HIV BLOT 2.2 - MP Biomedicals
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1. Diagnostics HIV BLOT 2 2 ENSAYO DE TRANSFERENCIA WESTERN PARA VIH C 0123 Nota Cambios resaltados FECHA DE REVISI N 05 05 MAE 0011 SPN 0 kit de 18 an lisis 11030 018 kit de 36 an lisis 11030 036 NOMBRE Y USO PREVISTO El ensayo HIV BLOT 2 2 de MP Diagnostics MPD es un enzimoinmunoensayo cualitativo para la detecci n in vitro de anticuerpos frente a los virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 VIH 1 y tipo 2 VIH 2 en suero o plasma humanos Su uso previsto es como an lisis complementario m s espec fico para muestras de suero o plasma humanos que presentan reactividad repetida utilizando procedimientos de detecci n selectiva como el ensayo de inmunoabsorci n ligada a enzimas ELISA INTRODUCCI N Existe actualmente una amplia disponibilidad de an lisis de detecci n selectiva para determinar la presencia de anticuerpos frente al VIH 1 y VIH 2 los agentes causales del s ndrome de inmunodeficiencia adquirida SIDA Dichos an lisis pueden ser muy sensibles pero existe la posibilidad de que sean menos espec ficos con lo que pueden dar lugar a falsos positivos Ello explica la necesidad de disponer de an lisis complementarios independientes de elevada especificidad para confirmar la presencia de anticuerpos frente al VIH 1 el VIH 2 o ambos Los kits HIV BLOT 2 2 de MP Diagnostics se dise aron como an lisis complementario m s espec fico para muestras de suero o plasma2. Bottiger B A Karlsson F Andreasson et al 1990 Envelope cross reactivity between Human Immunodeficiency Virus Type 1 and Type 2 detected by different serological methods Correlation between cross neutralization and reactivity against the main neutralizing site J Virol 64 7 3492 3499 MP Biomedicals Asia Pacific Pte Ltd 85 Science Park Drive 04 01 The Cavendish Singapore Science Park Singapore 118259 Tel 65 6775 0008 Fax 65 6775 4536 Correo electr nico enquiry_ap mpbio com Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D 66386 St Ingbert Alemania Tel 49 68 94 58 1020 Fax 49 68 94 58 1021 Correo electr nico info mt procons com Oficinas regionales MP Biomedicals Suisse S A Halle de Fret Aeroport P O Box 1015 1211 Ginebra 5 Suiza Tel 4122 788 1908 Fax 4122 788 1986 Correo electr nico mpbiosuisse mpbio com Patente 5 721 095 de EE UU El nombre y el logotipo de Genelabs cuentan con licencia de Genelabs Technologies Inc FIGURA 1 a b C gp 160 j mea gp 120 p 66 Ei D59 p 51 gp 41 a p 39 p 31 B p 24 k p17 Suero de _ py EE control VIH 2 g Control reactivo fuerte reactivo para el VIH 1 y el VIH 2 Control reactivo d bil reactivo s lo para el VIH 1 Control no reactivo Un ejemplo t pico de suero positivo para el VIH 2 27 SEA ou Seul 1o1d
3. Una banda de p24 o p31 las serolog as de retrovirus CRSS y una banda de ENV Cruz Roja Estadounidense Una banda de GAG otra de POL y otra de ENV Asociaci n alemana para el control Una banda de ENV y al menos una de as enfermedades v ricas DVV banda de GAG o de POL v ase tambi n el DIN 58 969 41 Recomendamos las siguientes directrices para la interpretaci n del MPD HIV BLOT 2 2 de MPD Deben registrarse los resultados de todas las bandas detectadas e interpretarse como NEGATIVO POSITIVO o DUDOSO PATR N INTERPRETACI N Ninguna banda v rica espec fica presente NEGATIVO Detecci n de anticuerpos p17 NEGATIVO UNICAMENTE sin ninguna otra banda Detecci n de 2 ENV gp160 gp41y gp120 y GAG p17 p24 p55 o POL p31 p51 p66 Detecci n de 2 ENV VIH 1 POSITIVO gp160 gp41 y gp120 y GAG con p17 p24 p55 o POL VIH 2 SE ALADO p31 p51 p66 y banda espec fica del VIH 2 visible VIH 1 POSITIVO Cualquier banda v rica espec fica DUDOSO presente pero el patr n no cumple los criterios para POSITIVO Cualquier banda v rica espec fica DUDOSO presente pero el patr n no cumple los con criterios para POSITIVO con una VIH 2 SE ALADO banda espec fica del VIH 2 visible LIMITACIONES DEL M TODO La detecci n de anticuerpos frente al VIH 1 no implica que se haya establecido un diagn stico de s ndrome de inmunodeficiencia adquirida SIDA Una TRANSFERENCIA NEG
4. Lyd e ap u 6 1 ej ua ej9 19sIp epiu epueg sonjebou s3 0 JU09 u OJ9NS IP seson 99Jj9p 0111409 9p sej uos ou UB S9 SEI se enb sepueq us9aJedy sajue uo 55e 1 JeJed erguasald o erpuasne uo2 ein p ua a3 19n opuoj un a9a1edy VSI13 Sp onisod Os e un 13S apand sIsIpeue p esanu e7 9 a jue noseq ojejd un ap Je6n ua oaeo Jopeube un opezI nn ey as s epen9apeul UQIDEAJ9SUOD eun Jod o uornejaBuoo p sopijada sojo19 JOd epezijemjeusap o epeJo119 9p e sa sisipeue I p e1sanu e ap 5B e7 y s unuuul so duuo5 sayan ues nw SISIJeue ap sesjsanul Se7 e opeBn uo5 9 uo5 pepeuluieluo5 sisijlpue J9p euIsann sisilpue j p esanu p ap esuoJla uoioniid SISIJeue ap esanu p 10d opeoSoAo1d 91se euwa qgold ja nb p nd YO OAIISOd olluoO o dulioSul opere Z ue noseq ojejd un ep eBn ue on1yejo ojejd un opeziin ey es enpe o soni oea selopueq ue ojejsoj p uoioel1u oSuo2 BUY 9 J0J9NpaJ ajuaBe un e O gonen zn esuajul eun e uoroisodxa Jod 0 98 109U1 O e 11snsS ap Hd G eueuny 5f uoo opeuluejuos opeBn uoo r epen9apeul o esua elnyesadua e voroIsodxa ap sosed solunsip 10d S9 qe saul sOADeay So 911U9 Sen ope6n uo5 se 9ju uuepeno pe I p 9U0119 uoioniiq g OPeAe uey es ON S ju uuepeno pe sepe el1 o sopejedaJd sepel uBe sepeuep uR s9 ou SOAIDBaJ SOT 9 JUSWEJ9ISIJ SEJL y epeno peul SOAI 9E81 UQIOPAJ
