Protocolo - Comercial Rafer
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1. c 666 Mg Donde Peak es el tama o en pares de bases de un producto dado co es un factor de correcci n del tama o y mo es el factor de correcci n de la movilidad para cada repetici n CGG El factor de correcci n de tama o representa la regi n com n del ADN incluida en los cebadores pero omitiendo las repeticiones CGG El factor de movilidad representa la movilidad aparente de cada unidad de repetici n Los amplicones que contienen CGG tendr n factores de correcci n ligeramente diferentes dependiendo de las condiciones espec ficas de la ejecuci n y de la configuraci n del instrumento que se est utilizando En la Tabla 10 se muestran los factores de correcci n para las configuraciones soportadas Tabla 10 Factores de correcci n de tama o y movilidad para configuraciones de instrumentos est ndar P gina 18 de 30 configuraci n a ma 3730 3730x 50 cm 231 9 2 937 3500 3500xL 50cm 232 6 2 962 No est n validados factores de correcci n para otros instrumentos longitudes de capilar tipos de pol mero y condiciones de ensayo pero pueden determinarse utilizando los procedimientos descritos en el procedimiento de calibraci n p gina 12 Parte Il Interpretaci n y notificaci n de los resultados Los alelos se describen como repeticiones de n mero entero asociadas a una categor a de genotipo espec fica normales intermedios con premutaci n con mutaci n completa y mosaico con mutaci n comple2. C durante 10 min Siga el manual de instrucciones del termociclador para a adir 20 segundos de extensi n por ciclo en este paso 10 Transfiera los productos de PCR para el an lisis por EC o almac nelos a una temperatura comprendida entre 15 C y 30 C hasta que se proceda al an lisis La estabilidad del producto de PCR a una temperatura comprendida entre 15 C y 30 C se ha verificado para un almacenamiento de hasta 10 d as Electroforesis capilar con POP 7 1 Descongele la formamida Hi Di y el marcador ROX 1000 a temperatura ambiente Agite bien en vortex 15 segundos y centrifugue los tubos antes de su uso 2 Prepare una soluci n de mezcla maestra a adiendo los componentes en el orden siguiente Formamida Hi Di 11 ul Marcador ROX 1000 2 ul Volumen total por pocillo 13 pl 3 Mezcle todos los reactivos a adidos agitando en v rtex por pulsos de tres a cinco veces y centrifugue brevemente para recogerlos en el fondo del tubo 4 Distribuya en al cuotas de 13 0 ul la soluci n de formamida Hi Di ROX en cada pocillo de una nueva placa de an lisis por EC Importante Las muestras deben coincidir con la configuraci n de la inyecci n en el analizador gen tico por ejemplo A1 H2 A3 H4 A11 H12 en los grupos apropiados de 8 16 o 24 capilares Si se ejecutan menos muestras del n mero predeterminado para cualquier grupo de inyecci n rellene los pocillos vac os sujetos a inyecci n con 15 ul de formami
3. 3130x y 3500xL En el centro 2 se prepararon cuatro r plicas de PCR y se analizaron en un 3130x En el centro 3 se prepararon cinco r plicas de PCR y se analizaron usando un 3500xL As se gener un total de 11 r plicas para cada resultado de alelo utilizando un 3500xL y se recogi P gina 25 de 30 un total de 12 r plicas para cada alelo usando un 3130x Independientemente de la serie el centro o el instrumento se obtuvo la misma longitud de repeticiones CGG para los alelos 20 29 31 54 y 119 La nica diferencia en la longitud de repeticiones medida fue de 1 CGG para el alelo 199 en el 3130x y de 2 CGG para el alelo 199 en el 3500xL ambos se encontraron dentro del rango esperado en esta longitud de repeticiones Estos resultados se corresponden con una coincidencia del 100 entre todas las observaciones de distintos laboratorios para identificar alelos normales intermedios o con premutaci n Tabla 16 Tabla 16 Resumen de la reproducibilidad del m todo entre laboratorios para determinar la longitud de repeticiones CGG Insramento __Caractersica 20066 29 666 31 066 sa cea 119066 199060 ai Le a ze te He 3130x Porcentaje de acuerdo 100 100 100 100 100 CGG minima 20 29 31 54 119 Pernia rs ds i 3500xI Porcentaje de acuerdo 100 100 100 100 100 CGG m nima 20 29 31 54 119 e Interferencia La bibliograf a cient fica ha documentado que sustancias end genas y ex genas contenidas e
4. 7 d as para un total de 8 series de PCR Cada serie de PCR const de 7 r plicas para 6 alelos en el rango de medici n 20 29 31 54 119 y 199 y 9 r plicas para un alelo con mutaci n completa 940 CGG para un total de 51 P gina 24 de 30 productos de PCR espec ficos del alelo por serie Todos los productos de PCR se analizaron en dos instrumentos de EC distintos 3130x o 3500xL As se gener un total de 8 x 51 x 2 816 resultados de alelos Independientemente de la serie el d a el usuario o el instrumento se obtuvo la misma longitud de repeticiones CGG para los alelos 20 29 y 31 La diferencia m xima en la longitud de repeticiones medida fue de 1 CGG para los alelos 54 y 119 y de 2 CGG para el alelo 199 Todos los alelos con mutaci n completa se clasificaron en la categoria gt 200 CGG Estos resultados se corresponden con una coincidencia del 100 entre todas las observaciones para identificar alelos normales intermedios con premutaci n o con mutaci n completa dentro de la precisi n del m todo Tabla 14 En la Tabla 15 se incluye tambi n una estimaci n de la precisi n para los tama os de productos de la PCR correspondientes medidos en pares de base por cada instrumento Las desviaciones est ndar se calcularon utilizando todos los datos observados para cada alelo antes del c lculo de la longitud de repeticiones CGG usando los factores de conversi n espec ficos del instrumento correspondientes consulte la parte d
5. de referencia emitido por la Sociedad Europea de Gen tica Humana ESHG y aprobados como Est ndar Internacional por la OMS El panel consta de cinco muestras de ADN gen mico Figura 11 Electroferogramas del panel internacional del X fr gil de la OMS NIBSC n 2 08 158 do 300 a 340 sit ra aj 34 1040 1140 07 120 Normal Mujer 07 122 Premutaci n Mujer 127 136 i 07 168 Mutacion completa gt 200 Mujer 07 170 Mutacion completa Hombre lato 07 174 Premutacion Hombre 88 97 IMM 128 Tabla 11 se presenta un resumen de los principales picos detectados y una comparacion con los rangos de resultados y los tama os medios de estos materiales de referencia Los resultados del kit AmplideX FMR1 PCR coincidieron en los dos centros y tambi n con los resultados publicados de 27 centros europeos que utilizaron diversas metodolog as de PCR para FMR1 P gina 20 de 30 Tabla 11 Resumen de los resultados del panel X fr gil de la OMS n mero de repeticiones CGG en 2 centros Est ndares de la OMS y resultados de evaluaci n Resultados del kit AmplideX internacional 19 FMR1 PCR muestra muestra ad 19 24 22 22 22 e 30 36 33 34 34 Mujer mutaci n 33 41 38 39 39 i 300 401 m st ie m e 07 1748 Hombre Hombre premutaci n 97 127 127 112 112 119 112 112 119 Tambi n pueden utilizarse como controles muestras de ADN de l nea celular bien caracterizadas procedentes del Cor
6. espec fico del instrumento se seleccionan autom ticamente Los picos de intensidad baja o m nima pueden seleccionarse manualmente seg n las directrices especificadas en la Tabla 8 Tabla 8 L mites predeterminados en la intensidad de la se al y rangos de pico bajos para las diferentes configuraciones del instrumento de EC 3130 3130x 10 49 rfu 3730 3730x 175 rfu 50 174 rfu 3500 3500xL 175 rfu 50 174 rfu d Tras deseleccionar los picos en todas las muestras identifique los picos de productos de longitud completa espec ficos para cada regi n del electroferograma utilizando las directrices de la Tabla 9 i Los picos de intensidad de se al m s baja pueden identificarse si est n en el rango de pico bajo li Elimine los picos extra de la muestra o los picos con morfolog a de repetici n no CGG P gina 16 de 30 Tabla 9 Directrices de selecci n de picos basadas en el rango de tama o y en las caracter sticas Los gr ficos de ejemplo se muestran en la secci n de interpretaci n de los datos Si el tama o del pico se O tiene estas encuentra en caracteristicas este rango Alelos normales 45 4 aa e intermedios Alelos con premutacion con un solo conjunto de picos y con menos de 8 picos desde el centro al extremo 400 820 pb Alelos con premutacion con distribuciones complejas de picos Entonces siga estas directrices para los picos que superan el l mite de se al del inst
