis de los agrupamientos para la selecci n de las cepas con potencial biofertilizante El dendograma de la interacci n de las medianas de producci n de compuestos ind licos y la actividad fijadora de nitr geno mostr dos grupos separados por m s del 25 de distancia fig 2 Las cepas Sp7 SRGM3 y SRGM4 formaron el grupo I con un 7 de distancia entre sus medianas En el grupo II se formaron dos subgrupos donde HGF1 HGF3 RGM1 RGM3 y RGM6 presentaron 2 de distancia y a su vez este mismo subgrupo IIA present 7 de distancia de la cepa SRGM2 conformando el subgrupo IIB Este an lisis de clasificaci n jer rquica permiti seleccionar los aislamientos del grupo I como las cepas con mayor actividad biofertilizante en condiciones in vitro Por esta raz n se seleccionaron las cepas SRGM3 SRGM4 y la cepa SRGM2 por su cercan a al grupo I donde se agrup Sp7 A brasilense Dendrogram using Average Linkage Between Groups Rescaled Distance Cluster Combine CASE 0 5 10 15 20 25 Label Num pe fone PR RGM1 RGM3 RGM6 HGF3 HGF 1 SRGHZ SRGH3 sp SRGM4 Fig 2 Dendrograma de las actividades biofertilizantes por los aislamientos de Azospirillum spp Fig 2 Dendrogram of the biofertilizer activities by the Azospirillum spp isolations Identificaci n gen tica de lo
35. s rainy and dry x 2 agronomic managements agroecological and extractive x 3 analyzed samples rhizospheric soil roots and leaves factorial arrangement The results did not reveal significant statistical differences which indicates that this bacterium can maintain its population under stress conditions by different physiological mechanisms From these samples 16 isolations were obtained belonging to the Azospirillum genus in which their acetylene reduction activity was evaluated as indicator of biological nitrogen fixation and their capacity in the production of indolic compounds as plant growth promoters The strains SRGM2 SRGM3 and SRGM4 obtained from rhizospheric soil samples of Guinea grass of the Experimental Station Motilonia of Corpoica Agustin Codazzi municipality Cesar department were selected These isolations were molecularly characterized by the gen 16S rRNA and according to the BLAST analysis in the GenBank database and showed 93 similarity with A lipoferum SRGM2 and SRGM3 and 94 with A brasilense SRGM4 Key words Growth nitrogen fixation Azospirillum sp Introduction Cesar is one of the main livestock production departments of the Colombian Caribbean region and constitutes an important milk producing region Gamarra 2005 Its soils are derived from well drained sedimentary materials and the pH is close to neutrality they have low organic matter levels high Ca contents and low levels of Mg K and minor elements
36. s aislamientos de Azospirillum spp El an lisis primario de la similitud entre las secuencias de los nucle tidos obtenidos y los depositados en la base de datos del GenBank utilizando el an lisis BLAST mostr que los aislamientos pertenecen a la subclase alfa proteobacterias de la familia Rhodospirillacea y estan fuertemente relacionados con el g nero Azospirillum por presentar hasta un 94 de similitud tabla 5 Tabla 5 Identificacion por el gen 16S rRNA de las tres cepas seleccionadas con potencial biofertilizante Table 5 Identification by the gen 16S rRNA of the three selected strains with biofertilizer potential Aislamiento 16S rRNA Numero de acceso ValorE Similitud SRGM2 Azospirillum sp EF100149 Azospirillum lipoferum cepa ICMP 8672 0 0 93 SRGM3 Azospirillum sp EF100149 Azospirillum lipoferum cepa ICMP 8672 0 0 93 SRGM4 Azospirillum sp _DQ288687 Azospirillum brasilense cepa MTCC4036 0 0 94 Las cepas SRGM2 y SRGM3 presentaron un 93 de similitud con A lipoferum y la SRGM4 un 94 de similitud con A brasilense Conclusiones No se encontraron variaciones en el tamafio de la poblaci n de Azospirillum por efecto de las pocas clim ticas lo que permite inferir que tolera condiciones de estr s h drico Se obtuvieron 184 aislamientos de las muestras de suelo las ra ces las hojas y los tallos del pasto guinea de los cuales 16 fueron caracterizados fenotipicamente como del g nero Azospirillum y se seleccionaron ocho po
37. s cepas se replicaron en agar Rojo Congo y se obtuvieron suspensiones celulares ajustadas a una concentraci n celular de 1 10 UFC mL Se inocularon 30 mL de caldo DYGS al 2 y se llev a incubaci n durante 48 horas a 32 C y 120 rpm La biomasa obtenida se centrifug a 8 000 rpm durante 10 minutos El sobrenadante se descart y las c lulas fueron suspendidas en 30 mL de buffer fosfato est ril 0 06 M y pH 7 0 De esta suspensi n celular se tomaron 100 mL y se inocularon en 50 mL de caldo NFb sin azul de Bromotimol y soluci n de vitaminas con una concentraci n de 200 mM de tript fano como precursor del cido indolac tico y 0 2 g L de NH Cl como fuente de N Se incub en oscuridad por 48 h 120 rpm y 32 C Radwan et al 2004 Se centrifugaron 10 mL del cultivo a 8 000 rpm por 10 minutos y se tomaron 2 mL del sobrenadante al cual se le adicionaron 8 mL de reactivo de Salkowsky Se realiz la lectura de la absorbancia de las muestras a 535 nm en espectrofot metro Spectronic 601 Milton Roy La concentraci n de compuestos ind licos se calcul utilizando la ecuaci n Y 0 0033X 0 0311 R 0 9855 donde Y Absorbancia de la muestra a 535 nm y X uM de cido indolac tico AIA Esta ecuaci n se obtuvo con la regresi n lineal de la curva de calibraci n en diferentes concentraciones de AIA 25 50 100 150 200 250 y 300 uM con la adici n del reactivo de Salkowsky Kuss et al 2007 Para la cuantificaci n de la fijaci n biol gica