5. No utilice los componentes del kit despu s de la fecha de caducidad que figura en la caja Evite la contaminaci n microbiana de los reactivos al abrirlos y al extraer partes al cuotas de los viales o frascos originales ya que ello reducir a de forma prematura el periodo de validez de los kits y dar a lugar a resultados err neos Al extraer partes al cuotas de los viales utilice t cnicas as pticas como pipetas o puntas de pipeta desechables Los controles del kit deben analizarse al mismo tiempo que las muestras cl nicas en cada serie de an lisis Para evitar la contaminaci n cruzada use una punta de pipeta nueva para cada al cuota de la muestra Para obtener resultados ptimos dispense todos los reactivos mientras todav a est n fr os y vu lvalos a guardar a 2 C 8 C lo antes posible Se aconseja lavar el material de vidrio que se vaya a utilizar para los reactivos con cido clorh drico 2 M y aclararlo bien con agua destilada o desionizada antes de usarlo Utilice s lo agua destilada o desionizada de calidad reactivo para diluir los reactivos Todos los reactivos deben mezclarse bien antes de su uso La soluci n del conjugado de trabajo el tamp n de lavado diluido y el tamp n de transferencia deben estar reci n preparados La soluci n del conjugado de trabajo debe prepararse en un recipiente o vaso de precipitado de polipropileno 13 14 15 16 17 18 19 20 No exponga los re
6. Suero humano inactivado con una concentraci n elevada de anticuerpos frente al VIH 1 y VIH 2 no reactivo para el HBsAg y sin anticuerpos frente al VHC Contiene azida s dica y timerosal como conservantes CONTROL REACTIVO 1 vial DEBIL 80 ul Suero humano inactivado con una concentraci n baja de anticuerpos frente al VIH 1 EXCLUSIVAMENTE no reactivo para el HBsAg y sin anticuerpos frente al VIH 2 y el VHC Contiene azida s dica y timerosal como conservantes sur srock 10x TAMP N DE BLOTTING 1 frasco CONCENTRADO 10x 20 ml Tamp n Tris con suero de cabra normal termoinactivado Contiene timerosal como conservante su wasH 20 TAMP N DE LAVADO 1 frasco CONCENTRADO 20x 70 ml Tris con Tween 20 Contiene timerosal como conservante CONJUGADO 1 vial Anticuerpo de cabra anti IgG 120 ul humana conjugado con fosfatasa alcalina Contiene azida s dica como conservante suBs BcIP NBT SUSTRATO 1 frasco A Soluci n de 5 bromo 4 cloro 100 ml 3 indolil fosfato BCIP y nitroazul de tetrazolio NBT POLVO DE BLOTTING Leche desnatada 10 paquetes 1 g cada uno Bandeja de incubaci n 2 4 bandejas de 9 pocillos Manual de instrucciones 1 copia Pinzas 1 par Nota se suministra un volumen de reactivos suficiente para 4 series de an lisis ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES 1 Para uso diagn stico in vitro nicamente 2 Para uso exclusivo por profesionales 3 Consulte el prospecto del p
7. SUu0O2 so 10d opesonoud 9ls eun Jod seun ua puu l qoid ja anb apang eonos1u O BuBliajoeq UOIDeUIueJuOO e sepiS Au sisipeue 9p sesenu ua s unwu so duio5 ap uo o lIdi591d Z SIsIJeue 9p es nw e ap eongo o euenapeq IIq p oasod 01 U00 SepE A9 1191QOS SEIL sIsIpeue ap sesan seunfje u A 06 08 ap Jopapa e ap ope isoo1 Bsap enyonue ap ous651ue seu iba sepueq opeolllu pi uey as g ya ogy VIH ojdwafe Jod esa uo eJedaJd p ua sajuasald 6 H seulajold uoo ppezni2 ewoy p ueuo Doea Seuls nu sp T solleIp uu lu ep s pepueo seu nb d uo euolnJes y n nu se es nw e7 Seanisod sepueg ap 2 HIA uesipur ou seoijinadso ou sepueq us9aJedy on sod OJJUOD JEQOIAWOS uOIDeuIMeJUO UO 9e911Qej ns ajuenp e 9U9 19 5Ue 1J01 99 9 p ua enua y e19ua aj sue ap oA od 9p lu l9lJ D UOIONosIg uoioezi nn ns Sp s lue lu uuepeno pe Opere ugy es ou selepueq seT z o esua 9 ueinp sel se e eyana ej opep ey as selin Se u seSue q SEy9uen se 1 sej ua so B u 11q9p pepisua u1 eun sojund us9aJedy ue41 sanu o sepeladsoa sepueq sej usa9aJede ON SVT TIO Ad Ad N IONIOSHA VAVd VAVAUDS V IU
8. contaminadas por part culas deben filtrarse 0 45 um o centrifugarse antes del an lisis Las muestras de los pacientes pueden estar inactivadas pero esto no es un requisito para el rendimiento ptimo del an lisis Para efectuar la inactivaci n 1 Afloje las tapas de los recipientes con la muestra 2 Caliente la muestra a 56 C durante 30 minutos al ba o Mar a 3 Deje enfriar la muestra antes de volver a ajustar las tapas 4 Lamuestra puede conservarse congelada hasta el an lisis Se recomienda que la muestra de los pacientes no se someta a ciclos repetidos de congelaci n y descongelaci n antes del ensayo MATERIAL ADICIONAL NECESARIO NO SUMINISTRADO e Agua destilada o desionizada e Guantes desechables e Plataforma basculante con velocidad de balanceo de 12 16 oscilaciones por minuto e inclinaci n de 5 10 para lavar las membranas uniformemente Pipetas y puntas del volumen adecuado Aspirador con dep sito de hipoclorito s dico Ba o Mar a de 56 C optativo Hipoclorito s dico para la descontaminaci n PREPARACI N DE LOS REACTIVOS 1 TAMP N DE LAVADO DILUIDO a El TAMP N DE LAVADO DILUIDO debe estar reci n preparado b Diluya 1 volumen de TAMP N DE LAVADO CONCENTRADO 20X con 19 vol menes de agua de calidad reactivo Mezcle bien 2 TAMP N DE BLOTTING DE TRABAJO a El TAMP N BLOTTING DE TRABAJO debe estar reci n preparado b Diluya 1 volumen de TAMP N BL
