Equipo de extracción de ADN oCheck® Manual de instrucciones
Contents
1. Cierre los tubos PCR etiquetados para almacenarlos Para obtener resultados ptimos con el ADN aislado en las aplicaciones posteriores se recomienda realizar la eluci n con el tamp n E suministrado Conserve el ADN extra do a 20 C Para realizar m s an lisis con los ensayos de la gama de productos oCheck consulte los manuales de instrucciones correspondientes PapilloCheck y PapilloCheck high risk 32 Equipo de extracci n de ADN oCheck Manual de instrucciones Revisi n 00 Febrero de 2011 11 SOLUCI N DE PROBLEMAS Problema y causa LA CANTIDAD DE ADN OBTENIDA ES NULA O INSUFICIENTE Lisis incompleta Reactivos no aplicados correctamente Eluci n deficiente del ADN desde la columna COLUMNAS OBTURADAS Lisis incompleta Reactivos no aplicados correctamente RENDIMIENTO DEFICIENTE DEL ADN EN REACCIONES ENZIM TICAS Contaminaci n cruzada de etanol o sal Contaminaci n del ADN con sustancias inhibidoras Comentarios y sugerencias eLa muestra no se ha mezclado y homogeneizado totalmente con el tamp n L1 y la proteinasa K La mezcla se debe mezclar en rgicamente en un Vortex inmediatamente despu s de a adirse el tamp n L1 e N mero de c lulas insuficiente en la muestra e Disminuci n de la actividad de la proteinasa K divida la soluci n en al cuotas y cons rvela a 20 C durante como m ximo 6 meses No vuelva a congelarla e Prepare los tampones L4 y W2 y las soluciones de2. N DEL ADN mg Preparar columnas m 450 ul de lisado m 1 minuto a 11 000 g mg 450 ul de lisado m 1 minuto a 11 000 g LAVADO DE LAS COLUMNAS 500 ul de tamp n W1 1 minuto a 11 000 g 600 ul de tamp n W2 1 minuto a 11 000 g SECADO DE LAS COLUMNAS Centrifugar 1 minuto a 11 000 g p R O T O C O L O ELUCI N DEL ADN 100 ul de tamp n E precalentado a 70 C 1 minuto a temperatura ambiente 18 25 C 1 minuto a 11 000 g LUS 11 o Equipo de extracci n de ADN oCheck Manual de instrucciones Revisi n 00 Febrero de 2011 14 2 Protocolo breve para la preparaci n con banda de 8 columnas n de cat logo 515 050 Extracci n del ADN mediante el Equipo de extracci n de ADN oCheck Preparaci n con banda de 8 columnas Greiner Bio One n de cat logo 515 050 PREPARACI N Comprobar que la centr fuga est a temperatura ambiente 18 25 C Preparar las soluciones de trabajo seg n el cap tulo 10 1 Calentar los bloques de calentamiento o los ba os Mar a a 56 y 70 C Precalentar el tamp n E de eluci n a 70 C Preparar las muestras seg n las instrucciones del cap tulo 10 2 Pipetear 250 ul de muestra en un microtubo de 1 5 2 ml PRELISIS 80 ul de tamp n L1 2 4 ul de soluci n de ARN portador 20 ul de soluci n de proteinasa K Agitar brevemente en el Vortex 56 C durante al menos 30 minutos Centrifugar brevemente LISIS 250 ul de tamp n L4 Agitar brevemente en el
3. Reactivo L3 wa Tamp n W1 w2 Tamp n W2 concentrado EI Tamp n E ES Proteinasa K liofilizada Tamp n de proteinasa PKB ARN portador liofilizado Columnas de centrifugado Tubos de colecci n Banda de columnas Hoja de papel Etiqueta para tamp n L4 Descargar instrucciones para el manual Equipo de extracci n de ADN oCheck Manual de instrucciones Revisi n 00 Febrero de 2011 2 CONSUMIBLES Y EQUIPO NECESARIOS 2 1 Preparaci n con una columna n de cat logo 515 040 Consumibles N de cat logo de Greiner Bio One Cantidad unidades Equipo de extracci n de ADN oCheck S 515 040 Preparaci n con una columna Puntas de filtro de micropipeta libres de desoxirribonucleasa est riles 765 288 Puntas de filtro de 0 5 10 pl 174 288 Puntas de filtro de 0 5 20 pl 172 288 Puntas de filtro de 10 100 ul 739 288 Puntas de filtro de 10 200 ul 750 288 Puntas de filtro de 100 1000 pl Otros consumibles necesarios e Microtubos de 1 5 2 ml con tapa de seguridad o tapa roscada para los pasos de lisis e Etanol pa gt 99 8 e Guantes de un solo uso Otro equipo necesario e Microcentr fuga adecuada para microtubos de 1 5 2 ml y 11 000 g e Vortex e Bloque de calentamiento ba o Mar a o Thermomixer adecuado para microtubos de 1 5 2 ml para incubaci n a 70 y 56 C e Micropipetas de entre 1 y 1000 ul e Contenedor de desechos e Reloj de control Equipo de extracci n de ADN oCheck Manu
4. Use el tamp n E precalentado 70 C Para evitar una p rdida de temperatura durante los pasos de pipeteado se recomienda llenar los microtubos de 1 5 2 ml con un m ximo de 1 300 ul de tamp n E suficiente para n 12 muestras Para evitar la contaminaci n cambie los guantes antes de iniciar este paso mg Coloque la columna en un microtubo de 1 5 ml limpio mg Aplique 100 ul de tamp n E precalentado 70 C en el centro de la membrana de la columna mg Cierre la tapa e incube a temperatura ambiente durante 1 minuto mg Centrifugue a 11 000 g durante 1 minuto Para obtener resultados ptimos con el ADN aislado en las aplicaciones posteriores se recomienda realizar la eluci n con el tamp n E suministrado Conserve el ADN extra do a 20 C Para realizar m s an lisis con los ensayos de la gama de productos oCheck consulte los manuales de instrucciones correspondientes PapilloCheck PapilloCheck high risk y PelvoCheck CT NG Equipo de extracci n de ADN oCheck Manual de instrucciones Revisi n 00 Febrero de 2011 9 GU ADE INSTALACI N Y TRABAJO PARA oCheck VACSET Y oCheck VACPUMP El sistema de vac o oCheck se ha dise ado para realizar la purificaci n manual r pida en paralelo de cidos nucleicos con el Equipo de extracci n de ADN oCheck Preparaci n con banda de 8 columnas Este sistema permite realizar r pidamente la purificaci n simult nea de cidos nucleicos de gran calidad Gracias
5. mer Lot nummer Kod partii batch nr KwOIK G Trapr dag Parti kodu Important Note Wichtiger Hinweis Note im portante Nota im portante Nota im portante Aviso im portante Belangri jke op merking Vigtig henvis ning Viktigt medde lande Wazne Viktig merknad 2NMAVTIKA onpe won nemli Not NDICE SE MA CONTENIDO DEL EQUIPO aa 5 CONSUMIBLES Y EQUIPO NECESARIOS onunaun aun anana sua a aa Da DR a DR RENE DR ERKENNEN ERR EEN 6 2 1 Preparaci n con una columna n de cat logo 515 040 oooocccononiconnncicococccoccncconnanonnnanconanarenananos 6 2 2 Preparaci n con banda de 8 columnas n de cat logo 515 050 susuus aun sana sean an K EE 7 TRANSPORTE Y ALMACENAMIENTO oooccocccocconccnnccnnconncnncnnnconanonnnnarennrnnnrnarrnnrnannnn 8 INSTRUCCIONES DE SEGURIDAD corran a 8 ELIMINACI N DE RESIDUOS NENNEN 9 INTRODUCCI N inncicccccnccnnicnninir nanenane nanenane annann 10 SR EE 10 iz USO PIEDO EE 10 ld E 11 6 4 Principio b sico de purificaci n del ADN uuuuana una aun sauna KREE a aa RR Da RED R RR DAR EDAD REENEN a DAR RD an au anana nnne 11 INSTRUCCIONES PARA LA SECUENCIA DE TRABAJO DE oCheck 12 ET Instrucciones generales as 12 T 2 TR EC codo cid OU SS 12 1 3 Advertencias y Precauciones EE 13 ESA nee de e e o EE 13 Razo MATE canciones E Ee 13 AA o Ulla O a 14 PREPARACI N CON UNA COLUMNA n de cat logo 515 040 15 8
6. y PelvoCheck CT NG Greiner Bio One n de cat logo 504 002 Equipo de extracci n de ADN oCheck Manual de instrucciones Revisi n 00 Febrero de 2011 34 14 PROTOCOLOS BREVES 14 1 Protocolo breve para la preparaci n con una columna n de cat logo 515 040 Extracci n del ADN mediante el Equipo de extracci n de ADN oCheck con preparaci n con una columna Greiner Bio One n de cat logo 515 040 PREPARACI N Comprobar que la centr fuga est a temperatura ambiente 18 25 C Preparar las soluciones de trabajo seg n el cap tulo 8 1 Calentar los bloques de calentamiento o los ba os Mar a a 56 y 70 C Precalentar el tamp n E de eluci n a 70 C Preparar las muestras seg n las instrucciones del cap tulo 8 2 Pipetear 250 ul de muestra en un microtubo de 1 5 2 ml PRELISIS 80 ul de tamp n L1 2 4 ul de soluci n de ARN portador 20 ul de soluci n de proteinasa K Agitar brevemente en el Vortex 56 C durante al menos 30 minutos Centrifugar brevemente LISIS 250 ul de tamp n L4 Agitar brevemente en el Vortex 70 C durante 15 minutos Centrifugar brevemente 4 AJUSTE DE LAS CONDICIONES DE UNI N DELADN mg 300 ul de etanol m Agitar brevemente en el Vortex mg Centrifugar brevemente Equipo de extracci n de ADN oCheck Manual de instrucciones Revisi n 00 Febrero de 2011 Extracci n del ADN p R O T O C O L O m lt m 02 D Extracci n del ADN 5 UNI
