Ref. 4102 Ref. 4122 Ref. 4105 Ref. 4125
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1.2. HYDRAGEL 7 HR viole Acide Acid Violet Ref 4102 HYDRAGEL 15 HR Acide Acid Violet Ref 4122 HYDRAGEL 7 HR Amnidoschwarz Amidoblack Ref 4105 HYDRAGEL 15 HR Amidoschwarz Amidoblack Ref 4125 2009 05 HYDRAGEL 7 amp 15 HR 2009 05 ESPECIFICACIONES DE USO Los kits HYDRAGEL 7 HR e HYDRAGEL 15 HR HR Alta Resoluci n est n dise ados para multifraccionamiento de las prote nas s ricas humanas o de las prote nas de otros fluidos biol gicos orina o l quido cefalorraqu deo LCR mediante electroforesis en geles de agarosa tamponados alcalinamente pH 8 6 Se utilizan junto con el instrumento semiautom tico HYDRASYS Las prote nas separadas se ti en con una soluci n de violeta cido El exceso de tinci n se elimina con una soluci n cida Los geles te idos y secados pueden ser interpretados visualmente para la detecci n de anormalidades en el patr n electrofor tico Cada gel de agarosa est destinado para procesar 7 muestras en el kit HYDRAGEL 7 HR 15 muestras en el kit HYDRAGEL 15 HR Para Uso Diagn stico In Vitro PRINCIPIO DEL TEST La electroforesis de prote nas es una t cnica bien establecida que se usa rutinariamente en los laboratorios cl nicos para la investigaci n de anormalidades proteicas en suero y otros fluidos biol gicos Est basada en el principio de la electroforesis de zona realizada en un medio de soporte adecuado La agarosa ha sido desarrollada para
3. PROTE NAS S RICAS La interpretaci n se realiza comparando los electroforetogramas de la muestra cl nica y un control normal En caso de que exista alguna fracci n aumentada disminuida o adicional normalmente es necesario confirmar los cambios observados mediante otras pruebas tales como la cuantificaci n de prote nas espec ficas inmunoelectroforesis o inmunofijaci n Entre las numeros simas prote nas plasm ticas s lo alrededor de quince existen en cantidad suficiente para ser visualizadas en los geles de Alta Resoluci n HR La importancia del gel HYDRAGEL 7 15 HR est en su sensibilidad en la zona cat dica que permite la detecci n de bandas monoclonales u oligoclonales d biles La interpretaci n es esencialmente cualitativa PROTE NAS DEL L QUIDO CEFALORRAQU DEO 423 Cualquier banda adicional detectada en la fracci n gamma del LCR sin ninguna fracci n correspondiente en el suero debe ser confirmada mediante un procedimiento de inmunofijaci n HYDRAGEL 3 6 CSF SEBIA o kits de inmunofijaci n SEBIA HYDRAGEL 1 2 4 9 IF SEBIA con el fin de caracterizar la s ntesis intratecal La confirmaci n inmunol gica es necesaria porque es posible detectar en la fracci n gamma bandas que no corresponden a inmunoglobulinas fracci n tau anhidrasa carb nica pos gamma o PCR por ejemplo NOTA La interpretaci n es estrictamente comparativa Es por lo tanto absolutamente necesario Analizar los fluidos biol gicos LC
4. Fracci n gamma que esencialmente contiene Ig y a veces lg A e lg M Muchos estudios han mostrado un incremento de inmunoglobulinas procedentes de una s ntesis dentro del Sistema Nervioso Central La estimulaci n antig nica de esta producci n de 19 G no ha sido explicada todav a Se han propuesto hip tesis que hablan de infecciones v ricas y reacciones autoinmunes Junto a la Esclerosis M ltiple un aumento de 19 G puede ser detectado durante la enfermedad desmielinizante infantil panencefalitis esclerosante subaguda y tambi n durante otros des rdenes inflamatorios e infecciosos La esclerosis m ltiple se detecta mediante m ltiples bandas monoclonales que revelan un aspecto oligoclonal de las gammaglobulinas Estas anormalidades aparecen muy pronto durante el curso de la enfermedad La intensidad de las diferentes bandas puede variar desde muy d bil a muy fuerte Este aspecto oligoclonal ha sido encontrado tambi n durante otros des rdenes del sistema nervioso central enfermedades infecciosas inflamatorias o no Se han detectado m ltiples bandas durante la panencefalitis esclerosante neurosifilis encefalitis v rica meningoencefalitis y meningitis bacteriana Tambi n se han encontrado pero raramente en la neuropat a perif rica tumores hidrocefalia enfermedades degenerativas y des rdenes vasculares Todos estos casos no deben ser considerados como falsos positivos sino como una indicaci n de una actividad inmunol gica a