7. las condiciones del ensayo utilizadas y pueden variar ligeramente de un laboratorio a otro Esta secci n describe c mo determinar un factor de conversi n espec fico del laboratorio utilizando el tama o en pares de bases de los amplicones de alelos de un control agrupado de l neas celulares Este control tambi n puede usarse como un control de la carrera de rutina con cada serie de PCR El control agrupado se prepara mezclando 4 moldes de ADN de l neas celulares disponibles comercialmente consulte http ccr coriell org Prepare las diluciones de cada ADN de l nea celular de Coriell en Tris 10 mM EDTA 0 5 mM pH 8 8 y combine tal como se muestra en la Tabla 6 que se incluye a continuaci n P gina 12 de 30 Tabla 6 Formulaci n del control agrupado utilizando ADN de 4 l neas celulares del CCR N mero de Repeticiones indicadas Longitud de repeticiones CGG por Concentraci n final MOTTA en el METER _ NA20239 20 183 193 183 193 20 199 199 10 ng ul NA07541 29 31 29 31 5 ng pl Los t rminos para co y mo se derivan de un acoplamiento lineal de la longitud de repeticiones CGG esperada y del tama o en pares de bases para los primeros cinco picos de los alelos del control agrupado a saber los alelos de 20 29 31 54 y 119 CGG El alelo 199 CGG no se utiliza para este gr fico ya que su longitud no se ha verificado por secuenciaci n Para calcular factores de conversi n espec ficos siga estos pasos 1 Anal
8. Asuracen MANI Kit AmplideX FMR1 PCR Instrucciones de uso nicamente para exportaci n Asuragen Inc Emergo Europe 2170 Woodward St Molenstraat 15 eal Austin TX 78744 1840 REP 2513 BH EE UU La Haya Pa ses Bajos 1 512 681 5200 31 70 345 8570 Eine gultige Version dieser Gebrauchsanweisungen auf Deutsch kann kostenlos erhalten werden sich mit Ihrem lokalen Verteiler in Verbindung setzend Une version valide de ces instructions d utilisation en francais peut tre obtenue gratuitement en contactant votre distributeur local Una version valida de estas instrucciones para uso en espanol puede ser obtenida gratuitamente al ponerse en contacto con su distribuidor local Umaversao valida dessasinstrucdes de uso emportugu s pode ser obtida gratuitamente ao contacto com o seu representante local Una versione valida di queste istruzioni per l uso in italiano pu essere gratuitamente ottenuta contattando il suo distributore locale Een geldige versie van de gebruiksaanwijzingen in het Nederlands kan gratis verkregen worden door uw plaatselijke vertegenwoordiger te contacteren PC 0164ESv5a Fecha de entrada en vigor 2012 07 P gina 1 de 30 ndice MACACO re 3 LE Gre O pe Lo cop CPE O COPIA pr nne reo arta i Urn er Pee RIO eR oR en nee ACE eee eee en cen ee ee ee 3 PHBCIDIO dela PUEDA a A EA evant aaa See aad A 5 Componentes delia AA A AA EA 7 Reactivos SUINIMISTFADOS CON Ol des 7 Manipulacion y CONSE
9. Diagnosis Treatment and Research 3rd ed 2002 Baltimore The Johns Hopkins University Press 3 109 15 Saluto A et al An enhanced polymerase chain reaction assay to detect pre and full mutation alleles of the fragile X mental retardation 1 gene J Mol Diagn 2005 7 5 p 605 12 16 Ulfelder K J and B R McCord The separation of DNA by Capillary Electrophoresis in Handbook of Capillary Electrophoresis J P Landers Editor 1997 CRC Press LLC Salem p 347 378 17 Chen L et al An information rich CGG repeat primed PCR that detects the full range of fragile X expanded alleles and minimizes the need for southern blot analysis J Mol Diagn 2010 12 5 p 589 600 18 Amos Wilson J et al Consensus Characterization of 16 FMR1 Reference Materials A Consortium Study J Mol Diagn 2008 10 1 p 2 12 Pagina 28 de 30 19 Hawkins M et al Preparation and validation of the first WHO international genetic reference panel for Fragile X syndrome Eur J Hum Genet 2010 20 Chastain P D 2nd et al Anomalous rapid electrophoretic mobility of DNA containing triplet repeats associated with human disease genes Biochemistry 1995 34 49 p 16125 31 21 Kiba Y L Zhang and Y Baba Anomalously fast migration of triplet repeat DNA in capillary electrophoresis with linear polymer solution Electrophoresis 2003 24 3 p 452 7 22 Sherman S B A Pletcher and D A Driscoll Fragile X syndrome diagnostic and c
10. NVACIOM e O a Guice 7 N mero dere acciones ti AA 7 Estabilidad delos e activos Ad 7 CallbracdioresY CONTO Statistical oct ici sacuoeaeieke 7 Reactivos requeridos pero no SUMINISTFAGOS cccccesecccssscccenececenececenceceesececeuececeeceeencessueecesseeeeensetsencessuneeeeees 7 Otros componentes suministrados CON este Kit cccccssecccsseccccsscccesecccenececensecceenceseecessececeeseeesecesseecessuecessuaess 8 Consumibles y equipos requeridos pero no suministrados ccoooccccncnncnnccnnonarononanonononnnnaronnonarononornnnaronnnnaronenanoss 8 Advertencias Y precauciones essssessseessrrersreresrevsetesrtrosttrostttstttes ttrt tst ttos ttes tt Setter Ees EE SSE ESE EESE E Sree Etres nbarteeredeees 8 Pasos previosalanali i nanena a a 9 Protocolo GeLKiIE Ample FIVIRE POR ota DOES 9 Descripcion blas 9 Configuraci n de la mezcla maestra de PCR y programa t rmico cccccccesecccccessececaesecccseeccceceeecceseuecessunecets 9 Electrotoresis capilar COM POP 7 mentana a A os 11 Analisis del tamano delos fragment OS a a A 12 Procedimiento de calibracion a ae 12 Procedimiento de CONTO da 14 Procedimiento Orma H OO PR ICO OP oo Po E PO E A tn asveden ce eabtak 14 Interoretaci n ad SlOs bel O S seen ane tne een een ee en eee ae Cen me tr dis edo nodo atlas 18 Descripcion general aria a 18 Parte C lculo de la longitud de repeticiones CGG cccooccccncnnccnnnnonacnnnonanonnonanonnnnonaronnonanonnnnononnnnnnnornnenanono
11. PCR con cebadores repetidos RP CGG El cebador CGG FMR1 es espec fico de las repeticiones CGG y no se hibrida con las secuencias AGG que se suelen encontrar en los alelos del FMR1 Por lo tanto las interrupciones en la intensidad de la se al del perfil de la PCR con cebadores repetidos RP CGG corresponden a la presencia del AGG intercalado Se piensa que las interrupciones AGG confieren estabilidad al ADN y reducen el riesgo de expansi n en la generaci n siguiente 10 13 La Figura 14 siguiente muestra un ejemplo representativo con 2 muestras de longitud casi id ntica un alelo 30 60 y uno 31 61 Figura 14 Electroferogramas que comparan una muestra de 30 60 CGG con AGG en ambos alelos arriba frente a una muestra de longitud similar 31 61 CGG con AGG solamente en el alelo 31 CGG abajo El alelo 61 CGG no tiene interrupciones AGG 30 CGG o465 CGG AGG CGG 60 0664466 066 466 0G6G ho eK 31 CGG oAGG CGG AGG CGG il me c G 31 61 i m AGG M po lIl AGG i en I A ul nM iol L A A A El perfil de picos de la PCR con cebadores repetidos RP CGG mostr 4 AGG para la primera muestra y solamente 2 AGG para la segunda muestra Bas ndose en el recuento de picos y en la inferencia de haplotipos para la localizaci n de las secuencias AGG 24 25 es posible deducir en muchos casos el patr n exacto de repeticiones CGG y de interrupciones AGG incluso en muestra
12. POI una de las causas principales de las disfunciones ov ricas en mujeres 5 y s ndrome de temblor ataxia asociado al X fr gil FX TAS que se relaciona principalmente con la enfermedad de Parkinson o con la demencia en varones portadores de la premutaci n mayores de 50 a os Los fenotipos de la premutaci n se asocian a un exceso del ARN mensajero y en consecuencia a una toxicidad del ARN y a un trastorno en la regulaci n de numerosas prote nas 6 En muchos ni os con alelos con la premutaci n del FWR1 tambi n se han encontrado deficiencias en el desarrollo sobre todo en lo que respecta a la atenci n y la comunicaci n social 7 De esta forma el s ndrome del X fr gil y sus trastornos asociados afectan a un amplio espectro de individuos de todas las edades y de numerosas condiciones mentales y de salud Las pruebas del s ndrome del X fr gil solamente deben realizarse despu s de un asesoramiento exhaustivo y con el consentimiento informado del paciente al que se le vayan a hacer Evaluaci n del riesgo La evaluaci n del riesgo y la interpretaci n cl nica del FXS y de los trastornos relacionados se determinan por el n mero de repeticiones CGG y por el estado de metilaci n del gen Seg n el n mero de repeticiones CGG se distinguen cuatro tipos de alelos alelos no afectados o normales alelos intermedios tambi n llamados alelos en zona gris alelos con premutaci n y alelos con mutaci n completa gt 200 CGG En la F
13. Tabla 18 se resume el rendimiento de la prueba para la clasificaci n precisa de alelos con mutaci n completa Tabla 18 Resumen del rendimiento del kit para la detecci n de alelos con mutaci n completa en comparaci n con el m todo de Southern blot Positivos gt 200 CGG Negativos lt 200 CGG a PCR EA EA 122 124 e ur Estas dos muestras presentaron alelos con premutaci n con ambos m todos mientras que los alelos con mutaci n completa de baja intensidad solamente pudieron detectarse con el kit AmplideX FMR1 PCR 23 Negativos Positivos Positivos 74 La sensibilidad diagn stica fue del 100 95 Cl 94 9 100 la especificidad diagn stica fue del 98 4 95 Cl 94 3 99 6 y la exactitud global fue del 99 95 Cl 96 4 99 7 Aviso al comprador 1 Este producto est indicado para uso diagn stico in vitro 2 El kit para diagn stico in vitro AmplideX FIMR1 PCR con la marca CE se fabrica en EE UU nicamente para su exportaci n No est permitida su reintroducci n en EE UU 3 Este producto no puede revenderse modificarse para su reventa ni utilizarse para fabricar productos comerciales sin la aprobaci n por escrito de Asuragen 4 Amplidex es una marca registrada de Asuragen Inc 5 Este producto est cubierto por la patente estadounidense n mero 6 270 962 y por las patentes relacionadas emitidas o pendientes concedidas bajo licencia a Asuragen Inc por EPICENTRE Technol
