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ANEXOS

1. Figura 43 Tanque de 30 mL para soluci n de filtrado Tanques de 120 mL para soluci n de lavado y alimentaci n ADVERTENCIA gt Los tanques no est n dise ados para ser sometidos a altas presiones Son NO AUTOCLAVABLES Los recipientes pueden quebrarse exponiendo al operador a da os ocasionados por derrame de la soluci n contenida d Instalar el Cartucho de Membrana de Fibra Hueca Tapar una de las salidas de la l nea de permeado con un adaptador solido Luer Lok que se encuentra dentro del kit de accesorios para el sistema MidJet 66 ANEXOS Figura 44 Membrana de fibra hueca para el sistema de ultrafiltraci n tangencial Cortar un tramo de manguera de una longitud de 30 cm 12 pulgadas Colocar en ambos extremos un adaptador Luer Lok Acoplar uno de los extremos en la salida de la l nea de permeado del cartucho Conectar el otro extremo de la manguera a una de las entradas del tanque de 30 ml Figura 45 Salida de la membrana para la soluci n filtrada Cortar un tramo de manguera de una longitud de 40 cm 16 pulgadas Instalar la v lvula de contrapresi n o de retenci n en la tuber a Colocar en ambos extremos un adaptador Luer Lok Acoplar en la salida de la l nea de retenido uno de los extremos Conectar el otro extremo en una de las entradas del tanque de alimentaci n 67 ANEXOS Figura 46 V lvula de retenci n o contrapresi n en la l nea de retroalimentaci n TIP gt No sobre ajusta
2. c Evitar apretar demasiado los de alimentaci n al sistema Si se enciende conectores de las tuber as al la bomba con la v lvula cerrada ejercer l l momento de instalar el sistema una fuerte contrapresi n provocando fugas o derrames del fluido en las tuber as 5 La bomba de alimentaci n del sistema MidJet se calienta al permanecer mucho tiempo encendida No tocar la bomba e Plataforma para montaje 60 ANEXOS e Bomba perist ltica para utilizar dos diferentes tama os de tuber a e Kit de accesorios para el sistema incluyendo Seis tanques de 30 ml y doce tanques de 120 ml cada uno con tapa y tuber as de entrada al tanque 1 v lvula de pellizco 10 adaptadores para tuber as de 1 8 Luer Lok 10 adaptadores para tuber as de 3 32 Luer Lok 6 adaptadores tipo tapadera Luer Lok 1 5 m 3 pies de manguera de silic n tama o 14 1 5 m 3 pies de manguera de silic n tama o 16 e Manual de Instrucciones de uso Instalaci n Seguridad 2 Aplicaciones El sistema MidJet puede concentrar y diafiltrar soluciones biol gicas de manera r pida y precisa El sistema acepta membrana de cartucho de fibra hueca MidGee o MidGee Hoop Este tipo de membranas minimiza el efecto de polarizaci n debido a la velocidad de flujo cruzado generado por la bomba de alimentaci n Esto resulta en la recuperaci n efectiva y alta del producto que se desee obtener utilizando las condiciones de presi n y
3. la membrana impulsada por una bomba perist ltica 1 Procedimiento para el uso de una nueva membrana de fibra hueca Remoci n del glicerol de la membrana Las membranas de ultrafiltraci n requieren de un pre tratamiento con una soluci n de alcohol glicerol para evitar el secado de las membranas durante su transporte Es necesario remover todo el glicerol de la membrana antes de usarse Adem s el glicerol minimiza la entrada de aire hacia los poros formando una capa la cual reduce permeabilidad hasta que el aire haya sido completamente desplazado por el l quido Seguir los siguientes pasos para realizar una buena limpieza de la membrana antes de utilizarse 1 Utilizar agua limpia y tibia a una temperatura m xima de 50 C Si el agua esta fr a la limpieza de la membrana ser menos efectiva Agregar 100 ppm de NaOCl para ayudar a la remoci n de glicerol 2 Ajustar la presi n transmembrana del cartucho a 15 psig para membrana de tama o de poro de 100 kDa y 300 kDa para membranas de 500 30000 kDa ajustar la presi n a 10 psig y una presi n de 5 psig para tama o de poro m s grande 3 El flujo de retenido debe de ser aproximadamente 1 10 del flujo de filtrado o permeado 4 Desechar ambos el filtrado y retenido al drenaje 73 ANEXOS 5 Continuar limpiado la membrana hasta haber obtenido por lo menos 100 ml de filtrado Aseg rese de que todo el NaOCI haya sido removido por completo antes de introducir la soluci n