5. III 82 Microglobulina A Esterasa del inhibidor C1 T y Globulinas G A M D E 48 HYDRAGEL 7 amp 15 HR 2009 05 BIBLIOGRAPHIE BIBLIOGRAPHY Cameron JS 1987 The nephrotic syndrome Am J Kidney Dis 10 157 171 Chopin N 1991 tude de la prot inurie Inf Tech Biol 1 23 28 Cohen R Francois B Sabot JF Bernard P Picq JP Adeleine P 1985 tude comparative de l immuno lectrophor se urinaire et de quatre index de s lectivit glom rulaire au cours des glom rulopathies chroniques Path Biol 33 23 26 Davenport RD Keren DF 1988 Oligoclonal bands in cerebrospinal fluids significance of corresponding bands in serum for diagnosis of multiple sclerosis Clin Chem 34 764 765 Joachim GR Cameron JS Chwartz M Belker EL 1964 Selectivity of protein excretion in patients with the nephrotic syndrome J Clin Invest 43 2332 2346 Keren DF High resolution electrophoresis and immunofixation techniques and interpretation Butterworth Heinemann Woburn MA USA 1994 397 pp Laurell DB 1972 Comparison and variation of the gel electrophoresis fractions of plasma cerebrospinal fluid and urine Scand J Clin Lab Investigation 29 71 82 Le Carrer D 1990 Prot inuries Mise au point sur leur exploration biologique en 1990 L Eurobiologiste 190 395 405 Le Carrer D Chopin N 1994 Profil prot ique urinaire Proposition d un protocole d exploration biologique des prot inuries Rev
6. ejemplo se vuelve turbia debido a contaminaci n microbiana Para evitar la proliferaci n microbiana en la soluci n decolorante diluida que se vaya a almacenar durante m s de una semana a ada 5 ul dL de ProClin 300 El decolorante diluido al que se ha a adido ProClin es estable en un contenedor cerrado a temperatura ambiente o en la nevera hasta la fecha de caducidad indicada en el kit o en la etiqueta del vial de decolorante 3 SOLUCI N DE LAVADO HYDRASYS Preparaci n Cada vial de la Soluci n de Lavado HYDRASYS stock SEBIA PN 4541 10 viales de 80 ml se diluye hasta 5 litros con agua destilada o desionizada Despu s de la diluci n la soluci n de lavado de trabajo contiene tamp n alcalino pH 8 8 0 3 azida s dica ATENCI N La soluci n de lavado stock contiene azida s dica 0 625 No ingerir Si se ingiere consultar al m dico inmediatamente La azida s dica puede dar lugar a la formaci n de compuestos explosivos o t xicos al entrar en contacto con cidos plomo o cobre Lavar siempre con gran cantidad de agua al desechar Uso Sirve para limpiar el Compartimento de Tinci n del HYDRASYS Utilizarla peri dicamente por ejemplo si el instrumento se usa diariamente lavar el compartimento de tinci n semanalmente El modo de empleo se encuentra en la hoja de instrucciones Almacenamiento estabilidad y se ales de deterioro Almacenar las soluciones de lavado stock y de trabajo en contenedores cerrados a temperatu
7. entre estas dos pruebas se ha basado en el n mero de bandas y su posici n Los resultados de los dos procedimientos concordaron en las 116 muestras y eran consecuentes con el diagn stico cl nico An lisis semicuantitativo En las aplicaciones semicuantitativas los resultados obtenidos con los geles HYDRAGEL 7 15 HR indican una muy buena reproducibilidad intra e interserial en todos los aspectos probados y no hubieron diferencias detectables visualmente entre las r plicas el CV medio era 4 0 Los procedimientos HYDRAGEL 7 15 HR con las opciones de tinci n con violeta cido y negro amido fueron comparados con otro procedimiento comercial de geles de alta resoluci n separaciones de alta resoluci n tradicionales de las prote nas s ricas y tinci n con violeta cido Para una mejor comparaci n todas las separaciones electrofor ticas fueron le das con un filtro amarillo como separaciones de 5 fracciones Se analizaron muestras de suero cl nicas n 56 con cada procedimiento y se compararon las concentraciones relativas de cada fracci n usando un an lisis de regresi n lineal siendo 0 973 el coeficiente de correlaci n medio en todas las fracciones proteicas con ambas soluciones de tinci n HYDRAGEL 15 HR violeta cido HYDRAGEL 15 HR negro amido FRACCI N Coeficiente Pendiente Intersecci n en y Gama Coeficiente Pendiente Intersecci n en y Gama de correlaci n HYDRAG
8. evitar que se deshidrate no deje que el papel de filtro contacte con el gel durante mucho tiempo Dispensar 120 ul de agua destilada o desionizada para el HYDRAGEL 7 HR o 200 pl para el HYDRAGEL 15 HR en el tercio inferior del marco serigrafiado en la Placa de Control de Temperatura del m dulo de migraci n Colocar el gel con el lado de agarosa hacia arriba con su borde inferior en contacto con el tope inferior del marco serigrafiado Fig 3 Aplicar el gel en la superficie haci ndolo contactar con el agua Fig 3 Asegurarse de que no se formen burbujas de aire que el agua est extendida bajo toda la superficie del gel y que ste est alineado con el marco serigrafiado 7 Devolver ambos soportes a su posici n original En esta posici n las esponjas tamponadas no tocan el gel NO FORZAR LOS SOPORTES HACIA ABAJO 8 Sacar el aplicador de la c mara h meda Asirlo por el pl stico protector Romper el pl stico protector de los dientes del peine Colocar el aplicador en la posici n No 5 del soporte IMPORTANTE Los n meros impresos en el aplicador deben quedar de cara al usuario Fig 4 Cerrar la tapa del m dulo de migraci n 10 Iniciar el procedimiento inmediatamente presionando la tecla START flecha verde situada en el lado izquierdo del teclado IMPORTANTE Asegurarse de que la toma de aire del lado derecho del instrumento no est bloqueada MIGRACI N DESCRIPCI N DE LAS ETAPAS AUTOM TICAS Los dos sopor