14. Tabla 5 Ajustes relativos a la inyecci n y al tiempo de carrera de los protocolos predeterminados de an lisis de fragmentos para diferentes clases de instrumentos y longitudes de capilar que ejecutan el pol mero POP 7 3130 3130x 2 5 kV 205 2 400 s 3730 3730x 2 5 kV 20 s 4 200 s 3500 3500xL 2 5 kV 20 s 2 400 s 9 Despu s de la ejecuci n los datos pueden analizarse para ver el tama o del amplicon y realizar la conversion a numero de repeticiones CGG Analisis del tamano de los fragmentos El an lisis del tama o de los fragmentos de la PCR espec fica o con cebadores repetidos RP CGG implica una serie de pasos para obtener el tama o de picos de producto de longitud completa as como para identificar las caracter sticas de la carrera para la correcta interpretaci n de los datos Los resultados se convierten en longitud de repeticiones CGG tal como se describe en la secci n de interpretaci n de los datos El an lisis del tama o de los fragmentos de la PCR espec fica o con cebadores repetidos RP CGG se realiza utilizando GeneMapper 4 0 4 1 Para obtener instrucciones detalladas consulte el procedimiento inform tico p gina 14 Procedimiento de calibraci n Procedimiento de calibraci n utilizado para determinar los factores de correcci n de tama o y movilidad Los factores de correcci n de tama o co y movilidad mo dependen del instrumento as como del tipo de pol mero de la longitud del capilar y de
15. X FMR1 PCR Descripci n general El protocolo de la prueba implica tres series clave de procedimientos 1 Configuraci n de la mezcla maestra de la PCR y procesamiento en termociclador 2 Electroforesis capilar 3 An lisis del tama o de los fragmentos Las instrucciones que se incluyen a continuaci n est n concebidas para la preparaci n y el an lisis de productos de la PCR espec fica o la PCR con cebadores repetidos RP CGG Solo hay dos diferencias en el protocolo preparaci n de las mezclas maestras de PCR con o sin el cebador CGG del FMR1 y las diferentes condiciones del ciclo El protocolo est concebido para una sola reacci n las mezclas maestras pueden prepararse para el n mero apropiado de reacciones en cada paso del protocolo Los reactivos suministrados son suficientes para un total de 100 reacciones ejecutadas en hasta cuatro sesiones independientes incluido un 10 de excedente para la preparaci n de reacciones adicionales por ejemplo una serie con 100 reacciones o cuatro series con 25 reacciones El n mero m nimo de reacciones por sesi n es 16 y no se admiten m s de cuatro ciclos de congelaci n y descongelaci n En la Tabla 2 se incluyen ejemplos del excedente recomendado para un n mero de muestras dado Tabla 2 Ejemplos de configuraci n de la mezcla maestra para la PCR Excedente recomendado El flujo de trabajo debe desarrollarse de manera unidireccional comenzando en un rea de pre amplificaci n y mov
16. a debe agitarse en v rtex antes de dispensarla para garantizar una mezcla adecuada de todos los reactivos 4 Dispense 13 0 ul de mezcla maestra en cada pocillo o tubo Utilice una pipeta repetidora si dispone de ella Cambie la punta de la pipeta al comienzo de cada columna de la placa si est usando una pipeta est ndar 5 A ada 2 0 ul de la muestra de ADN apropiada en cada pocillo Pipetee hacia arriba hacia abajo al menos dos veces para garantizar una mezcla correcta 6 Selle la placa con pel cula adhesiva aseg rese de que todos los pocillos y bordes de la placa est n cerrados herm ticamente 7 Agite en vortex la placa con suavidad 8 Centrifugue la placa para eliminar las burbujas que pudiera haber 1 minuto a 1 600 rcf Importante Aseg rese de que todas las burbujas se han eliminado de los pocillos 9 Transfiera la placa de PCR cerrada herm ticamente a un termociclador preprogramado y ejecute el protocolo de ciclo apropiado de la Tabla 4 P gina 10 de 30 Tabla 4 Protocolos de termocicladores PCR espec fica PCR con cebadores repetidos RP CGG Descripci n Duraci n Descripci n Duraci n gt 98 C durante ee ces 97 C durante 35 seg 97 C durante 35 seg 25 ciclos 10 ciclos 62 C durante 35 seg 35 seg 72 C durante 4 min Extension decile cui 97 C durante 35 seg 10 min 20 ciclos 68 Cdurante Amin C 68 Cdurante Amin 4 min 68 C some 4 min 20 ee 72
17. a todas las muestras Identifique todas las irregularidades en el acoplamiento o cualquier pico que falte en el marcador Atenci n Las muestras sin un marcador correctamente procesado deben excluirse de los an lisis posteriores Nota Puede observarse un pico espectral ascendente desde el canal FAM Por lo general este pico no interferir en los tama os del marcador Pueden observarse picos dobles por ejemplo 90 y 151 que no interfieren con la funci n del marcador En la Figura 6 se muestra un ejemplo de los picos con los distintos tama os del marcador ROX 1000 y de la curva de coincidencias Figura 6 Picos con tama os asignados Size Matches y Curva de coincidencia de tama os Size Calling Curve para el ROX 1000 La vista de Size Matches resalta los 21 picos del marcador e incluye un ejemplo de pico ascendente espectral procedente del canal FAM que deber a ignorarse en el canal ROX Size Matches Size Calling Curve 1007 902 179 y 739 799 19991051 151 182 01 674 739 79 Best Fit Second Order Curve A0 14 953063196652298 Al 0 03090053078 2725014 At 9 098440766608 6855E 6 R 2 0 9976334007 b Revise los controles de la sesi n i Aseg rese de que el control negativo incluido en la carrera cumple las especificaciones ii Asimismo aseg rese de que los controles positivos cumplen tambi n las especificaciones correspondientes Consulte ejemplos de los controles en la secci n de interpretaci n de los dato
18. arrier testing Genet Med 2005 7 8 p 584 7 23 Filipovic Sadic S et al A novel FMR1 PCR method for the routine detection of low abundance expanded alleles and full mutations in fragile X syndrome Clin Chem 2010 56 3 p 399 408 24 Poon P M et al AGG interspersion analysis of the FMR1 CGG repeats in mental retardation of unspecific cause Clin Biochem 2006 39 3 p 244 8 25 Eichler E E et al Haplotype and interspersion analysis of the FMR1 CGG repeat identifies two different mutational pathways for the origin of the fragile X syndrome Hum Mol Genet 1996 5 3 p 319 30 26 Spector E B Standards and Guidelines for Clinical Genetics Laboratories American College of Medical Genetics 2006 27 Macpherson J and H Sawyer Practice Guidelines for Molecular Diagnosis of Fragile X Syndrome Clinical Molecular Genetics Society 2005 cited 2011 February http www cmgs org BPGs pdfs 20current 20bpgs Fragile 20X pdf 28 Wiedbrauk D L J C Werner and A M Drevon Inhibition of PCR by aqueous and vitreous fluids J Clin Microbiol 1995 33 10 p 2643 6 29 Panaccio M and A Lew PCR based diagnosis in the presence of 8 v v blood Nucleic Acids Res 1991 19 5 p 1151 30 Boom R et al Rapid and simple method for purification of nucleic acids J Clin Microbiol 1990 28 3 p 495 503 Ap ndice A Glosario de s mbolos Simbolo Descripci n El Fecha de caducidad OOOO a rabricacop
19. con mutaci n completa m s grandes y alelos con mutaci n completa del grupo de picos que fe contenga el pico mas alto Deseleccione otros picos dentro de este grupo Identifique los picos como gt 200 CGG Interpretaci n de los datos Descripci n general La interpretaci n de los datos incluye tres conjuntos de informaci n 1 El c lculo de la longitud de repeticiones CGG 2 Interpretaci n y notificaci n de los resultados de las pruebas 3 Caracter sticas especiales de los resultados de los ensayos Parte C lculo de la longitud de repeticiones CGG Conversi n del tama o del pico en la longitud de repeticiones CGG Despu s de la electroforesis capilar el tama o del amplic n diana se deriva de la comparaci n con un est ndar de tama o coinyectado como puede ser un marcador ROX 1000 No obstante los productos de PCR de las regiones de repetici n del triplete tienen una migraci n anormalmente m s r pida que el ADN gen rico del est ndar de tama o 20 21 Esta mayor rapidez en la migraci n atribuida a la estructura del ADN rico en GC puede dar lugar a una longitud de repeticiones m s corta si no se utiliza un factor de correcci n apropiado El kit AmplideX FMR1 PCR incorpora dos factores de correcci n para convertir el tama o en pares de bases en el n mero de repeticiones CGG de cada alelo El tama o de cada pico se convierte en longitud de repeticiones seg n la Ecuaci n Ecuaci n 1 Peak
20. da Hi Di 5 Transfiera 2 ul de productos PCR a la placa de EC y pipetee arriba y abajo de 2 a 3 veces para mezclar bien Se recomienda una pipeta multicanal para la transferencia 6 Cierre herm ticamente la placa agite en v rtex centrifugue para eliminar las burbujas y transfiera a un termociclador P gina 11 de 30 7 Desnaturalice durante 2 min a 95 C seguido de 4 C hasta que est listo para la inyecci n en el instrumento de EC Si se desea los productos tambi n pueden conservarse en hielo y protegerse de la luz despu s del paso de desnaturalizaci n Atenci n Las muestras deben desnaturalizarse antes del an lisis por EC Nota Las muestras pueden ejecutarse hasta 24 horas despu s de la desnaturalizaci n 8 Prepare el analizador gen tico para la adquisici n de datos seg n las instrucciones del fabricante La inyecci n final y las condiciones de carrera deben ser validadas por el usuario final y pueden diferir entre instrumentos Se aplican las siguientes consideraciones e Elinstrumento debe estar calibrado para la detecci n de los colorantes fluorescentes FAM y ROX e Use el protocolo de an lisis de fragmentos instalado de f brica para el pol mero POP 7 y la longitud capilar de su instrumento como protocolo base e Ajuste las condiciones de inyecci n y el tiempo de carrera seg n la configuraci n concreta del instrumento y la longitud capilar Los valores de inicio recomendados se indican en la Tabla 5
