EN RESPUESTA A INOCULACIÓN CON AISLAMIENTOS DE
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1.2. 07 Fracci n Pigmentaci n Pigmentaci n onda pigmentaci n Pevetador cona RO vanillina roja amarlo crudo etanol orema roja verde gis roja verde verde verde al roja verde DI vardo naranja yis a 2 amaria naranja verde a cal naranja verde verde verde negro negro negro cal Acetato de MCR24 naranja rosado E2 crudo gris etanol NPK verde 35 Fracci n B2 Bencina NPK 02 Dicloro Metano NPK A2 Acetato NPK Fracci n hidroalcohalica MCR24 Revelador vanillina Tuz Tuz UV Caracteristica blanca Pigmentaci n Pigmentaci n onda Pigmentaci n corta Ri verde rosado verde cl rosado verde caf ci amarillo amaia amarlo gris naranja cal naranja verde negro azul varde varde caf ci rosado rosado verde rosado verde amarlo rosado roja varde
3. verde cl amarilla naranja gris naranja naranja verde roja negra blanca azul varde 36 Fracci n Bencina lig liq MCR24 D3 Dicloro metano MCR24 J Acetato de lig liq MCR24 FH2 Fraccion hidroalcoholica NPK B4 Bencina ligliq NPK Caracteristica verde cl Tuz Pigmentaci n naranja TuzUV onda corta Ri Pigmentaci n Pigmentaci n verde roja gris roja roja verde negra azul azul varde cl naranja gris rosado cal rosado verde naranja gris caf ci cal EN vardo amarila 37 Dicloro metano NPK Acetato etilo lig liq NPK Tuz Tuz UV Tuz UV Revelador Fracci n Caracteristica blanca Pigmentaci n onda Pigmentaci n onda Pigmentaci n targa RO corta R rosado azul varde 0 93 verde cl 005 rojo 005 gris rosado 009 gris verde cl verde verde verde rojo negro
4. crema rosado 0 05 gris verde cl 009 gris cal rojo gris verdo rojo vorde verde rojo gris ANEXO 10 3 Pesos y Concentraciones de los extractos obtenidos PESO seco ETAPA TEJIDO TRATAMIENTO REPLICA EXT g CONCENTRACION EXT g mL RAIZ Raz 1 0 03065 Raz 2 01867 0 09335 Raz 3 0 52595 va RAIZ NPK 1 0 1239 0 06195 va raiz NPK 2 0 0544 v4 RAIZ NPK 3 0 083 0 0415 ra ceras 1 02617 0 13085 Raz ceras 2 00356 0 0178 va ceras 3 00679 0 03395 va Raz 1 01623 008115 va Raz cepaza 2 0 0732 Raz cepaza 3 0 02115 Raz 1 01369 0 06845 Raz 2 0 0537 CEPA 26 3 01929 0 09645 0 08985 0 0544 0 05875 CEPA 24 0 04505 __ 5 24 2 0 1757 0 08785 CEPA 24 0 0787 85 maiz H0 1 0 1356 0 0678 RS maz 2 0 1316 0 0658 Rs Raiz H0 3 0 0967 0 04835 R5 RAIZ NPK 57 0 2528 0 1264 R5 RAZ NPK 2 0 3471 0 17355 R5 RAZ NPK 3 0 3746 0 1873 RS maz CEPA 9 1 0 1872 0 0936 As RAIZ CEPAS 2 0 1498 0 0749 R5 RAIZ CEPAS 3 0 2258 0 1129 RS gt RAIZ CEPA 24 0 141 0 0705 Rs RAI
5. ___1 22 1 Streptomyces MOR ___2 23 2 HOJAS Streptomyces MOR9 3 24 Termofida MCR24 1 25 VH24 1 Termofida MCR24 2 26 4 2 Termofida MOR24 El 27 VH24 3 Streptomyces MCR26 1 28 VH26 1 Sireplomyces MCR26 2 29 VH26 2 Streptomyces MOR26 3 30 VH26 3 Control H20 1 31 RR0 1 Rs maiz ControrH20 2 32 RR0 2 Control H20 Control NPK 1 33 CODIGO ESTADIO TEJIDO TRATAMIENTO REPLICA INTER Control NPK 2 35 1 2 Control NPK 3 36 RR13 Streptomyces 9 1 1 Streptomyces MORO 2 2 Streptomyces MORO 3 39 RR9 3 Termofida MCR24 1 4 4 1 Termofida MCR24 2 41 4 2 Termofida MOR24 3 42 RR24 3 Streptomyces MCR26 1 43 RR26 1 Streptomyces MCR26 2 44 RR26 2 Streptomyces MCR26 3 45 RR26 3 Control H20 1 46 Control H20 2 47 RH0 2 Control H20 3 3 Control NPK 1 49 RH1 1 Control NPK 2 50 RH12 Control NPK 3 51 1 3 Streptomyces MORO 1 52 RH9 1 Streptomyces MORO 2 53 RH9 2 HOJAS Streptomyces MCR9 3 54 8 Termofida MOR24 1 55 RH24 1 Termofida MCR24 2 56 RH24 2 Termofida MCR24 3 57 RH24 3 Streptomyces 26 1 58 RH26 1 Streptomyces MCR26 2 59 RH26 2 Streptomyces MCR26 60 RH26 3 10 2 Tabla con Rf de MCR24 y NPK ensayo nar en CCD
6. n a la importancia de los metab litos secundarios como sustancias t xicas en el control de pat genos Domingo y L pez 2003 Fern ndez y Gonz lez 2008 Granada 2009 entre otros Cuando en una planta se produce un estr s ya sea por una interacci n con agentes bi ticos microorganismos agentes abi ticos como luz UV o da os mec nicos como heridas de insectos todas estas condiciones se traducen en una respuesta de defensa de la planta la cual involucra la activaci n transcripcional de diversos genes que codifican para prote nas necesarias para la cicatrizaci n de la herida y o la prevenci n de la invasi n de microorganismos pat genos acumulando sustancias que no estaban presentes antes en los tejidos o lo estaban en bajas cantidades funcionando como agentes antimicrobianos o como agentes reguladores de otros mecanismos De estas sustancias las m s estudiadas son las fitoalexinas Arauz 1998 Lanot 2005 Granada 2009 Las fitoalexinas son sustancias t xicas que las plantas producen en cantidades apreciables solo despu s de haber sido estimuladas por los diferentes tipos de microorganismos fitopat genos o bien despu s de haber sufrido da os causados por agentes qu micos o mec nicos Dey 8 Harborne 1991 Agrios 2004 3 2 1 Fitoalexinas barreras qu micas Las fitoalexinas metab litos secundarios de bajo peso molecular con actividad antimicrobiana son de naturaleza qu mica diversa Dey amp Harborne 1991 principalme
7. E Colletotrichum lindemutianum 86 aii 21 Figura 7 Prueba de crecimiento de Phaeoisiaopsis griseola en diferentes medios cultivo para inducir mayor tasa de crecimiento y producci n de conidios 22 Figura 8 Pruebas preliminares de actividad del antif ngico comercial Terbinafina para los fitopat genos Fusarium oxysporum Colletotrichum lindemuthianum y Rhizoctonia solani vu PERE Figura 9 Discos de papel filtro inpregnados con los 60 24 Figura 10 Comparaci n del efecto en la inhibici n de melanina provocado por extractos de frijol frente R solani 225 Figura 11 Efecto de esporulaci n ocasionado por extractos de frijol C lindemuthianum 86 AA te 26 1 INTRODUCCION Las fitoalexinas son metab litos secundarios con actividad antimicrobiana sintetizados de novo en plantas en respuesta a la acci n de elicitores o inductores tanto ex genos producidos por pat genos agentes qu micos y da os mec nicos como end genos producidos por las plantas en respuestas a determinadas situaciones de estr s Las fitoalexinas son metab litos de peso molecular de naturaleza qu mica diversa terpenoides alcaloides gluc sidos flavonoides entre otros Se conoce su inducci n por interacciones compatibles y compatibles con pat genos y bacterias promotoras de crecimiento vegetal pero no se ha estudiado efecto de microorganismos como los actinomicetos La funci n de
8. OBJETIVOS 4 1 Objetivo general Comprobar la producci n de fitoalexinas en plantas de frijol com n Phaseolus vulgaris en respuesta a la inducci n bi tica por inoculaci n con actinomicetos 4 2 Objetivos espec ficos gt Inducir la s ntesis de fitoalexinas en plantas de frijol com n por inoculaci n de actinomicetos gt Emplear m todos fitoqu micos para la obtenci n extractos vegetales de las plantas para evaluar la presencia de fitoalexinas gt Evaluar vitro la actividad antimicrobiana de los extractos vegetales frente a fitopat genos foliares y radiculares en frijol u 5 METODOLOGIA La presente investigaci n se realiz en las instalaciones del laboratorio de Fitoqu mica y Qu mica Microbiol gica y el laboratorio UNIDIA Unidad de Investigaciones Agropecuarias de la Pontificia Universidad Javeriana 5 1 Preparaci n de in culo de actinomicetos Para inducir la respuesta sist mica de defensa en las plantas de fr jol se utilizaron tres cepas de actinomicetos MCR9 MCR24 MCR26 provenientes de la colecci n de microorganismos del laboratorio UNIDIA previamente caracterizados como promotores de crecimiento vegetal Duque y Quintana 2008 Franco Correa 2008 Bello y G mez 2009 Estas cepas se conservaron en un banco primario en glicerol al 12 Los aislamientos se reconstituyeron en agar avena y se incubaron 22 10 d as Franco Correa 1999 A partir de este crecimiento se prepar
