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1. Revista CENIC Ciencias Biol gicas Vol 46 No 2 pp 119 130 mayo agosto 2015 12 Le n K River n AM Arencibia O Santamar a Y L pez C novas L Two dimensional pulsed field minigel electrophoresis with high throughput sample format Journal of Food Safety 2013 33 215 21 13 Brug re JF Cornillot EW M t nier G Bansimon A Vivar s CP Encephalitozoon cuniculi Microspora genome physical map and evidence for telomere associated rDNA units on all chromosomes Nucleic Acids Research 2000 28 10 2026 33 14 Bautsh W Rapid physical mapping of the Mycoplasma mobile genome by two dimensional field inversion gel electrophoresis techniques Nucleic Acids Research 1988 16 11461 7 15 R mling U Grotues D Bautsh W Tiimmler B A physical genome map of Pseudomonas aeruginosa PAO EMBO Journal 1989 8 4081 9 16 Bancroft I Wolk CP Oren EV Physical and genetic maps of the genome of the heterocyst forming cyanobacterium Anabaena sp strain PCC 7120 Journal of Bacteriology 1989 171 5940 8 17 Klingberg TD Lesnik U Arneborg N Raspor P Jespersen L Comparison of Saccharomyces cerevisiae strains of clinical and nonclinical origin by molecular typing and determination of putative virulence traits Fems Yeast Research 2008 8 4 631 40 18 River n A L pez C novas L Herrera J B ez Camargo M Higginson D Orozco E Fast pulsed field minigel electrophoresis Analytical Letters 1995 28 1973 91 19 L pez C novas2. Las enzimas Asc I Fse I Pac I y Pme I revelaron polimorfismos de los fragmentos de restricci n de al menos tres de las siete parejas de cromosomas hom logos analizados Fig 2 mientras que Not I y Sfi I los evidenciaron en todas las parejas analizadas Fig 2 As estas dos enzimas revelaron la mayor cantidad de diferencias en la secuencia de ADN del genoma de las dos cepas de C neoformans las cuales no pudieron ser detectadas en el cariotipo electrofor tico obtenido en la 1D Asc Fse Pme I MEAKAI EENEI EES E o A O a a e AXI EEN gp VOIE X AB ABABABABABABABABABABABABABABABABABABAB kb m 22 T mm 399 5 z a Les mm Nm A a a a aza LLLI mc me c cq mme a PP Itam 145 5 zz a 9 B mm pr an aT 2222 1 zn ES a dd z223 E 4 po ae Nam UT um 7 77209 an a e area n c man I 10 0 c3 oxx Not I Pac Sfi l S A a AAN LE EIN E YE MIE NY ETE COME YE VMUESAS AY ABABABABABABABABABABABABABABABABABABABABAB kb pl m Ez d pa m 339 5 m anam 7579 am a DES m am IZ g I Z2 gt 2 TT Ze 232 m 145 5 am E PE im FE HE Es m aa a 375 p u 222223305 Ejea a TM cad zzz E a zaz22 7 4 m mnm a TL 1an ama PR Fig 2 Huella digital de los cromosomas I II III V VIII X y XIV de las cepas de C neoformans B3501A A y JEC21 B generadas virtualmente por la restricci n con Asc I
3. Fse I y Pme I Not I Pac I y Sfi I y por la separaci n de los fragmentos en miniCHEF con la rampa de tp s Np 15 100 10 150 5 300 3 500 1 3000 en gel de agarosa 1 5 9o 10 V cm y TBE 0 5X a 20 C Por tanto las condiciones experimentales recomendadas para generar la huella digital de los cromosomas de C neoformans B3501A y JEC21 y evidenciar las diferencias entre ellos consiste en la restricci n de los cromosomas individuales con Not I o Sfi I y la obtenci n de los patrones de restricci n en la c mara miniCHEF bajo condiciones de campo el ctrico 10 V cm temperatura de la disoluci n estabilizadora 20 C TBE 0 5X y la rampa de tp s Np 15 100 10 150 5 300 3 500 1 3000 Estas condiciones permitieron revelar la informaci n enmascarada en el cariotipo electrofor tico de las dos cepas de C neoformans analizadas 126 Revista CENIC Ciencias Biol gicas Vol 46 No 2 pp 119 130 mayo agosto 2015 Evaluaci n in silico de la utilidad de la informaci n revelada en la segunda dimensi n para discriminar cepas de C neoformans Para simular el an lisis en la segunda dimensi n del genoma de C neoformans se tuvo en cuenta que en las bandas comunes 2 3 y 6 Fig 1 de los cariotipos electrofor ticos de las cepas analizadas comigraron m s de un cromosoma en una o ambas cepas y que en la banda com n 5 migraron la misma distancia en el gel cromosomas no hom logos de las dos cepas Fig 1 Esto impli
4. an las muestras en una electroforesis real y debajo de cada pocillo se dibuja el patr n de bandas virtual de las mol culas de ADN que se obtendr a experimentalmente Todas las simulaciones se realizaron asumiendo campos el ctricos de 10 V cm temperatura del tamp n TBE 0 5 X Tris 44 5 mM cido b rico 44 5 mM EDTA 1 mM pH 8 3 de 20 C y gel de agarosa al 1 5 96 Se simularon los cariotipos electrofor ticos que se obtendr an en la 1D formados por los cromosomas intactos y las huellas digitales cromosomales que se obtendr an en la 2D formados por los macrofragmentos de restricci n de los cromosomas individuales contenidos en las bandas que en ambas cepas de C neoformans migraron la misma distancia los patrones 1D bandas comunes Dise o in silico de las rampas de fp necesarias para separar las mol culas de ADN en c maras miniCHEF La predicci n de los patrones de bandas Las condiciones electrofor ticas iniciales utilizadas para simular los patrones de bandas del ADN de las cepas de C neoformans en la 1D y 2D se estimaron a partir del c lculo de los tiempos de reorientaci n tr de las mol culas de ADN mediante las ecuaciones descritas por L pez C novas y col Estas ecuaciones describen las velocidades de migraci n cm s durante y despu s de la reorientaci n vr y vm respectivamente as como tr s y la migraci n total de mol culas de ADN de cualquier tama o sometidas a electroforesis en miniCHEF Las ecuaci