21. do a la amplificaci n preferente del alelo m s peque o 15 En consecuencia m s del 20 de las muestras de mujeres que son biol gicamente homocigotas debe analizarse por Southern blot para resolver la ambiguedad potencial de un alelo m s largo no amplificado Como resultado muchas de las muestras si no todas evaluadas en laboratorios cl nicos se analizan tambi n con el m todo de Southern blot m s complejo Por este motivo la t cnica actual de an lisis cl nico de X fr gil es laboriosa tiene bajo rendimiento y es costosa por lo que no puede satisfacer adecuadamente las necesidades de las pruebas de rutina El kit AmplideX FMR1 PCR se ha dise ado para solucionar estos problemas Dicho kit se utiliza para determinar el n mero de repeticiones CGG en el gen FMR1 utilizando la reacci n en cadena de la polimerasa y el an lisis de fragmentos mediante electroforesis capilar EC El uso del kit permite medir de forma precisa los alelos de hasta 200 CGG as como identificar los alelos con mutaci n completa con m s de 200 CGG y detectar un perfil de picos caracter stico que resuelve la cigosidad en muestras de mujeres P gina 4 de 30 Principio de la prueba El kit AmplideX FIVR1 PCR se basa en una reacci n de PCR con tres cebadores repetidos RP CGG a partir de ADN gen mico purificado y medici n de fragmentos en una plataforma validada de electroforesis capilar como puede ser un analizador gen tico de Applied Biosystem
22. e aproximadamente 1 hora de tiempo de carrera para cada conjunto de 4 a 96 muestras por inyecci n dependiendo del modelo utilizado Sangre completa A E Tiempo de trabajo manual Tiempo de instrumento Total 10 horas PCR FMR1 An lisis por EC or EC Analisis de datos de datos Prep 30 min M Prep 30 min Prep 304 60 min An lisis por EC 1 a 6 horas PCR FMR1 6 horas Despu s de la electroforesis capilar los electroferogramas se analizan para identificar picos de producto espec ficos de longitud completa Hasta aproximadamente 200 CGG los picos se detectan dentro del rango lineal del instrumento El tama o en pares de bases de estos picos se convierte en n mero de repeticiones CGG utilizando para ello factores de correcci n calculados especificamente seg n la configuraci n del equipo Por encima de 200 CGG el tama o del producto de la PCR supera el umbral de resoluci n del gel pol mero POP 7 Los fragmentos de PCR que superan este umbral tienen un ndice de migraci n equivalente independiente del tama o del producto 16 De este modo los productos de PCR del FMR1 que superan 200 CGG se identifican en la categor a de gt 200 CGG Adem s de proporcionar informaci n sobre el tama o los productos de la PCR con cebadores repetidos RP CGG pueden indicar caracter sticas cualitativas tales como la cigosidad y la presencia de AGG intercalado 17 P gina 6 de 30 Componentes del kit Reactivos su
23. e la secci n de interpretaci n de los datos p gina 18 Tabla 14 Resumen de la variabilidad del m todo dentro del laboratorio para determinar la longitud de repeticiones CGG rae 20 CGG 29 CGG 31 CGG 54 CGG 119 CGG 199 CGG ances Caracteristica aie Norm Norm Norm Interm Premut Premut compl Pale akan 112 112 112 112 112 112 144 Porcentaje de acuerdo 100 100 100 100 100 100 100 CGG m nima 20 29 31 53 118 198 Tabla 15 Estimaci n de la precisi n del m todo dentro del laboratorio para medir el tama o en pares de bases N mero Eo Ml Eo Ml M nimo pb EN 42 Ea 14 324 01 cz 75 ES 08 ca 54 EJ 15 3500xL M ximo pb 293 28 319 62 325 5 392 46 584 46 824 16 1076 14 Tama o medio pb 292 51 319 01 324 84 391 76 Desv est CV N mero E S E S M nimo pb ES 95 Es 33 321 14 ES 04 ES 64 ES 02 EN 7 3130x M ximo pb 289 79 316 29 322 12 388 96 581 39 822 29 1062 61 Tama o medio pb 289 45 315 93 321 77 388 58 581 10 820 53 1051 73 Desv est 0 20 0 21 0 21 0 22 0 19 1 16 5 36 CV 0 07 0 07 0 06 0 06 0 03 0 14 0 51 Reproducibilidad entre laboratorios La reproducibilidad entre laboratorios se evalu comprobando diferentes alelos en el rango de medici n 20 29 31 54 119 y 199 CGG en tres laboratorios distintos En el centro 1 el an lisis consisti en 7 r plicas cada una en dos instrumentos de EC distintos
24. ebadores repetidos RP CGG corresponden a los amplicones de la PCR individuales de cada combinaci n del cebador repetido con el cebador inverso Los picos correspondientes a las repeticiones CGG est n separados por 3 pb como es de esperar El perfil de picos ofrece una informaci n de confirmaci n sobre la cigosidad y la presencia de secuencias AGG intercaladas Figura 2 Metodolog as de PCR para el FMR1 se alando las caracter sticas de los sistemas de PCR de dos y tres cebadores FMR1 aG IR1 Cebador Cebador directo directo FMR1 FMR1 a i Le w bE T IE iE E uE rE A a w La Ee HE m aL tE 30 CGG 30 CGG all Ln E a on Pico especifico de _ Pico especifico de longitud completa vs longitud completa gt 200 gt 200 CGG CGG Pico espec fico de e Pico espec fico longitud completa de longitud f E uate wt i A AAA a i y A 4 P a i a E o El perfil de repetici n de la PCR con cebadores repetidos RP CGG puede anunciar la presencia de alelos m s largos en la amplificaci n independientemente de si estos alelos se detectan como productos de longitud completa En consecuencia el riesgo de p rdida del alelo m s largo en la PCR se reduce Los picos de producto de PCR espec fica de longitud completa pueden convertirse a partir del tama o en pares de bases en el n mero de repeticiones CGG utilizando para ello factores de conversi n predefinidos En teor a el p
25. ecci n para una detecci n robusta y reproducible de un alelo con mutaci n completa fue del 5 Exactitud de la medici n La exactitud de la medici n depende del tama o del amplic n y de la morfolog a de los picos espec ficos del gen Todos los tama os se determinaron utilizando los picos m s altos o centrales para todos los alelos La exactitud en la medici n del tama o se determin en comparaci n con una secuencia de ADN en el rango de 20 a 119 repeticiones Entre 119 y 200 CGG la exactitud de la medici n de los picos de producto espec ficos de longitud completa se relacion con el n mero de picos individuales CGG de los productos de la PCR con cebadores repetidos RP CGG Por encima de 200 CGG 0 aprox 821 pb todos los alelos se clasifican en la categor a de gt 200 CGG La exactitud de la medici n se determin con los controles de ADN de l nea celular publicados utilizando la medida de picos espec ficos y recuento de picos absolutos de los productos de la PCR con cebadores repetidos RP CGG y el panel est ndar internacional de la OMS para controles del X fr gil Precisi n 1 Reproducibilidad La reproducibilidad intraserial fue evaluada por un solo usuario en dos instrumentos de EC distintos 3130x y 3500xL utilizando un nico termociclador Cada serie de PCR const de 7 r plicas para 6 alelos en el rango de medici n 20 29 31 54 119 y 199 y 9 r plicas para un alelo con mutaci n completa 940 CGG La pr
26. ecisi n fue evaluada despu s de la conversi n del tama o del amplic n pb en repeticiones CGG redonde ndolas a un n mero entero seg n los factores de correcci n de tama o C y movilidad m espec ficos de cada instrumento consulte la secci n de an lisis del tama o de los fragmentos p gina 12 La diferencia m xima en la longitud de repeticiones medida fue de 1 CGG para el alelo 199 Tabla 13 Estos resultados se corresponden con una coincidencia del 100 entre todas las r plicas para identificar alelos normales intermedios o con premutaci n dentro de la precisi n del m todo Tabla 13 Tabla 13 Resumen de la reproducibilidad del m todo para determinar la longitud de repeticiones CGG Instrumento Caracteristica 20066 29066 3106654066 119 006199 cea Joao cac Pincha a i i y 3 3130x Porcentaje de acuerdo 100 100 100 100 100 100 100 CGG m nima 20 29 31 54 119 199 i anus i i y 7 3500xI Porcentaje de acuerdo 100 100 100 100 100 100 100 31 31 CGG m nima 20 29 CGG m xima 20 29 2 Reproducibilidad dentro del laboratorio 54 119 198 gt 200 ane La variabilidad del m todo dentro del laboratorio se evalu analizando 7 alelos diferentes que representaban un rango cl nicamente relevante de longitudes de repeticiones CGG Dos usuarios cada uno utilizando un termociclador distinto realizaron reacciones PCR en 4 d as diferentes a lo largo de un per odo de