7. 1 Preparaci n de soluciones de trabajo y condiciones de almacenamiento ooocccconcccnnnninnnnonns 15 la EE 16 8 2 1 Preparaci n de muestras para PapilloCheck y PapilloCheck high risk 16 8 2 2 Preparaci n de muestras para HevoCheckCTNG aa a ana aa a aa a aa aa aa ea E aa Da aia DD 16 8 9 Protocolo estanda EE 17 o a A Ee EES EE AS 17 OZA EE AA EE 17 e E BCEE 17 8 3 4 Ajuste de las condiciones de uni n del ADN seen 17 an mode AN A o e e td 18 8 3 6 lt Lavado de las columnas de centrifugado eaaa EE EE 18 8 3 7 Secado delas columnas de centrifugado n EE 18 oo o NVE owe rana an ata o a E E e A Ao 19 Equipo de extracci n de ADN oCheck Manual de instrucciones Revisi n 00 Febrero de 2011 9 GU A DE INSTALACI N Y TRABAJO PARA oCheck VACSET Y oCheck VACPUMP oocccccccconcccononccconaccnancccnnnconannrnnannnnns 20 BRO sida o AA APP 20 A SS ai CANA AMA AA ian 20 9 1 2 oCheck VacPump WT 21 9 2 Montaje de oCheck VacSet oooooococononnccocnoococnancncnnrcrr mann 22 9 2 1 Preparaci n para el lavado y la uni n del ADN ccooccccccccccconoconocononcnonononcnonnncnnonanonanenon 22 9 2 2 Preparaci n para la eluci n del ADN cn iaa 23 9 3 Montaje de oCheck VaACPUMP ouunaoau ana aa aa aa a RR Ea a REED a REED a RR DD REED O REED EEN KEEN REED ARE R DD RARA Da KEEN 24 9 4 Preparaci n del sistema de VaC O ooocconncccncccncconncconcconncnnncnnncnoncnnnnrnancrnnrrnnnrnnnrrnnrrnnrrnnnrnnn
8. 3 Protocolo est ndar Para usar el Equipo de extracci n de ADN oCheck Preparaci n con banda de 8 columnas con vac o se necesita un sistema de vac o adecuado El equipo necesario as como las instrucciones de instalaci n y trabajo se describen en el cap tulo 9 10 3 1 Preparaci n mg Compruebe que la centr fuga est ajustada a temperatura ambiente 18 25 C mg Prepare las muestras seg n las instrucciones del cap tulo 10 2 mg Caliente los bloques de calentamiento o los ba os Mar a a 56 C y a 70 C respectivamente mg Antes de la eluci n incube el tamp n E de eluci n a 70 C mg Aseg rese de que las soluciones de trabajo se hayan preparado seg n las instrucciones del cap tulo 10 1 10 3 2 Prelisis mg A ada 80 ul de tamp n L1 mg A ada 2 4 pl de la soluci n de ARN portador preparada mg A ada 20 pl de la soluci n de proteinasa K mg Cierre la tapa y mezcle brevemente con un Vortex de impulso Si est procesando varias muestras la proteinasa K el tamp n L1 y el ARN portador se deber an premezclar inmediatamente antes del uso No mezcle nunca el tamp n L1 y la proteinasa K m s de 10 15 minutos antes de a adirlos a la muestra La proteinasa K tiene tendencia a la autolisis en tamp n L1 en ausencia de un sustrato mg Incube a 56 C durante al menos 30 minutos Agite las muestras en una Thermomixer a 650 rpm Si usa un bloque de calentamiento o un ba o Mar a mezcle las muestras con Vor
9. ARN portador y proteinasa K seg n se indica en la secci n 8 1 o la 10 1 A ada etanol a los lisados antes de cargarlos en las columnas e Precaliente el tamp n E a 70 C antes de realizar la eluci n Aplique el tamp n E directamente en el centro de la membrana de s lice e La eficiencia de la eluci n desciende notablemente si la eluci n se realiza con tampones a un pH lt 7 0 Use tampones de eluci n ligeramente alcalinos como el tamp n E pH 8 5 eLa muestra no se ha mezclado y homogeneizado totalmente con el tamp n L1 y la proteinasa K La mezcla se debe mezclar en rgicamente en un Vortex inmediatamente despu s de a adirse el tamp n L1 e Disminuci n de la actividad de la proteinasa K divida la soluci n en al cuotas y cons rvela a 20 C durante como m ximo 6 meses No vuelva a congelarla e Prepare los tampones L4 y W2 y las soluciones de ARN portador y proteinasa K seg n se indica en la secci n 8 1 o la 10 1 A ada etanol a los lisados antes de cargarlos en las columnas e Aseg rese de centrifugar al menos durante 1 minuto a 11 000 g a fin de eliminar todo el tamp n W2 etan lico antes de eluir el ADN Si por cualquier motivo el nivel del tamp n W2 ha alcanzado la salida de la columna antes de secarse repita el centrifugado e No refrigere el tamp n W2 antes de usarlo Si est fr o no eliminar la sal de forma eficiente Lleve el tamp n W2 a temperatura ambiente antes de usarlo e No eluya el AD
10. Manual de instrucciones Revisi n 00 Febrero de 2011 93 Montaje de oCheck VacPump Coloque oCheck VacPump sobre una superficie firme Se debe montar oCheck VacPump tal y como se muestra en la figura ba Para conectar oCheck VacPump al sistema de vac o use la manga m s larga de las dos mangas de conexi n incluidas Corte la manga de conexi n m s corta en dos partes aproximadamente de 5 y 4 cm Use la manga de conexi n de 5 cm para conectar oCheck VacPump con el regulador de vac o Fije el silenciador en el extremo opuesto de oCheck VacPump en la salida mediante la manga de conexi n de 4 cm Silenciador aqu V lvula de sistema Rueda de ajuste de vac o Figura 5 a Montaje de oCheck VacPump b Regulador de vac o 9 4 Preparaci n del sistema de vac o Aseg rese de que la tapa del sistema de vac o el soporte de banda de columnas y las bandas de columnas est n colocadas correctamente Cierre la v lvula del sistema de vac o figura 5a Arranque la bomba de vac o Ajuste el vac o seg n el protocolo del equipo mediante el regulador de vac o figura 5b Abra la rueda de ajuste hasta alcanzar el nivel de vac o necesario 9 5 Aplicaci n del vac o Cargue las muestras en las bandas de columnas individuales Abra la v lvula del sistema de vac o y en caso necesario presione las bandas de columnas brevemente hasta que empiece el flujo 9 6 Ventilaci n del sistema de vac o Cuando las muestras h
11. Manual de instrucciones Revisi n 00 Febrero de 2011 El procedimiento completo de extracci n del ADN con el Equipo de extracci n de ADN oCheck debe realizarse en la sala 1 dedicada a la extracci n de ADN Al salir de esta sala es necesario cambiarse de bata En la secuencia de trabajo de oCheck la extracci n de ADN es el proceso m s susceptible de contaminaci n y por tanto resulta esencial cumplir estrictamente las instrucciones que figuran en este documento Asimismo para evitar la contaminaci n se deben seguir las directrices descritas en la secci n 7 3 1 En la sala 2 la mezcla de reacci n para PCR se prepara y divide en una superficie limpia La adici n del ADN extra do en la sala 1 debe realizarse en otro espacio de la sala 2 Despu s de salir de esta habitaci n es necesario cambiarse la bata En la tercera sala del laboratorio se llevan a cabo los pasos de lavado y de reacci n de hibridaci n En la sala 3 se instala tambi n el CheckScanner junto con el software CheckReport para realizar el an lisis final de los ensayos de la gama de productos oCheck 7 3 Advertencias y precauciones 7 3 1 Prevenci n de la contaminaci n e Deben usarse batas de laboratorio durante todos los procedimientos utilizando una bata diferente para cada sala del laboratorio e Se deben utilizar guantes para cada paso del an lisis y estos se deben cambiar en cada nuevo paso e Limpieza del laboratorio el lugar de trabajo se d
