Biotechnology Explorer™ Kit de huella genética (ADN - Bio-Rad
Contents
1. Preparaci n previa Objetivos Alicuotar el tamp n de carga Preparar los marcadores Lambda Hindlll Preparar la soluci n Bio Safe 1x para la tinci n de ADN Preparar los puestos de trabajo para los alumnos y comunes Tiempo requerido 20 minutos Material requerido Tamp n de carga Soluci n Bio Safe Marcadores Lambda Hindlll 1 Alicuotar el tamp n de carga A Rotula 8 microtubos como TC Tamp n de carga Alicuotar 35 ul del tamp n de carga en cada tubo Distribuir los tubos a cada puesto de trabajo de los alumnos B A adir 20 ul del tamp n de carga al tubo que contiene los marcadores Hindlll Si es posible calentar los marcadores 5 minutos a 65 C y luego enfriarlos en hielo al hacer esto se separan mejor las bandas de los marcadores Rotular 8 microtubos con una M A adir 15 ul de los marcadores con el tamp n de carga a cada tubo M Distribuir los tubos a cada puesto de trabajo de los alumnos 2 Preparar la soluci n Bio Safe para la tinci n de ADN Diluir 4 ml de la soluci n 500x en 499 ml de agua destilada en un recipiente adecuado Cubrir el recipiente y almacenarlo a temperatura ambiente hasta su uso 3 Electroforesis de las muestras El tiempo requerido es de 30 minutos aunque si es posible dejarla correr 40 minutos se obtendr una mayor resoluci n Procedimiento de tinci n del ADN con la soluci n Bio Safe El volumen de soluci n Bio Safe 1x necesario para te ir un gel de 7 x 7 7 x 10 cm es de aproxi2. C antes de utilizarlo Si quieres puedes preparar la agarosa con varias horas de antelaci n a la pr ctica y mantenerla caliente en un ba o a 55 60 C hasta su uso Preparaci n de los geles de agarosa Es necesario que cada gel tenga al menos 8 pocillos Siguiendo las instrucciones del apartado anterior prepara la agarosa calculando el volumen que se necesita A ade la agarosa al molde e introduce el peine La cantidad de agarosa debe alcanzar entre 0 5 y 0 7 cm de profundidad o bien ser suficiente como para cubrir los dientes del peine No muevas ni toques el molde o el peine hasta que la agarosa haya solidificado Una vez solidificada los geles pueden almacenarse en bolsas precintadas a temperatura ambiente o en el frigor fico hasta el d a siguiente El tiempo necesario para preparar los geles para todos los grupos de alumnos es de aproximadamente 30 minutos Si es posible prepara 1 2 geles extra de reserva Digesti n con enzimas de restricci n Las condiciones ptimas para la digesti n enzim tica son de 45 minutos a 37 C Si no se dispone de una placa t rmica ba o o estufa las muestras se pueden digerir introduciendo los tubos en una gradilla de pl stico o corcho que se situa en aproximadamente 1 litro de agua a 37 C y dej ndolas en incubaci n toda la noche mientras el agua se va enfriando Procedimiento para preparar los geles Con el sistema Bio Rad s Mini Sub Cell GT los geles se pueden preparar f cil
3. car de 5 carbonos denominado desoxirribosa P Mol cula de fosfato compuesta de tomos de f sforo y ox geno Bases nitrogenadas A adenina C citosina G guanina T timina El an lisis de las tres muestras de ADN anteriores mira la siguiente p gina nos ayudar a detectar similitudes y diferencias en las muestras de ADN de diferentes personas 19 ADN Fingerprinting Manual del Alumno Unidad 1 Introducci n al ADN fingerprinting Cu l es la estructura del ADN 1 Compara la estructura y colocaci n del az car y el fosfato en las cadenas laterales de las tres muestras Hay alguna diferencia 2 En la figura anterior las tres muestras contienen las mismas bases Describe tus observaciones 3 Est n las bases apareadas de la misma manera en las tres muestras Describe el patr n de apareamiento de las bases 4 En tu intento de analizar las muestras de ADN de tres seres vivos diferentes qu conclusiones sacas sobre las similitudes y diferencias de las muestras de ADN 5 Qu necesitas para comparar esas muestras de ADN y determinar si son id nticas o no 20 ADN Fingerprinting Manual del Alumno Unidad 2 Digesti n de las muestras de ADN con enzimas de restricci n C mo podemos detectar diferencias en la secuencia de bases A primera vista esta tarea te puede parecer dif cil Necesitas determinar si la secuencia lineal de pares de bases en las muestras de ADN es id ntica o n
4. mm Tama o pb Distancia mm Tama o pb 23 130 9 416 6 557 4 361 2 322 2 027 37 ADN Fingerprinting Manual del Alumno Papel semilogaritmico 100 000 B0 000 60 000 20 000 20 000 1 000 3 000 6 000 Tama o pares de bases Distancia mm ADN Fingerprinting Manual del Alumno 39 ADN fingerprinting Manual del Alumno Unidad 4 An lisis de los patrones de ADN Interpretaci n de resultados Pega una foto fotocopia o tu gel seco en este espacio Indica qu muestra hay en cada pocillo 1 Qu tratamos de determinar Recuerda el objetivo principal 2 Cu l de las muestras de ADN se fragmentaron C mo ser a tu gel si el ADN no se hubiera fragmentado 3 Qu produjo que el ADN se fragmentara 4 Qu es lo que determina el punto donde una endonucleasa de restricci n corta una mol cula de ADN 40 ADN fingerprinting Manual del Alumno 5 Una endonucleasa de restricci n corta dos mol culas de ADN en el mismo punto Qu asumes que es id ntico en las dos mol culas en ese punto 6 La muestra de alg n sospechoso parece tener los mismos sitios de reconocimiento para EcoRI o Psfl en el mismo punto que el ADN procedente de la escena del crimen 7 Bas ndote en el an lisis anterior la muestra de ADN de alg n sospechoso parece ser del mismo individuo
5. un volumen total de unos 275 ml para cada cubeta de electroforesis Ser n suficiente 3 litros de tamp n TAE 1x para las 8 cubetas de electroforesis y la preparaci n de los 8 geles de agarosa Para preparar 3 litros de TAE 1x a partir de TAE 50x a adir 60 ml de TAE 50x a 2 94 litros de agua destilada 4 Preparaci n de la agarosa Esto puede hacerse con 1 2 d as de antelaci n por el profesor o durante la sesi n pr ctica por los propios alumnos A La concentraci n recomendada para la preparaci n del gel es de agarosa al 1 Esta concentraci n de agarosa proporciona una excelente resoluci n y minimiza el tiempo requerido para la separaci n de los fragmentos de ADN en la electroforesis Para preparar agarosa al 1 a adir 1 g de agarosa a 100 ml de tamp n TAE 1x La agarosa se debe preparar con tamp n de electroforesis no con agua Si las cubetas de electroforesis son escasas puedes utilizar moldes o cristales de 7 x 10 cm y dos peines con 8 pocillos y preparar un gel para cargar las muestras de dos grupos de estudiantes Esta tabla te puede servir de gu a para saber los vol menes a utilizar Volumen de agarosa al 1 necesario N mero de geles Molde 7 x 7 cm Molde 7 x 10 cm 1 40 ml 50 mil 2 80 100 4 160 200 8 320 400 B A ade la agarosa en polvo a un recipiente adecuado p ej un matraz Erlenmeyer de 500 ml para preparar 200 ml A ade la cantidad apropiada de TAE 1x y agita para resuspender la ag