4. registrados mediante un detector de UV y un conduct metro con unidades de absorbancia AU y milisiemens mS respectivamente Ajustar la v lvula hasta lograr regular el flujo de lavado y el flujo de retroalimentaci n Los flujos deben de ser aproximadamente iguales para mantener el nivel del tanque de alimentaci n Dejar correr el sistema hasta que el tanque de dep sito de la soluci n filtrada se llene Apagar el sistema de ultrafiltraci n y presionar el bot n Detener en el software LPData Medir el volumen del filtrado y tomar una muestra Medir el volumen de la soluci n buffer y del tanque de alimentaci n Este ltimo debe de permanecer constante Las muestras de retenido deben de tomarse cada 10 minutos utilizando la v lvula de tres v as ubicada en la l nea de alimentaci n Repetir el procedimiento desde el paso 4 hasta obtener una conductividad cercana a la de la soluci n buffer Guardar la gr fica en el programa LPData View Si se requiere el software LPData View permite exportar los datos capturados durante la corrida a una base de datos en Excel Lavar la membrana recirculando agua alrededor de 15 minutos Si se va a guardar por m s de 2 semanas seguir las indicaciones de lavado Anexo B A cada muestra de retenido se hace pasar por el UV a 260 nm para medir densidad ptica de cidos nucleicos y a una longitud de 280 nm para medir prote nas Los datos registrados durante el experimento se ajustaron al modelo obteni
5. ANEXOS ANEXOS 59 ANEXOS ANEXO A Manual de Operaci n del Sistema de Ultrafiltraci n con Flujo Tangencial MidJet Benchtop System ADVERTENCIAS PRECAUCIONES 1 El sistema debe de estar desconectado 1 Para evitar da os al equipo planear para cualquier inspecci n o modificaci n cuidadosamente la instalaci n del de alg n elemento del sistema La sistema Ver las instrucciones de bomba puede encenderse instalaci n en la gu a accidentalmente provocando alg n da o eb 2 Las membranas de cartuchos de fibra en la persona o una liberaci n de presi n hueca son fuertes y seguras Un mal inesperada N manejo de ellas puede da ar la 2 Para prevenir una fuga inesperada y membrana Seguir la gu a de posiblemente da os f sicos usar prevenci n de da o a la membrana conectores en todas las tuber as l E a Si la membrana de fibra hueca se 3 Usar mangueras que no est n dise adas seca dif cilmente se puede volver a para bombas perist lticas provocar humedecer No permita que la fallas constantes en la tuber a membrana de ultrafiltraci n se exponiendo al operador de da os f sicos seque o derrames del fluido Utilizar en todo b Manipular los cartuchos momento mangueras especiales para ia cuidadosamente y no someter la usarse en bombas perist lticas membrana a presiones muy altas 4 Mantener la v lvula de pellizco abierta durante su uso cada vez que se va a iniciar la operaci n l E l
6. d rea de la ID mm de Fibras Nominal cm membrana cm MM ES 6 30 26 0 75 4 30 24 1 2 30 16 H22L 0 75 2 60 29 1 2 60 38 H24L 0 5 4 60 42 H42L 0 5 2 110 0 6 1 2 110 2 Tabla 6 Flujo Nominal de Alimentaci n y Ca da de Presi n en funci n de esfuerzo de corte Esfuerzo de corte Estilo MM H22L H24L H42L 200 2000 8000 16000 Nominal Flujo Flujo AP Flujo AP Flujo AP ID mm ml min AP psig ml min psig ml min psig ml min psig 0 5 12 5 0 7 25 1 5 50 2 9 100 5 5 0 75 20 0 5 40 1 80 2 160 4 1 25 0 5 50 0 75 100 l 200 4 5 0 75 10 1 20 2 40 4 80 8 1 25 0 8 50 1 5 100 3 200 9 0 5 3 5 1 5 17 3 33 5 66 10 0 5 4 2 5 8 5 al 17 10 33 19 1 25 1 5 1 5 3 100 6 200 16 El esfuerzo de corte y el flujo de alimentaci n son directamente proporcionales Los valores de esfuerzo de corte se basaron en viscosidad de 1 cp 75 ANEXOS 3 Almacenamiento de la Membrana Los cartuchos de ultrafiltraci n deben de humedecerse antes de ser guardados o almacenados Si se va a guardar un periodo de corto m ximo de dos semanas se puede dejar la membrana humedecida en agua Para almacenar un periodo m s largo llenar los cartuchos con alguna de las siguientes soluciones Agua con 5 10 ppm de cloro se debe monitorear cada semana 0 1 N de hidr xido de sodio 3 de formalina Soluci n de etanol 30 A O Asegurar que la membrana permanezca h meda para evitar que se seque 76 ANEXOS ANEXO C Programa