9. bano tabaco y tomate entre otras La resistencia inducida se manifiesta como una reducci n del n mero de plantas enfermas o en gravedad de la enfermedad tras la infecci n por un pat geno Tal efecto hacia la enfermedad puede ser local o sist mico Van Loon 1998 Otras actividades de las PGPR se han descrito como por ejemplo la fitoestimulaci n al propiciar la emergencia o el enraizamiento por la s ntesis de reguladores de crecimiento como giberelinas citoquininas y auxinas Estas sustancias estimulan la densidad y longitud de los pelos radicales lo que incrementa a su vez la capacidad de absorci n de agua y nutrientes y permite que las plantas sean m s vigorosas productivas y tolerantes a condiciones clim ticas adversas como la sequ a Franco 2008 Teniendo en cuenta los estudios realizados por Franco Correa 2008 se ha evidenciado actividad PGPR por parte de las cepas de actinomicetos de este estudio MCR9 MCR24 26 Las cepas MCR 9 MCR 26 se identificaron como pertenecientes al g nero Streptomyces y la MCR 24 se clasific en el g nero Thermobifida por caracterizaci n morfol gica bioqu mica y molecular 3 2 Mecanismos de defensa de las plantas En general las plantas contrarrestan el ataque de los pat genos Arauz 1998 Agrios 2004 Agrios 2005 mediante caracter sticas estructurales que act an como barreras f sicas e impiden que el pat geno penetre y se propague en ellas incluyendo la dep
10. el momento de corte en la planta as los compuestos fen licos pierden sus caracter sticas sutilmente luego de la cosecha Waterman 1994 Desde el momento que se hace el corte de la planta dividiendo parte a rea de la parte radicular la planta responde generando una cadena de reacciones producto de su defensa natural Para contrarrestar este efecto las plantas se congelaron en con nitr geno l quido luego de la cosecha y posteriormente se separaron las porciones a reas y radiculares 26 Entre los reportes referentes obtenci n de metab litos secundarios a partir de material vegetal Granada 2009 Fern ndez y Gonzales 2009 M rquez et al 2007 entre otros es importante la cantidad de material vegetal de estudio y por lo tanto la concentraci n de extracto que se obtenga de cada una de ellos para posteriormente hacer las pruebas de bioensayo A pesar que el cultivo de frijol pudo ser m s extenso pero por motivos de espacio no fue posible se logr colectar 2g a 5g de peso seco de los diferentes tejidos y obtener extractos a partir de 29 de tejido liofilizado de concentraciones entre 0 017g mL y 0 05g MI ver anexo Aunque se usaron 500 0 de extracto para activar los discos de papel filtro se pudo observar un marcado efecto de inhibici n de crecimiento f ngico Al parecer la cantidad de extracto para causar inhibici n no fue suficiente se ha descrito que cuando las fitoalexinas se producen en cantidades m nimas estas
11. en papel absorbente para posteriormente congelarlo con nitr geno l quido evitando desencadenar s ntesis de fitoalexinas por da os mec nicos El tejido congelado se almacen en bolsas selladas al vaci y se almacen en congelador a 20 C hasta el momento del proceso de liofilizaci n Lindig 2002 separando las porciones de tejidos foliares y radiculares Luego de la liofilizaci n se tomaron 2g de cada uno de los tejidos para el proceso de extracci n Para determinar el solvente y estrategia de extracci n m s apropiada se llev a cabo un ensayo preliminar comparando extractos de plantas inoculadas con la cepa 24 y tratadas con fertilizante NPK en estad o reproductivo R5 Se siguieron dos estrategias de extracci n y fraccionamiento de extractos La primera estrategia se bas en una extracci n seriada s lido l quido con tres solventes de diferentes polaridades La extracci n se hizo por medio de agitaci n del tejido liofilizado por agitaci n durante 48 horas luego se hizo filtraci n y el resto de tejido se someti nuevamente a extracci n por 48 horas Luego de los dos ciclos de extracci n con el primer solvente Bencina de petr leo se llev a cabo el mismo procedimiento con los solventes diclorometano y acetato de etilo partiendo del solvente con menor grado de polaridad y terminando con el de mayor grado de polaridad Al final de los tres ciclos de extracci n se fusionaron los filtrados del mismo solvente y se con
12. geno La bios ntesis de fitoalexinas tambi n puede ser inducida por bacterias promotoras de crecimiento vegetal gracias a su capacidad de inducci n de respuestas de defensa en plantas resistencia sist mica inducida Es por esta raz n que utlizando un modelo biol gico planta de fr jol se evaluar la producci n de fitoalexinas en respuesta inoculaci n con actinomicetos para ser caracterizados rizobacterias promotoras de crecimiento vegetal Se espera que los resultados obtenidos sean un punto de partida para investigaciones futuras enfocadas a generar alternativas de protecci n de cultivos libres de contaminantes qu micos 3 MARCO TEORICO 3 1 Rizobacterias promotoras de crecimiento vegetal PGPR Plant Growth Promoting Rhizobacteria Las bacterias que colonizan la ra z suelo rizosf rico son denominadas rizobacterias Franco 2008 Las rizobacterias no pat genas pueden promover el crecimiento de las plantas por estimulaci n hormonal o mejorar la obtenci n de nutrientes mecanismos directos as como evitar algunas enfermedades por medio de antagonismo o inducci n de resistencia en la planta mecanismos indirectos Bent 2002 Devendra 2007 Van Loon 2007 La resistencia sist mica inducida RSI en plantas es fenot picamente similar a la resistencia sist mica adquirida RSA estimulada por pat genos Se ha demostrado contra hongos bacterias y virus Kuc 1997 en plantas de frijol clavel pepino r
13. n requiere cantidades m nimas de extracto y los resultados de presencia de determinados grupos funcionales se puede asociar a la presencia de fitoalexinas 29 9 BIBLIOGRAFIA Abo ellil A Sharaf E Growth Morphologia Alterations and Adaptation of Some Plant Pathogenic Fungi to Benlate and Zineb A new look Online joumal of biological sciences 2003 3 3 271 281 Agrios G Fitopatolog a Editorial Limusa M xico 2004 98 p Agrios g Plant Pathology Fifth Edition Elservier 2005 208 247 p Arauz 1 Fitopatolog a un enfoque agroecol gico Editorial de la universidad de costa rica Costa rica 1998p Arias J JaramilloM Rengifo T Manual Buenas Pr cticas Agr colas en la producci n de frijol voluble Fao Corpoica Medell n Colombia 2007 167p Bello G mez R Evaluaci n de Mecanismos Directos Relacionados con la Promoci n de Crecimiento Vegetal por Parte de Actinomicetos Nativos Colombianos y su interacci n con Glomus sp Trabajo de grado 2009 1 180p Bent E Induced Systemic Resistance Mediated by Plant Growth Promoting Rhizobacteria PGPR and 2002 Chen B langer R Benhamou Paulitz T Defense Enzymes Induced in Cucumber Roots by Treatment With Plant Growth Promoting Rhizobacteria PGPR and Pythium aphanidermatum Physiological and molecular plant pathology 2000 56 1 13 23p Dey Harborne Methods in plant biochemistry Vol men 1 Terpenoids 1991 152 p Devendra k Choudhary A P