9. gel ya seco NOTA Si se observan manchas azules residuales en los geles despu s de la coloraci n decoloraci n una etapa de lavado suplementario con el programa LAV ISOENZ GEL permite eliminarlas o atenuarlas seg n su intensidad antes de su lectura en densit metro o esc ner 2 S es necesario limpiar el reverso del gel el lado de soporte de pl stico con un papel suave y h medo RESULTADOS Control de calidad Se aconseja incluir una muestra normal o un suero control Suero Control de Prote nas SEBIA PN 4785 en cada an lisis de muestras Valores an lisis cuantitativo La lectura densitom trica a 570 nm de las separaciones electrofor ticas te idas proporciona las concentraciones relativas porcentajes de las fracciones de prote na individuales Los valores normales media 2 SD de las fracciones electrofor ticas principales de las prote nas s ricas en los geles HYDRAGEL 7 15 HR han sido establecidos a partir de una poblaci n sana integrada por 225 adultos hombres y mujeres 45 HYDRAGEL 7 amp 15 HR 2009 05 FRACCI N HYRYS GELSCAN PHORESIS Alb mina 56 2 69 0 57 5 67 9 Alfa 1 globulinas 1 2 3 2 1 0 3 8 Alfa 2 globulinas 7 8 13 4 7 2 12 8 Beta globulinas 7 4 13 4 7 6 13 6 Gamma globulinas 9 8 18 6 10 3 18 3 Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de normalidad Interpretaci n La interpretaci n es cualitativa
10. mara de almacenaje h meda con el peine hacia arriba asirlo por el pl stico protector del peine Dejar que las muestras difundan en los dientes del aplicador durante 5 minutos despu s de la ltima aplicaci n de muestra Para un uso posterior hasta 8 horas mantener toda la c mara refrigerada Ver la hoja de instrucciones de la c mara h meda para m s detalles 3 Abrir la tapa del M dulo de Migraci n y elevar los soportes de los electrodos y el aplicador ATENCION Nunca cerra la tapa mientras los soportes est n elevados 4 Seleccionar el programa de migraci n en el men del instrumento lado izquierdo del teclado An lisis de suero 7 15 HR1 para HYDRAGEL 7 HR y HYDRAGEL 15 HR An lisis de LCR o de LCR suero 7 15 HR2 para HYDRAGEL 7 HR y HYDRAGEL 15 HR An lisis de orina 1 Orinas no concentradas 7 15 HR3 para HYDRAGEL 7 HR y HYDRAGEL 15 HR 2 Orinas concentradas 7 15 HR2 para HYDRAGEL 7 HR y HYDRAGEL 15 HR 5 Extraer las esponjas tamponadas de su envoltorio asirlas por los extremos de pl stico Engarzar los extremos de pl stico agujereados con las puntas met licas del soporte los extremos de pl stico deben quedar encarados al soporte Fig 2 Abi HYDRAGEL 7 amp 15 HR 2009 05 6 Abrir el contenedor del HYDRAGEL Extienda un papel de filtro fino de manera r pida y uniforme sobre la superficie del gel para absorber el exceso de l quido Retire el papel inmediatamente ADVERTENCIA Para
11. obtener un medio de soporte vers til y efectivo Aunque la mayor a de laboratorios cl nicos est n satisfechos con el tradicional patr n de cinco bandas de las prote nas s ricas las t cnicas de alta resoluci n pueden proporcionar informaci n adicional para el diagn stico En los geles HYDRAGEL 7 15 HR las prote nas s ricas las urinarias o las del LCR se separan en unas diez fracciones Cada fracci n contiene una o m s prote nas La composici n del gel y la elecci n del colorante permiten una resoluci n excelente y una elevada sensibilidad particularmente en la zona gamma El HYDRAGEL 7 15 HR es un ensayo cualitativo REACTIVOS Y MATERIALES SUMINISTRADOS EN LOS KITS HYDRAGEL 15 HR E HYDRAGEL 7 HR ART CULO PN 4102 PN 4122 PN 4105 PN 4105 Geles de Agarosa listos para su uso 10 geles 10 geles 10 geles 10 geles 10 bolsas de 2 10 bolsas de 2 10 bolsas de 2 10 bolsas de 2 Diluyente del colorante soluci n stock 1 vial 60 ml 1 vial 60 ml Colorante Negro Amido soluci n stock 1 vial 20 ml 1 vial 20 ml Esponjas Tamponadas listas para su uso Colorante Violeta Acido soluci n stock 1 vial 75 ml 1 vial 75 ml Aplicadores listos para su uso 1 caja de 10 7 dientes 1 caja de 10 15 dientes 1 caja de 10 7 dientes 1 caja de 10 15 dientes Papeles de Filtro 1 bolsa de 10 1 bolsa de 10 1 bolsa de 10 1 bolsa de 10 PARA OBTENER RESULTADOS PTIMOS Los elemen
