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1. En la segunda prueba se utilizaron agua agar AA harina de ma z agar HMA y papa dextrosa agar PDA como medios de cultivo en dos series de 10 a 15 cajas con el fin de conocer la influencia del medio de cultivo y el tiempo de recuperaci n en el porcentaje de captura del hongo En todos los ensayos la serie I se sembr con D flagrans mientras que la serie II s lo se mantuvo con el medio de cultivo y fungi como testigo La reducci n del n mero de nematodos gastrointestinales se realiz de manera indirecta al evaluar la recuperaci n de larvas despu s de la acci n nemat faga del hongo Para esto al cuarto d a de la siembra de D flagrans se agregaron en promedio 1 073 larvas para favorecer la actividad nemat faga mientras que en la serie del medio de cultivo se agreg la misma cantidad para conocer la recuperaci n de larvas del grupo testigo Las larvas fueron contabilizadas en al cuotas de 250 ml y posteriormente se agregaron en un volumen conocido en el centro de las cajas Petri para despu s incubar a temperatura ambiente m nima 30 7 C m xima 36 6 C media 33 6 C La recuperaci n larvaria fue a las 24 48 y 96 h por el m todo de Baermann 2 Esta consisti en enjuagar la superficie del agar con agua destilada se desprendi y se coloc en un embudo con suficiente agua Se dej el aparato de Baermann durante la noche 12 h y a la ma ana siguiente se recogieron las larvas en tubos de ensayo de 7 5 m2. to the trapped larvae curled larvae variable 76 4 2 4 and 91 3 1 6 at 24 and 48 h Trapped larva values were lower than those obtained in a study with D flagrans against Panagrellus redivivus where the higher predacious behavior can be attributed to exposure time since in our study the observation was performed at 48 h while in the study of reference the high trapping percentage was recorded on d 502 Other study yielded resulted similar to ours with capture values 55 Haemonchus larvae and 40 Haemonchus naked sheath less larvae 24 h after culture initiation D flagrans has also shown predatory activity against other nematode species such as Caenorhabditis elegans in which case 82 8 catch was obtained at 24 h 93 2 at 48 h and 95 at 60 h09 In the second test water agar WA corn meal agar CMA and dextrose potato agar DPA media were used in two 10 15 Petri dish series in order to investigate the influence of the culture medium and the recovery time of the mold capture percentage In all assays series I was seeded with D flagrans while in series I culture media were maintained mold free as a control Reduction of GI nematode numbers was indirectly evaluated by looking at larval recovery Cuadro 1 Porcentaje de larvas de nematodos gastrointestinales encontradas en cajas Petri con harina de ma z agar solo testigo y en harina de ma z agar y Duddingtonia flagrans a las 24 y 48 h despu s de agreg
3. A 250 ml aliquot was obtained in order to count the number of larvae using a light microscope 4 and 10X Percent larval reduction over the control was estimated using the 100 M equation M de 100 Rc Where M larval recovery as compared to control Rt larval recovery from plates containing D flagrans larvae recovered from treatment larvae added to treatment 100 Rc recovery of larvae from plates using culture medium as a control recovered larvae added larvae 100 Nematode genus was determined using an average of eight larvae from each plate This represented a total of 40 larvae culture medium at different larvae recovery times using the morphological codes described by Niec 13 Reduction larval percent was subjected to the analysis of variance 16 using the SAS software 17 in a random block model with a factorial arrangement and 95 confidence Y ia m b t dk tj dk jkl Where Y ja response variable reduction in larval numbers nematode genera m population mean CAPACIDAD DEPREDADORA DE Duddingtonia flagrans CONTRA NEMATODOS recuperadas del tratamiento larvas agregadas al tratamiento 100 Re Porcentaje de recuperaci n de larvas de las cajas con el medio de cultivo como testigo larvas recuperadas larvas agregadas 100 El g nero de los nematodos se determin en un promedio de ocho larvas por cada caja Petri esto fue un total de 40 larvas por cada grupo
4. DPA at 3 different recovery times 24 48 and 96 h In the first trial both rings and adhesive loops were observed as well as larvae trapped in such structures The LTA was higher at 48 h 68 4 16 0 as compared to that found at 24 h 41 1 19 9 P lt 0 01 In the second trial the reduction percentage in DPA was 26 0 and 48 7 in CMA which was lower than that in WA 75 9 and differences were observed in the recovery times and or in the interaction with the culture medium The percentage of Haemonchus 84 98 16 9 and Cooperia 14 5 16 4 remained equal in all aspects studied KEY WORDS Duddingtonia flagrans Biological control Gastrointestinal nematodes Larval reduction Recibido el 23 de febrero de 2004 y aceptado para su publicaci n el 13 de mayo de 2005 a Universidad Aut noma de Chapingo Centro Regional Universitario del Sureste Km 7 5 Carretera Teapa Vicente Guerrero Apartado Postal No 29 Teapa Tab 86800 Tel 01 932 3271622 Fax 01 932 3220615 e mail robgardu Uhotmail com rglezg Wcolpos mx Correspondencia al primer autor b CENID PAVET INIFAP Programa de Ganader a IREGEP Colegio de Postgraduados d Campus Veracruz Colegio de Postgraduados Proyecto Financiado por la Fundaci n Produce Tabasco A C 405 Roberto Gonz lez Gardu o et al T c Pecu M x 2005 43 3 405 414 En M xico los nematodos gastrointestinales son responsables de la disminuci n en la producci n de bov