14. una suspensi n de unidades propagativas en soluci n salina para llegar un in culo de concentraci n de 10 prop gulos g suelo Franco Correa 2008 5 2 Preparaci n inoculaci n y desarrollo de material vegetal Las semillas de fr jol frijol arbustivo variedad ICA Cerinza obtenidas de Impulsemillas se sometieron a un proceso de lavado con agua corriente para eliminar trazas de tratamiento con fungicidas Posteriormente se realiz una desinfecci n superficial con etanol al 80 por 30 segundos y NaCIO 5 por 6 minutos Linding 2002 y luego se realizaron nueve lavados con agua est ril Finalmente se realiz imbibici n de las semillas en agua est ril por 24 horas En bandejas pl sticas se inici la etapa de geminaci n por aproximadamente 10 d as en fotoperiodo 12 horas luz 12 horas oscuridad a temperatura ambiente Luego de este periodo las semillas germinadas se transplantaron en materos con suelo esterilizado por tres ciclos de autoclave a 121 C y 15 psi por 20 minutos G mez y Bello 2009 El suelo esterilizado fue inoculado con una suspensi n de prop gulos de actinomicetos a una concentraci n de 10 prop gulos g suelo como se mencion anteriormente Se establecieron cinco tratamientos incluyendo la inoculaci n con cada una de las cepas de actinomicetos MCR9 MCR24 MCR26 y dos controles uno sin inoculaci n de actinomicetos plantas tratadas con agua testigo absoluto y otro sin inoculaci n con act
15. DETECCI N DE FITOALEXINAS EN PLANTAS DE FR JOL Phaseolus vulgaris EN RESPUESTA A INOCULACI N CON AISLAMIENTOS DE ACTINOMICETOS LUCY DAYANA TORRES DIAZ TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial Para optar el titulo de MICROBI LOGA INDUSTRIAL PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL BOGOT D C JULIO DE 2010 NOTA DE ADVERTENCIA Art culo 23 de la Resoluci n 13 de Julio de 1946 La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis Solo valer por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral cat lica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna antes bien se vea en ella el anhelo de buscar la verdad y la justicia TABLA DE CONTENIDO RESUMEN 1 INTRODUCCION 2 JUSTIFICACION Y PLANTEAMIENTO DE PROBLEMA 3 MARCO TERORICO y 3 1 Rizobacteris promotoras de crecimiento vegetal PGPR 3 2 Mecanismos de defensa de las planta 321 Fitoalexinas barreras qu micas 3 3 Generalidades del frijol 4 OBJETIVOS 4 1 Objetivo general 4 2 Objetivos espec ficos 5 METODOLOGIA 5 1 Preparaci n de inoculaci n de actinomicetos 5 2 Preparaci n inoculaci n y desarrollo de material vegetal 5 3 Extracci n de fitoalexinas 5 4 Evaluaci n de actividad antimicrobiana de los extractos vegetales 6 RESULTADOS Y DISCUSI N 6 1 Recuperaci n y caracterizaci n
16. Z CEPA 24 2 0 198 0 099 R5 RAZ CEPA 24 3 0 0876 0 0438 85 RAIZ CEPA 26 1 0 1359 0 06795 RS RAIZ CEPA 26 2 0 1583 0 07915 R5 RAIZ CEPA 26 3 0 321 0 1605 RS HOJAS 1 0 3135 0 15675 RS HOJAS NPK 2 02194 01097 15 HOJAS NPK 3 0 2086 0 1043 85 __ 5 2 1 0 1973 0 09865 RS Hojas 24 2 0 1924 0 0962 R5 Holas CEPA 24 3 0 1747 0 08735 ANEXO 10 4 Medio de cultivo MEDIO AVENA Componentes Cantidad g L Preparacion Harina de avena 20 Disolver la harina de avena y el agar bacteriologico y aforar un litro con agua destilada calentar hasta ebullici n tapar y autoclavar por 15 minutos Agar bacteriol gico 15 1210 MEDIO MULLER HINTON MODIFICADO Componentes Cantidad g L Preparacion Glucosa 20 Disolver la glucosa peptona de caseina almid n extracto de Azul de metileno 100 pL por litro came y el agar agar aforar a 75 un litro con agua destilada calentar hasta ebullici n Almidon T5 agregar el azul de metileno tapar y autoclavar por 15 Extracto de carne minutos a 12196 Agar agar 15 Agar bacteriol gico 15 AGAR PAPA DEXTROSA Componentes Cantidad g L Preparacion Papa Parda Comercial 200 se adiciona 200gramos de papa en un litro de agua destilada hirviendo decant ndose y aforr ndose agreg ndole 15 gramos de agar agar luego autoclavar por 15 minutos a Agar Agar 15 12192
17. azo frente al da o ambiental El desarrollo basado en la conservaci n de recursos naturales debe proteger la estructura funci n la diversidad biol gica de los sistemas agr colas buscando mantener un equilibrio y un control medio ambiente y los recursos naturales Uno de estos recursos es el suelo que se constituye en el principal soporte de la agricultura El manejo biol gico y controlado de los cultivos se presenta como una altemativa ecol gica y eficaz frente a los numerosos y crecientes problemas causados microorganismos pat genos presentes en nuestro agro ecosistema En los ltimos a os se han descrito una gama de sustancias llamadas fitoalexinas que tienen gran importancia como mecanismo defensivo de las plantas Las fitoalexinas son sustancias producidas por la planta que inhiben el crecimiento de agentes infecciosos como hongos y bacterias Aparentemente todas las especies de plantas pueden producir fitoalexinas al ser infectadas por agentes pat genos o en respuesta a estr s abi tico qu mico o mec nico Se ha determinado cierta correlaci n entre el grado de resistencia de algunas plantas a determinados pat genos y la cantidad de fitoalexinas producidas En las variedades resistentes la planta responde a la infecci n con niveles altos fitoalexinas que son t xicos al pat geno mientras que en las que son susceptibles la concentraci n de fitoalexinas producida es insuficiente para inactivar al pat
18. centraron por rotaevaporaci n La segunda estrategia de extracci n se bas en una extracci n de tejido vegetal con etanol absoluto por dos ciclos de 48 horas tal como se hizo en la primera estrategia para obtener un extracto crudo etan lico a partir del cual se hizo un fraccionamiento seriado l quido l quido con los mismos solventes de la primera estrategia de extracci n Para el fraccionamiento l quido l quido una porci n del extracto crudo se mezcl con un volumen igual de agua para generar la fracci n hidroalcoh lica que posteriormente se fraccion por extracci n con bencina de petr leo diclorometano y acetato de etilo conservando el orden de polaridad ascendente El 13 procedimiento para concentraci n de extractos y fracciones es el mismo de la primera estrategia Finalmente para determinar la estrategia de extracci n m s apropiada se evaluaron los extractos por cromatograf a de capa delgada CCD Para desarrollar las separaciones eromatogr ficas se probaron 12 combinaciones de solventes para establecer la fase m vil que permitiera la mejor resoluci n de compuestos en placas de silica del 60 NanoSil G UVasa Macherey Nagel En la tabla 1 se muestran las mezclas de solventes evaluadas como fase m vil Tabla 1 Solventes evaluados para determinar fases m vil de corrida para cromatograf a de capa delgada Solventes Proporci n solventes Cloroformo Diclorometano Diclorometano Bencina de petr leo Diclo
19. en el centro de las placas de agar un disco de papel filtro Whatman 1 de 6mm de di metro activado con 500g de cada uno los extractos dilu dos en DMSO etanol control negativo de inhibici n se usaron discos impregnados con DMSO etanol y como control positivo de inhibici n se usaron discos activados 2 5mg ml Terbinafina reconstituida DMSO Finalmente como control absoluto de desarrollo f ngico se hizo siembra de los pat genos en placas de PDACAM Kevan ef al 1993 Prada y Vega 2008 Ni o 2009 Las placas se incubaron a temperatura ambiente por siete d as evaluando actividad antimicrobiana por medio de halos de inhibici n o alg n efecto en el crecimiento del pat geno desde las 72 horas de cultivo M rquez et al 2007 Ni o 2009 Para este ensayo se montaron cuatro r plicas de cada combinaci n pat geno extracto vegetal 15 6 RESULTADOS Y DISCUSI N 6 1 Recuperaci n y caracterizaci n morfol gica de actinomicetos Se confirmaron las caracter sticas morfol gicas macrosc picas y microsc picas de los actinomicetos de este estudio en las siembras en agar avena Figura 3 La cepa MCR9 mostr colonias de textura seca pulverulenta color anverso gris plateado y reverso caf oscuro microsc picamente se observaron filamentos en cadena larga de conidios y micelio en espiral La cepa MCR24 mostr colonias de textura seca pulverulenta anverso gris y pigmento amarillo difusible en el medio de cultivo mic
