CAPILLARYS HR - BG Analizadores
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1. CAPILLARYS HR Ref 2004 2009 04 CAPILLARYS HR 2009 04 UTILIZACION El kit CAPILLARYS HR permite realizar una separaci n de alta resoluci n en medio alcalino pH 9 9 de las prote nas del suero humano mediante electrotoresis capilar en el sistema autom tico CAPILLARYS Las prote nas del suero humano normal se separan en ocho fracciones principales El sistema CAPILLARYS permite realizar todas las etapas de la electroforesis hasta la obtenci n del perfil proteico para el an lisis cualitativo o cuantitativo Las prote nas separadas en capilares de s lice fundido son detectadas directamente en una burbuja existente en el capilar mediante espectrofotometr a de absorbancia a 200 nm Los perfiles electrofor ticos son analizados visualmente para detectar las anomal as La detecci n directa proporciona autom ticamente una cuantificaci n relativa precisa de cuatro prote nas principales alb mina alfa 1 glicoprote na cida orosomucoide alfa 1 antitripsina y haptoglobina La t cnica CAPILLARYS HR tambi n aporta una gran sensibilidad de detecci n de las prote nas monoclonales Para uso en diagn stico In Vitro PRINCIPIO DEL TEST La electroforesis de las prote nas del suero humano es un an lisis muy til en el laboratorio de an lisis cl nicos para investigar las modificaciones del perfil proteico Paralelamente a las t cnicas de electroforesis en diferentes soportes entre los que est el gel de agarosa se2. Resoluci n de problemas Contacte con el Servicio de Asistencia T cnica de SEBIA en caso de que el an lisis sea defectuoso Las fichas de datos de seguridad de los diferentes reactivos del kit as como las informaciones relativas a la eliminaci n de los desechos est n disponibles en el Servicio de Asistencia T cnica de SEBIA 40 CAPILLARYS HR 2009 04 CARACTERISTICAS TECNICAS Los resultados siguientes obtenidos con el kit CAPILLARYS HR en el sistema CAPILLARYS mediante an lisis cuantitativo indican que la repetibilidad y la reproducibilidad del kit CAPILLARYS HR son muy buenas en todos los aspectos probados con un coeficiente de variaci n medio del orden del 2 6 en los porcentajes de las fracciones Alb mina Alfa 1 glicoprote na cida Alfa 1 antitripsina y Haptoglobina Los porcentajes de las diferentes fracciones proteicas se obtuvieron con los par metros de integraci n por defecto del programa alisado O y deriva autom tica con triangulaci n Repetibilidad intraserial Se analizaron cinco sueros entre los que hab a un Suero Control Normal y un Suero Control Hipergamma SEBIA en el sistema CAPILLARYS con el kit CAPILLARYS HR y 2 lotes diferentes de tamp n de an lisis Cada suero se analiz simult neamente en los 8 capilares del sistema CAPILLARYS Se calcularon las medias desviaciones t picas SD y coeficientes de variaci n CV n 8 de cada muestra con cada lote de tamp n La tabla siguiente muestra
3. 141 CAPILLARYS HR 2009 04 SCHEMAS FIGURES PROFILS ELECTROPHORETIQUES ELECTROPHORETIC PATTERNS Figure 1 Profil normal A Normal pattern I B lipoproteins Hemopexin E o YY La k cy i Lia yA f t E a Prealbumin Albumin i i i Y Alpha 1 acid glycoprotein i i Alpha 2 macroglobulin Alpha 1 antitrypsin Haptoglobin Figure 2 Profil inflammatoire A Inflammatory pattern e Hemopexin A H A E pa L rl V MP NN A ds Prealbumin Albumin i i i B1 82 a O EE C4 CRP Alpha 1 acid glycoprotein i Alpha 2 macroglobulin Alpha 1 antitrypsin Haptoglobin 142 CAPILLARYS HR 2009 04 SCHEMAS FIGURES PROFILS ELECTROPHORETIQUES ELECTROPHORETIC PATTERNS Figure 3 Profil avec compl ment C3 d grad Pattern with degradated C3 complement BW Li haa H i a se A Prealb rin Albumin i i C3d B1 Cad kb i i C3d 82 Alpha 1 acid glycoprotein i l Alpha 2 macroglobulin Alpha 1 BE errs 143
4. Alfa 1 Glicoprote na cida 0 4 1 7 0 00 0 06 0 0 8 8 5 0 Alfa 1 Antitripsina 2 3 3 2 0 06 0 11 1 8 4 6 3 1 Haptoglobina 2 8 7 5 0 10 0 15 1 8 4 0 3 2 Exactitud El an lisis de 135 muestras diferentes normales y patol gicas mediante electroforesis capilar en el sistema CAPILLARYS con el kit CAPILLARYS HR y con sistemas comerciales de determinaci n nefelom trica de las fracciones alb mina alfa 1 glicoprote na cida alfa 1 antitripsina y haptoglobina muestra una buena correlaci n entre los dos sistemas de an lisis para el conjunto de las cuatro fracciones proteicas con una sensibilidad media del 86 3 y una especificidad media del 86 1 respecto a la t cnica nefelom trica calculadas seg n el m todo recomendado Wendling 1986 41 La tabla siguiente muestra los resultados del an lisis de regresi n lineal y CAPILLARYS HR CAPILLARYS HR 2009 04 L mites de las Fracci n Coeficiente de correlaci n Punto de corte en y Pendiente concentraciones g L CAPILLARYS HR Alb mina 0 942 5 862 0 813 17 86 49 43 Alfa 1 Glicoprote na cida 0 949 0 109 0 834 0 14 2 96 Alfa 1 Antitripsina 0 879 0 109 1 117 0 40 5 31 Haptoglobina 0 969 0 743 1 614 0 32 9 87 Sensibilidad Se diluy serialmente un suero patol gico con dos prote nas monoclonales de 0 90 y 4 86 g L las muestras diluidas se analizaron a continuaci n en el sistema CAPILLARYS con el kit CAPILLARYS H