5. Y jj m ti bj Cijk Donde Yijk variable respuesta porcentaje de larvas atrapadas porcentaje de larvas atrapadas y enroscadas m Media poblacional t efecto del i simo tratamiento Sin hongo atrapamiento a las 24 h atrapamiento a las 48 h bj efecto del j simo bloque j I IL ID ejk IN 0 s2 Las medias se compararon con la prueba de Tukey al 95 de confianza 6 En esta prueba se pudieron distinguir cuatro categor as de larvas a libres aqu llas que se desplazaban por la caja continuamente b enrolladas las que se encontraban de esa forma e inm viles y en algunos de los casos rodeadas por hifas c atrapadas aqu llas que fijas o en movimiento estaban en contacto con anillos o redes adhesivas tridimensionales d muertas aqu llas que permanec an r gidas y en posici n recta sin contacto con redes o anillos Cuadro 1 En muchas de las cajas se observaron anillos y redes adhesivas tridimensionales en las hifas en las cuales tambi n se not abundancia de clamidosporas En 408 estimated This combination parameter was generated since many curled immobile larvae surrounded by hyphae and sometimes nearby D flagrans rings were observed Percent trapped larvae and porcentage curled larvae trapped larvae were transformed to log n larvae in order to decrease the coefficient of variation then subjected to a variance analysisC using SAS GLM procedure A random block desi
6. Standard error 2 1 75 93 3 9 Culture media Group N Reduction Water agar With mold 40 87 93 No mold 38 46 99 Corn meal With mold 40 89 9a No mold 40 82 15 Potato dextrose with mold 40 74 1b No mold 40 68 2bc 3 7 0 04 0 0 1 4 48 70 5 3 1 9 0 04 0 0 1 9 26 05 4 8 2 2 0 04 0 0 abcd Different superscripts in each column mean differences P lt 0 01 N Number of plates Reduction in Gl nematode larvae 100 larvae recovered temperatura al usarlos contra Haemonchus contortus ya que a 25 C se ha observado un porcentaje de captura de 90 4 y 25 7 en estas especies respectivamente pero no se observaron ni anillos ni captura de larvas a 30 C 15 lo cual posiblemente influy en los valores que se encontraron en este estudio El medio de cultivo utilizado afect la recuperaci n de larvas y por deducci n el porcentaje de reducci n del n mero de las mismas ya que se considera que las larvas no recuperadas fueron atrapadas por el hongo En los medios ricos en nutrientes PDA y HMA el porcentaje de reducci n de la poblaci n larvaria fue menor que en el medio de cultivo de AA Este comportamiento se observ claramente en las cajas Petri con D flagrans tanto en el porcentaje de reducci n del n mero de larvas ajustado al testigo como en el no ajustado Cuadro 2 posiblemente porque este hongo es saprofito facultativo y cuando el medio de cultivo posee cantidades limitadas de nutrimentos los nematodos son una
7. en cada medio de cultivo a las diferentes horas de recuperaci n larvaria que se identificaron utilizando las claves morfol gicas descritas por Niec 3 El porcentaje de reducci n del n mero de larvas se someti a un an lisis de varianza 6 mediante el paquete SAS 7 en un modelo de bloques al azar con arreglo factorial a un 95 de confianza Y ijkl 7 m b tj dk tj dk ijkl Donde Y jjk variable respuesta Porcentaje de reducci n del n mero de larvas porcentaje de g neros de nematodos m Media poblacional b efecto del i simo bloque i I H ID tj efecto del j simo medio de cultivo i AA con hongo AA sin hongo HMA con hongo HMA sin hongo PDA con hongo PDA sin hongo d efecto de la k sima hora de recuperaci n de larvas k 24 48 96 tj dk efecto conjunto del j simo medio de cultivo y la k sima hora de recuperaci n de larvas ijkl IN 0 s2 Las medias se compararon con la prueba de Tukey al 95 de confianza 16 En esta prueba se encontraron diferencias entre medios de cultivo P lt 0 01 en la variable porcentaje de reducci n del n mero de larvas ajustado al testigo mientras que entre horas y en la interacci n de hora de recuperaci n y medios de cultivo los valores fueron similares P gt 0 05 Tal como se esperaba en cada una de las fechas en que se realiz el ensayo bloques los valores encontrados en la reducci n de la poblaci n larvaria fueron diferen
8. flagrans Sin embargo existe un estudio con D flagrans en el que se encontr diferencia en la capacidad depredadora dependiendo de la especie as cuando se prob contra T circumcincta y Trichostrongylus axei en este ltimo se observ un bajo porcentaje de capturaU9 Los estudios in vitro con hongos nemat fagos se han realizado contra distintas especies de nematodos par sitos de plantas 9 y de animales utilizando varias especies de hongos De las especies con inter s veterinario se ha usado Arthrobotrys robusta contra Haemonchus contortus con un alto porcentaje de captura a los siete d as de interacci n Existen otros estudios en los que se ha observado el comportamiento depredador de D flagrans contra Ostertagia ostertagiQ3 y se ha notado la reducci n del n mero These results differed from those in one study with D flagrans FTHO 8 that showed increased predacious activity as time progressed 22 7 at 12 h 82 4 at 24 h and up to 97 4 at 60 h against wild type Caenorhabditis elegansU9 Regarding the genera of nematodes added to the plates no differences were found in any of the studied parameters culture medium and larval recovery time The general average was 84 for Haemonchus and 16 for Cooperia These values are very similar in all media at all times 80 to 91 for Haemonchus 8 3 to 19 for Cooperia Mold treated plates showed values for both Haemonchus and Cooperia 85 6 and 13 4 similar to