5. cromosomal de C neoformans as como la s enzima s de restricci n que evidencien los polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricci n del ADN cromosomal en la 2D Mol culas de ADN utilizadas en las simulaciones Las secuencias de bases del ADN de las cepas Cryptococcus neoformans B3501A y JEC21 se obtuvieron del sitio web http www ebi ac uk genomes eukaryota html Para obtener dichas secuencias se emplearon las herramientas de software del sistema operativo Windows 7 El tama o de las mol culas de ADN correspondiente a cada uno de los cromosomas de estos microorganismos se utiliz para simular en computadora los patrones de bandas en la 1D Por otra parte para simular los patrones de bandas que se obtendr an en la 2D se utiliz el tama o de los macrofragmentos de restricci n del ADN de los cromosomas individuales generados previamente por la digesti n virtual de sus secuencias de bases con diferentes enzimas Simulaci n de los patrones electrofor ticos de ECP Los patrones electrofor ticos que se obtendr an en la c mara miniCHEF se simularon utilizando el software PFGESimulator Este software simula los patrones de bandas bas ndose en la ecuaci n que describe la migraci n del ADN lineal en CHEF para lo cual dibuja un rect ngulo de largo x ancho 256 x 339 p xeles 1 p xel 0 02 cm que representa un gel virtual Dentro del rect ngulo se representan 12 o 19 pocillos seg n se seleccione donde se aplicar
6. 26 Saracli MA Yildiran ST Sener K Gonlum A Doganci L Keller SM et al Genotyping of Turkish environmental Cryptococcus neoformans var neoformans isolates by pulsed field gel electrophoresis and mating type Journal Compilation Blackwell Publishing Ltd Mycoses 2006 49 124 9 130
7. Revista CENIC Ciencias Biol gicas Vol 46 No 2 pp 119 130 mayo agosto 2015 la secuencia de bases del ADN Para diferenciar estas mol culas indistinguibles en la 1D proponemos un an lisis bidimensional que permita obtener la huella digital cromosomal despu s de digerir los cromosomas individualmente con enzimas de restricci n adecuadas para generar macrofragmentos que puedan ser comparados al separarlos mediante una segunda ECP Las enzimas de restricci n que evidencian polimorfismos de los fragmentos de restricci n de los cromosomas que migran igual en los cariotipos de las cepas C neoformans B3501A y JEC21 Para simular el an lisis en la 2D del genoma de C neoformans se determin cu les enzimas de restricci n son tiles para obtener la huella digital de los cromosomas individuales involucrados en las bandas comunes de los cariotipos electrofor ticos de las cepas B3501A y JEC21 Este an lisis permitir a detectar las diferencias en la longitud de los fragmentos de restricci n como indicativo de las diferencias en la secuencia de bases de mol culas de tama os semejantes en ambas cepas Las enzimas Asc I Fse I Not I Pac I y Sfi I generaron virtualmente menos de 60 fragmentos de los cromosomas I II HI IV V VII X XI y XIV de las dos cepas de C neoformans y m s de la mitad de dichos fragmentos pose an tama os mayores de 20 kb Tabla 1 Con excepci n del ADN del cromosoma XIV de la cepa B3501A en el cual la enzi
8. bioinform tico que permiti el dise o y la comprobaci n in silico de la utilidad de dicha metodolog a La separaci n de los cromosomas intactos de las cepas estudiadas en la primera dimensi n 1D se logra en 9 3 h de ECP en una c mara miniCHEF aplicando tiempos de pulso tp entre 30 y 90 s La huella digital cromosomal se obtuvo en la segunda dimensi n 2D despu s de la restricci n de las bandas obtenidas en 1D con Not I o Sfi I y la separaci n de los fragmentos en la c mara miniCHEF aplicando tp entre 1 y 15 s durante 5 h Esta metodolog a evidencia las diferencias gen ticas entre cepas de C neoformans invisibles en la 1D luego de 14 3 h de electroforesis 1D 2D en contraste con las 30 a 40 h que tomar a una ECP en c maras CHEF convencionales Esta metodolog a pudiera implementarse para el estudio del genoma de otras especies de eucariotas unicelulares ABSTRACT Cryptococcus neoformans is a pathogenic yeast that causes meningoencephalitis specially in AIDS patients Epidemiological studies of clinical isolates have been encouraged due to the increase in its incidence for infection monitoring and control Pulsed Field Gel Electrophoresis PFGE is the most popular technique for microbial molecular subtyping with epidemiological purpose because of its versatility and reproducibility but the analysis of eukaryotic genomes like C neoformans in a single PFGE experiment does not reveal mutations that do not alter the chromosome
