Y Chromosome AZF Analysis System Technical Manual
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1. seguro de la calibraci n de su tapa t rmica u observa condensaci n en el tubo de reacci n a ada un recubrimiento de aceite mineral 2 Velocidad de la rampa de calentamiento enfriamiento del termociclador El tiempo que dura un ciclo del termociclador entre las temperaturas de desnaturalizaci n anillamiento y extensi n de los perfiles de ciclo t rmino de PCR denominados frecuentemente tiempo de rampa puede afectar a la amplificaci n mediante PCR La velocidad con la que el termociclador realiza un ciclo entre las temperaturas del perfil de ciclo t rmico de PCR depende de su fabricaci n El protocolo de ciclo mediante PCR proporcionado se ha optimizado para el termociclador Perkin Elmer Model 480 Los usuarios deber n validar los tiempos de rampa para utilizar otros termocicladores Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 USA Toll Free in USA 800 356 9526 Phone 608 274 4330 Fax 608 277 2516 www promega com Part TM252 Page 4 Printed in USA Revised 3 14 3 Calibraci n del equipo O A El xito de la amplificaci n mediante PCR especialmente en la PCR multiplex depende de la realizaci n de un ciclo t rmico preciso Aseg rese de la Promega calibraci n del equipo termociclador que est utilizando con el Y Chromosome AZF Analysis System D Control de la contaminaci n Resulta fundamental evitar la contaminaci n con ADN de los componentes de reacci n Para evitar la c2. e Termociclador e Tubos de amplificaci n de pared delgada e Enelcaso del termociclador Perkin Elmer DNA Thermal Cycler 480 utilice tubos de reacci n GeneAmp de pared delgada de 0 5 ml de capacidad n de componente N801 0737 N801 0611 o N801 0537 de Applied Biosystems e Gel de agarosa preparado minigeles de NuSieve 3 1 al 4 m s agarosa con tamp n TBE preparada Reliant n de cat 54927 54928 o 54929 de Cambrex e 1tamp n de TBE e Bromuro de etidio e Puntas de pipeta resistentes a aerosoles e Transiluminador de UV Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 USA Toll Free in USA 800 356 9526 Phone 608 274 4330 Fax 608 277 2516 www promega com Printed in USA Part TM252 Revised 3 14 Page 5 CQ A Preparaci n de la reacci n y Consulte en la figura 2 un resumen del diagrama de flujo del protocolo de Promega preparaci n de la reacci n En este procedimiento se colocan al cuotas de los ADN de muestra en un tubo de reacci n Separadamente se a ade ADN polimerasa Tag a cada una de las Multiplex Master Mixes A continuaci n la Multiplex Master Mix que contiene ADN polimerasa Taq se a ade a los tubos de reacci n que contienen el ADN de muestra Cada muestra de ADN se analiza utilizando cada una de las cinco Multiplex Master Mixes Diluya el ADN de muestra en Nuclease Free Water y prepare los controles Prepare las mezclas de Multiplex Master Mix y ADN polimerasa Taq una p
3. Skaletsky H et al 2003 The male specific region of the human Y chromosome is a mosaic of discrete sequence classes Nature 423 825 37 Pryor J L et al 1997 Microdeletions in the Y chromosome of infertile men New Eng J Med 336 534 39 Kent First M G et al 1996 The incidence and possible relevance of Y linked microdeletions in babies born after intracytoplasmic sperm injections and their fathers Mol Hum Reprod 2 943 50 Kostiner D R Turek P K and Reijo R A 1998 Male infertility Analysis of the markers and genes on the human Y chromosome Hum Reprod 13 3032 8 Kuroda Kawaguchi T et al 2001 The AZFc region of the Y chromosome features massive palindromes and uniform recurrent deletions in infertile men Nat Genet 29 279 86 Lahn B T and Page D C 1997 Functional coherence of the human Y chromosome Science 278 675 80 Reijo R et al 1996 Severe oligozoospermia resulting from deletions of azoospermia factor gene on Y chromosome Lancet 347 1290 3 Repping S et al 2002 Recombination between palindromes P5 and P1 on the human Y chromosome causes massive deletions and spermatogenic failure Am J Hum Genet 71 906 22 Saxena R et al 1996 The DAZ gene cluster on the human Y chromosome arose from an autosomal gene that was transposed repeatedly amplified and pruned Nat Genet 14 292 9 Simoni M et al 1999 Laboratory guidelines for molecular diagnosis of Y chromosomal microdel