9. de tamp n BLOTTING DE 2 ml TRABAJO a cada pocillo 5 A ada 20 ul de suero de los pacientes o 20 ul de controles seg n corresponda en cada uno de los pocillos Debe tomar precauciones para evitar a adir las muestras directamente en las tiras 6 Cubra la bandeja con la tapa suministrada 60 minutos e incube durante 1_hora a temperatura ambiente 25 3 C en la plataforma basculante 7 Destape la bandeja con cuidado para evitar salpicaduras y el mezclado de las muestras Incline la bandeja para aspirar la mezcla de los pocillos Cambie las puntas del aspirador entre muestras para evitar la contaminaci n cruzada Lave 3 veces cada tira con 2 ml de TAMP N DE LAVADO DILUIDO dejando que se empapen durante 5 minutos en la plataforma basculante entre los lavados to ensure specimens are not added directly on the strips A ada 2 ml de SOLUCION DEL CONJUGADO DE TRABAJO a cada pocillo Cubra la bandeja e incube durante 1 hora a temperatura ambiente 25 3 C en la plataforma basculante Aspire el CONJUGADO de los pocillos Lave como en el paso 8 A ada 2 ml de SOLUCI N SUSTRATO a cada pocillo Cubra la bandeja e incube durante 15 minutos en la plataforma basculante Nota La reacci n se puede parar antes de 15 minutos si todas las vendas son visibles Aspire el SUSTRATO y aclare las tiras un m nimo de tres veces con agua de calidad reactivo para detener la reacci n el lavado insuficient
10. uoo sisi peup 9p es nw e ap uo 5 52e tJ s Do 0 e Jouedns uoineqnoul ap emjeJadula o esu a 9 ue mp ol duuoSu OPpeAe7 OAl192681 p O SISIJeUe 9p esanu ej ap epe opeiseulsp uoi5oeqnou g opeBn uo5 I p o sisipeue ap esanu Zyd senja e ap esuo a uolon iGd L p ul sp eulajold eun 9P 9 81 S aJUSUua qIsog e pdB ouuoo 1e191d18 Ul oN Z esnup epueq eun s pdf ej anb PA IpAD epeq eseon i 0Je1 sns 9 IPLuUeL S ON y opeBn uo2 a OIpeue as ON o esu j ajueInp se se e eyana e opep ey as z 0J9NS OIPeue as ON L ouensn ep ojuelweze due a us ein e ap UOIDBA19SUOI AP sepeno peul sauo oipuos seun e opiq p sa puu qoid asa oqn ap ero1ul elnusde e ap sendsap oduan un usgaJede so Bau sojund so s oBequua u S seJ se p soqnj so ap jenu ernjiade e19ue e sueJ ej ep uned e ou Buo es nb ERES MOI PUILIp 1095 ap uodu ja peue ODIODIUY OJUAIUIIDALO e opiq p gun auns opipod p s lue opededw so Beu solund uens nIW e uey oquos e o el pueq a1d ep osed U0I999I9P e Jena esed otuo5 el ep solllood so1 9p s nds p Jegas s pue B lue seq o uo oop l uoJefep as sein SeT 9p seuoz us sogue q sojund ap uorouede ej ueooAoid nb 9 1e ap se nqinq usuanuo z sepel uBe ueIsy3 0J9NS p O JUOI SP epueq ap epu sny Sepejanal Se se sel1 Se us enfe ap Seden us soin5so sopuoj O seaidadse ou sepueq us9aJedy
11. 41 si no hay gp160 porque la gp160 es la forma polim rica de la gp41 y en el ensayo HIV BLOT 2 2 de MPD la concentraci n de gp160 es mayor que la de gp41 La gp41 aparece como una banda dilusa Las bandas n tidas y discretas en la regi n de la gp41 no deben interpretarse como banda gp41 Muchas muestras normales y no infectadas por el VIH resultan reactivas frente a este ant geno no asociado al VIH que probablemente tenga su origen en la l nea celular humana utilizada para cultivar el virus 2 La banda p55 se suele detectar cuando existe una reactividad fuerte para el p24 y o el p17 Las bandas que aparecen como p42 y p39 son fragmentos GAG y no deben interpretarse como gp41 ENV 3 Las bandas POL p66 p51 y p31 suelen detectarse de forma simult nea Sin embargo la sensibilidad del p66 y del p31 es mayor que la del p51 4 La reactividad cruzada con el VIH 2 es variable pero resulta t pica la reactividad con ant genos GAG POL o ambos Sin embargo en algunos casos puede haber reactividad cruzada con la banda gp160 pero raramente con la gp41 5 Existe tambi n una banda de elevado peso molecular aproximadamente 160 kD que se cree que es una prote na precursora GAG POL Esta banda se observa en ciertos sueros con t tulos elevados de VIH 2 o sueros dudosos reactivos s lo para GAG pero el patr n de banda es el de una banda n tida y discreta diferente de la banda difusa de la gp160 de ENV El proceso de interpretac
12. ATIVA no constituye una garant a de la ausencia del agente causal del SIDA Aunque una transferencia POSITIVA para anticuerpos frente al VIH 1 indica infecci n por el virus el diagn stico cl nico de SIDA s lo se puede establecer si la persona cumple los criterios definitorios de SIDA establecidos por los Centers for Disease Control de EE UU la Organizaci n Mundial de la Salud u otra autoridad competente Es un hecho conocido que las personas que han experimentado una seroconversi n reciente pueden presentar un patr n incompleto pero se produce un aumento de la reactividad tanto en el n mero como en la intensidad de las bandas si se hace un seguimiento durante un periodo de dos a seis meses La mayor a de las transferencias con resultados POSITIVOS presenta otras bandas v ricas espec ficas Las transferencias DUDOSAS no deben utilizarse como base para el diagn stico de infecci n por VIH 1 Se recomienda repetir todas las transferencias con resultado DUDOSO utilizando la muestra original y muestras seriadas En los donantes de sangre con transferencias DUDOSAS debe repetirse el an lisis con una muestra nueva al cabo de dos a seis meses Es tambi n sabido que los anticuerpos frente a p24 y a p31 disminuyen durante el curso del SIDA lo que provoca un desplazamiento de la interpretaci n de la transferencia de POSITIVA a DUDOSA Por consiguiente en tales circunstancias la interpretaci n de los resultados debe basarse en las t