27. entre las repeticiones CGG Se piensa que las interrupciones AGG confieren estabilidad al ADN y reducen el riesgo de expansi n en la generaci n siguiente 10 13 El riesgo en el caso de madres sin elementos AGG puede ser mayor que en el de madres con el mismo n mero de repeticiones pero con al menos una secuencia AGG y por consiguiente con menos secuencias CGG consecutivas Diagn stico molecular del X fr gil La mayor parte de los modelos de pruebas diagn sticas para el FMR1 se basa en la PCR con resoluci n de tama o por electroforesis capilar EC o mediante electroforesis en gel de agarosa o poliacrilamida para detectar hasta 100 150 repeticiones CGG El m todo de Southern blot para el FMR1 se utiliza para caracterizar muestras con n meros de repeticiones CGG demasiado grandes para amplificarlas mediante la PCR as como para determinar el estado de metilaci n del gen 14 Por desgracia esta t cnica es costosa requiere mucho tiempo y trabajo de laboratorio y adem s necesita grandes cantidades de ADN gen mico por lo que no es adecuada para pruebas con gran cantidad de muestras ni para la identificaci n sistem tica de la poblaci n La PCR puede solventar potencialmente cada una de estas limitaciones pero la alta riqueza en GC de la secuencia de repeticiones del triplete del X fr gil ha dificultado siempre la amplificaci n La PCR de ADN de mujeres con premutaci n y mutaci n completa es incluso m s problem tica debi
28. erfil de picos puede ofrecer una cuantificaci n muy precisa de las repeticiones CGG contando el n mero de picos de amplicones obtenidos con el cebador repetido hasta 200 CGG ofreciendo una confirmaci n complementaria del tama o Protocolo de trabajo El protocolo de trabajo de la prueba incluye una configuraci n de la mezcla maestra de PCR un programa de ciclos t rmicos y un an lisis usando electroforesis capilar El ADN gen mico se a ade a una mezcla maestra que contiene tamp n de P gina 5 de 30 amplificaci n para secuencias ricas en GC una mezcla de polimerasa y los cebadores F R FAM del FMR1 para la PCR espec fica El cebador CGG del FMR1 se a ade tambi n a la mezcla maestra para realizar la PCR con cebadores repetidos RP CGG Despu s del programa t rmico que dura aproximadamente 6 horas los productos de PCR no purificados se mezclan directamente con formamida Hi Di y el marcador ROX 1000 Despu s de desnaturalizar los productos los amplicones se miden en una plataforma validada de electroforesis capilar como puede ser un analizador gen tico de Applied Biosystems usando el pol mero POP 7 En la Figura 3 se muestra un esquema de la secuencia de trabajo Figura 3 Visi n global del protocolo de trabajo del kit AmplideX FMR1 PCR donde se muestran los pasos clave y el tiempo estimado para cada paso el programa t rmico para la PCR espec fica dura aproximadamente 3 5 horas El protocolo de an lisis por EC requier
29. ero de repeticiones superiores a 200 CGG 8 En el caso de los alelos con premutaci n de aprox 60 a 200 repeticiones el riesgo de expansi n a una mutaci n completa aumenta con el tama o Por encima de 100 repeticiones existe un riesgo sistem tico de expansi n en la siguiente generaci n 9 Los l mites en las longitudes de repeticiones CGG entre alelos normales intermedios y con premutaci n est n asociados a las longitudes de repetici n m s peque as que pueden expandirse a una mutaci n completa En la Tabla 12 se muestran los l mites actuales seg n el Colegio Americano de Gen tica M dica y la Sociedad Europea de Gen tica Humana 22 26 27 Seg n las pautas locales los l mites pueden ser diferentes en otras regiones Tabla 12 L mites de los genotipos relativos a varias longitudes de repeticiones CGG en el gen FMR1 seg n la regi n Categor a del genotipo Directrices ACMG Directrices ESHG Caracter sticas de rendimiento Anal ticas Especificidad anal tica Los cebadores directo forward e inverso reverse son espec ficos del gen del retraso mental humano FMR1 X fr gil NC_000023 10 y abarcan la regi n de repeticiones CGG dentro de la regi n 5 no traducida UTR del gen NT_011681 16 Human Chromosome X Contig Reference Assembly La amplificaci n espec fica del alelo FWR1 se verific mediante la secuenciaci n del ADN y comprobando l neas celulares bien caracterizadas y muestras c
30. es CGG tal como se describe en la secci n de an lisis de los datos Los t rminos utilizados para el an lisis se refieren a las funciones del GeneMapper 4 0 4 1 En la Figura 5 se muestra una visi n global del procedimiento de trabajo para el an lisis del tama o de los fragmentos Figura 5 Esquema del flujo de trabajo para el an lisis de datos incluido el procesamiento de los archivos de muestra la puntuaci n de picos del marcador la calificaci n de la ejecuci n de la sesi n la selecci n de picos espec ficos y el resumen de resultados Importaci n y procesamiento de datos Revisi n de picos Lae nan Revise los controles ns Seleccionar picos de detectado los 21 picos Si Y Li controes las Si gt f del marcador ROX E eE de la sesi n especificaciones producto especificos No No Los resultados de los Convertir tama o de controles no son v lidos pico en longitud de _ Repetirset repeticiones CGG Fallo de la muestra Reprocesar Resumen de resultados 1 Importaci n y procesamiento de datos a Importe los archivos fsa al GeneMapper b Procese los archivos seg n el m todo de an lisis el panel y el est ndar de tama o establecidos para el an lisis de productos de la PCR del FMR1 2 Revisi n de la serie a Cribe los picos del marcador ROX Revise los picos y la asignaci n de tama os y la curva de coincidencias de tama os del marcador ROX 1000 P gina 14 de 30 par
31. extra do de l neas celulares bien caracterizadas puede utilizarse para los controles positivos Las l neas celulares o el ADN gen mico purificado correspondiente pueden obtenerse de diversos dep sitos como el CCR 18 Adem s existe un panel de materiales de referencia proporcionado por la Sociedad Europea de Gen tica Humana ESHG y aprobado como est ndar internacional por el Comit de Expertos en Patrones Biol gicos ECBS de la OMS 19 En la secci n de interpretaci n de datos pueden verse ejemplos representativos obtenidos con estos materiales Los controles positivos y negativos tienen que estar dentro del rango especificado de aceptaci n de datos 1 Aseg rese de que el control negativo incluido en la carrera cumple las especificaciones 2 Asimismo aseg rese de que los controles positivos cumplen tambi n las especificaciones correspondientes Consulte ejemplos de los controles en la secci n de interpretaci n de los datos parte Il p gina 19 para obtener m s informaci n Procedimiento inform tico Para el an lisis del tama o de los fragmentos de la PCR espec fica o con cebadores repetidos RP CGG se puede utilizar GeneMapper 4 0 4 1 o un software equivalente Esto implica una serie de pasos para obtener el tama o de picos de producto de longitud completa as como para identificar las caracter sticas de la carrera para la correcta interpretaci n de los datos Los resultados se convierten en longitud de repeticion
32. fecha de caducidad impresa en la etiqueta Calibradores y controles e El kit no incluye calibradores ni controles pero se recomienda utilizarlos en cada serie e Eldiluyente proporcionado con el kit puede utilizarse como control negativo sin ADN e El est ndar internacional de la OMS s ndrome del X fr gil panel de referencia gen tico NIBSC 08 158 u otros est ndares de ADN de l nea celular disponibles en el mercado pueden utilizarse como controles positivos Reactivos requeridos pero no suministrados e El kit no incluye los reactivos requeridos para el aislamiento del ADN El ADN puede extraerse mediante las metodolog as ordinarias de preparaci n de muestras validadas por el laboratorio que aseguren un ADN intacto y de alta calidad P gina 7 de 30 Otros componentes suministrados con este kit PC 0165 Kit AmplideX FIMR1 PCR tarjeta del envase Consumibles y equipos requeridos pero no suministrados Material general de laboratorio y espacio de trabajo para realizar PCR Termociclador ABI 9700 ABI Veriti ejecuci n en modo 9700 m x o MJ Research PTC 225 Centr fuga para placas de 96 pocillos V rtex Microcentrifuga Pipetas con una precisi n comprendida entre 0 2 y 2 ul 1 y 10 ul 2 y 20 ul 20 y 200 ul y 100 y 1 000 ul Pipeta multicanal capaz de pipetear entre 1 y 10 ul Placas de PCR de 96 pocillos ABgene n 2 AB 0900 o equivalente Sellos de placas de PCR ABgene n 2 AB 0558 Phenix LMT 0028 o equivalen
33. gile X mental retardation Nat Cell Biol 2004 6 11 p 1048 53 5 Hagerman R J and P J Hagerman The fragile X premutation into the phenotypic fold Curr Opin Genet Dev 2002 12 3 p 278 83 6 Iwahashi C K et al Protein composition of the intranuclear inclusions of FXTAS Brain 2006 129 Pt 1 p 256 71 7 Hagerman R and P Hagerman Fragile X Syndrome Diagnosis Treatment and Research 2002 The Johns Hopkins University Press Baltimore p 3 109 8 deVries B B et al Variable FMR1 gene methylation of large expansions leads to variable phenotype in three males from one fragile X family J Med Genet 1996 33 12 p 1007 10 9 Nolin S L et al Expansion of the fragile X CGG repeat in females with premutation or intermediate alleles Am J Hum Genet 2003 72 2 p 454 64 10 Zhong N et al Fragile X gray zone alleles AGG patterns expansion risks and associated haplotypes Am J Med Genet 1996 64 2 p 261 5 11 Fernandez Carvajal I et al Expansion of an FMR1 grey zone allele to a full mutation in two generations J Mol Diagn 2009 11 4 p 306 10 12 Kunst C B et al The effect of FMR1 CGG repeat interruptions on mutation frequency as measured by sperm typing J Med Genet 1997 34 8 p 627 31 13 Eichler E E et al Length of uninterrupted CGG repeats determines instability in the FMR1 gene Nat Genet 1994 8 1 p 88 94 14 Hagerman R J and P J Hagerman Fragile X Syndrome