12. sueros podr an presentar problemas de aplicaci n debido a la difusi n dificultada a trav s de los dientes del aplicador de muestra En estos casos a adir 25 ul de Fluidil a 75 pl de suero y agitar en el v rtex durante 15 segundos Continuar entonces con el procedimiento habitual LCR o la pareja suero LCR Aplicar las muestras con una concentraci n total de prote nas de unos 10 g l IMPORTANTE El suero y el LCR deben presentar id ntica concentraci n total de prote nas Orinas El an lisis se lleva a cabo con orinas sin concentrar Si se necesita una elevada sensibilidad se puede aplicar la orina despu s de haberla concentrado Orinas no concentradas Aplicar la orina tal cual Si la concentraci n de prote nas es muy elevada es posible diluir la orina con salina para obtener una concentraci n de prote nas de unos 2 g l lo que proporciona un patr n m s claro Orinas concentradas El an lisis se realiza con muestras previamente concentradas hasta una concentraci n total de prote nas de unos 5 gll IMPORTANTE Algunas orinas contienen una elevada concentraci n de sales Esto puede provocar la deformaci n del gel durante la migraci n y por consiguiente deformaci n de los perfiles de migraci n Si tal deformaci n hace la interpretaci n inexacta la orina deber a dializarse para eliminar las sales NOTA En caso de orinas turbias concentradas o no se recomienda eliminar las part culas centrifugando las muestras dur
13. 85 NES 43 HYDRAGEL 7 amp 15 HR 2009 05 MUESTRAS PARA AN LISIS En el HYDRAGEL 7 15 HR se pueden analizar muestras de suero orina o l quido cefalorraqu deo LCR Las prote nas s ricas tambi n pueden cuantificarse despu s de la tinci n con violeta cido o negro amido Extracci n y almacenamiento de muestras Se recomienda analizar muestras frescas Deben obtenerse conforme a los procedimientos establecidos de uso en el laboratorio cl nico Si es necesario almacenar las muestras entre 2 y 8 C hasta una semana Las muestras congeladas son estables durante un mes por lo menos Las muestras de suero descongeladas pueden dar lugar a leves marcas de aplicaci n debidas a la desnaturalizaci n de prote nas o lipoprote nas Congelar los sueros y LCR con azida s dica 0 2 g l mejora la estabilidad del almacenaje Congelar las orinas con HEPES 0 1 M pH 6 75 y azida s dica 0 2 g l mejora la estabilidad del almacenaje Las muestras descongeladas pueden dar lugar a leves marcas de aplicaci n debidas a la desnaturalizaci n de prote nas IMPORTANTE No utilizar cido b rico como conservante Preparaci n de las muestras 1 Preparaci n de las muestras an lisis cualitativo Suero Aplicar muestras de suero sin diluir Bajo almacenaje entre 2 y 8 o despu s de la congelaci n algunos sueros particularmente aquellos que contengan crioglobulina o criogel pueden volverse viscosos o desarrollar turbidez Tales
14. EL 15 HR de correlaci n HYDRAGEL 15 HR Alb mina 0 981 0 98 1 89 36 7 66 1 0 985 0 96 2 35 36 1 67 4 Alfa 1 0 976 0 99 0 11 15 75 0 982 0 97 0 03 1 3 7 1 Alfa 2 0 982 0 98 0 14 6 8 24 5 0 978 0 96 0 31 5 7 24 2 Beta 0 956 0 91 0 90 5 8 19 8 0 918 0 95 0 41 5 4 20 0 Gamma 0 991 0 99 0 16 8 3 40 0 0 990 0 94 1 05 7 2 37 5 Sensibilidad La sensibilidad se determin a partir de la m xima diluci n seriada que proporcionaba una banda distinguible En los programas HR1 y la sensibilidad de detecci n fue de 100 300 mg l para una prote na monoclonal G Kappa En el programa la sensibilidad de detecci n fue de 15 20 mg l alb mina y prote na de Bence Jones Se observaron aproximadamente las mismas sensibilidades al utilizar negro amido y violeta cido como colorantes NOTA El l mite de detecci n puede variar en funci n de la posici n de la banda monoclonal y el fondo policlonal de la fracci n de las gammaglobulinas Linealidad Los m todos fueron lineales hasta al menos 58 g l de alb mina y 39 g l de 19 para ambos procedimientos de tinci n 47 HYDRAGEL 7 amp 15 HR 2009 05 PATRON DE MIGRACI N C Fanm gt a C orsoni D 1 Antitripsina ai Antiquimotripsina Lipoprote nas Haptoglobina Globulina Gc Ceruloplasmina a2 Macroglobulina Lipoproteinas gt Transferrina Hemopexina Complemento C3 Antithrombina
15. R suero obtenidos al mismo tiempo sin ning n tratamiento que pudiese modificar la concentraci n de lg G en el suero Aplicar cantidades id nticas de prote nas o de inmunoglobulinas en las 2 muestras Por lo tanto es necesario realizar una cuantificaci n previa con una buena precisi n y reactivos apropiados El l quido cefalorraqu deo LCR es un l quido biol gico con una concentraci n de prote nas baja La cantidad de prote na en un LCR normal es de unos 0 30 g l 0 15 La mayor a de prote nas del LCR tiene su origen en el suero desde donde son filtradas y transportadas a trav s de la barrera hematoencef lica Para analizarlo los geles HYDRAGEL 7 15 HR el LCR debe estar concentrado hasta unos 10 g l Un patr n de LCR normal muestra el siguiente orden de fracciones Prealb mina o transtiretina la fracci n m s r pida Alb mina la fracci n predominante que representa alrededor del 75 del total de prote nas Fracci n alfa 1 integrada principalmente por la alfa 1 antitripsina Alfa lipoprote nas Fracci n alfa 2 que contiene ante todo prote nas de alto peso molecular por consiguiente es muy d bil ya que las prote nas no pueden atravesar la barrera hematoencef lica Fracci n beta que contiene transferrina Fracci n beta 2 que contiene ante todo transferrina espec fica de LCR la fracci n tau una forma de transferrina que carece de un carbohidrato cido si lico