9. fuente importante de nitr geno durante el crecimiento0 lo cual favorece su comportamiento depredador El crecimiento del micelio fue muy abundante en los medios de cultivo de PDA y HMA mientras que en AA fue reducido y tal como se ha indicado en otro estudio0 el desarrollo del micelio no est relacionado con la actividad nemat faga dado que el cambio de la fase saprofita a la par sita depende de la influencia de factores bi ticos y abi ticos En este estudio se 412 parasitic phase depends on the influence of both biotic and non biotic factorsf1 This study showed a lower porcentage larval number reduction when mycelium growth was abundant CMA and DPA Both larval recovery time and larval recovery time x Culture media interaction showed no statistical differences This means that percentage trapping depended only on culture media Trapping percent values were similar at 24 48 and 96 h Figure 1 Figura 1 Porcentaje de reducci n del n mero de larvas a distintos tiempos y en diferentes medios de cultivo Figure 1 Reduction percentage in larval numbers at different times on different culture media 4 Water agar Corn meal A Dextrose potato 100 24 48 96 Hours after larvae addition CAPACIDAD DEPREDADORA DE Duddingtonia flagrans CONTRA NEMATODOS observ que el menor porcentaje de reducci n del n mero de larvas de nematodos ocurri cuando el crecimiento del micelio fue abundante H
10. grazing naturally infected animals were used so that the proportion of each nematode species varied in the two tests Species included Haemonchus contortus and Cooperia spp 98 and 2 in the first test 8 and 16 in the second test respectively Larvae were obtained from fecal cultures using Corticelli Lai s procedure 13 Larvae were concentrated using the Baermann s apparatus Larvae where then identified on the basis of their morphometric characteristics 3 using 200 larvae Cultures were performed 15 d prior to use Once obtained larvae were cleaned using a 50 saccharose solution then rinsed in sterile water with benzyl penicillin and streptomycin 200 TU and 260 mg mill respectively Two 10 Petri dish diameter 9 cm series were established in the first test using CMA medium to determine mold s percent catching ability by direct observation in order to determine the percentage of trapped larvae Only 60 to 100 individually counted larvae were added to the plate since this reduced amount of larvae allows for the determination of most of them Four days after mold seeding larvae were added then incubated at ambient temperature minimun 21 C maximum 30 C mean 23 5 C Twenty four 24 and 48 h later larvae in all plates were individually observed Using an optic microscope 10 and 40X trapped in either rings or adhesive loops free curled and dead larvae were counted The trapping larvae percentage wa
11. la capacidad depredadora de D flagrans contra cultivos mixtos de Haemonchus y Cooperia al estimar el porcentaje de reducci n en diferentes medios de cultivo El experimento se realiz en el Centro Regional Universitario del Sureste CRUSE de la Universidad Aut noma Chapingo UACH ubicado en Teapa Tabasco El clima de la regi n es c lido h medo con lluvias todo el a o La temperatura media anual es 25 8 C y la precipitaci n de 3 976 mm Af m wi g 0 Se utiliz una cepa de D flagrans FTHO 8 proporcionada por el Centro Nacional de Investigaci n Disciplinaria en Parasitolog a Veterinaria CENID PAVET del INIFAP en Cuernavaca Morelos aislada de heces de ovino U 1 12 La actividad nemat faga de D flagrans se comprob en dos pruebas la primera se realiz en tres Ocasiones 406 In Mexico gastrointestinal GI nematodes are responsible for production losses in grazing cattle sheep and goats particularly in hot weather where environmental conditions promote parasite proliferation GI nematode control has been traditionally based on the use of drugs The frequent use of drugs has resulted in resistance to anthelmintics in many countries affecting all antiparasitic drug classes used3 4 Therefore other control methods have been proposed The use of biological agents as nematode control methods has been widely studiedS 6 particularly nematophagous molds that help in decreasing the numbers of infecting lar
