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IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE HONGOS AISLADOS DE
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1. UNIVERSIDAD Hs NACIONAL aa DE COLOMBIA _ ACTA BIOLOGICA COLOMBIANA FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE BIOLOG A Art culo de investigaci n IDENTIFICACI N MOLECULAR DE HONGOS AISLADOS DE TEJIDOS DE FRIJOL CON SINTOMAS DE ANTRACNOSIS Molecular Identification of Fungi Isolated from Bean Tissues with Anthracnose Symptoms KATHERIN M VANEGAS BERROUET I A PABLO A GUTIERREZ S NCHEZ Ph D MAURICIO A MARIN MONTOYA Ph D 1 Laboratorios de Microbiolog a Industrial y Biolog a Celular y Molecular Universidad Nacional de Colombia Sede Medell n Calle 59A 63 20 Bloque 19A Medell n Colombia kmvanega unal edu co paguties unal edu co mamarinm unal edu co Autor de correspondencia Mauricio Mar n Montoya mamarinm unal edu co Presentado el 1 de agosto de 2013 aceptado el 1 de octubre de 2013 fecha de reenv o el 12 de diciembre de 2013 Citation Citar este art culo como VANEGAS BERROUET KM GUTI RREZ S NCHEZ PA MAR N MONTOYA MA Identificaci n molecular de hongos aislados de tejidos de fr jol con s ntomas de antracnosis Acta biol Colomb 2014 19 2 143 154 RESUMEN En este estudio se realiz el aislamiento de hongos en tejidos foliares y vainas de fr jol con s ntomas de antracnosis procedentes de cultivos de diferentes municipios del departamento de Antioquia Colombia La identificaci n de los aislamientos se realiz con base en la secuenciaci n de las regiones ITS del ADN ribosomal y se
2. Galvez G editors Bean production problems Cali Centro Internacional de Agricultura Tropical CIAT 1989 p 77 104 Punja ZK Utkhede RS Using fungi and yeasts to manage vegetable crop diseases Trends Biotechnol 2003 21 9 400 407 Santa C Mar n M D ez MC Identificaci n del agente causal de la pudrici n basal del tallo de vainilla en cultivos bajo cobertizos en Colombia Rev Mex Micol 2012 35 1 23 34 Identificaci n molecular de hongos aislados de tejidos de fr jol con s ntomas de antracnosis Schwartz HF Steadman JR Hall R Forster RL Com pendium of Bean Diseases 2nd ed St Paul APS Press 2005 p 109 Schulz B Guske S Dammann U Boyle C Endophyte host interactions Il Defining symbiosis of the endophyte host interaction Symbiosis 1998 25 1 213 227 Schulz B Boyle C Draeger S Rommert AK Endophytic fungi a source of novel biologically active secondary metabolites Mycol Res 2002 106 9 996 1004 Schulz B Boyle C The endophytic continuum Mycol Res 2005 109 6 661 686 Seena S Sridhar KR Endophytic fungal diversity of 2 sand dune wild legumes from the southwest coast of India Can J Microbiol 2004 50 12 1015 1021 Selim KA El Beih AA Abdel Rahman TM El Diwany Al Biology of Endophytic Fungi CREAM 2012 2 1 31 82 Stierle A Strobel GA Stierle D Taxol and taxane production by Taxomyces andreanae Science 1993 260 5105 214 216 Stone JK Bacon CW White JF An overview of endo
3. Con el fin de confirmar la naturaleza de los am plicones mediante secuenciaci n en ambas direcciones con la metodolog a de Big Dye Terminator Cycle Applied Biosystems E E U U en un secuenciador ABI Prism 3730XL PE Applied Biosystems de la compa a Macrogen Corea del Sur Las secuencias obtenidas con cada cebador se editaron y ensamblaron los consensos mediante Bioedit 6 0 6 Hall 1999 para proceder a su comparaci n con la base de datos de GenBank mediante Blastn y Blastx http www ncbi nlm nih gov BLAST Identificaci n molecular de hongos end fitos La identifi caci n molecular de los aislamientos end fitos se realiz con base en la amplificaci n por PCR con los cebadores univer sales ITS1 5 TCC GTA GGT GAA CCT GCG G 3 e ITS4 5 TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 3 White et al 1990 y su posterior secuenciaci n tal como se indic anteriormen te En adici n se obtuvieron secuencias de referencia de dife rentes especies de hongos reportados como end fitos en la literatura Schulz et al 2002 Schulz y Boyle 2005 Selim et al 2012 para realizar un alineamiento con el algoritmo Clustal W incluido en el software Bioedit 6 0 6 Hall 1999 La matriz obtenida fue empleada para realizar an lisis filoge n ticos basados en los algoritmos de Neighbor Joining NJ y M xima verosimilitud ML con distancia gen tica calculada por el m todo de Kimura dos par metros mediante el software Mega 5 0 Ta
4. Santa Rosa de Osos 06 38 51 N 75 27 37 W altitud 2550 ms n m Son s n 05 42 44 N 75 18 50 W altitud 2475 ms n m y Urrao 006 18 55 N 76 08 03 W altitud 1800 ms n m En estos municipios se colectaron al menos diez muestras de vainas y fol olos de fr jol variedad Cargamanto con s ntomas de antracnosis Las muestras utilizadas para el aislamiento de hongos consistieron de porciones de tejido de aproxima damente 1 cm de las zonas de avance de las lesiones que se desinfestaron en una soluci n de hipoclorito de sodio al 1 durante 1 min se lavaron con agua destilada est ril y se sembraron en medio de cultivo Papa Dextrosa Agar PDA suplementado con penicilina y tetraciclina 100 mg L Los cultivos se incubaron a temperatura ambiente 20 24 C durante 5 7 d as bajo un fotoper odo de 12 h luz 12 h os curidad realiz ndose transferencias a nuevos medios PDA de todas las colonias morfol gicamente identificadas como C lindemuthianum y de al menos uno de los otros morfotipos obtenidos Los aislamientos se encuentran conservados a 4 C en el Laboratorio de Microbiolog a industrial de la Universidad nacional de Colombia sede Medell n En todos los aislamientos se realizaron montajes microsc picos para evaluar la presencia de estructuras reproductivas y sus ca racter sticas morfol gicas comparadas con las descripciones disponibles en Mycobank www Mycobank org De cada municipio