34. i ndose a un rea de pos amplificaci n El producto amplificado debe permanecer en el rea de pos amplificaci n para reducir el riesgo de contaminaci n de los amplicones Configuraci n de la mezcla maestra de PCR y programa t rmico 1 Descongele todos los reactivos a excepci n de la mezcla de polimerasa durante unos 10 minutos a temperatura ambiente Coloque la mezcla de polimerasa en hielo Agite brevemente en v rtex todos los tubos tres a cinco pulsos en v rtex a excepci n de la mezcla de polimerasa Nota La mezcla de polimerasa debe conservarse en hielo en todo momento El tamp n de amplificaci n puede tener una precipitaci n observable cuando est fr o Despu s de haber descongelado el tubo por completo agite en v rtex para garantizar una mezcla homog nea P gina 9 de 30 2 A ada los componentes adecuados a un tubo de microcentrifuga de 1 5 ml en el orden exacto que se especifica en la Tabla 3 Tabla 3 Configuraci n de la mezcla maestra de la PCR Nota El tamp n de amplificaci n es viscoso retraiga el pist n lentamente para obtener la soluci n Importante Un exceso de mezcla de polimerasa puede inhibir la reacci n Aseg rese de que no haya gotas adicionales en la punta de la pipeta antes de dispensarla a la mezcla maestra 3 Agite en vortex la mezcla por completo tres a cinco pulsos en vortex antes de distribuir la mezcla en la placa o en los tubos de tiras de PCR Atenci n La mezcla maestr
35. ice el control agrupado con el kit AmplideX FMR1 PCR y determine el tama o medido en pares de bases para cada uno de los cinco primeros picos de amplicones Se recomienda calcular el tama o medio en pares de bases para cada pico de al menos dos series independientes Tabla 7 Datos de ejemplo para comparar la longitud de repeticiones esperada y el tama o observado Longitud de repeticiones 2 Calcule la pendiente y la intersecci n de los datos correlacionados en Excel o en un programa similar Figura 4 Gr fico de ejemplo para el c lculo de los factores de correcci n para las repeticiones CGG O O O 119 y 2 994x 232 4 R 1 al Oo Oo ie gt oO oO Oo o Tama o observado en pares de bases N O O 0 20 40 60 80 100 120 Longitud de repeticiones CGG mediante secuenciaci n de ADN La intersecci n del acoplamiento lineal corresponde al factor de correcci n Co y la pendiente al factor de movilidad mp En este ejemplo c 232 4 y mp 2 944 Para comprobar los factores de correcci n derivados el usuario debe comprobar el est ndar internacional de la OMS Fragile X Syndrome Genetic Reference Panel NIBSC 08 158 u otros est ndares de ADN de l nea celular disponibles en el mercado P gina 13 de 30 Procedimiento de control Es preciso usar controles positivos y negativos en cada serie El diluyente proporcionado con el kit puede utilizarse como control negativo sin ADN El ADN gen mico
36. iell Cell Repository 17 18 Las combinaciones de muestras de ADN de l nea celular pueden generar un control agrupado rico en informaci n en una PCR En la Figura 12 se muestra un ejemplo de resultado de electroferograma correspondiente a una muestra de control agrupado que combina un ADN de cuatro l neas celulares del CCR Consulte la secci n del procedimiento de calibraci n para conocer la formulaci n de este control agrupado Estas cuatro l neas celulares ofrecen alelos FMR1 correspondientes a 20 29 31 54 119 y 199 repeticiones CGG Las longitudes de repeticiones de los primeros cinco alelos se verificaron por secuenciaci n de Sanger 23 Por lo tanto el kit AmplideX FMR1 PCR es trazable al m todo de secuenciaci n de ADN y a los materiales del panel del X fr gil que pueden solicitarse al NIBSC Figura 12 Electroferograma de un control agrupado que muestra los resultados de la PCR con cebadores repetidos RP CGG para cuatro l neas celulares que abarcan 20 29 31 54 119 y 199 CGG El trazado superpuesto muestra la resoluci n de repeticiones y las intensidades de se al para los primeros cuatro alelos Parte Ill Caracter sticas especiales e Resoluci n de la cigosidad La PCR con cebadores repetidos RP CGG ofrece una se al nica para distinguir los alelos homocigotos de los heterocigotos En la Figura 13 se muestran perfiles de ejemplo para alelos homocigotos y heterocigotos Los productos de la PCR procedente
37. igura 1 se presenta la relaci n entre la longitud de las repeticiones CGG el defecto y el fenotipo P gina 3 de 30 Figura 1 Relaci n entre las longitudes de las repeticiones CGG y los fenotipos correspondientes Los tama os de repetici n se dividen en cuatro categor as normal verde intermedio azul con premutaci n naranja y con mutaci n completa rojo Los rangos espec ficos de repeticiones asociados a estas longitudes se muestran en la Tabla 12 CGG Defecto Consecuencia Resultados gt 200 F Transcripci n ARN bajo ee gt Prote nas bajas mp FXS ARNalto 55 200 Premutaci n Traducci n Prote nas FXTAS normales FXPOI Intermedio 45 34 ARN normal Ninguno Prote nas lt 45 Normal orina normales gt Normal Regi n 5 no traducida del FMR1 5 UTR Los alelos con mutaci n completa abarcan de 200 a m s de 1 000 repeticiones Por encima de 200 repeticiones el fenotipo del FXS se asocia al estado de metilaci n del alelo y no necesariamente al n mero de repeticiones superiores a 200 CGG 8 En el caso de los alelos con premutaci n de aprox 60 a 200 repeticiones el riesgo de expansi n a una mutaci n completa aumenta con el tama o Por encima de 100 repeticiones existe un riesgo sistem tico de expansi n en la siguiente generaci n 9 Adem s de los riesgos asociados a la longitud total de repeticiones CGG muchos alelos del FMR1 contienen secuencias AGG que se intercalan
38. ipos en cada centro El conjunto total de muestras const de 75 alelos normales NOR 6 alelos intermedios INT 43 alelos con premutaci n PM y 72 alelos con mutaci n completa FM incluidos algunos alelos con m s de 1 000 repeticiones CGG El ndice de aceptaci n inicial con el kit AmplideX FMR1 PCR fue del 98 5 193 196 las tres muestras restantes se amplificaron con xito al repetir la PCR Todas las muestras de los rangos normal intermedio premutaci n y mutaci n completa se identificaron correctamente con el kit AmplideX FMR1 PCR P gina 26 de 30 Tabla 17 Resumen de los genotipos observados de las muestras por centro y metodolog a comparados con los obtenidos mediante el m todo de Southern blot 7 Cm e IRE CT o a a En total 194 de las 196 muestras coincidieron con el m todo de Southern blot en las mediciones seg n el genotipo por categor as del alelo FMR1 m s largo Dos de las muestras con alelos con premutaci n f cilmente detectables con el kit y el m todo de Southern blot tambi n presentaron picos de baja intensidad correspondientes a alelos con mutaci n completa que solamente pudieron detectarse con el kit Estos resultados pueden reflejar que la tecnolog a AmplideX basada en la PCR presenta una sensibilidad mayor que el m todo de Southern blot para alelos con mutaci n completa de baja abundancia 17 23 consulte tambi n el apartado anterior de sensibilidad anal tica p gina 23 En la
39. ir se ales positivas falsas Utilice las precauciones apropiadas al manipular las muestras en el flujo de trabajo y al pipetear No mezcle componentes de diferentes lotes de reactivos No utilice los reactivos despu s de la fecha de caducidad impresa en el envase No intercambie tapones de tubos de reactivos que pudieran causar contaminaci n cruzada o degradaci n de los reactivos Utilice t cnicas de pipeteado adecuadas y mantenga el mismo patr n de pipeteado durante todo el procedimiento para garantizar resultados ptimos y reproducibles Aseg rese de que existe una distribuci n homog nea de la mezcla maestra es viscosa y puede acumularse dentro de la punta de la pipeta Utilice m todos y plataformas validados en laboratorio P gina 8 de 30 e Antes de su uso aseg rese de que todos los instrumentos se han calibrado de acuerdo con las instrucciones del fabricante e Pueden solicitarse las fichas de datos de seguridad P ngase en contacto con su distribuidor local Pasos previos al an lisis El ADN gen mico extra do mediante metodolog as de preparaci n de muestras est ndar de sangre completa recogida en EDTA es compatible con el kit AmplideX FMR1 PCR Se recomienda evaluar la concentraci n OD260 y pureza OD260 280 del ADN gen mico purificado asi como almacenar las muestras de ADN a una temperatura inferior a 15 C A ada de 20 a 80 ng en cada reacci n 2 ul de ADN a 10 40 ng ul Protocolo del kit Amplide