6. 1 laboratorio O 23 ADN Fingerprinting Manual del Alumno Unidad 2 Protocolo Digesti n de las muestras de ADN 1 Rotula los tubos a Utiliza microtubos de los siguientes colores y rot lalos como se indica a continuaci n Verde EC Escena del crimen Azul S1 Sospechoso 1 Naranja S2 Sospechoso 2 Violeta S3 Sospechoso 3 Rojo S4 Sospechoso 4 Amarillo S5 Sospechoso 5 Marca los tubos con tu nombre fecha y sesi n de pr cticas La digesti n enzim tica tendr lugar en estos tubos Pon los tubos en la gradilla de corcho 197007 S cS S1 S2 S3 S4 S5 2 Localiza el tubo que contiene la mezcla de enzimas de restricci n marcado como ENZ ENZ mezcla enzim tica 3 Localiza tus muestras de ADN Usando una nueva punta de pipeta para cada muestra pasa 10 ul de cada muestra de ADN al correspondiente microtubo coloreado Stock ADN CS S1 S2 S3 S4 S5 24 ADN Fingerprinting Manual del Alumno Observaciones 1 Describe las muestras de ADN propiedades f sicas 2 Hay alguna diferencia observable a simple vista entre las muestras de ADN 3 Describe la apariencia de la mezcla de endonucleasas de restricci n 4 A ade la mezcla enzim tica Con la micropipeta y utilizando una nueva punta de pipeta para cada muestra pasa 10 ul de la mezcla enzim tica a cada tubo seg n se muestra a continuaci n Nota Cambia las puntas siempre que cambies de reactivo o si de forma acci
7. H ND N n e A S j Z y gt 2 4 gt gt 2 gt f gt K gt A y LND A M todo 1 M todo 2 Nota Evitar la exposici n prolongada de los geles secados a luz directa para evitar que las bandas se decoloren Representaci n gr fica de los datos Muchos de los alumnos pueden no estar familiarizados con el papel logar tmico y semilogar tmico Se sugiere que se les ense e la manera adecuada de utilizarlo Se puede incluir una explicaci n sobre los diferentes usos del papel semilogar tmico frente al papel milimetrado lineal Es una oportunidad para repasar las matem ticas y recordar las secuencias num ricas lineales y exponenciales Se incluyen ambos tipos de papel lineal y semilogar tmico en las p ginas 37 y 38 de este manual 15 ADN Fingerprinting Manual del Profesor Guia r pida para el uso del kit ADN Fingerprinting D a 1 Preparaci n de las muestras de ADN pa rr r y 1 Colocar en hielo el tubo con la mezcla de enzimas e de restricci n rotulado como ENZ 2 Rotular cada uno de los microtubos coloreados de la siguiente forma Verde EC Escena del crimen Azul S1 Sospechoso 1 A A e PE Naranja S2 Sospechoso 2 j F Violeta S3 Sospechoso 3 U U U UW Al Rojo S4 Sospechoso 4 CS S1 S2 S3 S4 S5 Amarillo S5 Sospechoso 5 Marca los tubos con tu nombre fecha y sesi n de pr cticas Pon los tubos en la gradilla de corcho 3 Pipetear 10 ul de cada muestra de ADN de lo
8. Para la enzima Pst C T G C A G G ACG TIC SE Como todas las enzimas las enzimas de restricci n funcionan mejor en un tamp n buffer y a una temperatura espec ficos El tamp n apropiado para las enzimas de restricci n se incluye con la muestra de ADN de manera que cuando el ADN rehidratado y las enzimas se mezclan se crean las condiciones ideales para el ptimo funcionamiento de las enzimas El buffer contiene Tris 50 mM NaCl 100 mM MgCl 10 mM DDT 1 mM pH 8 0 que son las condiciones ideales para el funcionamiento correcto de las enzimas EcoRI y Pstl ADN Fingerprinting Manual del Profesor Visualizaci n de los fragmentos de restricci n El ADN es incoloro de manera que los fragmentos de ADN no se pueden ver en el gel durante la electroforesis Se utiliza un tamp n de carga que contiene dos colorantes azules y que se a ade a la soluci n de ADN Los colorantes no ti en el ADN pero facilitan la carga de los geles y permiten ver el avance de la electroforesis Los colorantes migran hacia el polo positivo situado al final del gel al igual que los fragmentos de ADN El colorante r pido migra con los fragmentos de ADN de aproximadamente 500 pb mientras que el colorante lento migra con los fragmentos de ADN de tama o aproximado de 5 kpb La tinci n del ADN muestra su localizaci n en el gel Cuando el gel se sumerge en una soluci n diluida de colorante Bio Safe las mol culas del colorante se unen a las mol
9. Un examen visual de los geles permite ver la posici n del tamp n de carga pero no las posiciones de los fragmentos de ADN Los fragmentos de ADN se visualizan ti endo el gel con un colorante azul El colorante tiene una alta afinidad por el ADN y se une fuertemente a los fragmentos de ADN haci ndolos visibles Estas bandas visibles de ADN se pueden fotografiar dibujar o conservar secando el gel para su an lisis El dibujo situado m s abajo representa un ejemplo de un gel te ido despu s de una electroforesis Para analizarlo es importante recordar la siguiente informaci n e Cada carril contiene una muestra diferente de ADN e Cada muestra de ADN fue tratada con las mismas endonucleasas de restricci n Analiza las bandas del siguiente gel y luego contesta a las preguntas de la siguiente p gina CS Si S Carril 33 ADN Fingerprinting Manual del Alumno Unidad 4 Cuestionario 1 Qu crees que contiene cada banda 2 En este gel cu ntas muestras de ADN crees que se cargaron en cada pocillo 3 Cu l ser a una explicaci n l gica a que haya m s de una banda de ADN para cada muestra 4 Qu es lo que produjo la fragmentaci n del ADN 5 Cu l de las muestras de ADN tiene el mismo n mero de sitios de restricci n para las endonucleasas de restricci n utilizadas Indica los n meros de los pocillos 6 Qu muestra tiene el fragmento m s peque o de ADN 7 Asumiendo que se utilizara un f
10. de ADN digerido Tamp n carga Rotulador Puntas pipeta Micropipeta P 10 o P 20 Contenedor para residuos caja Gradilla de corcho Cubeta electroforesis y fuente alimentaci n Cristalizador o cubeta para tinci n gel 2 22 aa rr E E a p8opo00000000 0 Marcadores Hindlll Puesto com n Tamp n electroforesis TAE 1x 275 ml gel cubeta o Colorante Bio Safe 1x 500 ml m 29 ADN Fingerprinting Manual del Alumno Unidad 3 Protocolo Electroforesis de las muestras de ADN 1 Utiliza un gel de agarosa preparado por tu profesor o si el profesor te ense a prep ralo tu mismo 2 Cuando el gel est preparado saca de la nevera las muestras de ADN digeridas Usando una nueva punta de pipeta para cada muestra a ade 5 ul de tamp n de carga a cada tubo Muestras ADN Tamp n de carga Escena del crimen EC 5 ul Sospechoso 1 S1 5 ul Sospechoso 2 S1 5 ul Sospechoso 3 S1 5 ul Sospechoso 4 S1 5 ul Sospechoso 5 S1 5 ul Tamp n de carga TC Golpear con el dedo y contra la mesa Cierra los tubos Mezcla los componentes golpeando suavemente los tubos con el dedo Si dispones de centr fuga dales un pulso para que el contenido quede en el fondo de los tubos Si no golpea los tubos suavemente sobre la mesa 3 Coloca en la cubeta de electroforesis el molde con el gel preparado Los pocillos deben estar en el extremo en el que se sit a el c todo donde se conecta el cable negro Con mucho cuidado r
11. mara y pel cula normales Bio Rad s Standard Polaroid gel documentation system Secado del gel de agarosa Nota El secado de los geles de agarosa requiere el uso de la agarosa de alta resistencia Bio Rad Otras agarosas pueden resultar inapropiadas para este fin Existen dos m todos para el secado de geles de agarosa M todo 1 El m todo 1 es el preferido y requiere el uso del film de soporte del gel n mero de cat logo 170 2984 EDU Simplemente sacar el gel de agarosa deste ido de la cubeta y recortar las zonas sin bandas con un cuchillo Situar el gel directamente sobre la cara hidrof lica de un trozo de film de soporte del gel El agua formar gotas en la cara hidrof bica pero se esparcir en la cara hidrof lica Centrar el gel en el film Situar el film en una hoja de papel secante y dejar secar evitando la exposici n directa a la luz Al secarse el gel se pegar al film y no encoger Si se deja el gel sobre el film sin tocarlo se secar completamente a temperatura ambiente en 2 3 d as Se obtendr una copia lisa transparente y duradera del experimento M todo 2 Despu s de te ir y deste ir el gel dejarlo en la cubeta o cristalizador Dejarlo secar al aire durante 2 3 d as Al secarse el gel encoger considerablemente pero proporcionalmente Si se deja en la cubeta sin tocarlo el gel deber a quedar relativamente liso pero se puede arrugar mientras se seca co Film de soporte del gel Ls gt cy