20. fitoalexinas pueden no ser detectables debido a que su s ntesis es muy r pida luego de su inducci n Taiz y Zleger 2006 24 Para que la resistencia inducida se manifieste debe transcurrir un periodo de tiempo antes de que ocurra la s ntesis y el movimiento sist mico de una o varias sustancias del punto de inoculaci n o inducci n las partes inoculadas Agrios 2004 E relaci n a esto se tuvo en cuenta que el estadio de crecimiento puede ser un determinante en la inducci n de la resistencia de la planta En R solani esto se pudo ver reflejado en el estadio de reproducci n en donde se observ que todos los extractos pertenecientes a esta etapa causaron alteraci n en el pigmento de las colonias del fitopat geno mientras que en el estadio vegetativo no se observ efecto de los extractos Tambi n se observ una diferencia entre los tratamientos con actinomicetos en donde MCR24 y MCR26 alteraron la pigmentaci n caracter stica de las colonias observ ndose blancas mientras que MCR9 no causo ning n efecto en el desarrollo de R solani Por otro lado se pudo apreciar que MCR24 en el estad o de desarrollo VA se diferencia de las dem s cepas ya que los extractos de ra z fueron los que ocasionaron la inhibici n de s ntesis de melanina mientras que los extractos de hojas visiblemente no tuvieron acci n Cuando se hace una comparaci n con los controles control de crecimiento Terbinafina y DMSO etanol el color marr n carac
21. inomicetos pero tratado con fertilizante de s ntesis qu mica NPK El fertilizante fue aplicado al cultivo en dos momentos el primero al inicio de la siembra y el segundo al momento del desarrollo de primera hoja trifoliada estad o de desarrollo vegetativo V3 12 En los materos se adicion 1 Kg de suelo est ril inoculado o no se sembraron dos semillas germinadas de forma equidistante Cada uno de los tratamientos incluy tres grupos de diez materos que fueron ubicados aleatoriamente en el invernadero Se evalu peri dicamente el desarrollo de las plantas basado en las etapas propuestas por el manual t cnico Buenas Pr cticas Agr colas BPA en la producci n de frijol voluble Arias 2007 5 3 Extracci n de fitoalexinas El muestreo de material vegetal para la extracci n de fitoalexinas se llev a cabo en dos etapas de desarrollo de las plantas de fr jol seg n est n definidas en el manual t cnico para producci n de fr jol de Corpoica 2007 El primer muestreo se llev a cabo en la fase de crecimiento VA correspondiente a la aparici n de la tercera hoja trifoliada y el segundo muestreo en la fase de crecimiento RS correspondiente al estado de prefloraci n identificada por la presencia del bot n floral El tejido vegetal foliar y radicular colectado en fresco a partir de cinco materos por cada tratamiento se lav con agua corriente para retirar residuos de suelo luego se sec
22. ivamente La cantidad de extracto requerida para determinar halos de inhibici n de crecimiento micelial de los fitopat genos puede ser mayor de 0 5mg 28 8 RECOMENDACIONES Teniendo cuenta que no se observ claramente inhibici n de crecimiento micelal de los fitopat genos evaluados se recomienda aumentar las concentraciones del extracto vegetal para comprobar la relaci n y el efecto entre la cantidad de extarcto requerida para inhibir a los fitopat genos La t cnica de difusi n en placa no es la m s apropiada para el estudio de fitoalexinas para el fitopat geno Phaeoisaripsis griseola pues este no presenta un crecimiento radial extenso Se recomienda evaluar otras alternativas para determinar actividad biol gica de extractos vegetales por ejemplo inhibici n a nivel de germinaci n El fitopat geno R solani mostr diferencias morfol gicas a nivel macrosc pico en respuesta los extractos de los estad os de crecimiento V4 y 5 esto nos indica que la etapa de desarrollo puede ser determinante en la actividad antimicrobiana por lo tanto en futuras investigaciones ser a pertinente evaluar otros estad os de para verificar esta observaci n hecho haber determinado actividad antif ngica no descarta la posibilidad de un efecto de los actinomicetos en la inducci n de rutas de metabolismo secundario por lo que se recomienda examinar los extractos a nivel de grupos funcionales Esta evaluaci
23. izobacterias con Hongos Formadores de Micorrizas Tesis doctoral Facultad de ciencias Universidad de granada Espa a 2008 1 266p Garc a R Fitoalexinas Mecanismos de Defensa de las Platas Revista Chapingo M xico 2003 4 10p Granada S Caracterizaci n Fitoqu mica y Evaluaci n de la Actividad F ngica de Material Elicitado y no Elicitado de Solanum tuberosum papa y su Correlaci n con la Respuesta Fitoalexina Trabajo de grado Universidad de Antioquia 2009 G mez B Nosanchuk J Melanin and Fungi Current Opinion in Infectious Diseases 2003 16 2 91 96p Harborne J Phytoalexins Natural plant Protection University of reading Elsevier 2003 1152 1159 p Hasegawa Mitsuhara Seo S Imai Koga J Okadak Yamane H Ohashi Y Phytoalexin Accumulation in the Interaction Between Rice and the Blast Fungus Plant Physiology 1986 82 864 866p Hyakumachi M Yokoyama K Role of Melanin in Susceptibility and Resistance of Rhizoctonia solani to Microbial Lysis Transactions of the British Mycological Society 1987 89 1 27 33p Kevan P Croft Jiittner F Alan J Volatile Products of the Lipoxygenase Pathway Evolved From Phaseolus vulgaris Leaves Inoculated with Pseudomonas syringae pv phaseolicola Plant physiology 1993 101 13 24p Krishnaveni S Liang G Muthukrishnan S Manickam A Purification and Partial Characterization of Chitinases from Sorghum Seed Plant science 1999 144 1 7p Lanot A Elicitation of Isof
24. las fitoalexinas radica en la protecci n de la planta frente a pat genos afectando la integridad de su pared y membrana celular interrumpiendo su metabolismo o evitando su reproducci n El inter s de algunos grupos de investigaci n ha sido el de reconocer la existencia e importancia de las fitoalexinas y su aplicaci n en el campo agr cola ya que contribuyen directamente en el control y manejo de bacterias y hongos fitopat genos Adicionalmente en el campo de la ingenier a gen tica los avances pueden llegar a incidir en la maquinaria biosint tica de estos metabolitos contribuyendo al mejoramiento de cultivos por resistencia m ltiples pat gena El presente estudio busca evaluar la producci n de fitoalexinas en respuesta a la interacci n de planta actinomicetos con el objetivo de caracterizar estos microorganismos como rizobacterias promotoras de crecimiento vegetal PGPR por su sigla en ingl s plant growth promoting rhizobacteria 2 JUSTIFICACI N Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA La utilizaci n de pesticidas qu micos durante d cadas para el control de enfermedades en cultivos agr colas ha hecho inminente la b squeda de alternativas amigables que contribuyan a minimizar el impacto negativo sobre el medio ambiente Este deterioro ambiental en el tiempo ha llevado a buscar metodolog as de control que contribuyan en la prevenci n o reducci n de los efectos de los pesticidas de s ntesis qu mica a corto y mediano pl
25. lavan Phytoalexins Springer 2005 355 36p M rquez R Torres C Mercado A Actividad Anti F ngica del Extracto Total en etanol de las Hojas Frescas de Pedilanthus tithymaloides poit Ultimorrial Scientia et technica 2007 8 033 155 159p 31 Maldonado Betancourt Lozoya E Local and systemic gene expression of Sesquiterpene Phytoalexin Biosynthetic Enzymes in plant leaves European journal of plant pathology 2007 Murphy J Reddy Ryu Kloepper J li Rhizobacteria Mediated Growth Promotion of Tomato Leads to Protection Against Cucumber Mosaic Virus Phytopathology 2003 93 10 1301 1307p Ni o F Evaluaci n de Metabolitos Secundarios del Hongo Ganoderma lucidum con actividad antifungica frente a fusarium spp De inter s cl nico Trabajo de grado 2010 Rojas L Vargas J Evaluaci n de la Actividad Enzim tica de Quitinasas en Plantas de Frijol Phaseolus vulgaris inoculadas con Actinomicetos Nativos Colombianos Trabajo de grado 2009 Sherma Fried Handbook of Thin Layer Chromatography Segunda Edici n Ed pennsylvania dekker 1996 Stenglein S Aulicino M Arambarri A Balatti P New Media for Increasing Sporulation and Germination of Phaeoisariopsis griseola Conidia European journal of plant pathology 2006 115 173 180p Taiz L Zeiger E Plant physiology Fourth Edition Sinauer Associates Sunderland 2006 316 343 p Van loon L Bakker P Pieterse Systemic Resistance Induces by Rhizo