4. _ 4534TA Figura 3 Ejemplo de un an lisis en gel de la deleci n del cromosoma Y Se muestran los productos de amplificaci n de las reacciones de las Multiplex A E Master Mix Cada una de las Multiplex Master Mix se utiliza para la amplificaci n de las muestras de Male Genomic DNA MD115A calles 1 3 5 7 9 y de una muestra representativa que contiene deleciones del cromosoma Y calles 2 4 6 8 10 Las bandas resultantes de la amplificaci n del control positivo de Male Genomic DNA se comparan con las bandas resultantes de la amplificaci n del ADN gen mico de prueba que contiene deleciones del cromosoma Y observe las bandas con deleciones en todas esas calles excepto en la correspondiente a Multiplex E El marcador calles M es el 50bp DNA Step Ladder suministrado con el sistema Hemos observado algunas bandas no espec ficas que aparecen por encima o por debajo de los productos de amplificaci n esperados en el gel de agarosa en particular una banda d bil en Multiplex D aproximadamente a 150 pb y en Multiplex E por encima del control Verifique que sus controles negativos amplificaciones de muestras sin ADN no muestran unos productos de amplificaci n mediante PCR detectables Siempre y cuando sus controles negativos no muestren productos de amplificaci n mediante PCR estas bandas no espec ficas no tienen efecto sobre el an lisis Nota Se ha observado la presencia de se al positiva SY133 en algunos individuos que
5. individuos que muestran una delecci n AZFb lo cual sugiere que el locus SY133 se encuentra presente de manera adicional en el cromosoma de estos KR N a gt 00 0 m TIN TIN nln gt gt aja oO Tt CO gt gt nln ue gt 3 x N 00 09 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 USA Toll Free in USA 800 356 9526 Phone 608 274 4330 Fax 608 277 2516 www promega com Printed in USA Part TM252 Revised 3 14 Page 13 U S Pat No 6 242 235 Australian Pat No 761757 Canadian Pat No 2 335 153 Chinese Pat No ZL99808861 7 Hong Kong Pat No HK 1040262 Japanese Pat No 3673175 European Pat No 1088060 and other patents pending 2013 2014 Promega Corporation All Rights Reserved GoTagq is a registered trademark of Promega Corporation GeneAmp is a registered trademarks of Roche Molecular Systems Inc Reliant is a registered trademark of CBM Intellectual Properties Inc NuSieve is a registered trademark of Lonza Sales AG Please contact Promega Technical Services or access our web site at www promega com for the most up to date information on Promega products Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 USA Toll Free in USA 800 356 9526 Phone 608 274 4330 Fax 608 277 2516 www promega com Part TM252 Printed in USA Page 14 Revised 3 14
6. TECHNICAL MANUAL Y Chromosome AZF Analysis System 2800 Woods Hollow Rd AEA ll i Productos sanitarios MDSS GmbH INSTRUCCIONES DE A Wri Revised 3 14 para diagn stico Schiffgraben 41 USO DEL PRODUCTO in vitro 30175 Hanover Alemania MD1631 Pari IMAS Y Chromosome 2 AZF Analysis System Manual t cnico TM252 INSTRUCCIONES DE USO DEL PRODUCTO MD1631 Toda la literatura t cnica se encuentra disponible en Internet en www promega com Visite nuestra web para verificar que est utilizando la versi n m s reciente de este manual t cnico 1 Uso previsto de pro ducho ams 1 2 LC Los y POP E oo O O 2 3 Componentes del ro aeaaea 3 A Consideraciones generales erro 3 e EA A 10 ADN e Cenr eam nanenaaene enrerre rT Ty rrr nro rire ry 2 ae vs m B Condiciones de POR 4 Schiffgraben 41 a o PP Po E EE 4 D Cc ide GUADA 5 30175 Hanover oniro ELA CONAN A O aE EEE E Alemania Es RERO de CNO nd 5 B Reacciones Ce amp CACA aos 5 A erario de la io ete vO T 6 B Protocolo de ciclo t rmico mediante PCR ptimo para el termociclador Perk a doU sios EEEE 8 E Eleelrororesis engelde ae at Ose mundo peepanad 8 Ds Analisisde lOs ao e108 retos 9 E An lisis de los datos muestras experimentales ooooioioioionncnnms 10 il AMM e o A 11 Te AP AIE apna II 11 A Composici n de tampones y soluciones usina 11 a Cib EE 12 1 Uso previsto del producto El Y Chromosome AZF Analysis System cumple los requisitos de la Directi