5. se seleccion al menos un aislamiento presumi blemente de C lindemuthianum de vaina y de tejido foliar para la confirmaci n molecular de su identidad Identificaci n molecular de los hongos Extracci n de cidos nucleicos Cada aislamiento purificado se coloc en matraces conteniendo 20 mL de medio l quido extracto de malta al 2 ME incub ndose a temperatura ambiente en oscuridad por 16 20 d as El ADN del micelio obtenido se extrajo por el m todo del CTAB 3X siguiendo el protocolo descrito por Doyle y Doyle 1990 modificado por Santa et al 2012 La integridad del ADN se determin por electroforesis en gel de agarosa al 0 8 suplementado con bromuro de etidio 10 mg mL Los geles se fotodocumen taron con el sistema digital Bio Doc Analyze Biometra Alemania La concentraci n y pureza del ADN se eval o por lecturas a 260 nm y 280 nm en un equipo Nanodrop 2000C Thermo E E U U Identificaci n molecular de C lindemuthianum De cada mu nicipio se seleccion al menos un aislamiento de vaina y de tejido foliar Tabla 1 morfol gicamente identificado como Tabla 1 Aislamientos de Colletotrichum lindemuthianum obtenidos en tejidos de plantas de fr jol variedad Cargamanto de diferentes municipios del departamento de Antioquia Colombia La confirmaci n de su identidad se realiz mediante PCR d plex con cebadores CD1 CD2 y CY1 CY2 Aislamientos Procedencia Prueba PCR d plex K3 K4 Vaina Carmen de Vibo
6. Fig 2 El primer clado se subdividi a su vez en tres subclados IA IB IC con valores de bootstrap de 100 El lA correspondi al g nero teleom rfico Pleospora y a diferentes especies de Stemphylium en este clado se ubic adem s la secuencia del aislamiento K26 con un nivel de identidad de 0 994 con respecto a este ltimo g nero mitosp rico matriz no mostrada El subcla do IB correspondi al g nero anam rfico Alternaria e incluy dos aislamientos colectados en este estudio K27 y K35 con niveles de identidad de 1 con respecto a miembros de este g nero mientras que el subclado IC agrupo a las formas perfectas e imperfectas Curvularia lunata de la especie Cochliobolus lunatus con el aislamiento K8 con quienes com parti niveles de identidad de 0 994 Por otra parte el clado II se dividi en dos subclados IIA y IIB con valores de bootstrap gt 99 separando en el IIA a la especie Leptosphaerulina chartarum de otras especies de este g nero ej L americana L trifolii y de formas mitosp ricas picnidiales como Phoma Coniothyrium y Ampelomyces sp La matriz de identidad generada permite plantear la hip tesis taxon mica que el aislamiento K12 pertenece a dicha especie identidad 0 996 pero no as el aislamiento K2 pues solo present un valor de identidad de 0 9 con esta En el sub clado IIB se ubicaron en diferentes posiciones los aisla mientos K13 K16 y K17 los dos primeros compartieron niveles de
7. al 2000 Sin embargo en un sen tido m s limitado es frecuente utilizar esta denominaci n para aquellos hongos y bacterias que colonizan una planta sin causarle s ntomas visibles Schulz y Boyle 2005 Estudios recientes en diferentes plantas han demostrado que los hongos end fitos son ubicuos al reino vegetal Ganley et al 2004 Kumar et al 2004 Zhang et al 2006 Huang etal 2009 Adem s de los beneficios en la protecci n vegetal los hongos end fitos han sido reconocidos como fuente impor tante de nuevos productos naturales para la industria farma c utica agr cola e industrial Huang et al 2009 Schulz et al 2002 reportan que de 6500 hongos end fitos aislados de diferentes plantas herb ceas rboles y algas filamentosas de Alemania y Costa Rica el 80 presentaban efectos anti bacteriales fungicidas alguicidas o herbicidas Los principa les metabolitos hasta ahora caracterizados en estos hongos incluyen polic tidos isoprenoides esteroides xanthonas fe noles isocumarinas derivados de perileno quinonas furan dionas terpenoides depsip ptidos y citochalasinas Tan y Zou 2001 Selim etal 2012 siendo un ejemplo claro de su gran potencial biotecnol gico el descubrimiento del taxol paclitaxel un potente alcaloide inhibidor de c lulas cance r genas en el hongo end fito Taxonomyces andreanae aislado de la planta gimnosperma Taxus chiniensis var mairei Stierle etal 1993 Los hongos e
8. con fungicidas sist micos y protectantes y la siembra de variedades resistentes al hongo Schwartz et al 2005 siendo a n poco explorada la utilizaci n de estrategias de control biol gico de C lindemuthianum bien por antagonismo directo o por inducci n de resistencia en su hospedante En los ltimos a os diferentes estudios han demostrado que la utilizaci n de consorcios microbiales hongos y bacterias end fitos impactan positivamente la sanidad de las plantas inoculadas gracias a la inducci n de cascadas de defensa asociadas a los mecanismos de resistencia sist mica adqui rida SAR resistencia sistema inducida ISR y resistencia a insectos mediada por cido jasm nico Schulz et al 2005 Selim et al 2012 Debido a esto es posible el tratamiento de semillas o pl ntulas con bioformulaciones de end fitos que colonicen los tejidos del hospedante y compitan eficien temente contra microorganismos fitop togenos en la rizos fera y o filosfera Schulz y Boyle 2005 El t rmino end fito es amplio dadas sus ra ces griegas de las 144 Acta biol Colomb 19 1 143 154 mayo agosto de 2014 palabras endon dentro y phyton planta y por tanto su utilizaci n biol gica no ha carecido de controversia Schulz y Boyle 2005 Por esto en t rminos generales se refiere a cualquier microorganismo que viva en el interior de los teji dos vegetales y cuyos efectos pueden ser neutros ben ficos o detrimentales Stone et