7. de la soluci n del tanque de alimentaci n y creara vac o permitiendo el fluido del tanque de la soluci n de lavado hacia el tanque de alimentaci n Seguir los siguientes pasos para una buena diafiltraci n 1 Llenar el tanque de dep sito de la soluci n de lavado Buffer y cerrarlo con la tapa correspondiente Asegurar que este bien cerrado 2 Conectar el tubo del tanque hacia una de las entradas del tanque de alimentaci n Conectarlo a la manguera m s larga de la tapadera del tanque de alimentaci n 3 Encender la bomba para circular la soluci n a trav s de la membrana Una vez que la soluci n se est permeando se crear vac o permitiendo que la soluci n de lavado fluya hacia el tanque de alimentaci n 5 4 Procedimiento durante el Experimento Una vez instalado el equipo de ultrafiltraci n con flujo tangencial MidJet Benchtop System acoplado al equipo BiologicBio Rad seguir el siguiente procedimiento durante cada corrida 70 A A Y O 10 11 12 13 14 15 ANEXOS Encender el equipo Biologic Bio Rad y el software LPData View Medir el volumen inicial de Lisado Clarificado Soluci n de Alimentaci n a la Membrana Medir el volumen inicial de soluci n Buffer Soluci n de Lavado Encender el equipo con la v lvula de retenci n abierta Iniciar el programa LPData View presionando el bot n Iniciar En este momento los datos de absorbancia y conductividad del flujo de permeado ser n
8. deseada 6 Realizar una ltima evaluaci n de limpieza utilizando agua desionizada Registrar los datos y condiciones del fluido presi n flujo temperatura para asegurar que la membrana este completamente limpia Un flujo muy lento de agua indica que a n existen contaminantes y que no se realiz una limpieza adecuada a la membrana 7 Acondicionar la membrana antes de empezar el experimento Introducir al sistema una soluci n buffer por 10 minutos para lograr humedecer y homogenizar todas las reas del sistema 2 Flujo de Alimentaci n al sistema La corriente de alimentaci n tiene un gran efecto sobre el flux del permeado Una gu a sobre el flujo de recirculaci n a trav s de la membrana se presenta en la Tabla 5 Los datos propuestos est n en funci n del tipo de membrana di metro interno y esfuerzo de corte La ca da de presi n a lo largo de la membrana est en funci n del flujo de alimentaci n y puede utilizarse para determinar el flujo de retroalimentaci n La suma del flujo de filtrado y flujo de recirculaci n provee el flujo de alimentaci n Par metros de operaci n para la membrana Presi n m xima de entrada 3 5 barg 50 psig Presi n t pica de entrada 0 7 1 4 barg 10 20 psig Temperatura m xima 60 C 140 F Rango de pH 2 13 74 ANEXOS Tabla5 Propiedades F sicas de membranas de fibra hueca de polisulfona para un sistema de flujo tangencial Midjet System Estilo Nominal N mero Longitu
9. do en el cap tulo Il 71 ANEXOS 5 5 Para apagar el Sistema seguir los siguientes pasos Apagar el traductor de presi n Apagar la bomba Desajustar la perilla ubicada encima del cabezal de la bomba A e M P Limpiar el sistema siguiendo las indicaciones de la gu a para membranas de cartucho de fibra hueca Anexo B 6 Mantenimiento del Sistema e Inspecci n Revisar y cambiar la tuber a de la bomba las veces que sean necesarias Verificar que todas las tuber as est n en las mejores condiciones ADVERTENCIA gt Usar mangueras que no est n dise adas para bombas perist lticas provocara fallas constantes en la tuber a exponiendo al operador de da os f sicos o derrames del fluido Utilizar en todo momento mangueras especiales para usarse en bombas perist lticas 7 Especificaciones del Sistema MidJet Benchtop Modelo MDG 3SP Dimensiones aproximadas 20 x 18 x 12 cm 8 x 7 x 5 pulgadas Peso 1 6 kg 3 5 Ibs Material Tuber a silicona Tanques de Deposito poliestireno Accesorios de Tuber a nylon y policarbonato 72 ANEXOS ANEXO B Instrucciones de Operaci n de Membranas de Fibra Hueca en el Sistema de Flujo Tangencial MidJet Benchtop Las membranas se utilizan para operar en flujo cruzado En comparaci n con las membranas de filtraci n normal filtraci n con flujo cruzado involucra una l nea de recirculaci n de la soluci n de alimentaci n a trav s de la superficie de