9. com n 2 de la cepa B3501A result en un patr n de bandas que combin los fragmentos de restricci n del cromosoma X y el XI pues se trata de una banda mixta en el cariotipo de esta cepa el cual se compar con el patr n de bandas resultante de la digesti n del cromosoma X de la cepa JEC21 En consecuencia los patrones obtenidos pose an diferente forma y cantidad de bandas La cantidad de bandas diferentes fue de 7 y 8 bandas para Not I y Sfi L respectivamente lo cual es explicable porque se compararon los patrones de restricci n de dos cromosomas de la cepa B3501A con uno solo en el cariotipo de la cepa JEC21 Fig 3 Un resultado semejante al anterior se obtuvo al comparar los patrones de restricci n de las bandas comunes 3 y 6 las cuales tambi n involucraban bandas mixtas que conten an cromosomas hom logos y no hom logos Fig 3 Esta comparaci n evidenci una cantidad similar de bandas diferentes tanto con Not I 11 y 9 bandas respectivamente como con Sfi I 10 y 9 bandas respectivamente Fig 3 Por ltimo la pareja de patrones generados por Not I de las cepas B3501A y JEC21 correspondientes a la banda com n 5 mostr 21 bandas diferentes Fig 3 lo que evidenci la gran diferencia que exist a entre ellos Estas diferencias se deben a que los cromosomas involucrados en la banda com n 5 no son hom logos para ambas cepas cromosomas IV y ID lo que explicar a que existieran variaciones en la secuencia de bases de d
10. genes de los patrones virtuales del ADN de las cepas de C neoformans B3501A y JEC21 obtenidos en la 2D se sometieron a un an lisis densitom trico mediante el software GuefastScan amp Neuronic SA La Habana Cuba Las parejas de patrones de restricci n del ADN de las bandas comunes en los cariotipos electrofor ticos de las dos cepas se compararon entre s Para dicha comparaci n se consideraron como bandas todos los pixeles comprendidos en las regiones de los patrones virtuales donde existi baja resoluci n en los fragmentos de restricci n Se determin la similitud entre todas las parejas de patrones de bandas de ADN obtenidos en la 2D para las dos cepas de C neoformans a trav s del c lculo del coeficiente de DICE y con la ayuda del GuefastScan amp RESULTADOS Y DISCUSI N El procedimiento bioinform tico que permiti la determinaci n de las condiciones experimentales para la r pida caracterizaci n del genoma de cepas C neoformans mediante 2D miniECP se realiz a partir del an lisis de las secuencias disponibles en las bases de datos en internet de las 122 Revista CENIC Ciencias Biol gicas Vol 46 No 2 pp 119 130 mayo agosto 2015 cepas B3501A y JEC21 El mismo comprendi la selecci n de las enzimas de restricci n adecuadas para fragmentar los cromosomas individuales as como de los reg menes de fp para obtener el cariotipo electrofor tico en la 1D y la huella digital cromosomal en la 2D a trav s de
11. la simulaci n en computadora de los patrones de bandas que se obtendr an en miniCHEF al separar los cromosomas intactos y sus macrofragmentos de restricci n Simulaci n del an lisis en la 1D del genoma de cepas de C neoformans La simulaci n de una rampa de tp entre 90 y 30 s durante 9 3 h permiti resolver virtualmente las mol culas del ADN cromosomal intacto de las cepas B3501A y JEC21 en patrones con 10 y 12 bandas respectivamente de un total de 14 cromosomas en ambas cepas Fig 1 La aplicaci n de esta rampa de tiempos de pulsos garantiz la separaci n adecuada de los cromosomas intactos que pose an tama os en un rango de tallas amplio de 700 a 2300 kb Fig 1 Sin embargo algunos de los cromosomas de la cepa B3501A comigraron en una nica banda como los cromosomas X y XI 1063 y 1086 kb VI y VII 1414 y 1411 kb I II y III 2297 2283 y 2079 kb debido a que poseen tama os que se diferencian en muy pocas kb Fig 1A De forma semejante ocurri con el patr n de la cepa JEC21 en el que comigraron los cromosomas VIII y IX 1178 y 1194 kb y los cromosomas I y III 2300 y 2105 kb Fig 1B Estas parejas de mol culas no fue posible resolverlas bajo ninguna otra condici n de tp resultados no mostrados porque al diferir entre ellas en solo en unas pocas kb sus tr Tabla 1 y velocidades de migraci n son semejantes lo cual hace muy dif cil que puedan ser resueltas mediante ECP A B I M l am 6 a 11 Iv
12. reorientaci n de las mol culas que se pretend an resolver Las correspondientes cantidades de repeticiones Np1 Np2 Npn de cada tiempo de pulso tpl tp2 tpn se estimaron con el software PFGESimulator fijando Np1 Np2 Npn y cambiando estos valores hasta obtener la resoluci n deseada en aproximadamente 5 10 h de electroforesis Las condiciones de tp y Np se suministraron como condiciones iniciales al simulador del PFGESimulator y se modificaron paso a paso siguiendo el procedimiento de prueba y error hasta que se obtuvieron patrones de bandas donde aparec an resueltas la mayor cantidad de mol culas de ADN Selecci n de las enzimas de restricci n para el an lisis 2D miniECP Las secuencias de bases del ADN de las cepas C neoformans B3501A y JEC21 se analizaron mediante la aplicaci n de b squeda de sitios de restricci n con la ayuda del software PFGESimulator Este software carga la secuencia de bases del ADN del genoma de cualquier organismo identifica la posici n de los sitios de restricci n para todas las enzimas de restricci n conocidas y brinda como datos de salida la cantidad y tama o de los fragmentos de ADN generados con cada enzima de restricci n Se seleccionaron las enzimas de restricci n que cortaran 60 veces o menos las secuencias de los cromosomas procesados y que al menos el 50 de los fragmentos generados fueran mayores de 20 kb Determinaci n de la similitud entre las cepas de C neoformans Las im