12. American Vol 262 5 May 1990 ADN Fingerprinting Manual del Profesor Planificaci n de la pr ctica Hay cinco unidades o pr cticas en este cuaderno Todas las sesiones se realizan en periodos de 50 minutos Cada pr ctica incluye e Una serie de consideraciones previas para los alumnos e Una tarea de investigaci n activa para los alumnos e Cuestiones para el an lisis e interpretaci n de los resultados obtenidos Programaci n para el alumno Unidad 1 Actividad Unidad 2 Actividad Unidad 3 Actividad Unidad 4 Actividad Introducci n ADN fingerprinting Lecturas y discusi n Consideraciones previas 1 y 2 Digesti n de muestras de ADN con enzimas de restricci n Preparar los geles realizar la digesti n con las enzimas de restricci n Hacer an lisis preliminar y cuestiones de revisi n Electroforesis de ADN Cargar y correr los geles te ir los geles toda noche Contestar las preguntas de an lisis y revisi n An lisis e interpretaci n de resultados Deste ir los geles Contestar las preguntas de an lisis Hacer la curva est ndar o patr n Discutir y sopesar los resultados Preparaci n de las pr cticas por el profesor En este apartado se perfila el calendario recomendado para la preparaci n anticipada de las sesiones pr cticas por parte del profesor Para m s detalles consultar la Gu a del profesor para la preparaci n de la pr ctica en las p ginas 10 16 Ac
13. Biotechnology Explorer Y Kit de huella gen tica ADN fingerprint Manual de instrucciones Numero de cat logo 166 0007 EDU www explorer bio rad com Los reactivos liofilizados se pueden almacenar a temperatura ambiente Los marcadores de ADN deben guardarse a 4 C o a temperaturas inferiores durante almacenamientos superiores a 4 semanas La duplicaci n de cualquier parte de este documento est autorizada s lo para su uso en clase Para soporte t cnico llame a su oficina local de Bio Rad en Espa a 91 590 52 00 4006096 ADN Fingerprinting indice Manual del profesor Informaci n b sica para el profesor Planificaci n de la pr ctica Gu a del profesor para la preparaci n de la pr ctica Gu a r pida para el uso del kit ADN Fingerprinting Manual del alumno Unidad 1 Unidad 2 Unidad 3 Unidad 4 Introducci n al ADN Fingerprinting Digesti n de las muestras de ADN con enzimas de restricci n Electroforesis y tinci n de las muestras de ADN Secado de los geles y an lisis de las patrones de ADN ADN Fingerprinting Manual del Profesor ADN Fingerprinting Manual del profesor Informaci n b sica para el profesOT oooconncccinocccinoccccnonccnonaccconncnonnnnnonn nc nana rer 3 Planificaci n de la pr ctica sea era Er conan cco nn c cnn nc n nana a E AEG 7 Gu a del profesor para la preparaci n de la pr ctica 9 Gu a r pida para el uso del kit ADN Fingerprinting acer 15 ADN Fingerp
14. Despu s de la incubaci n guarda los tubos en la nevera hasta que los necesites Ba o 26 ADN Fingerprinting Manual del Alumno Unidad 2 Digesti n de las muestras de ADN con enzimas de restricci n Cuestionario 1 Antes de incubar las muestras describe cualquier cambio visible que se pudiera producir en los tubos que conten an la muestra de ADN despu s de a adir las enzimas de restricci n 2 Puedes ver alguna evidencia que indique que las muestras de ADN est n fragmentadas o alteradas de alguna forma por la adici n de EcoRl Pstl Explica tu respuesta 3 En ausencia de evidencia visible de cambio es posible que las muestras de ADN est n fragmentadas 4 Contestar al d a siguiente Despu s de incubar 24 horas hay alguna pista visible de que las enzimas de restricci n hayan modificado de alguna forma el ADN en los tubos Razona tu respuesta 27 ADN Fingerprinting Manual del Alumno Unidad 3 Electroforesis y tinci n de las muestras de ADN C mo podemos detectar la posici n de los sitios de restricci n para EcoRI y Pstl en nuestras muestras de ADN Dado que intentamos detectar cambios a nivel molecular y no hay pistas o evidencias visibles de ellos esta tarea puede parecernos imposible Veamos si podemos entenderlo Una manera para determinar la localizaci n de los sitios de restricci n podr a ser averiguar lo siguiente 1 Cu ntos fragmentos de ADN de diferente tama o hay e
15. arosa en el tamp n Si utilizas un matraz Erlenmeyer sit a otro matraz Erlenmeyer de 25 ml en la boca del primero y en posici n invertida El matraz peque o actuar como una c mara de reflujo permitiendo una ebullici n prolongada o vigorosa sin que se produzcan muchas p rdidas por evaporaci n La agarosa se puede fundir en un agitador magn tico a temperatura elevada en un ba o caliente o en un horno microondas Precauci n Usar siempre guantes gafas protectoras y bata mientras se prepara el gel de agarosa La agarosa hirviendo o los recipientes con agarosa caliente pueden producir graves quemaduras en la piel Uso del horno microondas Este es el m todo m s r pido y seguro para disolver la agarosa Introduce el matraz o botella con el gel en el microondas AFLOJA EL TAP N SI UTILIZAS UNA BOTELLA D jalo 3 minutos a media intensidad Para el horno cada 30 segundos y agita el matraz para disolver la agarosa Calienta y agita la soluci n hasta que todas las part culas de agarosa se hayan disuelto D jalo enfriar hasta los 55 60 C antes de utilizarlo Uso del agitador magn tico A ade un im n a la soluci n de agarosa Calienta hasta ebullici n el matraz en el agitador magn tico Se debe evitar que las burbujas alcancen el cuello del matraz 12 ADN Fingerprinting Manual del Profesor Calienta y agita la soluci n hasta que todas las part culas de agarosa se hayan disuelto D jalo enfriar hasta los 55 60
16. culas de ADN atrapadas en el gel de agarosa Para aumentar el contraste y visualizar con facilidad las bandas de ADN el exceso de colorante se puede eliminar del gel desti ndolo con agua Cuando las bandas sean visibles tus alumnos pueden comparar los patrones de restricci n de diferentes muestras de ADN El gel situado a continuaci n muestra el patr n de ADN que obtendr an los estudiantes tras la electroforesis El ADN de la escena del crimen se ha marcado como CS el del sospechoso 1 como S1 y as sucesivamente El ADN recogido en la escena del crimen se carga en el pocillo 2 y el ADN de cada sospechoso se carga en los pocillos 3 4 5 6 y 7 respectivamente El pocillo 1 contiene los marcadores de tama o conocido obtenidos de la digesti n de un ADN por la enzima Hindlll Por acuerdo los pocillos se numeran empezando por la parte superior izquierda Los estudiantes deben observar los patrones de bandas y comprobar si las bandas de alg n sospechoso coinciden con las del ADN recogido en la escena del crimen M CS S1 S2 S3 S4 S5 1 2 3 4 5 6 7 8 Se observa f cilmente que el ADN procedente de la escena del crimen y el del sospechoso 3 S3 son id nticos Quiz quieras saber si este hallazgo es una prueba v lida o no para condenar al sospechoso La realidad es que esta prueba sit a al sospechoso en la escena del crimen pero puede que se necesiten m s pruebas para probar que es el o la culpable Bye Puedes indicar a tus alumno