12. 30 C U5 This can also have affected the values found in this study Culture media also affected the trapping activity which was reflected as a decreasing in the number of recovered larvae since non recovered larvae were assumed to have been trapped by the mold When nutrient rich media DPA and CMA were used percentage larval population reduction was higher than that in WA This performance was clearly observed in plates with D flagrans both in control adjusted and non adjusted percentage larval number reduction Table 2 possibly because this is a facultative saprophytic mold This way when the substrate contains limited amounts of nutrients nematodes become an important nitrogen source during mold s growth phase thus enhancing its predacious behavior As shown elsewhere mycelium development was very abundant on DPA and CMA as apposite to WA where such growth was reduced Mycelium development is not related with nematophagous activity since the passage from the saprophytic phase to the Roberto Gonz lez Gardu o et al T c Pecu M x 2005 43 3 405 414 Cuadro 2 Porcentaje de reducci n del n mero de larvas y de larvas ajustadas al testigo en diferentes medios de cultivo con y sin Duddingtonia flagrans Table 2 Reduction percentage in number of larvae and control adjusted larvae in different culture media with and without Duddingtonia flagrans Not adjusted Control adjusted 9 Standard error Reduction Y
13. 60 mg ml respectivamentel En la primera prueba se establecieron dos series de 10 cajas Petri 9 cm de di metro con HMA como medio de cultivo para determinar el porcentaje de captura del hongo por medio de observaci n directa para determinar el porcentaje de larvas atrapadas por lo Cual s lo se agregaron en las cajas Petri entre 60 a 100 larvas de nematodos contadas de manera individual debido a que se tratar a de localizar la mayor cantidad de ellas y este n mero era factible de contar A los cuatro d as despu s de la siembra del hongo se agregaron las larvas y se incub a temperatura ambiente m nima 21 C m xima 30 C media 23 5 C Se revisaron las larvas de manera individual en todas las cajas a las 24 y 48 h y por medio de un microscopio ptico a 10 y 40X se contaron las larvas atrapadas en anillos o redes tridimensionales libres enroscadas y muertas El porcentaje de larvas atrapadas respecto al total de larvas contabilizadas se calcul mediante la siguiente f rmula l 12 15 la cual se modific al integrar las categor as de los diferentes estados de las larvas que representaron el total de larvas XxX A 100 x y w z 407 October 2 17 and 21 2002 by direct observation of the interaction of both population mold and nematodes In the second test mold action was indirectly measured by larval recovery on August 4 6 and 10 2003 In each test mixed cultures of GI nematode larvae from
14. ENID PAVET Mexico s National Institute for Forestry Agricultural and Animal Research INIFAP Jiutepec Morelos The nematophagous ability of D flagrans was proven using two tests The first test was performed on 3 d CAPACIDAD DEPREDADORA DE Duddingtonia flagrans CONTRA NEMATODOS durante el mes de octubre del 2002 d as 12 17 y 21 y consisti en observar directamente al hongo y los nematodos En la segunda prueba se estim de manera indirecta con la recuperaci n de larvas la acci n del hongo y se realiz en agosto del 2003 d as 4 6 y 10 Para cada prueba se utilizaron cultivos mixtos de larvas de nematodos gastrointestinales obtenidos de animales en pastoreo con infestaci n natural por lo que las proporciones de cada g nero fueron diferentes en las dos pruebas en que se realiz el estudio Los g neros incluyeron Haemonchus contortus y Cooperia punctata 98 y 2 en la primera prueba 8 y 16 en la segunda prueba respectivamente Las larvas se obtuvieron del cultivo de heces por el procedimiento de Corticelli Lai3 y se concentraron en el aparato de Baermann 4 para su posterior identificaci n con base en caracter sticas morfom tricasU3 a partir del conteo de 200 larvas Los cultivos se realizaron 15 d as antes de utilizarse y una vez obtenidas las larvas se limpiaron en una soluci n de sacarosa al 50 y se enjuagaron en agua est ril con bencil penicilina y estreptomicina en concentraciones de 200 UI y 2
15. MA y PDA El tiempo al cual se recuperaron las larvas no mostr diferencias estad sticas ni su interacci n con los medios de cultivo Esto indica que los porcentajes de captura s lo dependieron de los medios de cultivo y fueron similares tanto a las 24 48 como a las 96 h Figura 1 Estos resultados fueron diferentes a lo encontrado en un estudio con D flagrans FTHO 8 que indica un incremento en la actividad predatoria conforme transcurre el tiempo obteni ndose porcentajes de 22 7 a las 12 h 82 4 a las 24 h y hasta 97 4 a las 60 h en Caenorhabditis elegans tipo silvestreU9 Con relaci n a los g neros de nematodos adicionados a las cajas Petri no se encontraron diferencias en ninguno de los factores estudiados medios de cultivo y tiempo de recuperaci n de larvas El promedio general fue de 84 para Haemonchus y 16 para Cooperia valores muy parecidos a los recuperados en todos los medios de cultivo y a los diferentes tiempos de 80 a 91 para Haemonchus y de 8 3 a 19 para Cooperia En los tratamientos con el hongo se encontraron porcentajes de Haemonchus y Cooperia 85 6 y 13 4 similares a los de las cajas Petri que constitu an el testigo 84 3 y 15 4 en la identificaci n de 908 y 886 larvas respectivamente Esto podr a indicar que la reducci n de la poblaci n larvaria ocurri tanto en Haemonchus como en Cooperia ya que el grupo sin hongo mantuvo el mismo porcentaje de especies que el grupo con D