5. La soluci n de hipoclorito de sodio de 9 puede conservarse 3 meses a temperatura ambiente en un recipiente de pl stico cerrado herm ticamente protegido de la luz solar y de cualquier fuente de calor o ignici n y alejado de los cidos y el amoniaco 37 CAPILLARYS HR 2009 04 4 SOLUCION DE LAVADO CAPILLARYS Preparacion El vial de la soluci n de lavado concentrada SEBIA referencia n 2052 2 viales de 75 mL debe completarse hasta 750 mL con agua destilada o desionizada ATENCI N La soluci n de lavado contiene sosa c ustica Soluci n corrosiva Provoca quemaduras graves Cons rvela lejos del alcance de los ni os En caso de contacto con los ojos l velos inmediatamente con agua en abundancia y consulte a un especialista Qu tese inmediatamente cualquier prenda manchada o salpicada Use guantes adecuados y un sistema de protecci n ocular facial Uso Para lavar los capilares del CAPILLARYS Reactivo adicional necesario en caso de realizar series inferiores a 40 an lisis IMPORTANTE Antes de llenar el contenedor de soluci n de lavado se recomienda lavar con agua destilada o desionizada en abundancia el cuello del contenedor el conector y el tubo para evitar la acumulaci n de sales Conservaci n estabilidad y se ales de deterioro Las soluciones de lavado concentrada y diluida deben conservarse a temperatura ambiente o en nevera en contenedores cerrados para evitar la evaporaci n La soluci n concentrada es es
6. lectura de los c digos de barras de los tubos primarios hasta 8 y del cargador diluci n de las muestras a partir de los tubos primarios lavado de los capilares inyecci n de las muestras diluidas separaci n y detecci n directa de las prote nas en los capilares 38 CAPILLARYS HR 2009 04 Las etapas manuales son las siguientes colocaci n de los tubos primarios en los cargadores introducci n en el sistema CAPILLARYS recuperaci n de los cargadores despu s del an lisis LEA DETENIDAMENTE EL MANUAL DE INSTRUCCIONES DEL CAPILLARYS I PREPARACI N DEL AN LISIS ELECTROFOR TICO 1 Encienda el CAPILLARYS y el ordenador de control 2 Abra el programa de gesti n Phoresis Capillarys y valide el nivel de los reactivos tras lo cual el aparato se iniciar autom ticamente 3 Use el kit CAPILLARYS HR con el programa de an lisis CAPILLARYS HR Para saber c mo seleccionar el programa de an lisis CAPILLARYS HR y conectar el contenedor de tamp n CAPILLARYS HR al aparato lea detenidamente el manual de instrucciones del CAPILLARYS 4 El cargador de muestras posee 8 posiciones para tubos Coloque hasta 8 tubos primarios en cada cargador de forma que el c digo de barras de cada tubo quede encarado hacia la ventana de lectura del mismo IMPORTANTE Si el n mero de tubos que va a analizar es inferior a 8 complete el cargador poniendo tubos con agua destilada o desionizada a Coloque un se
7. siguiente gamma globulinas beta 2 globulinas beta 1 globulinas alfa 2 macroglobulina haptoglobina alfa 1 antitripsina alfa 1 glicoprote na cida y alb mina La identificaci n de los picos y la interpretaci n cualitativa deben hacerse respecto a un suero de referencia normal REACTIVOS SUMINISTRADOS EN EL KIT CAPILLARYS HR COMPONENTES REF N 2004 Tampon listo para usar 2 contenedores de 700 mL Soluci n de lavado soluci n concentrada 1 vial de 75 mL Segmentos de diluci n 1 bolsa de 70 Filtros 3 filtros PARA OBTENER RESULTADOS PTIMOS Los elementos de un mismo kit deben usarse conjuntamente y seg n las instrucciones suministradas LEA DETENIDAMENTE LAS HOJAS DE INSTRUCCIONES ATENCI N No use agua destilada o desionizada comercial como por ejemplo el agua para planchar riesgo de deterioro importante de los capilares Use exclusivamente agua de calidad ultrapura como el agua para inyecci n 1 TAMP N Preparaci n El tamp n est listo para usar Contiene tamp n alcalino pH 9 9 aditivos inocuos a las concentraciones usadas necesarios para un funcionamiento ptimo Uso Tamp n para el an lisis de las prote nas s ricas mediante electroforesis capilar Conservaci n estabilidad y se ales de deterioro El tamp n debe conservarse a temperatura ambiente de 15 a 30 C o en nevera entre 2 y 8 C Es estable hasta la fecha de caducidad indicada en el kit o en la etiqueta