16. ante 10 minutos a 3000 rpm o por filtraci n en un filtro de 0 45 um para obtener una buena difusi n en los aplicadores 2 Preparaci n de las muestras an lisis cuantitativo Tinci n con negro amido Utilizar muestras de suero sin diluir Tinci n con violeta cido Utilizar muestras de suero previamente diluidas 4 veces 1 vol 3 vol con salina Seguir entonces con el procedimiento habitual Muestras a descartar No usar muestras de suero hemolisadas La hem lisis incrementa las fracciones alfa 2 y beta Evitar usar muestras de plasma El fibrin geno da lugar a una banda cerca del punto de aplicaci n que puede ser confundida con una inmunoglobulina monoclonal PROCEDIMIENTO El sistema HYDRASYS es un instrumento semiautom tico multiparam trico Las etapas autom ticas incluyen el procesado de los geles de agarosa HYDRAGEL en la siguiente secuencia aplicaci n de la muestra migraci n electrofor tica secado tinci n decoloraci n y secado final Las etapas manuales incluyen el manejo de las muestras y los geles y la puesta en marcha del instrumento para el funcionamiento LEER CUIDADOSAMENTE EL MANUAL DE INSTRUCCIONES DEL HYDRASYS 1 PUESTA EN MARCHA DE LA MIGRACI N 1 Encender el HYDRASYS 2 Colocar un aplicador en una superficie plana con los n meros de los pocillos en la cara superior Fig 1 Aplicar 10 ul de muestra en cada pocillo Cargar el aplicador en el plazo de 2 minutos Colocar el aplicador en la c
17. cuado 2 ESPONJAS TAMPONADAS Preparaci n Las tiras de esponja tamponadas est n listas para su uso Cada una contiene tamp n tris barbital pH 8 7 0 2 azida s dica aditivos inocuos a las concentraciones utilizadas necesarios para un funcionamiento ptimo ATENCI N El tamp n de las esponjas contiene barbital 0 55 y azida s dica 0 30 No ingerir Si se ingiere consultar al m dico inmediatamente Al desechar evitar el contacto con cidos plomo o cobre ya que se conoce su tendencia a formar compuestos explosivos o t xicos en contacto con la azida s dica Uso Las esponjas tamponadas funcionan como un reservorio del tamp n de electroforesis y aseguran el contacto entre el gel y los electrodos 41 INSTRUCCIONES SEBIA Espa ol HYDRAGEL 7 amp 15 HR 2009 05 Almacenamiento estabilidad y se ales de deterioro Las esponjas tamponadas pueden conservarse a temperatura ambiente o en la nevera Deben ser conservadas horizontalmente en su bolsa protectora la flecha situada en la parte frontal del kit debe apuntar hacia arriba Son estables hasta la fecha de caducidad indicada en el kit o en su bolsa protectora NO LAS CONGELE Deseche las esponjas tamponadas si la bolsa est abierta o si las esponjas est n secas 3 DILUYENTE DEL COLORANTE PN 4105 y 4125 Preparaci n El diluyente del colorante concentrado debe ser usado como se ha descrito en el p rrafo COLORANTE NEGRO AMIDO Contiene una soluci n ci
18. da Uso Para la preparaci n del colorante negro amido Conservaci n estabilidad y se ales de deterioro El diluyente del colorante concentrado puede conservarse a temperatura ambiente o en la nevera Es estable hasta la fecha de caducidad indicada en el kit o en la etiqueta del vial de diluyente NO LO CONGELE No le a ada azida s dica 4 COLORANTE NEGRO AMIDO PN 4105 y 4125 Preparaci n El colorante negro amido concentrado es una soluci n viscosa que puede gelificarse lo que no afecta de ning n modo a la calidad de la soluci n final y su capacidad de coloraci n Para obtener una perfecta reconstituci n del colorante siempre hay que prepararlo como se indica a continuaci n A ada unos 15 mL de diluyente del colorante en el vial de negro amido concentrado Cierre el vial con cuidado Agite el vial intensamente durante un m nimo de 5 segundos Vierta la soluci n obtenida en el recipiente de preparaci n de la soluci n de coloraci n Repita esta operaci n dos veces o tres veces si es necesario Vierta el resto de diluyente en el recipiente de preparaci n de la soluci n de coloraci n Complete hasta 300 mL con agua destilada o desionizada Agite esta soluci n de 5 a 10 minutos El colorante est listo para usar NOTA Una reconstituci n incompleta del colorante puede implicar una mala coloraci n de la fracci n alb mina disminuci n de su porcentaje o aparici n de un agujero blanco en el centro de la f