7. ara cada Y 7 e Control positivo Control Prepare las reacciones ADN de de Male negativo 1 Coloque el ADN de muestra Multiplex ADN polimerasa muestra Genomic DNA sin ADN o el control en los tubos Master Mix para Taq para cada cada muestra muestra 799 ee eT ADN de Control muestra positivo negativo Ciclo t rmico 3856MA10_2A Figura 2 Representaci n esquem tica del an lisis con el Y Chromosome AZF Analysis System Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 USA Toll Free in USA 800 356 9526 Phone 608 274 4330 Fax 608 277 2516 www promega com Part TM252 Printed in USA Page 6 Revised 3 14 1 Descongele las Multiplex Master Mixes Nuclease Free Water y Male Genomic E DNA en hielo Una vez descongeladas cons rvelas en hielo Agite con v rtex A las Multiplex Master Mixes durante 5 10 segundos antes del uso Promega 2 Complete la tabla siguiente para determinar el n mero de reacciones para cada Multiplex Master Mix Para cada muestra de ADN habr cinco tubos de reacci n uno para cada Multiplex Master Mix Incluya un control positivo de Male Genomic DNA y un control negativo sin ADN para cada Multiplex Master Mix N de Control Control Tubos de Multiplex ADN positivo de Male negativo reacci n Master Mix de muestra Genomic DNA sin ADN totales A 1 1 B 1 1 C 1 1 D 1 1 E 1 1 3 Prepare y etiquete el n mero necesario de tubos de reacci n determinado anteriorment
8. diante PCR multiplex se deben utilizar cincuenta nanogramos de ADN Se puede obtener una sobreestimaci n de la concentraci n de ADN mediante espectrofotometr a si la proporci n A269 Azs es baja o si el valor de la absorbancia es peque o inferior a 0 1 Promega Leyenda de simbolos Productos sanitarios para diagn stico in vitro gt 30 C i Conservar de 10 a 30 C lt N gt Contiene suficiente oy para n pruebas Representante autorizado Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 USA Toll Free in USA 800 356 9526 Phone 608 274 4330 Fax 608 277 2516 www promega com Printed in USA Revised 3 14 Part TM252 Page 3 Condiciones de PCR Es posible que se formen gradientes de concentraci n en las Multiplex Master Mixes conservadas a 20 C Tras descongelar las muestras seg n las indicaciones agite con v rtex cada tubo durante 10 15 segundos antes del uso Precaliente el instrumento hasta 94 C antes de colocar los tubos en su interior No utilice m s de 1 unidad de ADN polimerasa GoTaq por cada reacci n de amplificaci n mediante PCR multiplex Los vol menes finales habituales de la PCR con el Y Chromosome AZF Analysis System son de 25 ul Unos vol menes de PCR de 12 5 ul pueden tener como resultado la aparici n de m ltiples bandas residuales por lo que no se deben utilizar Termocicladores El Y Chromosome AZF Analysis System se ha desarrollado m
9. e Utilice tubos de amplificaci n de pared delgada Coloque los tubos de reacci n en hielo 4 Enun tubo separado diluya cada muestra de ADN hasta 10 ng ul con el Nuclease Free Water suministrada Mezcle bien con v rtex durante 5 10 segundos A ada 5 ul de ADN a los tubos de reacci n etiquetados debidamente que se encuentran en el hielo Muestra de ADN de control positivo Para la muestra de control positivo de Male Genomic DNA diluya el Male Genomic DNA hasta 10 ng ul a adiendo 6 ul de Male Genomic DNA a 24 ul de Nuclease Free Water Mezcle bien con vortex durante 5 10 segundos A ada 5 ul a los tubos de reacci n etiquetados adecuadamente que se encuentran en el hielo Muestra de control negativo sin ADN Para el control negativo sin ADN a ada 5 ul de Nuclease Free Water a los tubos de reacci n etiquetados adecuadamente que se encuentran en el hielo 5 Prepare cinco mezclas de Multiplex Master Mix ADN polimerasa GoTaq en hielo una para cada Multiplex Master Mix Agite con v rtex las Multiplex Master Mixes antes de usarlas Volumen por Volumen por Componente reacci n 10 reacciones Multiplex Master Mix 20 ul 200 ul ADN polimerasa GoTaq 5 u pl 0 2 pl 2 ul volumen final 20 2 ul 202 ul 6 Mezcle agitando en el vortex 7 A ada 20 ul de la mezcla de Multiplex Master Mix ADN polimerasa GoTaq a los tubos de reacci n apropiados que contienen el ADN de muestra o los controles conservados en hielo 8 Mezc