9. confirm por observaci n microsc pica de estructuras reproductivas en aquellos aislamientos que esporulaban en medios de cultivo En todas las muestras sintom ticas se logr el aislamiento del agente causal de la antracnosis Colletotrichum lindemuthianum siendo confirmada su identidad por PCR d plex con cebadores espec ficos CD1 CD2 y CY1 CY2 En adici n se obtuvieron 17 hongos end fitos 14 de los cuales no esporularon en medio de cultivo Mycelia sterilia siendo identificados mediante an lisis filogen ticos de regiones ITS como miembros de los Ascomycetes Leptosphaerulina tres aislamientos Diaporthe tres aislamientos Gibberella un aislamiento Plectosphaerella un aislamiento y Biscogniauxia un aislamiento y de los g neros mitosp ricos Phoma dos aislamientos Alternaria dos aislamientos y Stemphylium un aislamiento Los tres hongos restantes se identificaron con base en caracteres morfol gicos y secuenciaci n como miembros de los g neros Fusarium dos aislamientos y de la especie Curvularia lunata un aislamiento Este estudio aumenta el conocimiento de la micobiota de leguminosas como base para el desarrollo de estudios futuros que permitan evaluar el efecto de estos hongos sobre el desarrollo de enfermedades como la antracnosis y de otros problemas bi ticos y abi ticos del cultivo del fr jol Palabras clave ADNr end fitos PCR Phaseolus vulgaris ABSTRACT In this work endophytic fungi from leaves and p
10. cucumerina D novem D phaseolorum y L chartarum La mayor parte de los aislamientos identificados en este es tudio concuerdan con los reportes de los principales g neros de hongos end fitos registrados en la literatura Schulz et al 2002 Schulz y Boyle 2005 Selim et al 2012 As por ejemplo Schulz et al 1998 en un estudio que incluy m s de 6000 end fitos de cerca de 500 plantas diferentes de la regi n templada encontraron que la mayor a de estos hongos pertenec an a g neros ubicuos como Acremonium Alternaria Cladosporium Coniothyrium Epicoccum Fusarium Geniculosporium Phoma y Pleospora mientras que Schulz y Boyle 2005 indican que algunos g neros son comunes a las regiones tropicales y templadas ej Fusarium Phomopsis Phoma Por otra parte los miembros del orden Xylariales y de los g neros Colletotrichum Guignardia Phyllosticta y Pestalotiopsis predominan como end fitos en los tr picos En adici n diferentes estudios tambi n han reportado la ocurrencia de end fitos espec ficos a un hospedante particular tal como ocurre en el caso del hongo Lophodermium spp en con feras Discula umbrinella en Fagus sylvatica y Physalospora vaccinii en Vaccinium oxycoccus Shulz y Boyle 2005 Una muestra clara de esta situaci n se aprecia en los resultados de un estudio reportado por estos autores en el que se inocularon brotes de fr jol con 26 aislamientos de hongos end fitos aislados de esta planta
11. de fr jol con s ntomas de antracnosis et al 2003 Afortunadamente la disponibilidad actual que ofrecen las t cnicas moleculares para complementar los es tudios taxon micos de hongos brinda herramientas que posibilitan la identificaci n de hongos end fitos a n en ausencia de esporas Huang et al 2009 El conocimiento de la diversidad de hongos end fitos aso ciados a tejidos infectados por fitopat genos es fundamental para la comprensi n de las interacciones hospedante pa t geno y puede ser fuente importante de posibles agentes de control biol gico o de promoci n de mecanismos de defensa en las plantas Punja y Utkhede 2003 Porque el conoci miento que se tiene de la micobiota end fita en ambientes altoandinos es muy limitado en esta investigaci n se evalu la diversidad de hongos asociados a lesiones de antracnosis de fr jol variedad Cargamanto a partir de su aislamiento de diferentes cultivos del departamento de Antioquia Co lombia realiz ndose su identificaci n con base en an lisis filogen ticos de secuencias de regiones ITS del ADN ribo somal ADNr MATERIALES Y METODOS Aislamiento de hongos Se realizaron colectas de tejidos de fr jol en los municipios de Antioquia Carmen de V boral 06 05 06 N 75 20 19 W altitud 2150 ms n m La Uni n 05 58 28 N 75 21 43 W altitud 2400 ms n m Marinilla 06 10 36 N 75 20 21 W altitud 2120 ms n m
12. la reducci n de la severidad de enfermedades la prevenci n de la herbivor a y la tolerancia a sequ as Seena y Sridhar 2004 Adem s es frecuente el aislamiento y la carac terizaci n a partir de extractos de hongos end fitos de nuevos compuestos bioactivos y metobolitos secundarios de utilidad en diferentes campos ej control biol gico de plagas y enfer medades drogas antitumorales y antibi ticas an logos de hormonas vegetales Schulz et al 2002 Selim et al 2012 CONCLUSIONES El presente trabajo representa un primer reporte de la mi cobiota asociada a cultivos de fr jol de las regiones altoan dinas del departamento de Antioquia El efecto de dichos Acta biol Colomb 19 1 143 154 mayo agosto de 2014 151 Vanegas KM Guti rrez PA Mar n MA hongos sobre el desarrollo epidemiol gico de enfermedades como la antracnosis del fr jol o incluso de ataques de in sectos plagas es hasta ahora desconocido y deber a ser abordado en un pr ximo estudio en el que se realicen pre inoculaciones individuales y en consorcios de estos hongos En este sentido en un estudio reciente Akutse et al 2013 reportaron la utilidad de la inoculaci n de diez hongos pertenecientes a los g neros Beauveria 3 Hypocrea 1 Gibberella 1 Metarhizium 2 Trichoderma 1 y Fusarium 2 para reducir el efecto del minador la arveja y el fr jol Liriomyza huidobrensis encontrando que ocho de los aislamientos una vez coloniz