40. l nicas representativas Rango de partida de ADN El rango del ADN de partida se evalu por primera vez con 1 a 100 ng de ADN de l nea celular Los productos de longitud completa de la PCR espec fica y con cebadores repetidos RP CGG se observaron con todas las cantidades de ADN La precisi n del tama o no se vio afectada por la cantidad de ADN Una muestra en mosaico que conten a 20 de 940 CGG en un fondo con 80 de 23 CGG fue testada a continuaci n en el rango de 1 a 100 ng de ADN El rango recomendado es de 20 a 80 ng de ADN por PCR Sensibilidad anal tica La detecci n de un alelo con mutaci n completa poco abundante se determin con 40 ng de partida utilizando una valoraci n anal tica de dos muestras cl nicas Una muestra cl nica con mutaci n completa de hombre se mezcl P gina 23 de 30 con un alelo normal de hombre de 31 CGG para generar diferentes porcentajes del alelo con mutaci n completa entre 0 y 100 manteniendo el ADN total constante en 40 ng Los picos de repeticiones CGG y los picos de producto espec ficos de longitud completa se detectaron en muestras con tan solo un 1 de mutaci n completa lo que equival a a 400 pg de un alelo con mutaci n completa en un fondo de 39 6 ng de alelo normal La intensidad de la se al del pico de producto de longitud completa y los picos con cebadores repetidos RP CGG aumentaron al incrementar la cantidad de partida relativa del alelo con mutaci n completa El l mite de det
41. ministrados con el kit Tabla 1 Componentes del kit AmplideX FMR1 PCR P N 76008 145187 Mezcla de polimerasa De 15 a 30 C 145188 Marcador ROX 1000 200 ul De 15 a 30 C Manipulaci n y conservaci n e Guarde los reactivos en un congelador que no tenga sistema no frost y en la oscuridad a una temperatura comprendida entre 15 C y 30 C e Deje que los reactivos a excepci n de la mezcla de polimerasa se descongelen a temperatura ambiente antes de su uso Una vez finalizada la descongelaci n agite en v rtex todos los reactivos excepto la mezcla de polimerasa e Antes de abrir los frascos centrifugue brevemente cada componente para recoger las soluciones en el fondo de los frascos e La preparaci n del ensayo debe realizarse a temperatura ambiente intervalo aproximado de 18 C a 25 C N mero de reacciones e Los reactivos proporcionados son suficientes para un total de 100 reacciones PCR espec fica del gen o PCR con cebadores repetidos RP CGG y los 100 an lisis subsiguientes por EC e Los reactivos se han verificado para su uso en hasta cuatro ciclos de congelaci n y descongelaci n No se recomienda realizar ciclos adicionales e Las mezclas maestras pueden prepararse para el n mero apropiado de muestras con un n mero m nimo recomendado de 16 reacciones por serie Estabilidad de los reactivos e Si se conserva en las condiciones especificadas el producto mantendr su eficacia hasta la
42. n la sangre perif rica pueden interferir en los m todos de PCR inhibiendo la actividad de la ADN polimerasa 28 29 Por lo tanto es necesario purificar el ADN antes del paso de amplificaci n de la PCR Se ha demostrado que los m todos est ndar de extracci n del ADN eliminan estos compuestos potencialmente interferentes 30 El kit AmplideX FMR1 PCR se dise para ser compatible con m todos de extracci n de ADN comerciales y validados en el laboratorio Durante la prueba de 196 muestras cl nicas representativas no se observ ninguna inhibici n Rango de medici n e Elrango de medici n de la longitud de repeticiones es de 5 a 200 CGG Por encima de 200 CGG todos los alelos se clasifican en la categor a de gt 200 CGG Diagn sticas y cl nicas El kit AmplideX FMR1 PCR se evalu con un conjunto de 196 muestras cl nicas obtenidas de dos centros externos empleando m todos de PCR espec fica y con cebadores repetidos RP CGG Un conjunto de 146 muestras caracterizadas previamente mediante el m todo de Southern blot se enviaron a Asuragen para su an lisis Las otras 50 muestras se evaluaron en un laboratorio externo Los t cnicos de laboratorio que realizaron el an lisis de la PCR asignaron de forma an nima los genotipos de las muestras Los resultados de ambas metodolog as de PCR en cada centro fueron id nticos y se resumen en la Tabla 17 con una comparaci n con el m todo de Southern blot para cada categor a de genot
43. nnnaoos 18 Parte Il Interpretaci n y notificaci n de los resultados ooccccconocnnnnonacnnnonanonnnonaconnnnnnannnonononnnonaronnnonanonnnnanoss 19 Parte Ill CaracteristiCas especiales inside 21 imitaciones del Procedimiento de examen arta tati alad s 22 Valores Dard laS decisiones Medicas a dia oc 23 Intervalos de tte rencia O O oi 23 Caracteristicas de rendimiento ni AA ia 23 ANACRE ii 23 Raneo de Mediciones 26 Didgnosticas VCIINICAS si de de aia ds ld ade a dls 26 AVISO COMP ad scsparsissie T 27 A A N E 28 ADendice A Glosaro Ge sSIMDOIOS sitiada 29 Pagina 2 de 30 Indicaciones El kit AmplideX FMR1 PCR es una herramienta de diagn stico in vitro dise ado para uso profesional en laboratorios cl nicos a fin de amplificar y detectar las secuencias repetidas del triplete citosina guanina guanina CGG en la regi n 5 no traducida del gen 1 del retraso mental del X fr gil FMR1 El kit est concebido como ayuda para diagnosticar el s ndrome del X fr gil y los trastornos asociados al mismo como el s ndrome de temblor ataxia FX TAS y la insuficiencia ov rica primaria FX POI a trav s de la determinaci n del numero de repeticiones CGG hasta 200 CGG y la detecci n de alelos con m s de 200 CGG La prueba consta de una reacci n en cadena de la polimerasa PCR por sus siglas en ingl s de ADN gen mico purificado de sangre completa seguida de electroforesis capilar en un analizador gen tico general validado en lab
44. ogies Corporation 726 Post Road Madison WI 53713 EE UU 6 La compra de este producto concede al comprador un derecho limitado no exclusivo y no transferible dentro de las patentes o solicitudes de patentes a usar el producto adquirido para realizar pruebas de diagn stico molecular P gina 27 de 30 dirigidas al gen FMR1 o el gen FMR2 No se concede ninguna otra licencia al comprador ya sea de forma expl cita impl cita legal ni de ninguna otra forma 7 Todos los instrumentos deben mantenerse y utilizarse seg n las instrucciones del fabricante 8 Asuragen no se hace responsable en modo alguno ya sea por motivos contractuales extracontractuales incluida la negligencia o de otro tipo de ninguna reclamaci n derivada o relacionada con el uso de este producto Ninguna parte de este documento excluye o limita cualquier responsabilidad cuya exclusi n o limitaci n por parte de Asuragen sea ilegal Bibliograf a 1 Verkerk A J etal Identification of a gene FMR 1 containing a CGG repeat coincident with a breakpoint cluster region exhibiting length variation in fragile X syndrome Cell 1991 65 5 p 905 14 2 Hagerman R J and P J Hagerman Testing for fragile X gene mutations throughout the life span Jama 2008 300 20 p 2419 21 3 Oostra B A and R Willemsen A fragile balance FMR1 expression levels Hum Mol Genet 2003 12 Spec No 2 p R249 57 4 Jin P R S Alisch and S T Warren RNA and microRNAs in fra
45. or P gina 29 de 30 2012 Asuragen Inc Todos los derechos reservados Kit AmplideX FMR1 PCR PC 0164ESv5a Fecha de entrada en vigor 2012 07 Asuracen AI P gina 30 de 30
46. oratorio o en una plataforma de electroforesis capilar y la conversi n del tama o del producto en el n mero de repeticiones CGG Generalidades El s ndrome del X fr gil FXS hace referencia a un trastorno en la repetici n de trinucle tidos que tiene su causa principal en la expansi n de las secuencias repetidas del triplete citosina guanina guanina CGG en la regi n 5 no traducida del gen 1 del retraso mental del X fr gil FMR1 NM_002024 4 1 El n mero de repeticiones CGG se asocia a diversos trastornos que pueden afectar tanto a pacientes j venes como adultos 2 La expansi n a 200 repeticiones o m s da lugar a la inactivaci n del gen FMR1 a trav s de la metilaci n de las repeticiones CGG y de la isla CoG adyacente al gen FMR1 La prote na FMR1 es una prote na de uni n al ARN que act a como regulador global de la traducci n en las neuronas y resulta muy importante para la plasticidad sin ptica 3 Dada su funci n clave en el desarrollo nervioso y en el transporte del ARN 4 este gen se considera responsable de diversos trastornos relacionados con el X fr gil Los individuos con mutaciones completas m s de 200 repeticiones CGG presentan con frecuencia el FXS cl sico caracterizado por retraso mental autismo y des rdenes emocionales y psiqui tricos 5 Se sabe que los portadores de la premutaci n 55 200 o 59 200 CGG entra an el riesgo de desarrollar insuficiencia ov rica primaria asociada al X fr gil FX
47. rumento Seleccione el pico m s alto por lo general el pico m s a la derecha en este rango de tama o Puede haber m ltiples picos en el rango normal Confirme la selecci n de todos los picos por ejemplo 30 o 29 30 o 29 31 CGG Seleccione el pico m s alto por lo general el pico central en el caso de alelos de m ltiples picos o de los picos en este rango de tama o por ejemplo 119 CGG Seleccione los picos centrales de dos grupos de alelos Si los picos entre alelos superan el l mite de se al identifique ambos grupos separados por on un guion por ejemplo 112 117 CGG Si los picos entre dos grupos de alelos son inferiores a 50 rfu u otro limite los alelos pueden identificarse con una coma como alelos distintos por ejemplo 97 105 CGG Seleccione el pico central y ultimo pico gt 50 rfu u otro limite para alelos con mas de 8 picos desde el centro hasta el extremo por ejemplo 92 a 104 CGG Usando los siguientes ejemplos 560 470 S 112 CGG 117 CGG hs 104 CGG P gina 17 de 30 Si el tama o del pico se O tiene estas encuentra en caracter sticas este rango Entonces siga estas directrices para los picos que superan el Usando los siguientes ejemplos l mite de se al del instrumento Alelos con mutaci n completa de menos de gt 200 CGG gt 200 CGG Seleccione solo el componente aproximadame nte 1 000 pb que pueden resolverse a partir de picos