17. dental la punta toca el l quido de uno de los tubos Ante la duda cambia la punta El ADN se a ade antes que las enzimas A ade siempre las enzimas en ltimo lugar 25 ADN Fingerprinting Manual del Alumno Ahora tus muestras de ADN contendr n Muestras ADN Mezcla Volumen total 10 ul EcoRl Ps l de reacci n EC Escena del crimen 10 ul 20 ul S1 Sospechoso 1 10 ul 20 ul S2 Sospechoso 2 10 ul 20 ul S3 Sospechoso 2 10 ul 20 ul S4 Sospechoso 2 10 ul 20 ul S5 Sospechoso 2 10 ul 20 ul 5 Mezcla el contenido Cierra todos los tubos Mezcla los componentes golpeando suavemente los tubos con el dedo Si dispones de centrifuga da un pulso a los tubos durante 2 segundos para hacer que el l quido quede en el fondo del tubo y se mezclen y reaccionen los componentes Aseg rate de que los tubos se colocan de forma equilibrada en la centr fuga Si no dispones de centr fuga golpea el tubo con una vez es suficiente como si fuera un term metro Golpear los tubos sobre la mesa tambi n ayuda a mezclar los componentes IA CS S1 S2 S3 S4 S5 Golpear con el dedo y contra la mesa 6 Incuba las muestras Pon los tubos en la gradilla de corcho e inc balos a 37 C en el ba o durante 45 minutos Alternativamente los tubos se pueden incubar dej ndolos en un volumen elevado de agua calentada a 37 C y dejando que se enfr e lentamente durante toda la noche hasta que alcance la temperatura ambiental
18. el tama o de los fragmentos de ADN Si estuvieras en un juicio querr as confiar en la estimaci n ocular de coincidencia entre dos muestras hecha por un t cnico de laboratorio o querr as una medida m s precisa Con el fin de hacer m s precisa la comparaci n entre el ADN de la escena del crimen y el ADN del sospechoso algo que sea m s que una impresi n visual se necesita crear una medida cuantitativa del tama o de los fragmentos Se realiza de la siguiente manera 1 Usando la regla mide la distancia a la que ha migrado cada banda Mide la distancia en mil metros desde el fondo del pocillo hasta el centro de cada banda de ADN y apunta los datos en la tabla de la siguiente hoja Los datos de la tabla se usar n para construir una curva patr n y para estimar el tama o de los fragmentos de la escena del crimen y de los sospechosos 2 Para hacer una estimaci n exacta del tama o de los fragmentos tanto de la escena del crimen como de los sospechosos se construye una curva patr n usando las distancias eje X y el tama o de los fragmentos eje Y de los marcadores de tama o Lambda Hindlll Usando tanto el papel lineal como el semilogar tmico dibuja la distancia frente al tama o de las bandas 2 6 En cada gr fica usa una regla y traza una l nea uniendo los puntos Contin a la l nea hacia el lado derecho del papel En qu papel se obtiene la l nea m s recta para estimar el tama o de los fragmentos de la escena de
19. es realizadas a sus genes individuales a lo largo del tiempo Por eso para determinar hasta qu punto incrimina una prueba de ADN se necesita hacer la siguiente pregunta Estad sticamente cu ntas personas en una poblaci n presentar n un patr n id ntico al observado en la muestra recogida en la escena del crimen 1 de cada 10 000 o 1 de cada 10 Notas y lecturas recomendadas 1 ADN profiling Fast Becoming Accepted Tool For Identification Pamela Zurer Chemical and Engineering News Oct 10 1994 2 PCR significa Reacci n en cadena de la polimerasa es una t cnica usada para amplificar peque as cantidades de ADN en este caso para posibilitar el posterior an lisis de ese ADN 3 RFLP significa Polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricci n riff lips en la jerga En esta t cnica el ADN se corta con enzimas de restricci n en fragmentos de diferentes longitudes Cada individuo posee distintos puntos de restricci n de manera que dos piezas de ADN de diferente origen pueden producir fragmentos de diferente longitud cuando se cortan con la misma enzima 4 Una excelente fuente de informaci n para el profesor es Genetic Fingerprinting Pauline Lowrie and Susan Wells New Scientist 16 November 1991 5 Is ADN Fingerprinting ready for the courts William C Thompson and Simon Ford New Scientist March 31 1990 6 When Science Takes the Witness Stand Peter Neufled and Nevelle Coleman Scientific
20. esis en gel de agarosa El t rmino electroforesis significa mover con electricidad Electroforesis en gel de agarosa La electroforesis separa fragmentos de ADN en funci n de su tama o Los fragmentos de ADN se cargan en un gel de agarosa que se sit a en una cubeta rellena con una soluci n tamp n conductora La corriente pasa a trav s de electrodos situados en cada extremo de la cubeta Los fragmentos de ADN est n cargados negativamente y cuando se sit an en un campo el ctrico migran hacia el polo positivo La matriz del gel de agarosa act a como una malla molecular a trav s del cual los fragmentos peque os de ADN se pueden mover con m s facilidad que los 28 ADN Fingerprinting Manual del Alumno grandes Tras un periodo de tiempo los fragmentos peque os migrar n m s lejos que los grandes Los fragmentos del mismo tama o permanecen juntos y forman una sola banda de ADN Una analog a Compara este proceso con lo que ocurrir a si en un aula todos los pupitres y sillas se hubieran dispersado sim tricamente por todo el aula Un solo estudiante podr a avanzar por el laberinto r pidamente y con poca dificultad mientras que cuatro estudiantes unidos por las manos tardar an m s tiempo y tendr an m s dificultades para avanzar entre el laberinto de sillas Compru balo Unidad 3 Electroforesis de las muestras de ADN Material necesario Z S Puesto de trabajo alumnos N mero Gel agarosa Muestras
21. etira el peine del gel 4 A ade 275 ml de tamp n de electroforesis en la cubeta justo hasta que cubra los pocillos 5 Localiza los marcadores de ADN Hindlll en el tubo rotulado como M Los geles se interpretan de izquierda a derecha As la primera muestra se carga en el pocillo del lado izquierdo del gel 30 ADN Fingerprinting Manual del Alumno 6 Utilizando una punta de pipeta diferente para cada muestra cargar el gel de la siguiente manera Pocillo 1 M Marcadores de ADN 10 ul Pocillo 2 EC tubo verde 20 ul Pocillo 3 S1 tubo azul 20 ul Pocillo 4 S2 tubo naranja 20 ul Pocillo 5 S3 tubo violeta 20 ul Pocillo 6 S4 tubo rojo 20 ul Pocillo7 S5 tubo amarillo 20 ul 7 Colocar la tapa a la cubeta de electroforesis La tapa encaja en una nica posici n rojo con rojo y negro con negro Conectar los cables a la fuente de alimentaci n 8 Encender la fuente a 100 V y dejar correr la electroforesis durante 30 40 minutos Mientras puedes ir contestando las preguntas de revisi n de la siguiente p gina 9 Cuando la electroforesis haya terminado desconectar de la fuente de alimentaci n y quitar la tapa de la cubeta Con cuidado sacar de la cubeta el molde con el gel Ten precauci n el gel es muy resbaladizo Para retirar el gel del molde empuja el gel con el pulgar para que se deslice y con cuidado d jalo caer en el cristalizador o cubeta para la tinci n 10 A ade 60 ml del coloran