8. ACTIVO El aparato autom tico CAPILLARYS permite una gesti n autom tica de los reactivos IMPORTANTE Es necesario seguir el procedimiento previsto para el cambio de los contenedores de reactivo si no se hace correctamente los contenedores pueden despresurizarse y los an lisis pueden verse afectados y respetar el c digo de colores contenedor conector en cada cambio de contenedor La aparici n de la ventana de gesti n de los reactivos indica que es necesario cambiar uno o varios reactivos colocar un nuevo contenedor de tamp n de an lisis y o llenar el contenedor de lavado con la soluci n de lavado reconstituida y o llenar el contenedor de limpieza con agua destilada o desionizada filtrada y o vaciar el contenedor de desechos ATENCI N No use agua destilada o desionizada comercial como por ejemplo el agua para planchar riesgo de deterioro importante de los capilares Use exclusivamente agua de calidad ultrapura como el agua para inyecci n IMPORTANTE Se recomienda lavar con agua destilada o desionizada en abundancia el contenedor de limpieza antes de llenarlo Consulte el manual de instrucciones del CAPILLARYS 39 CAPILLARYS HR 2009 04 RESULTADOS Control de calidad Se recomienda incluir una serie de an lisis con un suero control al iniciar la sesi n de trabajo Valores La detecci n directa en el capilar a 200 nm proporciona las concentraciones relativas porcentajes de cada fracci n La con
9. APICLEAN debe conservarse en nevera entre 2 y 8 C Es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta del vial NO LO CONGELE Debe estar exento de precipitados Deseche CAPICLEAN si cambia de aspecto o aparece turbidez debido a contaminaci n microbiana 3 SOLUCI N DE HIPOCLORITO DE SODIO para la limpieza de la c nula de muestras Preparaci n Prepare una soluci n de hipoclorito de sodio lej a de 9 clorom trica entre 2 y 3 de cloro a partir de una dosis concentrada de 250 mL de 36 clorom trica 9 6 de cloro diluida hasta 1 litro volumen final en agua destilada o desionizada fr a Uso Para limpiar la c nula de muestras del aparato autom tico para electroforesis capilar CAPILLARYS SEBIA mantenimiento semanal para eliminar cualquier prote na que se haya adsorbido a la c nula Consulte la hoja de instrucciones del CAPILLARYS SEBIA Use el cargador de muestras espec fico para el mantenimiento n 100 Coloque en este cargador en la posici n 1 un tubo de hem lisis que contenga 2 mL de la soluci n de hipoclorito de sodio preparada anteriormente Introduzca el cargador n 100 de mantenimiento en el sistema CAPILLARYS En el men de la ventana MANTENIMIENTO que aparece en la pantalla seleccione la opci n Iniciar la limpieza de la c nula soluci n de hipoclorito de sodio o soluci n de lavado CDT y luego confirme la selecci n Conservaci n estabilidad y se ales de deterioro
10. R Las mayores diluciones que permit an ver esas bandas monoclonales fueron respectivamente las de 1 16 y 1 32 la menor concentraci n de una banda monoclonal detectada fue pues del orden de 0 06 a 0 15 g L en esta muestra NOTA El l mite de detecci n de una paraprote na puede variar en funci n de la posici n de la banda monoclonal y del fondo policlonal de la zona de las gammaglobulinas Linealidad La t cnica CAPILLARYS HR presenta una linealidad perfecta tras analizar una mezcla con concentraciones variables de alb mina 52 g L y gammaglobulinas 31 g L 42 CAPILLARYS HR 2009 04 BIBLIOGRAPHIE BIBLIOGRAPHY Bienvenu J Les prot ines de la r action inflammatoire D finition physiologie et m thodes de dosage Ann Biol Clin 1984 42 47 52 2 Clark R et al Rapid capillary electrophoretic analysis of human serum proteins qualitative comparison with high throughput agarose gel electrophoresis J Chromatogr A 744 205 213 1996 Engler R Prot ines de la r action inflammatoire Fonctions r gulatrices Ann Biol Clin 1988 46 336 342 Frot JC Hofmann H Muller F Benazet MF Giraudet P Le concept du profil prot ique Ann Biol Clin 1984 42 1 8 5 Grant GH Silverman LM Christenson RH Amino acids and proteins Tietz NW ed Fundamentals of Clinical Chemistry 3rd edition Philadelphie WB Saunders 1987 291 345 Henskens Y et al Detection and identification of monoclon