13. 3 0 173 13 14 12 166 11 16 0 242 Pme I 16 18 4 375 17 18 4 375 9 9 28 334 9 10 4 319 Sfi I 26 37 0 268 26 34 0 266 11 14 0 424 8 0 2 355 AscI 5 5 105 910 5 5 105 738 5 6 17 363 FseI 8 8 19 769 8 8 19 711 6 8 0 523 NotI II 14 16 2 1078 14 17 2 435 IX 9 15 4 184 PacI 17 24 3 927 18 25 3 290 14 16 0 141 Pme I 14 16 15 838 13 15 15 416 9 9 28 340 Sfi I 15 20 0 805 17 23 0 467 11 15 0 421 Asc I 14 14 28 254 14 15 3 288 5 6 10 430 4 5 10 781 Fse I 16 21 1 391 15 20 1 391 10 11 7 451 10 11 7 451 NotI III 28 36 0 338 31 42 0 3 201 X 10 14 0 2 195 12 17 0 2 186 Pac I 28 36 0 259 28 37 0 256 10 18 0 270 10 18 0 270 Pme I 9 11 0 854 9 11 0 4 886 8 8 27 351 8 8 21 354 Sfi I 19 26 0 307 21 28 0 248 7 10 0 307 8 11 0 308 Asc I 11 14 4 392 9 11 3 302 Fse I 11 17 0 2 261 9 11 5 198 NotI IV 16 20 5 317 XI 9 13 1 236 Pac I 25 34 0 145 13 16 1 202 Pme I 8 9 12 503 4 5 0 4 403 Sfi I 16 23 0 2 440 9 15 0 7 342 Asc I 11 12 0 7 410 10 10 22 442 3 3 67 568 3 3 67 564 FseI 6 8 4 526 6 8 4 527 2 2 157 609 2 2 157 604 NotI V 17 22 0 4 195 20 24 0 4 195 XIV q 8 10 6 285 8 10 6 291 PacI 9 11 0 9 335 10 15 1 331 3 3 133 423 3 4 13 405 Pme I 11 12 6 335 11 12 6 367 2 2 27 735 Sfi I 15 18 5 221 17 20 5 231 9 16 0 3 208 10 16 0 3 175 Obtenci n in s lico de la huella digital de los cromosomas individuales de las cepas C neoformans B3501A y JEC21 en la 2D Las condiciones para separar los fragmentos de restricci n de los cromosomas individuales en el miniCHEF se dete
14. 7 5 2 2 IV VI Vip 747 VllL eum 3 m VIII IX X Xi m 2 x XiV 1 22 xiv Fig 1 Cariotipos electrofor ticos virtuales de las cepas de C neoformans B3501A A y JEC21 B que se obtendr an en la c mara miniCHEF bajo condiciones de campo el ctrico 10 V cm agarosa 1 5 temperatura del tamp n 20 C TBE 0 5X usando la rampa de tp s Np 90 45 70 100 40 120 30 30 9 3 h de electroforesis La rampa de 1p s Np 90 45 70 100 40 120 30 30 permiti separar virtualmente la mayor a de los cromosomas de ambas cepas de C neoformans en un tiempo de electroforesis de 9 3 h tres veces menor que el descrito en la literatura el cual oscila entre 30 a 40 horas 25 2 Esta disminuci n en el tiempo de electroforesis con respecto a los protocolos utilizados hasta el momento debe facilitar la obtenci n de los cariotipos electrofor ticos de C neoformans experimentalmente a lo que se le adicionar a el ahorro en reactivos que implica el uso de la tecnolog a para realizar ECP en minigeles Los cariotipos electrofor ticos virtuales de las dos cepas estudiadas muestran 6 bandas comunes que se se alan en la Fig 1 con n meros ar bigos como resultado de que bajo esas condiciones de electroforesis ambas cepas contienen cromosomas que migran la misma distancia en el gel Estas bandas comunes est n formadas por cromosomas de tama os semejantes Fig 1 los cuales solo podr an ser discriminados analizando 123
15. Infectious Diseases 2013 32 11 1377 91 5 Meyer W Casta eda A Stuatr J Matthew H Casta eda E Molecular typing of iberoamerican Cryptococcus neoformans isolates Emerging Infectious Diseases 2003 9 2 189 05 6 Mitchell TG Litvintseva AP Typing species of Cryptococcus and epidemiology of cryptococcosis The Yeast Handbook Berlin Springer 2010 167 90 7 Perfect JR Ketabachi N Cox GM Ingram CW Beiser CL Karyotyping of Cryptococcus neoformans as an epidemiological tool Journal of Clinical Microbiology 1993 31 3305 9 8 Wickes BI Moore TDE Kwon Chung KJ Comparison or the electrophoretic karyotypes and chromosomal location of ten genes in the two varieties of Cryptococcus neoformans Microbiology 1994 140 543 50 9 Barchiesi F Hollis RJ Messer SA Scalise G Rinaldi MG Pfaller A Electrophoretic karyotype and in vitro antifungal susceptibility of Cryptococcus neoformans isolates from AIDS patients Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 1995 23 99 103 10 Goering RV Pulsed field gel electrophoresis A review of application and interpretation in the molecular epidemiology of infectious disease Infection Genetics and Evolution 2010 10 866 875 11 Brug re JF Cornillot EW M t nier G Vivar s CP In gel DNA radiolabelling and two dimensional pulsed field gel electrophoresis procedures suitable for fingerprinting and mapping small eukaryotic genomes Nucleic Acids Research 2000a 28 10 e48 129