22. l Profesor Gu a del profesor para la preparaci n de la pr ctica Este apartado describe los preparativos que debe realizar el profesor antes de cada sesi n pr ctica Se incluye una estimaci n del tiempo de preparaci n para cada sesi n Unidad 2 Digesti n con enzimas de restricci n de las muestras de ADN Preparaci n previa Objetivos Tiempo a emplear Material necesario Metodolog a Rehidratar las muestras de ADN y las enzimas de restricci n Alicuotar las enzimas de restricci n Preparar los puestos de trabajo comunes y de los alumnos Preparar los geles de agarosa o si los van a a preparar los alumnos preparar la agarosa y mantenerla en el ba o a 50 55 C hasta que la usen Calentar un ba o a 37 C 30 min 1 hora depender de qui n prepare los geles de agarosa Cubetas moldes y peines para electroforesis Tamp n electroforesis TAE 50x Agarosa en polvo 16 microtubos 1 Rehidrataci n de las muestras Nota Todos los viales de ADN y de enzimas deben contener un residuo blanco que aparecer como un polvo suelto en los viales de ADN Las muestras liofilizadas de ADN se encuentran en viales de cristal transparente marcados con etiquetas de colores La mezcla liofilizada de las enzimas EcoRl Pstl se encuentra en un vial de color mbar A Para rehidratar las muestras de ADN a adir 200 ul de agua est ril en cada vial de ADN liofilizado y agitarlo para resuspenderlo Dejar que las mues
23. l crimen y de los sospechosos Por qu crees que una gr fica es m s recta que la otra 3 Decide qu gr fica la del papel lineal o la del semilogar tmico se debe usar para estimar el tama o de los fragmentos de ADN de las escena del crimen y de los sospechosos Justifica tu elecci n 4 Para estimar el tama o de un fragmento de la escena del crimen o de un sospechoso mide la distancia a la que migr ese fragmento Localiza esa distancia en el eje X de tu curva patr n y desde esa posici n en el eje X sube hasta la curva patr n y luego sigue la l nea milimetrada del papel hasta el eje Y Quiz s quieras dibujar una marca en l piz de la trayectoria que has seguido desde el eje X al Y El punto en el que la l nea se encuentra con el eje Y indica el tama o aproximado del fragmento de ADN Haz esto para todos los fragmentos de la escena del crimen y de los sospechosos 5 Compara los tama os de los fragmentos de los sospechosos y de la escena del crimen Hay alg n sospechoso que coincida con la escena del crimen Est s seguro de que coinciden 36 Manual del Alumno ADN Fingerprinting Marcadores Lambda Hindlll Escena crimen Sospechoso 1 Sospechoso 2 Sospechoso 3 Sospechoso 4 Sospechoso 5 banda Distancia mm Tama o pb Distancia mm Tama o pb Distancia mm Tama o pb Distancia mm Tama o pb Distancia mm Tama o pb Distancia
24. lizar los resultados con la ayuda del profesor Dejar que el gel se seque sobre el film de soporte o sobre la mesa del laboratorio Cuando est seco p galo en tu cuaderno de laboratorio 17 Manual del Profesor ADN Fingerprinting Manual del Alumno ADN Fingerprinting Manual del alumno Unidad 1 Introducci n al ADN Fingerprinting oooonnnnnninionnccccnncnncnconononna nn ncnnannns 18 Unidad 2 Digesti n de las muestras de ADN con enzimas de restricci n 20 Unidad 3 Electroforesis y tinci n de las muestras de ADN oooconcccccccccncccccccnccnconos 27 Unidad 4 Secado de los geles y an lisis de las patrones de ADN ooooccocccccccccccccnoo 32 18 ADN Fingerprinting Manual del Alumno Unidad 1 Introducci n al ADN fingerprinting Vas a realizar un procedimiento denominado ADN fingerprinting Los datos obtenidos te permitir n determinar si las muestras de ADN que te ser n proporcionadas son del mismo individuo o de varios diferentes Para este experimento es necesario repasar la estructura de la mol cula de ADN ESTRUCTURA DEL ADN fa lt 3 MY lt Dom UDE 9 y O DD Mol cula 1 de ADN Mol cula 2 de ADN Mol cula 3 de ADN PLANTA HUMANO BACTERIA El esquema anterior representa una peque a porci n de ADN de tres seres vivos diferentes En esta representaci n el sistema de s mbolos es el siguiente Cadenas laterales S Az
25. lla 1 a Cubeta con hielo 1 Puesto com n ADN escena crimen rehidratado con tamp n 1 vial O ADN sospechoso 1 rehidratado con tamp n 1 vial a ADN sospechoso 2 rehidratado con tamp n 1 vial m ADN sospechoso 3 rehidratado con tamp n 1 vial m ADN sospechoso 4 rehidratado con tamp n 1 vial a ADN sospechoso 5 rehidratado con tamp n 1 vial Estufa o ba o a 37 C 1 laboratorio O Agarosa l quida 35 40 ml gel a Molde para preparar geles cristales 1 puesto a Cinta adhesiva 1 puesto m Se deben usar gafas protectoras mientras se est en el laboratorio Se deben seguir las medidas generales de seguridad como no comer ni beber en el laboratorio ADN Fingerprinting Manual del Profesor Unidad 3 Electroforesis de las muestras de ADN Puesto de trabajo alumnos Numero v Gel de agarosa 1 m Muestras con ADN digerido 5 O Colorante para ADN Tamp n carga 1 O 2 Rotuladores 1 O Puntas pipeta 1 caja O Micropipeta P 10 o P 20 1 O Contenedor para residuos 1 Gradilla 1 Cubeta electroforesis y fuente alimentaci n 1 O Cristalizador o cubeta para tinci n gel 1 O Puesto com n Tamp n electroforesis TAE 1x 275 ml gel caja O Colorante Bio Safe 1x 500 ml O Marcadores Hindlll 1 O Unidad 4 An lisis de resultados Puesto de trabajo alumnos N mero v Agua para deste ir geles 60 ml O Regla milimetrada 1 O Papel semilogar tmico 1 O Puesto com n No se necesita material com n 10 ADN Fingerprinting Manual de
26. madamente 60 ml Los geles se deben separar del soporte antes de la tinci n Esto se realiza f cilmente sujetando la base del gel en una mano y empuj ndolo suavemente con el pulgar de la otra mano Se debe tener especial precauci n para no romper la zona de los pocillos al separar el gel Situar el gel en una cubeta o cristalizador y cubrirlo completamente con la soluci n colorante Para obtener mejores resultados dejar los geles en agitaci n toda la noche Se pueden te ir varios geles en un recipiente grande marc ndolos con cortes en diferentes esquinas para diferenciarlos Si se utilizan las cubetas del kit cada gel se puede te ir de forma individual en una cubeta Dejar los geles ti ndose toda la noche Al d a siguiente aclarar los geles te idos con agua y deste irlos al menos 10 minutos Para obtener el m ximo contraste los geles se pueden dejar desti ndose en agua toda una noche El colorante no es t xico pero se deben utilizar guantes mientras se tocan los geles para evitar te irse las manos 14 ADN Fingerprinting Manual del Profesor Unidad 4 Secado de los geles y an lisis de las bandas de ADN Preparaci n previa Objetivo Preparar puestos de trabajo Tiempo requerido 10 minutos Material No es necesario preparar ning n reactivo Para obtener una copia permanente del gel antes de su secado bien se puede calcar dibujando los pocillos y las bandas de ADN en papel acetato o se puede fotografiar con una c