13. OTTING CONCENTRADO 10X con 9 vol menes de agua de calidad reactivo Mezcle bien c A ada 1 g de POLVO DE BLOTTING por cada 20 ml del TAMP N DE BLOTTING diluido preparado en la etapa anterior 2 b Revuelva hasta que el polvo se disuelva por completo d Revuelva de nuevo antes de dispensar la mezcla 3 SOLUCI N DEL CONJUGADO DE TRABAJO Nota prepare la soluci n en un recipiente o vaso de precipitado de polipropileno a LA SOLUCI N DEL CONJUGADO DE TRABAJO debe estar reci n preparada b Prepare la SOLUCI N DEL CONJUGADO DE TRABAJO diluyendo CONJUGADO en TAMP N DE TRANSFERENCIA en proporci n de 1 1000 p ej 5 ul de CONJUGADO en 5 ml de TAMP N DE TRANSFERENCIA 4 SOLUCI N SUSTRATO lista para su uso a Dispense el volumen necesario directamente del frasco Use una pipeta limpia Cierre bien el frasco despu s de usarlo PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO ENSAYO R PIDO Notas a Los usuarios pueden utilizar el an lisis r pido o de noche para funcionar las pruebas Las vendas del VIH son convertidas y m s vendas pueden aparecer con el an lisis de noche pero el funcionamiento total de los dos an lisis es igual b Aspire todos los productos qu micos y reactivos utilizados con un aspirador provisto de dep sito con hipoclorito s dico c Todas las incubaciones deben efectuarse en una plataforma basculante Precauci n Algunas muestras pueden causar manchas oscuras en el punto de la tira en el que
14. Procedure Enzyme linked Immunoelectro transfer Blot technique for HTLV III LAV antibodies CDC Atlanta H Towbin T Staehlin and J Gordon 1979 Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets procedure and some applications Proc Natl Acad Sci EE UU 76 4350 4354 J Schupbach M Popovic R V Gilden M A Gonda M G Sarngadharan and R C Gallo 1984 Serological Analysis of subgroup of Human T Lymphotropic retroviruses HTLV II associated with AIDS Science 224 503 505 M G Sarngadharan M Popovic L Bruch J Schupbach and R C Gallo 1984 Antibodies reactive with human T Lymphotropic retroviruses HTLV III in the serum of patients with AIDS Science 224 506 608 CDC 1985 Provisional public health service inter agency recommendations for screening donated blood and plasma for antibody to the virus causing Acquired Immune Deficiency Syndrome United States Morbidity and Mortality Weekly Report 34 1 1 5 WHO Collaborating Group on HIV 2 1990 WHO Weekly Epidem Rec 10 p74 75 F Clavel D Guetard F Brun Vezinet et al 1986 Isolation of a new human retrovirus from West African patients with AIDS Science 233 343 346 F Clavel 1987 HIV 2 the West African AIDS virus AIDS 1 135 140 R S Tedder A Hughes T Corrah et al 1988 Envelope cross reactivity in Western Blot for HIV 1 and HIV 2 may not indicate dual infection Lancet 11 927 930
15. VIH antes o en la misma muestra en todos los paneles CL USULA DE EXENCI N DE RESPONSABILIDAD El fabricante garantiza exclusivamente que el kit de an lisis funcionar como ensayo diagn stico in vitro de acuerdo con las especificaciones y limitaciones descritas en el Manual de instrucciones del producto cuando se use de conformidad con las instrucciones citadas en el mismo El fabricante rehusa cualquier garant a expl cita o impl cita incluida la garant a expl cita o impl cita relativa a la comercializaci n adecuaci n para el uso o supuesta utilidad para cualquier fin El fabricante s lo se obliga a la sustituci n del producto o al reembolso del precio de compra del mismo El fabricante no ser responsable ante el comprador ni ante terceros de cualesquiera da os perjuicios o p rdidas econ micas provocados por la utilizaci n O la aplicaci n del producto PROBLEMAS T CNICOS Y RECLAMACIONES En caso de problemas t cnicos o si desea presentar una reclamaci n proceda de la siguiente manera 1 2 3 Anote el n mero de lote del kit y su fecha de caducidad y el n mero de lote de la tira Conserve los kits y los resultados obtenidos P ngase en contacto con la oficina de MP Biomedicals m s cercana o con su distribuidor local BIBLIOGRAF A 1 N e a D N V C W Tsang K Hancock M Wilson D F Palmer S Whaley J S Mc Dougal and S Kennedy Marzo de 1985 Developmental
16. activos ni realice el an lisis en un rea en la que exista un nivel elevado de vapores de desinfectantes qu micos p ej vapores de hipoclorito durante las etapas de almacenamiento y de incubaci n el contacto inhibe la reacci n de color Los reactivos tampoco deben exponerse a la luz intensa Es preferible efectuar el ensayo a temperatura ambiente 25 C 3 O Aseg rese de colocar las tiras con los n meros hacia arriba En los ensayos de Western blot es importante utilizar un agitador con plato basculante el uso de un agitador rotativo podr a poner en peligro el rendimiento del kit La velocidad de agitaci n y el ngulo de inclinaci n recomendados son respectivamente de 12 a 16 ciclos por minuto y de 5 a 10 grados steps Contact inhibits col our reaction Also do not expose reagents to strong light Si se utiliza equipo automatizado debe verificarse que haya sido validado antes de su uso Aseg rese de a adir las muestras sin que toquen la tira Para ello puede inclinar la bandeja y a adir la muestra en la parte baja donde se acumula el tamp n De este modo se evitar la formaci n de puntos negros debidos a la adici n de muestra a la tira No utilice congeladores con funci n de descongelaci n autom tica para conservar los reactivos y las muestras No recomendamos la utilizaci n de muestras diluidas o liofilizadas ya que pueden producir falsos resultados Si forman parte o constituyen la totalidad de un pane