16. L Bravo L Herrera J River n AM Javer E Sanchez A et al DNA fingerprinting of Vibrio cholerae and Aeromonas species by pulsed field minigel electrophoresis Electrophoresis 2006 27 14 2857 64 20 River n AM L pez C novas L Herrera JA Arencibia O Manual de Usuario Sistema Guefast 06 c maras miniCHEF y miniTAFE accesorios y unidad de control La Habana Editorial CENIC Primera Edici n 2006 pp 1 35 2 River n AM L pez C novas L Santos YM Plasencia E Corrales F Registration certificate of the PFGESimulator software No 828 2011 2011 CENDA La Habana Cuba 22 L pez C novas L Gal n L Orozco E River n A Kinetic properties of DNA migration under clamped homogeneous electric field conditions DNA size migration velocities and reorientation time determined in a single clamped homogeneous electric field run Journal of Chromatography 1998 806 123 39 23 Registro de equipo m dico Software GuefastScan 2008 Certificado de registro de equipos m dicos 2008 Nro 0090414851200 CECMED Cuba Pr rroga del registro de equipo m dico 2014 C digo no 81 MMH no Registro I 009041 24 Dice LR Measures of the amount of ecologic association between species Ecology 1945 26 297 302 25 Sukroongreung S Lim S Tantimavanich S Eampokalap B Carter D Nilakul C Kulkeratiyut S Tansuphaswadikul S Phenotypic switching and genetic diversity of Cryptococcus neoformans Journal of Clinical Microbiology 2001 39 2060 4
17. Revista CENIC Ciencias Biol gicas Vol 46 No 2 pp 119 130 mayo agosto 2015 Electroforesis bidimensional de campos pulsados en minic maras para caracterizar los cromosomas de Cryptococcus neoformans procedimiento bioinform tico Karen Le n Arcia Dpto Biolog a Molecular Centro de Neurociencias de Cuba Ave 25 esquina 158 Cubanac n Playa La Habana kla Ocneuro edu cu Recibido 28 de abril de 2014 Aceptado 3 de febrero de 2015 Palabras clave Cryptococcus neoformans Electroforesis de Campos Pulsados ECP tipificaci n molecular electroforesis bidimensional Key words Cryptococcus neoformans Pulsed Field Gel Electrophoresis Molecular subtyping Two dimensional electrophoresis RESUMEN Cryptococcus neoformans es una levadura que provoca meningoencefalitis com nmente en pacientes inmunodeprimidos El incremento en su incidencia ha motivado estudios epidemiol gicos de aislados cl nicos para establecer redes de vigilancia La electroforesis de campos pulsados ECP es una de las t cnicas m s utilizadas en la subtipaci n molecular de microorganismos con fines epidemiol gicos por su versatilidad y reproducibilidad sin embargo el an lisis del genoma de eucariotas mediante un nico experimento de ECP solo revela aquellas mutaciones que modifican el tama o de sus cromosomas El presente trabajo propone una metodolog a para caracterizar el genoma de C neoformans mediante ECP bidimensional y describe el procedimiento
18. a con la misma enzima vari desde 1 hasta 6 en una cepa en relaci n con la otra como en el caso del ADN del cromosoma III de la cepa B3501A que con la enzima Not I se restringe en 36 fragmentos mientras que en la cepa JEC21 en 42 fragmentos Tabla 1 fila 3 Sin embargo en este caso el tama o de los fragmentos fue semejante Estos resultados sugieren que si se resolvieran los fragmentos generados por cualquiera de estas seis enzimas preseleccionadas en forma de patrones de bandas mediante miniCHEF ser a posible evidenciar los polimorfismos de los fragmentos de restricci n de los cromosomas de tama os semejantes en las capas B3501A y JEC21 de C neoformans 124 Revista CENIC Ciencias Biol gicas Vol 46 No 2 pp 119 130 mayo agosto 2015 Tabla 1 Enzimas que generan hasta 60 fragmentos y que al menos el 50 de ellos tienen tallas mayores que 20 kb al digerir virtualmente cada uno de los cromosomas de las cepas de C neoformans B3501A y JEC21 involucrados en las bandas comunes de sus cariotipos electrofor ticos B3501A JEC21 B3501A JEC21 Bandas Intervalo Bandas Intervalo Bandas Interval Bandas Intervalo gt 20kb tallas gt 20kb tallas gt 20kb o tallas gt 20kb tallas Enz Crom Total kb Total kb Crom Total kb Total kb Asc I 14 17 4 685 14 17 4 683 5 6 17 363 7 7 69 258 Fse I 16 21 1 517 17 22 1 517 6 8 0 518 9 10 0 9 233 NotI I 24 29 0 5 374 26 29 0 5 375 VII 11 17 4 334 10 12 5 257 PacI 30 50 0 254 32 5
19. ca que si el an lisis en la segunda dimensi n se realizara experimentalmente habr a que tener en cuenta a todas las mol culas de ADN que comigran en una banda la cual se la denominar a banda mixta porque contendr a m s de un cromosoma Por lo tanto en la digesti n virtual con Not I o Sfi I de cada una de las bandas mixtas de los patrones se debi contemplar el an lisis de restricci n de todos los cromosomas contenidos en dichas bandas En todas las parejas de patrones de bandas obtenidos por la digesti n virtual tanto con Not I como con Sfi L de las mol culas de ADN que migraron en las seis bandas comunes se observ polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricci n lo que evidenci las diferencias en la secuencia de ADN que no pudieron ser detectadas cuando se compararon los cariotipos electrofor ticos de ambas cepas de C neoformans Fig 3 Por ejemplo el an lisis de la banda com n 1 result en la comparaci n de los patrones de restricci n del cromosoma XIV de cada cepa y evidenci que solo se diferenciaban en una banda Fig 3 Sin embargo las diferencias entre los cromosomas XIV de ambas cepas fueron m s evidentes cuando se obtuvo el patr n de restricci n virtual con Sfi I el cual mostr tres bandas diferentes entre los dos patrones Fig 3 En el caso de la banda com n 4 que posee cromosomas hom logos en los cariotipos de ambas cepas cromosoma V con la enzima Not I se evidenciaron mejor las diferen