13. y 19 procedentes de otras especies vegetales encontrando que el 69 de los primeros pod an colonizar los tejidos de fr jol inoculados mientras que este valor tan solo alcanzaba el 7 de los otros aislamientos Con relaci n al aislamiento de hongos end fitos en legumi nosas herb ceas diferentes reportes se alan como algunos de los hongos m s frecuentes en estos hospedantes a Alternaria alternata Alternaria tenuissima Bipolaris sp Cladosporium sp Colletotrichum sp Curvularia lunata Epicoccum nigrum Glomerella cingulate Glomerella glycines Nigrospora sphaerica Colletotrichum truncatum Chaetomium globosum Phoma sp Aspergillus sp Trichoderma sp Drechslera sp Penicillium sp Phomopsis longicolla Phomopsis sojae Phomopsis sp Pleospora herbarum Fusarium spp y Stemphylium sp entre otros Larran et al 2002 Seena y Sridhar 2004 Dudeja et al 2012 siendo destacado el he cho que de los 11 g neros encontrados en el presente estu dio siete incluyendo a Colletotrichum coinciden con dicho listado Los cuatro hongos restantes Diaporthe Gomes etal 2013 Plectosphaerella Rosa et al 2012 Leptosphaerulina Suryanarayanan y Murali 2006 y Biscogniauxia Nugent et al 2005 son frecuentemente registrados como end fitos de diferentes plantas en el tr pico y la regi n templada La asociaci n de hongos end fitos con sus plantas hospe dantes resulta en ventajas como la promoci n de su creci miento
14. aron los tejidos de las plantas fueron patog nicos al minador causando un 100 de mortalidad luego de 13 a 15 d as de contacto con el insecto En adici n la emer gencia de los adultos fue significativamente reducida cuando se inocul con Hypocrea spp 21 4 y Beauveria spp 38 Se espera que los resultados de la presente investigaci n estimulen la realizaci n de estudios bioprospectivos que conduzcan al mejoramiento de las condiciones sanitarias de los cultivos de fr jol en nuestro medio y o que permitan identificar compuestos que generen valor agregado a la cadena productiva de leguminosas en Colombia AGRADECIMIENTOS Esta investigaci n fue financiada por la Vicerrector a de Investigaciones de la Universidad Nacional de Colombia proyecto 20101009932 Convocatoria Nacional para el fortalecimiento de los Grupos de Investigaci n y Creaci n Art stica de la Universidad Nacional de Colombia 2010 2012 Se agradece al Profesor Mauricio Salazar Yepes por su apoyo en la colecci n y el aislamiento de los hongos BIBLIOGRAF A Akutse KS Maniania NK Fiaboe KK Van Den Berg J Ekesi S Endophytic colonization of Vicia faba and Phaseolus vulgaris Fabaceae by fungal pathogens and their effects on the life history parameters of Liriomyza huidobrensis Diptera Agromyzidae Fungal Ecol 2013 6 4 293 301 Arias JH Rengifo T Jaramillo M Manual T cnico Buenas Pr cticas Agr colas en la Producci n de Frijol Voluble Mede
15. dente la diferencia en el n mero de aislamientos obtenidos en tejido foliar 14 con relaci n a aquellos de tejido de vaina tres Tabla 2 La identificaci n morfol gica de C lindemuthianum se logr en los siete aislamientos obtenidos de vainas presentando conidias hialinas cil ndricas y unicelulares promedio SD 15 75 2 44 x 4 7640 46 y micelio septado de colores gris a negro oliva Liu et al 2013 Para el caso de los hongos end fitos solo se logr la observaci n de esporas en tres aislamientos los que fueron identificados morfol gicamente a nivel de g nero como Curvularia K8 y Fusarium K1 y K36 Los 14 aislamientos end fitos restantes fueron catalogados seg n el criterio de Lacap et al 2003 como Mycelia sterilia debido a la ausencia de estructuras reproductivas en sus medios de cultivo Identificaci n molecular de los hongos El m todo de extracci n de ADN basado en el uso de CTAB 3X permiti obtener ADN en la cantidad y calidad adecuada con un promedio de concentraci n de 625 5 ng uL SD 670 7 y relaciones de 260 nm 280 nm de 1 63 SD 0 24 Identificaci n molecular de C lindemuthianum Las reacciones de PCR d plex con el par de cebadores CD1 CD2 y CY1 CY2 1000 pb 500 pb 100 pb 1000 pb 500 pb 100 pb generaron los fragmentos del tama o esperado de 638 pb y 442 pb respectivamente en los aislamientos identificados morfol gicamente como C lindemuthianum pero no en los otros mo
16. iabialidad gen tica de este hongo en Antioquia con base en la utilizaci n de marcadores moleculares microsat lites dise ados por nuestro grupo Adem s del aislamiento del agente causal de la antracnosis tambi n se obtuvieron 17 cepas de hongos asociados a los tejidos infectados y que por aislarse del interior de los tejidos de fr jol previa desinfecci n superficial fueron denominados como endofitos siguiendo la terminolog a planteada por Stone et al 2000 De este proceso de aislamiento fue evidente una mayor proporci n de aislamientos obtenidos en tejido foliar de fr jol 14 17 en comparaci n con tejido de vaina 3 17 Esta situaci n era de esperarse por cuanto el espacio intercelular parenquim tico es el sitio donde se presenta en mayor medida la colonizaci n de end fitos en tejidos a reos de plantas Schulz y Boyle 2005 Selim et al Identificaci n molecular de hongos aislados de tejidos de fr jol con s ntomas de antracnosis GU584954 Pleospora herbarum K26 Antioquia JX424810 Stemphylium vesicanum JX424813 Stemphylium vesicanum JX164072 Stemphylium sp AF203448 Stemphylium solani GU934566 Stemphylium globuliferum 96 JN108912 Altemaria brassicae HQ014678 Altemana altemate DQ242505 Altemana arborescens AF314581 Altemana gaisen 95 IB KC771501 Altemaria arborescens I K27 Antioquia K35 Antioquia KC288118 Curvularia lunata KC462186 Curvularia lunata 100 FJ040177 Cochliobolus lunatus 100 10 Pleos