16. T c Pecu M x 2005 43 3 405 414 Estudio in vitro de la capacidad depredadora de Duddingtonia flagrans contra larvas de nematodos gastrointestinales de ovinos de pelo In vitro predacious ability of Duddingtonia flagrans against gastrointestinal nematode larvae of hair sheep Roberto Gonz lez Gardu o Pedro Mendoza de Givesb Glafiro Torres Hern ndez Carlos Becerril P rez Eusebio Ortega Jim nezd Omar Hern ndez Mendo RESUMEN El control biol gico de nematodos con hongos es una alternativa para evitar la resistencia antihelm ntica El objetivo de la presente investigaci n fue conocer la capacidad depredadora de Duddingtonia flagrans contra cultivos de Haemonchus y Cooperia al estimar el porcentaje de reducci n de poblaciones de nematodos en diferentes medios de cultivo El experimento se llev a cabo en la Universidad Aut noma Chapingo en Teapa Tabasco M xico Se utiliz una cepa mexicana de D flagrans que se someti a dos pruebas en la primera se contaron directamente larvas atrapadas libres enroscadas y muertas En la segunda se desafi el hongo con nematodos en tres diferentes medios agua agar AA harina de ma z agar HMA y papa dextrosa agar PDA a tres tiempos de recuperaci n 24 48 y 96 h En la primera prueba se observaron anillos y redes as como larvas atrapadas en esas estructuras El porcentaje de larvas atrapadas fue mayor a las 48 h 68 4 16 0 respecto a las 24 h 41 1 19 9 P lt 0 01 En la s
17. aboratory experiments to evaluate the ability of Arthrobotrys oligospora to destroy infective larvae of Cooperia species and to investigate the effect of physical factors on the growth of the fungus J Helminthol 1985 59 119 125 Nordbring Hertz B Ecology and recognition in the nematode nematophagous fungus system Adv Microb Ecol 1988 10 81 114 Gonz lez CME Mendoza de GP Quir z RH Comparison of the trapping ability of Arthrobotrys robusta and Monacrosporium gephyropagum on infective larvae of Strongyloides papillosus J Helminthol 1998 72 209 213 Fern ndez AS Larsen M Nansen P Henningsen E Gronvold J Wolstrup J Henriksen SA Bjorn H The ability of the nematode trapping fungus Duddingtonia flagrans to reduce the transmission of infective Ostertagia ostertagi larvae from faeces to herbage J Helminthol 1999 73 115 122 Faedo M Larsen M Waller PJ The potential of nematophagous fungi to control the free living stages of nematode parasites of sheep Comparison between Australian isolates of Arthrobotrys spp and Duddingtonia flagrans Vet Parasitol 1997 72 149 155 Githigia SM Thamsborg SM Larsen M Kyvsgaard NC Nansen P The preventive effect of the fungus Duddingtonia flagrans on trichostrongyle infections of lambs on pasture Int J Parasitol 1997 8 27 931 939 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
18. adas Table 1 Gastrointestinal nematode larvae percentages observed on corn meal agar plates control and corn meal agar Duddingtonia flagrans plates at 24 and 48 h after larvae addition Free larvae Curled larvae N Number Number Replication October 12 Control 10 9 9 90 0 0 0 0 0 24 h reading 10 7 8 27 0 3 8 13 1 48 h reading 10 2 0 6 7 5 2 17 4 Replication II October 17 Control 10 9 0 95 7 0 0 0 0 24 h reading 10 10 9 17 6 23 0 37 0 48 h reading 10 2 8 5 4 12 9 24 7 Repetici n III 21 de octubre Control 10 16 6 90 7 0 0 0 0 24 h reading 10 11 4 16 9 33 0 48 9 48 h reading 10 3 8 7 1 13 9 26 1 N Number of plates abc Different superscripts in each column mean differences P lt 0 05 409 Trapped larvae Dead larvae Number Number Total larvae 0 0 0 0 a 1 1 10 0 11 0 16 7 57 8 0 6 2 1 28 9 22 1 74 2 0 5 1 7 29 8 0 0 0 0 a 0 4 4 3 9 4 26 9 43 3 b 1 3 2 1 62 1 35 9 68 6 0 7 1 3 52 3 0 0 0 0 a 1 7 9 3 18 3 21 5 31 9 b 1 6 2 4 67 5 35 1 65 9 0 5 0 9 53 3 Roberto Gonz lez Gardu o et al T c Pecu M x 2005 43 3 405 414 mismo g nero a las 24 h de iniciado el cultivo La actividad depredadora de D flagrans tambi n se ha observado contra otras especies de nematodos como Caenorhabditis elegans con el cual se obtuvo un porcentaje de captura de 82 8 a las 24 h 93 2 a las 48 h y a las 60 h alcanz m s del 95 de capturaU9
19. ce of chlamydospores of nematophagous fungi to the digestive processes of sheep in Mexico J Helminthol 1998 72 155 158 Flores CJ Herrera RD V zquez PV Mart nez GJC Mendoza de GP Capacidad nemat faga de dos cepas del hongo Duddingtonia flagrans desarrollada en harina de ma z agar Vet M x 1999 30 2 199 203 Niec R Cultivo e identificaci n de larvas infectantes de nematodos gastroent ricos del bovino y ovino Instituto Nacional de Tecnolog a Agropecuaria Manual T cnico 3 1 ed Argentina 1968 12 13 14 Tarazona VJM Manual de t cnicas de parasitolog a veterinaria 1 ed Zaragoza Espa a Editorial Acribia 1973 Mendoza de GP Zavaleta ME Herrera RD Quir z RH n vitro trapping capability of Arthrobotrys spp on infective larvae of Haemonchus contortus and Nacobbus aberrans J Helmintol 1994 68 223 229 Steel RG Torrie JH Bioestadistica Principios y procedimientos 2 ed M xico D F Ed McGraw Hill 1980 SAS Institute The SAS System for Windows Version 8 SAS Institute Inc Cary NC USA 1999 Larsen M Prospects for controlling animal parasitic nematodes by predacious micro fungi Parasitol 2000 120 121 131 Mendoza de GP Davies KD Clark SJ Behnke JM Predatory behavior of trapping fungi against srf mutants of Caenorhabditis elegans and different plant and animal parasitic nematodes Parasitol 1999 119 95 104 Gronvold J Korsholm H Wolstrup J Nansen P Henriksen SA L