11. ada o desionizada soluci n de limpieza Conservaci n Antes de usarlos los filtros deben conservarse en su embalaje original herm ticamente cerrado en un lugar seco a temperatura ambiente o en nevera REACTIVOS NECESARIOS NO SUMINISTRADOS 1 AGUA DESTILADA O DESIONIZADA Uso Para lavar los capilares del aparato autom tico para electroforesis capilar CAPILLARYS SEBIA Se recomienda usar agua destilada o desionizada filtrada con un filtro de porosidad lt 0 45 um Renueve el agua cada d a para evitar contaminaciones microbianas En caso de conservaci n prolongada a ada 35 pL L de ProClin 300 IMPORTANTE Antes de llenar el contenedor de agua se recomienda lavarlo con agua destilada o desionizada 2 CAPICLEAN Presentaci n El vial de la soluci n enzim tica concentrada CAPICLEAN SEBIA referencia n 2058 1 vial de 25 mL contiene enzimas proteol ticos surfactantes y aditivos inocuos a las concentraciones usadas necesarios para un funcionamiento ptimo ATENCI N La soluci n CAPICLEAN puede causar irritaci n o quemaduras cut neas oculares o de las mucosas Uso Para la limpieza semanal de los capilares y de la c nula de muestras del aparato autom tico para electroforesis capilar CAPILLARYS SEBIA Consulte la hoja de instrucciones del CAPICLEAN SEBIA IMPORTANTE No vuelva a usar el segmento de diluci n despu s de limpiar los capilares y la c nula Conservaci n estabilidad y se ales de deterioro El C
12. al gammopathies by capillary electrophoresis Clin Chem 44 1184 1190 1998 7 Jellum E et al Journal of Chromatography Biomedical Applications Diagnostic applications of chromatography and capillary electrophoresis J Chromatogr B 689 155 164 1997 8 Jenkins MA and Guerin MD Quantification of serum proteins using capillary electrophoresis Ann Clin Biochem 32 493 497 1995 9 Jenkins MA et al Evaluation of serum protein separation by capillary electrophoresis prospective analysis of 1000 specimens J Chromatogr B 672 241 251 1995 10 Jenkins MA and Guerin MD Journal of Chromatography Biomedical Applications Capillary electophoresis procedures for serum protein analysis comparison with established techniques J Chromatogr B 699 257 268 1997 11 Jenkins MA and Ratnaike S Five unusual serum protein presentations found by capillary electrophoresis in the clinical laboratory J Biochem Biophys Methods 41 31 47 1999 12 Johnson AM Alper CA Deficiency of alpha 1 antitrypsin in childhood liver disease Pediatrics 1970 46 921 925 13 Johnson AM A new international reference preparation for proteins in human serum Arch Pathol Lab Med 1993 117 29 31 14 Katzmann JA et al Identification of monoclonal proteins in serum A quantitative comparison of acetate agarose gel and capillary electrophoresis Electrophoresis 18 1775 1780 1997 15 Landers JP Clinical Capillary E
13. bos analizados se obtienen al cabo de 12 minutos Para el cargador de muestras siguiente las etapas 1 y 2 lectura de los c digos de barras y diluci n de los sueros se realizan durante la etapa 5 migraci n del cargador anterior disminuyendo el tiempo de obtenci n de resultados Drop EXTINCION 1 Inicie el ciclo de extinci n 2 Antes de validar para que comience el ciclo cambie el contenedor de tamp n CAPILLARYS HR por un nuevo contenedor que contenga agua destilada o desionizada filtrada 3 Confirme que quiere iniciar el ciclo de extinci n pulse S el ciclo de extinci n se realizar autom ticamente ll AN LISIS DE LOS RESULTADOS Desde el final del an lisis se realiza autom ticamente la cuantificaci n relativa de las fracciones y se pueden analizar los perfiles obtenidos A partir de la concentraci n de prote nas totales de la muestra se pueden calcular las concentraciones de las 4 prote nas principales siguientes alb mina orosomucoide alfa 1 antitripsina y haptoglobina Los perfiles electrofor ticos se analizan visualmente para detectar anomal as NOTA La exactitud de los valores de concentraci n de las 4 prote nas principales depender de la del valor de las prote nas totales III FIN DE LA SECUENCIA DE AN LISIS El usuario debe realizar el procedimiento de extinci n al final de la sesi n de trabajo para conservar los capilares en condiciones ptimas IV LLENADO DE LOS CONTENEDORES DE RE