17. identidad de 0 996 con especies de Phoma y el ltimo de 0 994 con las especies L americana y L trifolii adem s de Coniothyrium aleuritis por lo que no fue posible identificar dichos aislamientos a nivel de especie Con respecto al dendrograma generado para los Sorda riomycetes este present cinco clados principales 1 a V con valores de bootstrap gt 99 Fig 3 El clado correspondi a la familia Nectriaceae del Orden Hypocreales e incluy ade m s de diferentes especies del g nero Fusarium o de su forma sexual Gibberella a tres de los aislamientos obtenidos en este estudio K1 K18 y K36 La matriz de identidad resultante 148 Acta biol Colomb 19 1 143 154 mayo agosto de 2014 permite plantear que estos aislamientos est n filogen ti camente asociados con las especies F equiseti F oxysporum y Gibberella zeae An F graminearum respectivamente al presen tarse niveles de identidad con respecto a secuencias de refe rencia de dichas especies superiores a 0 992 Por su parte los clados Il y Ill representan las familias Plectosphaerellaceae y Glomerellaceae del orden Glomerellales respectivamente siendo posible identificar como miembro de la especie Plectosphaerella cucumerina al aislamiento K33 identidad 0 988 y confirmar la identidad de los dos aislamientos de referencia K39 y K41 como C lindemuthianum El clado IV representa al orden Diaporthales al contener tanto formas perfectas del g nero Diapor
18. lar de hongos aislados de tejidos de fr jol con s ntomas de antracnosis 2012 Existen adem s varios reportes que se alan que al gunos end fitos est n adaptados a ciertos rganos vegetales por ejemplo Phyllosticta multicorniculata lo est en ac culas de abetos Melanconium apiocarpum y Cryptosporiopsis sp est n con finados a corteza de Alnus spp y Phialocephala spp y Phialopora spp parecen ser espec ficos solo a ra ces de Quercus spp Schulz y Boyle 2005 Por esto la inoculaci n cruzada de los aislamientos obtenidos en el presente estudio en vaina y tejido foliar permitir en el futuro evaluar la hip tesis de especializaci n de tejidos en end fitos en fr jol La secuenciaci n de las regiones ITS del ADNr de los aisla mientos permiti su identificaci n taxon mica en el mbito gen rico aunque para algunas cepas los an lisis filogen ticos realizados posibilitaron plantear su identidad en cuanto a especie Todos los aislamientos obtenidos correspondieron a Ascomycetes de las clases Dothideomycetes o Sordario mycetes y dada la ausencia de estructuras reproductivas en la mayor a de las colonias 14 17 solo fue posible confir mar la identidad morfol gica y molecular en tres cepas una de Curvularia lunata y dos especies de Fusarium F oxysporum y F equiseti La presencia de hongos Mycelia sterilia en estudios de aisla miento de hongos end fitos en diferentes plantas y tejidos vegetales es frecuente
19. ll n FAO 2007 p 198 Chaves G Anthracnose En Schwartz H Galvez G editors Bean production problems Cali Centro Internacional de Agricultura Tropical CIAT 1989 p 39 54 Chen YY Conner RL Gillard CL MClaren DL Boland GJ Balasubramanian PM etal A quantitative real time PCR assay for detection of Colletotrichum lindemuthianum in navy bean seeds Plant Pathol 2012 62 4 900 907 Doyle JJ Doyle JL Isolation of plant DNA from fresh tissue Focus 1990 12 13 15 Dudeja SS Giri R Saini R Suneja Madan P Kothe E Interaction of endophytic microbes with legumes J Basic Microbiol 2012 52 3 248 260 152 Acta biol Colomb 19 1 143 154 mayo agosto de 2014 Felsenstein J Confidence limits on phylogenies an approach using the bootstrap Evolution 1985 39 4 783 791 FENALCE El cultivo de frijol Historia e importancia El cerealista 2010 Mayo junio 30 31 Ganley RJ Brunsfeld SJ Newcombe G A community of unknown endophytic fungi in western white pine Proc Natl Acad Sci U S A 2004 101 27 10107 10112 Gomes RR Glienke C Videira Sl Lombard L Groenewald JZ Crous PW Diaporthe a genus of endophytic saprobic and plant pathogenic fungi Persoonia 2013 31 1 1 41 Guo LD Hyde KD Liew EC Identification of endophytic fungi from Livingstonia chinensis based on morphology and rDNA sequences New Phytol 2000 147 3 617 630 Hall TA BioEdit a user friendly biological sequence alignment editor a
20. morum Pp K33 Antioquia I 4Q238971 Plectosphaerella pauciseptata JQ796755 Plectosphaerella cucumerina 92 HQ238969 Plectosphaerella plurivora K39 Colletotrichum lindemuthianum Antioquia Glomerellales K41 Colletotrichum lindemuthianum Antioquia JX546816 Glomerella lindemuthiana HQ330982 Glomerella acutata KC343157 Diaporthe novem AJ312366 Diaporthe helianthi 10 Antioquia KC343180 Diaporthe phaseolorum EU520302 Phomopsis euphorbiae AB302247 Phomopsis sp JF430490 Diaporthe phaseolorum K20 Antioquia K34 Antioquia KC145886 Diaporthe actinidiae JX231011 Phomopsis malvacearum Diaporthales EF026133 Biscogniauxia cylindrispora EF155488 Biscogniauxia nummularia EF026131 Biscogniauxia capnodes FJ884075 Biscogniauxia sp Xylariales K32 Antioquia EF495236 Plectosphaerella cucumerina RA 0 1 DQ411531 Uromyces appendiculatus Figura 3 rbol filogen tico basado en secuencias de la regi n ITS del ADNr de hongos Sordariomycetes aislados de tejidos de fr jol variedad Cargamanto en el departamento de Antioquia Colombia identificados por la letra K Los n meros en las ramas indican los valores de bootstrap gt 80 y los n meros romanos corresponden a los clados referidos en el texto En algunas accesiones se indica el nombre del teleomorfo Ej Glomerella porque as fue depositada la accesi n en GenBank 150 Acta biol Colomb 19 1 143 154 mayo agosto de 2014 Identificaci n molecu