10. ediante el uso del termociclador Perkin Elmer DNA Thermal Cycler 480 El uso con otros termocicladores necesitar la validaci n y optimizaci n del protocolo por parte del usuario Utilice nicamente tubos de pared delgada para la amplificaci n mediante PCR Con el termociclador Perkin Elmer Model 480 utilice tubos de reacci n GeneAmp de pared delgada de 0 5 cm de capacidad 1 Termocicladores con tapas t rmicas frente a no t rmicas Se encuentran disponibles termocicladores con tapas t rmicas o con tapas no t rmicas En el caso de los termocicladores que tienen una tapa no calentada p ej el Perkin Elmer DNA Thermal Cycler 480 es necesario colocar un recubrimiento de aceite mineral sobre la reacci n para evitar la evaporaci n de la misma durante el ciclo t rmico Para los termocicladores con tapas t rmicas no resulta necesario el recubrimiento con aceite mineral La tapa t rmica de estos termocicladores evita la evaporaci n de la reacci n durante el transcurso del ciclo t rmico No obstante aseg rese de que la tapa t rmica funciona correctamente En el caso de que observe que sus tubos de reacci n amplificados en un termociclador equipado con tapa t rmica muestran condensaci n en la tapa y alrededor de la parte superior del tubo de reacci n esto constituye una indicaci n de que la tapa t rmica no funciona correctamente y es posible que se haya obtenido un mal resultado de las amplificaciones del sistema Si no est
11. etions Int J Androl 22 292 9 7 Ap ndice A Composici n de tampones y soluciones 110mM cido b rico tamp n de TBE 1X 89mM Base de Tris 2mM EDTA Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 USA Toll Free in USA 800 356 9526 Phone 608 274 4330 Fax 608 277 2516 www promega com Printed in USA Part TM252 Revised 3 14 Page 11 E B Hojas de c lculo A Promega Tabla 1 Perfil de productos de amplificaci n mediante PCR para las muestras de prueba Registre la presencia o la ausencia de los productos de amplificaci n mediante PCR para cada muestra experimental Multiplex A Master Mix Muestras Tama o del Posici n SSM Locus producto pb en el mapa SY 254 DAZ 380 18 SY157 DYS240 290 20 SY81 DYS271 209 2 SY130 DYS221 179 11 SY182 KAL Y 125 5 SMCX 83 Control Multiplex B Master Mix Muestras Tama o del Posici n SSM Locus producto pb en el mapa SYPR3 SMCY 362 i 51127 DYS218 274 9 SY242 DAZ 239 16 SY 208 DAZ 140 17 SMCX 83 Control Multiplex C Master Mix Mwaestras H Tama o del Posici n SSM Locus producto pb en el mapa SY128 DYS219 228 10 D1 Dl DYS212 190 6 SY145 DYF51S1 143 14 51209 DAZ 124 19 SMCX 83 Control Multiplex D Master Mix Muestras Tama o del Posici n SSM Locus producto pb en el mapa SILOS DYS225 177 12 51152 DYS236 125 15 SY124 DYS215 109 8 SMCX 83 Control Multiplex E Ma
12. i n incluye un par de cebadores que amplifica una regi n del gen SRY que act a como amplificaci n de control para el factor determinante testicular situado en el brazo corto del cromosoma Y humano bp i 500 200 MN 200 300 3 Y a 300 200 aan Tt r i 200 4322TA09_3A Figura 1 Ejemplo de amplificaci n de ADN gen mico masculino Amplificaci n de ADN gen mico masculino MD115A calles 1 3 5 7 9 as como de control negativo sin ADN calles 2 4 6 8 10 para cada una de las Multiplex Master Mixes Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 USA Toll Free in USA 800 356 9526 Phone 608 274 4330 Fax 608 277 2516 www promega com Part TM252 Page 2 Printed in USA Revised 3 14 3 Componentes del producto Producto Tama o N de cat Y Chromosome AZF Analysis System MD1631 Prohibida su venta en Estados Unidos S lo para exportaci n El Y Chromosome AZF Analysis System incluye o 25 30 C 25 reacciones e MD154A Multiplex A Master Mix 500 pl e MDI55A Multiplex B Master Mix 500 ul e MDI56A Multiplex C Master Mix 500 ul e MD157A Multiplex D Master Mix 500 pl e MD158A Multiplex E Master Mix 500 ul e M300C GoTag DNA Polymerase 200 u e P119F Nuclease Free Water Lo mil e G452C 50bp DNA Step Ladder 340 ng ul 90 ug e MD115A Male Genomic DNA 50 ng ul 2 9 18 e G190B Blue Orange 6X Loading Dye 1 ml Condiciones de almacenamiento Conserve todos los componen