17. bralas con los pa os de papel y s quelas Otra posibilidad es dejar que las tiras se sequen en los pocillos de la bandeja Coloque las tiras en una hoja de trabajo papel blanco no absorbente No aplique cinta adhesiva sobre las bandas reveladas Observe las bandas v ase Interpretaci n de los resultados y califique los resultados Para el almacenamiento mantenga las tiras en la oscuridad 3x2ml 2 ml 30 minutos 3x2 ml 2 ml 15 minutos 3x2 ml RESUMEN DE LOS PROTOCOLOS DE ENSAYO Cant Temp amb Temp amb Ensayo r pido Ensayo nocturno OOO AAA O Tamp n blotting de trabajo Muestra Tamp n de lavado Conjugado 3x2ml 3x5min 60 min 2 ml 1 2 min 1 2 min 2 ml 20 ul 60 min Toda la noche 16 20 horas 3x5 min 30 min Tamp n de lavado 3x5 min 3x5 min Sustrato listo para su uso Agua destilada 15 min o menos 3x2ml 15 min o menos CANTIDADES DE REACTIVOS NECESARIAS PARA DIVERSOS NUMEROS DE TIRAS Reactivos N MERO DE TIRAS A UTILIZAR 3 6 9 15 2 2 Tamp n de 60 100 140 240 300 400 520 lavado 1X ml Tamp n blotting de 20 40 60 80 100 120 160 trabajo 1X ml Conjugado u T Sustrato m 11 Polvo de bloting g 1 12 3 14 5 615 CONTROL DE CALIDAD Recomendamos que se analicen en todos los ensayos los controles no reactivo reactivo fuerte y reactivo d bil independientemente del n mero d
18. dos que contengan cido a menos que se seque la zona previamente con un papel absorbente Para su eliminaci n el material utilizado incluidos los guantes desechables debe tratarse como material potencialmente biopeligroso No utilice el autoclave para el material que contenga hipoclorito s dico Esterilice en autoclave todos los materiales usados y contaminados a 121 C y 15 psi durante 30 minutos antes de desecharlos Otra opci n consiste en descontaminar los materiales con una soluci n de hipoclorito s dico al 5 durante 30 60 minutos antes de desecharlos en una bolsa para residuos biopeligrosos Descontamine todos los productos qu micos y reactivos usados a adi ndoles un volumen de hipoclorito s dico suficiente como para conseguir una concentraci n final de al menos el 1 D jelos en reposo durante 30 minutos para lograr una descontaminaci n eficaz No recomendamos la reutilizaci n de las bandejas de incubaci n PRECAUCIONES ANAL TICAS 1 10 11 12 Para obtener un rendimiento ptimo del ensayo es necesario un CUMPLIMIENTO ESTRICTO del procedimiento descrito en el presente Manual de instrucciones Cualquier modificaci n del procedimiento puede provocar resultados an malos NO CAMBIE NI SUSTITUYA LOS REACTIVOS DE UN LOTE DEL KIT POR LOS DE OTRO Los controles el conjugado y las tiras de Western blot est n ajustados para un funcionamiento ptimo Use s lo los reactivos que se suministran con el kit
19. e durante esta etapa puede provocar la aparici n de un fondo oscuro Utilizando unas pinzas coloque las tiras con suavidad sobre pa os de papel C bralas con los pa os de papel y s quelas Otra posibilidad es dejar que las tiras se sequen en los pocillos de la bandeja Coloque las tiras en una hoja de trabajo papel blanco no absorbente No aplique cinta adhesiva sobre las bandas reveladas Observe las bandas v ase Interpretaci n de los resultados y califique los resultados Para el almacenamiento mantenga las tiras en la oscuridad 3x2ml 2 ml 60 minutos 3x2 ml 2 ml 15 minutos 3x2 ml PROCEDIMIENTO ALTERNATIVO ENSAYO NOCTURNO Procedimiento 1 2 A ada 2 ml de TAMP N DE LAVADO DILUIDO a cada pocillo Utilizando unas pinzas extraiga con cuidado del tubo la cantidad de TIRAS necesaria y coloque cada tira en su pocillo con el n mero hacia arriba Incluya tiras para los controles reactivo fuerte reactivo d bil y no reactivo Incube las tiras durante 1 2 minutos a temperatura ambiente 25 3 C en un plato basculante velocidad 12 16 ciclos por minuto Extraiga el tamp n por aspiraci n Nota No permita que las tiras sequen falta puede dar lugar a marcas acuosas en las tiras desarrolladas para algunos espec menes j A ada 2 ml de TAMPON BLOTTING DE TRABAJO a cada pocillo A ada 20 ul de suero de los pacientes o de controles seg n corresponda en cada uno de
20. e muestras que se analicen Para que los resultados obtenidos en cualquier ensayo se consideren v lidos se deben cumplir las siguientes condiciones 1 CONTROL NO REACTIVO No deben observarse bandas espec ficas del VIH 1 ni del VIH 2 en las tiras de control no reactivo La banda del control de suero debe ser visible Fig 1c 2 CONTROL REACTIVO FUERTE Todas las bandas del peso molecular que corresponda deben ser evidentes En la Figura 1a se muestra una gu a de las posiciones relativas de las bandas visualizadas con el ensayo HIV BLOT 2 2 de MPD que permite identificar las bandas que se observan para el CONTROL REACTIVO FUERTE Las bandas son p17 p24 p31 gp41 p51 p55 p66 gp120 gp160 Pueden ser visibles tambi n otras bandas asociadas a los ant genos centrales del core p39 p42 Tenga cuidado de no interpretarlas err neamente como gp41 Los ant genos de la envoltura gp41 y gp120 op160 aparecen como las bandas difusas t picas de las olucoprote nas La banda del control de suero debe ser visible La banda espec fica del VIH 2 tambi n debe ser visible tal y como se muestra en la Figura 1a 3 CONTROL REACTIVO D BIL El control reactivo d bil proporciona una medida de la sensibilidad del kit Deben aparecer bandas d biles en p24 y o gp41 y en gp120 gp160 Puede haber o no algunas bandas d biles adicionales La banda del control de suero debe ser visible Fig 1b INTERPRETACI N DE LOS RESULTADOS NOTA para ev