14. centraci n de cada prote na se calcula a partir de estas concentraciones relativas y la concentraci n de prote nas totales Los valores normales de las 4 prote nas principales han sido establecidos a partir de una poblaci n de 111 adultos que presentan valores normales en la determinaci n nefelom trica de estas 4 prote nas CAPILLARYS HR Alb mina 60 7 71 1 34 12 49 94 g L Alfa 1 glicoprote na cida Orosomucoide 0 3 1 2 0 19 0 73 g L Alfa 1 antitripsina 1 3 2 9 0 86 2 25 g L Haptoglobina 1 5 5 6 1 12 3 79 g L Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores normales NOTA Los valores normales han sido obtenidos con los par metros de integraci n por defecto del programa alisado 0 y deriva autom tica con triangulaci n Los valores de haptoglobina indicados son el doble de los usados habitualmente pero correlacionan perfectamente con los valores obtenidos usando t cnicas de determinaci n mediante anticuerpos Interpretaci n El aumento de una o varias prote nas inflamatorias orosomucoide y haptoglobina acompa ado o no de la aparici n de un pico suplementario en la parte an dica de las gammaglobulinas PCR es indicativo de una inflamaci n Cualquier otra deformaci n del perfil respecto al normal tambi n es indicativa de una anomal a especialmente la aparici n de un pico fino suplementario en las zonas beta 1 beta 2 y gammaglobulinas Puede s
15. del vial de tamp n No conserve el tamp n cerca de una ventana o de una fuente de calor NOTA Si el tamp n de an lisis ha sido conservado a 2 8 C conviene dejar que alcance la temperatura ambiente antes de usarlo NO LO CONGELE Deseche el tamp n si cambia de aspecto o aparece turbidez debido a contaminaci n microbiana a un precipitado o a part culas en suspensi n 2 SOLUCI N DE LAVADO Preparaci n El vial de soluci n de lavado concentrada debe completarse hasta 750 mL con agua destilada o desionizada ATENCI N La soluci n de lavado contiene sosa c ustica Soluci n corrosiva Provoca quemaduras graves Cons rvela lejos del alcance de los ni os En caso de contacto con los ojos l velos inmediatamente con agua en abundancia y consulte a un especialista Qu tese inmediatamente cualquier prenda manchada o salpicada por el producto Use guantes adecuados y un sistema de protecci n ocular facial Uso Para lavar los capilares despu s de la separaci n electrofor tica de las prote nas IMPORTANTE Antes de llenar el contenedor de soluci n de lavado se recomienda lavar con agua destilada o desionizada en abundancia el cuello del contenedor el conector y el tubo para evitar la acumulaci n de sales 36 INSTRUCCIONES SEBIA Espa ol CAPILLARYS HR 2009 04 Conservaci n estabilidad y se ales de deterioro Las soluciones de lavado concentrada y diluida deben conservarse a temperatura ambiente o en nevera en co
16. gmento de diluci n nuevo en cada cargador en caso de ausencia del segmento aparecer un mensaje de advertencia 6 Introduzca el o los cargador es completo s en el sistema CAPILLARYS por el orificio de entrada situado en medio del aparato Se pueden introducir hasta trece cargadores a la vez pudi ndose a adir nuevos cargadores de forma continua a medida que se vaya completando el an lisis de los cargadores ya introducidos Cuando quiera analizar un suero control use el cargador espec fico n 0 previsto a este efecto 7 Saque de la cinta de salida situada a la izquierda del aparato los cargadores ya analizados 8 Coja con precauci n el segmento de diluci n usado y des chelo ATENCI N Manipule con cuidado los segmentos de diluci n que contengan muestras biol gicas DILUCI N MIGRACI N DESCRIPCI N DE LAS ETAPAS AUTOM TICAS Lectura de los c digos de barras de los tubos primarios de muestra y del cargador Diluci n de los sueros con el tamp n de an lisis con limpieza de la c nula de muestras entre cada diluci n Lavado de los capilares Inyecci n de las muestras diluidas en los capilares Migraci n a voltaje constante con temperatura controlada por efecto Peltier durante unos 7 minutos Lectura a 200 nm y aparici n simult nea del perfil proteico en la pantalla del ordenador NOTA Estas etapas se realizan consecutivamente para el primer cargador de muestras introducido los perfiles correspondientes a los tu