13. iones en cadena de la polimerasa PCR 6 8 Los cebadores se han combinado en cinco juegos de Multiplex Master Mix para su uso en PCR multiplex Esto permite determinar la presencia o la ausencia de las 20 SSM realizando cinco amplificaciones mediante PCR simult neas figura 1 Las deleciones del cromosoma Y localizadas en las regiones amplificadas por estos juegos de cebadores se han asociado con la infertilidad masculina 1 2 6 9 17 En general las regiones adyacentes del cromosoma Y no aparecen como productos de amplificaci n secuenciales dentro de una nica reacci n de amplificaci n multiplex Las excepciones son las regiones SY242 y SY208 del locus DAZ que aparecen representadas como productos de amplificaci n secuenciales en las reacciones con Multiplex B Master Mix y las regiones SY84 y SY86 de los loci DYS273 y DYS148 que aparecen representadas como productos de amplificaci n secuenciales en las reacciones con Multiplex E Master Mix Las Multiplex Master Mixes A D contienen un par de cebadores de control que amplifican los fragmentos del locus SMCX ligado al cromosoma X La quinta Multiplex Master Mix Multiplex E contiene un par de cebadores de control que amplifica una regi n nica tanto del ADN masculino como femenino ZFX ZFY Estos pares de cebadores de control son controles internos para las reacciones de amplificaci n multiplex y prueban la integridad de la muestra de ADN gen mico Finalmente la Multiplex E Master Mix tamb
14. le agitando suavemente con vortex Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 USA Toll Free in USA 800 356 9526 Phone 608 274 4330 Fax 608 277 2516 www promega com Printed in USA Part TM252 Revised 3 14 Page 7 9 Centrifugue los tubos brevemente para hacer descender todo el contenido al fondo de los mismos Mantenga los tubos de reacci n en hielo hasta que se encuentren listos para el ciclo t rmico 10 Los termocicladores que no dispongan de tapa t rmica por ejemplo el Perkin Elmer Model 480 thermal cycler requieren la aplicaci n de un recubrimiento con aceite mineral sobre las reacciones en el tubo de reacci n Incline los tubos y a ada una gota de aceite en la pared lateral del tubo dejando que descienda por ella Protocolo de ciclo t rmico mediante PCR ptimo para el termociclador Perkin Elmer Model 480 El siguiente protocolo se ha optimizado para el termociclador Perkin Elmer Model 480 En el caso de utilizar un termociclador diferente el usuario es responsable de la validaci n y optimizaci n del protocolo Es crucial precalentar el instrumento hasta 94 C antes de colocar los tubos en su interior ADN Polimerasa Condiciones de PCR Model 480 Tubos de reacci n GoTaq DNA 94 C durante 2 minutos despu s GeneAmp de pared Polymerase 94 C durante 1 minuto delgada 0 5 ml 57 C durante 30 segundos 72 C durante 1 minuto Repetir durante 35 ciclos y despu s 72 C du
15. muestran una delecci n AZFb lo cual sugiere que el locus SY133 se encuentra presente de manera adicional en el cromosoma de estos Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 USA Toll Free in USA 800 356 9526 Phone 608 274 4330 Fax 608 277 2516 www promega com Part TM252 Page 10 Printed in USA Revised 3 14 6 Bibliograf a E A de 2 10 11 12 15 14 l5 16 17 Vollrath D et al 1992 The human Y chromosome A 43 interval map based on naturally occurring deletions Science 258 52 9 Promega Reijo R et al 1995 Diverse spermatogenic defects in humans caused by Y chromosome deletions encompassing a novel