20. e on the 48 h reading was higher P lt 0 01 than that at 24 h 68 4 16 0 and 41 1 19 9 respectively This situation was similar CAPACIDAD DEPREDADORA DE Duddingtonia flagrans CONTRA NEMATODOS otros estudios tambi n se ha observado este efecto ya que este hongo produce una gran cantidad de esporas y se puede reproducir f cilmente en condiciones de laboratorio 12 18 A las 24 h despu s de agregar las larvas al medio de cultivo con D flagrans se observaron algunos nematodos en los anillos al principio ten an movimientos vigorosos y posteriormente 48 h aparec an inm viles y atrapados en redes con tres a cinco anillos El porcentaje de larvas atrapadas fue mayor en la lectura realizada a las 48 h P lt 0 01 respecto a las 24 h 68 4 16 0 y 41 1 19 9 respectivamente situaci n similar a la variable larvas atrapadas enroscadas 76 4 2 4 y 91 3 1 6 a las 24 y 48 h Los valores de larvas atrapadas encontrados fueron menores a los indicados en un estudio con D flagrans contra Panagrellus redivivus en el cual el mayor comportamiento depredador puede atribuirse al tiempo de exposici n ya que en este estudio la observaci n se realiz hasta las 48 h y en el estudio de referencia el alto porcentaje de captura se registr hasta los cinco d as 12 En otro estudio se encontraron resultados similares al presente con valores de captura de alrededor del 55 de larvas de Haemonchus y 40 de larvas desenvainadas del
21. egard are limited ACKNOWLEDGEMENTS Our thanks are expressed to Foundation Produce Roberto Gonz lez Gardu o et al T c Pecu M x 2005 43 3 405 414 de larvas de Ostertagia TrichostrongylusfW y Nematodirus 25 en cultivos de heces En los estudios in vitro es importante considerar el tipo de medio de cultivo cuando se realizan pruebas de la capacidad depredadora de D Flagrans ya que por los resultados obtenidos se puede concluir que la concentraci n de nutrimentos del medio puede afectar la capacidad nemat faga del hongo Tambi n es recomendable realizar estudios con infecciones mixtas lo cual permitir conocer el comportamiento depredador de los hongos en infecciones de campo ya que la literatura disponible al respecto es limitada AGRADECIMIENTOS A la fundaci n Produce Tabasco A C y a la Direcci n de Centros Regionales de la Universidad Aut noma Chapingo por el financiamiento otorgado Al C Cornelio Hern ndez Garc a por su valioso apoyo y participaci n en el trabajo de laboratorio LITERATURA CITADA 1 Mendoza de GP Zavaleta ME Quir z RH Herrera RD Perdomo RF Interaction between the nematode destroying fungus Arthrobotrys robusta Hyphomycetales and Haemonchus contortus infective larvae in vitro Vet Parasitol 1992 41 101 107 Borgsteede FHM Gastrointestinal helminthiasis Anthelmintic resistance and how to prevent and control Symposium Parasitol Int 1998 47 Suppl 23 48 Prichard R Blackha
22. egunda prueba el porcentaje de reducci n en PDA 26 0 y HMA 48 7 fue menor que en AA 75 9 y no hubo diferencia en el tiempo de recuperaci n ni en la interacci n con el medio de cultivo El porcentaje de larvas de Haemonchus 84 98 16 9 y el de Cooperia 14 5 16 4 fue similar en todos los factores estudiados Es importante considerar el tipo de medio de cultivo en el que se realizan las pruebas in vitro ya que la concentraci n de nutrimentos puede afectar la capacidad nemat faga del hongo PALABRAS CLAVE Duddingtonia flagrans Control biol gico Nematodos gastrointestinales Reducci n larvaria ABSTRACT The nematode control using fungi is one alternative to prevent anthelmintic resistance The purpose of this study was to evaluate the in vitro predacious ability of Duddingtonia flagrans against Haemonchus and Cooperia infective larvae by both visualizing and measuring the larvae trapping activity LTA and by the nematode populations reduction in different culture media These experiments were carried out at the Autonomous University of Chapingo in Teapa Tabasco Mexico One D flagrans Mexican strain was used in the two trials In the first trial LTA was visualized and measured under the microscope and observations were described In the second trial a reduction of the nematode population by the fungal activity was evaluated using three different culture media water agar WA corn meal agar CMA and dextrose potato agar
23. gn was used One block was represented each time the test was performed since each test was run homogeneously but on a different date Therefore the model was as follows Y ik m t bj Cijk Where Y jr response variable trapped larvae trapped curled larvae m population mean t effect of i th treatment i no mold trapped at 24 h trapped at 48 h bj effect of the j th block j I IL 1D ejk IN 0 s2 Means were compared using Tukey s test with a 95 confidence 6 Four different larval categories were distinguished in this test a free larvae those moving continuously throughout the plate b curled larvae coiled immobile sometimes hypha surrounded larvae c trapped larvae fixed or moving larvae in contact with rings or tri dimensional adhesive loops d dead larvae rigid straight larvae with no loop ring contact Table 1 Many plates contained rings and tri dimensional adhesive loops in the hyphae with abundant chlamydospores In another study this effect has been also observed since this mold produces a great amount of chlamydospores and it can be easily reproduced under laboratory conditions 12 18 Twenty four 24 hours after adding the larvae to the culture medium containing D flagrans some nematodes were observed into the rings which in the beginning had vigorous movement Later 48 h larvae were immobile and trapped in 3 to 5 ring loops The percentage of trapped larva
