(LISTOS)ESManual de instrucciones GRHI
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1. Descongelar y congelar repetidas veces los reactivos puede disminuir la sensibilidad del kit Usar guantes desechables Usar pipetas calibradas y puntas de pipeta con filtro Los ensayos deben llevarse a cabo por personal cualificado y siguiendo las buenas pr cticas de laboratorio No usar el kit despu s de la fecha de caducidad Uso para diagn stico in vitro 8 Muestras cl nicas Recoger las muestras en tubos est riles Almacenarlas y transportarlas congeladas a 20 C hasta su uso Utilizar ARN bien purificado y libre de inhibidores de la PCR 9 Procedimiento a Extracci n de ARN Procedimiento GRIP b Protocolo Stage 3 Repeat 45 times 3 Temperature Cycle Pai 95 0 115 60 0 30 r20 30 Advance to Next Stage Selecci n de fluor foros FAM detecta FluA TxR detecta FluB Alx532 detecta el control interno c Preparaci n de la reacci n Descongelar la AmpliMix y el Control Positivo FluA Tomar una al cuota de 22 8 uL de Amplimix a adir 0 3 uL de retrotranscriptasa y 7 5 uL del ARN de cada muestra o control a cada tubo Colocar los tubos en el equipo Seleccionar el protocolo GRIP G Iniciar el programa de amplificaci n d Interpretaci n de los resultados Ba p Alx532 Interpretaci n Std Res Std Res Std Res P POS ND Indiferente POSITIVO Influenza A ND POS Indiferente POSITIVO Influenza B POS POS Indiferente POSITIVO I2. con Ct 29 28 Control positivo FluB A4 en verde ausencia de se al Fluorescence Ww Site Protocol SamplelD Sample FAM FAM Ct Alx532 Alx532 Ct ID Type Std Res Std Res GRIP C UNKN NEG 0 00 POS 26 74 NEG 2 GRIP C UNKN NEG 0 00 POS 27 16 NEG A3 GRIP C FlUA UNKN POS 29 28 POS 27 33 NEG 4 C F GRIP luB UNKN NEG 0 00 POS 26 90 POS Gr fica 2 Canal TxR FluB Resultado obtenido al amplificar dos controles negativos un control positivo FluA y un control positivo FluB Control negativo A1 en azul ausencia de se al Control negativo A2 en gris ausencia de se al Control positivo FluA A3 en naranja ausencia de se al Control positivo FluB A4 en verde se observa se al con Ct 27 64 11 Observaciones C FluA C FluB Tabla de compatibilidad de fluor foros Fluorescence Fluor foro Fluor foro alternativo FAM TET CAL Fluor Gold 540 Site Protocol SamplelD Sample Status FAM FAM Ct Alx532 Alx532 Ct TR Std Res TXR Ct ANG47 Alx647 Ct ID Std Res Std Res At GRIP C UNKN oK NEG 0 00 POS 26 74 NEG E NEG 0 00 o CFA unk Jok iros zaz pos 233 Neo oo NEO 00 HEX JOE VIC CAL Fluor Orange 560 Alexa 532 Ag C FluB UNKN OK NEG 0 00 POS 26 90 POS i NEG 0 00 Texas Red ROX LC Red 610 CAL Fluor Red 610 Gr fica 3 Canal Alx532 control interno Resultado obtenido al amplificar dos controles negativos un control
3. positivo FluA y un control positivo FluB Control negativo A1 en azul se observa se al con Ct 26 74 Control negativo A2 en gris se observa se al con Ct 27 16 Control Fecha de publicaci n Marzo 2012 positivo FluA A3 en naranja se observa se al con Ct 27 33 Control positivo FluB A4 en verde se observa se al con Ct 26 90 HINI site ID Protocol Sample ID HINI H1N1 C Fluorescence Sample Status FAM FAMCt Al532 Ax532Ct TXR TXR Ct Type Std Res _Std Res Std Res UNKN OK NEG 0 00 POS 26 27 NEG 0 00 UNKN OK POS 29 50 POS 26 26 NEG 0 00 Gr fica 1 Canal FAM FluA H1N1 Resultado obtenido al amplificar un control negativo y un control positivo FluA H1N1 Control negativo A13 en azul ausencia de se al Control positivo FluA H1N1 A14 en gris se observa se al con Ct 29 50 Fluorescence Site Protocol SamplelD Sample Notes Status FAM FAM Ct Alx532 Alx532 Ct TXR TXR Ct Type Std Res Std Res Std Res A13 H1IN1 C UNKN OK NEG 0 00 POS 26 27 NEG 0 00 A14 H1N1 C UNKN OK POS 29 50 POS 26 26 NEG 0 00 Gr fica 2 Canal Alx532 control interno Resultado obtenido al amplificar un control negativo y un control positivo FluA H1N1 Control negativo A13 en azul se observa se al con Ct 26 27 Control positivo FluA H1N1 A14 en gris se observa se al con Ct 26 26 10 Control de calidad Se recomienda que se lleven a cabo controles positivos y negati