10. do momento mangueras especiales para usarse en bombas perist lticas 5 1 Procedimiento para iniciar el sistema 1 Encender el transductor de presi n en caso de tenerlo 2 Agregar la soluci n de alimentaci n al tanque de alimentaci n 120 ml y la soluci n de lavado en el tanque ubicado enseguida 3 Abrir 100 la v lvula de contrapresi n 4 Encender la bomba perist ltica presionando el bot n que est en la plataforma 5 Ajuste el flujo de alimentaci n utilizando la perilla ubicada encima del cabezal de la bomba 6 Ajuste la presi n utilizando la v lvula de contrapresi n ubicada en la l nea de retenido 69 ANEXOS 5 2 Par metros de Operaci n Velocidad de Flujo de recirculaci n t pico 50 140 ml min M xima presi n de entrada 30 psig 2 barg Presi n de entrada t pica para Microfiltraci n 3 10 psig 0 2 0 7 barg Presi n de entrada t pica para Ultrafiltraci n 10 20 psig 0 7 1 4 barg M xima temperatura de operaci n 60 C 140 F Rango de pH 2a13 ADVERTENCIA gt Mantener la v lvula de retenci n abierta cada vez que se va a iniciar la operaci n de alimentaci n al sistema Si se enciende la bomba con la v lvula cerrada ejercer una fuerte contrapresi n provocando fugas o derrames del fluido en las tuber as 5 3 Volumen de Diafiltrado Constante El sistema MIDJET es adecuado para alcanzar un volumen de diafiltrado constante ya que la bomba permitir la succi n
11. flujo ptimas 61 ANEXOS 3 Descripci n del Equipo y Accesorios del Sistema MidJet Benchtop a Plataforma para montaje La plataforma incluye un soporte para instalar la bomba perist ltica y el cartucho Tambi n tiene espacio para colocar dos recipientes de 120 ml y uno de 30 ml b Bomba Perist ltica El sistema incluye una bomba perist ltica de 24 volts DC de una sola velocidad Al ajustar el seguro que est ubicado encima del cabezal de la bomba aumenta la velocidad de flujo de lo contrario disminuye el flujo La bomba permite utilizar tuber a de tama o 14 y 16 c Tanques de Deposito El sistema MidJet incluye tanques de 30 ml y 120 ml con sus respectivas tapas adaptadas con las tuber as de entrada al tanque Los recipientes no pueden ser sometidos a alta presi n por lo que son NO autoclavables Dentro de los tanques se crea vacio permitiendo alimentar el fluido de un tanque a otro y al interior de la membrana Adem s permite que la soluci n retenida ingrese al tanque de alimentaci n por debajo del nivel del l quido evitando la formaci n de espumas Cada tanque indica el volumen con el cual se est trabajando El volumen exacto del sistema depender del tama o de membrana que se est utilizando d Accesorios para Tuber as El sistema incluye accesorios para tuber as mangueras y una v lvula de contrapresi n Los accesorios para tuber as permiten conectar la tuber a a los tanques de dep sito Las
12. mangueras de silicona son de 14 y 16 especiales para bombas perist lticas La velocidad de flujo m xima para la tuber a de 14 es de 50 ml min y la de tama o 16 permite un flujo m ximo de 140 ml min 62 ANEXOS La v lvula permite regular y controlar la contrapresi n a trav s de la membrana de cartucho de fibra hueca La v lvula debe instalarse en la l nea de retenido sta permite un ajuste preciso en la tuber a para controlar la presi n e Membranas de Fibra Hueca de Polisulfona Leer la gu a para el uso y manipulaci n de membranas de fibra hueca Anexo B 4 Instalaci n del Sistema MidJet System a Seleccionar un espacio adecuado para instalar el equipo Aseg rese que el lugar este cerca de un toma corriente b Instalar la bomba perist ltica Figura 35 Bomba perist ltica de 24 volts DC de una sola velocidad 1 Colocar la bomba encima de la plataforma para montaje y conectar el cable de corriente de la bomba Figura 36 Plataforma de montaje y bomba perist ltica 63 ANEXOS 2 Desajustar la perilla que est encima del cabezal de la bomba Girarla en cualquier direcci n Figura 37 Perilla para ajustar la velocidad de flujo de alimentaci n al sistema 3 Seleccionar el tama o de tuber a con el que se trabajar y cortar la manguera de 35 a 45 cm Colocar los adaptadores Luer Lok en ambos extremos de la manguera Figura 38 Kit de accesorios para tuber as mangue