24. inos Ovinos y caprinos en pastoreo en especial en los climas c lidos donde las condiciones ambientales favorecen su proliferaci n Su control se ha realizado tradicionalmente con productos farmac uticos y el uso frecuente de estos ha originado resistencia antihelm ntica en muchos pa ses y en todas las familias de desparasitantes usadosG 4 por lo que se han propuesto otros m todos de control de los cuales el uso de agentes biol gicos ha sido muy estudiado6 6 en especial los hongos nemat fagos que ayudan a reducir el n mero de larvas infestantes de las pasturas y prevenir futuras infestaciones en los reba os que muestran resistencia antihelm ntica Duddingtonia flagrans es un hongo depredador que desarrolla estructuras especializadas anillos y redes adhesivas con las cuales captura e inmoviliza a los nematodos penetra el cuerpo y finalmente consume el contenido Los estudios in vitro con esta especie han probado que se logra una reducci n del n mero de larvas de los estadios de vida libre de los nematodos par sitos S Sin embargo existen pocos estudios in vitro con cultivos mixtos sin duda frecuentemente observados en animales en pastoreo y por otra parte debido a que este hongo es saprofitoO y tambi n capaz de cambiar su alimentaci n dependiendo del tipo de sustrato en el cual se encuentre lo cual puede modificar su capacidad nemat faga por lo que se propuso como objetivo de esta investigaci n conocer
25. l los cuales se dejaron reposar a 4 C por 6 h Despu s se elimin el sobrenadante hasta ajustar el volumen a 2 5 ml y se tom una al cuota de 250 ml en la que se cont el n mero de larvas en un microscopio compuesto a 4 y 10X De esta manera el porcentaje de reducci n del n mero de larvas respecto al testigo se obtuvo con la f rmula 100 M M E 100 Re Donde M Porcentaje de recuperaci n de larvas respecto al testigo Rt Porcentaje de recuperaci n de larvas de las cajas conteniendo Duddingtonia flagrans larvas 410 after fungus nematode action For this purpose an average of 1 073 larvae were added four days after mold seeding in order to promote the nematophagous activity The same amount of larvae was added to the mold free culture media in order to determine larval recovery in the controls Larvae were counted in 250 ml aliquots Larvae were then added to the center of each plate in a known volume and incubated at ambient temperature minimum 30 7 C maximum 36 6 C mean 33 6 C Larval recovery was performed at 24 48 and 96 h using Baermann s method For this purpose agar surface was rinsed with distilled water then detached and placed in a funnel with water Preparations were left in Baermann s apparatus overnight 12 h Larvae were collected the following morning in a 7 5 ml test tube and then set aside at 4 C for 6 h Supernatant was then discarded until volume was adjusted to 2 5 ml
26. ll W Lin H Y Sharma SR Beech RN Alterations in genetic variability of Haemonchus contortus Nematoda genes following selection with anthelmintics Parasitol Int 1998 47 Supp 105 131 Sangster NC Managing parasiticide resistance Vet Parasitol 2001 98 89 109 Waller PJ Sustainable helminth control of ruminants in developing countries Vet Parasitol 1997 71 195 207 Waller PJ International approaches to the concept of integrated control of nematode parasites of livestock Int J Parasitol 1999 29 155 164 Larsen M Biological control in a global perspective a review with emphasis on Duddingtonia flagrans In Biological Control of Nematode Parasites of Small Ruminants in Asia 1 ed Malaysia FAO 2002 19 37 Larsen M Biological control of helminths Int J Parasitol 1999 29 139 146 Dijksteerhuis J Veenhuis M Harder W Nordbring hertz B Nematophagous Fungi Physiological aspects and structure function relationships Adv Microb Physiol 1994 36 11 139 Garc a E Modificaciones al sistema de clasificaci n clim tica de K ppen 4 ed M xico D F UNAM 1988 10 414 Tabasco A C and to the Administration of Regional Centers Direcci n de Centros Regionales The Autonomous University of Chapingo for having financed this research Thanks also to Mr Cornelio Hern ndez Garc a for his assistance and participation in lab work End of english version 11 Llerandi JRD Mendoza de GP Resistan