4. EXIAGENIE CE MOLECULAR Progenie molecular Artes y Oficios 37 Valencia 46021 Espa a Tel 902 91 05 05 Fax 902 91 05 06 www progenie molecular com RealCycler GRHI G v 1 1 Uso previsto RealCycler GRHI G es un kit de reactivos que permite la detecci n cualitativa por PCR a tiempo real del ARN de Influenza A Influenza B y del gen H1 de la nueva variante de gripe H1N1 en muestras cl nicas El sistema incluye un control interno de amplificaci n para prevenir los falsos negativos debidos a la inhibici n de la reacci n 2 Especificaciones Sensibilidad 100 copias uL Influenza A 100 copias uL Influenza B y 500 copias uL Influenza A H1N1 Especificidad Influenza A gen M1 y M2 matrix protein Influenza B gen M1 y M2 matrix protein e Influenza A H1N1 gen hemaglutinina 3 Estabilidad y almacenamiento Todos los componentes del kit RealCycler GRHI G deben ser almacenados a 20 C El kit es estable a 20 C hasta la fecha de caducidad ver etiqueta externa del kit 4 Descripci n del m todo La reacci n en cadena de la polimerasa PCR est basada en la amplificaci n de una regi n espec fica del genoma del pat geno usando primers y sondas espec ficos En la PCR a tiempo real se utilizan sondas marcadas con fluorocromos Hay una emisi n de fluorescencia que es proporcional a la cantidad de ARN presente en la muestra El Cycle threshold Ct es el ciclo de la PCR en el que se detecta inicialment
5. e un aumento en la se al de fluorescencia En la amplificaci n GRIP Influenza A se detecta en FAM Influenza B se detecta en TxR y el control interno en Alx532 En la amplificaci n de HINI H1N1 se detecta en FAM y el control interno en Alx532 5 Composici n RealCycler GRHI G incluye la mezcla de reacci n Amplimix GRIP y Amplimix HINI una retrotranscriptasa un Control Positivo ARN FluA y un Control Positivo ARN FluA H1N1 Todos los reactivos est n listos para su uso sin a adir ni reconstituir ning n componente Componente Viales N mero Volumen Conservaci n AmpliMix GRIP 1 560 uL 15 25 9C AmpliMix 15 250 HINI 1 540 uL 15 259C Control Positivo ARN FluA 60 uL 15 2590C Control Positivo ARN FluA H1N1 1 60 uL 15 25 C E Componente Volumen Conservaci n Retrotrans criptasa 15 23C 6 Material y equipamiento adicional requerido y no suministrado Equipo de PCR a tiempo real Kit de extracci n de ARN Guantes desechables Pipetas calibradas Puntas de pipeta con filtro Congelador 20 C 7 Advertencias y precauciones Todos los componentes del kit deben mantenerse en fr o mientras se est n manipulando Despu s de a adir el ARN minimizar el tiempo necesario para iniciar el programa de amplificaci n Los tubos con la mezcla de amplificaci n no deben exponerse a la luz durante un periodo de tiempo prolongado
6. nfluenza A y B ND ND POS NO SE DETECTA ND ND ND NO VALORABLE Procedimiento HINI b Protocolo Stage 3 Repeat 45 times 3 Temperature Cycle T Advance to Next Stage Selecci n de fluor foros FAM detecta FluA H1N1 AIx532 detecta el control interno c Preparaci n de la reacci n Descongelar la AmpliMix y el Control Positivo ARN FluA H1N1 Tomar una al cuota de 22 uL de Amplimix a adir 0 3 uL de retrotranscriptasa tap n azul y a adir 10 uL del ARN de cada muestra o control a cada tubo Colocar los tubos en el equipo Seleccionar el protocolo HINI G Iniciar el programa de amplificaci n d Interpretaci n de los resultados Poda Alx532 Interpretaci n Std Res Std Res p POS Indiferente POSITIVO FluA H1N1 ND POS NO SE DETECTA ND ND NO VALORABLE e Ejemplo de resultado GRIP Fluorescence FAM FAM Ct Alx532 Alx532 Ct TXR Std Res TXR Ct ALXB47 Alx647 Ct Std Res Std Res GRIP NEG 0 00 POS 26 74 NEG 0 00 2 GRIP NEG 0 00 POS 27 16 NEG 0 00 A3 GRIP Flu e POS 29 28 POS 27 33 NEG 0 00 4 GRIP Flu NEG 0 00 POS 26 90 POS 27 64 Gr fica 1 Canal FAM FluA Resultado obtenido al amplificar dos controles negativos un control positivo FluA y un control positivo FluB Control negativo A1 en azul ausencia de se al Control negativo A2 en gris ausencia de se al Control positivo FluA A3 en naranja se observa se al
7. vos cada vez que se realice un an lisis Cada lote del kit RealCycler GRHI G ha sido testado seg n las especificaciones de la PCR a tiempo real utilizando el equipo SmartCycler Cepheiad
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