17. ha desarrollado la t cnica de la electroforesis capilar que ofrece las ventajas de una automatizaci n completa del an lisis separaciones r pidas y una buena resoluci n Se define como una t cnica de separaci n electrocin tica realizada en un tubo de di metro interno inferior a 100 um lleno de un tamp n compuesto por electrolitos Se considera una tecnolog a intermedia entre la electroforesis de zona en soporte y la cromatograf a l quida El sistema CAPILLARYS usa el principio de la electroforesis capilar en soluci n libre que representa la forma m s corriente de electroforesis capilar Permite la separaci n de mol culas cargadas en funci n de su movilidad electrofor tica propia en un tamp n de pH dado y seg n el pH del electrolito de un flujo electroendosm tico m s o menos importante El sistema CAPILLARYS posee 8 capilares en paralelo permitiendo realizar 8 an lisis simult neos En este sistema la inyecci n de las muestras en los capilares diluidas con el tamp n de an lisis se realiza en el nodo por aspiraci n La separaci n se realiza a continuaci n aplicando una diferencia de potencial de varios miles de voltios en los extremos de cada capilar La detecci n directa de las prote nas se efect a a 200 nm en el lado cat dico Los capilares se lavan a continuaci n con una soluci n de lavado y luego con el tamp n de an lisis Con el tamp n usado de pH alcalino el orden de migraci n de las prote nas s ricas es el
18. lectrophoresis Clin Chem 41 495 509 1995 16 Marshall WJ eds Plasma proteins Illustrated textbook of clinical chemistry Londres Gower Medical Publishing 1988 207 218 17 Oda RP et al Capillary electrophoresis as a clinical tool for the analysis of protein in serum and other body fluids Electrophoresis 18 1715 1723 1997 18 Romette J Les marqueurs prot iques de l inflammation et de la d nutrition Feuillets de Biologie 1987 XXVIII 156 69 73 19 Routledge PA Clinical relevance of Alpha1 Acid Glycoprotein in health and disease Baumann P eds Alpha1 Acid Glycoprotein Genetics Biochemistry Physiological Functions and Pharmacology New York AR Liss 1989 185 198 20 Schmidt K Alpha1 Acid Glycoprotein Putnam FW eds The Plasma Proteins New York Academic Press 1975 183 228 21 Silverman EK Pierce JA Province MA et al Variability of pulmonary function in alpha 1 antitrypsin deficiency Clinical correlation Ann Intern Med 1989 111 982 991 22 Wijnen PA and van Dieijen Visser M Capillary Electrophoresis of Serum Proteins Reproducibility Comparison with Agarose Gel Electrophoresis and a Review of the Literature Eur J Clin Chem Clin Biochem 34 535 545 1996 23 Wendling A Proc dures de diagnostic ou de d pistage Justification et validit d un test de diagnostic ou de d pistage sensibilit sp cificit Impact Internat Sept 93 97 1986 at Ro o
19. les durante 1 mes NOTA No conserve los sueros a temperatura ambiente Las prote nas de las muestras conservadas entre 2 y 8 C se degradan en particular el complemento C3 A partir de los 2 d as de conservaci n la degradaci n del complemento C3 provoca una deformaci n de la fracci n beta 2 con una elevaci n al lado de beta 1 y la aparici n de un pico suplementario al lado de la zona gamma que ocultar a la presencia eventual de una PCR aumentada ver PERFILES ELECTROFOR TICOS Un suero conservado unos 8 d as entre 2 y 8 C presenta una desaparici n progresiva de la fracci n beta 2 la aparici n de un pico suplementario al lado de la zona gamma que ocultar a la eventual PCR aumentada y la aparici n de una elevaci n en la fracci n beta 1 en la parte contigua a la fracci n beta 2 ver PERFILES ELECTROFOR TICOS A partir de los 8 d as de conservaci n la fracci n beta 1 se deforma totalmente ensanch ndose con aparici n de un nuevo pico al lado de la alfa 2 macroglobulina se puede observar la presencia de un pico al lado de la fracci n gamma en el lugar de la PCR y la fracci n beta 2 desaparece casi totalmente ver PERFILES ELECTROFOR TICOS Despu s de la congelaci n del suero la fracci n alfa 2 macroglobulina tiene tendencia a deformarse y disminuir Preparaci n de las muestras Use directamente muestras de suero sin diluir Despu s de conservarlos en nevera entre 2 y 8 C o congelarlos algunos suer
20. los valores medios en desviaciones t picas SD y coeficientes de variaci n CV obtenidos para las cuatro fracciones proteicas principales de los 5 sueros analizados p ALFA 1 FRACCI N ALBUMINA GLICOPROTEINA ACIDA ALFA 1 ANTITRIPSINA HAPTOGLOBINA Suero A lote n 1 lote n 2 MEDIA 58 6 58 3 1 3 1 3 2 4 2 4 5 4 5 6 SD 1 05 0 99 0 09 0 05 0 21 0 23 0 07 0 09 CV 1 8 1 7 6 8 3 6 8 9 9 4 1 3 1 6 Suero B lote n 1 lote n 2 MEDIA 50 7 50 1 2 2 2 1 4 3 4 3 10 3 10 4 SD 0 95 0 79 0 05 0 05 0 16 0 14 0 18 0 19 CV 1 9 1 6 EIER 3 7 3 2 1 8 1 9 Suero C lote n 1 lote n 2 MEDIA 62 8 62 5 0 4 0 5 25 24 2 6 2 8 SD 0 92 0 60 0 03 0 00 0 07 0 06 0 10 0 05 CV 15 1 0 8 0 0 0 29725 3 8 1 8 Suero D lote n 1 lote n 2 MEDIA 62 2 63 7 0 8 0 7 2 6 2 7 4 1 3 9 SD 0 78 0 43 0 03 0 00 0 09 0 07 0 07 0 07 CV 1 3 0 7 4 2 0 0 3 2 2 6 1 7 1 7 Suero E lote n 1 lote n 2 MEDIA 44 6 44 1 1 9 1 9 2 7 2 8 3 6 3 8 SD 0 56 0 58 0 04 0 03 0 12 0 05 0 09 0 10 CV 1 3 1 3 2 2 1 8 4 5 1 8 2 4 2 6 Reproducibilidad interserial Se analizaron ocho sueros en el sistema CAPILLARYS con el kit CAPILLARYS HR Cada suero se analiz simult neamente en los 8 capilares del sistema CAPILLARYS y el an lisis se repiti 10 veces con 3 lotes de tamp n de an lisis Se calcularo