26. los diferentes metabolitos Por esta raz n se llev a cabo previamente una prueba para escoger el mejor solvente de extracci n Figura 5 El solvente seleccionado fue bencina de petr leo acetona en proporci n 8 2 19 Figura 5 Comparaci n de corridas Cromatograficas con diferentes combinaciones de solventes Luego del proceso de extracci n s lido l quido en acetato de etilo y su correspondiente filtraci n los 60 extractos se concentraron por rotaevaporaci n Finalmente los extractos fueron pesados y reconstitu dos en acetato de etilo Los pesos de los extractos secos se encuentran resumidos en el anexo 3 Todos los extractos se ajustaron a una misma concentraci n 50mg mL para posteriormente activar discos de papel filtro 1001 de extracto para una cantidad de 500pg de extracto por disco de papel filtro 6 4 Evaluaci n de actividad antimicrobiana de extractos La actividad biol gica fue evaluada frente a hongos fitopat genos foliares y radiculares de frijol La caracterizaci n morfol gica de los aislamientos se llev a cabo en agar avena La caracterizaci n morfol gica macro y microsc pica confirm la identidad y pureza de los aislamientos f ngicos La figura 6 muestra la morfolog a microsc pica tipica de cada una de las cepas Se seleccionaron para el estudio las cepas de Colletotrichum lindemuthianum 86 Rhizoctonia solani y Fusarium oxysporium Las cepas de lindemuthianum 56 y Phaeoisiaropsis griseola se e
27. morfol gica de actinomicetos 6 2 Preparaci n de siembra y seguimiento de desarrollo de plantas fr jol 16 6 3 Extracci n de fitoalexinas 6 4 Evaluaci n de actividad antimicrobiana de extractos 7 CONCLUSIONES 8 RECOMENDACIONES 9 BIBLIOGRAFIA 10 ANEXOS 101 Convenci n de tratamientos para cada extractos 102 Tablacon Rf MCR24 y NPK ensayo preliminar en CCD 103 Pesos y Concentraciones de los extractos obtenidos 10 4 Medios de cultivo TABLA DE FIGURAS Figura 1 Rutas metab licas en plantas puta 9 Figura 2 Estadios de desarrollo del 10 Figura 3 Morfolog a microsc pica y macrosc pica de los actinomicetos de estudio A microscop a cepa MCR9 MCR 24 MCR 26 B Macroscop a cepas MCR 9 MCR 24 MCR 26 en agar 16 Figura 4 Cromatograf a de capa delgada de extractos en diferentes solventes Los valos en rojo muestran los extractos en acetato de etilo Placas visualizadas con A luz blanca B luz UV onda larga C luz UV onda corta D luz banca revelado con vanillina Figura 5 Comparaci n de corridas Cromatograficas con diferentes combinaciones de solventes A 20 Figura 6 Caracterizaci n morfol gica microsc pica de aislamientos f ngicos tinci n con azul de lactofeno A Phaeoisariopsis griseola Rhizoctonia solani Fusarium oxysporium D Colletotrichum lindemutianum 56
28. n de las semillas considerado como un porcentaje apto y adecuado para el inicio del cultivo de frijol en condiciones de invernadero 16 En cuanto a la etapa de desarrollo de las plantas en condiciones de invemadero se dispuso de un espacio de largo por 3m de ancho en el que se construy un invernadero de 3m de altura Es preciso se alar que si bien las condiciones ambientales no siempre fueron constantes las variaciones clim ticas no tuvieron efectos considerables que impidieran el desarrollo del cultivo En relaci n a lo mencionado anteriormente Lindig 2002 demostr que las condiciones de crecimiento del fr jol en invernadero pueden afectar la inducci n de defensa sist mica como la s ntesis de fitoalexinas Por otro lado Heil 2001 plantea que en invernadero las plantas tienden a aumentar su rendimiento y disminuir en defensa esto quiere decir que son susceptibles a factores que puedan causar alg n tipo de da o Contrariamente las plantas cultivadas en campo pueden ser capaces de producir en mayor proporci n sustancias para su defensa aunque disminuye su rendimiento Estos comportamientos dependen directamente del gasto de energ a generado por las plantas y los est mulos que esta tenga para la producci n de mecanismos de defensa 2001 Durante el desarrollo del cultivo se observ en algunas hojas clorosis y marchitamiento prematuro esta reacci n pudo deberse a un efecto de estr s abi tico Lo
29. nte isoflavonoides en leguminosas que se sintetizan en las plantas despu s de una infecci n microbiana o estr s abi tico La s ntesis se puede disparar la acci n de factores como elicitores o inductores tanto ex genos producidos por pat genos agentes qu micos da os mec nicos como end genos producidos en respuesta a determinadas situaciones de estr s Se han identificado principalmente dicotiled neas y existen pocos reportes de su presencia en monocotiled neas y gimnospermas En leguminosas como el fr jol se han descrito cerca de 16 tipos diferentes las m s conocidas son faseolina faseolidina faseolinisoflavona y kievitona Universidad Aut noma de Zacatecas 2010 La t cnica de cultivo vitro es una de las 8 alternativas para la producci n de fitoalexinas y la investigaci n de estos metab litos como una contribuci n para el control de ciertas plagas Garc a 2003 Universidad Autonoma de Zacatecas 2010 En general las fitoalexinas no son potentes antibi ticos y son baja especificidad muchas son biocidas y otras tienen efectos bivest ticos Universidad Autonoma de Zacatecas 2010 La resistencia de la planta al pat geno ocurre cuando una o m s fitoalexinas alcanzan una concentraci n suficiente para inhibir el desarrollo del agente infeccioso Se ha descrito que antes de una infecci n se encuentran en una concentraci n casi detectable despu s de una infecci n son sintetizadas r pidamente ca
30. o del pepino cohombro han demostrado adem s de la protecci n a la enfermedad el r pido desarrollo de las plantas inoculadas con PGPR en comparaci n con las plantas control Murphy et al 2003 Por otro lado el monitoreo diario del desarrollo de las plantas de fr jol no mostr diferencias marcadas en el crecimiento altura y n mero de foliolos comparado entre los tratamientos por lo tanto no se puede asegurar que el in culo de los actinomicetos haya sido suficiente para observar un est mulo marcado en el crecimiento Para determinar un est mulo en el crecimiento es necesario llevar a cabo mediciones de altura de las plantas y peso seco a nivel foliar y radicular 17 6 3 Extracci n fitoalexinas Para la identificaci n de los diferentes extractos se cre una tabla de c digos con el objetivo de facilitar la interpretaci n de los resultados La tabla de c digos se presenta en el anexo 1 La tabla est distribuida por etapa de crecimiento V4 R5 tejido vegetal hojas ra ces tratamiento cepa actinomiceto controles y r plica por ejemplo VRO 1 corresponde V etapa vegetativa R ra z 0 control H O y 1 r plica 1 RH26 3 R etapa reproductiva H hojas 26 tratamiento con cepa MCR2 y 3 r plica 3 Los m todos de extracci n del material vegetal deben obedecer a la naturaleza qu mica de las sustancias presentes en la planta y al prop sito de investigaci n En la b squeda de metabolitos pa