21. humanos que presentan reactividad repetida utilizando el ensayo ELISA Los ant genos v ricos espec ficos separados del VIH 1 que se adhieren a las tiras mediante procedimientos de electroforesis y electrotransferencia se combinan en la misma tira con un p ptido sint tico espec fico del VIH 2 lo cual permite delimitar con mayor exactitud las respuestas de anticuerpos ante prote nas v ricas espec ficas Cada tira incluye tambi n un control interno de adici n de muestras para reducir al m nimo el riesgo de falsos negativos debidos a errores operativos y para garantizar la adici n de las muestras DESCRIPCI N DE LOS S MBOLOS A continuaci n figuran los signos gr ficos que aparecen en los envases y productos de MP Diagnostics y que son los que se incluyen con m s frecuencia en los dispositivos m dicos y sus envases Se explican con mayor detalle en la Norma brit nica y europea BS EN 980 2003 Dispositivo m dico uso No reutilizar Usar antes de OS Sin nimos para diagn stico in Fecha de caducidad vitro C digo de serie N mero de Sin nimos cat logo LOT i N mero de lote y N mero de serie Atenci n Consulte las Y L mite de Instrucciones de temperatura USO Representante paal E EC REP autorizado en la Comunidad Europea W Contenido suficiente Consultar las para lt n gt ensayos instrucciones de PRINCIPIOS QU MICOS Y BIOL GICOS DEL PROCEDIMIENTO Mediante transferencia por electroforesis se adh
22. i n consta de los siguientes elementos 1 Verificaci n de que la banda del control de suero es visible Si el control es negativo los resultados deben considerarse no v lidos ya que ello indica un error t cnico como por ejemplo la falta de adici n de muestra de conjugado o de sustrato 2 Identificaci n del peso molecular de cada banda de la tira de an lisis utilizando como gu a las tiras de control REACTIVO FUERTE de control REACTIVO D BIL o de ambos 3 La interpretaci n posterior de la tira de an lisis se basa en la detecci n de patrones espec ficos en las bandas seg n las recomendaciones de las autoridades pertinentes Ministerio de Sanidad Organizaci n Mundial de la Salud etc Las directrices espec ficas para la interpretaci n pueden variar seg n los criterios locales MPD recomienda seguir el criterio aceptado de conformidad con las normativas locales En la tabla que aparece a continuaci n figuran algunas de las directrices recomendadas por diferentes organismos reguladores internacionales INTERPRETACI N DE LOS CRITERIOS Al menos una banda de ENV gp41 y gp120 160 y p24 p24 y p31 y gp41 o gp120 gp160 ORGANISMO REGULADOR Centers for Disease Control CDC ASTPHLD Food and Drug FDA Administration de EE UU Centre Nationale de Dos bandas de ENV con GAG Transfusion Sanguine o POL Organizaci n Mundial Dos bandas de ENV con o sin GAG de la Salud WHO o POL Consorcio para la normalizaci n de
23. ieren a las tiras de nitrocelulosa prote nas antig nicas ligadas separadas de VIH 1 inactivado y parcialmente purificado m s un p ptido sint tico espec fico del VIH 2 Las tiras de nitrocelulosa individuales se incuban con suero o plasma diluidos y controles Si la muestra contiene anticuerpos espec ficos frente al VIH 1 y VIH 2 dichos anticuerpos se unir n a las prote nas del VIH 1 y al p ptido del VIH 2 de las tiras A continuaci n se lavan las tiras para eliminar los productos no ligados Los anticuerpos que se unen espec ficamente a las prote nas del VIH se pueden visualizar mediante una serie de reacciones con anticuerpos de cabra anti lgG humana conjugados con fosfatasa alcalina y el sustrato BCIP NBT La sensibilidad de este m todo permite detectar en el suero o el plasma cantidades nfimas de anticuerpos espec ficos frente al VIH COMPONENTES DEL KIT Descripci n del componente Cantidad suministrada TIRAS DE Disponible NITROCELULOSA en 18 36 Con lisado de VIH 1 p ptido tiras espec fico de la envoltura del VIH 2 y una banda de control para la adici n de suero Mant ngalas secas y alejadas de la luz CONTROL CONTROL NO REACTIVO 1 vial A Suero humano normal 80 ul inactivado no reactivo para el ant geno de superficie de la hepatitis B HBsAg y sin anticuerpos frente al VIH 1 2 y VHC Contiene azida s dica y timerosal como conservantes CONTROL REACTIVO 1 vial FUERTE 80 ul