21. mura et al 2011 El soporte de la topolog a interna de los rboles filogen ticos se realiz mediante an lisis de bootstrap con 1 000 iteraciones Felsenstein 1985 RESULTADOS En total se obtuvieron 34 aislamientos de hongos 17 corres pondieron a C lindemuthianum y 17 a hongos end fitos aso Tabla 2 Resultados de identidad en GenBank de secuencias ITS del ADNr de hongos aislados de tejidos foliares y de vainas de plantas de fr jol variedad Cargamanto en cultivos del Departamento de Antioquia Aislamiento Procedencia Identidad en GenBank Tama o pb Identidad K1 Fol olo Carmen de Viboral QA e 0 E E a ae gt gt A ol gt E a iis gop ae aa sane FiS aa ge nS OT ee anes ei eee EE Gases Rig A a o ki ae N JN400714 Fusarium oxysporum 522 100 H S32835 as UL RKC288118 Carvulavia anata SASH Eo F r A a Si ES A pana ee ra uence JN712494 Leptosphaerulina australis eee Tog a SE ae E Pr AE LT a ee Zot ey A Cian JX546806 Colletotrichum lindemuthianum 530 100 K n in poro die dd id si AB302247 Phomops rr o Ae anes de lr E OS Entre par ntesis se presenta el porcentaje de cobertura Valor e para todas las comparaciones 0 0 146 Acta biol Colomb 19 1 143 154 mayo agosto de 2014 Identificaci n molecular de hongos aislados de tejidos de fr jol con s ntomas de antracnosis ciados a los tejidos de fr jol siendo evi
22. nd fitos pueden dividirse en tres grupos ba sicos las micorrizas los balansi ceos y los no balansi ceos Los primeros son hongos que establecen relaciones simbi ticas con ra ces de plantas favoreciendo la toma de nutrien tes especialmente de f sforo por parte de stas mientras que los segundos son hongos de la familia Balansiaceae Ascomycetes y espec ficamente de los g neros Epichlo y Balansia y de sus estados anam rficos Neotyphodium y Ephelis Estos hongos se caracterizan por su desarrollo sist mico en tejidos de gram neas y por su transmisi n vertical por se milla sexual Schulz y Boyle 2005 El tercer grupo corres ponde a todas aquellas especies de hongos end fitos que no pertenecen a la familia Balansiaceae siendo la gran mayo r a Ascomycetes o sus formas asexuales algunos ejemplos de estos hongos son Acremonium Cladosporium Alternaria Fusarium Pestalotiopsis Phoma Phomopsis y Colletotrichum Schulz et al 2002 Schulz y Boyle 2005 Desde el punto de vista experimental el estudio de hongos end fitos tiene varios desaf os siendo uno de los m s limi tantes la imposibilidad de esporular que presentan muchos de los aislamientos en medios de cultivo por esta raz n es com n encontrar en los reportes de este tipo de investiga ciones la ocurrencia de una alta frecuencia de hongos categorizados morfol gicamente como Mycelia sterilia Lacap Identificaci n molecular de hongos aislados de tejidos
23. nd analysis program for Windows 95 98 NT Nucleic Acids Symp Ser 1999 41 95 98 Huang WY Cai YZ Hyde KD Corke H Sun M Biodiversity of endophytic fungi associated with 29 traditional Chinese medicinal plants Fungal Diver 2008 33 1 61 75 Huang WY Cai YZ Surveswaran S Hyde KD Corke H Sun M Molecular phylogenetic identification of endophytic fungi isolated from three Artemisia species Fungal Diver 2009 36 1 69 88 Kumar DS Hyde KD Biodiversity and tissue specificity of endophytic fungi from Tripterygium wilfordii Fungal Diver 2004 17 1 69 90 Lacap DC Hyde KD Liew ECY An Evaluation of the fungal morphotype concepts based on ribosomal DNA sequence Fungal Diver 2003 12 1 53 66 Larran S Rollan C Bruno H Alippi HE UrrutiA MJ Endophytic fungi in healthy soybean leaves Invest Agr Prod Agr Prod Prot Veg 2002 17 1 173 178 Liu B Cai L Crous PW Damm U Circumscription of the anthracnose pathogens Colletotrichum lindemuthianum and C nigrum Mycologia 2013 105 4 844 860 Nugent LK Sihanonth P Thienhirun S Whalley AJ Biscogniauxia a genus of latent invaders Mycologist 2005 19 1 40 43 Rosa LH Tabanca N Techen N Pan Z Wedge DE Moraes RM Antifungal activity of extracts from endophytic fungi associated with Smallanthus maintained in vitro as autotrophic cultures and as pot plants in the greenhouse Can J Microbiol 2012 58 10 1202 1211 Pastor Corrales MA Tu JC Anthracnose En Schwartz H
24. o molecular 100 pb plus Fermentas 2 a 7 aislamientos identificados en el estudio como Colletotrichum lindemuthianum 8 a 12 aislamientos de hongos end fitos 13 control positivo ADN de Colletotrichum lindemuthianum 14 Control negativo H20dd Acta biol Colomb 19 1 143 154 mayo agosto de 2014 147 Vanegas KM Guti rrez PA Mar n MA identidad gt 99 y valores e 0 0 a los hongos que se presentan en la tabla 2 Los resultados de las comparaciones con Blastn corresponden a un alineamiento local que conduce a identifi caciones putativas Por lo tanto para tener mayor confia bilidad en la identificaci n se realizaron an lisis filogen ticos separados para Ascomycetes de las clases Sordariomycetes y Dothideomycetes siendo posible en la mayor a de aislamien tos bajo estudio la inferencia de la identidad taxon mica gen rica aunque para algunas cepas fue posible plantear su hip tesis de identidad en cuanto a la especie Los an lisis filogen ticos se realizaron con base en 642 pb para ambas clases siendo los dendrogramas generados similares para los dos algoritmos de agrupamiento utilizados NJ y ML aunque con variaciones topol gicas menores en la ubicaci n de los clados Por motivos de espacio se pre senta solo el dendrograma NJ Para el caso de los Dothi deomycetes el dendrograma se dividi en dos clados prin cipales I y Il representando las familias Pleosporaceae y Didymellaceae del orden Pleosporales