19. ensibilidad no puede darse ninguna garant a respecto a la detecci n de la totalidad de todos los componente monoclonales Resoluci n de problemas Avisar al Servicio de Atenci n T cnica del distribuidor cuando el test no funcione pese a haber seguido cuidadosamente las instrucciones para la preparaci n y almacenaje de los materiales y para el procedimiento a seguir Las hojas de seguridad de los diferentes reactivos del kit as como las informaciones relativas a la eliminaci n de los desechos est n disponibles en el Servicio de Asistencia T cnica de su distribuidor CARACTER STICAS T CNICAS Se usaron materiales preparaci n de las muestras y procedimientos est ndar Todas las separaciones electrofor ticas fueron evaluadas visualmente An lisis cualitativo Los resultados obtenidos con los geles HYDRAGEL 7 15 HR indican una muy buena reproducibilidad intra e interserial en todos los aspectos probados y no hubieron diferencias detectables visualmente entre las r plicas Se analizaron muestras patol gicas y normales de suero parejas LCR suero y orina procedentes de 116 pacientes en geles HYDRAGEL 7 15 HR y en un sistema comercial comparable de geles de alta resoluci n Las muestras se prepararon como se recomienda en los procedimientos respectivos Los parecidos diferencias de los patrones electrofor ticos y la presencia de bandas monoclonales u oligoclonales fueron los aspectos comparados La comparaci n visual o cualitativa
20. ivos inocuos a las concentraciones usadas necesarios para un funcionamiento ptimo ATENCI N Es perjudicial si se ingiere Uso Para la tinci n de geles con separaciones electrofor ticas de prote nas IMPORTANTE El colorante est destinado para la coloraci n de 10 geles Cambie el colorante despu s de su utilizaci n en 10 coloraciones Almacenamiento estabilidad y se ales de deterioro Almacenar las soluciones stock y de trabajo a temperatura ambiente o refrigeradas en contenedores cerrados para evitar la evaporaci n La soluci n stock del colorante es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la caja del kit o en las etiquetas del vial La soluci n de trabajo del colorante es estable durante 6 meses 6 APLICADORES Uso Aplicadores precortados de un solo uso para la aplicaci n de la muestra Almacenamiento Almacenar los aplicadores en un lugar seco a temperatura ambiente o refrigerados D NE EN A 7 PAPELES DE FILTRO Uso Papeles de filtro finos absorbentes precortados de un solo uso para secar el exceso de humedad de la superficie del gel antes de la aplicaci n de la muestra Conservaci n Les papeles de filtro finos deben conservarse en un lugar seco a temperatura ambiente o en la nevera 42 HYDRAGEL 7 amp 15 HR 2009 05 REACTIVOS NECESARIOS NO SUMINISTRADOS 1 SALINA Preparaci n Preparar una soluci n de NaCl 0 15 M 9 g l en agua destilada o desionizada Uso Para diluir las muestra
21. odos y la placa de control de temperatura con un pa uelo de papel suave humedecido Abrir el Soporte del Gel Colocar el gel secado con el lado de agarosa hacia arriba en los orificios de las dos varillas y cerrar el soporte Asegurase de que el gel est colocado correctamente en el soporte Fig 5 Colocar el soporte del gel en el M dulo de Procesado Tinci n IMPORTANTE Antes de iniciar el programa de procesado tinci n comprobar lo siguiente el contenedor de colorante contiene 300 ml de colorante el contenedor de decolorante contiene como m nimo 1 litro de soluci n decolorante el contenedor de deshechos est vac o Para conocer en qu posiciones conectar los reactivos consultar la informaci n que aparece en la pantalla del instrumento seleccionar la tecla VER CANALES IMPORTANTE No olvidar bloquear los canales no utilizados 8 Seleccionar el programa de tinci n HR ACID VIOLET HR AMIDO el men del instrumento e iniciar el proceso presionando la tecla START flecha verde situada en el lado derecho del teclado A BE 5 Durante la tinci n la decoloraci n el lavado y el secado del gel el compartimento permanece bloqueado Despu s del enfriamiento de la cubeta una se al sonora bip suena y el sistema se desbloquea la ventilaci n se mantiene hasta la recuperaci n del porta films FINALIZACI N DEL PROCESADO DEL GEL 1 Retirar el soporte del gel del compartimento abrirlo y extraer el
22. r dificultades de integraci n e interpretaci n los geles HYDRAGEL tienen una composici n particular que coloca generalmente las HDL en la zona alfa 2 y las LDL en la zona beta Sin embargo esta migraci n es muy sensible a los siguientes factores tiempo de almacenamiento de la muestra concentraci n de lipoprote nas tratamientos con medicamentos por ejemplo con heparina estado de hidrataci n del gel conservaci n del gel variaciones incluso muy leves de las materias primas Por estas razones puede observarse un ligero desplazamiento an dico de estas lipoprote nas que se vuelven m s aparentes o que implica un ensanchamiento de la fracci n incluso un desdoblamiento de la zona alfa 2 y o de la zona beta 1 Los porcentajes de las fracciones alfa 2 y beta permanecen inalterados a pesar del leve desdoblamiento debido a la variaci n de la movilidad electrofor tica 2 La forma caracter stica de la fracci n de beta lipoproteina con una focalizaci n importante y una forma irregular no puede en ning n caso provocar un error de interpretaci n s lo cambia su aspecto Las muestras de suero descongeladas pueden dar lugar a leves marcas de aplicaci n debidas a la desnaturalizaci n de prote nas o lipoprote nas No usar muestras de suero hemolisadas Evitar usar muestras de plasma Teniendo en cuenta los principios anal ticos de las t cnicas actuales principios de la electroforesis de zona resoluci n y s