12. Vortex 70 C durante 15 minutos Centrifugar brevemente 4 AJUSTE DE LAS CONDICIONES DE UNI N DELADN mg 300 pl de etanol m Agitar brevemente en el Vortex mg Centrifugar brevemente Equipo de extracci n de ADN oCheck Manual de instrucciones Revisi n 00 Febrero de 2011 Extracci n del ADN p R O T O C O L O Dm e 11 02 D Extracci n del ADN 5 UNI N DEL ADN mg pipetear 900 pl de lisado en las bandas de columnas m Aplicar vac o 200 mbar mo Evitar la formaci n de espuma LAVADO DE BANDAS DE COLUMNAS 1 lavado 600 ul de tamp n W1 2 lavado 900 ul de tamp n W2 3 lavado 900 ul de tamp n W2 Para cada paso de lavado mg 30 60 segundos mg 200 mbar mg Evitar la formaci n de espuma SECADO DE BANDAS DE COLUMNAS p R O T O C O L O 10 minutos a 600 mbar ELUCI N DEL ADN 100 ul de tamp n E precalentado a 70 C 5 minutos a temperatura ambiente 18 25 C Aplicar vac o 400 mbar Evitar la formaci n de espuma Reducci n de la presi n atmosf rica seg n la viscosidad de la muestra puede ser necesario aumentar el tiempo de filtrado o el vac o por ejemplo de 200 a 400 mbar Dm e m 02 D Equipo de extracci n de ADN oCheck Manual de instrucciones Revisi n 00 Febrero de 2011
13. contenedor de desechos en el lavavajillas 22 Equipo de extracci n de ADN oCheck Manual de instrucciones Revisi n 00 Febrero de 2011 9 2 2 Preparaci n para la eluci n del ADN Para los pasos de eluci n del ADN paso 10 3 8 del protocolo se debe modificar el sistema de vac o tal como se muestra en la figura Ab IT DI DI DI DI DI Retire el soporte de banda de columnas junto con las bandas de columnas y col quelos sobre una hoja de papel limpia suministrada con el equipo Retire la tapa del sistema de vac o y extraiga el contenedor de desechos usado Inserte separadores Round Well Block y encima la gradilla de microtubos por los laterales estrechos de la base del sistema de vac o figura 4b Coloque la gradilla de microtubos sobre los separadores Coloque la cantidad adecuada de tubos PCR etiquetados cada segunda fila de la gradilla de microtubos empezando por la fila n 2 de la gradilla de microtubos Cierre el sistema de vac o y coloque las bandas de columnas encima Compruebe que cada banda de columnas est situada directamente sobre un tubo PCR para recolectar el ADN eluido figura 4c Vuelva a comprobar que todas las bandas de columnas y las bandas de columnas ciegas sigan estando correctamente encajadas en el soporte de banda de columnas Figura 4c Cada banda de columnas debe estar situada directamente sobre un tubo PCR de la banda PCR Equipo de extracci n de ADN oCheck
14. es necesario separar las zonas dedicadas a la extracci n y a la amplificaci n No introduzca nunca un producto de amplificaci n en una zona destinada exclusivamente a la extracci n Ambas zonas deben estar provistas de equipos consumibles batas de laboratorio y guantes diferentes No transfiera nunca batas guantes ni equipo de la zona dedicada a la extracci n a la zona dedicada a la amplificaci n 7 2 Separaci n de las salas La figura 1 muestra un ejemplo de c mo se puede dividir un laboratorio en tres secciones diferentes Una secci n se utiliza para la extracci n de ADN otra se dedica a la preparaci n y generaci n de las reacciones PCR y la ltima se dedica a la hibridaci n y al an lisis Cada sala se debe utilizar exclusivamente para la aplicaci n o t cnica indicada a fin de impedir la contaminaci n de las muestras El uso de diferentes colores puede ayudar a evitar un intercambio accidental de equipo y consumibles entre las zonas No se deben intercambiar equipos ni consumibles entre las diferentes salas o espacios del laboratorio Por tanto es obligatoria la duplicaci n de equipos y consumibles Figura 1 Separaci n de salas en la secuencia de trabajo de oCheck Sala 1 Extracci n de ADN Sala 2 Preparaci n de la reacci n PCR y divisi n de la mezcla de reacci n en una superficie limpia espacio separado para la adici n de ADN plantilla Sala 3 Hibridaci n y an lisis Equipo de extracci n de ADN oCheck
15. las fichas de datos de seguridad Frases de riesgo R10 Inflamable R22 Nocivo en caso de ingesti n R 36 37 38 Irrita los ojos las v as respiratorias y la piel R 36 38 Irrita los ojos y la piel R 42 Posibilidad de sensibilizaci n por inhalaci n Frases de seguridad S Mant ngase el recipiente bien cerrado S16 Conservar alejado de fuentes de ignici n No fumar S 22 No respirar el polvo S 24 Ev tese el contacto con la piel 529 Ev tese el contacto con los ojos S 26 En caso de contacto con los ojos l vese inmediatamente con agua abundante y acuda a un m dico S 36 37 Utilizar indumentaria y guantes de protecci n adecuados La versi n actual de las fichas de datos de seguridad de este producto se puede descargar del sitio web de Greiner Bio One www gbo com bioscience biochips_download Equipo de extracci n de ADN oCheck Manual de instrucciones Revisi n 00 Febrero de 2011 5 ELIMINACI N DE RESIDUOS El clorhidrato de guanidina en los tampones L2 y W1 puede formar compuestos muy reactivos cuando se mezcla con lej a No se debe a adir lej a ni soluciones cidas directamente a los residuos de preparaci n de las muestras La contaminaci n de los residuos l quidos con material infeccioso de desecho es muy improbable aunque no puede quedar totalmente excluida Por lo tanto los residuos l quidos se deben considerar como infecciosos y por tanto manipularse y eliminarse de acuerdo con las normativas de seguri
16. n actual de las fichas de datos de seguridad para este producto se puede descargar del sitio web de Greiner Bio One www gbo com bioscience biochips_download Equipo de extracci n de ADN oCheck Manual de instrucciones Revisi n 00 Febrero de 2011 8 PREPARACI N CON UNA COLUMNA n de cat logo 515 040 8 1 Preparaci n de soluciones de trabajo y condiciones de almacenamiento Todos los componentes del equipo se deben almacenar a temperatura ambiente 18 25 C y permanecer n estables durante dos a os a partir de la fecha de su fabricaci n Antes de comenzar con el protocolo del Equipo de extracci n de ADN oCheck prepare las siguientes soluciones 1 Soluci n de proteinasa K antes de utilizar el equipo por primera vez a ada 1 35 ml de tamp n de proteinasa PKB para disolver la proteinasa K liofilizada Divida la soluci n en al cuotas y almac nela a 20 C durante como m ximo 6 meses No vuelva a congelarla 2 Tamp n W2 A ada 56 ml de etanol p a gt 99 8 al concentrado de tamp n W2 Marque la fecha actual en la etiqueta del frasco El tamp n W2 permanece estable a temperatura ambiente 18 25 C durante como m ximo un a o 3 Tamp n L4 transfiera el tamp n L2 al reactivo L3 en su totalidad y mezcle bien Adhiera al frasco la etiqueta L4 proporcionada con el equipo Marque la fecha actual en la etiqueta del frasco El tamp n L4 resultante permanece estable durante como m ximo un a o a temperatura amb
17. Check CT NG Greiner Bio One n de cat logo 504 002 hasta que no haya finalizado la validaci n El Equipo de extracci n de ADN oCheck est previsto para ser utilizado exclusivamente con ensayos de la gama de productos oCheck Greiner Bio One Frickenhausen Alemania que especifiquen el uso del Equipo de extracci n de ADN oCheck en sus manuales de instrucciones El Equipo de extracci n de ADN oCheck cumple los requisitos de la directiva sobre productos sanitarios para diagn stico in vitro 98 78 CE y por tanto presenta la marca de conformidad CE El producto est previsto para ser utilizado NICAMENTE por profesionales como t cnicos y personal m dico formados en t cnicas de biolog a molecular 6 2 Uso indebido El Equipo de extracci n de ADN oCheck NO est previsto para su uso con CarnoCheck Greiner Bio One ParoCheck Greiner Bio One ni ning n otro producto que no forme parte de la gama de productos oCheck Equipo de extracci n de ADN oCheck Manual de instrucciones Revisi n 00 Febrero de 2011 6 3 Muestras Para la aplicaci n posterior de PapilloCheck Greiner Bio One n de cat logo 465 060 y PapilloCheck high risk Greiner Bio One n de cat logo 505 060 se ha dise ado y probado el Equipo de extracci n de ADN oCheck para la extracci n de ADN viral y gen mico humano de citolog as cervicouterinas humanas obtenidas con uno de los sistemas de recogida de muestras siguientes e Pap