27. mente En esta secci n se indica como preparar los geles de forma convencional Se detallan otros m todos en el manual de instrucciones del sistema Bio Rad s Mini Sub Cell GT Paso 1 Paso 2 Paso 3 Paso 4 Paso 5 Paso 6 Paso 7 Paso 8 Paso 9 Sellar los bordes del molde o soporte donde se va a preparar el gel con cinta adhesiva de laboratorio Apretar la cinta firmemente a los bordes para formar un precinto herm tico Nivelar el molde sobre una mesa usando el nivelador proporcionado Preparar la cantidad de agarosa adecuada en tamp n TAE Dejar enfriar la agarosa hasta al menos los 60 C y verterla sobre el soporte Mientras se enfr a la agarosa colocar el peine en el molde El peine se debe colocar a unos 2 cm del extremo del soporte nunca en la mitad del gel Dejar que el gel solidifique a temperatura ambiente durante 10 20 minutos Tendr aspecto opaco cuando est listo para su uso Retirar el peine del gel con precauci n Retirar la cinta de los bordes del soporte Colocar el molde o soporte en la cubeta de electroforesis situando los pocillos en el c todo negro Las muestras de ADN migrar n hacia el nodo rojo durante la electroforesis Para preparar un gel doble en el soporte de 7 x 10 cm con dos peines de 8 pocillos coloca un peine en un extremo y el otro peine a la mitad del soporte 13 ADN Fingerprinting Manual del Profesor Unidad 3 Electroforesis y tinci n de las muestras de ADN
28. mol cula de la manera descrita arriba 1 Cu ntos fragmentos de ADN se obtendr an tras el corte 2 Escribe la secuencia de bases de los dos fragmentos el izquierdo y el derecho Izquierdo Derecho 3 Qu diferencias hay entre los dos fragmentos 21 ADN Fingerprinting Manual del Alumno 4 El tama o del fragmento de ADN se puede expresar como el n mero de pares de bases del fragmento Indicar el tama o de los fragmentos obtenidos a Elfragmento m s peque o tiene pares de bases pb b Cu l es el tama o del fragmento m s largo 5 Observa las dos muestras de ADN mostradas a continuaci n en las que por simplificaci n se representa una sola cadena Muestra 1 CAGTGATCTCGAATTCGCTAGTAACGTT Muestra 2 TCATGAATTCCTGGAATCAGCAAATGCA Si ambas muestras fueran tratadas con una enzima de restricci n cuyo sitio de reconocimiento fuera GAATTCC indica el n mero de fragmentos y el tama o de los mismos que se obtendr an para cada muestra de ADN Muestra 1 Muestra 2 N de fragmentos N de fragmentos Escribe el tama o de cada fragmento en orden del m s grande al m s peque o Muestra 1 Muestra 2 22 ADN Fingerprinting Manual del Alumno Unidad 2 Digesti n de las muestras de ADN con enzimas de restricci n Metodolog a Tras observar con detenimiento es evidente que la nica diferencia entre el ADN de diferentes individuos es la secuencia lineal de pares de bases E
29. n cada muestra 2 Cuales son los tama os relativos de cada fragmento Por tanto de alguna forma debes obtener evidencias para contestar la siguiente pregunta Se encuentran los sitios de restricci n para EcoRl y Pstl localizados en los mismos puntos en cada muestra de ADN Los siguientes hechos te ser n de ayuda para determinar el tama o de los fragmentos de ADN en tus muestras An lisis de la digesti n con enzimas de restricci n La estructura tridimensional de las enzimas de restricci n les permite fijarse a una mol cula de ADN de doble cadena y desplazarse a lo largo de la h lice hasta que reconocen una secuencia espec fica de pares de bases que indica a la enzima que deje de desplazarse Las enzimas entonces digieren separan qu micamente la mol cula de ADN en ese sitio denominado sitio de restricci n actuando como unas tijeras moleculares que cortan el ADN en una secuencia espec fica de pares de bases Si un sitio de restricci n aparece en m s de un punto en la mol cula de ADN la enzima de restricci n har un corte en todos y cada uno de esos sitios obteni ndose m ltiples fragmentos La longitud de cada fragmento depender de la posici n de los sitios de restricci n en la mol cula de ADN Cuando las enzimas de restricci n se usan para cortar una larga cadena de ADN se pueden obtener varios fragmentos Esos fragmentos se pueden separar y visualizar usando una t cnica denominada electrofor
30. n esta pr ctica tu grupo recibir 6 muestras de ADN Recuerda que tu tarea es determinar si alguna de ellas pertenece al mismo individuo o si son todas de diferentes individuos Hasta aqu tu an lisis preliminar ha incluido los siguientes puntos e Las similitudes y diferencias entre ADN de diferentes individuos e Como las endonucleasas cortan hidrolizan las mol culas de ADN e C mo el a adir la misma endonucleasa de restricci n a dos muestras de ADN puede proporcionar algunas pistas sobre las diferencias entre la secuencia lineal de pares bases Ahora que tienes nociones b sicas sobre estos tres puntos est s listo para realizar la primera fase del procedimiento de ADN fingerprinting la digesti n con enzimas de restricci n de tus muestras de ADN Listado de material necesario en tu puesto de trabajo Aseg rate que los materiales de la siguiente lista est n en tu puesto de trabajo antes de comenzar la pr ctica Puesto de trabajo alumnos N mero Enzimas EcoRl Pstl ENZ 1 tubo 80 ul O Puntas pipeta 15 a Micropipeta P 10 o P 20 1 a Microtubos de colores verde azul naranja violeta 1 O rojo amarillo Rotulador de tinta indeleble 1 O Contenedor para residuos 1 a Gradilla de corcho 1 m Cubeta con hielo 1 O Puesto com n ADN escena crimen 1 vial O ADN sospechoso 1 1 vial a ADN sospechoso 2 1 vial O ADN sospechoso 3 1 vial O ADN sospechoso 4 1 vial O ADN sospechoso 5 1 vial O Estufa o ba o a 37 C
31. o La comprensi n de algunos hallazgos relativamente recientes en la tecnolog a del ADN recombinante te puede ayudar a elaborar un plan En 1968 el Dr Werner Arber de la Universidad de Basel Suiza y el Dr Hamilton Smith de la Universidad Johns Hopkins Baltimore descubrieron varias enzimas en las bacterias las cuales cuando se a ad an a cualquier ADN romp an hidrolizaban los enlaces entre las mol culas de az car fosforilado actuando de forma espec fica en algunas secuencias de bases sitios de reconocimiento Esto produc a la ruptura de la doble cadena de ADN en el sitio de reconocimiento y la mol cula de ADN se fracturaba en dos fragmentos Estas tijeras moleculares o enzimas hidrol ticas son las endonucleasas de restricci n Puedes imaginar por qu se llaman endonucleasas de restricci n Dos endonucleasas de restricci n muy comunes son EcoRI y Pstl y las utilizar s en esta pr ctica Para comprender mejor c mo EcoRl y Pstl te pueden ayudar a realizar el ensayo ADN fingerprinting primero debes entender y visualizar el efecto del corte del ADN por las endonucleasas de restricci n E ATGI GATCCTCAATTACCT TACCTAGIGAGTTAATGGA E La l nea entre los pares de bases representa los puntos en los que se romper n los enlaces si la endonucleasa de restricci n reconoce la secuencia GAATTC Las siguientes preguntas se refieren a c mo se ver a afectado un fragmento de ADN si la endonucleasa de restricci n cortara la
32. or secuencias espec ficas de pares de bases Si existe m s de una diana de restricci n en una mol cula de ADN la enzima de restricci n cortar en cada uno de esos sitios obteni ndose m ltiples fragmentos As si un fragmento lineal de ADN se corta con una enzima de restricci n cuya diana de restricci n se encuentra en dos puntos diferentes de la mol cula de ADN se obtendr n tres fragmentos de diferentes longitudes La longitud de cada fragmento depender de la localizaci n de las dianas de restricci n en la mol cula de ADN Cuando las enzimas de restricci n se usan para cortar cadenas de ADN plasm dico circular como las muestras incluidas en este kit se obtienen fragmentos de ADN de varios tama os El ADN cortado con enzimas de restricci n puede ser separado y observado utilizando una t cnica denominada electroforesis en gel de agarosa El t rmino electroforesis significa mover con electricidad Electroforesis en gel de agarosa La electroforesis separa los fragmentos de ADN en funci n de su tama o Los fragmentos de ADN se cargan en un gel de agarosa que se sit a en una cubeta que contiene una soluci n l quida conductora La corriente el ctrica pasa a trav s de dos electrodos situados en cada extremo de la cubeta Los fragmentos de ADN est n cargados negativamente y cuando se sit an en un campo el ctrico migrar n hacia el polo positivo La matriz del gel de agarosa act a como un tamiz molecular a trav