RNA binding protein gene Nature Genet 10 383 93 Foote S et al 1992 The human Y chromosome Overlapping DNA clones spanning the euchromatic region Science 258 60 6 Affara N et al 1996 Report of the second international workshop on Y chromosome mapping 1995 Cytogenet Cell Genet 73 33 76 Kent First M G et al 1996 Gene sequence and evolutionary conservation of human SMCY Nat Genet 14 128 9 Kent First M G et al 1999 Defining regions of the Y chromosome responsible for male infertility and identification of a fourth AZF region AZFd by Y chromosome microdeletion detection Mol Reprod and Dev 53 27 41 Vogt P H et al 1997 Report of the third international workshop on Y chromosome mapping 1997 Cytogenet Cell Genet 79 1 20
16. ontaminaci n las reas de trabajo previas y posteriores a la amplificaci n deben estar aisladas preferiblemente en salas separadas Utilice siempre puntas de pipetas con barrera frente a aerosoles pipetas exclusivas para la preparaci n de las reacciones guantes desechables limpios y evite la contaminaci n por arrastre de las soluciones de reserva Los lugares de trabajo y las pipetas deben limpiarse con una soluci n de lej a suave antes y despu s de cada uso E Reacciones de control En cada experimento se deben incluir reacciones de control adecuadas 1 En todos los casos se deben llevar a cabo reacciones de amplificaci n en paralelo con las muestras utilizando el control positivo Male Genomic DNA como patr n La amplificaci n mediante PCR del control positivo Male Genomic DNA suministrado siempre debe dar lugar a los productos de amplificaci n esperados consulte los tama os esperados en el Apartado 7 B Tabla 1 2 Siempre se debe llevar a cabo una reacci n de amplificaci n mediante PCR con un control negativo sin ADN en paralelo con las muestras con objeto de verificar que los reactivos no est n contaminados con ADN La amplificaci n mediante PCR de un control sin ADN no debe producir producto de amplificaci n alguno 5 Reacciones de amplificaci n Materiales que ha de aportar el usuario En el Ap ndice Apartado 7 A se encuentran las composiciones de las soluciones e Aceite mineral ligero libre de nucleasa
17. os no se pueden considerar v lidos si cualquiera de los productos de amplificaci n no aparece en las reacciones con el control positivo de Male Genomic DNA 3 Cebador de control en las Multiplex Master Mixes En las reacciones con las Multiplex A B C y D Master Mix el producto de amplificaci n m s peque o 83 pb se deber a producir a partir de un locus ligado al cromosoma X SMCX En el caso de la Multiplex E Master Mix el producto de amplificaci n m s grande 496 pb se deber a producir a partir de los genes ZFY ZFX La ausencia de estos productos es indicativa de un problema con esa amplificaci n mediante PCR multiplex particular En el caso de que estas bandas de control aparezcan con el control positivo de Male Genomic DNA pero no con el ADN de muestra esto sugiere que puede haber alg n problema con el ADN gen mico utilizado como patr n Los problemas con el ADN de muestra pueden ser la presencia de impurezas una cuantificaci n del ADN imprecisa o un ADN degradado Verifique el patr n de ADN en un gel de agarosa antes de repetir la amplificaci n Repita las amplificaciones para cualquiera de las reacciones con ADN de muestra en las que no aparezca el producto de control Puede resultar necesario aislar de nuevo el ADN gen mico patr n Promega Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 USA Toll Free in USA 800 356 9526 Phone 608 274 4330 Fax 608 277 2516 www promega com Prin