18. Collection Kit STRAW Greiner Bio One n de cat logo 453 101 se pueden procesar directamente mg Pipetee 250 pul de la muestra de orina en un microtubo de 1 5 2 ml Se recomienda utilizar microtubos con tapa de seguridad o tapa roscada para los pasos de lisis Para validar la extracci n de ADN se deber a utilizar un control de muestra negativo en cada ciclo de extracci n Equipo de extracci n de ADN oCheck Manual de instrucciones Revisi n 00 Febrero de 2011 8 3 Protocolo est ndar 8 3 1 Preparaci n IT IT IT IT DI Compruebe que la centr fuga est ajustada a temperatura ambiente 18 25 C Prepare las muestras seg n las instrucciones del cap tulo 8 2 Caliente los bloques de calentamiento o los ba os Mar a a 56 C y a 70 C respectivamente Antes de la eluci n incube el tamp n E de eluci n a 70 C Aseg rese de que las soluciones de trabajo se hayan preparado seg n las instrucciones del cap tulo 8 1 8 3 2 Prelisis IT Ir Ir DI IT A ada 80 ul de tamp n L1 A ada 2 4 ul de la soluci n de ARN portador preparada A ada 20 ul de la soluci n de proteinasa K Cierre la tapa y mezcle brevemente con un Vortex de impulso Incube a 56 C durante al menos 30 minutos Agite las muestras en una Thermomixer a 650 rpm Si usa un bloque de calentamiento o un ba o Mar a mezcle las muestras con Vortex de vez en cuando durante el periodo de incubaci n Si est procesan
19. Equipo de extracci n de ADN oCheck Manual de instrucciones Preparaci n con una columna n de cat logo 515 040 Preparaci n con banda de 8 columnas n de cat logo 515 050 Para uso diagn stico in vitro nicamente Revisi n 00 Febrero de 2011 por parte de personal de laboratorio profesional Greiner Bio One GmbH Maybachstr Ze 72636 Frickenhausen Alemania gt Tel fono 49 0 7022 948 0 Fax 49 0 7022 948 514 info de gbo com e www gbo com bioscience g re ner b o One e GLOSARIO DE S MBOLOS en de fr es pt ni da SV pl no el tr Do not reuse Nicht wieder verwen den Ne pas r utiliser No utilizar m s Non riutilizza bile N o utilz ar mais Niet opnieuw gebruiken M ikke genbru ges Far ej ateran vandas Nie stosowa ponownie M ikke brukes flere ganger Mpol v p as xp ons Yeniden ullanmayin Use by Mindes tens haltbar bis Date limite de conser vation jusqu au A utilizar preferib lemente antes de Da utilizzare entro e non oltre Autilizar prefer velmente antes de Tenminste houdbaar tot Anvendes senest Sista f r bruknings dag Termin zydatnosci holdbar til Xp on wWG Son kullanma tarihi Consult Instruc tions for Use Vor Gebrauch Anwei sung lesen Lire les in structions avant utilisation Antes de usar lea las in
20. M Qiagen Hilden Alemania deben diluirse en agua destilada 100 ul de muestra 150 ul de agua destilada En general si la muestra de la citolog a cervicouterina est muy concentrada y ya agregada es necesario diluir y homogeneizar la muestra antes de comenzar el proceso de extracci n Las muestras de citolog as cervicouterinas que est n muy diluidas y no presenten c lulas visibles deben concentrarse a fin de obtener un mayor volumen de c lulas para la extracci n Centrifugue hasta 1000 pul de la muestra durante 5 minutos a 11 000 g y resuspenda el pellet en 250 ul de agua destilada Este paso de concentraci n solo se puede aplicar a las muestras de citolog as cervicouterinas tomadas mediante PapilloCheck Collection Kit el medio de toma de muestras PreservCyt o el medio de toma de muestras Surepath Si se us el medio de toma de muestras STM no es posible concentrar mediante centrifugado mg Pipetee 250 pl de la soluci n de la muestra en un microtubo de 1 5 2 ml Para evitar la contaminaci n use microtubos con tapa de seguridad o tapa roscada para los pasos de lisis Se recomienda validar el procedimiento completo de aislamiento del ADN en cada ciclo de extracci n de ADN utilizando un control de muestra negativo 8 2 2 Preparaci n de muestras para PelvoCheck CT NG Las muestras de orina humana que se tomen con e PelvoCheck Collection Kit SAFE Greiner Bio One n de cat logo 453 100 e PelvoCheck
21. N con el tamp n TE El EDTA puede inhibir las reacciones enzim ticas Vuelva a purificar el ADN y el yalo con el tamp n E e Si la proporci n A260 280 del eluado es inferior a 1 6 repita el procedimiento de purificaci n a ada al eluado 1 volumen de tamp n L4 m s 1 volumen de etanol 96 100 Cargue la mezcla en una columna de centrifugado y proceda a realizar el paso de uni n del ADN secci n 8 3 5 o 10 3 5 del protocolo est ndar Equipo de extracci n de ADN oCheck Manual de instrucciones Revisi n 00 Febrero de 2011 33 12 ASISTENCIA T CNICA Greiner Bio One cuenta con un departamento de servicio t cnico compuesto por cient ficos con amplia experiencia tanto pr ctica como te rica en biolog a molecular y en los productos oCheck Si tiene cualquier duda o problema con los productos oCheck no dude en ponerse en contacto con su distribuidor local de Greiner Bio One 13 CARACTER STICAS DE RENDIMIENTO El Equipo de extracci n de ADN oCheck es un accesorio de diagn stico in vitro para los ensayos de la gama de productos oCheck Se ha comprobado el rendimiento anal tico y espec fico del Equipo de extracci n de ADN oCheck junto con el ensayo relevante Consulte los manuales de instrucciones de los productos oCheck correspondientes para una descripci n detallada del rendimiento PapilloCheck Greiner Bio One n de cat logo 465 060 PapilloCheck high risk Greiner Bio One n de cat logo 505 060
22. a ambiente No deseche el resto del lisado mg Deseche el tubo de colecci n con el flujo Para evitar la contaminaci n cambie los guantes antes de iniciar este paso m Prepare nuevos tubos de colecci n y coloque las columnas en nuevos tubos de colecci n m Pipetee el resto de los 450 pul de lisado en la columna mg Centrifugue a 11 000 g durante 1 minuto a temperatura ambiente Para evitar la contaminaci n cambie los guantes antes de iniciar este paso mg Deseche el tubo de colecci n con el flujo y coloque las columnas en nuevos tubos de colecci n 8 3 6 Lavado de las columnas mg Aplique 500 ul de tamp n W1 en la columna mg Centrifugue a 11 000 g durante 1 minuto a temperatura ambiente mg Deseche el tubo de colecci n con el flujo y coloque la columna en un nuevo tubo de colecci n mg Aplique 600 ul de tamp n W2 en la columna mg Centrifugue a 11 000 g durante 1 minuto a temperatura ambiente mg Deseche el tubo de colecci n con el flujo y coloque la columna en un nuevo tubo de colecci n 8 3 7 Secado de las columnas mm Centrifugue a 11 000 g durante 1 minuto para secar la membrana totalmente Este paso es necesario para eliminar los rastros de etanol El etanol presente en el tamp n W2 inhibe las reacciones enzim ticas y debe ser completamente eliminado antes de la eluci n del ADN Equipo de extracci n de ADN oCheck Manual de instrucciones Revisi n 00 Febrero de 2011 8 3 8 Eluci n del ADN
23. ac o b V lvula del sistema de vac o mg Detenga el vac o inmediatamente despu s de que todo el l quido haya pasado por las columnas aproximadamente 30 segundos cerrando la v lvula del sistema de vac o para evitar la formaci n de espuma m Apague la bomba de vac o y libere el vac o Equipo de extracci n de ADN oCheck Manual de instrucciones Revisi n 00 Febrero de 2011 10 3 6 Lavado de bandas de columnas Para los siguientes pasos se recomienda el uso de la pipeta de 8 canales y los dep sitos de tamp n para los vol menes de tamp n necesarios cuando se usan dep sitos de tamp n consulte la tabla 1 Si usa dep sitos de tamp n prepare la cantidad adecuada de soluciones tamp n N mero de muestras que se extraer n Tamp n W1 28 5 ml Tamp n W2 Tabla 1 Cantidad necesaria de soluciones tamp n para n x muestras Antes de usar por primera vez a ada 200 ml de etanol consulte tambi n el cap tulo 10 1 mg A ada 600 ul de tamp n W1 a cada pocillo de las bandas de columnas figura 9 a b Figura 9 a Pipetee tamp n W1 desde el dep sito de tamp n b Adici n de tamp n W1 alos pocillos de las bandas de columnas mg Ajuste el vac o a 200 mbar con el regulador de vac o www Aplique lentamente el vac o abriendo la v lvula del sistema de vac o hasta que todos los lisados pasen por las columnas figura 8 mg Detenga el vac o inmediatamente cerrando la v lvula del sistema de