33. ostrar similitudes gen ticas entre individuos Las posiciones relativas de las bandas marcadas radiactivamente en un gel est n determinadas por el tama o de los fragmentos de ADN que las forman El tama o de los fragmentos indica variaciones en el ADN de cada individuo Estamos yendo m s all de lo que este manual pretende Para tener informaci n m s detallada recomendamos revisar las referencias de la p gina 6 La muestra necesaria para esta t cnica se puede obtener de cualquier material biol gico que contenga ADN tejidos fluidos corporales sangre y semen fol culos pilosos etc El an lisis de ADN se puede hacer incluso de material desecado como una mancha de sangre o tejido momificado Si la muestra de ADN es muy peque a se puede amplificar utilizando la PCR El ADN se trata despu s con enzimas de restricci n que cortan el ADN en fragmentos de diferentes longitudes Digesti n enzim tica del ADN Dado que cortan el ADN las enzimas de restricci n son las tijeras qu micas de los bi logos moleculares Cuando una determinada enzima de restricci n reconoce una secuencia de reconocimiento de 4 o 6 pares de bases en un fragmento de ADN corta la mol cula en ese punto Las secuencias de reconocimiento de dos enzimas usadas habitualmente EcoRl y Pstl aparecen a continuaci n El lugar exacto en que se corta la cadena de ADN se se ala con unas tijeras como s mbolo SE Para la enzima Eco RI G Es CTTAA E SE
34. que el ADN recogido en la escena del crimen Describe la evidencia cient fica que sustenta tu conclusi n 41
35. ragmento circular de ADN pl smido como material de partida cu ntos sitios de restricci n tendr a la muestra del carril 3 8 Qu muestras de ADN parecen haber sido cortadas en el mismo n mero de fragmentos y del mismo tama o 9 Bas ndote en tu an lisis de este gel cu l es tu conclusi n sobre las muestras de ADN del dibujo Alguna de las muestras parece proceder de la misma fuente Si es as cu les Describe las evidencias que justifican tus conclusiones 34 ADN Fingerprinting Manual del Alumno Unidad 4 An lisis de los patrones de ADN Protocolo Puesto de trabajo alumnos N mero v Agua para deste ir geles 60 ml a Regla milimetrada 1 Papel milimetrado lineal 1 m Papel milimetrado semilogaritmico 1 a Puesto com n No se necesita material com n Pasos para te ir y deste ir el gel 1 Elimina el colorante Bio Safe recogi ndolo en una botella o similar y desti e el gel con 60 ml de agua durante unos 15 minutos 2 Elimina el agua del cristalizador Pregunta al profesor c mo tirar de forma adecuada el colorante 3 Recorta los carriles sin bandas del gel con un cuchillo Deja secar el gel sobre la cara hidrof lica de un trozo de film de soporte del gel o en el cristalizador sobre la mesa del laboratorio durante 3 5 d as Cuando el gel est seco p galo en tu cuaderno de laboratorio como recuerdo 35 ADN Fingerprinting Manual del Alumno An lisis cuantitativo d
36. rinting Manual del Profesor Informaci n b sica para el profesor Introducci n A los t cnicos que trabajan en laboratorios forenses a menudo se les solicita que determinen la huella gen tica o ADN fingerprinting para aportar evidencias en juicios o para otras aplicaciones Determinar la huella gen tica implica la amplificaci n del ADN mediante la reacci n en cadena de la polimerasa PCR 2 para analizar peque as cantidades de ADN o mediante el polimorfismo de longitud de fragmentos de restricci n RFLP Sy si se dispone de grandes cantidades de ADN Una etapa del an lisis mediante RFLP requiere que el estudiante compare los patrones de bandas producidas por las muestras de ADN cuando se separan en un gel de agarosa En esta pr ctica se comparan las bandas producidas por una muestra que representa el ADN recogido en la escena del crimen y cinco muestras obtenidas de sospechosos en el caso Es importante que indiques a tus alumnos que en esta pr ctica se utiliza la t cnica m s sofisticada para muestras complejas de ADN humano Enzimas de restricci n Las enzimas de restricci n se sit an en la mol cula de ADN y se desplazan por la h lice hasta que reconocen unas secuencias espec ficas de pares de bases que indican a la enzima que deje de desplazarse Las enzimas entonces digieren separan qu micamente la mol cula de ADN en ese punto llamado diana de restricci n actuando como tijeras moleculares cortando el ADN p
37. s tubos del kit al correspondiente microtubo Muestras ADN mezcla de enzimas coloreado Usar una punta de pipeta diferente para cada muestra de ADN Asegurarse de que las muestras quedan en el fondo de los tubos 4 Pipetear 10 ul de la mezcla de enzimas ENZ en el fondo de cada tubo Cambiar la punta de la pipeta para cada muestra de enzimas 5 Tapar los tubos y mezclar los componentes golpeando suavemente los tubos con el dedo Si se dispone de microcentr fuga dar un pulso para que todo el l quido quede en el fondo del tubo De lo contrario golpear el tubo sobre la mesa Golpear con el dedo y contra la mesa 6 Colocar los tubos en una gradilla de corcho e y incubar 45 minutos a 37 C o toda la noche a temperatura ambiente en un volumen elevado de agua calentada a 37 C 7 Despu s de la incubaci n sacar los tubos del ba o y dejarlos en la nevera hasta su uso 16 ADN Fingerprinting Dia 2 Electroforesis 1 a o N Sacar las muestras de ADN digerido de la nevera Si se dispone de centr fuga dar un pulso a los tubos para que todo el l quido quede en el fondo del tubo Utilizando una punta de pipeta diferente para cada muestra a adir 15 ul de tamp n de carga TC en cada tubo Cerrar los tubos y mezclar los componentes golpeando suavemente los tubos con el dedo Colocar un gel de agarosa en la cubeta de electroforesis Rellenar la cubeta con tamp n TAE 1x has
38. s de la cual los fragmentos peque os de ADN se pueden mover con m s facilidad que los m s grandes Tras cierto tiempo los fragmentos peque os avanzar n m s que los m s grandes Los fragmentos del mismo tama o permanecen juntos y migran juntos produciendo una sola banda de ADN An logamente se podr a comparar este proceso con lo que ocurrir a si todos los pupitres y sillas se hubieran dispersado sim tricamente por todo un aula Un solo estudiante podr a avanzar por el laberinto r pidamente y con poca dificultad mientras que cuatro estudiantes unidos por las manos tardar an m s tiempo y tendr an m s dificultades para avanzar entre el laberinto de sillas 4 ADN Fingerprinting Manual del Profesor ADN Fingerprinting Todas las personas tienen similitudes y diferencias en sus secuencias de ADN Para demostrar que un fragmento de ADN contiene una secuencia de nucle tidos espec fica se puede construir una sonda de ADN complementario marcado radiactivamente de manera que reconozca y se una a la secuencia en el fragmento original de ADN Las sondas radiactivas permiten a los bi logos moleculares localizar identificar y comparar el ADN de diferentes personas Esta sonda se puede describir como una etiqueta radiactiva que se unir a una cadena simple de ADN y producir una banda en un gel o una banda en una membrana de nylon que es una r plica del gel Southern blot Por su especificidad la sonda radiactiva se puede usar para dem