23. ra ambiente o refrigerados Son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta del vial Desechar la soluci n de lavado de trabajo si cambia su aspecto por ejemplo se vuelve turbia debido a contaminaci n microbiana 4 FLUIDIL Preparaci n El Fluidil SEBIA PN 4587 5 ml est listo para su uso Uso Para diluir muestras viscosas o turbias por ejemplo sueros que contengan crioglobulinas o criogeles Almacenamiento estabilidad y se ales de deterioro Almacenar a temperatura ambiente o refrigeradas Es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta del vial El Fluidil debe estar exento de precipitados EQUIPAMIENTO Y ACCESORIOS NECESARIOS PERO NO SUMINISTRADOS 1 Sistema HYDRASYS SEBIA PN 1210 o PN 1211 Micropipeteador manual o automatico como el HYDRAPLUS SEBIA PN 1216 o HYDRAPLUS 2 SEBIA PN 1217 para cargar los aplicadores de muestra de una forma alternativa C mara de Almacenaje H meda PN 1270 suministrada con el HYDRASYS Kit de Contenedores suministrado con el HYDRASYS Soporte del Gel para medios geles SEBIA PN 1278 Pipetas 10 pl y 200 ul Densit metro esc ner capaz de leer geles de 82 x 51 mm 82 x 102 mm a 570 nm o con un filtro amarillo p ej HYRYS SEBIA DVSE SEBIA o el programa PHORESIS para esc ner de sobremesa Observar las indicaciones del fabricante para los procedimientos de operaci n y calibraci n 8 Materiales de control de calidad Suero Control SEBIA PN 47
24. racci n Despu s de la diluci n la soluci n colorante contiene soluci n cida pH 2 negro amido 4 g L etil n glicol 6 7 aditivos inocuos a las concentraciones usadas necesarios para un funcionamiento ptimo ATENCI N Nocivo en caso de ingesti n Uso Para la coloraci n de los geles despu s de la separaci n electrofor tica de las prote nas IMPORTANTE El colorante est destinado para colorear s lo 10 geles Cambie el colorante despu s de 10 usos Conservaci n estabilidad y se ales de deterioro Las soluciones de colorante concentrada y diluida pueden conservarse a temperatura ambiente o en la nevera en contenedores cerrados para evitar la evaporaci n La soluci n concentrada es estable hasta la fecha de caducidad indicada en el kit o en la etiqueta del vial de colorante La soluci n diluida es estable durante 1 mes El per odo de estabilidad puede prolongarse a 3 meses si la soluci n diluida se conserva en nevera Es imperativo colocar el contenedor cerrado en nevera inmediatamente despu s de cada uso No almacene la soluci n de colorante diluida cerca de una fuente de calor 5 COLORANTE VIOLETA CIDO PN 4102 y 4122 Preparaci n Cada vial de la soluci n stock del colorante violeta cido se diluye hasta 300 ml con agua destilada o desionizada Despu s de la diluci n la soluci n de trabajo del colorante contiene soluci n cida pH 2 violeta cido 0 2 g dL etil n glicol 3 25 adit
25. s Almacenamiento estabilidad y se ales de deterioro Almacenar a temperatura ambiente o refrigerada Desechar despu s de 3 meses o si cambia su aspecto por ejemplo se vuelve turbia debido a contaminaci n microbiana Para per odos de almacenaje m s prolongados a adir azida s dica 1 g l 2 SOLUCI N DECOLORANTE Preparaci n Cada vial de la Soluci n Decolorante stock SEBIA PN 4540 10 viales de 100 ml se diluye hasta 100 litros con agua destilada o desionizada Es conveniente diluir s lo 5 ml de la soluci n stock hasta 5 litros volumen del contenedor de soluci n decolorante Despu s de la diluci n la soluci n decolorante de trabajo contiene cido c trico 0 5 g l Uso Para deste ir esto es la eliminaci n del exceso de tinci n y la coloraci n de fondo de los geles y para enjuagar la c mara de tinci n despu s de la limpieza con soluci n de lavado Para neutralizar la acidez del decolorante introduzca dentro del contenedor de desechos vac o 15 ml de sosa al 50 soluci n comercial Almacenamiento estabilidad y se ales de deterioro Almacenar la soluci n decolorante stock a temperatura ambiente o refrigerada Es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la caja del kit o en las etiquetas del vial La soluci n decolorante de trabajo es estable durante una semana a temperatura ambiente en una botella cerrada No a adir azida s dica Desechar la soluci n decolorante de trabajo si cambia su aspecto por