24. itar errores en las interpretaciones las tiras reveladas deben estar completamente secas La presencia o ausencia de anticuerpos frente al VIH 1 en la muestra se determina comparando cada tira de nitrocelulosa con las tiras de control del ensayo con los controles NO REACTIVO REACTIVO FUERTE Y REACTIVO D BIL La Figura 1a puede servir de ayuda para la identificaci n de las diversas bandas que aparecen en la tira que se ha hecho reaccionar con el control REACTIVO FUERTE TENGA EN CUENTA QUE el extremo numerado de las tiras debe situarse hacia el fondo tal y como se muestra en la figura es decir las bandas gp120 gp160 son las m s alejadas del extremo numerado PESO G ANT GENO DESCRIPCI N MOLECULAR EN gp 160 ENV Forma polim rica Ancha y difusa de la gp41 de glucoprote na NV gp 120 E Membrana externa Difusa de glucoprote na p66 POL Transcriptasa Banda discreta inversa p55 GAG Prote na precursora Banda discreta p51 POL Transcriptasa Banda discreta justo inversa por debajo de p55 p39 G Fragmento de p55 AG gp41 Difusa de glucoprote na p31 AG p24 G Prote na central Banda ancha core p17 GAG Prote na central Banda ancha core Algunos de los ant genos mencionados en la tabla anterior derivan de la misma prote na precursora y pueden tener ep topos superpuestos Este hecho debe tenerse en cuenta al interpretar el patr n Por ejemplo 1 Resulta improbable detectar gp
25. l de control de calidad deber n estar validadas INSTRUCCIONES DE CONSERVACI N 1 2 Conserve el kit HIV BLOT 2 2 de MPD y sus componentes a 2 C 8 C cuando no se est n utilizando Todos los reactivos y tiras de an lisis si se conservan a 2 C 8 C son estables hasta la fecha de caducidad que figura en el kit No congele los reactivos Tiras de ant genos e Evite las exposiciones innecesarias de las tiras de ant genos a la luz Reactivos e Conserve los reactivos en sus viales o frascos originales que deben permanecer tapados e Dispense todos los reactivos cuando a n est n fr os y vu lvalos a guardar a 2 C 8 C lo antes posible e Cuando el sustrato se conserva a 2 C 8 C puede precipitar sin que ello afecte al funcionamiento del kit Precauci n Evite las exposiciones innecesarias del sustrato a la luz RECOGIDA TRANSPORTE Y CONSERVACI N DE LAS MUESTRAS Se pueden utilizar muestras de suero o plasma con EDTA heparina o citrato s dico Antes de guardar las muestras verifique que se hayan separado por centrifugaci n los co gulos O las c lulas sangu neas Las muestras deben conservarse a 2 C 8 C si el an lisis se va a llevar a cabo en los 7 d as posteriores a la extracci n O congelarse a una temperatura de al menos 20 C si el an lisis se va a retrasar m s de 7 d as Es preferible utilizar muestras transparentes y no hemolizadas Las muestras lip micas ict ricas o
26. los pocillos Cubra la bandeja con la tapa suministrada e incube durante toda la noche 16 20 horas a temperatura ambiente 25 3 C en la plataforma basculante 2 ml 2 minutos 2 ml 20 ul toda la noche 10 11 12 13 14 15 16 Reactivos Tira de nitrocelulosa Tamp n de lavado Destape la bandeja con cuidado para evitar salpicaduras y el mezclado de las muestras Incline la bandeja para aspirar la mezcla de los pocillos Cambie las puntas del aspirador entre muestras para evitar la contaminaci n cruzada Lave 3 veces cada tira con 2 ml de TAMP N DE LAVADO DILUIDO dejando que se empapen durante 5 minutos en la plataforma basculante entre los lavados A ada 2 ml de SOLUCION DEL CONJUGADO DE TRABAJO a cada pocillo Cubra la bandeja e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente 25 3 C en la plataforma basculante Aspire el CONJUGADO de los pocillos Lave como en el paso 8 A ada 2 ml de SOLUCION SUSTRATO a cada pocillo Cubra la bandeja e incube durante 15 minutos en la plataforma basculante Nota La reacci n se puede parar antes de 15 minutos si todas las vendas son visibles Aspire el SUSTRATO y aclare las tiras un m nimo de tres veces con agua de calidad reactivo para detener la reacci n el lavado insuficiente durante esta etapa puede provocar la aparici n de un fondo oscuro Utilizando unas pinzas coloque las tiras con suavidad sobre pa os de papel C
27. mente Tabla3 Estudio de sensibilidad de la banda del p ptido del VIH 2 con muestras seropositivas para el VIH 2 N mero de muestras 178 Transferencia Western de Reactividad al p ptido del VIH 2 VIH 2 Perfil serol gico Positiva Negativa GAG POL y 2 ENV 160 0 GAG POLy1ENV 18 O CSueros clasificados como positivos por los resultados del ensayo Pasteur New LAV Blot 2 Datos aportados por el Dr Oliviero E Varnier y la Dra Flavia Lillo Laboratorio de retrovirus humanos Universidad de G nova Tabla 4 Estudio de especificidad de la banda del p ptido del VIH 2 con muestras seropositivas para el VIH 1 muestras de donantes sanos y suero con otras infecciones v ricas TIPODE MUESTRA N MERO REACTIVIDAD al P PTIDO del VIH 2 POSITIVA NEGATIVA Seropositiva para 197 16 181 VIH 1 Donantes sanos 208 0 208 Seropositiva para 5 5 HTLV 1 CMV O1 O1 O V z ster IgG Rub ola Paperas Adenovirus HSV Dengue 455 O OI O O1 Ol 2Al analizarlas mediante Western Blot para HIV 2 de MPD 6 de estas muestras presentaron reactividad con ENV y GAG o POL otras 9 fueron reactivas s lo a GAG y o POL y 1 muestra result negativa Se analiz con el ensayo HIV Blot 2 2 de MPD un total de 15 paneles de seroconversi n para VIH 1 comercializados y los resultados mostraron que el ensayo HIV Blot 2 2 de MPD logr detectar anticuerpos frente al