20. ccionar a priori las condiciones experimentales que mejor resuelvan los cariotipos electrofor ticos y los macrofragmentos de restricci n de los cromosomas individuales de C neoformans u otro organismo eucariota unicelular De igual forma se podr a seleccionar a priori la enzima de restricci n para generar dichos macrofragmentos de restricci n de los cromosomas individuales o la huella digital cromosomal de estos organismos mediante 2D miniECP Dichas condiciones experimentales permitir n caracterizar de forma r pida el genoma de cepas de C neoformans mediante 2D miniECP y pueden evidenciar la presencia de mutaciones puntuales o reordenamientos g nicos en los cromosomas de este microorganismo El objetivo de este trabajo es determinar in silico las condiciones de ECP en miniCHEF que permiten el an lisis bidimensional del genoma de las cepas C neoformans B3501A y JEC21 y las enzimas de restricci n tiles para obtener la huella digital de cada uno de los cromosomas en la 120 Revista CENIC Ciencias Biol gicas Vol 46 No 2 pp 119 130 mayo agosto 2015 segunda dimensi n Adem s evaluar in silico la utilidad de la informaci n obtenida en la segunda dimensi n para comparar el genoma de cepas de Cryptococcus neoformans MATERIALES Y M TODOS En este trabajo se describe el procedimiento bioinform tico que permiti la selecci n de los reg menes de tiempos de pulsos que generan el cariotipo electrofor tico y la huella digital
21. cias entre los patrones de restricci n de ese par de mol culas ya que estos patrones pose an 8 bandas diferentes mientras que con Sfi I solo presentaban 4 Not I Sfi l A A S E E a ABABABABABABABABABABABAB m a a gt Za 2 339 5 kb ma 2m2 BH a 2 ss kb m zzz n T IT CZ m y 22m 5222 al mm 2m a ma um di 48 5 kb a a m E n ab v ms zm7 BB a 2 8 B kb T m a E 00 kb Fig 3 Comparaci n de los patrones de bandas virtuales de las cepas C neoformans B3501A A y JEC21 B obtenidos en la 2D en miniCHEF agarosa 1 5 10 V cm TBE 0 5X a 20 C y la rampa de tp s Np 15 100 10 150 5 300 3 500 1 3000 luego de la digesti n in s lico con Not I y Sfi I de los cromosomas que migraron la misma distancia en sus cariotipos electrofor ticos bandas comunes Las parejas de patrones de restricci n comparados se formaron por la digesti n enzim tica de cromosoma XIX de B3501A y cromosoma XIV de JEC21 1 cromosomas X y XI de B3501A y cromosoma X de JEC21 2 cromosoma VIII de B3501A y cromosomas VIII y IX de JEC21 3 cromosoma V de B3501A y cromosoma V de JEC21 4 cromosoma IV de B3501A y cromosoma II de JEC21 5 y cromosomas I II y III de B3501A y cromosomas I y III de JEC21 6 127 Revista CENIC Ciencias Biol gicas Vol 46 No 2 pp 119 130 mayo agosto 2015 La restricci n con Not I o Sfi I de la banda
22. i n ha demandado la investigaci n epidemiol gica de aislamientos ambientales y cl nicos Al respecto se ha propuesto el establecimiento de redes de vigilancia epidemiol gica con la participaci n de laboratorios de referencia que permitan su identificaci n y monitoreo Para el estudio de la epidemiolog a del Cryptococcus neoformans se han aplicado varias t cnicas de tipificaci n basadas en caracteres gen ticos En particular la Electroforesis de Campos Pulsados ECP ha resultado un m todo til y t cnicamente simple para determinar la relaci n clonal de cepas involucradas en eventos epidemiol gicos Sin embargo el cariotipaje no evidencia los cambios en la secuencia de bases del ADN cromosomal que provocan diferencias de tama o por debajo del 5 10 9 Por esa raz n se ha propuesto el an lisis bidimensional del ADN de eucariotas mediante ECP 2D ECP La 2D ECP consiste en la obtenci n del cariotipo electrofor tico del microorganismo primera dimensi n 1D la escisi n del patr n de bandas y su aplicaci n en otro gel el cual se somete a otra ECP segunda dimensi n 2D en condiciones de electroforesis diferentes a las de la 1D Las mol culas del patr n de bandas 1D pueden ser digeridas o no con enzimas de restricci n El an lisis bidimensional a diferencia del que se realiza en una sola dimensi n ha permitido explorar mayores regiones del genoma de eucariotas y detectar variaciones en el tama o de los cromoso
23. ichas mol culas aun cuando posean el mismo tama o El an lisis de la similitud entre los patrones de restricci n con Not I o Sfi I de las mol culas contenidas en las bandas comunes del cariotipo electrofor tico de ambas cepas de C neoformans mediante el c lculo del coeficiente de DICE puso en evidencia las diferencias entre ellas Tabla 2 La presencia de cromosomas hom logos en las bandas comunes arroj la mayor similitud entre los patrones bandas comunes 1 y 4 Fig 3 Tabla 2 Cuando en una banda com n exist a m s de un cromosoma es decir era una banda mixta en el cariotipo de una de las dos cepas el coeficiente de similitud entre los patrones virtuales disminuy porque uno de los patrones conten a adem s los fragmentos de restricci n de otro cromosoma bandas comunes 2 3 y6 Fig 3 Tabla 2 Los valores de coeficientes de similitud de DICE menores se obtuvieron cuando las bandas comunes en los cariotipos electrofor ticos de las dos cepas estaban formadas por cromosomas no hom logos banda com n 5 Fig 3 Tabla 2 Tabla 2 Coeficiente de DICE para cada pareja de patrones de restricci n virtuales con Not I o Sfi I de las mol culas contenidas en las bandas comunes de los cariotipos electrofor ticos de las cepas C neoformans B3501A y JEC21 Coeficiente de DICE Banda com n NotI Sfi I 1 0 92 0 95 2 0 64 0 64 3 0 58 0 52 4 0 68 0 85 5 0 27 0 45 6 0 67 0 75 Los coeficientes de DICE obtenidos en las comparacio