31. olus vulgaris una leguminosa fue escogido como planta modelo debido su r pido crecimiento y a la capacidad para restaurar la fertilidad de suelos agr colas En la primera etapa de desarrollo el sistema radical est formado por la radicula del embri n la cual se convierte posteriormente en la ra z principal o primaria A los pocos d as de la emergencia de la rad cula es posible ver las ra ces secundarias presenta n dulos distribuidos en las ra ces laterales Estos n dulos son colonizados por bacterias del g nero Rhizobium las cuales fijan el nitr geno atmosf rico El ciclo biol gico de la planta de frijol se divide en dos fases sucesivas la fase vegetativa y la fase reproductiva La fase vegetativa se inicia cuando se le brinda a la semilla las condiciones para iniciar la germinaci n y termina cuando aparecen los primeros botones florales La fase reproductiva comprende desde el desarrollo de los botones florales hasta la madurez de cosecha Figura 2 Figura 2 Estadios de desarrollo del frijol Los fitopat genos representan uno de los principales problemas para la producci n del fr jol se encuentran la antracnosis Colletotrichum lindemuthianum mancha anillada Phoma exigua var diversispora mancha angular Phaeoisiaropsis griseola pudriciones radicales Fusarium solani f sp phaseoli F oxysporum f sp phaseoli Pythium sp Rhizoctonia solani y y virus del mosaico com n del 10 4
32. osici n de calosa y suberina reduciendo el posible crecimiento microbiano en la superficie vegetal y la interacci n planta pat geno Rojas y Vargas 2009 Tambi n por medio de reacciones bioqu micas que tienen lugar en las c lulas del hospedero las cuales producen sustancias t xicas para el pat geno o crean condiciones que inhiben su desarrollo como la presencia de quitinasas enzimas 7 hidrol ticas que degradan la quitina principal constituyente de la pared celular de los hongos Krishnaveni 1999 Otro de los mecanismos para prevenir la dispersi n de la infecci n del pat geno es la respuesta hipersensible RH Este mecanismo se basa en la producci n de especies reactivas de ox geno tales como los radicales s per oxido hidroxilo OH y per xido Granada 2009 generando la muerte r pida de las primeras c lulas infectadas y la restricci n de la expansi n del pat geno aisl ndolo del resto de la planta Granada 2009 Por otro lado las enzimas peroxidasas desempe an un papel importante en el proceso de resistencia debido a que se encuentran relacionadas con la s ntesis de compuestos fen licos y la formaci n de barreras estructurales Chen et al 2000 Recientes estudios han confirmado la inducci n de peroxidasas en plantas de fr jol en respuesta a inoculaci n con actinomicetos Ferroni 2009 Existe una gran cantidad de trabajos realizados a partir de extractos de plantas en donde se hace alusi
33. pueden tener otra funcionalidad en el desarrollo de la planta Yoshikawa en el a o 1986 hace un estudio en donde prueba concentraciones m nimas de fitoalexinas con acido indol ac tico para evaluar la producci n de ra ces adventicias en plantas de fr jol concluyendo que cuando hay producci n de fitoalexinas estas pueden no solo estar asociadas a la defensa de la panta sino que tambi n ejercen una funci n como cofactor actuando sin rgicamente con otros compuestos en este caso promoviendo el enraizamiento Yoshikawa 1986 27 7 CONCLUSIONES acetato de etilo mostr ser el solvente apropiado para la extracci n de metabolitos de tejidos de fr jol Gracias a su polaridad media se extraen mayor n mero de metabolitos y en mayor concentraci n comparando con solventes de diferentes polaridades La selecci n de la mezcla de solventes bencina de petr leo acetona proporci n 8 2 fase m vil para desarrollar las cromatograf as de capa delgada demuestra la baja media polaridad los metabolitos extra dos a partir de los tejidos de fr jol Los extractos del material vegetal tanto de hoja como ra z no mostraron actividad antif ngica en t rminos de halos de inhibici n de crecimiento micelial sin embargo se observaron otros efectos sobre los fitopat genos en relaci n a su pigmentaci n y producci n de conidios como s ntomas de estr s en colonias de R solani y lindemuthianum respect
34. ra la determinaci n de su actividad biol gica la extracci n del material vegetal frecuentemente se realiza con solventes org nicos de bajo punto de ebullici n alcohol y acetato de etilo entre otros y baja reactividad El alcohol es generalmente m s eficaz para recuperar la mayor a de los compuestos presentes Fern ndez y Gonzales 2009 Sin embargo en pruebas preliminares para este trabajo realizando cromatograf a capa delgada en placas de s lica gel se concluy que el mejor solvente para extraer un amplio espectro de metabolitos fue acetato de etilo Las corridas cromatogr ficas de los extractos de acetato de etilo presenta un mayor n mero de bandas con Rf entre 0 05 a 0 93 anexo 2 En la figura 4 los valos en rojo se alan los extractos en acetato de etilo de los tratamientos NPK y MCR24 en los cuales se observa mayor n mero y definici n de bandas Las placas reveladas con vainilla muestran tambi n mayor diversidad de compuestos en los extractos de acetato de etilo 18 Figura 4 Cromatograf a de capa delgada de extractos en diferentes solventes Los valos en rojo muestran los extractos en acetato de etilo Placas visualizadas con A luz blanca luz UV onda larga C luz UV onda corta D luz banca revelado con vanillina El solvente de corrida fase m vil tambi n es determinante en la escogencia del solvente de extracci n en funci n de la resoluci n de las bandas de
35. rakash B Induced Systemic Resistance ISR in Plants Mechanism of Action Indian Journal of Pathology and Microbiology 2007 47 289 297p Domingo D L pez M Plantas con Acci n Antimicrobiana Revista Espa ola Quimioterapia 2003 16 4 385 393p Dom nguez A M todos de Investigaci n fotoqu mica Distrito federal de m xico 1973 Duque Quintana M Determinaci n Preliminar de la Actividad Promotora de Crecimiento Vegetal de Actinomicetos Aislados de suelo Trabajo de grado 2008 1 109 p Ebel J Phytoalexin Synthesis The Biochemical Analysis of the Induction Process Annals review of phytopathology 1986 24 235 264p Fern ndez D Gonz lez Evaluaci n vitro de la Actividad Anti F ngicas del Extracto Foliar del rbol Azadirachta indica Contra algunos hongos Fitopat genos Trabajo de grado Pontificia Universidad Javeriana Bogot 2009 30 Ferroni J Evaluaci n de Respuestas Sist micas Inducidas en Plantas de Frijol Phaseolus vulgaris por la Interacci n con Actinomicetos Nativos Colombianos Trabajo de grado Pontificia Universidad Javeriana 2009 Franco correa M Aislamiento Caracterizaci n y Evaluaci n de Actinomycetes Inhibidores de Algunos Hongos Fitopat genos Tesis de maestr a en microbiolog a Departamento de qu mica instituto de Biotecnolog a Universidad Nacional de Colombia 1999 1 86 p Franco correa Evaluaci n de Caracteres PGPR en Actinomicetos e Interacciones de estas Rh
36. resentaron diferentes coloraciones dependiendo de extracto Los discos con pigmento verde corresponden a los extractos de tejido foliar presencia de 22 clorofila los que no tienen pigmento corresponden a los extractos de tejido radicular Figura 9 Los resultados de actividad biol gica de los extractos en t rminos de halos de inhibici n de crecimiento micelial no fueron positivos Se observ crecimiento masivo al alrededor de los discos de papel impregnados con los extractos para las cepas F oxysporum y R solani En el caso de lindemutianum 86 el crecimiento no fue homog neo sin embargo se observ halo de inhibici n de crecimiento alrededor del disco TERBINAFINA Bm m Figura 8 Pruebas preliminares de actividad del antif ngico comercial Terbinafina para los fitopat genos Fusarium oxysporum Colletotrichum lindemuthianum y Rhizoctonia solani 23 Figura 9 Discos papel filtro inpregnados con los 60 extractos Aunque no se determin inhibici n de crecimiento de los pat genos por acci n de los extractos vegetales se observaron diferencias a nivel morfol gico en el desarrollo de las cepas indicando un posible efecto de estr s por parte de los extractos para lindemuthianum 86 y R solani No siempre las fitoalexinas son inhibitorias de crecimiento en fitopat genos tambi n pueden alterar el metabolismo de los pat genos retrasando su crecimiento y generando alteraciones en s