26. tes descienden con lo cual las esponjas tamponadas y el aplicador entran en contacto con la superficie del gel El soporte del aplicador se eleva Programa de migraci n 7 15 HR1 y 7 15 La migraci n se realiza a voltaje constante de 255 V a 20 controlados por efecto Peltier hasta que se hayan acumulado 75 Vh durante unos 18 minutos Programa de migraci n 7 15 La migraci n se realiza a voltaje constante de 255 20 controlados por efecto Peltier hasta que se hayan acumulado 40 Vh durante unos 10 minutos El soporte de los electrodos se eleva para desconectar los electrodos La temperatura de la placa de control asciende hasta 60 durante 9 minutos para secar el gel La placa de control es enfriada cuando alcanza 50 un pitido indica que la tapa del m dulo de migraci n se desbloquea La temperatura de la placa permanece a 50 C hasta que se abre la tapa Entonces la temperatura va descendiendo hasta que llega a 20 C en menos de 5 minutos momento en el que se puede comenzar una nueva migraci n NOTA La tapa del m dulo de migraci n permanece cerrada durante todas las etapas de la migraci n II PUESTA EN MARCHA DEL PROCESADO DEL 1 Abrir la tapa Sacar el aplicador y desechar Elevar ambos soportes extraer las esponjas tamponadas por sus extremos de pl stico y desechar Retirar el gel secado para su procesado posterior Despu s de cada uso limpiar los electr
27. tos de un mismo kit deben utilizarse conjuntamente y seg n las instrucciones incluidas LEER ATENTAMENTE LAS INSTRUCCIONES 1 GELES DE AGAROSA Preparaci n Los geles de agarosa est n listos para su uso Cada gel contiene agarosa 8 0 g l tamp n tris barbital pH 8 6 0 1 aditivos inocuos a las concentraciones utilizadas necesarios para un funcionamiento ptimo ATENCI N Los geles de agarosa contienen barbital 0 18 No ingerir Si se ingiere consultar al m dico inmediatamente Uso Medio de soporte para la electroforesis de prote nas Almacenamiento estabilidad y se ales de deterioro Almacenar los geles en posici n horizontal en sus recipientes protectores originales a temperatura ambiente 15 a 30 C La flecha situada en la parte frontal de la caja del kit debe apuntar hacia arriba NO REFIGERAR NI CONGELAR Evitar el almacenaje en un lugar cercano a una ventana o a una fuente de calor Evitar variaciones de temperatura importantes durante el almacenaje Son estables hasta la techa de caducidad indicada en la caja del kit y en sus recipientes protectores Desechar el gel cuando i cristales o precipitados en la superficie del gel o su textura sea muy blanda consecuencias de la congelaci n del gel ii se observe crecimiento bacteriano o f ngico iii se evidencie una cantidad excesiva de l quido en el recipiente del gel consecuencia de la exudaci n del tamp n debida a un almacenamiento inade
28. ue francaise des laboratoires 269 29 37 Le Carrer D Nicolas A Ducasse L 1992 L analyse des prot inuries au laboratoire de biologie en 1992 Revue francaise des laboratoires 225 41 47 Linstedt G Lindberg PA 1974 Loss of tubular proteinuria pattern during urine concentration with a commercial membrane filter cell Clin Chem Acta 56 125 126 Olsson JE Link M 1973 Immunoglobulin abnormalities in multiple sclerosis 1973 Arch Neurol 28 392 399 Papadopoulos NM Costello R Kay AD Cuttler NR Papoport SL 1984 Combined immunochemical and electrophoretic determination of protein in paired serum and cerebrospinal fluid samples Clin Chem 30 1814 1816 Pearson SD Wu JT Sensitive specific detection of oligoclonal banding in cerebrospinal fluid by agarose gel electrophoresis 1989 Clin Chem 35 1997 Philipon C 1989 Prot ines urinaires Int r t clinique et interpr tation Technique et Biologie 6 239 249 Waller KV Ward KM Mahan JD Wismatt DK 1989 Current concepts in proteinuria Clin Chem 35 755 765 Wendling A Proc dures de diagnostic ou de d pistage Justification et validit d un test de diagnostic ou de d pistage sensibilit sp cificit Impact Internat 1986 Sept 93 97 167 HYDRAGEL 7 amp 15 HR 2009 05 SCH MAS FIGURES Figure 1 Figure 3 Figure 2 Figure 4 Figure 5 168
29. umentada del sistema nervioso central Se recomienda encarecidamente que tales LCR sean analizados simult neamente con el suero del paciente a la misma concentraci n de prote nas esto es unos 10 g l En algunas anormalidades linfoproliferativas se puede detectar un aspecto oligoclonal tanto en el suero como en el LCR Cualquier patr n oligoclonal tiene que ser confirmado mediante investigaciones posteriores con kits de inmunofijaci n HYDRAGEL 1 IF SEBIA 4301 HYDRAGEL 2 4 IF SEBIA PN 4302 4304 4308 HYDRAGEL 9 IF SEBIA 4309 HYDRAGEL 3 6 CSF SEBIA PN 4350 4351 HYDRAGEL 1 BENCE JONES SEBIA PN 4321 HYDRAGEL 2 4 BENCE JONES SEBIA PN 4322 4324 ORINA 1235785101415 La electroforesis de orina se realiza con el fin de detectar componentes monoclonales EI HYDRAGEL 7 15 HR se utiliza como un sistema de despistaje de prote nas urinarias Permite la detecci n de componentes monoclonales que deben identificarse mediante inmunofijaci n y la detecci n de prote nas de origen tubular glomerular o mixto que deben ser caracterizadas con m todos adecuados filtraci n molecular en tamp n SDS o medidas nefelom tricas espec ficas o inmunofijaci n con anticuerpos apropiados 46 HYDRAGEL 7 amp 15 HR 2009 05 Interferencias y Limitaciones Las lipoprote nas LDL y HDL son mol culas complejas con una movilidad electrofor tica natural muy variable desde la zona beta a la zona alfa 2 Para evita
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