48. s El kit incluye cebadores espec ficos del gen y cebadores de la zona CGG una mezcla de polimerasa un tamp n para la amplificaci n de la regi n de repeticiones CGG en el gen FMR1 y un marcador ROX 1000 para la medici n mediante electroforesis capilar El tama o de los productos de PCR se transforma en n mero de repeticiones CGG utilizando los factores de conversi n de tama o y movilidad Los usuarios tambi n pueden optar por realizar una PCR espec fica del gen con dos cebadores omitiendo el cebador CGG M todos para la PCR El kit incluye reactivos para realizar 2 tipos de PCR PCR espec fica del gen GS PCR y PCR con cebadores repetidos CGG RP PCR Figura 2 La PCR espec fica del gen utiliza dos cebadores espec ficos del gen FMR1 que abarcan la regi n de repeticiones CGG Los productos de la PCR con los cebadores espec ficos del gen representan alelos de longitud completa Figura 2A La PCR con cebadores repetidos RP CGG se diferencia de la PCR espec fica m s convencional por la adici n de un tercer cebador que es complementario a la regi n de repeticiones del triplete del gen FMR1 El electroferograma resultante incluye los productos PCR de longitud completa generados a partir de los cebadores espec ficos que abarcan la regi n de repeticiones CGG y los picos de repeticiones CGG obtenidos por la RP PCR Figura 2B Los picos espec ficos de longitud completa son similares en los dos m todos Los productos de la PCR con c
49. s parte Il p gina 19 para obtener m s informaci n sobre el uso de controles positivos 3 Seleccione picos diana espec ficos a Los trazos del electroferograma se revisan para ver si se cumplen los criterios de selecci n de picos Para el an lisis de los productos de la PCR con cebadores repetidos RP CGG los m ltiples picos de RP CGG se deseleccionan para simplificar la conversi n del pico de los productos de longitud completa de la PCR espec fica en la longitud de repeticiones CGG En la b Figura 7 incluida a continuaci n se resalta un ejemplo de este proceso relativo a un alelo con premutaci n de mujer P gina 15 de 30 Figura 7 Electroferograma de ejemplo con ajustes de an lisis predeterminados arriba y solo picos de longitud completa espec ficos seleccionados a partir del electroferograma de la PCR con cebadores repetidos RP CGG abajo 145 245 343 des 545 Bs 745 cds 34 1043 1143 it ron TWH tes WATT ti ria Abst delicada a i OSADO aa Deselecci n y selecci n de picos espec ficos por genes i TA PA ct JA dea Nota Si se procesan los resultados de una PCR espec fica solo estar n presentes los picos espec ficos del gen y solo ser preciso seleccionar estos picos No se requiere la deselecci n c Deseleccione todos los picos y a continuaci n seleccione los picos de productos de longitud completa espec ficos En general los picos que superan un l mite
50. s de alelos homocigotos revelan una se al de l nea base despu s de los picos de repeticiones CGG que se extiende hasta el pico de producto de longitud completa y contin a hasta el final del electroferograma A la inversa los alelos heterocigotos tienen un patr n de decaimiento caracter stico de productos de repeticiones CGG que superan el rango normal de la longitud de repeticiones CGG a lo largo de la P gina 21 de 30 detecci n de alelos normales y expandidos Adem s los productos de cebado repetido CGG se generar n incluso si no se detecta el pico de producto con longitud completa Figura 13 Los reactivos FMR1 para la PCR con cebadores repetidos RP CGG ofrecen una se al inequ voca de muestras de mujeres que resuelve la cigosidad Los gr ficos superpuestos muestran la resoluci n y las intensidades de se al de los productos de la PCR con cebadores repetidos RP en el rango de 500 a 700 pb Cada pico del amplic n con cebadores repetidos RP CGG est separado por 3 pb 140 340 540 740 940 140 240 540 740 540 4000 0 CGG 4000 A E e Female 30 ta ma Female 29 gt CGG 3000 Homozygc 3000 Heterozygol yg E ud bin iin as Sen LLL ONO Ani 1000 1000 0 IN o A e 140 340 0 0 940 140 340 w40 T40 40 Female 30 Homozygc ta Female 30 gt 2 Heterorygou sl A AT TO o ATAATA CANA VAR MINA HASAN NE AAA nate A A f Pl koo e Variaci n de la intensidad de la se al en perfiles de
51. s de mujeres Limitaciones del procedimiento de examen e Es posible que esta prueba no detecte formas poco frecuentes de deficiencia de FMRP no causadas por la expansi n de CGG tales como la eliminaci n o la mutaci n puntual o el retraso mental asociado a otros lugares P gina 22 de 30 fr giles En estos casos los estudios de enlaces citogen ticos o de secuenciaci n as como los ensayos dise ados para identificar mutaciones y eliminaciones poco frecuentes pueden ofrecer informaci n adicional importante Los cebadores F R FAM del FMR1 y los cebadores CGG del FMR1 carecen de lugares de union polim rficos tal como los definidos por la base de datos Single Nucleotide Polymorphism versi n dbSNP build 131 y Human Genome Build 37 1 Sin embargo la presencia de variantes poco frecuentes del gen FMR1 puede hacer que se obtengan resultados falsos o miscalls predicciones err neas Por lo tanto los resultados del ensayo deben interpretarse teniendo en cuenta otros datos de laboratorio y el estado cl nico global del paciente Esta prueba no debe utilizarse por s sola para diagnosticar el s ndrome del X fr gil o los trastornos asociados al X fr gil Valores para las decisiones m dicas Intervalos de referencia biol gica Los alelos con mutaci n completa abarcan de 200 a m s de 1 000 repeticiones Por encima de 200 repeticiones el fenotipo del FXS se asocia al estado de metilaci n del alelo y no necesariamente al n m
52. ta Los resultados oscilan entre 5 y 200 repeticiones por encima de 200 repeticiones todos los alelos se identifican como gt 200 CGG Describa el genotipo para los alelos asignados seg n el rango de referencia En muestras con m ltiples alelos se especifica el alelo m s largo Las muestras con alelos con premutaci n y con mutaci n completa se identifican como mosaicos con mutaci n completa 22 El genotipo puede asignarse seg n directrices espec ficas tal como se muestra en la Tabla 12 de la secci n de valores para las decisiones m dicas p gina 23 e Ejemplo de resultados de la PCR con cebadores repetidos RP CGG para alelos normales con premutaci n y con mutaci n completa Figura 8 Ejemplos de alelos normales que muestran 29 30 CGG comparado con 30 CGG 140 20 E dd 540 Edi Tad gua Sah 1 000100 E 2000 FONO Figura 9 Ejemplo de alelo con premutaci n El pico m s alto en la muestra se selecciona para representar el alelo 80 CGG CHICA gt P gina 19 de 30 Figura 10 Ejemplo de alelo con mutaci n completa muestra de un hombre El pico de producto de longitud completa supera 200 CGG y se identifica como gt 200 CGG Los picos de productos de repetici n CGG individuales pueden identificarse f cilmente en el gr fico 140 24 340 dal 540 bao ra 340 340 1040 1140 Trazabilidad de los est ndares del X fr gil En la Figura 11 pueden apreciarse electroferogramas obtenidos con el panel del material
53. te Soporte de compresi n de PCR Applied Biosystems n 2 4312639 o equivalente Plataformas y materiales de electroforesis capilar validados en laboratorio Analizadores gen ticos ABI compatibles con el pol mero POP 7 por ejemplo series 3130 3730 o 3500 Pol mero POP 7 Applied Biosystems n 2 4363785 o equivalente Formamida Hi Di Applied Biosystems n 2 4311320 o equivalente Calibradores para los colorantes FAM y ROX DS 30 o DS 31 Applied Biosystems n 2 4345827 n 2 4345829 o equivalente Software GeneMapper 4 0 4 1 o equivalente Advertencias y precauciones Utilice un equipo de protecci n personal adecuado Lleve gafas de protecci n apropiadas guantes protectores y ropa protectora al trabajar con estos materiales Al manipular muestras humanas siga las precauciones universales indicadas por la OSHA 1910 1030 CLSI M29 u otras gu as pertinentes ADVERTENCIA RIESGO QU MICO Formamida Hi Di Provoca irritaci n en los ojos la piel y las v as respiratorias Riesgos para el desarrollo y posibilidad de malformaciones del feto Evite inhalar el vapor Aseg rese de que existe una ventilaci n adecuada Entre las sustancias que pueden interferir con el kit cabe citar ciertos f rmacos y la heparina No deben utilizarse muestras altamente lip micas hemolizadas ict ricas ni muestras con proteinemia Utilice puntas de pipeta con filtro sin nucleasas y tubos sin nucleasas La contaminaci n cruzada de la PCR puede produc
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