18. rante 5 minutos bajada y mantenimiento a 4 C Electroforesis en gel de agarosa Para llevar a cabo la electroforesis y conseguir una posterior visualizaci n ptima de los productos de amplificaci n se requieren minigeles de NuSieve 3 1 al 4 m s agarosa con tampon TBE preparada Reliant N de Cat 54927 54928 6 54929 de Cambrex 1 Diluya el marcador de peso molecular del siguiente modo Componente Volumen 50bp DNA Step Ladder 12 ul Blue Orange 6X Loading Dye 4 ul Nuclease Free Water 8 ul 2 A ada 2 5 pl del Blue Orange 6X Loading Dye a cada tubo de amplificaci n y mezcle Cargue 10 ul del marcador de peso molecular diluido en el primer pocillo del gel Cargue 10 ul pocillo de cada muestra Cargue 10 ul del marcador de peso molecular diluido en el ltimo pocillo del gel a Di A w Coloque el gel en TBE 1X que contenga 0 5 ug ml de bromuro de etidio y aplique 5 V cm medidos como la distancia entre los electrodos hasta que el frente de tinte de azul de bromofenol migre hasta el final del gel 7 Fotografie el gel con ayuda del transiluminador de UV 320 nm Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 USA Toll Free in USA 800 356 9526 Phone 608 274 4330 Fax 608 277 2516 www promega com Part TM252 Page 8 Printed in USA Revised 3 14 D An lisis de los datos Controles Compruebe que las reacciones de control han producido los resultados esperados antes de analizar sus muestra
19. s Las hojas de c lculo proporcionadas consulte el Apartado 7 B Tabla 1 se pueden utilizar tanto para el an lisis de los controles como para el de las muestras experimentales 1 Control negativo sin ADN No deber an aparecer productos de amplificaci n espec ficos en las calles que contienen las reacciones de control negativo sin ADN Pueden aparecer algunas bandas o manchas de bajo peso molecular como resultado de las interacciones de los cebadores Los resultados no se pueden considerar v lidos si se observan productos de amplificaci n en las reacciones de control negativo sin ADN Esto es indicativo de ADN contaminante y se debe repetir el experimento poniendo especial cuidado para evitar la contaminaci n 2 Control positivo de Male Genomic DNA En la tabla 1 Apartado 7 B se indica el n mero y tama o de los productos de amplificaci n para cada Multiplex Master Mix La reacci n de control positivo con Male Genomic DNA para cada Multiplex Master deber a mostrar todas las bandas indicadas para esa Multiplex Master Mix Apartado 7 B Tabla 1 Los tama os de los productos de amplificaci n se pueden estimar compar ndolos con el marcador 50bp DNA Step Ladder incluido en el gel Si no est n presentes todas las bandas esperadas en las reacciones con el control positivo de Male Genomic DNA o si se observan bandas extra importantes esto es indicativo de un problema con los reactivos de amplificaci n o con el termociclador Los resultad
20. ster Mix Muestras Tama o del Posici n SSM Locus producto pb en el mapa ZFX ZFY 496 Control SY14 SRY 400 1 SY134 DYS224 303 13 SY86 DYS148 232 3 SY84 DYS273 177 4 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 USA Toll Free in USA 800 356 9526 Phone 608 274 4330 Fax 608 277 2516 www promega com Part TM252 Page 12 Printed in USA Revised 3 14 a a 2 qu o Jm 5 3 gt E a L Q mo D 2 E E J a o pa NEMS VN Oo xD e LLENO a Ano ON N NAZNOWU gt N Ex lt gt gt m lt O 11x2 2 FPP EG na O Nan E ea Oey aa 113 O Yp Eucromatina Pseudoautos mico Pseudoautos mico SRY SRY Se ee A Control Control Control Control Control Hie ie lJele l l l a ih as een dior aa ie a eves SY14 1 4320MA09_3A Tabla 2 Hoja de c lculo para la cartograf a del cromosoma Y Para obtener una informaci n m s detallada consulte la figura 2 complementaria de la referencia bibliogr fica 8 Los pal ndromos 8 7 6 5 y 4 se localizan en la direcci n proximal de la regi n SY121 y en la direcci n distal de la regi n SY182 1 La regi n SY121 se encuentra en el l mite distal de P4 8 La region AZFb se extiende desde P5 hasta la regi n proximal a P1 8 La regi n AZFc incluye P1 y P2 8 Al menos una copia de SY157 se localiza fuera del l mite de la regi n AZFc Nota Se ha observado la presencia de se al positiva SY133 en algunos