24. ada Las muestras de citolog as cervicouterinas humanas que se tomen con e Medio de toma de muestras STM Qiagen Hilden Alemania deben diluirse en agua destilada 100 ul de muestra 150 ul de agua destilada En general si la muestra de la citolog a cervicouterina est muy concentrada y ya agregada es necesario diluir y homogeneizar la muestra antes de comenzar el proceso de extracci n Las muestras de citolog as cervicouterinas que est n muy diluidas y no presenten c lulas visibles deben concentrarse a fin de obtener un mayor volumen de c lulas para la extracci n Centrifugue hasta 1000 ul de la muestra durante 5 minutos a 11 000 g y resuspenda el pellet en 250 ul de agua destilada Este paso de concentraci n solo se puede aplicar a las muestras de citolog as cervicouterinas tomadas con PapilloCheck Collection Kit el medio de toma de muestras PreservCyt o el medio de toma de muestras Surepath Si se us el medio de toma de muestras STM no es posible concentrar mediante centrifugado mg Pipetee 250 pl de la soluci n de la muestra en un microtubo de 1 5 2 ml Para evitar la contaminaci n use microtubos con tapa de seguridad o tapa roscada para los pasos de lisis Se recomienda validar el procedimiento completo de aislamiento del ADN en cada ciclo de extracci n de ADN mediante un control de muestra negativo Equipo de extracci n de ADN oCheck Manual de instrucciones Revisi n 00 Febrero de 2011 10
25. al de instrucciones Revisi n 00 Febrero de 2011 2 2 Preparaci n con banda de 8 columnas n de cat logo 515 050 Consumibles N de cat logo de Greiner Bio One Cantidad unidades Equipo de extracci n de ADN oCheck Preparaci n con banda de 8 columnas 915 050 12 x 8 prep Puntas de filtro de micropipeta libres de desoxirri bonucleasa est riles 765 288 Puntas de filtro de 0 5 10 yl 7174 288 Puntas de filtro de 0 5 20 pl 772 288 Puntas de filtro de 10 100 pl 739 288 Puntas de filtro de 10 200 pl 750 288 Puntas de filtro de 100 1000 pl Tiras de tubo con 8 tubos PCR sin tapa 673 210 Tiras de tapa para tiras de tubo con 8 tubos 373 270 Tubos PCR singulares 671 201 Equipo N de cat logo de Greiner Bio One Cantidad unidades oCheck VacSet conjunto de vac o 863 080 1 oCheck VacPump bomba de vac o 863 070 1 Otros consumibles necesarios e Microtubos de 1 5 2 ml con tapa de seguridad o tapa roscada para los pasos de lisis e Dep sito de tamp n desechable vol menes 25 y 100 ml e Puntas de micropipeta para volumen de 1200 ul para multipipeta de 8 canales e Etanol pa gt 99 8 e Guantes de un solo uso Otro equipo necesario e Microcentr fuga adecuada para microtubos de 1 5 2 ml y 11 000 g e Vortex e Bloque de calentamiento ba o Mar a o Thermomixer adecuado para microtubos de 1 5 2 ml para incubaci n a 70 y 56 C e Micropipetas de entre 1 y 1000 pl e Multipipeta de 8 canales para
26. al uso del vac o se eliminan los prolongados pasos de centrifugado y decantaci n Los Equipos de extracci n de ADN oCheck est n basados en la tecnolog a de ultrafiltrado y ofrecen una forma r pida y c moda de purificar cidos nucleicos Cuando use el Equipo de extracci n de ADN oCheck Preparaci n con banda de 8 columnas con vac o se recomienda utilizar oCheck VacSet n de cat logo 863 080 y oCheck VacPump n de cat logo 863 070 9 1 Contenido 9 1 1 oCheck VacSet Gradilla de microtubos Bandas de columnas ciegas 12 Separadores Base del sistema de vac o SAGA Contenedores de desechos Regulador de vac o Figura 2 Contenido de oCheck VacSet 20 Equipo de extracci n de ADN oCheck Manual de instrucciones Revisi n 00 Febrero de 2011 9 1 2 oCheck VacPump oCheck VacPump Mangas de conexi n Silenciador Figura 3 Contenido de oCheck VacPump 21 Equipo de extracci n de ADN oCheck Manual de instrucciones Revisi n 00 Febrero de 2011 9 2 Montaje de oCheck VacSet mg Coloque la base del sistema de vac o sobre una superficie firme El sistema de vac o debe prepararse tal como se muestra en la figura 4 a b Soporte de banda de EE Soporte de banda columnas con bandas EE e de columnas de columnas s en Ee con bandas de pOT columnas Tapa del sistema Tapa del sistema de vac o de vac o Contenedor de Gradilla de desechos microtubos Gradilla de mi
27. ayan pasado por el filtro de las bandas de columnas cierre la v lvula del sistema de vac o y detenga la bomba de vac o Espere unos 30 segundos hasta que el soporte de banda de columnas con las bandas de columnas se pueda extraer con facilidad Equipo de extracci n de ADN oCheck Manual de instrucciones Revisi n 00 Febrero de 2011 10 PREPARACI N CON BANDA DE 8 COLUMNAS n de cat logo 515 050 10 1 Preparaci n de soluciones de trabajo y condiciones de almacenamiento Todos los componentes del equipo se deben conservar a temperatura ambiente 18 25 C y permanecer n estables durante dos a os a partir de la fecha de su fabricaci n Antes de comenzar con el protocolo del Equipo de extracci n de ADN oCheck prepare las siguientes soluciones 1 Soluci n de proteinasa K antes de utilizar el equipo por primera vez a ada 3 35 ml de tamp n de proteinasa PKB para disolver la proteinasa K liofilizada Divida la soluci n en al cuotas y almac nela a 20 C durante como m ximo 6 meses No vuelva a congelarla Tamp n W2 A ada 200 ml de etanol p a gt 99 8 al concentrado de tamp n W2 Marque la fecha actual en la etiqueta del frasco El tamp n W2 permanece estable a temperatura ambiente 18 25 C durante como m ximo un a o Tamp n L4 transfiera el tamp n L2 al reactivo L3 en su totalidad y mezcle bien Adhiera al frasco la etiqueta L4 proporcionada en el equipo Marque la fecha actual en la etique
28. crotubos Base del sistema Separador de vac o Separador Round Well Block Base del sistema de vac o V lvula de sistema de vac o Figura 4 a Preparaci n para el lavado y la uni n del ADN b Preparaci n para la eluci n del ADN 9 2 1 Preparaci n para el lavado y la uni n del ADN mg Para los procedimientos de lavado y uni n del ADN pasos del protocolo 10 3 5 10 3 7 prepare el sistema de vac o tal como se muestra en la figura 4a mg Coloque uno de los dos contenedores de desechos en el interior de la base del sistema de vac o mg Cierre la base del sistema de vac o con la tapa del sistema de vac o mg Coloque el soporte de banda de columnas en la junta de goma de la tapa del sistema de vac o mg Inserte la cantidad necesaria de bandas de columnas en el soporte de banda de columnas mg Aseg rese de que las bandas de columnas est n insertadas correctamente y de que las bandas de columnas queden fijadas firmemente al soporte de banda de columnas se escuchar un clic Si se procesan menos de 48 muestras simult neamente solamente se debe insertar la cantidad necesaria de bandas de columnas en el soporte y el resto de las posiciones se deben rellenar en el soporte de banda de columnas con la cantidad adecuada de bandas de columnas ciegas Aseg rese de que las bandas de columnas y las bandas de columnas ciegas ajusten correctamente en el soporte de banda de columnas antes de aplicar el vac o No lave el