25. ods of bean presenting anthracnose symptoms were isolated from plants collected at different municipalities in the province of Antioquia Colombia Isolates were identified by sequencing the rDNA ITS regions together with the examination of reproductive structures during sporulation in culture media Colletotrichum lindemuthianum the causal agent of anthracnose was isolated in all samples showing symptoms of this disease These results were confirmed by duplex PCR using the specific primers CD1 CD2 and CY1 CY2 Additionally 17 endophytic fungi were obtained Fourteen isolates did not sporulate in culture media Mycelia sterilia but were identified by phylogenetic analysis of the ITS regions as the Ascomycetes Leptosphaerulina 3 Diaporthe 3 Gibberella 1 Plectosphaerella 1 and Biscogniauxia 1 and the mitosporic genera Phoma 2 Alternaria 2 and Stemphylium 1 Three isolates were identified combining morphological Acta biol Colomb 19 1 143 154 mayo agosto de 2014 143 Vanegas KM Guti rrez PA Mar n MA and molecular analysis as Fusarium 2 and Curvularia lunata 1 This work increases our knowledge of the mycobiota of legume plants and will serve as support of future studies aimed at determining the effect of these fungi on the development of anthracnose as well as other problems affecting the bean crop Keywords endophytes PCR Phaseolus vulgaris rDNA INTRODUCCION La antracnosis del frijol Phaseolus vulgari
26. phytic microbes endophytism defined En Bacon CW White JF editors Microbial Endophytes New York Marcel Dekker 2000 p 3 30 o Suryanarayanan TS Murali TS Incidence of Leptosphaerulina crassiasca in symptomless leaves of peanut in southern India J Basic Microbiol 2006 46 4 305 309 Tamura K Peterson D Peterson N Stecher G Nei M Kumar S MEGAS Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood Evolutionary Distance and Maximum Parsimony Methods Mol Biol Evol 2011 28 10 2439 2442 Tan RX Zou WX Endophytes a rich source of functional metabolites Nat Prod Rep 2001 18 4 448 459 Wang W Tang JH Wang YC Molecular detection of Colletotrichum lindemuthianum by Duplex PCR J Phytopathol 2008 156 7 431 437 White TJ Bruns T Lee S Taylor JW Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics En Innis MA Gelfand DH Sninsky JJ White TJ editors PCR Protocols A guide to methods and applications New York Academic Press 1990 p 315 322 Zhang HW Song YC Tan RX Biology and chemistry of endophytes Nat Prod Rep 2006 23 5 753 771 Acta biol Colomb 19 2 143 154 mayo agosto de 2014 153
27. poraceae K8 Antioquia HQ166551 Leptosphaerulina chartarum K12 Antioquia 100 CU566269 Leptosphaerulina chartarum 100 TIA K2 Antioquia AY278318 Leptosphaerulina americana il a AY131203 Leptosphaerulina trifolii 2 17 Antioquia o AB470868 Coniothyrium aleuntis Sai 35 K13 Antioquia Do IB 16 Antioquia 5 95 JQ936191 Ampelomyces sp A AB369456 Phoma herbarum JQ388278 Phoma sp DQ474111 Phoma macrostoma DQ411531 Uromyces appendiculatus 0 05 Figura 2 rbol filogen tico basado en secuencias de la regi n ITS del ADNr de hongos Dothideomycetes aislados de tejidos de fr jol var Cargamanto en el departamento de Antioquia Colombia identificados por la letra K Los n meros en las ramas indican los valores de bootstrap gt 80 y los n meros romanos corresponden a los clados referidos en el texto En algunas accesiones se indica el nombre del teleomorfo Ej Cochliobolus porque as fue depositada la accesi n en GenBank Acta biol Colomb 19 1 143 154 mayo agosto de 2014 149 Vanegas KM Guti rrez PA Mar n MA JQ690085 Fusarium equiseti 100 K1 Antioquia GU073123 Fusarium equiseti K36 Antioquia KC254033 Fusarium oxysporum 6 100 JN400697 Fusarium oxysporumf sp ciceris EU264073 Fusarium oxysporumf sp strigae K18 Antioquia HQ333193 Gibberella zeae Hypocreales AY147313 Fusarium culmorum HQ248200 Gibberella zeae KC577196 Fusarium graminearum JX125047 Fusarium cul
28. ral A Cc a adem Vaina Urrao o ae eo __ vege nnn Acta biol Colomb 19 1 143 154 mayo agosto de 2014 145 Vanegas KM Guti rrez PA Mar n MA C lindemuthianum para la confirmaci n molecular de su iden tidad mediante la prueba de PCR d plex dise ada por Wang et al 2008 que utiliza dos pares de cebadores espec ficos CYVEY2 CY1 5 CTT TGT GAA CAT ACC TAA CC 3 CY2 5S GGT TTT ACG GCA GGA GTG 3 y CDVCD2 CD1 5 ACC TGG ACA CAT AAG TCA AAG 3 CD2 5 CAA CAATGC CAG TAT CAG AG 3 dirigidos a las regiones ITS del ADNr y al pseudogen de permeasa de hierro FTR7 res pectivamente Las reacciones de PCR se realizaron en un volumen de 25 uL conteniendo 15 3 pL H2Odd 1X Buffer PCR 0 2 mM dNTPs 2 mM MgCl 0 2 pM de cada cebador 1 U de Taq polimerasa Fermentas Lituania 0 4 pL de BSA 10 mg pL y 1 pL de ADN El programa de amplificaci n incluy una desnaturalizaci n inicial a 94 C durante 5 min seguida de 32 ciclos a 94 C por 45 s 62 C por 30s 72 C por 1 min y una extensi n final a 72 C por 7 min Los ampli cones obtenidos fueron separados por electroforesis de gel de agarosa al 1 8 y su tama o verificado por comparaci n con el marcador de peso molecular Generuler 100 pares de bases Plus Fermentas En dos de los aislamientos K39 y K41 se purificaron directamente del gel los fragmentos ob tenidos utilizando el kit O Aquick Gel Extraction Qiagen Alemania