21. n las medias desviaciones t picas SD y coeficientes de variaci n CV n 10 de las cuatro fracciones proteicas principales de cada suero para cada lote La tabla siguiente muestra los l mites de los valores medios SD y CV obtenidos para las 8 muestras analizadas y un coeficiente de variaci n medio calculado a partir de todos los coeficientes de variaci n n 24 FRACCION MEDIA SD CV CV MEDIO Alb mina 44 5 66 7 0 12 1 38 0 2 2 2 0 8 Alfa 1 Glicoprote na cida 0 4 1 8 0 00 0 06 0 0 7 6 3 9 Alfa 1 Antitripsina 2 3 3 2 0 04 0 10 1 4 3 9 2 5 Haptoglobina 2 7 7 6 0 05 0 16 0 9 4 5 2 2 Reproducibilidad interlotes Se analizaron ocho sueros en el sistema CAPILLARYS con el kit CAPILLARYS HR con 3 lotes de tamp n de an lisis Los sueros se analizaron simult neamente en los 8 capilares del sistema CAPILLARYS y el an lisis se repiti 10 veces con cada lote Se calcularon las medias desviaciones ipicas SD y coeficientes de variaci n CV n 30 de cada suero y de las cuatro fracciones proteicas principales La tabla siguiente muestra los l mites de los valores medios SD y CV obtenidos para las 8 muestras analizadas con los 3 lotes de tamp n de an lisis y un coeficiente de variaci n medio calculado a partir de todos los coeficientes de variaci n n 3 FRACCION MEDIA SD CV CV MEDIO Alb mina 45 0 66 2 0 39 1 25 0 6 2 0 1 3
22. ntenedores cerrados para evitar la evaporaci n La soluci n concentrada es estable hasta la fecha de caducidad indicada en el kit o en la etiqueta del vial de soluci n de lavado La soluci n diluida es estable durante 3 meses Deseche la soluci n de lavado diluida si cambia de aspecto o aparece turbidez debido a contaminaci n microbiana 3 SEGMENTOS DE DILUCI N Uso Segmentos de diluci n de un solo uso para que el aparato realice la diluci n de las muestras de suero Deben colocarse en el cargador de muestras ATENCI N Manipule con precauci n los segmentos de diluci n que contengan muestras biol gicas 4 FILTROS Uso Filtros de un solo uso para el filtrado del tamp n de la soluci n de lavado reconstituida y del agua destilada o desionizada usada para la limpieza de los capilares IMPORTANTE Cambie sistem ticamente los tres filtros al empezar un kit nuevo Enrosque un filtro al final de cada tubo que cuelga de los tapones de los contenedores de tamp n soluci n de lavado y agua destilada o desionizada Al cambiar los filtros lave los contenedores y los tubos con agua destilada o desionizada Los filtros usados tambi n deben lavarse con agua antes de su eliminaci n El filtro destinado al tamp n de an lisis debe usarse para la filtraci n de la totalidad de los dos contenedores de tamp n listo para usar los otros dos filtros est n destinados a la filtraci n de la soluci n de lavado reconstituida y del agua destil
23. os especialmente aquellos que contienen una crioglobulina o un criogel se vuelven viscosos o turbios Una vez que hayan alcanzado el estado l quido estos sueros pueden analizarse directamente Igualmente los sueros que contengan una inmunoglobulina polimerizada pueden analizarse directamente sin ning n tratamiento previo Se recomienda observar el aspecto del suero antes del an lisis por si hay hem lisis presencia de crioglobulinas o turbidez Muestras a descartar No use muestras hemolizadas La hem lisis comporta la formaci n de un complejo hemoglobina haptoglobina que provoca el desplazamiento de la fracci n haptoglobina hacia la alfa 2 macroglobulina Este fen meno es visible incluso en muestras hemolizadas muy d bilmente y en algunos casos la cuantificaci n de esta fracci n ya no es posible No use muestras de suero antiguas o mal conservadas ya que las fracciones beta 1 y beta 2 estar n muy modificadas No use muestras de plasma El fibrin geno migra justo antes de la fracci n beta 2 en la posici n de la PCR su presencia en algunas muestras plasma suero mal defibrinado o suero de paciente bajo tratamiento anticoagulante puede falsear la interpretaci n del an lisis confusi n con un aumento de la PCR PROCEDIMIENTO El sistema CAPILLARYS es un instrumento multiparam trico autom tico que permite realizar el an lisis de las prote nas s ricas en 8 capilares en paralelo seg n las etapas siguientes