29. dad locales Respete las normativas locales provinciales y nacionales relativas a la eliminaci n de residuos Equipo de extracci n de ADN oCheck Manual de instrucciones Revisi n 00 Febrero de 2011 6 INTRODUCCI N 6 1 Uso previsto El Equipo de extracci n de ADN oCheck Greiner Bio One n de cat logo 515 040 o n de cat logo 515 050 es un equipo de diagn stico in vitro dise ado para la preparaci n de ADN procedente de muestras de origen humano para su posterior an lisis con ensayos de la gama de productos oCheck El m todo utilizado para el aislamiento de cido nucleico en las diversas versiones del Equipo de extracci n de ADN oCheck genera ADN adecuado para su posterior an lisis directo con los siguientes equipos Equipo de extracci n de ADN oCheck Preparaci n con una columna n de cat logo 515 040 e PapilloCheck Greiner Bio One n de cat logo 465 060 e PapilloCheck high risk Greiner Bio One n de cat logo 505 060 e PelvoCheck CT NG Greiner Bio One n de cat logo 504 002 Equipo de extracci n de ADN oCheck Preparaci n con banda de 8 columnas n de cat logo 515 050 e PapilloCheck Greiner Bio One n de cat logo 465 060 e PapilloCheck high risk Greiner Bio One n de cat logo 505 060 No se recomienda el uso del Equipo de extracci n de ADN oCheck Preparaci n con banda de 8 columnas para aislar el ADN para su an lisis posterior con el ensayo Pelvo
30. de la base del sistema de vac o figura 10 mg Coloque la gradilla de microtubos sobre los separadores mg Coloque la cantidad adecuada de tubos PCR etiquetados cada segunda fila de la gradilla de microtubos empezando por la fila n 2 de la gradilla de microtubos mg Cierre el sistema de vac o y coloque las bandas de columnas encima Compruebe que cada banda de columnas est situada directamente sobre un tubo PCR para recolectar el ADN eluido figura 11 Vuelva a comprobar que todas las bandas de columnas y las bandas de columnas ciegas sigan estando fijadas correctamente en el soporte de banda de columnas 31 Equipo de extracci n de ADN oCheck Manual de instrucciones Revisi n 00 Febrero de 2011 Figura 11 Cada banda de columnas debe estar situada directamente sobre un tubo PCR de la banda PCR DI DI Ir DI DI DI Pipetee 100 ul de tamp n E precalentado 70 C directamente en la membrana de cada banda de columnas utilizando una micropipeta monocanal Se deben utilizar puntas nuevas para cada muestra Incube durante 5 minutos a temperatura ambiente Aplique lentamente el vac o hasta un m ximo de 400 mbar abriendo la v lvula del sistema de vac o Detenga r pidamente el vac o cerrando la v lvula del sistema de vac o inmediatamente despu s de que todo el l quido haya pasado por las columnas para evitar la formaci n de espuma Apague la bomba de vac o y libere el vac o
31. do varias muestras la proteinasa K el tamp n L1 y el ARN portador se deber an premezclar inmediatamente antes del uso No mantenga mezclados nunca el tamp n L1 y la proteinasa K durante m s de 10 15 minutos antes de a adirlos a la muestra La proteinasa K tiene tendencia a la autolisis en el tamp n L1 en ausencia de un sustrato 8 3 3 Liss DI DI DI Ir Centrifugue brevemente el microtubo para eliminar las gotas del interior de la tapa A ada 250 ul de tamp n L4 Cierre la tapa y mezcle brevemente con un Vortex de impulso durante 10 segundos Incube a 70 C durante 15 minutos Cierre bien la tapa de los microtubos para evitar una apertura accidental 8 3 4 Ajuste delas condiciones de uni n del ADN DI DI DI IT Centrifugue brevemente el microtubo para eliminar las gotas del interior de la tapa A ada 300 ul de etanol p a gt 99 8 a la muestra Cierrre la tapa inmediatamente y mezcle brevemente con un Vortex de impulso durante 15 segundos Centrifugue brevemente el microtubo para eliminar las gotas del interior de la tapa Equipo de extracci n de ADN oCheck Manual de instrucciones Revisi n 00 Febrero de 2011 8 3 5 Uni n del ADN Para evitar la contaminaci n cambie los guantes antes de iniciar este paso mg Para cada muestra coloque una columna en un tubo de colecci n mg Pipetee con cuidado 450 pl de los lisados en la columna y centrifugue a 11 000 g durante 1 minuto a temperatur
32. ebe descontaminar con un limpiador adecuado antes y despu s de trabajar e Microtubos no toque nunca la parte interior de la tapa del microtubo Para evitar la contaminaci n cruzada abra solamente un tubo cada vez Para evitar la contaminaci n use microtubos con tapa de seguridad o tapa roscada para los pasos de lisis e Se deben utilizar puntas de filtro de micropipeta adecuadas est riles libres de desoxirribonucleasa ribonucleasa y ADN humano Es preciso cambiar siempre las puntas de pipeta tras una transferencia de l quido 7 3 2 Precauciones generales e Cuando reciba el Equipo de extracci n de ADN oCheck compruebe que los componentes no est n da ados Si uno de los componentes estuviera da ado por ejemplo frascos de tamp n p ngase en contacto con su distribuidor local de Greiner Bio One No utilice los componentes da ados del equipo ya que podr a obtener unos resultados deficientes e No utilice reactivos caducados e No utilice el Equipo de extracci n de ADN oCheck una vez superada la fecha de caducidad e No mezcle reactivos procedentes de lotes diferentes e Use nicamente los reactivos y el equipo proporcionados con el equipo de extracci n y aquellos recomendados por el fabricante e Es necesario realizar comprobaciones y calibraciones regulares de las micropipetas del ba o Mar a y del bloque de calentamiento El pipeteado de peque as cantidades de l quido en el intervalo de microlitros resulta di
33. entes celulares macromoleculares solubles se eliminan durante el lavado con tampones etan licos Finalmente se eluye el ADN viral bacteriano y gen mico humano puro a baja fuerza i nica en un tamp n de eluci n ligeramente alcalino Una vez purificado el ADN se obtiene una soluci n adecuada para el an lisis directo con los ensayos de la gama de productos oCheck Equipo de extracci n de ADN oCheck Manual de instrucciones Revisi n 00 Febrero de 2011 7 INSTRUCCIONES PARA LA SECUENCIA DE TRABAJO DE oCheck 7 1 Instrucciones generales Las siguientes instrucciones se basan en la experiencia de laboratorio con la implantaci n de las t cnicas de vanguardia actualmente utilizadas en biolog a molecular y pretenden garantizar la m xima seguridad para los m todos basados en PCR Se deben tomar las precauciones que se estimen razonables cuando se usa el Equipo de extracci n de ADN oCheck junto con el an lisis posterior del ADN purificado con ensayos de la gama de productos oCheck En general los procesos de biolog a molecular tales como la detecci n amplificaci n y extracci n de ADN deben ser realizados por personal con la formaci n adecuada Adem s es preciso contar con una secuencia de trabajo clara y bien estructurada que impida la obtenci n de resultados err neos como consecuencia de la degradaci n o contaminaci n de los productos de amplificaci n del cido nucleico en las muestras Para garantizar dicha secuencia
34. ficultoso Por lo tanto realice el pipeteado con las micropipetas con la mayor precisi n posible e Todos los pasos que conlleven centrifugado deber an realizarse a temperatura ambiente 18 25 C e Los reactivos no utilizados y los residuos deben eliminarse de acuerdo con las correspondientes directrices regionales y nacionales Equipo de extracci n de ADN oCheck Manual de instrucciones Revisi n 00 Febrero de 2011 7 3 3 Seguridad en el trabajo e Este equipo est destinado nicamente al diagn stico in vitro y debe ser utilizado exclusivamente por personal formado en las pr cticas de laboratorio para el diagn stico in vitro e No pipetee nunca las soluciones utilizando la boca e No coma beba fume ni aplique productos cosm ticos en las zonas de trabajo e Extreme la precauci n al manipular las muestras biol gicas que contengan material de origen humano potencialmente infeccioso Para minimizar el riesgo de infecci n con material potencialmente infeccioso se recomienda trabajar en una cabina de flujo laminar hasta que se lisen las muestras Manipule y elimine todas las muestras biol gicas como si pudieran transmitir agentes infecciosos Evite el contacto directo con las muestras biol gicas y evite salpicar o pulverizar e L vese las manos de forma exhaustiva despu s de manipular muestras y reactivos e Lleve siempre una bata de laboratorio guantes y gafas de seguridad cuando trabaje con muestras humanas La versi