29. rfotipos encontrados Fig 1A Las secuencias obte nidas para dos de los aislamientos K39 y K41 confirmaron la naturaleza de los amplicones al obtener como primeros hits del resultado de Blastx para CD1 CD2 niveles de iden tidad de 34 a 37 valores e 1x102 coberturas 71 74 con respecto a prote nas permesas de hierro de diferentes hongos incluyendo miembros del g nero Colletotrichum ej Accesiones EJP66635 EGX90976 ELA 37854 Para el caso de los amplicones generados con CY1 CY2 el an lisis de Blastn identific sus secuencias como parte de la regi n ITS del ADNr de C lindemuthianum ej JX546806 JX546807 GU227800 EU400129 con 99 de identidad y valores de 0 0 cobertura 99 Identificaci n molecular de hongos end fitos La amplifica ci n de los productos de PCR de las regiones ITS del ADNr de los hongos end fitos aislados gener fragmentos de 600 a 700 pb con los cebadores ITS1 e ITS4 Dichas variaciones de tama o eran una evidencia inicial de que correspond an a di ferentes especies Fig 1B El an lisis con Blastn confirm esta observaci n al obtenerse como primeros hits con valores de Figura 1 Productos amplificados por PCR con los cebadores A CD1 CD2 638 pb y CY1 CY2 442 pb B ITS1 ITS4 600 700 pb a partir de ADN obtenido de micelio de hongos aislados de tejidos de fr jol variedad Cargamanto con s ntomas de antracnosis en cultivos de Antioquia Colombia L nea 1 marcador de pes
30. s L causada por Colletotrichum lindemuthianum Sacc amp Magnus Briosi amp Cavara es una de las enfermedades mas limitantes de este cultivo en el mundo pudiendo ocasionar p rdidas en los ren dimientos de hasta el 95 especialmente cuando se cultivan variedades susceptibles al pat geno en regiones h medas y monta osas Pastor Corrales y Tu 1989 como ocurre en diferentes departamentos de Colombia En este pa s la siem bra de fr jol se extiende a cerca de 120000 ha siendo el 93 cultivado en la zona andina Fenalce 2010 El departa mento de Antioquia es uno de los principales productores de fr jol con cerca del 27 del volumen de producci n nacional 110 000 ton a o y un rea de siembra cercana a 26000 ha a o Arias et al 2007 La antracnosis afecta diferentes tejidos del fr jol incluyendo fol olos pec olos tallos y vainas en estas ltimas se pre sentan lesiones necr ticas que pueden transformarse en chancros hundidos con centros de color salm n que repre sentan las masas de conidias del hongo Chaves 1989 Las semillas afectadas pueden presentar decoloraci n de la testa aunque es frecuente su infecci n latente asintom tica situaci n que representa un problema epidemiol gico dada la eficiente transmisi n de C lindemuthianum por esta v a Chen et al 2012 El manejo de la antracnosis del fr jol se fundamenta en la siembra de semilla certificada libre del pat geno el control qu mico
31. the como a estados mitosp ricos de Phomopsis En este clado se presentaron adem s los aisla mientos obtenidos en este estudio K10 K20 y K34 siendo el primero identificado como D novem con un valor de 0 994 de identidad y los dos restantes como D phaseolorum con quien comparti un nivel de identidad de 1 Finalmente en el clado V se ubicaron especies del g nero Biscogniauxia de la familia Xylariaceae orden Xylariales En este clado fue posible identificar solo en cuanto a g nero al aislamiento K32 DISCUSI N En este trabajo se realiz el aislamiento y la identificaci n de hongos asociados a tejidos de fr jol foliar y vainas con s ntomas de antracnosis una de las enfermedades m s limitantes para la producci n de esta leguminosa en la regi n andina de Colombia En todos los tejidos colectados fue posible la obtenci n de aislamientos de C lindemuthianum el agente causal de dicha enfermedad siendo confirmada su identidad mediante PCR d plex con los cebadores espec ficos CD1 CD2 y CY1 CY2 dise ados por Wang et al 2008 En dos de los aislamientos se secuenciaron los amplicones generados determin ndose su identidad con una regi n del gen de permeasa de hierro FTR1 y de una porci n de las regiones ITS1 5 85 e ITS2 del ADNr de C lindemuthianum para CD1 CD2 y CY1 CY2 respectivamente Los aislamientos de C lindemuthianum obtenidos en el presente estudio ser n utilizados en un pr ximo estudio para evaluar la var
32. y generalizada Lacap et al 2003 Schulz y Boyle 2005 Selim et al 2012 As por ejemplo Huang et al 2008 encontraron hongos end fitos que no esporulaban en medio de cultivo en 27 de 29 plantas medi cinales evaluadas en su trabajo siendo la frecuencia de ais lamientos est riles del 27 mientras que Guo et al 2000 al estudiar la biodiversidad de end fitos en Livistona chinensis determinaron que el 16 de los morfotipos encontrados no esporulaban Debido a esta situaci n el uso de t cnicas moleculares basadas en an lisis filogen ticos de secuencias de regiones ribosomales y de otras regiones del genoma ej B tubulina factor de elongaci n 1 se ha constituido en una herramienta fundamental para lograr la identificaci n de muchos de los hongos end fitos que actualmente se re portan en la literatura Schulz y Boyle 2005 Selim et al 2012 El presente estudio representa un claro ejemplo de la utilidad de stas herramientas moleculares al permitir en 14 aislamientos est riles asociados a tejidos de fr jol su identifi caci n en cuanto a g nero as Leptosphaerulina tres aisla mientos Diaporthe tres aislamientos Phoma dos aislamien tos Stemphylium un aislamiento Alternaria dos aislamientos Gibberella un aislamiento Plectosphaerella un aislamiento y Biscogniauxia un aislamiento En adici n el an lisis filoge n tico permiti plantear la asociaci n en cuanto a especie de G zeae P
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