39. s que esto es una simulaci n En la realidad los t cnicos analizan segmentos mucho m s largos de ADN y se obtienen muchas m s bandas Se buscan segmentos espec ficos de ADN comunes en una poblaci n y que producir n un patr n de bandas nico para cada individuo ADN Fingerprinting Manual del Profesor Fiabilidad de las pruebas de ADN Los dos principales factores que afectan a la fiabilidad de la tecnologia del ADN en la medicina forense son la gen tica de las poblaciones y la estad stica gen tica En los humanos hay miles de loci RFLP o de segmentos de ADN que se pueden seleccionar y usar para analizar la huella gen tica En funci n de factores demogr ficos como el origen tnico o el aislamiento geogr fico algunos segmentos mostrar n m s variabilidad que otros Algunas poblaciones muestran mucha menos variabilidad en segmentos particulares de ADN que otras El grado de variabilidad afectar a la probabilidad de que exista m s de un individuo con la misma secuencia Si el 90 de una poblaci n presenta el mismo patr n para un determinado segmento de ADN poca informaci n se podr obtener Pero si la frecuencia de aparici n de un patr n de ADN para un determinado segmento en una poblaci n es extremadamente baja entonces este segmento puede ser una herramienta muy til para discriminar entre los individuos de esa poblaci n Cada poblaci n muestra diferentes patrones en sus genotipos debido a las distintas aportacion
40. ta cubrir el gel usando aproximadamente 275 ml de tamp n Comprueba que los pocillos del gel est n cerca del electrodo negro y que la base del gel est cerca del electrodo rojo Utilizando una punta de pipeta diferente para cada muestra cargar el volumen indicado de cada muestra en los 7 pocillos del gel en el siguiente orden Pocillo 1 M Marcadores de ADN 10 ul Pocillo 2 EC tubo verde 20 ul Pocillo 3 S1 tubo azul 20 ul Pocillo 4 S2 tubo naranja 20 ul Pocillo 5 S3 tubo violeta 20 ul Pocillo 6 S4 tubo rojo 20 ul Pocillo7 S5 tubo amarillo 20 yl Colocar la tapa en la cubeta de electroforesis La tapa encaja en una nica posici n Los puntos rojo y negro de la tapa se unen a los puntos rojo y negro de la cubeta Conectar los electrodos a la fuente de alimentaci n Encender y dejar 30 minutos a 100 V Cuando la electroforesis haya terminado desconectar y retirar la tapa Con cuidado sacar de la cubeta el molde con el gel Ten cuidado el gel es muy escurridizo Poner el gel en el cristalizador o cubeta de tinci n A adir 60 ml del colorante para ADN en la cubeta Cubrir la cubeta con una pel cula de pl stico Deja el gel ti ndose toda la noche en agitaci n D a 3 An lisis del gel 1 Eliminar el colorante traspas ndolo a una botella A adir 60 ml de agua al gel y dejar desti endo 15 minutos Eliminar el agua tir ndola al contenedor de residuos Ana
41. te Bio Safe en el cristalizador y c brelo con pl stico Deja que el gel se ti a durante toda la noche movi ndolo intermitentemente si no se dispone de agitador 31 ADN Fingerprinting Manual del Alumno Unidad 3 Electroforesis de las muestras de ADN Cuestionario de revisi n 1 El aparato de electroforesis origina un campo el ctrico con un polo positivo y otro negativo situados en cada extremo del gel Las mol culas de ADN est n cargadas negativamente A qu polo o crees que migrar n las muestras de ADN Explica por qu 2 Qu color representa al polo negativo 3 Despu s de cargar las muestras de ADN en los pocillos se las fuerza a moverse a trav s de la matriz del gel Qu fragmentos grandes o peque os crees que migrar n al extremo opuesto del gel con mayor rapidez Explica por qu 4 Qu fragmentos grandes o peque os esperas que se desplacen la m nima distancia desde el pocillo Explica por qu 32 ADN Fingerprinting Manual del Alumno Unidad 4 Secado de los geles y an lisis de los patrones de ADN Alguna de las muestras de ADN de los sospechosos coincide con la del individuo presente en la escena del crimen T mate un momento para pensar c mo analizar s tu gel En los dos ltimos pasos tendr s que A Visualizar los fragmentos de ADN en tu gel B Analizar el n mero y posici n de las bandas visibles de ADN en tu gel Visualizaci n de los fragmentos de ADN
42. tividad Realizaci n Duraci n Lectura del manual Inmediatamente 1 hora Preparaci n del tamp n de electroforesis Antes de 1 hora TAE y de los geles de agarosa o durante la Unidad 2 Rehidrataci n de muestras de ADN y Antes de la Unidad 2 20 minutos enzimas y preparaci n de al cuotas Preparaci n del colorante para ADN Bio Safe Antes de la Unidad 2 10 minutos Preparaci n puestos trabajo D a de pr cticas 10 minutos d a ADN Fingerprinting Manual del Profesor Listado de material Puesto de trabajo de los alumnos El material necesario para el desarrollo de cada pr ctica y que debe estar en cada puesto de trabajo al inicio de la misma aparece en los siguiente listados Los componentes presentes en el kit son suficientes para montar 8 puestos de trabajo para alumnos Puesto comun El listado de material y equipos necesarios para cada pr ctica y que deben estar en una zona com n a la que tengan acceso todos los grupos de trabajo aparece a continuaci n El profesor decidir si los alumnos acceden al material com n y equipos o si es el profesor el que al cuota el material y maneja los aparatos Unidad 2 Digesti n del ADN con enzimas de restricci n Puesto de trabajo alumnos N mero o Enzimas EcoRl Pstl 1 tubo 80 ul O Puntas pipeta 15 Micropipeta P 10 o P 20 1 a Microtubos de colores verde azul naranja 1 O violeta rojo amarillo O Rotulador de tinta indeleble 1 Contenedor para residuos 1 m Gradi
43. tras se rehidraten a temperatura ambiente durante 5 minutos o hasta que se disuelvan Puede que sea necesario un suave calentamiento a 37 C durante 10 minutos Si quieres puedes traspasar las muestras rehidratadas a los tubos microtubos coloreados de 1 5 ml para facilitar el pipeteo a los alumnos Las muestras rehidratadas de ADN est n en una soluci n tamp n a una concentraci n de 0 3 ug ul en Tris 100 mM NaCl 200 mM MgCl 20 mM DTT 2mM pH 8 0 Al a adir las enzimas de restricci n la concentraci n final del tamp n ser Tris 50 mM NaCl 100 mM MgCl 10 mM DTT 1mM pH 8 0 siendo stas las condiciones ptimas para la actividad de las enzimas EcoRI y Pstl B Para rehidratar la mezcla de enzimas EcoRl Pstl a adir 750 ul de agua est ril y agitar para resuspender las enzimas Dejar que las enzimas se rehidraten en hielo durante 5 minutos Es crucial que la mezcla de enzimas se mantenga en hielo pero sin congelar una vez que se hayan rehidratado Las enzimas rehidratadas se deben usar en las 12 horas siguientes 2 Preparaci n de las al cuotas de la mezcla de enzimas Transferir 80 ul de la mezcla enzim tica rehidratada a cada uno de los 8 microtubos de 1 5 ml marcados como ENZ 11 ADN Fingerprinting Manual del Profesor 3 Preparaci n del tamp n de electroforesis El tamp n de electroforesis TAE Tris acetato EDTA se encuentra en una soluci n concentrada 50x Usaremos el tamp n TAE 1x necesitando
Download Pdf Manuals
Related Search