24. ma Pme I no posee sitios de restricci n el resto de los cromosomas involucrados en las bandas comunes se digirieron virtualmente con Pme I de forma semejante a como lo hicieron las enzimas mencionadas anteriormente La mayor a de los fragmentos de restricci n de los cromosomas analizados con las seis enzimas ten an tama os diferentes al comparar ambas cepas que oscilaron entre 20 y 600 kb Tabla 1 Sin embargo el ADN del cromosoma II brind fragmentos de hasta 1000 kb cuando se digiri virtualmente con cualesquiera de las enzimas preseleccionadas Tabla 1 fila 2 La enzima Asc I tambi n gener fragmentos con tama os en el orden de las 700 kb del ADN de los cromosomas I y X Tabla 1 filas 1 y 3 mientras que Pme I digiri el ADN de los cromosomas III y XIV cepa JEC21 en fragmentos con tama os de hasta 700 y 800 kb respectivamente Tabla 1 filas 3 y 5 Todas las enzimas preseleccionadas mediante el an lisis in silico permitieron detectar diferencias entre las dos cepas en cuanto al tama o y la cantidad de los fragmentos de restricci n generados por ellas El tama o de los fragmentos de algunos cromosomas fue hasta tres veces superior en una cepa en relaci n con la otra por ejemplo el tama o del fragmento mayor del cromosoma II generado con Pac I fue de 928 kb en la cepa B3501A y de 290 kb en la cepa JEC21 ya que el ADN de esta ltima pose a un sitio m s de corte Tabla 1 fila 2 La cantidad de fragmentos de un cromosom
25. mas de estos organismos que no han sido detectadas en una nica ECP Adem s la 2D ECP combinada con la restricci n en el propio gel de las mol culas de ADN ha facilitado el mapeo de genes en los cromosomas del par sito intracelular Encephalitozoon cuniculi y la construcci n del mapa f sico de cromosomas circulares en especies bacterianas como Micoplasma mobile Pseudomonas aeruginosa PAO y Anabaena sp 5 6 Los procedimientos de 2D ECP descritos requieren de largos tiempos de electroforesis y gran cantidad de reactivos porque usan los sistemas convencionales de ECP 17 A esto se adicionan los gastos de tiempo y reactivos que requiere la selecci n de las condiciones adecuadas de ECP para la obtenci n de patrones de bandas de ADN en la 1D y 2D debido a que este proceso se realiza a trav s de ensayos de prueba y error Lo cual quedar a resuelto con la utilizaci n de la tecnolog a de ECP en minigeles miniECP que emplea cinco veces menos cantidad de reactivos qu micos y reduce de cuatro a cinco veces los tiempos de electroforesis 18 19 20 El sistema de miniECP Guefast 060 cuenta con un simulador PFGESimulator basado en las ecuaciones que describen la migraci n de mol culas de ADN lineales en el CHEF Contour Clamped Homogeneous Electric Field que permite generar las condiciones de electroforesis en c maras miniCHEF y simular los patrones de bandas de mol culas de ADN que se obtendr an 22 De esta manera se pueden sele
26. nes entre los patrones 2D de las bandas comunes de las 2 cepas de C neoformans fueron mayores con Sfi I que con Not I con excepci n de la banda com n 3 Tabla 2 Esto indica que la digesti n de los cromosomas de las bandas comunes con Not I en combinaci n con la separaci n de los macrofragmentos de restricci n utilizando la rampa de tp s Np 15 100 10 150 5 300 3 500 1 3000 evidenci mejor que Sfi I las diferencias gen ticas existentes en las mol culas que fueron indistinguibles en la 1D 128 Revista CENIC Ciencias Biol gicas Vol 46 No 2 pp 119 130 mayo agosto 2015 Sin embargo ambas enzimas permitieron evidenciar de igual forma los polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricci n de los cromosomas por lo pudieran ser utilizadas indistintamente para el an lisis bidimensional de cepas de C neoformans CONCLUSIONES La metodolog a 2D miniECP propuesta para caracterizar el genoma de C neoformans permitir a evidenciar los polimorfismos de la longitud de los fragmentos de restricci n de los cromosomas que ser an indetectables al separar los cromosomas intactos en una sola electroforesis Esta metodolog a requerir a de la restricci n de los cromosomas individuales con las enzimas Not I o Sfi I y los resultados finales se obtendr an despu s de un total de 14 3 h de electroforesis 1D 2D seg n las simulaciones en computadoras en contraste con las 30 a 40 h que toma realizar un experime