24. ospecharse la presencia de un componente monoclonal en el suero si el mensaje de alerta siguiente aparece en pantalla Warning Migration centering is out of range o si el perfil proteico est retardado o deformado Para confirmar la presencia de un componente monoclonal en la muestra ser necesario realizar un tratamiento reductor con beta mercaptoetanol y repetir el an lisis tras el mismo En este caso prepare una soluci n reductora a adiendo un 1 de beta mercaptoetanol al Fluidil SEBIA referencia n 4587 1 vial de 5 mL Estando el sistema CAPILLARYS preparado para analizar muestras a ada 100 pL de soluci n reductora a 300 pL de suero puro Agite en el v rtex y deje que incube durante 15 minutos como m ximo y luego siga con el procedimiento habitual IMPORTANTE Despu s del tratamiento reductor con beta mercaptoetanol la muestra debe ser analizada inmediatamente no debe haber ning n otro cargador en espera de ser analizado en el sistema CAPILLARYS Cualquier aspecto monoclonal u oligoclonal debe confirmarse usando el kit de inmunotipado SEBIA CAPILLARYS IMMUNOTYPING o los kits de inmunofijaci n SEBIA HYDRAGEL IF Consulte la BIBLIOGRAF A si desea obtener informaci n complementaria sobre la interpretaci n de los perfiles obtenidos Zonas alfa La posici n del pico de haptoglobina en el perfil electrofor tico es variable dependiendo del fenotipo de haptoglobina que migra entre las fracciones alfa 1 antitri
25. psina y alfa 2 macroglobulina Si la haptoglobina est muy disminuida en un s ndrome hemol tico por ejemplo su pico no ser identificado autom ticamente en la t cnica CAPILLARYS HR Ser entonces necesario delimitar manualmente la fracci n haptoglobina Igualmente tambi n ser necesario delimitar manualmente la fracci n orosomucoide cuando la concentraci n de esta prote na en el suero analizado sea muy baja o cuando est cerca de la alfa 1 antitripsina Zonas beta El complemento C4 migra entre las fracciones beta 1 y beta 2 la PCR migra en la zona gamma justo antes de la fracci n beta 2 y se detecta a partir de unos 30 mg L en suero fresco ver PERFILES ELECTROFOR TICOS La hemopexina puede aparecer como una elevaci n m s o menos importante en la base de la beta 1 al lado de la alfa 2 macroglobulina ver PERFILES ELECTROFOR TICOS Las beta lipoprote nas pueden formar un peque o pico entre las fracciones alfa 2 macroglobulina y beta 1 ver PERFILES ELECTROFORETICOS Si las fracciones hemopexina y beta lipoprote nas est n muy aumentadas se detectar n como picos individuales suplementarios en la t cnica CAPILLARYS HR Interferencias y limitaciones Ver MUESTRAS PARA EL AN LISIS Teniendo en cuenta los principios anal ticos de las t cnicas actuales principios de la electroforesis de zona resoluci n y sensibilidad no hay garant as en cuanto a la detecci n total de todos los componentes monoclonales
26. table hasta la fecha de caducidad indicada en el kit o en la etiqueta del vial La soluci n diluida es estable durante 3 meses Deseche la soluci n de lavado diluida si cambia de aspecto o aparece turbidez debido a contaminaci n microbiana EQUIPAMIENTO Y ACCESORIOS NECESARIOS 1 Sistema de electroforesis capilar CAPILLARYS SEBIA referencia n 1220 6 n 1222 2 Cargadores de muestras suministrados con el sistema CAPILLARYS 3 Contenedores de pl stico suministrados con el sistema CAPILLARYS contenedor para la limpieza de los capilares debe llenarse con agua destilada o desionizada contenedor de soluci n de lavado y contenedor de desechos MUESTRAS PARA EL AN LISIS Extracci n y conservaci n de las muestras El an lisis se hace con sueros frescos Los sueros deben obtenerse de acuerdo con los procedimientos establecidos de uso en el laboratorio cl nico Las muestras pueden conservarse un maximo de 2 dias en nevera entre 2 y 8 C sin ninguna degradaci n aparente del complemento C3 Despu s de 2 d as de conservaci n a 2 8 C la degradaci n del complemento C3 afecta progresivamente a las zonas beta 1 y beta 2 y a la parte de la zona gamma contigua a beta 2 el resto de fracciones permanecen inalteradas hasta los 10 dias de conservaci n a 2 8 C Para conservaciones m s prolongadas congele r pidamente las muestras como m ximo durante las 8 horas siguientes a su obtenci n Los sueros congelados son estab
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