37. rometano Bencina de petr leo Diclorometano Bencina de petr leo Diclorometano Metanol E Cloroformo Metanol Bencina de petr leo Acetato de ello Bencina de petr leo Acetona Bencina de petr leo Acetona Bencina de petr leo Acetona Bencina de petr leo Acetona Las cromatograf as de ensayo para determinar fase m vil se corrieron con los extractos crudo etan lico y extractos s lido l quido de bencina de petr leo diclorometano y acetato de etilo Posterior a la resoluci n de los extractos las placas se visualizaron en luz visible luz UV longitud de onda larga y corta y se revelaron con vanillina Los resultados de las pruebas preliminares de extracci n determinaron con mejor solvente acetato de etilo por lo tanto la extracci n de los tejidos vegetales se llev a cabo en 65mL del solvente Lindig 2002 a temperatura ambiente por 48 horas Posteriormente se filtr y la biomasa vegetal someti segundo ciclo de extracci n las dos fases de solvente se mezclaron concentraron por rotaevaporaci n a presi n reducida de 240 psi 40 Posteriormente estos extractos se nuevamente a extracci n bajo las mismas condiciones Luego del usaron para evaluar su actividad antimicrobiana frente a fitopat genos espec ficos del frijol Domingo L pez 2003 Fern ndez y Gonz lez 2008 Granada 2009 5 4 Evaluaci n de acti antimicrobiana de los extracto
38. rosc picamente se observaron filamentos ramificados y pocos conidios simples La cepa MCR26 mostr colonias peque as de textura seca pulverulenta anverso de color gris a morado y reverso gris oscuro microsc picamente se observaron filamentos largos y fragmentados micelio tortuoso cadenas de conidios cortas sin formar espirales Figura 3 Morfolog a microsc pica y macrosc pica de los actinomicetos de estudio A microscop a cepa MCR9 MCR 24 MCR 26 Macroscop a cepas 9 MCR 24 MCR 26 en agar avena Las caracter sticas macrosc picas y microsc picas de las cepas MCR9 MCR24 MCR26 concuerdan con lo determinado por Duque y Quintana en el 2008 cuando evaluaron su actividad como PGPR por lo tanto se puede considerar que las cepas est n activas viables y puras 6 2 Preparaci n de siembra y seguimiento de desarrollo de plantas frijol El m todo de desinfecci n de las semillas se escogi despu s de hacer pruebas con diferentes tiempos de desinfecci n en NaCIO por 2 4 6 8 y 10 minutos Los mejores resultados para la germinaci n se consiguieron con concentraciones de hipoclorito al 5 por 6 minutos y etanol al 80 por 30 segundos evit ndose la contaminaci n de las semillas durante el periodo de germinaci n en fotoperiodo y manteni ndose las caracter sticas propias de la semilla color forma tama o y viabilidad finalizar el periodo de germinaci n en fotoperiodo se alcanz el 80 de la germinaci
39. s pocos casos fueron aislados y se evit mezclar las plantas de muestreo con las que presentaran s ntomas de estr s Estos cambios fueron identificados a tiempo gracias a una monitoreo diario de las plantas en el cual no solo se observaban cambios morfol gicos en la planta sino tambi n la etapa de desarrollo en la que se encontraba para as determinar el momento de la cosecha El tiempo de muestreo de los dos estadios de desarrollo no present diferencias marcadas entre los diferentes tratamientos Las plantas alcanzaron el estad o de desarrollo vegetativo 4 luego de 33 d as de siembra en los materos La colecta de material para estad o reproductivo difiri del estad o vegetativo en que todas las plantas llegaron al estad o en el mismo d a el muestreo de las plantas se llev a cabo entre 45 y 51 d as posteriores a la siembra en suelo El hecho de no observar diferencias marcadas en los tiempos de desarrollo de las plantas en cada estad o entre los diferentes tratamientos no permite determinar actividad promotora de crecimiento vegetal por la interacci n de frijol actinomicetos en funci n de aceleraci n del ciclo de desarrollo de las plantas de fr jol La aceleraci n del ciclo de desarrollo vegetativo y reproductivo y la productividad de la planta es uno de los efectos de la interacci n PGPR Lucy et al 2004 Estudios de aplicaci n de PGPR para la protecci n de plantas de pepino frente CMV virus del mosaic
40. s vegetales La actividad biol gica de los extractos se evalu frente a un pat geno foliar como Colletotrichum lindemuthianum y dos pat genos radiculares como Fusarium oxysporum y Rhizoctonia solani Las cepas fueron donadas por el Laboratorio de patolog a del fr jol del CIAT 14 Centro Internacional de Agricultura Tropical Se prepar un banco primario de almacenamiento de discos de agar micelio en agua est ril Los aislamientos f ngicos fueron cultivados en agar avena para la producci n de conidios y micelio y as preparar los in culos para las pruebas de actividad biol gica Para el in culo de C lindemuthianum y F oxysporum se prepar una suspensi n conidial 10 conidios mL En el caso de Rhizoctonia solani pat geno de micelio est ril se prepar el in culo a partir de un cultivo en caldo papa dextrosa que fue licuado para fragmentar el micelio Una vez preparados los in culos se sembraron masivamente 0 1mL en placas de PDA papa dextrosa agar suplementado con Cloranfenicol y azul de metileno PDACAM Ni o 2009 Este medio de cultivo permite valorar el aspecto morfol gico y coloraci n de las colonias f ngicas por su alto contenido en carbohidratos condiciona un mayor crecimiento M rquez 2007 el Cloranfenicol inhibe el crecimiento de bacterias y el azul de metileno genera un buen contraste para la lectura de los halos de inhibici n de crecimiento f ngico Luego de la siembra de los pat genos se coloc
41. si en horas despu s del ataque del pat geno y son t xicas para un amplio espectro de hongos y bacterias pat genas Garc a 2003 La concentraci n de la fitoalexinas depende de factores como la especificidad del inductor concentraci n de elicitor tiempo de contacto con el inductor l nea celular estado de desarrollo del hospedero concentraci n y combinaci n de los fitorreguladores y condiciones ambientales y nutricionales del medio en donde se desarrolla la planta Seg n Ebel 1986 la dosis efectiva que inhibe el crecimiento de hongos y bacterias parece ser elevada y se calcula en el orden de 1x10 a 1x10 concentraci n que se alcanza en el tejido infectado Garc a 2003 Los metab litos secundarios en plantas pueden ser divididos en tres grupos qu micos terpenos fen licos y compuestos que contienen nitr geno La bios ntesis de estos metab litos secundarios est interconectada con la s ntesis de metab litos primarios Figura 1 presta 4 R 7 EN Figura 1 Rutas metab licas en plantas Fuente Agrios 2005 La mayor a de las fitoalexinas reportadas se encuentran entre los compuestos fen licos derivados de flavonoides derivados de la ruta biosint tica de los fenilpropanoides la cual proviene de la ruta de shikimato resultante de la ruta de las pentosas fosfato Agrios 2005 3 3 Generalidades del fr jol El frijol com n Phase