28. omo nocivos Xn por las directivas de la Comunidad Econ mica Europea CEE que son de aplicaci n A continuaci n figuran las frases relativas a los riesgos R correspondientes R20 21 22 Nocivo por inhalaci n por ingesti n y en contacto con la piel 1 Evite la contaminaci n microbiana de los reactivos al abrirlos y al extraer partes al cuotas de los viales o frascos originales 2 No pipetee con la boca 3 Manipule las muestras las tiras de nitrocelulosa el reactivo los controles reactivos fuerte y d bil y los controles no reactivos como si fueran potencialmente infecciosos 4 Use bata de laboratorio y guantes desechables mientras realiza el ensayo Deseche los guantes en bolsas para residuos biopeligrosos L vese bien las manos al finalizar 5 Es muy recomendable que este ensayo se lleve a cabo en una c mara de bioseguridad 6 Mantenga el material alejado de bebidas y alimentos 7 En caso de accidente o contacto con los ojos l vese inmediata y abundantemente con agua y ac dase a un m dico 8 Ac dase a un m dico de inmediato si se ingiere material contaminado o si ste entra en contacto con heridas abiertas u otras lesiones de la piel 10 11 12 Limpie de inmediato los vertidos de material potencialmente peligroso con un papel absorbente y lave la zona contaminada con una soluci n de hipoclorito s dico al 1 antes de reanudar el trabajo El hipoclorito s dico no debe utilizarse para verti
29. ransferencias posteriores y en las evaluaciones cl nicas Dada su elevada especificidad la AUSENCIA DE REACTIVIDAD de las muestras con el p ptido espec fico de la envoltura del VIH 2 en una transferencia v rica dudosa no excluye la posibilidad de infecci n con otras cepas del VIH 2 Las muestras se aladas como infecci n por VIH 2 deben volverse a analizar con un kit de Western blot para VIH 2 CARACTER STICAS ESPEC FICAS DEL ENSAYO Se evalu mediante estudios cl nicos el rendimiento del ensayo HIV BLOT 2 2 de MPD para la detecci n de anticuerpos frente al VIH 1 y el VIH 2 Tabla 1 Estudio de sensibilidad de la reactividad del ant geno v rico del VIH 1 en muestras seropositivas para el VIH 1 N mero de muestras 197 PERFIL HIV BLOT 2 2 HIV 1 WB de SEROL GICO N MERO DUPONT ORTHO N MERO GAG POL y ENV 192 97 5 188 95 4 p24 p31 gp41 ylo 187 94 9 179 90 9 gp120 gp160 ENV y GAG o POL 197 100 0 197 100 0 Tabla2 Estudio de especificidad de la reactividad del ant geno v rico del VIH 1 en muestras de donante sano y suero con otras infecciones v ricas TIPO DE N MERO POSITIVO REACTIVIDAD al VIH 1 MUESTRA DUDOSO NEGATIVO Donantes sanos 0 11 197 HTLV 1 5 o 0 5 OMV 4 VEB IgM 5 0 4 V z ster IgG 4 Sarampi n 6 0 2 4 Paperas 3 Adenovirus 5 0 2 3 HSV 5 0 0 5 Dengue 5 0 1 4 Todos visibles como una banda de p24 o p17 nica
30. roducto para obtener informaci n sobre los componentes potencialmente peligrosos INFORMACI N SANITARIA Y DE SEGURIDAD PRECAUCIONES Este kit contiene productos de origen humano Ning n m todo de an lisis permite AN ofrecer una garant a absoluta de que los hemoderivados humanos no transmitan una infecci n MANIPULE LAS MUESTRAS LOS CONTROLES REACTIVOS FUERTES Y D BILES Y LOS CONTROLES NO REACTIVOS COMO SI FUERAN POTENCIALMENTE INFECCIOSOS Se recomienda manipular los componentes del ensayo y las muestras de conformidad con las pr cticas correctas de laboratorio Asimismo deben desecharse siguiendo los procedimientos de seguridad establecidos El control reactivo fuerte el control reactivo d bil y el control no reactivo contienen timerosal y azida s dica el tamp n de blotting concentrado y el tamp n de lavado concentrado contienen timerosal el conjugado contiene azida s dica La azida s dica puede reaccionar con el cobre y el plomo que se utilizan en ciertas tuber as y formar sales explosivas Aunque las cantidades que se usan en este kit son peque as los materiales que contienen azida deben eliminarse con vol menes relativamente grandes de agua para evitar la acumulaci n de azidas met licas en las tuber as A continuaci n figuran las frases relativas a los riesgos R correspondientes R22 Nocivo por ingesti n El sustrato contiene 5 bromo 4 cloro 3 indolil fosfato y nitroazul de tetrazolio clasificados c
31. se a adieron Para evitar este problema proceda de la forma siguiente i A ada siempre la muestra despu s de haber dispensado el TAMP N BLOTTING DE TRABAJO ii Incline ligeramente la bandeja elevando su extremo superior o su fondo El tamp n de transferencia se desplazar hacia la zona m s baja de la bandeja A ada la muestra en la zona en la que se haya acumulado el tamp n de transferencia Cuando haya dispensado todas las muestras devuelva la bandeja a su posici n plana inicial Aseg rese siempre de que las tiras se mantengan h medas durante el proceso iii Otra opci n si no desea inclinar la bandeja es dispensar las muestras en el extremo superior o en el fondo del pocillo De esta forma si aparecen manchas oscuras la lectura de los resultados de la tira no se ver afectada Procedimiento 1 A ada 2 ml de TAMP N DE LAVADO 2 mi DILUIDO a cada pocillo 2 Utilizando unas pinzas extraiga con cuidado del tubo la cantidad de TIRAS necesaria y coloque cada tira en su pocillo con el n mero hacia arriba Incluya tiras para los controles reactivo fuerte reactivo d bil y no reactivo 3 Incube las tiras durante 1 2 minutos a 2 minutos temperatura ambiente 25 3 C en un plato basculante velocidad 12 16 ciclos por minuto Extraiga el tamp n por aspiraci n Nota No permita que las tiras sequen falta puede dar lugar a marcas acuosas en las tiras desarrolladas para algunos espec menes 4 A ada 2 ml
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