35. grandes vol menes entre 50 y 1200 pl e Contenedor de desechos e Reloj de control e Gradilla PCR Equipo de extracci n de ADN oCheck Manual de instrucciones Revisi n 00 Febrero de 2011 3 TRANSPORTE Y ALMACENAMIENTO El transporte y el almacenamiento del Equipo de extracci n de ADN oCheck se realizan a temperatura ambiente Para m s informaci n sobre el almacenamiento de soluciones de trabajo preparadas consulte las secciones 8 1 y 10 1 4 INSTRUCCIONES DE SEGURIDAD Los siguientes componentes del Equipo de extracci n de ADN oCheck contienen elementos peligrosos Utilice guantes y gafas de seguridad y siga las instrucciones de seguridad proporcionadas en esta secci n Contenido RE Frases de Frases de Frases de Componente de peligroso peligro riesgo riesgo seguridad Nocivo en caso de ingesti n Irrita los R 22 36 38 ojos y la piel Clorhidrato de E guanidina Inflamable es Nocivo en caso de Tamp n W1 guanidina R 10 22 36 38 S7 16 25 isopropanol 25 ingesti n Irrita los ojos y la piel Irrita los ojos las v as respiratorias Proteinasa K y la piel liofilizada Posibilidad de sensibilizaci n por inhalaci n Proteinasa K R 36 37 38 42 S 22 24 26 36 37 La etiqueta de peligro no es necesaria si la cantidad por frasco es inferior a 125 g o ml seg n 67 548 CEE Art 25 1999 45 CE Art 12 y las normas alemanas GefStoffV 20 3 y TRGS 200 7 1 Para m s informaci n consulte
36. iente 18 25 C 4 Soluci n de ARN portador a ada 900 ul de tamp n L1 para disolver el ARN portador liofilizado Dispense el ARN portador disuelto en al cuotas por ejemplo al cuotas de 35 ul para realizar 12 extracciones Almacene la soluci n de ARN portador disuelto a 20 C No vuelva a congelarlo Las ampollas usadas se deben desechar una vez descongeladas Durante el almacenamiento especialmente a temperaturas bajas es posible que se formen precipitados blancos en los tampones L1 L2 o L4 Dichos precipitados se pueden disolver con facilidad si se incuba el frasco a 50 70 C antes de utilizarlo Equipo de extracci n de ADN oCheck Manual de instrucciones Revisi n 00 Febrero de 2011 8 2 Preparaci n de muestras 8 2 1 Preparaci n de muestras para PapilloCheck y PapilloCheck high risk Las muestras de citolog as cervicouterinas humanas que se tomen con e PapilloCheck Collection Kit Greiner Bio One n de cat logo 465 070 e Medio de toma de muestras PreservCyt Hologic Bedford MA EE UU se pueden procesar directamente Las muestras de citolog as cervicouterinas humanas que se tomen con e Medio de toma de muestras Surepath BD Franklin Lakes NJ EE UU se deben lavar antes de usarlas centrifugue 250 pul de la muestra durante 5 minutos a 11 000 g y resuspenda el pellet en 250 ul de agua destilada Las muestras de citolog as cervicouterinas humanas que se tomen con e Medio de toma de muestras ST
37. illoCheck Collection Kit Greiner Bio One n de cat logo 465 070 e PreservCyt Hologic Bedford MA EE UU e Surepath BD Franklin Lakes NJ EE UU e STM Qiagen Hilden Alemania Para la aplicaci n posterior del ensayo PelvoCheck CT NG Greiner Bio One n de cat logo 504 002 se ha validado el Equipo de extracci n de ADN oCheck para la extracci n de ADN bacteriano y gen mico humano de muestras de orina humana obtenidas mediante los siguientes sistemas de toma de muestras e PelvoCheck Collection Kit SAFE Greiner Bio One n de cat logo 453 100 e PelvoCheck Collection Kit STRAW Greiner Bio One n de cat logo 453 101 El resto de los sistemas de toma de muestras no est n validados y no se deben utilizar con el Equipo de extracci n de ADN oCheck 6 4 Principio b sico de purificaci n del ADN El Equipo de extracci n de ADN oCheck se ha dise ado para realizar la purificaci n de ADN viral bacteriano y gen mico humano a partir de muestras de origen humano Las muestras se lisan de manera r pida y eficiente a adiendo proteinasa K y tamp n L1 El tamp n de lisis y el etanol crean las condiciones adecuadas para la uni n de los cidos nucleicos a la membrana de s lice de las columnas El ARN portador mejora la uni n y la recuperaci n de ADN viral bacteriano y gen mico en bajas concentraciones Los contaminantes inhibidores potenciales de PCR como las sales los metabolitos y los compon
38. it yalo por el no usado limpio mg Inserte la tapa del sistema de vac o junto con el soporte de banda de columnas y las bandas de columnas en la base del sistema de vac o Aseg rese de que el sistema de vac o est bien cerrado y de que todas las bandas de columnas o las bandas de columnas ciegas ajusten correctamente www Aplique el m ximo vac o al menos 400 600 mbar de diferencia de presi n durante 10 minutos para secar la membrana totalmente m Apague la bomba de vac o y libere el vac o Este paso es necesario para eliminar los rastros de etanol El etanol presente en el tamp n W2 inhibe las reacciones enzim ticas y debe ser totalmente eliminado antes de la eluci n del ADN 10 3 8 Eluci n del ADN Para los siguientes pasos de eluci n se debe modificar el sistema de vac o seg n lo indicado en la figura 10 Soporte de banda de columnas con bandas de columnas Tapa del sistema de vac o Gradilla de microtubos Gradilla de microtubos Separador Separador Round Well Block Base del sistema de vac o Figura 10 Preparaci n para la eluci n del ADN mg Retire el soporte de banda de columnas junto con las bandas de columnas y col quelos sobre una hoja de papel limpia suministrada con el equipo m Retire la tapa del sistema de vac o y extraiga el contenedor de desechos usado mg Inserte separadores Round Well Block y encima la gradilla de microtubos en los laterales estrechos
39. medisinsk utstyr In Vitro lIAYVWOTI K IATPIKA OUOKEU In vitro diagnostik tibbi tan r n Tempe rature limitation Tempera turbegren zung Limite de temp ra ture Limitaci n de tempera tura Limiti di tempera tura Limita o de tempera tura Tempera tuurbeper king Tempera turbegra ens r Tempe ratur be gr nsning Ograni czenie tempera tury tempe raturbe grensning Mepio pIO O Bepuokpa g aG S cakl k s n rlamas Contents sufficient for lt n gt tests Inhalt ausrei chend f r lt n gt Tests Contenu suffisant pour lt n gt tests Contenido suficiente para lt n gt ensayos Contenuto sufficiente per lt n gt test Conte do suficiente para lt n gt ensaios Voldoen de inhoud voor lt n gt tests Indehol der nok til lt n gt test Inneh llet racker till lt n gt tester Zawarto wystarcza na lt n gt test w Innhold tilstrekke lig for lt n gt tester TTEPI XEI ETTOPK G UAIK yia lt n gt OOKI MAG ES eri i lt n gt test i in yeter lidir Irritant Reizend irritant irritante Irritante irritante Irriterend Lokalirri terende irriterande dra ni cy irriterende EpebIOTIK Tahris edici Batch code Chargen bezeich nung N de lot C digo de lote Codice del lotto C digo do lote Lot nummer Lotnum