42. sphere Bacteria Annual review of phythopathology 1998 36 453 483p Van loon L Plant Responses to Plant Growth Promoting Rhizobacteria European ournal plant of pathology 2007 119 243 254p Waterman P Mole S Analysis of phenolic plant metabolites Oxford 1994 Yoshikawa M Gemma H Sobajima Y Masago H Rooting Cofactor Activity of Plant Phytoalexins Plant physiology 1986 82 864 866p Universidad Autonoma de Zacatecas Departamento de biologia molecular de plantas Sinteis de Fitoalexinas Http www uaz edu mx uabe lbmp sintesis htm consultado el julio 15 de 2010 32 10 ANEXOS ANEXO 10 1 Convenci n de tratamientos para cada extracto CODIGO ESTADIO TRATAMIENTO REPLICA INTER CONVENCION Control H20 1 1 1 Control H20 2 2 2 Control H20 Control NPK 1 4 VRI Control NPK 2 5 VRT2 Control NPK 6 1 3 Streptomyces MCR9 1 7 Streptomyces MCR9 _ 2 8 VR9 2 RAIZ Streptomyces mCR9 3 E VR9 3 Termofida MCR24 1 10 VA241 Termofida MOR24 2 VR24 2 Termofida MCR24 3 12 VA24 3 Streplomyces MOR26 1 13 VR26 1 Streptomyces MCR26 2 14 VR26 2 Streptomyces 26 15 VR26 3 Control H20 1 16 1 Control H20 2 17 2 Control H20 a 18 3 Control NPK 1 19 1 1 Control NPK 2 20 1 2 Control NPK a 21 1 3 Streptomyces
43. ter stico del fitopat geno permanece esto confirma una vez m s que los extractos pueden ser los causantes de esta alteraci n Este efecto en la morfolog a de la colonia consiste en una diferencia en la pigmentaci n del micelio Los cultivos de los tratamientos mencionados anteriormente presentan pigmentaci n marr n claro mientras que el micelio del resto de los tratamientos se observa blanco Figura 10 Es probable que los extractos est n ejerciendo estr s sobre el pat geno y ste en respuesta no sintetice melanina por lo cual el micelio no se observa oscuro Hyakumachi et al 1987 Abi Ellil y Sharaf 2003 En este caso los extractos pueden ser inhibidores de expresi n de factores de patogenicidad ya que la melanina cumple funciones importantes en los fitopat genos atribuyendo mecanismos de opresi n necesarios en el momento de la infecci n Hyakumachi et al 1987 G mez y Nosanchuk 2003 Figura 10 Comparaci n del efecto en la inhibici n de melanina provocado por extractos de frijol frente 25 lindemutianum 86 en respuesta al enfrentamiento con los diferentes extractos present mayor producci n de conidios Figura 11 aunque no se observaron diferencias entre los diferentes tratamientos De los 60 extractos evaluados 46 indujeron producci n de conidios y en los 14 restantes las colonias se comportaron de igual forma que el control negativo DMSO etanol y el control de crecimiento sin solvente Los 14 e
44. tos Figura 7 Prueba de crecimiento de Phaeoisiaopsis griseola en diferentes medios de cultivo para inducir mayor tasa de crecimiento y producci n de conidios Las pruebas preliminares de actividad de antif ngicos comerciales mostraron inhibici n de F oxysporum por DMSO puro Figura 8 Siendo el DMSO esencial como solvente para asegurar su difusi n en el medio de los extractos se probaron mezclas de DMSO y etanol como solvente para diluir los extractos La mezcla en proporci n 1 1 no mostr inhibici n de crecimiento del pat geno En cuanto a la actividad antif ngica de terbinafina se observ inhibici n de crecimiento para las cepas de F oxysporum lindemuthianum 86 pero en menor proporci n para la cepa de A solani obteniendo halos de 32mm 17mm y 7mm respectivamente Adicionalmente se evalu el posible efecto inhibitorio de acetato de etilo sobre los pat genos f ngicos teniendo en cuenta que las diluciones de los extractos en DMSO etanol contienen trazas de este solvente Ninguno de los pat genos inhibi su crecimiento por acetato de etilo esto puede deberse a que el acetato de etilo por ser un solvente de alta presi n de vapor se evapora r pidamente sin dejar trazas en el papel filtro o el medio de cultivo que puedan tener efecto delet reo para las cepas de los fitopat genos Para la prueba de actividad antimicrobiana a partir de los discos de papel filtro impregnados con los 60 extractos los discos p
45. u morfolog a Hammerschmidt 1999 Las fitoalexinas no son espec ficas en su comportamiento debido a que sin importar el tipo de agente bi tico o abi tico utilizado como inductor el nivel de resistencia en la planta var a en funci n de los pat genos Agrios 2004 pues estos no responden de la misma manera ya que muchos expresan mecanismos de detoxificaci n Tambi n es muy importante la concentraci n de fitoalexinas producida para lograr un efecto m s evidente frente a la inhibici n del pat geno Entre las fitoalexinas producidas por el fr jol se encuentra la faseolina la cual se ha identificado como inhibidora de diferentes fitopat genos pero esta est presente principalmente en las semillas Garc a 2003 Teniendo en cuenta que en este estudio no se prepararon extractos a partir de semillas no se podr a asegurar que la interacci n con actinomicetos no induce la s ntesis de este metabolito Las plantas de fr jol en respuesta la inoculaci n con los actinomicetos pudieron sintetizar otro tipo de fitoalexinas diferentes a la faseolina ya que se repotan16 tipos de fitoalexinas en fr jol Universidad Aut noma de Zacatecas 2010 pero quiz s la concentraci n no fue suficiente para observarse un efecto inhibitorio en el crecimiento f ngico Las fitoalexinas sintetizadas por una misma especie vegetal no se comportan de la misma forma y su s ntesis depende directamente del elicitor bi tico o abi tico Por otro lado las
46. xcluyeron del estudio por su baja producci n de conidios y lento crecimiento respectivamente Se probaron diferentes medios de cultivo como Muller Hinton suplementado con glucosa V8 V8 suplementado con 2 y 4 p v de harina de amaranto para inducir mayor crecimiento de P griseola en incubaci n con luz constante y oscuridad constante Figura 7 pero los resultados no fueron los esperados Steinglein et al 2006 20 Figura 6 Caracterizaci n morfol gica microsc pica de aislamientos f ngicos tinci n azul de lactolenol A Phaeoisariopsis griseola Rhizoctonia solani Fusarium oxysporium D Colletotrichum lindemutianum 56 E Colletotrichum lindemutianum 86 A partir de la reconstituci n de las cepas en medio avena hizo repique en los medios Muller Hinton comercial Muller Hinton preparado por componentes y PDA luego de cinco d as de incubaci n 22 0 se evalu su comportamiento en los diferentes medios obteniendo que la mejor producci n de micelio y conidos se da en el medio PDA Se present buen crecimiento en todos los medios pero en el medio PDA se determin mayor producci n de conidios en menor tiempo y desarrollo de micelio m s homog neo la placa de cultivo En repiques sucesivos 21 tambi n se observ mayor estabilidad morfol gica en medio PDA estas razones el medio PDA fue seleccionado para las pruebas de actividad antimicrobiana de los extrac
47. xtractos fueron VRO 1 VRO 2 VHO 3 VRO 3 VR1 2 VR1 3 VR26 1 VHO 3 VH26 1 VH26 2 RHO 3 RR1 2 RR26 3 y RH24 1 La inducci n temprana de producci n de conidios puede estar asociada a un efecto de estr s por parte de los extractos Figura 11 Efecto de esporulaci n ocasionado por extractos de frijol en lindemuthianumB6 Es importante agregar que en la mayor a de los casos es dif cil de diferenciar si el compuesto con actividad antimicrobiana se sintetiza por inducci n de un elicitor o se sintetiza constitutivamente fitoanticipinas Adem s no se ha comprobado en que parte de la planta puedan encontrarse las mayores concentraciones de las fitoalexinas se desconoce si su producci n est ntimamente relacionada a un fen meno espec fico que ocurre en una etapa en particular de la inducci n o de la enfermedad Granada 2009 Por las razones mencionadas anteriormente se prepararon extractos de tejidos foliares y radiculares y se muestre en dos etapas diferentes de desarrollo asumiendo que en estadios vegetativos y reproductivos se expresan rutas metab licas secundarias diferentes Para diferenciar entre fitoalexinas y fitoanticipinas la estrategia fue la comparaci n entre los tratamientos de inoculaci n con actinomicetos y los controles tratados con agua y fertilizante NPK Entre algunas de las caracter sticas de los compuestos fen licos existe la posibilidad de volatilizaci n este fen menos se puede presentar desde
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