27. s estimated using the equation below l 12 15 The equation was modified when the different larval categories within total larval count were integrated Xx A 100 x y w z Where A catch x number of trapped larvae y number of free larvae w number of curled larvae z number of dead larvae The number of trapped larvae was estimated The trapped larvae curled larvae variable was also Roberto Gonz lez Gardu o et al T c Pecu M x 2005 43 3 405 414 Donde A porcentaje de captura x n mero de larvas atrapadas y n mero de larvas libres w n mero de larvas enroscadas z n mero de larvas muertas Se calcul el porcentaje de larvas atrapadas y tambi n se calcul la variable larvas atrapadas enroscadas la cual se gener debido a que se observaron muchas larvas enroscadas sin movimiento que se encontraban rodeadas por hifas y algunas veces cerca de anillos de D flagrans El porcentaje de larvas atrapadas y el porcentaje de larvas enroscadas las atrapadas se transformaron a log n porcentaje de larvas con el fin de reducir el coeficiente de variaci n y posteriormente se sometieron a un an lisis de varianzad6 con el procedimiento GLM del SASU Se utiliz un dise o en bloques al azar donde cada ocasi n en que se realiz la prueba represent un bloque ya que cada uno se trabaj de manera homog nea pero en distinta fecha por lo que el modelo qued de la siguiente manera
28. tes P lt 0 01 debido probablemente a factores ambientales y al manejo del material y como se ha encontrado en otro estudioC0 la temperatura pudo afectar el crecimiento y comportamiento depredador de los hongos En Arthrobotrys conoides y A oligospora se ha observado el efecto de la 411 b effect of the i th block i I I II t effect of j th culture medium i WA with mold WA with no mold CMA with mold CMA with no mold DPA with mold DPA with no mold di effect of the k th larval recovery hour k 24 48 96 tj dk jointly effect of j th culture medium k th larval recovery time ejk IN 0 s2 Means were compared using Tukey s test at 95 confidence l0 In this test differences P lt 0 01 among culture media were found regarding the control adjusted larval number reduction percent while among hours and recovery hour x culture medium interaction values were similar P gt 0 05 As expected in one of the days blocks in which the assay was performed larval population decreasing values differed P lt 0 01 probably due to environmental factors and material management differences and as observed in another studyC0 temperature could have affected mold growth and predacious behavior Temperature has also affected the effect of Arthrobotrys conoides and A oligospora against Haemonchus contortus with 90 4 and 25 7 catch ability respectively at 25 C but no rings or larvae trapping occurred at
29. those in control plates 84 3 and 15 4 when 908 and 886 larvae were identified respectively This could mean that larval population reduction occurred in both Haemonchus and Cooperia since the mold free group maintained the same percentage species as the D flagrans group Nevertheless another studyU1 found species related differences in the predacious ability of D flagrans with a higher value against T circumcincta and a lower trapping percent against Trichostrongylus axei In vitro studies have also been performed with different nematophagous mold species against different parasitic nematodes of plants and animals As far as nematode species of veterinary interest are concerned Arthrobotrys robusta has been used against Haemonchus contortus with a high percent of trapping ability after 7 d of interaction In other studies the predacious performance of D flagrans against Ostertagia ostertagi23 has been observed Reduction in Ostertagia TrichostrongylusC4 and NematodirusE5 larval numbers in fecal cultures have been reported In in vitro studies it is important to consider the culture medium when analyzing the predatory ability of D flagrans since from our results it can be concluded that nutrient concentrations in the media can affect mold s trapping ability Studies should be performed in order to learn about the predacious performance of molds against mixed nematode field infections since literature reports on this r
30. vae L3 from pasture as well as preventing future infections in herds with anthelmintic resistance Duddingtonia flagrans is a predacious mold that develops specialized structures rings and y adhesive loops used to catch and immobilize nematodes The mold then penetrates nematode s body to lastly consume its content In vitro studies with this mold species have shown that it reduces the number of free living larval stages of parasitic nematodes 8 Nevertheless only a few in vitro studies have been carried out with mixed cultures Mixed nematode infections unquestionably occur in grazing livestock On the other hand D flagrans is a saprophytic moldO and it has the ability of altering both its feeding habits in accordance with the substrate and its nematophagous ability Therefore the objective of this research was to know the predacious ability of D flagrans against mixed Haemonchus Cooperia cultures by estimating percent reductions in different culture media This experiment was carried out at the Autonomous University of Chapingo s South Fast Regional Center UACH s CRUSE located in Teapa Tabasco Mexico Weather in the region is hot and humid with rains year round Mean annual temperature is 25 8 C and raining rate is 3 976 mm Af m wi g 10 D flagrans FTHO 8 strain was used This strain was isolated from sheep feces 1 12 and provided by the National Center of Disciplinary Research in Veterinary Parasitology C
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