40. rennrrnnanes 24 9 5 Aplicaci n del vac o A ERE RED RR DAR DUE DR EDAD DAR DAR DRA DD RD DAR Dan Da RU an DD 24 9 6 Ventilaci n del sistema de VACI EE 24 10 PREPARACI N CON BANDA DE 8 COLUMNAS n de cat logo 515 050 25 10 1 Preparaci n de soluciones de trabajo y condiciones de almacenamiento ssssc ssso 25 10 2 Preparaci n de muestras oro oo ado a oa 26 10 2 1 Preparaci n de muestras para PapilloCheck y PapilloCheck high risk 26 10 3 Protocolo estandar 27 10o PETENDA ATON EE 27 IDAS o a E A A REN A A 27 10 3 EES a a 27 10 3 4 Ajuste de las condiciones de uni n del ADN GE 21 lag ge A O EE 28 10 356 lavado de bandas de columnas EE 30 103 7 Secado de Dandas de columnas e ae a aa a ANAS 31 10 3 S ElCom e ER E E E a old a 31 11 SOLUCI N DE PROBLEMAS NENNEN 33 125 ASISTENCIA TECNICA e e e E 34 13 CARACTER STICAS DE RENDIMIENTO ENEE 34 E PROTOCOLOS DR ooo 35 14 1 Protocolo breve para preparaci n con una columna n de cat logo 515 040 35 14 2 Protocolo breve para preparaci n con banda de 8 columnas n de cat logo 515 050 37 Equipo de extracci n de ADN oCheck Manual de instrucciones Revisi n 00 Febrero de 2011 1 CONTENIDO DEL EQUIPO Equipo de extracci n Preparaci n con Preparaci n con ban de ADN oCheck Nombre una columna n de da de 8 columnas n cat logo 515 040 de cat logo 515 050 Tamp n L1 Tamp n L2
41. soporte de banda de columnas en la junta de goma de la tapa del sistema de vac o mg Inserte la cantidad necesaria de bandas de columnas en el soporte de banda de columnas Aseg rese de que las bandas de columnas est n insertadas correctamente y de que las bandas de columnas est n bien fijadas al soporte de banda de columnas se escuchar un clic Si se procesan menos de 48 muestras simult neamente solamente se debe insertar la cantidad necesaria de bandas de columnas en el soporte y el resto de las posiciones se deben rellenar en el soporte de banda de columnas con la cantidad adecuada de bandas de columnas ciegas Aseg rese de que las bandas de columnas y las bandas de columnas ciegas ajusten correctamente en el soporte de banda de columnas antes de aplicar el vac o No lave el contenedor de desechos usado en el lavavajillas 28 Equipo de extracci n de ADN oCheck Manual de instrucciones Revisi n 00 Febrero de 2011 mg Pipetee 900 ul de los lisados en los pocillos de las bandas de columnas con cuidado de no humedecer los bordes de los pocillos figura 7 Figura 7 Pipetee el lisado en los pocillos de las bandas de columnas mm Ajuste el vac o a 200 mbar con el regulador de vac o figura 8a www Aplique lentamente el vac o abriendo la v lvula del sistema de vac o hasta que todos los lisados pasen por las columnas figura 8b Rueda de ajuste V lvula de sistema de vac o Figura 8 a Regulador de v
42. struccio nes Leggere le istruzi oni prima dell uso Antes de usar leia as instru es Gebruik saanwij zing lezen L s brugsan visningen L s bruk sanvisnin gen f re anv nd ning Przed u yciem przeczyta instrukcj Les bruksan visning f r bruk 2uuBou AEUTE TE TIC Odny ec Xp ons Kullanma dan nce talimat okuyun Catalog Number Katalog nummer Num ro de r f rence N mero de cat lo go Numero catalogo N mero de cat lo go Catalo gusnum mer Katalog nummer Katalog nummer Numer katalo gowy katalog nummer Api8pi S KaTad you Katalog numaras Manufac turer Hersteller Fabricant Fabri cante Produt tore Fabri cante Fabrikant Producent Tillverkare Producent produsent KaTaoKeu OOTTIC Uretici firma Equipo de extracci n de ADN oCheck Manual de instrucciones Revisi n 00 Febrero de 2011 In Vitro Diag nostic Me dical Device In vitro Diagnosti kum Produit m di cal de diagnostic in vitro Producto medicinal de diagn sti ca in vitro Dispositivo medico diagnosti co in vitro Producto medicinal de diagn sti ca in vitro In vitro diag nostisch medisch product In vitro meskdicin doag nose apparat In vitro medicinsk doag nostisk apparatur Diag nostyka in vitro Produkt yw in vitro di agnostisk
43. ta del frasco El tamp n L4 resultante permanece estable durante como m ximo un a o a temperatura ambiente 18 25 C Soluci n de ARN portador a ada 900 ul de tamp n L1 para disolver el ARN portador liofilizado Dispense el ARN portador disuelto en al cuotas por ejemplo al cuotas de 50 ul para realizar 16 extracciones Conserve la soluci n de ARN portador disuelto a 20 C No vuelva a congelarlo Las ampollas usadas se deben desechar una vez descongeladas Durante el almacenamiento especialmente a temperaturas bajas es posible que se formen precipitados blancos en los tampones L1 L2 o L4 Dichos precipitados se pueden disolver con facilidad si se incuba el frasco a 50 70 C antes de utilizarlo Equipo de extracci n de ADN oCheck Manual de instrucciones Revisi n 00 Febrero de 2011 25 10 2 Preparaci n de muestras 10 2 1 Preparaci n de muestras para PapilloCheck y PapilloCheck high risk Las muestras de citolog as cervicouterinas humanas que se tomen con e PapilloCheck Collection Kit Greiner Bio One n de cat logo 465 070 e Medio de toma de muestras PreservCyt Hologic Bedford MA EE UU se pueden procesar directamente Las muestras de citolog as cervicouterinas humanas que se tomen con e Medio de toma de muestras Surepath BD Franklin Lakes NJ EE UU se deben lavar antes de usarlas centrifugue 250 pul de la muestra durante 5 minutos a 11 000 g y resuspenda el pellet en 250 ul de agua destil
44. tex de vez en cuando durante el periodo de incubaci n 10 3 3 Lisis mg Centrifugue brevemente el microtubo para eliminar las gotas del interior de la tapa mg A ada 250 ul de tamp n L4 mg Cierre la tapa y mezcle brevemente con un Vortex de impulso durante 10 segundos mg Incube a 70 C durante 15 minutos mg Cierre bien la tapa de los microtubos para impedir una apertura accidental 10 3 4 Ajuste de las condiciones de uni n del ADN mg Centrifugue brevemente el microtubo para eliminar las gotas del interior de la tapa mg A ada 300 ul de etanol p a gt 99 8 a la muestra mg Cierre la tapa inmediatamente y mezcle brevemente con un Vortex de impulso durante 15 segundos mg Centrifugue brevemente el microtubo para eliminar las gotas del interior de la tapa 27 Equipo de extracci n de ADN oCheck Manual de instrucciones Revisi n 00 Febrero de 2011 10 3 5 Uni n del ADN mg Prepare el sistema de vac o oCheck de acuerdo con la figura 6 para una descripci n m s detallada consulte el cap tulo 9 Soporte de banda de columnas con bandas de columnas Tapa del sistema de vac o Contenedor de desechos Base del sistema V lvula de sistema de vac o Figura 6 Preparaci n para el lavado y la uni n del ADN mg Coloque uno de los dos contenedores de desechos en el interior de la base del sistema de vac o mg Cierre la base del sistema de vac o con la tapa del sistema de vac o mg Coloque el
45. vac o despu s de que todo el l quido haya pasado por las columnas aproximadamente 30 segundos para evitar la formaci n de espuma mg A ada 900 ul de tamp n W2 a cada pocillo de las bandas de columnas www Ajuste el vac o a 200 mbar con el regulador de vac o mg Aplique el vac o hasta que el tamp n haya pasado por las columnas aproximadamente 30 segundos mg Detenga el vac o inmediatamente cerrando la v lvula del sistema de vac o despu s de que todo el l quido haya pasado por las columnas aproximadamente 30 segundos para evitar la formaci n de espuma mg A ada 900 ul de tamp n W2 a cada pocillo de las bandas de columnas mg Ajuste el vac o a 200 mbar con el regulador de vac o mg Aplique el vac o hasta que todo el tamp n haya pasado por las columnas aproximadamente 30 segundos mg Detenga el vac o inmediatamente cerrando la v lvula del sistema de vac o despu s de que todo el l quido haya pasado por las columnas aproximadamente 30 segundos para evitar la formaci n de espuma mg Apague la bomba de vac o y libere el vac o 30 Equipo de extracci n de ADN oCheck Manual de instrucciones Revisi n 00 Febrero de 2011 10 3 7 Secado de bandas de columnas mg Tras el paso de lavado final detenga el vac o y ventile el sistema de vac o secci n 9 6 Retire el soporte de banda de columnas junto con las bandas de columnas Retire la tapa del sistema de vac o y extraiga el contenedor de desechos usado y sust
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