38. se samples 16 isolations were obtained belonging to the Azospirillum genus in which their acetylene reduction activity was evaluated as indicator of biological nitrogen fixation and their capacity in the production of indolic compounds as plant growth promoters The strains SRGM2 SRGM3 and SRGM4 obtained from rhizospheric soil samples of Guinea grass of the Experimental Station Motilonia of Corpoica Agustin Codazzi municipality Cesar department were selected These isolations were molecularly characterized by the gen 16S rRNA and according to the BLAST analysis in the GenBank database and showed 93 similarity with A lipoferum SRGM2 and SRGM3 and 94 with A brasilense SRGM4 Key words Growth nitrogen fixation Azospirillum sp Introduccion El Cesar es uno de los principales departamentos ganaderos de la regi n Caribe colombiana y constituye una importante regi n productora de leche Gamarra 2005 Sus suelos se derivan de materiales sedimentarios bien drenados y el pH es cercano a la neutralidad tienen bajos niveles de materia organica altos contenidos de Ca y bajos niveles de Mg K y elementos menores su textura varia de franco a franco arcillosa En ellos se cultivan especies forrajeras entre las cuales el pasto guinea Panicum maximum Jacq alcanza una alta productividad en materia seca de alrededor de 12 a 18 t ha Cuesta Mufioz et al 2005 Sin embargo estos suelos presentan deterioro f sico qu mico y biol gico lo que
39. sers FEDEGAN and the Government of the Cesar Department
40. tions The primary analysis of similarity among the sequences of the obtained nucleotides and the ones deposited in the GenBank database using the BLAST analysis showed that the isolations belong to the alpha subclass proteobacteria of the Rhodospirillacea family and are strongly related to the Azospirillum genus for presenting up to 94 similarity table 5 The strains SGRM2 and SGRM3 showed 93 similarity with A lipoferum and SRGM4 94 similarity with A brasilense Conclusions No variations were found in the size of the Azospirillum population due to the season which allows inferring that it tolerates hydric stress conditions From the soil root leaf and stem samples of Guinea grass 184 isolations were obtained from which 16 were phenotypically characterized as belonging to the Azospirillum genus and eight were selected for their similarity with the studied genus Three promising strains were selected to be used as biofertilizer because of their high nitrogen fixation and production of indoleacetic acid they were molecularly identified and similarities were found with A lipoferum and A brasilense according to the GenBank database Acknowledgements To the Soil Microbiology Laboratory and the Experimental Station Motilonia of CORPOICA for their collaboration and economic support through the project financed by the Ministry of Agriculture and Rural Development of the Republic of Colombia the Colombian Federation of Livestock Rai
41. ulated and it was taken to incubation during 48 hours at 32 C and 120 rpm The obtained biomass was centrifuged at 8 000 rpm during 10 minutes The supernatant was discarded and the cells were suspended in 30 mL of sterile phosphate buffer 0 06M and pH 7 0 From this cell suspension 100 uL were taken and inoculated in 50 mL of NFb broth without Bromothymol blue and vitamin solution with a concentration of 200 uM of tryptophan as precursor of indoleacetic acid and 0 2 g L of NH Cl as source of N It was incubated in the dark during 48 hours 120 rpm and 32 C Radwan et al 2004 Ten mL of the culture were centrifuged at 8 000 rpm for 10 minutes and 2 mL of the supernatant were taken to which 8 mL of Salkowsky reagent were added The sample absorbance reading was made at 535 nm in spectrophotometer Spectronic 601 Milton Roy The concentration of indolic compounds was calculated using the equation Y 0 0033X 0 0311 R 0 9855 where Y Absorbance of the sample at 535 nm and X uM of idoleacetic acid IAA This equation was obtained with the lineal regression of the calibration curve in different concentrations of IAA 25 50 100 150 200 250 and 300uM with the addition of the Salkowsky reagent Kuss et al 2007 For quantifying the in vitro biological nitrogen fixation the acetylene reduction method was used The isolations were inoculated in 10 mL flasks with 3 mL of semisolid medium NFb or LGI and were incubated for 24 hours at 32 C Afterwa
42. um spp La secreci n de sustancias promotoras del crecimiento de las plantas tales como auxinas giberelinas y citoquininas por Azospirillum parece estar involucrada parcialmente en este efecto Reis Junior et al 2004 Radwan et al 2005 Kuss et al 2007 Teniendo en cuenta que en Colombia no existe hasta el momento ning n registro de la evaluaci n de poblaciones de esta bacteria asociadas a las pasturas este trabajo tuvo como objetivo iniciar el estudio de cepas nativas de Azospirillum en el pasto guinea en el Valle del Cesar como el primer paso hacia la b squeda de aislamientos con potencial biofertilizante Materiales y M todos Determinaci n del efecto de las pocas de lluvia y sequ a sobre las poblaciones de Azospirillum en el pasto guinea Se tomaron muestras del suelo rizosf rico y de la planta completa de guinea en la poca de lluvia en septiembre de 2006 158 6 mm de precipitaci n y 28 1 C de temperatura y en la seca en febrero de 2007 0 mm de precipitaci n y 31 C de temperatura Los dos sitios seleccionados presentan condiciones contrastantes respecto al manejo del suelo En la E E Motilonia se desarrollan pr cticas agron micas como la incorporaci n de materia org nica al suelo la planificaci n de la siembra y el pastoreo racional en la finca Fernambuco se practica el sobrepastoreo y el laboreo intensivo del suelo El suelo rizosf rico se obtuvo al removerlo de las ra ces a partir del cual se realizaron d
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