27. nto de ECP como los reportados en la literatura hasta el momento El procedimiento descrito para el an lisis virtual del genoma de C neoformans mediante ECP bidimensional es potencialmente extensible al an lisis del genoma de otras especies La detecci n de los polimorfismos de la longitud de los fragmentos de restricci n de los cromosomas individuales de tama o similar permitir a discriminar cepas de microorganismos eucariotas cuyos cariotipos electrofor ticos fuesen semejantes As la metodolog a de 2D miniECP pudiera brindar informaci n til para la subtipaci n molecular de organismos m s complejos como los eucariotas unicelulares de forma r pida y de f cil interpretaci n REFERNCIAS BIBLIOGR FICAS 1 Garc a GL Novoa AM Criptococosis Una amenaza para pacientes inmunodeprimidos Gaceta M dica Espirituana 2011 13 3 Consultada 24 de abril de 2014 Disponible en http bvs sld cu revistas gme pub vol 13 3 15 p15 html 2 Gaona Flores VA Central nervous system and Cryptococcus neoformans North American Journal of Medical Science 2013 5 492 3 3 Brizuela S y Montero N Criptococosis asociado a VIH SIDA a prop sito de un paciente Revista M dica de Costa Rica y Centroam rica 2013 LXX 605 43 7 4 Gullo FP Rossi SA Sardi JCO Teodoro VLI Mendes Giannini MJS Fusco Almeida AM Cryptococcosis epidemiology fungal resistance and new alternatives for treatment European Journal of Clinical Microbiology amp
28. ones descritas son vr 0 0207 Q 1 1 E 8rnL gt 1 vm 0 665 Q 1 1 E 6 81mL 957 2 tr 2 0 134 LE vr 0926 3 121 Revista CENIC Ciencias Biol gicas Vol 46 No 2 pp 119 130 mayo agosto 2015 Donde O carga neta en statcoulomb de la mol cula de ADN y se calcula como le pb e electr n y pb la cantidad de pares de bases L largo del contorno en cm de la mol cula lineal de ADN y se calcula como 0 34 nmepb E campo el ctrico en statvolt cm y viscosidad de la disoluci n estabilizadora en Poises Esta ltima se calcula interpolando el valor de la temperatura del tamp n TBE 0 5 X en un polinomio que describe la relaci n entre la viscosidad del agua y su temperatura en C Los reg menes de tp aplicados en las simulaciones consistieron en secuencias rampas de tp La selecci n de los tp l mites de las rampas que se aplicar an en las corridas in silico se realiz a partir de los valores de los tr de las mol culas de ADN de las cepas en estudio calculados con las ecuaciones 1 y 3 El criterio que se emple para seleccionar dichos l mites fue que los tp de m xima y m nima duraci n deb an poseer valores comprendidos dentro del rango 0 1 lt tr tp lt 1 0 donde tr es el tiempo de reorientaci n de las mol culas de ADN de mayor y menor tama o que se requer an separar Los tp intermedios tp2 tp n 1 se calcularon considerando que deb an poseer valores cercanos a los tiempos de
29. rminaron siguiendo el mismo procedimiento de selecci n de los tp que el empleado para separar los cromosomas intactos en la 1D La simulaci n de la separaci n de los fragmentos de restricci n generados con las enzimas Asc I Fse I y Pme I en los cromosomas I II M IV V VII X XI y XIV que se obtendr an en la c mara miniCHEF aplicando la rampa de tp s Np 15 100 10 150 5 300 3 500 1 3000 revel que en esas condiciones era posible resolver m s del 80 de los fragmentos mayores de 20 kb Fig 2 De forma similar los patrones de bandas virtuales de los fragmentos de restricci n de los cromosomas IV V VMI X 125 Revista CENIC Ciencias Biol gicas Vol 46 No 2 pp 119 130 mayo agosto 2015 XI y XIV generados con Not I Pac I o Sfi I tambi n pose an la mayor a de las bandas bien resueltas en las condiciones de electroforesis mencionadas Fig 2 Sin embargo los patrones de los cromosomas I de ambas cepas con las enzimas Not I Pac I o Sfi I pose an m ltiples zonas de barrido en las que comigraron fragmentos de tallas semejantes Fig 2 Los patrones de restricci n de los cromosomas III de ambas cepas con las enzimas Not I y Pac I tambi n presentaron numerosas zonas de barrido Fig 2 A pesar de la presencia de las zonas de barrido se pudieron evidenciar diferencias en la longitud de los macrofragmentos de restricci n en los cromosomas hom logos de ambas cepas de C neoformans Fig 2
30. s size That is why the author proposes a two dimensional PFGE methodology for the C neoformans genome characterization The present describes the bioinformatic procedure used to design and verify in silico the efficacy of such methodology The resolution of the intact chromosomes was achieved in the first dimension 1D after 9 3 h of electrophoresis in the CHEF minichamber applying pulses between 30 and 90s The chromosomal fingerprint was obtained in the second dimension 2D after restrict the individual bands with Not I or Sfi I and then separate the fragments in the CHEF minichamber applying pulses between 1 and 15 s for 5 h The proposed methodology reveals the genetic differences in the genome of C neoformans strains that were invisible in 1D in 14 3 h of electrophoresis 1D 2D in contrast with the 30 40 h that takes a PFGE in regular electrophoretic chambers Such methodology could be applied for studying the genome of other unicellular eukaryotic species 119 Revista CENIC Ciencias Biol gicas Vol 46 No 2 pp 119 130 mayo agosto 2015 INTRODUCCI N La cripotococosis es una infecci n provocada por la levadura Cryptococcus neoformans que puede desencadenar meningoencefalitis y afecta principalmente a individuos inmunodeprimidos o inmunocomprometidos Desde la aparici n del s ndrome de inmunodeficiencia adquirida SIDA se ha producido un gran incremento en su incidencia como una afecci n mic tica oportunista Esta situac
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