Manual de usuario
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1. cada uno de los amplificados que se vaya a purificar en una placa limpia 2 A adir 2 ul de ExosaplT a cada pocillo 3 Incubar las muestras 15 minutos a 372C y 15 minutos a 802C en un termociclador A partir de los productos de PCR purificados se preparan dos reacciones de secuenciaci n una con el cebador directo Sec F HBB y la otra con el reverso Sec R HBB El set imegen HBB incluye los cebadores necesarios para realizar las reacciones de secuenciaci n 6 Electroforesis capilar Una vez purificadas las reacciones de secuenciaci n deben ser sometidas a electroforesis capilar Dependiendo del modelo de secuenciador utilizado se emplear el pol mero recomendado por el fabricante Para programar las condiciones de electroforesis se tendr en cuenta que el tama o de los amplificados es de 823 pb y 528 pb 10 Control de calidad Todos los productos comercializados por el Instituto de Medicina Gen mica son sometidos a un riguroso control de calidad El set imegen HBB ha superado todas las pruebas de validaci n internas que garantizan la fiabilidad y reproducibilidad de cada ensayo 12 Garant as y responsabilidades El Instituto de Medicina Gen mica le garantiza que todos sus productos est n libres de defectos tanto en los materiales empleados como en su proceso de su fabricaci n Esta garant a se hace extensible hasta la fecha de caducidad del producto siempre que se mantengan las condiciones de conservaci n especifica2. A instituto de medicina gen mica Parque Cientifico Universidad de Valencia C Catedr tico Agust n Escardino Y 46980 Paterna Valencia Tel 96 321 23 40 Fax 96 321 23 41 www imegen es i g imegen HBB IMG 156 An lisis gen tico molecular del gen HBB mediante secuenciaci n 1 Descripci n La Beta Talasemia MIM 4141900 se hereda siguiendo un patr n autos mico recesivo y est asociada a mutaciones en el gen HBB localizado en 11p15 5 Mediante el uso del set imegen HBB podr realizar un estudio molecular para el an lisis de peque as deleciones inserciones y mutaciones puntuales en la regi n codificante los sitios de splicing y las regiones reguladoras 5 UTR y 3UTR del gen HBB Este estudio no permite detectar grandes deleciones duplicaciones 2 Componentes y almacenamiento del set Este set contiene reactivos suficientes para la realizaci n de 24 determinaciones o 3 Preparaci n de las reacciones de amplificaci n En los tubos de PCR HBB que incluye el set imegen HBB se han incluido los cebadores necesarios para realizar las reacciones de amplificaci n Se deben realizar dos amplificaciones por cada muestra una para la amplificaci n conjunta de los exones 1 y 2 y otra reacci n de PCR para la amplificaci n del ex n 3 Para estimar la cantidad de reactivos necesaria se debe tener en cuenta el n mero de muestras y controles a analizar simult neamente Recomendamos realiza
3. das en este Manual Nuestros productos est n dise ados para uso en investigaci n El usuario de los productos es responsable de validar la utilidad de los protocolo propuestos por el Instituto de Medicina Gen mica Dichos protocolos se consideran nicamente una gu a El Instituto de Medicina Gen mica no le ofrece ninguna otra garant a expresa o impl cita que se extienda m s all del funcionamiento correcto de los componentes de este set La nica obligaci n del Instituto de Medicina Gen mica respecto de las garant as precedentes ser la de reemplazar los productos o bien devolver el precio de la compra de los mismos a voluntad del cliente siempre y cuando se pruebe la existencia de un defecto en los materiales o bien en la elaboraci n de sus productos El Instituto de Medicina Gen mica no ser responsable de ning n da o directo o indirecto que resulte en p rdidas econ micas o en da os que pudieran producirse por el uso de este producto por parte del comprador o usuario 13 Servicio de atenci n al cliente Para cualquier consulta sobre las aplicaciones de este producto o sobre sus protocolos puede contactar con nuestro Departamento T cnico Tel fono 963 212 340 Mail info imegen es Rev 10 10 2012 2 2
4. r los c lculos considerando una reacci n m s o bien incrementando un 10 el volumen de cada reactivo 1 Descongelar los reactivos y el ADN de las muestras Dar un v rtex a cada uno de los reactivos y mantener en fr o 2 En dos tubos de 1 5 ml preparar los mix de PCR con las siguientes cantidades Master Mix HBB 19 9 ul 19 9 ul Taq HBB PCR HBB Ex 1 2 PCR HBB Ex 3 O y 25w O 3 Dispensar en tubos de 0 2 ml o en una placa de PCR 22 5 ul de cada uno de los m sters de PCR 4 A adir 2 5 ul de ADN 10 ng ul a cada una de las reacciones Rev 10 10 2012 1 2 gt ia TEEN maera A instituto de medicina gen mica Parque Cientifico Universidad de Valencia C Catedr tico Agust n Escardino 9 i 46980 Paterna Valencia Tel 96 321 23 40 Fax 96 321 29 41 www imegen es l i g 4 Programa de amplificaci n Someter las reacciones de amplificaci n al siguiente programa de amplificaci n IMG 156 952C 30 segundos O ee o Posteriormente se deben analizar mediante electroforesis en gel de agarosa al 2 los productos de PCR para verificar la presencia de amplificados en todos los exones y la ausencia de amplificaci n en los controles negativos 5 Secuenciaci n de los productos de PCR Antes de realizar la secuenciaci n es necesario realizar la purificaci n de los productos de PCR Esta purificaci n se puede realizar empleando el siguiente protocolo 1 A adir 5 ul de
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