13. r los conectores Luer Lok Tratar de mantener la longitud de las mangueras lo m s corto posible Utilizar mangueras de corta longitud minimiza el error del sistema e Consideraciones para la Diafiltraci n La conexi n entre el tanque de alimentaci n y el tanque de la soluci n de lavado debe de estar bien cerrada para permitir que se cree vac o De esta manera la soluci n de lavado fluir con facilidad hacia el tanque de alimentaci n Tapar los dos orificios restantes del tanque de lavado Si no se va a realizar una diafiltraci n remover la l nea de diafiltraci n del proceso f Conectar la corriente el ctrica Conectar el cable de corriente de la bomba a 110 volt 60 Hz o 220 volt 50 Hz Figura 47 Sistema de ultrafiltraci n con flujo tangencial MidJet Benchtop System 68 ANEXOS TIP gt Trabajar con agua hasta familiarizarse con la operaci n del sistema Esto permitir identificar si hay alguna fuga en alguna tuber a 5 Operaci n del Sistema MidJet Benchtop System Antes de utilizar el sistema de ultrafiltraci n aseg rese de haber le do la gu a para membranas de cartucho de fibra hueca Leer bien las especificaciones de la misma y procedimiento para lavar y almacenar la membrana Anexo B ADVERTENCIA gt Usar mangueras que no est n dise adas para bombas perist lticas provocar fallas constantes en la tuber a exponiendo al operador de da os f sicos o derrames del fluido Utilizar en to
14. ras y una v lvula de contrapresi n 3 Instalar la v lvula de tres v as en la tuber a de alimentaci n a la membrana Figura 39 V lvula de tres v as para la toma de muestras de la soluci n retenida 64 ANEXOS 4 Colocar la manguera en el cabezal de la bomba Cubrir la manguera y girar la perilla hasta que quede ajustada Figura 40 Ajuste de la manguera de alimentaci n en la bomba perist ltica c Posici n de los tanques de dep sito Tomar un tanque de 120 mL con su respectiva tapadera que tiene tres entradas Colocar el tanque en el espacio derecho que est frente a la bomba Este tanque ser el tanque que contendr la soluci n de alimentaci n Figura 41 Tanque de 120 mL para la soluci n de alimentaci n Si se planea realizar una diafiltraci n Tomar otro tanque de 120 mL con su respectiva tapadera que tiene tres entradas Colocar el recipiente en el espacio que est en el centro frente a la bomba Lado izquierdo del tanque de alimentaci n En este tanque se colocar la soluci n de lavado buffer que ser alimentada constantemente al tanque de alimentaci n 65 ANEXOS Figura 42 Tanque de 120 mL para la soluci n de lavado Buffer TE y soluci n de alimentaci n Tomar un recipiente de 30 mL con su respectiva tapadera que tiene tres entradas Colocarlo en el espacio izquierdo del tanque de lavado Este ser el tanque de recolecci n de la soluci n permeada o filtrada
15. utilizado para Regresi n no Lineal function Problema clear clc format short q format compact xybata 2 7 0 24692 SA o Gedon aa 39 6 0 25306 44 55 0 28334 DAS e gt 90201 64 35 01 559804 AA 000325 84 15 0 60801 100 98 0 62799 So 0 De 10 4339 183 15 0 78583 217 8 O81772 23209 s84225 20 TL 0 8790415 X xyData 1 m size X 1 SDetermina el numero de puntos Y xyData 2 5 problema Regresion no lineal var dep iqma var indep V_D parm 1 90 S valores iniciales de los parametros npar size parm 2 Determina el nuemro de parametros options optimset MaxFunEvals 1000 Cambia los valores de la funcion MaxFunEvals Beta fminsearch sigma parm options X Y 3 Encuentra los valores optimos usando la fincion fminsearch f Ycalc sigma Beta X Y Calcula los valores de Y Ycal dispil Results problema Reg for 1 1 npar Res Res 1 Beta 1 end disp Valor de los parametros Epa disp Res plot X Ycalc r X Y b grafica los valores experimentales de y y los valores calculados Xlabel var indepl ylabel var dep function f Ycale sigma parm XyY Define la funcion de Sigma sm parm 1 k parm 2 O c parm 3 for i 1 size X 1 Yealc 1 p1 sm X il k EU end resid 1 Y Ycalc f resid resid 77

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