21. ted in USA Revised 3 14 Part TM252 Page 9 Promega E An lisis de los datos muestras experimentales Las hojas de c lculo proporcionadas en el Ap ndice Apartado 7 B se pueden utilizar para el an lisis de las muestras experimentales Determine la presencia o la ausencia de los productos de PCR esperados Apartado 7 B Tabla 1 Si en estas reacciones no aparece alguno de los productos se pueden localizar con ayuda de la hoja de c lculo para la cartograf a del cromosoma Y Apartado 7 B Tabla 2 Todas las deleciones deber an aparecer contiguas Si faltan m ltiples bandas de amplificaci n y esas bandas no se localizan en regiones adyacentes del cromosoma Y Apartado 7 B Tabla 2 estas representan bandas residuales y no son deleciones En este caso se deber repetir el an lisis La ausencia de una sola banda de amplificaci n en una muestra puede representar una banda residual y por tanto se deber repetir el an lisis para confirmar que el locus no se amplifica Tenga en cuenta que es posible que un locus presente en una muestra no se amplifique si existe una mutaci n en uno de sus cebadores Los resultados del diagn stico obtenidos con este sistema se deben interpretar nicamente junto con otros datos cl nicos o de laboratorio La Figura 3 muestra un ejemplo de an lisis en gel de un ADN de muestra que tiene una deleci n del cromosoma Y entre las posiciones del mapa 15 a 20 11 tf tU Cc hu ha 1 7
22. tes de 10 a 30 C Evite realizar m ltiples ciclos de congelaci n descongelaci n MDSS GmbH Schiffgraben 41 30175 Hanover Alemania 4 Consideraciones generales A Muestra patr n de ADN La concentraci n la pureza y el tama o del ADN constituyen consideraciones importantes con el fin de asegurar unos resultados satisfactorios con el Y Chromosome AZF Analysis System Un ADN de mala calidad puede tener como resultado un aumento del la amplificaci n de fondo o un fallo de la amplificaci n El fallo de la amplificaci n se puede manifestar como una ausencia completa de amplificaci n en todas las bandas con las Mutiplex Master Mixes o como la formaci n de subpoblaciones residuales de alelos en las mezclas maestras individuales Con el fin de evitar esto utilice nicamente ADN de alta calidad con una proporci n de absorbancia A g0 A20 21 8 El ADN no se debe someter a esfuerzos cortantes y debe estar libre de prote nas contaminantes de etanol o de sales especialmente EDTA la concentraci n de EDTA debe ser lt 0 4 mM Cuantifique el ADN antes de su uso en el Y Chromosome AZF Analysis System dado que la adici n de una cantidad demasiado grande o demasiado peque a de ADN puede hacer que las reacciones fallen Para la estimaci n de la concentraci n de ADN se pueden utilizar las medidas espectrofotom tricas absorbancia a 260 nm A20 en las que 1 uA 50 ug de ADN bicatenario ml En cada reacci n de amplificaci n me
23. va 98 79 CE de la Uni n Europea sobre productos sanitarios para diagn stico in vitro El Y Chromosome AZF Analysis System proporciona un m todo multiplex basado en PCR para analizar la integridad de la regi n AZF del cromosoma Y humano El Y Chromosome AZF Analysis System est pensado para su uso como parte de un plan de diagn stico con objeto de caracterizar la infertilidad masculina Los resultados del diagn stico obtenidos mediante este sistema se deben interpretar junto con otros datos cl nicos o de laboratorio Esta informaci n resulta potencialmente til para los pacientes que se est n planteando la fertilizaci n in vitro puesto que las deleciones situadas en la regi n AZF del cromosoma Y se transmiten a los descendientes masculinos engendrados mediante fertilizaci n in vitro lo que tiene como resultado la infertilidad del ni o Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 USA Toll Free in USA 800 356 9526 Phone 608 274 4330 Fax 608 277 2516 www promega com Printed in USA Part TM252 Revised 3 14 Page 1 Descripci n El Y Chromosome AZF Analysis System proporciona un m todo para la detecci n de la regi n AZF del cromosoma Y humano El sistema consta de 20 pares de cebadores que son hom logos a sitios con secuencias marcadas previamente identificados y cartografiados SSM 1 7 Estos cebadores amplificar n los segmentos cortos de ADN no polim rficos del cromosoma Y al utilizarlos en reacc
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